ES2330087T3 - Proteina analoga al factor de crecimiento de las lagrimas oculares. - Google Patents

Abstract

Composición que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 4, o un fragmento bioactivo de la misma, caracterizada porque el fragmento se une específicamente a al menos uno de los ligandos naturales de un polipéptido nativo de lacritina, así como un vehículo farmacéuticamente aceptable, caracterizada porque la composición es una formulación tópica oftálmica.

Description

Proteína análoga al factor de crecimiento de las lágrimas oculares.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una composición que comprende una nueva proteína ocular denominada lacritina. En una realización de la invención, se utilizan composiciones que comprenden lacritina para mejorar la curación de heridas en la córnea y/o para tratar pacientes con una producción lagrimal deficiente.

Antecedentes de la invención

La salud de la superficie ocular depende de las secreciones de fluido lagrimal procedentes de la glándula lacrimal. Las células acinares lagrimales que se encuentran en la glándula lacrimal son células secretoras de lágrimas polarizadas y muy diferenciadas que se adhieren a una membrana basal periacinar compleja. La masa del citoplasma de las células apicales contiene grandes gránulos secretores repletos de proteínas lagrimales. Las proteínas lagrimales conocidas incluyen: lisozimas, que desempeñan un papel bactericida destacado en la superficie de la córnea; lactoferrina, que funciona como agente bactericida y como inhibidor potencial de la activación complementaria; un componente secretor, que regula el movimiento transcelular de IgA en el lumen de los acinos, actuando en la superficie de la córnea para inhibir la adhesión bacteriana; y lipocalinas lagrimales (prealbúmina específica de las lágrimas) y factores de crecimiento TGF\alpha, TGF\beta y EGF, cuyas funciones se desconocen. En la rata, la peroxidasa es un componente lagrimal que sirve de marcador adecuado en estudios experimentales. No sólo las lágrimas tienen un papel bactericida importante, sino que también mantienen la córnea limpia y lubricada y son importantes para el bienestar del epitelio corneal.

Cuando la producción de lágrimas de las células acinares lacrimales es en conjunto deficiente, el resultado es un "ojo seco" (también conocido como queratoconjuntivitis Sica [KCS]). El ojo seco es una manifestación ocular común del síndrome de Sjögren, enfermedad autoinmune de etiología desconocida que afecta a millones de personas en el mundo. Las personas más comúnmente afectadas son mujeres post-menopáusicas con varios grados de gravedad. Si no se trata, el ojo seco puede conducir a una abrasión, ulceración, infección bacteriana de la córnea y pérdida de la visión. Los mecanismos moleculares subyacentes al descenso patogénico de la producción secretora por la principal glándula lacrimal son potencialmente múltiples. Las glándulas lacrimales de los pacientes con síndrome de Sjögren contienen focos de linfocitos B y T, cuya expansión patógena, posiblemente debida a un insulto viral, puede destruir los acinos lacrimales. Sin embargo, la pérdida de volumen acinar a menudo parece insuficiente en cuanto a la sobrecapacidad teórica de la principal glándula lacrimal. Diversos estudios sugieren una producción secretora potencial hasta diez veces más alta de la necesaria para mantener una capa acuosa normal en la película lacrimal. Por ello, otros mecanismos merecen atención, por ejemplo la secreción aberrante de una o varias citoquinas comunes que pueden alterar directa o indirectamente la función lacrimal de las células acinares y/o conducir a un descenso en la inervación neural. Puede(n) ser necesario(s) nuevo(s) factor(es) autocrino(s)/paracrino(s) liberado(s) por las células acinares lagrimales en la película lagrimal para la salud del mecanismo secretor de lágrimas, el sistema ductal y el epitelio corneal. También es necesaria la membrana basal periacinar para la función secretora normal, en parte a través de "BM180", cuya sinergia aparente con la laminina-1 favorece la estimulación de la secreción de lágrimas. La alteración de cada uno de estos factores, conjunta o independientemente de los cambios hormonales, podría contribuir a la reducción de la capacidad secretora.

Los protocolos existentes para tratar el ojo seco tienen varias limitaciones. En particular, los fluidos de sustitución lacrimal artificiales tópicos son ampliamente distribuidos por numerosas compañías farmacéuticas, pero su eficacia es escasa y dura poco. Esta falta de eficacia se debe en parte al hecho de que los constituyentes de las lágrimas humanas naturales son sólo parcialmente conocidos.

La presente invención se dirige a una nueva glicoproteína extracelular humana denominada "lacritina" que se ve notablemente reducida en el síndrome de Sjögren. Además, se ha descubierto que la lacritina actúa de forma autocrina para aumentar la secreción lacrimal "inestimulada" (pero no estimulada). La lacritina es producida por las células acinares lacrimales y es liberada en su mayor parte en el fluido lacrimal, de forma muy similar a los TGF\beta expresados en las células acinares. Esta glicoproteína actúa como un factor de crecimiento cuando se añade en su forma recombinante purificada a cultivos de células epiteliales humanos de córnea y, en un mecanismo de reacción, parece que actúa también sobre las mismas células de la glándula lacrimal que la producen. En consecuencia, en una realización de la presente invención, se incluye la lacritina como agente activo en productos de lágrimas artificiales.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere al aislamiento y caracterización de una nueva proteína de la glándula lacrimal como componente de una composición. La lacritina recombinante purificada posee actividad como factor de crecimiento tanto en las células epiteliales corneales humanas como en las células acinares lacrimales que la producen. Por consiguiente, en una realización de la presente invención, se proporciona una utilización para preparar un medicamento para tratar el ojo seco y otros trastornos que requieren la humidificación del ojo mediante la administración de composiciones que comprenden un polipéptido de lacritina.

Breve descripción de las figuras

Fig. 1: es una representación gráfica que demuestra que la lacritina recombinante incrementa la secreción no estimulada por las células acinares lacrimales aisladas en la rata. Se observó un aumento de la secreción no estimulada en presencia de cantidades progresivas de lacritina en pocillos recubiertos de lacritina.

Fig. 2A y 2B: representan la proliferación inducida por la lacritina y la fosforilación de la tirosina. La Fig. 2A es una representación gráfica del número de células de las glándulas salivares humanas (HSG) que se determinó cuatro días después de la administración de diversas cantidades de lacritina (0 a 10 ng/ml de lacritina) a las células HSG en un medio exento de suero. La Fig. 2B es un gráfico de barras que representa la proliferación de las células HSG al administrar BSA (barra 1; 10 ng/ml) o suero (barra 2; 10%), que se añadió durante el mismo período de tiempo. Todos los experimentos se realizaron en pocillos recubiertos de laminina-1 (0,05 \muM).

Descripción detallada de la invención Definiciones

En la descripción y reivindicaciones de la invención se empleará la siguiente terminología de acuerdo con las definiciones establecidas a continuación.

Tal como se utiliza aquí, "ácido nucleico", "ADN" y términos similares incluyen también análogos de ácido nucleico, es decir análogos que tienen un esqueleto diferente del de fosfodiéster. Por ejemplo, los llamados "ácidos nucleicos peptídicos" que son conocidos en la técnica y que tienen enlaces peptídicos en lugar de enlaces de fosfodiéster en su esqueleto se consideran como formando parte del alcance de la presente invención.

El término "péptido" abarca una secuencia de 3 o más aminoácidos donde los aminoácidos son de origen natural o sintético (de origen no natural). Los péptidos miméticos incluyen péptidos con una o más de las siguientes modificaciones:

1.

péptidos en los que una o más de las uniones (enlaces) peptidilo -C(O)NR- se han sustituido por un enlace no peptidilo, tal como un enlace -CH_{2}-carbamato (-CH_{2}OC(O)NR-), un enlace fosfonato, un enlace -CH_{2}-sulfonamida (-CH_{2}-S(O)_{2}NR-), un enlace urea (-NHC(O)NH-), un enlace -CH_{2}-amina secundaria o con un enlace peptidilo alquilado (-C(O)NR-) donde R es alquilo(C_{1}-C_{4});

2.

péptidos en los que el N-terminal es derivatizado a un grupo -NRR1, a un grupo -NRC(O)R, a un grupo -NRC(O)OR, a un grupo -NRS(O)_{2}R, a un grupo -NHC(O)NHR, siendo R y R1 hidrógeno o alquilo(C_{1}-C_{4}), a condición de que R y R1 no sean ambos hidrógeno;

3.

péptidos en los que el C-terminal es derivatizado a -C(O)R2, donde R2 se selecciona de entre el grupo consistente en alcoxi(C_{1}-C_{4}), y -NR3R4 donde R3 y R4 se seleccionan, independientemente, de entre el grupo consistente en hidrógeno y alquilo(C_{1}-C_{4}).

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Los residuos aminoácidos de origen natural en los péptidos se abrevian según las recomendaciones de la IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission como sigue: Fenilalanina es Phe o F; Leucina es Leu o L; Isoleucina es Ile o I; Metionina es Met o M; Norleucina es Nle; Valina es Val o V; Serina es Ser o S; Prolina es Pro o P; Treonina es Thr o T; Alanina es Ala o A; Tirosina es Tyr o Y; Histidina es His o H; Glutamina es Gln o Q; Asparagina es Asn o N; Lisina es Lys o K; Ácido Aspártico es Asp o D; Ácido Glutámico es Glu o E; Cisteína es Cys o C; Triptófano es Trp o W; Arginina es Arg o R; Glicina es Gly o G, y X es cualquier aminoácido. Otros aminoácidos de origen natural incluyen, a modo de ejemplo, 4-hidroxiprolina, 5-hidroxilisina y similares.

