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CN113321742B - 一种重组超氧化物歧化酶及其构建方法和应用 - Google Patents

一种重组超氧化物歧化酶及其构建方法和应用 Download PDF

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CN113321742B CN202110623853.0A CN202110623853A CN113321742B CN 113321742 B CN113321742 B CN 113321742B CN 202110623853 A CN202110623853 A CN 202110623853A CN 113321742 B CN113321742 B CN 113321742B
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Abstract

本发明提供了一种重组超氧化物歧化酶及其构建方法和应用，属于生物工程技术领域；本发明中，通过将SOD和Rec连接，构建出重组超氧化物歧化酶SOD‑Linker‑Rec，所述重组超氧化物歧化酶能够自我高效纯化且稳定性好、抗氧化酶效率高。

Description

一种重组超氧化物歧化酶及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种重组超氧化物歧化酶及其构建方法和应用。
背景技术
生物体内低浓度超氧阴离子自由基(O2-)是维持生命活动所必需的，其浓度过高时，可引起机体组织细胞氧化损伤，导致机体发生疾病，甚至死亡。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase；SOD）是生物体内存在的一种抗氧化金属酶，它能够催化超氧阴离子自由基歧化生成氧和过氧化氢，在机体氧化与抗氧化平衡中起到至关重要的作用。并且，超氧化物歧化酶与很多疾病的发生、发展密不可分。
自由基是带有不成对电子、原子或离子，其化学性质活泼，有极高的氧化性能，以夺取核酸、氨基酸等生物分子的电子，使这些物质性质演化成毒性更强的羟自由基，可导致机体的多种疾病。SOD能够清除细胞中的自由基，有抗衰老、抗辐射、消炎、抑制肿瘤和癌症的功能。并且，SOD对胃病、气管炎、皮肤病、烧伤、脚气等都有独特疗效，同时还对醒酒、亢奋精神、抗疲劳、恢复体力、减肥也有很好的效果。目前，SOD在化妆品、食品、保健品、医药、酒类、饮料等行业有着广泛的应用。但是，目前SOD存在稳定性较差，易发生杂菌污染，分离纯化较为困难，生产成本高，酶活损失大。
发明内容
针对现有技术中存在不足，本发明提供了一种重组超氧化物歧化酶及其构建方法和应用。本发明中，通过将SOD和节肢模拟弹性蛋白（Rec）连接，构建出重组超氧化物歧化酶SOD-Linker-Rec，所述重组超氧化物歧化酶能够自我高效纯化且稳定性好、抗氧化酶效率高。
本发明中首先提供了一种重组超氧化物歧化酶SOD-Linker-Rec，所述SOD-Linker-Rec的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码SOD-Linker-Rec的核苷酸序列如SEQID NO:2所示。
本发明中还提供了上述重组超氧化物歧化酶SOD-Linker-Rec的构建方法，具体包括如下步骤：
将超氧化物歧化酶（Homo sapiens (human)）与Rec通过接头Linker连接，得到重组超氧化物歧化酶SOD-Linker-Rec。
具体的，所述接头Linker为连接肽(GGGGS)3，其核酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述Rec为节肢模拟弹性蛋白(resilin-mimetic elastic protein，Rec)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，编码所述Rec的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
本发明中还提供了一种重组表达质粒pET28a（+）-SOD-Linker-Rec，所述质粒包括SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
本发明中还提供了含有上述重组表达质粒的重组菌。
本发明还提供了一种制备重组超氧化物歧化酶的方法，所述方法为LB培养基中25℃添加0.4 mM的IPTG诱导培养上述重组菌，利用(NH4)2SO4沉淀所述重组超氧化物歧化酶，然后悬于Tris-HCl中，0~4℃静置12~24h，吸取凝聚层，即为纯化后的重组超氧化物歧化酶。
本发明还提供了所述重组超氧化物歧化酶在抗氧化中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
节肢模拟弹性蛋白（resilin-mimetic elastic proteinRec，Rec）来自于天然节肢弹性蛋白（果蝇Resilin CG15920），由18个十五肽(GGRPSDSYGAPGGGN)的重复序列组成，是一种细胞外基质蛋白，为动脉、肺、腱、皮肤和韧带等组织提供弹性和弹性。并且，其在中性水中能耐受125 ℃的高温，在140-150 ℃以内不会降解，即使经过长时间的处理，非极性溶剂以及尿素、盐酸胍等几乎都不会对从橡胶态到固态的变化带来永久性改变。
本发明中，在SOD的C端连接Rec连接了Rec，使SOD具有的热稳定性和冷却凝集的特性，这种特性使蛋白的纯化方法大大简化，只需经过冷却凝集简单的过程就能获得目标蛋白，避免了亲和色谱层析法繁琐的实验过程，为重组超氧化物歧化酶低廉、简便、高效的大量生产创造了可能。通过该特性可以实现SOD的纯化，得到更高的纯化倍数，并不改变SOD酶活性且增加稳定性。
