ES2329480T3

ES2329480T3 - Injerto de tejido.

Info

Publication number: ES2329480T3
Application number: ES05076303T
Authority: ES
Inventors: Jeremy D. Ollerenshaw; Steven Goldstein; Kirby S. Black
Original assignee: Cryolife Inc
Current assignee: Artivion Inc
Priority date: 2000-01-28
Filing date: 2001-01-29
Publication date: 2009-11-26
Anticipated expiration: 2021-01-29
Also published as: EP1250109A1; EP1591078A1; PT1591078E; EP1591078B1; DE60139279D1; NO327637B1; US20100285587A1; CY1109458T1; WO2001054619A1; NO20023154D0; US20050191281A1; US6866686B2; US7763081B2; US20020128724A1; AU783780B2; NO20023154L; EP1250109A4; DK1591078T3; JP5142437B2; CA2396698A1

Abstract

Procedimiento de preparación de un injerto de tejido tubular consistente en: i) lavar un tejido inicial que es un uréter humano o animal con al menos un agente reductor de biocarga de forma que dicho tejido inicial es desinfectado, ii) descelularizar el tejido desinfectado resultante a partir de la etapa (i) con una solución que lisa las células de dicho tejido desinfectado de forma que se forma una matriz de tejido, iii) contactar dicha matriz de tejido resultante de la etapa (ii) con una nucleasa de forma que el ácido nucléico asociado con dicha matriz de tejido es degradado, iv) lavar dicha matriz de tejido resultante de (iii) de forma que se extraen restos celulares o extracelulares retiradas y se obtiene dicho injerto de tejido y, opcionalmente criopreservar y/o esterilizar dicha matriz de tejido.

Description

Injerto de tejido.

La presente solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud Provisional No. 60/178.632, presentada el 28 de enero de 2000.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un procedimiento de preparación de un material de injerto de tejido.

Antecedentes

En general, los tejidos biológicos tienen un mejor rendimiento funcional que dispositivos sintéticos equivalentes cuando se utilizan como un implante corporal. Actualmente los injertos de tejido están mayormente limitados a tejidos autólogos y aloinjertos que tienen restricciones de suministro inherentes y preocupaciones logísticas de recolección, transporte y serologías. Por consiguiente, hay una necesidad de fuentes adicionales de injertos de tejido biológico. Los tejidos animales representan dicha fuente. Los tejidos animales pueden ser obtenidos de forma relativamente fácil a partir de mataderos en grandes cantidades. Antes del uso, sin embargo, estos tejidos deben ser tratados para extraer las proteínas antigénicas que producen una respuesta de rechazo por parte del huésped a continuación de la implantación.

La extracción de proteínas antigénicas puede lograrse procesando el tejido del donante en una forma tal que se extrae el componente celular del tejido donante. Muchas proteínas están presentes sobre celulares. Por lo tanto, la extracción de células también extrae estas proteínas. Después de la descelularización, el tejido puede ser empaquetado y esterilizado para su uso como injerto biológico. Los injertos pueden ser implantados en humanos u otros animales para reparar, aumentar o reemplazar estructuras naturales, sistemas o dispositivos prostéticos existentes. Estos incluyen pero no están limitados a, sistemas cardiovascular, vascular, urogenital, neurológico, gastrointestinal y ortopédico. Los injertos también pueden utilizarse para proporcionar acceso a hemodiálisis.

El documento WO 98/36707 describe injertos que utilizan un uréter como material inicial. El documento US 5 899 936 describe procedimientos para preparar injertos mediante el lavado, descelularizado y repoblado de las matrices.

Un procedimiento de procesado de tejido animal puede volverlo adecuado para la implantación en un huésped humano (o no-humano). El tejido humano puede ser procesado para utilizar como un implante aloinjerto.

Descripción de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento de preparación de un material de injerto de tejido y al material de injerto multipropósito resultante. La invención también se refiere a un procedimiento de utilización del injerto de tejido como reemplazo para tejido vascular o no-vascular.

Un aspecto de la invención proporciona un procedimiento de preparación de un injerto de tejido tubular, como se indica en la reivindicación 1.

Los objetivos y ventajas de la presente invención serán claros a partir de la descripción que sigue a continuación.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento de preparación de un tejido animal o humano en una forma tal para volverlo adecuado para el uso en aplicaciones de injerto vascular y no-vascular. El tejido preparado según el procedimiento de la presente invención exhibe propiedades físicas y biológicas que lo vuelven particularmente bien adaptado para las aplicaciones de injerto de tejido.