Los aminoácidos de origen sintético o no natural se refieren a aminoácidos que no son de origen natural in vivo pero que, sin embargo, se pueden incorporar en las estructuras peptídicas descritas aquí. El "péptido sintético" resultante contiene aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos de origen natural, genéticamente codificados en una, dos o más posiciones de los péptidos. Por ejemplo, la naftilalanina puede ser sustituida por triptófano para facilitar la síntesis. Otros aminoácidos sintéticos que se pueden convertir en péptidos incluyen L-hidroxipropilo, L-3,4-dihidroxifenilalanilo, alfa-aminoácidos tales como L-alfa-hidroxilisilo y D-alfa-metilalanilo, L-alfa-metilalanilo, beta-aminoácidos, e isoquinolilo. Los D-aminoácidos y aminoácidos de origen no natural sintéticos se pueden incorporar también en los péptidos. Otros derivados incluyen la sustitución de las cadenas laterales de origen natural de los 20 aminoácidos genéticamente codificados (o cualquier L o D aminoácido) por otras cadenas laterales.

Tal como se emplea aquí, el término "sustitución conservadora de aminoácidos" se define aquí como los intercambios dentro de uno de los cinco grupos siguientes:

I.

Pequeños residuos alifáticos, no polares o ligeramente polares:

Ala, Ser, Thr, Pro, Gly;

II

Residuos polares cargados negativamente y sus amidas:

Asp, Asn, Glu, Gln;

III

Residuos polares cargados positivamente:

His, Arg, Lys;

IV.

Grandes residuos alifáticos no polares:

Met, Leu, Ile, Val, Cys;

V

Grandes residuos aromáticos:

Phe, Tyr, Trp.

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Un "polienlazador" es una secuencia de ácido nucleico que comprende una serie de tres o más secuencias de reconocimiento diferentes para endonucleasas de restricción muy cercanas unas a otras (es decir menos de 10 nucleótidos entre cada sitio).

Tal como se emplea aquí, el término "vector" se utiliza con referencia a moléculas de ácido nucleico que tienen la capacidad de replicarse de forma autónoma en una célula huésped y que pueden ser opcionalmente capaces de transferir uno o más segmentos de ADN de una célula a otra. Se pueden utilizar los vectores para introducir ADN extraño en células huésped donde se pueden replicar (es decir, reproducir) en grandes cantidades. Ejemplos de vectores incluyen plásmidos, cósmidos, vectores de fago lambda, vectores virales (tales como vectores retrovirales).

Tal como se emplea aquí, un "gen" se refiere a una secuencia codificante de ácido nucleico así como a los elementos reguladores necesarios para que la secuencia de ADN se transcriba en ARN mensajero (mARN) y se traduzca después en una secuencia de aminoácidos característica de un polipéptido específico.

Un "marcador" es un átomo o molécula que permite la detección específica de una molécula que comprende aquel marcador en presencia de moléculas similares sin este marcador. Los marcadores incluyen, por ejemplo, isótopos radioactivos, determinantes antigénicos, ácidos nucleicos disponibles para la hibridación, cromóforos, fluoróforos, moléculas quimioluminiscentes, moléculas electroquímicamente detectables, moléculas que proporcionan una polarización de fluorescencia alterada o una dispersión de la luz alterada y moléculas que permiten el aumento de supervivencia de una célula u organismo (es decir un marcador seleccionable). Un gen reportero es un gen que codifica para un marcador.

Un promotor es una secuencia de ADN que dirige la transcripción de una secuencia de ADN, tal como la secuencia codificante del ácido nucleico de un gen. Típicamente, un promotor está situado en la región 5' de un gen, cerca del sitio de inicio transcripcional de un gen estructural. Los promotores pueden ser inducibles (la velocidad de transcripción cambia en respuesta a un agente específico), específicos de tejido (expresados solamente en algunos tejidos), específicos temporales (expresados solamente en algunos momentos) o constitutivos (expresados en todos los tejidos y a una velocidad de transcripción constante).

Un núcleo promotor contiene secuencias de nucleótidos esenciales para la función del promotor, incluyendo la caja TATA y el inicio de la transcripción. Según esta definición, un núcleo promotor puede tener o no una actividad detectable en ausencia de secuencias específicas que mejoran la actividad o confieren una actividad específica al tejido.

Un "intensificador" es un elemento regulador de ADN que puede incrementar la eficacia de transcripción sin tener en cuenta la distancia u orientación del intensificador con respecto al sitio de inicio de la transcripción.

Tal como se emplean aquí, los términos "complementario" o "complementaridad" se utilizan con referencia a los polinucleótidos (es decir, una secuencia de nucleótidos) relacionados por las reglas de apareamiento de bases. Por ejemplo, la secuencia "A-G-T" es complementaria de la secuencia "T-C-A".

Tal como se emplea aquí, el término "hibridación" se utiliza con referencia al apareamiento de ácidos nucleicos complementarios. La hibridación y la fuerza de hibridación (es decir, la fuerza de asociación entre los ácidos nucleicos) se ve afectada por factores tales como el grado de complementariedad entre los ácidos nucleicos, la severidad de las condiciones implicadas, la longitud del híbrido formado y la relación G:C dentro de los ácidos nucleicos.

Tal como se emplea aquí, el término "purificado" y similares se refieren al aislamiento de una molécula o compuesto en una forma que está sustancialmente exenta de los contaminantes normalmente asociados a la molécula o compuesto en un entorno nativo o natural.

Tal como se emplea aquí, el término "polipéptido de lacritina" y similares se refieren a péptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos SEQ. ID. NO. 4 y fragmentos biológicamente activos de la misma.

Tal como se emplea aquí, el término "fragmentos biológicamente activos" o "fragmento bioactivo" de un polipéptido de lacritina abarca partes naturales o sintéticas de la secuencia de aminoácidos MKFTTLLFLAAVAGALVYA
EDASSDSTGADPAQEAGTSKPNEEISGPAEPASPPETTTTAQETSAAAVQGTAKVTSSRQELNPLKSIVEKSILL
TEQALAKAGKGMHGGVPGGKQFIENGSEFAQKLLKKFSLLKPWA (SEQ. ID. NO. 4) que son capaces de una unión específica a al menos uno de los ligandos naturales del polipéptido nativo de lacritina.

"Unido de forma operable" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes están configurados para realizar su función habitual. Así, las secuencias de control o los promotores unidos operablemente a un secuencia codificante son capaces de efectuar la expresión de la secuencia codificante.

Tal como se emplea aquí, el término "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera de los vehículos farmacéuticos estándar, tales como soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua y emulsiones tales como emulsiones aceite/agua o agua/aceite, así como diversos tipos de agentes humectantes.

Tal como se emplea aquí, el término "tratamiento" incluye el alivio de los síntomas asociados a un trastorno o condición específica y/o la prevención o eliminación de dichos síntomas.

La invención

La presente invención se refiere a composiciones que comprenden lacritina, una nueva molécula análoga al factor de crecimiento humano. La longitud total del cADN de la lacritina ha sido clonada a partir de una librería de glándulas lacrimales humanas (SEQ. ID. NO. 2) y el gen genómico correspondiente (SEQ. ID. NO. 1) ha sido clonado y secuenciado, incluyendo 5,2 kb de la secuencia genómica aguas arriba y 2,8 kb aguas abajo.

En una realización, la presente invención se dirige al objeto en base a un polipéptido purificado que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 4, un fragmento bioactivo de la SEQ ID NO. 4, o la secuencia de aminoácidos que difiere de la SEQ ID NO. 4 en una o más sustituciones conservadoras de aminoácidos. Preferentemente, el polipéptido purificado comprende una secuencia de aminoácido que difiere de la SEQ ID NO. 4 en 20 o menos sustituciones conservadoras de aminoácidos y especialmente en 10 o menos sustituciones conservadoras de aminoácidos. Alternativamente, el polipéptido puede comprender una secuencia de aminoácidos que difiere de la SEQ ID NO. 4 en 1 a 5 alteraciones, donde las alteraciones se seleccionan, independientemente, de una única deleción, inserción o sustitución de aminoácidos. En una realización preferente, se proporciona una composición que comprende un polipéptido de SEQ ID NO. 4 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La lacritina posee actividad mitogénica, incrementa la secreción "inestimulada" pero no estimulada y favorece la señalización tanto en las células acinares lacrimales como en las epiteliales corneales. La lacritina recombinante preparada en E. coli activa específica y rápidamente tanto las células epiteliales corneales humanas como las células acinares lacrimales del ratón y la rata, éstas últimas de forma autocrina, para intensificar la síntesis lacrimal. La lacritina es activa a niveles de ng/ml y no es detectable el LPS (endotoxina) bacteriano contaminante. La actividad de la lacritina recombinante purificada indica que actúa como factor de crecimiento tanto en células epiteliales corneales humanas como en las células acinares lacrimales que la producen. Notablemente, la lacritina actúa similarmente a un factor de crecimiento solamente en el ojo y, en menor medida, en la glándula salival. Estos efectos beneficiosos específicos de órgano se pueden utilizar para aumentar drásticamente la eficacia de los productos lacrimales tópicos artificiales disponibles actualmente.