本发明通过基因修饰技术构建了重组超氧化物歧化酶SOD-Linker-Rec ，所述重组超氧化物歧化酶中，Rec蛋白具有一定的热稳定性和冷却凝集的特性，这种特性使蛋白的纯化方法大大简化，只需经过盐析加热离心等简单的过程就能获得目标蛋白，进而使重组超氧化物歧化酶可以简单、快速、高效地自我纯化，这种快速而简单的纯化方式在效率上优于传统的镍柱亲和层析纯化方式，此外可以提高SOD酶热和不同温度储存条件下的稳定性。
附图说明
图1为重组表达质粒pET28a（+）SOD-Linker-Rec构建示意图。
图2为不同温度和时间下纯化的SOD-Linker-Rec的SDS-PAGE图。
图3为 0 ℃下不同时间纯化后的SOD-Linker-Rec回收率与纯化倍数。
图4为SOD-Linker-Rec和SOD-Linker在不同温度下的酶活性。
图5为SOD-Linker-Rec和SOD-Linker的热稳定性图（A）和储存稳定性图（B）。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
实施例1：重组表达质粒pET28a（+）SOD-Linker-Rec的构建
苏州泓迅生物科技股份公司全基因合成SOD（Homo sapiens (human)，登录号CR541742.1）核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，编码的氨基酸序列如SEQID NO:3所示。将上述SOD序列的5’和3’分别带上Xba I和Nhe I酶切位点，得到带有Xba I和Nhe I酶切位点的SOD核苷酸序列，然后将带有Xba I和Nhe I酶切位点的SOD核苷酸序列构建到pET28a（+）质粒上，记为pET28a（+）-SOD。
苏州泓迅生物科技股份公司全基因合成Linker- Rec核苷酸序列，在linker的5’带有Nhe I酶切位点，Rec的3’ 带有Hind I酶切位点，Linker和ELP之间有Sac I酶切位点，然后将上述序列构建在PUC18质粒上，记为 PUC18-Linker- Rec质粒。
其中，所述接头Linker为连接肽(GGGGS)3，其核酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述Rec为节肢模拟弹性蛋白(resilin-mimetic elastic protein，Rec)，其氨基酸序列如SEQID NO:6所示，编码所述Rec的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
SEQ ID NO:5：
GGTGGCGGAG GGTCTGGTGG CGGAGGGTCC GGTGGCGGAG GGTCA
SEQ ID NO:6：
PEPPVNSYLPPSDSYGAPGQSGPGGRPSDSYGAPGGGNGGRPSDSYGAPGQGQGQGQGQGGYAGKPSDTYGAPGGGNGNGGRPSSSYGAPGGGNGGRPSDTYGAPGGGNGGRPSDTYGAPGGGGNGNGGRPSSSYGAPGQGQGNGNGGRSSSSYGAPGGGNGGRPSDTYGAPGGGNGGRPSDTYGAPGGGNNGGRPSSSYGAPGGGNGGRPSDTYGAPGGGNGNGSGGRPSSSYGAPGQGQGGFGGRPSDSYGAPGQNQKPSDSYGAPGSGNGNGGRPSSSYGAPGSGPGGRPSDSYGPPASG
SEQ ID NO:7：
CCGGAGCCACCAGTTAACTCGTATCTACCTCCGTCCGATAGCTATGGAGCACCGGGTCAGAGTGGTCCCGGCGGCAGGCCGTCGGATTCCTATGGAGCACCTGGTGGTGGAAACGGTGGACGGCCCTCAGACAGCTATGGCGCTCCAGGCCAGGGTCAAGGACAGGGACAAGGACAAGGTGGATATGCAGGCAAGCCCTCAGATACCTATGGAGCCCCTGGTGGTGGAAATGGCAACGGAGGTCGTCCATCGAGCAGCTATGGCGCTCCTGGCGGTGGAAACGGTGGTCGTCCTTCGGATACCTACGGTGCTCCTGGTGGCGGAAATGGTGGACGCCCATCGGACACTTATGGTGCTCCTGGTGGTGGTGGAAATGGCAACGGCGGACGACCTTCAAGCAGCTATGGAGCGCCTGGTCAAGGACAAGGCAACGGAAATGGCGGTCGCTCATCGAGCAGCTATGGTGCTCCTGGCGGTGGAAACGGCGGTCGTCCTTCGGATACCTACGGTGCTCCCGGTGGTGGAAACGGTGGTCGTCCTTCGGATACTTACGGCGCTCCTGGTGGCGGCAATAATGGCGGTCGTCCCTCAAGCAGCTACGGCGCTCCTGGTGGTGGAAACGGTGGTCGTCCATCTGACACCTATGGCGCTCCTGGTGGCGGTAACGGAAACGGCAGCGGTGGTCGTCCTTCAAGCAGCTATGGAGCACCTGGTCAGGGCCAAGGTGGATTTGGTGGTCGTCCATCGGACTCCTATGGTGCTCCTGGTCAGAACCAAAAACCATCAGATTCATACGGCGCCCCTGGTAGCGGCAATGGCAACGGCGGACGTCCTTCGAGCAGCTATGGAGCCCCAGGCTCAGGACCTGGTGGCCGACCCTCCGACTCCTACGGACCCCCAGCTTCTGGA。
图1为重组质粒pET28a（+）-SOD-Linker- Rec的限制酶位点。使用Nhe I和Hind I双酶切pet28a（+）-SOD和PUC18-Linker- Rec，所述双酶切体系为：
Nhe I：1 uL；
Hind I：1 uL；