El tejido adecuado para el uso en la presente invención puede obtenerse a partir de cadáveres humanos o a partir de bovinos, porcinos u otros animales, por ejemplo, bajo condiciones de matadero. El tejido puede ser transportado al punto de la preparación del tejido bajo condiciones necesarias para mantener el tejido a una temperatura deseada. Los tejidos pueden ser transportados, por ejemplo, inmersos en una solución de sal fisiológica y, al llegar, inspeccionados, lavados, por ejemplo, en una solución de sal fisiológica, y limpiados (diseccionados) libres de material adherente no deseado, tal como tejido conectivo y grasa.

Un uréter aislado es el material de injerto de tejido. Sin embargo, pueden utilizarse otros tejidos incluyendo arterias, venas, tendones, válvulas del corazón, fascia lata, pericardio y nervios, pero no entran dentro del ámbito de esta invención.

Después de la recolección y disección, ventajosamente el tejido de trasplante es, primero lavado, por ejemplo, con salino fosfato tamponado (PBS), para reducir la biocarga microbiana. El tejido se incuba entonces (por ejemplo, a aproximadamente 37ºC durante aproximadamente 18 horas) en una solución que contenga uno o más agentes antimicrobianos, por ejemplo, un antibiótico o un agente antifúngico, o mezcla de los mismos, para reducir adicionalmente la biocarga. Los antibióticos preferidos incluyen amakacina, lincomicina, cefotaxima, vancomicina, rifampina, diflucan y amfotericina B. Ventajosamente, se utiliza una mezcla de estos antibióticos. El tejido puede entonces ser criopreservado para procesamiento adicional en un tiempo posterior o someterse inmediatamente a descelularización.

La descelularización preferentemente se logra mediante la incubación del tejido en una solución efectiva para lisar las células nativas en el tejido. Ventajosamente, el tejido se incuba (por ejemplo, a aproximadamente 37ºC) en agua estéril (por ejemplo, durante aproximadamente 4 horas en el caso de uréteres), sin embargo, un tampón hipotónico acuoso o un tampón de baja fuerza iónica también puede utilizarse. Si se desea, la solución de decelularización puede incluir otros agentes, tales como inhibidores de proteasa ((por ejemplo, queladores tales como EDTA)).

Después de la descelularización, la matriz de tejido resultante se trata con un coctel de nucleasa para degradar el material nuclear. Las nucleasas que puede utilizarse para la digestión de ADN y ARN nativo de la célula incluyen tanto exonucleasas como endonucleasas. Otras nucleasas son adecuadas para utilizar en esta etapa del proceso y están comercialmente disponibles. Por ejemplo, puede utilizarse un coctel que comprende ADNsa I (SIGMA Chemical Company, St. Louis, Mo.) y ARNsa A (SIGMA Chemical Company, St. Louis, Mo.).

Preferentemente, las nucleasas están presentes en una solución tampón que contiene sales de magnesio y calcio (por ejemplo, sales cloruro). La concentración iónica y el pH de la solución tamponada, la temperatura del tratamiento y la longitud del tratamiento se seleccionan para asegurar el nivel deseado de actividad nucleasa efectiva. En el caso de uréteres, el tampón es preferentemente un tampón Tris a pH 7,6. Preferentemente, el coctel nucleasa contiene aproximadamente de 0,1 \mug/ml a 50 \mug/ml, preferentemente de 17 \mug/ml, de ADNsa I, y aproximadamente de 0,1 \mug/ml a 50 \mug/ml, preferentemente 17 \mug/ml, de ARNsa A. El tratamiento nucleasa puede ser efectuado a, por ejemplo, aproximadamente de 20ºC a aproximadamente 38ºC, preferentemente a aproximadamente 37ºC, durante aproximadamente de 1 a 36
horas. En el caso de uréteres, el tratamiento nucleasa durante aproximadamente 19 horas típicamente es suficiente.

A continuación de la descelularización y el tratamiento nucleasa, la matriz de tejido resultante puede ser tratada (lavada) para asegurar la extracción de los restos de célula que pueden incluir proteína celular, lípidos celulares, y ácido nucléico celular, así como restos extracelulares, tales como proteínas solubles extracelulares, lípidos y proteoglicanos. La extracción de restos celulares y extracelulares reduce la posibilidad de que la matriz de tejido trasplantado provoque una respuesta inmune adversa del receptor ante un implante. Por ejemplo, el tejido puede ser incubado en un tampón (por ejemplo, PBS) o en una solución detergente tal como una solución de Triton X-100 en agua. La composición de la solución, y las condiciones bajo las cuales ésta se aplica al matriz de tejido pueden ser seleccionadas para disminuir o eliminar la actividad de la nucleasa utilizada durante el procesamiento de nucleasa y para extraer los restos de célula. El proceso puede incluir incubación a una temperatura de entre aproximadamente 2ºC y 42ºC, siendo preferidos 37ºC. La matriz de tejido puede ser incubada en la solución de detergente por hasta 7 días, siendo aproximadamente 24 horas suficiente en el caso de una matriz de uréter. Cuando se utiliza tampón en lugar de una solución detergente, la matriz de tejido puede ser incubada por hasta 30 días, siendo aproximadamente 14 días suficientes en el caso de una matriz de uréter.