Los suplementos lacrimales actuales no son muy populares entre los pacientes, en parte debido a que el alivio obtenido con estos productos es muy breve (menos de 15 min). Ejemplos de aproximación para la sustitución lacrimal incluyen el uso de soluciones salinas tamponadas, isotónicas, soluciones acuosas que contienen polímeros solubles en agua que transforman las soluciones en más viscosas y, por tanto, se derraman con menos facilidad en el ojo. Se intenta también la reconstitución de las lágrimas proporcionando uno o más componentes de la película lagrimal, tales como fosfolípidos y aceites. Los ejemplos de estas aproximaciones de tratamiento se describen en la patente de Estados Unidos Nº 4.131.651 (Shah y col.), la patente de Estados Unidos Nº 4.370.325 (Packman), la patente de Estados Unidos Nº 4.409.205 (Shively), las patentes de Estados Unidos Nº 4.744.980 y 4.883.658 (Holly), la patente de Estados Unidos Nº 4.914.088 (Glonek), la patente de Estados Unidos Nº 5.075.104 (Gressel y col.) y la patente de Estados Unidos Nº 5.294.607 (Glonek y col.), cuyas descripciones se incluyen aquí. Las formulaciones oftálmicas existentes pueden incluir también TGF-beta, corticoides o andrógenos. Son todos no específicos para el ojo y tienen efectos sistémicos. Por el contrario, la lacritina está altamente restringida al ojo y es un constituyente natural de las lágrimas humanas y de la película lacrimal.

Es muy deseable una formulación oftálmica que comprenda lacritina (por ejemplo fluidos lacrimales artificiales que contienen lacritina) debido a la actividad de la lacritina y sus efectos localizados. De acuerdo con una realización de la invención, se utilizan composiciones que comprenden lacritina para mejorar la curación de heridas en la córnea y/o para tratar pacientes con una producción deficiente de lágrimas. Más en particular, de acuerdo con una realización se utiliza la lacritina para tratar el síndrome del ojo seco, incluyendo el síndrome de Sjögren, y para mejorar la curación de heridas en la córnea, mediante la aplicación tópica de composiciones que comprenden el polipéptido de lacritina. De acuerdo con una realización, la composición incluye un vehículo farmacéuticamente aceptable y se utiliza una cantidad farmacéuticamente eficaz del polipéptido sustancialmente puro que comprende la secuencia de aminoácidosd SEQ ID NO. 4 para tratar el síndrome del ojo seco.

Las composiciones con lacritina de la presente invención se pueden formular utilizando componentes oftálmicos estándar y, preferentemente, se formulan como soluciones, suspensiones y otras formas de dosificación de administración tópica. En general, son preferentes las soluciones acuosas, en base a su facilidad de formulación, compatibilidad biológica (especialmente teniendo en cuenta la enfermedad que ha de ser tratada, por ejemplo enfermedades y trastornos del tipo ojo seco), así como la capacidad del paciente para administrarse fácilmente estas composiciones por instilación de una a dos gotas de las soluciones en los ojos afectados. Sin embargo, las composiciones pueden ser también suspensiones, geles viscosos o semiviscosos u otros tipos de composiciones sólidas o semisólidas.

Las composiciones de la presente invención pueden incluir agentes tensioactivos, conservantes, antioxidantes, agentes de tonicidad, tampones, conservantes, codisolventes y agentes para aumentar la viscosidad. Se pueden emplear en las presentes composiciones diversos agentes tensioactivos útiles en las formulaciones oftálmicas tópicas. Estos agentes tensioactivos pueden ayudar previniendo la degradación química de la lacritina y también que la lacritina se enlace a los recipientes en los que están envasadas las composiciones. Ejemplos de agentes tensioactivos que se pueden utilizar en las composiciones incluyen, pero no se limitan a, Cremophor.RTM.EL, polioxil-20 cetoestearil éter, polioxil-40 aceite de ricino hidrogenado, polioxil-23 lauril éter y poloxamer-407. Se pueden añadir antioxidantes a las composiciones de la presente invención para proteger el polipéptido de lacritina contra la oxidación durante el almacenamiento. Ejemplos de estos antioxidantes incluyen, pero no se limitan a, vitamina E y análogos de la misma, ácido ascórbico y derivados e hidroxianisol butilado (BHA).

Las formulaciones de lágrimas artificiales existentes se pueden utilizar también como vehículos farmacéuticamente aceptables para el agente activo de lacritina. Por tanto, en una realización, se utiliza lacritina para mejorar los productos existentes de lágrimas artificiales para el síndrome del ojo seco, así como para desarrollar productos de ayuda a la curación de heridas en la córnea. Ejemplos de composiciones para lágrimas artificiales útiles como vehículos incluyen, pero no se limitan a, productos comerciales tales como Tears Naturale.RTM., Tears Naturale II.RTM, Tears Naturale Free.RTM, y Bion Tears.RTM. (Alcon Laboratories, Inc., Fort Worth, Tex.). Ejemplos de otras formulaciones como vehículo fosfolipídico incluyen aquellas descritas en la patente de Estados Unidos Nº 4.804.539 (Guo y col.), la patente de Estados Unidos Nº 4.883.658 (Holly), la patente de Estados Unidos Nº 4.914.088 (Glonek), la patente de Estados Unidos Nº 5.075.104 (Gressel y col.), la patente de Estados Unidos Nº 5.278.151 (Korb y col.), la patente de Estados Unidos Nº 5.294.607 (Glonek y col.), la patente de Estados Unidos Nº 5.371.108 (Korb y col.), la patente de Estados Unidos Nº 5.578.586 (Glonek y col.); las patentes mencionadas anteriormente se incorporan aquí como referencia en la medida en que describen composiciones fosfolipídicas útiles como vehículos fosfolipídicos de la presente invención.

Se pueden añadir también otros compuestos a las composiciones oftálmicas de la presente invención para incrementar la viscosidad del vehículo. Ejemplos de agentes de aumento de la viscosidad incluyen, pero no se limitan a, polisacáridos tales como ácido hialurónico y sus sales, sulfato de condroitina y sus sales, dextranos, diversos polímeros de la familia de la celulosa; polímeros vinílicos y polímeros de ácido acrílico. En general, el vehículo fosfolipídico o las composiciones vehículo de lágrimas artificiales tendrán una viscosidad de 1 a 400 centipoises (cps). Las composiciones preferentes que contienen lágrimas artificiales o vehículos fosfolipídicos tendrán una viscosidad de aproximadamente 25 cps.

Los productos oftálmicos tópicos normalmente se envasan en formas multidosis. Por tanto, se requieren conservantes para impedir la contaminación microbiana durante el uso. Los conservantes adecuados incluyen cloruro de benzalconio, clorobutanol, bromuro de benzododecinio, metilparaben, propilparaben, alcohol feniletílico, edetato de disodio, ácido sórbico, policuaternio-1 u otros agentes conocidos por los especialistas en la técnica. Estos conservantes se emplean típicamente a un nivel del 0,001 al 1,0% en peso/volumen. Las composiciones en dosis unitarias de la presente invención son estériles, pero típicamente no conservadas. Por tanto, en general estas composiciones no contendrán conservantes.

En los humanos, la lacritina es producida por la glándula lacrimal (en grandes cantidades), la glándula salivar (moderadamente), en células basales del epitelio corneal (según inmunotinción de la córnea humana con anticuerpos anti-lacritina; y detección ELISA de la lacritina en cultivos de células epiteliales de córnea humana) y posiblemente en la tiroides, pero en ningún otro lugar. La lacritina aumenta la secreción "inestimulada" pero no estimulada, tiene una actividad mitogénica y favorece la señalización en las células tanto acinares lagrimales como epiteliales corneales. Esta glicoproteína tiene una distribución glandular altamente restringida y este modelo de expresión altamente restringido, en combinación con sus atributos funcionales, ponen de manifiesto su papel diferenciativo autocrino/paracrino putativo en la glándula lacrimal y el sistema ocular cercano.

Los experimentos fisiológicos utilizando lacritina recombinante generada por E. coli sugieren que probablemente se trata de un factor de crecimiento. La lacritina estimula la señalización del calcio en las células epiteliales de la córnea humana y en las células acinares lagrimales del ratón. Estimula la fosforilación de la tirosina en las células acinares lacrimales de rata y las células ductales salivales humanas y aumenta la cantidad de proteínas lacrimales liberadas de las mismas células acinares que la producen.

Se ha clonado la longitud total del cADN de la lacritina a partir de una librería de glándulas lacrimales humanas (SEQ. ID. NO. 2) y se ha clonado y secuenciado el gen genómico correspondiente (SEQ. ID. NO. 1), incluyendo 5,2 kb de la secuencia genómica aguas arriba y 2,8 kb aguas abajo. También ha sido parcialmente clonado por RT-PCR un gen homólogo de ratón y esta secuencia aislada del gen de lacritina de ratón posee una identidad del 99% con la secuencia humana. La expresión de la lacritina está notablemente restringida. Se exploraron cincuenta y dos poliA+ o RNA totales de distintos tejidos y se detectó mARN de lacritina solamente en las glándulas lacrimales (muy abundante), salivares (de escasa a moderada) y tiroides (escasa). Una revisión de la literatura sugiere que este nivel de control transcripcional es inigualable por cualquier otra proteína lagrimal.