10×Buffer：2 uL；
PUC18-Linker- Rec：5 uL；
无菌水：补齐至20 μL；
将上述双酶切体系加入离心管中并混合均匀，在37 ℃下酶切2-3 h，然后按照常规胶回收试剂盒的方法回收Linker- Rec基因片段和线性化的pet28a（+）-SOD，接着把胶回收得到的Linker- Rec基因片段和pet28a（+）-SOD通过T4连接酶（宝生物工程（大连）有限公司）连接。所述连接体系为：
10×T4 Ligase buffer：2 μL；
pet28a（+）SOD：依回收浓度而定；
Linker- Rec：依回收浓度而定；
T4 DNA Ligase（10U/μL）：1 μL；
无菌水：补齐至20μL；
反应在在16 ℃的培养箱中进行，反应18 h左右，连接后得到重组质粒pET28a（+）-SOD-Linker- Rec，命名SOD-Linker-Rec，所述SOD-Linker-Rec的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码SOD-Linker-Rec的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
SEQ ID NO:1：
MATKAVCVLKGDGPVQGIINFEQKESNGPVKVWGSIKGLTEGLHGFHVHEFGDNTAGCTSAGPHFNPLSRKHGGPKDEERHVGDLGNVTADKDGVADVSIEDSVISLSGDHCIIGRTLVVHEKADDLGKGGNEESTKTGNAGSRLACGVIGIAQASGGGGSGGGGSGGGGSELPEPPVNSYLPPSDSYGAPGQSGPGGRPSDSYGAPGGGNGGRPSDSYGAPGQGQGQGQGQGGYAGKPSDTYGAPGGGNGNGGRPSSSYGAPGGGNGGRPSDTYGAPGGGNGGRPSDTYGAPGGGGNGNGGRPSSSYGAPGQGQGNGNGGRSSSSYGAPGGGNGGRPSDTYGAPGGGNGGRPSDTYGAPGGGNNGGRPSSSYGAPGGGNGGRPSDTYGAPGGGNGNGSGGRPSSSYGAPGQGQGGFGGRPSDSYGAPGQNQKPSDSYGAPGSGNGNGGRPSSSYGAPGSGPGGRPSDSYGPPASGKL
SEQ ID NO:2：
ATGGCGACGAAGGCCGTGTGCGTGCTGAAGGGCGACGGCCCAGTGCAGGGCATCATCAATTTCGAGCAGAAGGAAAGTAATGGACCAGTGAAGGTGTGGGGAAGCATTAAAGGACTGACTGAAGGCCTGCATGGATTCCATGTTCATGAGTTTGGAGATAATACAGCAGGCTGTACCAGTGCAGGTCCTCACTTTAATCCTCTATCCAGAAAACACGGTGGGCCAAAGGATGAAGAGAGGCATGTTGGAGACTTGGGCAATGTGACTGCTGACAAAGATGGTGTGGCCGATGTGTCTATTGAAGATTCTGTGATCTCACTCTCAGGAGACCATTGCATCATTGGCCGCACACTGGTGGTCCATGAAAAAGCAGATGACTTGGGCAAAGGTGGAAATGAAGAAAGTACAAAGACAGGAAACGCTGGAAGTCGTTTGGCTTGTGGTGTAATTGGGATCGCCCAAGCTAGCGGTGGCGGAGGGTCTGGTGGCGGAGGGTCCGGTGGCGGAGGGTCAGAGCTCCCGGAGCCACCAGTTAACTCGTATCTACCTCCGTCCGATAGCTATGGAGCACCGGGTCAGAGTGGTCCCGGCGGCAGGCCGTCGGATTCCTATGGAGCACCTGGTGGTGGAAACGGTGGACGGCCCTCAGACAGCTATGGCGCTCCAGGCCAGGGTCAAGGACAGGGACAAGGACAAGGTGGATATGCAGGCAAGCCCTCAGATACCTATGGAGCCCCTGGTGGTGGAAATGGCAACGGAGGTCGTCCATCGAGCAGCTATGGCGCTCCTGGCGGTGGAAACGGTGGTCGTCCTTCGGATACCTACGGTGCTCCTGGTGGCGGAAATGGTGGACGCCCATCGGACACTTATGGTGCTCCTGGTGGTGGTGGAAATGGCAACGGCGGACGACCTTCAAGCAGCTATGGAGCGCCTGGTCAAGGACAAGGCAACGGAAATGGCGGTCGCTCATCGAGCAGCTATGGTGCTCCTGGCGGTGGAAACGGCGGTCGTCCTTCGGATACCTACGGTGCTCCCGGTGGTGGAAACGGTGGTCGTCCTTCGGATACTTACGGCGCTCCTGGTGGCGGCAATAATGGCGGTCGTCCCTCAAGCAGCTACGGCGCTCCTGGTGGTGGAAACGGTGGTCGTCCATCTGACACCTATGGCGCTCCTGGTGGCGGTAACGGAAACGGCAGCGGTGGTCGTCCTTCAAGCAGCTATGGAGCACCTGGTCAGGGCCAAGGTGGATTTGGTGGTCGTCCATCGGACTCCTATGGTGCTCCTGGTCAGAACCAAAAACCATCAGATTCATACGGCGCCCCTGGTAGCGGCAATGGCAACGGCGGACGTCCTTCGAGCAGCTATGGAGCCCCAGGCTCAGGACCTGGTGGCCGACCCTCCGACTCCTACGGACCCCCAGCTTCTGGA AAGCTT。
实施例2：扩大培养表达SOD-Linker-Rec的大肠杆菌