Si se utiliza, la solución detergente puede ser lavada de la matriz de tejido utilizando múltiples lavados en una solución acuosa estéril (por ejemplo, agua). El número de lavados y tiempos óptimos pueden ser fácilmente determinados, sin embargo, aproximadamente 4 lavados de 30 minutos son preferidos en el caso de matrices de uréter.

Después del lavado, la matriz de tejido puede entonces ser empaquetada, esterilizada y/o almacenada antes de la implantación. Ventajosamente, la matriz de tejido empaquetada se mantiene en un estado no congelado, preferentemente a una temperatura entre 0ºC y 40ºC, más preferentemente, entre 0ºC y 20ºC, más preferentemente entre 2ºC y 8ºC hasta y durante la esterilización utilizando, por ejemplo, la aproximación utilizada en el Ejemplo 11. Después de la esterilización, la matriz de tejido puede ser mantenida a temperatura ambiente. Si se desea, la matriz de tejido puede ser criopreservada antes o después de esterilización para uso posterior. Las técnicas de criopreservación de tejido son bien conocidas en la técnica. Brockbank, K. G. M. Basic Principles of Viable Tissue Preservation. In: Transplantation Techniques and use of Cryopreserverd Allograft Cardiac Valves and Vasular Tejido. D. R. Clarke (ed.), Adams Publishing
Group, Ltd., Boston. pp 9-23, discute la criopreservación de tejidos y órganos y se incorpora aquí como referencia.

Las matrices de tejido, tanto previamente criopreservadas como no, pueden ser esterilizadas utilizando técnicas de esterilización reconocidas en la técnica. Ventajosamente, la esterilización se efectúa utilizando radiación gamma a una dosis de entre 10 kGy y 100 kGy, preferentemente entre 20 kGy y 40 kGy, más preferentemente entre 25 kGy y 40 kGy. Modos alternativos de esterilización incluyen tratamiento con ácido peracético de yodo o rayo de electrones. Después de la esterilización, la matriz de tejido puede almacenarse congelada o descongelada antes de la implantación. Si se almacena criopreservada, por ejemplo, en nitrógeno líquido, la matriz de tejido es estable durante al menos 5 años. Antes de utilizar ununa matriz de tejido congelada, la matriz es descongelada utilizando un protocolo diseñado para eluir soluciones crioprotectoras. Por ejemplo, la matriz puede ser descongelada rápidamente a 4ºC en un baño de agua a una temperatura de 37-42ºC. La matriz pueden entonces ser rápidamente transferida a un medio de crecimiento tal como Dulbeccos' Modified Eagles Medium (DMEM) que contiene manitol (por ejemplo, at aproximadamente 0,5%). El manitol y crioprotectores residuales pueden ser extraídos mediante dilución en serie (lavado) con soluciones 0,5, 0,25 y 0,0 M de manitol en DMEM. Siguiendo a los lavados, el tejido está listo para usar. Para tejidos no almacenados congelados, pueden utilizarse protocolos de lavado alternado, por ejemplo, lavado en PBS o DMEM. Pueden utilizarse los procedimientos de implantación reconocidos en la técnica y el procedimiento seleccionado es dependiente de la matriz de tejido utilizada y del sitio de implantación.

La matriz de tejido resultante del procedimiento antes descrito, particularmente una matriz de uréter, puede utilizarse como un injerto de conducto (tubular). Por ejemplo, una matriz de uréter puede utilizarse como un injerto vascular, guía de nervio, o reemplazo para cualquier estructura tubular, incluyendo un uréter. Cuando se utiliza como un injerto de conducto, el diámetro del injerto debe generalmente ser aproximadamente el mismo que el diámetro de la estructura nativa. Los injertos resultantes del procedimiento antes descrito demuestran características favorables como injertos de acceso a hemodiálisis.

Para utilizar en otras aplicaciones de injerto, una matriz de tejido de uréter resultante del procedimiento anterior puede cortarse longitudinalmente y desenrollarse para formar un parche de tejido. El procedimiento completo de descelularización/tratamiento de nucleasa descrito anteriormente puede llevarse a cabo sobre parches de tejido (por ejemplo, tejido del uréter) preparado mediante el corte del segmento longitudinalmente y desenrollarlo para formar un parche de pre-injerto. Los parches de injerto preparados pueden ser utilizados, por ejemplo, como un material de injerto de piel o para reparar otros defectos de tejidos del cuerpo que les conducen a la aplicación quirúrgica de un parte de injerto de tejido que tienen las características físicas y funcionales de la presente composición de injerto.