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Ejemplo 1 Aislamiento del Gen de Lacritina cADN y Clonación Genómica de la Lacritina

Se prehibridaron filtros duplicados que contenían placas (5 x 10^{4} por filtro) procedentes de una de cada diez sublibrerías de una librería de cADN de glándulas lacrimales humanas (Dickinson & Thiesse, 1995) a 42ºC durante 4 horas en 5 x Denhardt, 6,76 x SSC, 10 mM fosfato de sodio, 1 mM EDTA, 0,5% SDS y 182 \mug/ml de ADN de esperma de salmón, y luego se hibridaron durante toda la noche a 42ºC con uno de dos 23-mer oligonucleótidos superpuestos ("S1" [AGCTGGGGCACAGGCACCCGCAC; SEQ ID NO. 11] y "S2" [GGGGTTCTGGGGCTGCAGCTGGG; SEQ ID NO. 12], cuyos extremos habían sido etiquetados con [^{32}P]gATP 7.000 Ci/mmol (ICN, Irvine CA) y purificados. Las condiciones del lavado final fueron 2 x SSC (45ºC), correspondiente a 29,5ºC menos que la Tm de S1 o S2 (74,5ºC en 2 x SSC para ambos). Las placas positivas de ambos filtros se recogieron y se volvieron a explorar tres veces por duplicado con cada oligonucleótido, dando lugar a cuarenta y siete clones. Se volvió a analizar posteriormente cada uno en condiciones de estringencia progresiva de lavado (-29,5, -24,5, -19,5 y -14,5ºC Tm). Se cortaron insertos colocados en pBluescript y ambas hebras se secuenciaron con un Secuenciador de ADN Prizm 377 (Perkin-Elmer, Branchburg, NJ; University of Virginia Biomolecular Research Facility). De los clones idénticos, el más común era una nueva secuencia carente de homología con BM180 (Calidad de ajuste óptimo = 16, contra calidad aleatoria de 17 \pm 2), a partir de la cual se derivaron los oligonucleótidos S1 y S2 ricos en poli G. Estaba previsto un marco de lectura abierto de 417 pb, cuyo producto proteico esperado se designó "lacritina", de acuerdo con la expresión de sus glándulas lacrimales. Se utilizó posteriormente el inserto de lacritina para explorar una librería genómica P1 humana (llevada a cabo por Genome Systems Inc.; St. Louis MO) y se obtuvieron tres clones idénticos, tal como se determina mediante digestión de restricción y análisis Southern. El fragmento más grande positivo de lacritina (12,4 kb) se subclonó intacto en pBluescript y se secuenciaron completamente ambas hebras. El alineamiento y análisis (Kumar y col., 2000) de cADN y la secuencia genómica se realizaron básicamente con el software basado en Unix (Gelstart, Gap) y en Web (FASTA, BestFit, Gap) de Genetics Computer Group (Madison WI) utilizando configuraciones por defecto y valores E (FASTA) limitados a 5 o menos. La búsqueda de los exones genómicos y la identificación de sitios de empalme se facilitó por el sitio web de Baylor College of Medicine Human Genome Sequencing Center. Todas las secuencias de nucleótidos se comunicaron al Banco de Datos GenBank/EBI con los números de acceso af238867 (cADN) y ay005150 (genómico).

Análisis Northern

Se obtuvieron durante la autopsia glándulas lacrimales y submandibulares humanas mediante división Southern, de Cooperative Human Tissue Network, 18 horas después de la muerte y la mayoría 8 horas después, para minimizar la degradación autolítica. Se siguieron los postulados de la Declaración de Helsinki y se obtuvo el consentimiento informado y la total aprobación de IRB. Los donantes no tenían infecciones virales o bacterianas sistémicas conocidas y los tejidos eran normales, según lo determinaba la causa de muerte, los informes de patología y en la mayoría de los casos el examen histológico. Los tejidos se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido después de su extirpación y se almacenaron a -85ºC hasta su utilización para la preparación de ARN. Se extrajo ARN total de 100-300 mg de tejido utilizando una versión comercial del método del tiocianato de guanidina/fenol ácido (RNazol B, Tel-Test, The Woodlands, TX). Se disolvió ARN purificado en agua tratada con dietilpirocarbonato y se determinó la concentración y pureza a partir de los valores de absorción A260/280. Se consideró como aceptable una relación cercana a 2,0. La integridad del ARN fue determinada inicialmente por electroforesis de muestras de ARN complejado con bromuro de etidio en un gel que contenía formaldehído 0,22M. Se rechazaron las muestras que no mostraban bandas de rARN 28S y 18S prominentes en una relación de 1:1-2:2 bajo luz UV. Para el blotting (detección), se separó el ARN (5 \mug/banda) en un gel de agarosa al 0,8% en condiciones de desnaturalización (Laurie y col., 1989) y se transfirió a nitrocelulosa. También se sometieron a prueba dos Northern blots (cat#7756-1 y 7751-1; Clontech Labs, Palo Alto, CA) con múltiples poli A+ ARN adultos y fetales humanos y un dot blot (cat#7770-1; Clontech Labs) que contenía cincuenta poli A+ ARN humanos diferentes junto con ARN y ADN de control. Se hibridaron los blots con el inserto de lacritina etiquetada [^{32}P], se lavaron con 0,1 x SSC, 0,1% SDS (Northern) o 2 x SSC, 0,1% de SDS (dot blot) a 55ºC, y se expusieron a una película de rayos X. Se cuantificaron después los dot blots utilizando la Imagen de NIH mediante la medición de los valores de grises de los píxeles de los dots individuales.

Análisis por PCR y Mapeo de Cromosomas

Se examinó por RT-PCR un empalme alternativo por medio de ARN total lagrimal o submandibular humano y cebado inicial con oligo dT, o de una manera específica del gen con el cebador inverso de lacritina CGCTACAAGGGTATTTAAGGC (SEQ ID NO. 13) (correspondiente a los nucleótidos 523 a 503 procedentes de cADN de lacritina). La amplificación posterior con el cebador directo de lacritina ACTCACTCCTCATCCCAAAG (SEQ ID NO. 14, procedente del exón 1; nucleótidos 32 a 51 de cADN de lacritina) y el cebador inverso TTTTCAGCTTCTCATGCCC (SEQ ID NO. 15; procedente del exón 5; nucleótidos 480 a 462 de cADN de lacritina) implicaba la desnaturalización durante 2 min a 94ºC, treinta ciclos de amplificación (94ºC durante 30 s, 52ºC durante 30 s y 72ºC durante 1 min) y un ciclo final durante 5 min a 72ºC. El producto por PCR se analizó en geles de agarosa.

Para el mapeo de FISH (Genome Systems; St. Louis, MO), el ADN genómico de lacritina fue etiquetado con dUTP-digoxigenina por traducción de nick y se hibridó (50% de formamida, 10% de dextrano, 2 x SSC) hasta la metafase de los cromosomas a partir de linfocitos de sangre periférica humanos estimulados con PHA. Después de los lavados, se detectó el etiquetado específico con anticuerpos antidigoxigenina expuestos a fluoresceína y DAPI, y se examinaron en un microscopio Nikon Labophot. Se analizaron un total de ochenta células metafásicas, mostrando sesenta un etiquetado específico. Se obtuvo la confirmación mediante doble etiquetado utilizando un marcador de 12q15 y mediante comparación con la secuencia del borrador del proyecto genoma humano. Se tomaron fotografías con una Nikon AFX con un aumento de 1,435 x.

Resultados

Las células acinares lacrimales son células secretoras de exocrina polarizada que contienen algunos mARN que están notablemente subrrepresentados en los bancos de datos genéticos y pueden codificar para una serie rica en factores de diferenciación-suposición que subyace bajo la exploración de oligonucleótidos pareados de una pequeña librería de cADN de glándulas lacrimales humanas utilizada. Entre los clones identificados por esta aproximación se encontraba una nueva secuencia de cADN (SEQ ID NO. 2) representada por varios clones independientes y correspondiente a una transcripción de 760 pb y la secuencia de aminoácidos correspondiente (SEQ ID NO. 4). El producto genético secretado de esta transcripción específica de las glándulas lacrimales fue designado "lacritina". La secuencia de ácido nucleico de la lacritina contiene un marco de lectura abierto de 417 pb que prevé un núcleo proteico hidrofílico de 14,3 kDa con un péptido señal de 19 aminoácidos, lo que da lugar a una proteína de núcleo secretada madura de 12,3 kDa con un punto isoeléctico de 5. Cabe destacar un nivel moderadamente alto de glicosilación con seis sitios putativos de O-glicosilación entre los residuos 52 y 64 y un único sitio de N-glicosilación cercano al C-terminal, lo que indica que la lacritina es una proteína de núcleo moderadamente bien glicosilada muy parecida al dominio de unión a glicosaminoglicano del neuroglicano C y el dominio globular amino a fibulina-2 con el que la lacritina mantiene una homología parcial. El análisis Northern Blot indica un alto nivel de especificidad de las glándulas lacrimales.

En investigaciones FASTA de la base de datos de primates, la homología parcial se detecta con la región de unión a glicosaminoglicano del neuroglicano C humano (32% de identidad en 102 aminoácidos; calidad BestFit = 83 contra 37 \pm 5 cuando se aleatorizó la secuencia de lacritina) y con la región globular amino "exenta de cisteína", posiblemente de tipo mucina de la fibulina-2 humana (30% de identidad en 81 aminoácidos; calidad BestFit = 81 contra 38 \pm 5 aleatoriamente). Aunque los tres son ricos en O-glicosilación, el posicionamiento de la serina y treonina no es compartido estrictamente; y tanto la lacritina como la fibulina-2 carecen de sitios de unión a glicosaminoglicano. El neuroglicano C (af059274) es un componente de la matriz extracelular cerebral (anclado por el dominio transmembrana; Yasuda y col., 1998). La fibulina-2 (x89494) está muy dispersa en las membranas del basamento y estroma de tejidos embrionarios y adultos (Sasaki y col., 1999). Las investigaciones de las bases de datos de no-primates apuntaron a homologías moderadas con la proteína de tipo mucina en T. Cruzi (af036464; calidad BestFit = 78 contra 46 \pm 10); el antígeno 2 de superficie del merozoito en P. falciparum (u91656; calidad BestFit = 76 contra 53 \pm 6) y la proteína putativa de arabinogalactano en P. taeda (af101791; calidad BestFit = 74 contra 37 \pm 4).