（1）将新鲜转化的重组大肠杆菌转移至有50 μg/mL卡那霉素的固体LB培养基（琼脂粉15g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH7.4）中，并在37 ℃下培养过，然后将过夜培养后的单个菌落转移至5ml 含有50 μg/ mL卡那霉素的液体LB培养基（胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，pH7.4）中，并在37 ℃，200 rpm的轨道振荡器中培养过夜，接着将3 mL过夜培养的细菌接种在300 mL 含50 μg/mL卡那霉素的液体LB培养基在37 ℃，200 rpm下生长3小时或细菌的OD600达到0.4-0.6之间。
（2）将步骤（1）中最终得到的液体培养基置于冰上20分钟，向其中添加异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）至终浓度0.4 mM，然后分别在16 ℃，25 ℃和37 ℃以180rpm摇动培养16-20h（过夜）来诱导重组超氧化物歧化酶SOD-Linker-Rec表达。最后将液体培养基在3000 rpm，4 ℃下离心20分钟弃上清，得到不同温度下培养的细胞沉淀物，将其保存在-80 ℃备用。
（3）将步骤（2）中三种培养温度下得到的细胞沉淀物解冻，分别重悬于10 mLTris-HCl（50 mM，pH 8.0）中，并在3000 rpm，4 ℃下离心20分钟后弃上清，收集菌体，菌体用50 mM pH值为8.0的Tris-HCl洗涤两次。然后将细胞重悬于含1 mM PMSF（200 μL）的20mL Tris-HCl缓冲液中，并使用超声细胞破碎仪在冰上超声裂解30分钟，接着6 s交替超声处理，并间歇冷却6 s。最后将得到的含细胞沉淀物的溶液在4 ℃下13000 rpm离心30分钟，重复两次，从沉淀物中分离出含有上清液的可溶性蛋白，即重组超氧化物歧化酶SOD-Linker-Rec。
为了确定以可溶形式或包涵体形式表达的目标蛋白质的性质，将沉淀重悬于2 mLTris-HCl缓冲液中，分别保存部分上述得到的裂解液，上清液和沉淀用于SDS-PAGE分析。结果如图2所示，在25 ℃诱导条件下，SOD-Linker-Rec上清中50 kDa位置处明显增加一条条带，表明诱导成功，获得可溶性重组超氧化物歧化酶SOD-Linker-Rec。
实施例3：冷却凝集纯化重组超氧化物歧化酶SOD-Linker-Rec
本实施例中利用冷却凝集来纯化SOD，以此验证实施例2中制备的SOD的自纯化性能及其纯化效率。将适量浓度为0.3-2.0 M的(NH4)2SO4加到500 μL含有上清液的可溶性蛋白中，混匀后置于冰上30-60 min，然后4 ℃，12000 rmp离心15 min，分离上清和沉淀，沉淀重悬于Tris-HCl（50 mM，pH值为8.0）缓冲液。将重悬的Tris-HCl缓冲液置于0、4 ℃放置1、2、12、24 h，观察出现凝聚层，吸取凝聚层即目标蛋白。将凝聚层转移到新的EP管中。保存一部分纯化的样品用于SDS-PAGE分析。
图2为将重悬的Tris-HCl缓冲液置于不同温度放置不同时间的SDS-PAGE图，图中，M：蛋白Marker；Ctr：对照（含pet28a（+））诱导8 h表达全菌；lys：pET28a（+）-SOD-Linker-Rec诱导8 h表达全菌；sup：含SOD-Linker- Rec上清；pel：含SOD-Linker- Rec沉淀。从图中可以看出，0 ℃放置12-24 h纯化效果最佳。
图3是不同温度放置不同时间纯化后的SOD-Linker-Rec回收率与纯化倍数，从图中可以看出，0℃下放置12h的SOD-Linker-Rec的纯化倍数和回收率达到最高，此时纯化倍数为11.34，回收率达到91.74%，放置24h的SOD-Linker-Rec的纯化倍数和回收率虽略有下降，但仍能纯化倍数仍能达到9.52，回收率达到87.12%，可见，SOD-Linker-Rec在0 ℃放置12-24 h纯化效果最佳。
实施例4：不同温度下重组超氧化物歧化酶SOD-Linker-Rec酶活
本实施例中采用使用经典的氮蓝四唑(NBT)显色法检测试剂盒（碧云天生物技术，上海）来检测构建得到的重组超氧化物歧化酶SOD-Linker-Rec的活性。由于试剂盒中的黄嘌呤(Xanthine)及黄嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase, Xo)反应系统产生超氧阴离子(O2-)，会将氮蓝四唑还原为蓝色的甲臜(formazan)，甲臜在560 nm处有强吸收，但SOD会清除超氧阴离子，进而抑制甲臜的形成，可据此进行比色分析计算出重组超氧化物歧化酶活性水平。当反应液蓝色愈深，超氧化物歧化酶活性愈低，反之则酶活性愈高。
具体的酶活检测方法如下：
根据氮蓝四唑(NBT)显色法检测试剂盒的说明书，事先制备WST-8/酶工作液和反应起始液，进行预试验确定SOD的最佳量，以便SOD的抑制率在30%和70%之间。将20 μL SOD、160 μL WST-8/酶工作液和20 μL反应起始液混合，在37 ℃孵育30 min后560 nm处检测吸光度。按照试剂盒说明书中的公式计算SOD的酶活性。
抑制百分率＝ (A空白对照1-A样品)/(A空白对照1-A空白对照2)×100%
待测样品中SOD酶活力单位＝抑制百分率/(1-抑制百分率) units
不同温度下重组超氧化物歧化酶SOD-Linker-Rec酶活检测如下：
制备不添加Rec的SOD-Linker作为对照组，所述SOD-Linker的制备方法与实施例3中制备SOD-Linker-Rec的方法基本相似，仅不添加Rec。
将相同质量的SOD-Linker-Rec酶和SOD-Linker酶分别与160 μL ST-8/酶工作液在20、25、30、35、40、45、50、55、60、70 ℃中预热10 min，然后加入20 μL反应起始液，在20~80℃下孵育30 min后560 nm处检测吸光度，通过上述公式计算SOD-Linker-Rec酶和SOD-Linker酶活。然后以反应中最大酶活为100%，其它酶活与其作百分比，绘制温度相对酶活性的图。
图4为SOD-Linker-Rec和SOD-Linker在不同温度下酶活，从图中可以看出，测定的温度范围内，在相同温度下，SOD-Linker-Rec的酶活高于SOD-Linke，可见，SOD-Linker-Rec比SOD-Linker更加稳定。
实施例5：重组超氧化物歧化酶的热和储存稳定性
将等量实施例3中获得的SOD-Linker-Rec和SOD-Linker在无反应液情况下分别在不同温度（20-70 ℃）中放置30 分钟，然后将酶转移到冰上调整酶温度，12000 rpm离心10分钟，去除变性和沉淀的蛋白质，按实施例4所述方法测定酶活，以最高点酶活作为100%，其它酶活值与最高点酶活值作比较，绘制不同温度对相对活性的曲线。
图5（A）为SOD-Linker-Rec和SOD-Linker的热稳定性图，SOD-Linker-Rec和SOD-Linker在不同温度下的相对酶活，从图中可以看出，当温度升高到50 ℃时，SOD-Linker-Rec酶活性只有15%，SOD-Linker酶仍可以保持80%活性，由此可以得出，本发明所制备的SOD-Linker-Rec具有良好的热稳定性。
本实施例中还考察了SOD-Linker-Rec和SOD-Linker-的储存稳定性，具体方法如下所示：将SOD-Linker-Rec和SOD-Linker酶各准备两份，一份存放在4 ℃，另一份25 ℃中保存，分别储存0、4、8、12、16、20、24天后，按照实施例4所述方法检测酶活，并以最高点酶活为100%，其它酶活与最高点酶活作比较，同时绘制时间对相对酶活的曲线。
图5（B）为SOD-Linker-Rec和SOD-Linker的储存稳定性图，即SOD-Linker-Rec和SOD-Linker在储存不同天数时的相对酶活，从图中可以看出不管是在4 ℃下还是在25 ℃下条件下，SOD-Linker-Rec酶的活性均高SOD-Linker酶活性。
综上，SOD-Linker-Rec酶的热和储存稳定性都明显高于SOD-Linker酶。可见，本发明制备的SOD-Linker-Rec酶的热和储存稳定性显著提高，同时可以简单、快速、高效地自我分离纯化。
所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏大学
<120> 一种重组超氧化物歧化酶及其构建方法和应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 478
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ala Thr Lys Ala Val Cys Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro Val Gln
1 5 10 15
Gly Ile Ile Asn Phe Glu Gln Lys Glu Ser Asn Gly Pro Val Lys Val
20 25 30
Trp Gly Ser Ile Lys Gly Leu Thr Glu Gly Leu His Gly Phe His Val
35 40 45
His Glu Phe Gly Asp Asn Thr Ala Gly Cys Thr Ser Ala Gly Pro His
50 55 60
Phe Asn Pro Leu Ser Arg Lys His Gly Gly Pro Lys Asp Glu Glu Arg
65 70 75 80
His Val Gly Asp Leu Gly Asn Val Thr Ala Asp Lys Asp Gly Val Ala
85 90 95
Asp Val Ser Ile Glu Asp Ser Val Ile Ser Leu Ser Gly Asp His Cys
100 105 110
Ile Ile Gly Arg Thr Leu Val Val His Glu Lys Ala Asp Asp Leu Gly
115 120 125
Lys Gly Gly Asn Glu Glu Ser Thr Lys Thr Gly Asn Ala Gly Ser Arg
130 135 140
Leu Ala Cys Gly Val Ile Gly Ile Ala Gln Ala Ser Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Pro Glu Pro
165 170 175
Pro Val Asn Ser Tyr Leu Pro Pro Ser Asp Ser Tyr Gly Ala Pro Gly
180 185 190
Gln Ser Gly Pro Gly Gly Arg Pro Ser Asp Ser Tyr Gly Ala Pro Gly
195 200 205
Gly Gly Asn Gly Gly Arg Pro Ser Asp Ser Tyr Gly Ala Pro Gly Gln
210 215 220
Gly Gln Gly Gln Gly Gln Gly Gln Gly Gly Tyr Ala Gly Lys Pro Ser
225 230 235 240
Asp Thr Tyr Gly Ala Pro Gly Gly Gly Asn Gly Asn Gly Gly Arg Pro
245 250 255
Ser Ser Ser Tyr Gly Ala Pro Gly Gly Gly Asn Gly Gly Arg Pro Ser
260 265 270
Asp Thr Tyr Gly Ala Pro Gly Gly Gly Asn Gly Gly Arg Pro Ser Asp
275 280 285