Se detectaron EST que no correspondían o eran homólogos, de acuerdo con la abundancia de lacritina en la glándula lacrimal humana y la expresión restringida en los demás lugares. El análisis Northern reveló un potente mensaje de 760 pb de la glándula lacrimal, mensajes más débiles de la glándula submandibular y tiroides del mismo tamaño. No se detectó ningún mensaje en la glándula adrenal adulta humana, testículos, timo, páncreas, intestino delgado o estómago; tampoco en el cerebro, pulmón, hígado o riñón fetal humano. De forma similar, en un dot blot comercial de cincuenta poli A+ ARN de diferentes tejidos humanos que excluían la glándula lacrimal, se descubrió la expresión de lacritina solamente en la glándula submandibular ("glándula salivar"), y en menor medida en la tiroides. La secuencia codificante de la lacritina fue subclonada en pET-28b y pcADN3.1/myc-His(+)C para generar lacritina (293 células T) recombinante de mamíferos y bacteriana, respectivamente. Ambas formas de lacritina mostraron una migración anómala en SDS PAGE.

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Ejemplo 2 Caracterización de la Expresión y Función de la Lacritina Preparación de Lacritina Recombinante y Antisueros Antilacritina

La longitud total de cADN de lacritina fue subclonada dentro del marco en pET-28b (Novagen, Madison, WI), con la orientación confirmada por la secuenciación completa por todo el inserto. Entonces se obtuvo lacritina recombinante etiquetada con His por inducción con IPTG de células transformadas BL-21 y se purificó del medio en resina Talon (Clontech; Palo Alto, CA) utilizando procedimientos estándar de desnaturalización. Se supone que el uso necesario de condiciones de desnaturalización para la etapa de unión refleja la inaccesibilidad a la etiqueta His debido al plegado en ausencia de glicosilación. Después de la elución, la lacritina fue ampliamente dializada contra PBS y se eliminó la etiqueta His por segmentación con trombina. Se evaluó la calidad de la proteína mediante SDA-PAGE y Western Blott con el anticuerpo anti-His (Santa Cruz Biotechnology; Santa Cruz CA). La lacritina muestra una movilidad anómala en SDS PAGE. La carencia de lipopolisacárido bacteriano contaminante se confirmó mediante el ensayo del lisado de amebocitos del limulus (MRL Referencia Lab; Cypress CA). Para una comparación analítica, pequeñas cantidades de lacritina de mamífero se expresaron en 293 células T por medio de pcADN3.1/myc-His(+) (Invitrogen, Carlsbad CA) que contenía el inserto de lacritina y luego se purificaron en condiciones nativas.

Se preparó posteriormente antisuero antibacteriano de lacritina en conejos (Covance Research Products, Denver PA) y se evaluó por ELISA (dilución de 1/1.000) por medio de lacritina recombinante bacteriana (4 \mug/ml) como capa y suero preinmune (1/1.000) como control. Para la inmunohistoquímica, secciones de tejidos humanos fijados en formalina-zinc, incrustados en parafina y una microserie de tejidos humanos fueron desparafinados y rehidratados y se calentaron en un microondas (20 min en 10 mM de tampón citrato, pH 6,0) para exponer el antígeno. Se bloqueó la peroxidasa endógena y luego se realizó la inmunodetección por medio del método del complejo de avidina-biotina-peroxidasa (Vectastain Elite kit, Vector Laboratories, Burlingame, CA) después de la incubación con antisuero antilacritina o suero preinmune (1/1.000) durante una hora a temperatura ambiente. Las secciones fueron contrateñidas con hematoxilina, se colocaron en sulfato cúprico y después se sumergieron en carbonato de litio.

Análisis de la Función Celular

Células acinares lagrimales de rata recién aisladas y líneas celulares ductales de HSG (glándula salival humana) y de HCE (epiteliales de la córnea humana) se utilizaron para estudiar la función de la lacritina. Para los estudios de secreción, las células acinares de rata se colocaron en placas exentas de suero durante toda la noche en pocillos co-recubiertos con 0,05 \muM de laminina-1 (para asegurar la adhesión) y de 0 a 20 \muM de lacritina, o alternativamente con laminina-1 (0,05 \muM) y se trataron al día siguiente con un medio exento de suero que contenía de 0 a 162 ng/ml de lacritina soluble durante cuatro horas. Entonces se recogieron las secreciones inestimuladas y estimuladas (carbachol 10-4 M/VIP 10-8M), se evaluaron (ensayo peroxidasa) y se normalizaron a \mug de ADN celular. Para estudiar la fosforilación de la tirosina, cultivos de toda la noche exentos de suero tanto de células acinares lacrimales de rata como de células HSG se lavaron y trataron con 10 ng/ml de lacritina soluble durante 0,5, 2,5, 10 y 30 minutos. La inmunoprecipitación del anticuerpo antifosfotirosina Py(20) de los lisados celulares se examinó entonces mediante Western Blot en geles al 7% SDS PAGE por medio de Py(20) y ECL para la detección. La señalización del calcio en las células epiteliales de la córnea humana se llevó a cabo de forma similar en un cultivo exento de suero (Trinkaus-Randall y col., 2000; Klepeis & Trinkaus-Randall, en la preparación). Se cultivaron células de HCE hasta confluencia sobre cubreobjetos de vidrio en medios para queratinocitos (Life Technologies, Rockville MD) que contenían extracto pituitario bovino (30 \mug/ml), EGF (0,1 ng/ml) y penicilina/estreptomicina, y se dejaron en reposo 18 horas antes de cargarlas con Fluo-3AM (2 \muM, Sondas Moleculares, Eugene OR) a 37ºC durante 30 minutos. Por medio de un Zeiss 510 LSM invertido para la visualización, se registraron en primer lugar imágenes de la línea base de 50 s. Mientras el láser estaba funcionando, se añadió lacritina (concentración final de 4 y 40 ng/ml) y se controló continuamente la respuesta cada 786 ms durante un mínimo de 200 segundos.

Estudios de Unión a ECM

Se llevaron a cabo los estudios de unión en placas de 96 pocillos recubiertas a 10 \mug/pocillo con colágeno IV, laminina-1, entactina/nidógeno-1, colágeno I, fibronectina, vitronectina, EGF, heparina o BMS (Matter & Laurie, 1994). Los pocillos se lavaron, se bloquearon (PBS-T), se incubaron con 0-30 nM de lacritina (en PBS-T que contenía un 1% de BSA) durante 1 hora (4ºC), se lavaron y detectaron con el anticuerpo antilacritina (1/1.000) mediante ELISA.

Resultados

Los anticuerpos preparados contra la lacritina bacteriana se aplicaron a secciones de glándulas lacrimales y salivales humanas y a microseries de tejidos que contenían secciones fijadas en formalina, incrustadas en parafina, de 75 tejidos humanos diferentes y órganos (véase la Tablad I). Se observó claramente la inmunorreactividad en los gránulos secretores de las células acinares en las glándulas lacrimales y salivales mayor y menor, pero no era evidente en otros epitelios o estromas. La presencia en la tiroides fue equívoca (Tabla I). La frecuencia de tinción de las células acinares era alta en la glándula lacrimal, mientras que sólo las células acinares salivales dispersas eran reactivas. La inmunorreactividad era también evidente en las secreciones dentro de los lúmenes de los conductos lacrimales y salivales. Se detectó lacritina, por ELISA, en las lágrimas humanas y en menor medida en la saliva.

TABLA I Inmunolocalización Restringida de la Lacritina en Órganos Humanos^{a}

1

Se evaluó la función de la lacritina en cultivos exentos de suero de células acinares lacrimales, ductales salivares y epiteliales corneales por medio de ensayos de secreción (acinar), proliferación (ductal), fosforilación de la tirosina (acinar, ductal) y señalización del calcio (epitelial corneal). Se colocaron en placas células acinares lacrimales recién aisladas de rata en cantidades progresivas de lacritina (con una pequeña cantidad constante de laminina-1 para asegurar la adherencia) o en pocillos recubiertos de laminina-1 en los que se añadió lacritina al medio. La lacritina tanto recubierta como soluble mejoró la secreción inestimulada de una forma dosis-dependiente (véase la Fig. 1), pero no se observó ningún efecto en las vías secretoras estimuladas activadas por los agonistas carbachol y VIP. Estos resultados sugieren un papel autocrino o paracrino, posiblemente a través de los receptores de la superficie celular acinar luminal. Como la lacritina fluye desde los acinos, está en contacto con las células epiteliales ductales y finalmente con el epitelio corneal.

Se cultivaron células ductales submandibulares ("HSG") humanas en reposo en medios exentos de suero que contenían cantidades progresivas de lacritina y se estudió la proliferación celular. Los cultivos de lacritina parecían más sanos; después de cuatro días, se evidenció un incremento dosis-dependiente en el número de células ductales (véase la Fig. 2a) que alcanzó un nivel más alto en más de dos veces que el del control negativo de BSA (10 ng/ml) (véase la Fig. 2b). El mismo nivel de lacritina favoreció la fosforilación transitoria de la tirosina de una banda de 48 kDa en células lacrimales de rata y de HSG.

Después, se examinaron las señales del calcio en células epiteliales corneales humanas. Mientras que el nivel basal de señalización era despreciable, la adición de lacritina resultó en ondas de calcio rápidas y sostenidas que se propagaban por todas las células. El inicio de las ondas precedió al de la respuesta habitual al factor de crecimiento epidérmico (20-40 s) y la amplitud de la respuesta dependía de la concentración de lacritina. Para asegurar que no estaba implicado el lipopolisacárido bacteriano (un posible contaminante de las preparaciones de proteínas recombinantes), se sometieron a prueba muestras en el ensayo del lisado de amebocitos del Limulus y no se detectó ningún lipopolisacárido (< 0,05 EU/ml). Finalmente, se estudió la capacidad de la lacritina para unirse a los componentes fibronectina o vitronectina de la película lacrimal, así como los constituyentes de la membrana basal periacinar que podían albergar pequeñas cantidades de lacritina no detectables por el procedimiento inmunohistoquímico. La lacritina mostró una notable avidez por la fibronectina y vitronectina y existía una fuerte unión de la membrana basal atribuible al colágeno IV, nidógeno/entactina y laminina-1, similar a la que se observó para la fibulina-2 (Sasaki y col., 1995). No se observó ninguna unión al colágeno-I, EGF o heparina.

El mensaje más bien amplio de la glándula lacrimal a la lacritina sugería formas alternativamente empalmadas o la degradación del ARN. Lo mismo no era cierto para la glándula submandibular en la que se evidenciaba una señal discreta, pero mucho menos intensa. Para abordar este problema y obtener información sobre cómo está dispuesto el gen de lacritina, se secuenció un fragmento genómico de 12,4 kb, el mayor fragmento positivo con la lacritina fácilmente obtenible de los clones genómicos de la lacritina. El gen se compone de cinco exones precedidos de una secuencia promotora pronosticada de 109 a 59 pb aguas arriba del sitio de inicio de la traducción (puntuación del promotor = 1,0; NNPP/Eucariota). El exón 1 codifica el péptido señal completo e incluye 38 pb de la secuencia no traducida en 5'. El exón 3 contiene la secuencia para todos los sitios O-glicosilación putativos. El sitio previsto de N-glicosilación se forma en la unión de empalme del exón 4 con el exón 5. El exón 5 incluye 53 pb de la secuencia no traducida en 3'. Se detectan tres sitios potenciales de poliadenilación de 367, 474 y 534 pb aguas abajo del exón 5, el primero de los cuales estaría de acuerdo con una transcripción de 760 pb. Las secuencias en los límites exón-intrón se conforman todas a los donadores o aceptores de empalme previstos, a excepción del aceptor de empalme del exón 4. Las secuencias intrónicas descubrieron elementos de repetición intrónica comunes. Asimismo se descubrió independientemente, en un fragmento genómico individual, un pseudógeno de lacritina que carecía de 38 pb de 1 secuencia del exón en 5'.

Para examinar posibles empalmes alternativos, se utilizó RT-PCR con cADN de la glándula submandibular o lacrimal como plantilla y los cebadores directos e inversos procedentes de los exones 1 y 5, respectivamente, incluyendo cada uno la secuencia flanqueante no traducida. Se detectó un único producto por PCR en ambos órganos cuyo tamaño (449 pb) estaba de acuerdo con la transcripción de los cinco exones sin empalme alternativo. FISH reveló que el gen lacritina está localizado en el cromosoma 12, resultado confirmado por el doble etiquetado con una sonda para 12q15. La medición de diez cromosomas etiquetados específicamente localizó al gen lacritina aproximadamente a un 16% de la distancia del centrómero al telómero de 12q, un área que corresponde a 12q13. Se encontró también en 12q13 una alacrimia genética rara conocida por el Síndrome Triple A. Una PCR experimentada por medio de cebadores genómicos de lacritina y plantillas de BAC que se extendía sobre la región del síndrome de Triple A no produjo el producto por PCR. El gen lacritina está incluido parcialmente en las secuencias del borrador AC068789.4, AC025686.2 y AC025570.6, indicando una localización de 12q13 aproximadamente a 65,1 hasta 65,9 Mpb del centrómero.

El descubrimiento de la lacritina se desarrolló a partir de la hipótesis de que múltiples factores extracelulares desencadenan la diferenciación glandular, en particular los factores de crecimiento y los componentes de la matriz extracelular circundante. Efectivamente, se ha informado de la formación acinar parcial o fallada en ratones carentes de miembros o receptores de la superfamilia del TGFb, ErbB4, el receptor de progesterona, la osteopontina, glicoproteína de matriz extracelular, el receptor de EGF (con TGFa y anfiregulina), el receptor 2 (IIIb) del factor de crecimiento de fibroblastos, o el factor de crecimiento FGF-10. La unión de estos factores a la función secretora de las células acinares en un cultivo ha demostrado ser más compleja. Sin embargo, está claro que el entorno mesenquimal y hormonal periacinar afecta al desarrollo y la función glandular y que la regulación tanto autocrina como paracrina desempeña un papel importante. Los más delicados son los cultivos primarios de células exocrinas recién aisladas, particularmente las células acinares lacrimales que se desdiferencian funcionalmente en ausencia de los factores de masa molecular más baja y lagrimales-1 procedentes de la matriz extracelular y otros sitios.

La introducción de lacritina recombinante a cultivos de células acinares lacrimales, ductales salivales y epiteliales corneales proporcionaron interesantes aclaraciones funcionales. Las células acinares lacrimales mostraron un aumento de la secreción inestimulada (pero no estimulada) y una fosforilación rápida de la tirosina de una proteína de 48 kDa. Las células ductales fosforilaron la misma banda de 48 kDa y fueron proliferativas. Se observó un transient del calcio rápido y sostenido en las células epiteliales corneales. Por tanto, todos los tipos de células que contribuyen a o se benefician del flujo de lacritina parecen ser lacritina inducibles, mientras que los controles fueron negativos y no se evidenció ningún lipopolisacárido bacteriano contaminante (conocido por ser proliferativo en cultivos celulares inmunes). Queda por aclarar cómo actúa la lacritina. Posiblemente, un receptor(es) común(es) es(son) mediador(es), cuya ligación se puede unir conjuntamente a la fosforilación de la tirosina y a la liberación del calcio como en la retina neural en la que las quinasas de tirosina han sido asociadas a la entrada capacitativa de calcio y a la liberación inducida por inositol-3-fosfato de los almacenes intracelulares de calcio. Alternativamente, la señalización de lacritina en los tres tipos celulares puede ser diferente. Las células acinares lacrimales, ductales y epiteliales corneales realizan funciones increíblemente diferentes. Aunque algunos mecanismos de señalización intracelular pueden ser comunes, otros son únicos y algunos mecanismos comunes se pueden aprovechar de forma diferente. La señalización del calcio en las células acinares lacrimales es más frecuentemente un efecto aguas abajo de la ligación del receptor muscarínico que media la liberación de las proteínas lagrimales por la vía secretora estimulada, vía aparentemente no afectada por la lacritina. Todavía, sutilezas en la amplitud del calcio, frecuencia y localización, dependientes de la naturaleza y la dosis del agonista pueden tener efectos drásticamente diferentes. La lacritina contrastante es BM180, constituyente de la membrana basal periacinar, que parece actuar sólo en la vía secretora estimulada. Al equilibrar las cantidades de lacritina disponible y BM180 puede ofrecer un mecanismo sencillo por el que se puede controlar la capacidad secretora en las glándulas en desarrollo y adultas.

La inmunolocalización de la lacritina en los gránulos secretores, en el contenido secretor de los conductos y en las lágrimas se amplió por medio de estudios de unión que revelaron una notable afinidad con los constituyentes lacrimales fibronectina y vitronectina. Aunque no se ha inmunodetectado en otros sitios, la lacritina se unió también a los componentes nidógeno/entactina, colágeno IV y laminina-1, pero no al colágeno I, EGF o heparina de la membrana basal periacinar. Se ha informado de propiedades de unión similares para la fibulina-2 (Sasaki y col., 1995). Aunque la significación y naturaleza precisa de estas interacciones quedan por determinar, la unión de la membrana basal es quizás análoga a los factores de crecimiento, cuya acumulación en la matriz extracelular, aunque funcionalmente potente, es a menudo demasiado baja para una inmunodetección fiable. Alternativamente, la unión de la membrana basal (si la hay) podría ser posiblemente menos importante que el daño del tejido.

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Ejemplo 3 Caracterización del Promotor de la Lacritina

La hipótesis de trabajo es que la actividad del gen lacritina es atribuible a un promotor atípicamente restrictivo y potente que trabaja mano a mano con los únicos elementos intensificadores (y posiblemente represores) en un medio de correguladores y factores de transcripción adecuados. Este control transcripcional específico del tejido es equivalente o sobrepasa el de la aA-cristalina (cristalino), rhodopsina (retina), aldehído deshidrogenasa clase 3 y genes de queratocono (córnea), y ofrece una oportunidad única para iniciar una nueva literatura sobre la gestión nuclear de la expresión genética en la glándula lacrimal humana.