Thr Tyr Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Asn Gly Asn Gly Gly Arg Pro
290 295 300
Ser Ser Ser Tyr Gly Ala Pro Gly Gln Gly Gln Gly Asn Gly Asn Gly
305 310 315 320
Gly Arg Ser Ser Ser Ser Tyr Gly Ala Pro Gly Gly Gly Asn Gly Gly
325 330 335
Arg Pro Ser Asp Thr Tyr Gly Ala Pro Gly Gly Gly Asn Gly Gly Arg
340 345 350
Pro Ser Asp Thr Tyr Gly Ala Pro Gly Gly Gly Asn Asn Gly Gly Arg
355 360 365
Pro Ser Ser Ser Tyr Gly Ala Pro Gly Gly Gly Asn Gly Gly Arg Pro
370 375 380
Ser Asp Thr Tyr Gly Ala Pro Gly Gly Gly Asn Gly Asn Gly Ser Gly
385 390 395 400
Gly Arg Pro Ser Ser Ser Tyr Gly Ala Pro Gly Gln Gly Gln Gly Gly
405 410 415
Phe Gly Gly Arg Pro Ser Asp Ser Tyr Gly Ala Pro Gly Gln Asn Gln
420 425 430
Lys Pro Ser Asp Ser Tyr Gly Ala Pro Gly Ser Gly Asn Gly Asn Gly
435 440 445
Gly Arg Pro Ser Ser Ser Tyr Gly Ala Pro Gly Ser Gly Pro Gly Gly
450 455 460
Arg Pro Ser Asp Ser Tyr Gly Pro Pro Ala Ser Gly Lys Leu
465 470 475
<210> 2
<211> 1434
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggcgacga aggccgtgtg cgtgctgaag ggcgacggcc cagtgcaggg catcatcaat 60
ttcgagcaga aggaaagtaa tggaccagtg aaggtgtggg gaagcattaa aggactgact 120
gaaggcctgc atggattcca tgttcatgag tttggagata atacagcagg ctgtaccagt 180
gcaggtcctc actttaatcc tctatccaga aaacacggtg ggccaaagga tgaagagagg 240
catgttggag acttgggcaa tgtgactgct gacaaagatg gtgtggccga tgtgtctatt 300
gaagattctg tgatctcact ctcaggagac cattgcatca ttggccgcac actggtggtc 360
catgaaaaag cagatgactt gggcaaaggt ggaaatgaag aaagtacaaa gacaggaaac 420
gctggaagtc gtttggcttg tggtgtaatt gggatcgccc aagctagcgg tggcggaggg 480
tctggtggcg gagggtccgg tggcggaggg tcagagctcc cggagccacc agttaactcg 540
tatctacctc cgtccgatag ctatggagca ccgggtcaga gtggtcccgg cggcaggccg 600
tcggattcct atggagcacc tggtggtgga aacggtggac ggccctcaga cagctatggc 660
gctccaggcc agggtcaagg acagggacaa ggacaaggtg gatatgcagg caagccctca 720
gatacctatg gagcccctgg tggtggaaat ggcaacggag gtcgtccatc gagcagctat 780
ggcgctcctg gcggtggaaa cggtggtcgt ccttcggata cctacggtgc tcctggtggc 840
ggaaatggtg gacgcccatc ggacacttat ggtgctcctg gtggtggtgg aaatggcaac 900
ggcggacgac cttcaagcag ctatggagcg cctggtcaag gacaaggcaa cggaaatggc 960
ggtcgctcat cgagcagcta tggtgctcct ggcggtggaa acggcggtcg tccttcggat 1020
acctacggtg ctcccggtgg tggaaacggt ggtcgtcctt cggatactta cggcgctcct 1080
ggtggcggca ataatggcgg tcgtccctca agcagctacg gcgctcctgg tggtggaaac 1140
ggtggtcgtc catctgacac ctatggcgct cctggtggcg gtaacggaaa cggcagcggt 1200
ggtcgtcctt caagcagcta tggagcacct ggtcagggcc aaggtggatt tggtggtcgt 1260
ccatcggact cctatggtgc tcctggtcag aaccaaaaac catcagattc atacggcgcc 1320
cctggtagcg gcaatggcaa cggcggacgt ccttcgagca gctatggagc cccaggctca 1380
ggacctggtg gccgaccctc cgactcctac ggacccccag cttctggaaa gctt 1434
<210> 3
<211> 154
<212> PRT
<213> 人(human)
<400> 3
Met Ala Thr Lys Ala Val Cys Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro Val Gln
1 5 10 15
Gly Ile Ile Asn Phe Glu Gln Lys Glu Ser Asn Gly Pro Val Lys Val
20 25 30
Trp Gly Ser Ile Lys Gly Leu Thr Glu Gly Leu His Gly Phe His Val
35 40 45
His Glu Phe Gly Asp Asn Thr Ala Gly Cys Thr Ser Ala Gly Pro His
50 55 60
Phe Asn Pro Leu Ser Arg Lys His Gly Gly Pro Lys Asp Glu Glu Arg
65 70 75 80
His Val Gly Asp Leu Gly Asn Val Thr Ala Asp Lys Asp Gly Val Ala
85 90 95
Asp Val Ser Ile Glu Asp Ser Val Ile Ser Leu Ser Gly Asp His Cys
100 105 110
Ile Ile Gly Arg Thr Leu Val Val His Glu Lys Ala Asp Asp Leu Gly
115 120 125
Lys Gly Gly Asn Glu Glu Ser Thr Lys Thr Gly Asn Ala Gly Ser Arg
130 135 140
Leu Ala Cys Gly Val Ile Gly Ile Ala Gln
145 150
<210> 4
<211> 462
<212> DNA
<213> 人(human)
<400> 4
atggcgacga aggccgtgtg cgtgctgaag ggcgacggcc cagtgcaggg catcatcaat 60
ttcgagcaga aggaaagtaa tggaccagtg aaggtgtggg gaagcattaa aggactgact 120
gaaggcctgc atggattcca tgttcatgag tttggagata atacagcagg ctgtaccagt 180
gcaggtcctc actttaatcc tctatccaga aaacacggtg ggccaaagga tgaagagagg 240
catgttggag acttgggcaa tgtgactgct gacaaagatg gtgtggccga tgtgtctatt 300
gaagattctg tgatctcact ctcaggagac cattgcatca ttggccgcac actggtggtc 360
catgaaaaag cagatgactt gggcaaaggt ggaaatgaag aaagtacaaa gacaggaaac 420
gctggaagtc gtttggcttg tggtgtaatt gggatcgccc aa 462
<210> 5
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggtggcggag ggtctggtgg cggagggtcc ggtggcggag ggtca 45
<210> 6
<211> 303
<212> PRT
<213> 果蝇(drosophilid)
<400> 6
Pro Glu Pro Pro Val Asn Ser Tyr Leu Pro Pro Ser Asp Ser Tyr Gly
1 5 10 15
Ala Pro Gly Gln Ser Gly Pro Gly Gly Arg Pro Ser Asp Ser Tyr Gly
20 25 30
Ala Pro Gly Gly Gly Asn Gly Gly Arg Pro Ser Asp Ser Tyr Gly Ala
35 40 45
Pro Gly Gln Gly Gln Gly Gln Gly Gln Gly Gln Gly Gly Tyr Ala Gly
50 55 60
Lys Pro Ser Asp Thr Tyr Gly Ala Pro Gly Gly Gly Asn Gly Asn Gly
65 70 75 80
Gly Arg Pro Ser Ser Ser Tyr Gly Ala Pro Gly Gly Gly Asn Gly Gly
85 90 95
Arg Pro Ser Asp Thr Tyr Gly Ala Pro Gly Gly Gly Asn Gly Gly Arg
100 105 110
Pro Ser Asp Thr Tyr Gly Ala Pro Gly Gly Gly Gly Asn Gly Asn Gly
115 120 125
Gly Arg Pro Ser Ser Ser Tyr Gly Ala Pro Gly Gln Gly Gln Gly Asn
130 135 140
Gly Asn Gly Gly Arg Ser Ser Ser Ser Tyr Gly Ala Pro Gly Gly Gly
145 150 155 160
Asn Gly Gly Arg Pro Ser Asp Thr Tyr Gly Ala Pro Gly Gly Gly Asn
165 170 175
Gly Gly Arg Pro Ser Asp Thr Tyr Gly Ala Pro Gly Gly Gly Asn Asn