Mapeo de los Elementos Reguladores del Gen Lacritina

La aclaración de cómo la expresión del gen lacritina se dirige a la glándula lacrimal se determinará tal como se describe a continuación para entender mejor la regulación genética lacrimal. En primer lugar, la identificación del(de los) sitio(s) de iniciación de la transcripción de lacritina se confirmará experimentalmente. En base a un análisis computacional del promotor, se anticipa la transcripción para que se inicie en un único sitio localizado de 69 pb aguas arriba ("-69 pb"; "Red Neural") del sitio de inicio de la traducción de ATG. Los elementos de la "caja TATA" y/o "Iniciador" ("Inr") del núcleo promotor desempeñan un papel importante en el establecimiento del sitio de inicio de la transcripción en muchos genes, particularmente en aquellos altamente expresados. Como ejemplo, los elementos del Inr a +1, +220 (también la caja TATA en +190 pb) y +316 pb (intrónico) designan los sitios de inicio de la transcripción en el gen del queratocono humano, tal como lo confirmó experimentalmente la extensión del cebador (véase Tasheva ES, Conrad AH, Conrad GW. Identification and characterization of conserved cis-regulatory elements in the human keratocan gene promotor. Biochim. Biophys. Acta. 2000 Jul. 24; 1492(2-3):452-9); y una caja TATA figura prominentemente en la iniciación de la transcripción de los promotores genéticos de aA-cristalina, rhodopsina y aldehído-deshidrogenasa. Si la región de -94 a -46 pb prevista de la Red Neural comprende realmente el núcleo promotor de lacritina con el sitio de inicio de la transcripción de -69 pb (puntuación = 1,0), entonces la caja TATA putativa y los elementos de Inr en -52 y -67 pb, respectivamente, deben desempeñar un papel clave en la iniciación de la transcripción. Alternativamente, la transcripción podría empezar en -62 pb, tal como lo sugiere el "Núcleo Promotor". La extensión del cebador y la 5'-RACE mediada por ARN ligasa resolverán esta cuestión.

Para la extensión del cebador, se aprovechará un cebador inverso 20-mer ("LacP83") designado como "Prime" (GCG, Madison WI) que es complementario de los nucleótidos de 64 a 83 pb de mARN de la lacritina. Según el procedimiento de rutina, LacP83 será etiquetado en su extremo por fosforilación con quinasa de la T4 polinucleótido-quinasa en presencia de [g^{32}P]ATP, templado con ARN lacrimal total (100 fmol de cebador por 10 \mug de ARN) durante 20 minutos a 58ºC, enfriado y después incubado durante 30 minutos a 41ºC con transcriptasa inversa AMV (Promega, Madison WI) en presencia de desoxinucléotidos. El tamaño del(los) cADN nuevamente formado(s), según se analizaron por análisis/radiografía SDS-PAGE de desnaturalización, proporciona suficiente información para calcular la(s) localizacione(s) aproximada(s) de los sitios de inicio de la transcripción, con identificación del(los) terminal(es) 5' determinado(s) por secuenciación semiautomática ABI de cADN a partir de una reacción ampliada de extensión no radioactiva y la 5'-RACE mediada por la ARN-ligasa. Los controles de extensión del cebador incluirán la sustitución del ARN lacrimal por ARN (o no ARN) de levadura total y el uso de un ARN preparado mediante transcripción in vitro con el cebador asociado (Promega, Madison WI), para lo cual las condiciones de extensión del cebador se establecen previamente.

Para la confirmación, se utilizará 5'-RACE mediada por ARN ligasa ("GeneRacer"; Invitrogen). Se trata de una potente modificación basada en PCR de la extensión del cebador. Con este propósito, 1-5 \mug de ARN lacrimal humano total serán tratados con fosfatasa de intestino de ternera (1 U por 10 \mul de mezcla de reacción) para eliminar los 5'-fosfatos del ARN degradado y no contaminantes de mARN. La incubación con tabaco ácido pirofosfatasa (0,5-1 U por 10 \mul de mezcla de reacción) elimina la estructura 5'-CAP presente solamente en los extremos 5' auténticos y posibilita la ligación de un oligonucleótido de ARN específico del kit ("GeneRacer RNA Oligo") con la T4 ARN ligasa (5 U por 10 \mul de mezcla de reacción). La posterior transcripción inversa cebada por LacP83 generará una sola hebra de cADN. El cADN luego se amplificará por PCR mediante LacP83 y cebado complementario con oligo 5' ARN como par de cebadores, y se secuenciará para identificar el(los) sitio(s) de inicio. En los controles negativos PCR, las amplificaciones se realizarán en ausencia de LacP83 o GeneRacer ARN Oligo o sin plantilla, y si se observara bandeo o manchas, se llevaría a cabo otra optimización por PCR (es decir, el uso de menos plantillas o menos ciclos de PCR o realizar PCR anidadas para aumentar la cantidad de amplicones o utilizar touchdown PCR).

Se anticipa la observación de una banda de cADN extendida por un único cebador de 152 (o 145) pb de acuerdo con un sitio de inicio de transcripción en -69 pb (o -62 pb) y la inclusión de 83 pb desde el extremo 5' del cebador hasta el sitio de inicio de la traducción [69 + 83 pb (o 62 + 83 pb)]. Esta probabilidad está de acuerdo con la única transcripción aparente por análisis Northern de la glándula salival humana. La banda lacrimal humana más ancha ha sido interpretada como atribuible a la abundancia de mARN combinada posiblemente con alguna ligera degradación. Aunque no se ha observado ningún empalme alternativo, no se puede descartar completamente la posibilidad de una segunda transcripción.

Se generará también un constructo reporter de luciferasa y se iniciará el mapeo regional basado en la transfección de los elementos reguladores del gen de lacritina. Se plantea la hipótesis de que el alineamiento Bayesiano de los genes de lacritina en humanos y ratas proporcionará un excelente fundamento para la interpretación de la actividad del constructo reportero, y que, de forma similar, la conservación evolutiva hará factible la utilización de una línea celular acinar lacrimal de conejo como huésped de transfección-la única línea celular inmortalizada procedente de glándula lacrimal de cualquier especie. Esta aproximación exploratoria preparará el terreno conceptual para más estudios detallados tanto in vitro como in vivo.

La especificidad del tejido de lacritina se basa supuestamente en la naturaleza y diversidad de los módulos de unión al factor de transcripción que comprenden su promotor genético y región(es) amplificadora(s) putativa(s). La expresión preferida por el cristalino del gen aA-cristalina, por ejemplo, es regulada por un complejo de transcripción de CREB/CREM, aA-CRYBP1, Pax 6, TBP, USF, AP-1 (contexto de AP-1 importante para la especificidad del tejido) y L-maf que forma un núcleo sobre el promotor de aA-cristalina de 150 pb. Los constructos del plásmido transfectado que posicionan artificialmente la expresión de la luciferasa o de cloranfenicol-acetiltransferasa bajo el control de las regiones del promotor intacto o progresivamente acortado (o mutado) en 5', han sido utilizadas previamente para identificar la región reguladora de acción en cis de un promotor. El "Dual-Luciferase Reporter Assay System" (Promega) versátil y sensible, por ejemplo, ensaya secuencialmente tanto el promotor genético transfectado a investigar (tal como lo manifiesta el nivel de luciferasa de luciérnaga expresada) como un promotor de control HSV-TK positivo interno cotransfectado diseñado para conducir la expresión independientemente de una luciferasa sintética de Renilla reniformis con distintas propiedades de sustrato a un nivel de línea base constante (véase a continuación). La investigación posterior en ratones transgénicos mediante b-galactosidasa como reportero aporta el contexto cromosómico en juego. La disponibilidad reciente de una línea celular lacrimal de conejo (Nguyen DH, Beuerman RW, Halbert CL, Ma Q, Sun G. Caracterización de células epiteliales de la glándula lagrimal de conejo inmortalizada. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 1999 Apr;35(4):198-204) y la clonación genómica de la lacritina abren ahora esta línea de investigación en el campo de las glándulas lacrimales.

Si se iniciara realmente la transcripción a -69 ó -62 pb, la extensión de los constructos genómicos aguas arriba de -2.435 a -10 pb ("Lacrgen2.4"), de -1.619 a -10 pb ("Lacrgen1.6") ó de -856 a -10 pb ("Lacrgen0.9") podría incluir todos o la mayoría de los elementos necesarios para la expresión elevada y específica del tejido. La preparación de cada uno aprovechará el amplicon padre "LacrgenInit" (de -2.960 a -10 pb) para que se genere por PCR a partir del fragmento genómico de lacritina de 12,4 kb utilizando el cebador inverso "LacP-10/Xho I" (de -10 a -31 pb) con el sitio Xho I incorporado, y el cebador directo "LacP-2960" (de -2.960 a -2.942 pb). Los pares de cebadores son diseñados por "Prime" (GCG, Madison WI). La digestión posterior de LacrgenInit con Xhol, BgI II/Xho I o Hind III/Xho I produce los fragmentos Lacrgen2.4, Lacrgen1.6 ó Lacrgen0.9, respectivamente, con extremos adecuados para la ligación preparada (después de la purificación del gel) en la región de múltiples clonaciones de pGL3-Basic justo aguas arriba del gen luciferasa (luc+) sin promotor y sin amplificador.