180 185 190
Gly Gly Arg Pro Ser Ser Ser Tyr Gly Ala Pro Gly Gly Gly Asn Gly
195 200 205
Gly Arg Pro Ser Asp Thr Tyr Gly Ala Pro Gly Gly Gly Asn Gly Asn
210 215 220
Gly Ser Gly Gly Arg Pro Ser Ser Ser Tyr Gly Ala Pro Gly Gln Gly
225 230 235 240
Gln Gly Gly Phe Gly Gly Arg Pro Ser Asp Ser Tyr Gly Ala Pro Gly
245 250 255
Gln Asn Gln Lys Pro Ser Asp Ser Tyr Gly Ala Pro Gly Ser Gly Asn
260 265 270
Gly Asn Gly Gly Arg Pro Ser Ser Ser Tyr Gly Ala Pro Gly Ser Gly
275 280 285
Pro Gly Gly Arg Pro Ser Asp Ser Tyr Gly Pro Pro Ala Ser Gly
290 295 300
<210> 7
<211> 909
<212> DNA
<213> 果蝇(drosophilid)
<400> 7
ccggagccac cagttaactc gtatctacct ccgtccgata gctatggagc accgggtcag 60
agtggtcccg gcggcaggcc gtcggattcc tatggagcac ctggtggtgg aaacggtgga 120
cggccctcag acagctatgg cgctccaggc cagggtcaag gacagggaca aggacaaggt 180
ggatatgcag gcaagccctc agatacctat ggagcccctg gtggtggaaa tggcaacgga 240
ggtcgtccat cgagcagcta tggcgctcct ggcggtggaa acggtggtcg tccttcggat 300
acctacggtg ctcctggtgg cggaaatggt ggacgcccat cggacactta tggtgctcct 360
ggtggtggtg gaaatggcaa cggcggacga ccttcaagca gctatggagc gcctggtcaa 420
ggacaaggca acggaaatgg cggtcgctca tcgagcagct atggtgctcc tggcggtgga 480
aacggcggtc gtccttcgga tacctacggt gctcccggtg gtggaaacgg tggtcgtcct 540
tcggatactt acggcgctcc tggtggcggc aataatggcg gtcgtccctc aagcagctac 600
ggcgctcctg gtggtggaaa cggtggtcgt ccatctgaca cctatggcgc tcctggtggc 660
ggtaacggaa acggcagcgg tggtcgtcct tcaagcagct atggagcacc tggtcagggc 720
caaggtggat ttggtggtcg tccatcggac tcctatggtg ctcctggtca gaaccaaaaa 780
ccatcagatt catacggcgc ccctggtagc ggcaatggca acggcggacg tccttcgagc 840
agctatggag ccccaggctc aggacctggt ggccgaccct ccgactccta cggaccccca 900
gcttctgga 909

Claims (10)

1.一种重组超氧化物歧化酶，记为SOD-Linker-Rec，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.编码权利要求1所述的重组超氧化物歧化酶的核苷酸，其序列如SEQ ID NO:2所示。
3.权利要求1所述的重组超氧化物歧化酶的构建方法，其特征在于，所述构建方法为将超氧化物歧化酶与Rec通过接头Linker连接，得到重组超氧化物歧化酶SOD-Linker-Rec。
4.根据权利要求3所述的重组超氧化物歧化酶的构建方法，其特征在于，所述接头Linker为连接肽(GGGGS)3，其核酸序列如SEQ ID NO:5所示。
5.根据权利要求3所述的重组超氧化物歧化酶的构建方法，其特征在于，所述Rec的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，编码所述Rec的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
6.一种重组表达质粒pET28a（+）-SOD-Linker-Rec，其特征在于，所述质粒包括SEQ IDNO:2所示的核苷酸序列。
7.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌包括权利要求6所述的重组表达质粒或权利要求2所述的核苷酸。
8.一种制备重组超氧化物歧化酶的方法，其特征在于，所述方法为LB培养基中添加的IPTG诱导培养权利要求7所述的重组菌，利用(NH4)2SO4沉淀所述重组超氧化物歧化酶，然后悬于Tris-HCl中，静置反应，吸取凝聚层，即为纯化后的重组超氧化物歧化酶。
9.根据权利要求8所述的制备重组超氧化物歧化酶的方法，其特征在于，所述静置反应为在0~4℃下反应12~24h。
10.权利要求1所述的重组超氧化物歧化酶在制备抗氧化剂中的应用。
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