Se utilizará para los estudios de transfección una nueva línea celular acinar lacrimal (Nguyen y col. '99) que ha sido cultivada durante doce meses sin dificultad. Las células muestran una morfología epitelial fuerte y sintetizan el componente secretor, la transferrina y el receptor de transferrina. Es importante señalar que expresan también la lacritina y que tienen una fácil capacidad de transfección. Para llevar a cabo las transfecciones, \approx 80% de cultivos confluentes que contienen suero en placas de 96 pocillos serán transfectados transitoriamente con Lacrgen2.4, Lacrgen1.6 o Lacrgen0.9 en pGL3-Basic, más el plásmido de control interno phRL-TK (total de 0,24 \mug de plásmido/pocillo; relación 50:1 de pGL3-Basic con respecto a phRL-TK) utilizando = 0,8 \mul/pocillo del reactivo LipofectAMINE 2000 (Invitrogen Life Technologies). 48 horas después, se lavarán suavemente los cultivos tres veces en PBS, se lisarán durante 15 minutos en 1X de "Passive Lysis Buffer" (20 \mul/pocillo; Promega), y se ensayará la luciferasa de luciérnaga con la adición del "Luciferase Assay Reagent II" (100 \mul/pocillo) en un luminómetro de placas de 96 pocillos L-Max (Molecular Devices, Menlo CA; en línea con el ordenador). Las lecturas se ponen a cero para tratar de forma similar los pocillos que contienen el lisado de células no transfectadas. Posteriormente, se añade el "Stop & Glo Reagent" (100 \mul/pocillo) para el ensayo de la luciferasa de Renilla. La inclusión de 293 células humanas transfectadas de forma idéntica servirá de control negativo, mientras que las células epiteliales corneales humanas Araki-Sasaki (HCE-T) y las células salivales humanas HSG (ambas secretan lacritina) son controles positivos adecuados. La transfección óptima de la LipofectAMINE lagrimal y las condiciones del ensayo de la luciferasa con Bright-Glo (Promega) aprovecharán el vector de pGL3-Control, con lo cual las células transfectadas se benefician de la expresión de luc+ bajo el control del amplificador y promotor SV40. Se espera que la eficacia de transfección sea del 75-90% y que uno de Lacrgen2.4, Lacrgen1.6 o Lacrgen0.9, probablemente Lacrgen1.6 o Lacrgen0.9, definirá mejor la secuencia mínima exigida para la actividad del promotor de lacritina.

El curso de la investigación ofrece un punto de inicio lógico para la generación y prueba de los constructos derivados de Lacrgen2.4, Lacrgen1.6 o Lacrgen0.9 progresivamente acortados en 5' por la deleción anidada, aproximación aplicada a la secuenciación genómica del gen lacritina y regiones flanqueantes. Lo hacen posible los sitios únicos Kpn I y Sac I justo aguas arriba de cada inserto en la región de clonación múltiple de pGL3-Basic y la carencia de cualquier sitio interno Kpn I o Sac I en Lacrgen2.4, Lacrgen1.6 o Lacrgen0.9 -este último según lo determina Map (GCG). Así, cuando se digiere con Kpn I y Sac I, se genera un plásmido lineal en el que el extremo Kpn I es resistente a la exonucleasa III (sobresaliente en 3') y el extremo de Sac I (rebajado en 3') es sensible. La proximidad de Lacrgen2.4, Lacrgen1.6 o Lacrgen0.9 al sitio Sac I los hace sensibles al acortamiento de la exonucleasa. Para llevarlo a cabo, 2 \mug del constructo de plásmido son digeridos por Kpn I y Sac I. Después de la inactivación de la enzima (10 min a 70ºC) y enfriamiento en hielo, el plásmido lineal en el tampón de exonucleasa es tratado con exonucleasa III a un volumen final de 40 \mul a 25ºC o 15ºC para lograr deleciones sucesivas de 50-100 pb a intervalos de 3 minutos. Se quitan 2 partes alícuotas de 2 \mul de cada intervalo de 3 minutos y se colocan en tubos sobre hielo que contienen nucleasa S1. Después de haber tomado todas las partes alícuotas a intervalos regulares, se retiran del hielo las digestiones del plásmido, se incuban a temperatura ambiente durante 30 minutos para la digestión de los extremos salientes con la nucleasa S1, se inactivan con calor, se recircularizan por ligación de los extremos romos en presencia de T4 ARN ligasa, se examinan en geles de agarosa y se transforman en células competentes con la selección de ampicilina. Las preparaciones de plásmidos de cada una se aplican entonces a la transfección (con el plásmido de control interno) de las células acinares lacrimales y la valoración de la expresión de la luciferasa.

<110> The University of Virginia Patent Foundation

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Laurie, Gordon

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Kumar, Rajesh

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Sanghi, Sandhya

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Lumsden, Angela

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<120> Proteína de Tipo Factor de Crecimiento de las Lágrimas Oculares

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<130> 00662-02

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<150> US 60/269.900

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<151> 20.02.2001

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<160> 15

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<170> PatentIn version 3.0

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<210> 1

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<211> 12354

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<221> exón

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<222> (5194)..(5251)

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<221> exón

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<222> (6802)..(6855)

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<221> exón

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<222> (7654)..(7794)

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<221> exón

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<222> (8196)..(8297)

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<221> exón

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<222> (9082)..(9143)

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<221> sig_péptido

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<222> (5194)..(5250)

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<400> 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

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<210> 2

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<211> 522

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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12

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<210> 3

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<211> 416

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

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13

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<210> 4

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<211> 138

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

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14

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<210> 5

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<211> 5193

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 5

15

16

17

18

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<210> 6

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<211> 2436

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 6

19

20

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<210> 7

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<211> 1620

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 7

21

22

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<210> 8

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<211> 862

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 8

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23

\hskip1cm

24

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<210> 9

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<211> 19

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 9

25

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<210> 10

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<211> 119

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 10

26

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<210> 11

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<211> 23

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Sonda de oligonucleótidos para detectar el clon genómico de lacritina

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<221> unión a cebador

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<222> (1)..(23)

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<400> 11

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27

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<210> 12

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<211> 23

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Sonda de oligonucleótidos para detectar el clon genómico de lacritina

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<221> unión a cebador

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<222> (1)..(23)

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<400> 12

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28

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<210> 13

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<211> 21

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Cebador de PCR correspondiente a los nucleótidos 523 a 503 del gen lacritina

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<221> unión a cebador

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<222> (1)..(21)

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<400> 13

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29

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<210> 14

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Cebador de PCR para el exón 1 del gen lacritina

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<221> unión a cebador

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<222> (1)..(20)

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<400> 14

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30

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<210> 15

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<211> 19

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Cebador de PCR para el exón 5 del gen lacritina

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<221> unión a cebador

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<222> (1)..(19)

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<400> 15

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31

Claims (10)

1. Composición que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 4, o un fragmento bioactivo de la misma, caracterizada porque el fragmento se une específicamente a al menos uno de los ligandos naturales de un polipéptido nativo de lacritina, así como un vehículo farmacéuticamente aceptable, caracterizada porque la composición es una formulación tópica oftálmica.

2. Composición según la reivindicación 1, que comprende además un fosfolípido o un aceite farmacéuticamente aceptable.

3. Método in vitro para identificar un compuesto de prueba capaz de modular la actividad de la lacritina (SEQ ID NO. 4), comprendiendo dicho método:

a)

poner en contacto una solución que contiene lacritina con dicho compuesto de prueba; y

b)

medir la actividad de la lacritina en presencia y ausencia de dicho compuesto de prueba, de modo tal que si el nivel obtenido en presencia del compuesto de prueba difiere del que se obtiene en su ausencia, entonces se identifica un compuesto que modula la actividad de la lacritina, caracterizada porque la actividad de la lacritina es actividad mitogénica.

\vskip1.000000\baselineskip

4. Método según la reivindicación 3, caracterizado porque la actividad de la lacritina medida es la capacidad de la lacritina para favorecer la proliferación de células ductales.

5. Método según la reivindicación 4, caracterizado porque la actividad de la lacritina medida es la capacidad de la lacritina para favorecer la fosforilación de la tirosina o la señalización del calcio.

6. Utilización de una composición que comprende un polipéptido, caracterizada porque el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4, o un fragmento bioactivo de la misma, caracterizada porque el fragmento se une específicamente a al menos uno de los ligandos naturales de un polipéptido nativo de lacritina, o una secuencia de aminoácidos que difiere de la SEQ ID NO: 4 en una o más sustituciones conservadoras de aminoácidos; o una secuencia de aminoácidos que difiere de la SEQ ID NO: 4 en una sola mutación, caracterizada porque la única mutación representa una sola deleción, inserción o sustitución de aminoácidos, para preparar un medicamento para el tratamiento de la producción deficiente de lágrimas.

7. Utilización según la reivindicación 6, caracterizada porque el medicamento es una formulación tópica oftálmica.

8. Utilización según la reivindicación 7, caracterizada porque el medicamento comprende un fosfolípido o un aceite farmacéuticamente aceptable.

9. Utilización de una composición que comprende un polipéptido, caracterizada porque el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4, o un fragmento bioactivo de la misma, caracterizado porque el fragmento se une específicamente a al menos uno de los ligandos naturales de un polipéptido nativo de lacritina, o una secuencia de aminoácidos que difiere de la SEQ ID NO: 4 en una o más sustituciones conservadoras de aminoácidos; o una secuencia de aminoácidos que difiere de la SEQ ID NO: 4 en una sola mutación, caracterizada porque la única mutación representa una sola deleción, inserción o sustitución de aminoácidos, para la preparación de un medicamento destinado a aumentar la proliferación de células epiteliales corneales o de células acinares lacrimales humanas.

10. Método in vitro para detectar un receptor de lacritina, comprendiendo dicho método el proporcionar una célula que ha sido transfectada con secuencias de ácido nucleico que codifican para receptores celulares potenciales; poner en contacto dichas células transfectadas con la lacritina (SEQ ID NO. 4); detectar las células que muestran la señalización del calcio dependiente de la lacritina; aislar las secuencias de ácido nucleico de las células detectadas; e identificar una secuencia de ácido nucleico que confiere la señalización del calcio dependiente de la lacritina a las células transfectadas con tal secuencia de ácido nucleico.