Una matriz de tejido puede actuar como un andamio para la repoblación espontánea mediante células huésped in vivo conduciendo a la reconstrucción y estabilización del tejido. El resultado es una construcción completamente funcional, no-inmunogénica, viable que contiene células autólogas que expresan proteínas contráctiles. La mejor tasa de evidencia y falta de infección vista en los presentes injertos puede ser atribuible a la incorporación temprana, recelularización y remodelación de la matriz con células huésped.

Ciertos aspectos de la presente invención se describen con mayor detalle en los siguientes Ejemplos no limitativos.

Ejemplo 1 Implantación de Uréter Bovino Descelularizado como un Injerto Vascular Periférico en el Perro Procedimientos

Se recogieron uréteres de bovino fresco de mataderos dentro de las 2 horas de la muerte y se enviaron a una instalación de procesamiento a 4ºC en una solución de salino tamponado con fosfato (PBS) para evitar la degradación del tejido en tránsito. Una vez recibido el tejido, se realizó una inspección gruesa del tejido y se seleccionaron uréteres de 4 mm de diámetro exterior y 30 a 40 cm de longitud para procesar. Los uréteres seleccionados se diseccionaron utilizando instrumentos estériles para extraer el material adherente no deseado tal como tejido conectivo y grasa. Los uréteres se colocaron entonces en contenedores de polipropileno de 300ml de capacidad y se lavaron cuatro veces con 250 ml estéril PBS para reducir la biocarga microbiana. Los uréteres se llevaron entonces a través de etapas para extraer el tejido celular y el contenido de antígeno.

La descelularización se inició mediante incubación en un coctel de antibióticos y agentes antimicóticos que consistía en una solución de antibióticos. Esta mezcla contenía lo siguiente: amakacina (34 \mug/ml), lincomicina (160 \mug/ml), cefotaxima (181 \mug/ml), vancomicina (136 \mug/ml), rifampina (82 \mug/ml), diflucan (120 \mug/ml) y amfotericina B (0,5 \mug/ml). La incubación se produjo durante 18 horas en un incubador agitador a 37ºC. Para la lisis celular, la solución de antibiótico se reemplazó con 250 ml de agua estéril y la incubación se dejó continuar durante 4 horas en un baño de agua agitador a 37ºC. Esto fue seguido por incubación durante 19 horas a 37ºC en un coctel de enzimas para degradar el material nuclear ahora expuesto mediante el lisado de los orgánulos celulares. Este coctel contenía ADNsa I (47 Kunitz U/ml) y ARNsa A (1 Kunitz U/ml) en una solución que contiene cloruro de magnesio (1 \mug/ml) y cloruro de calcio (3 \mug/ml) y tamponada utilizando Tris[hidroximetil]aminometano hidrocloruro (50 \mug/ml) a pH 7,6. (La ADNsa I y ARNsa A se obtuvieron a partir de Sigma Chemical Company (D-5025 y R-5000) y ambas se utilizaron en una concentración de 17 \mug/ml.) Subsecuentemente, el tejido se colocó en una solución 3,5 mM de detergente Triton X-100 en agua estéril para extraer restos celulares. Esta incubación se llevó a cabo durante 24 horas a 37ºC en un baño de agua agitador. La solución detergente se eliminó del tejido mediante cuatro lavados en agua estéril a 37ºC durante 30 minutos cada uno. Después de estos lavados, la matriz resultante se empaquetó, se criopreservó, se esterilizó y se colocó en un almacenamiento antes del uso como un injerto vascular.

Para la preservación, el tejido se empaquetó en paquetes estériles que contenían solución Dulbeccos' Modified Eagles Medium (DMEM) y 10% dimetil sulfóxido (DMSO) con 10% de suero bovino fetal. La criopreservación se realizó utilizando un congelador de tasa controlada para reducir la temperatura del paquete a -80ºC a 0,5ºC por minute. Cuando la temperatura del tejido había alcanzado -80ºC se extrajo cada paquete y se colocó en nitrógeno líquido a -196ºC para almacenamiento a largo plazo. La esterilización del tejido se realizó en el estado congelado utilizando una dosis de 25-30 kGy de radiación gamma. A continuación de la esterilización, el tejido se almacenó a -196ºC en nitrógeno líquido hasta su uso.

Antes de la implantación, la matriz de tejido se descongeló para extraer la solución crioprotectora del tejido. Los injertos fueron descongelados rápidamente a 4ºC en un a baño de agua a una temperatura de 37-42ºC. El tejido fue rápidamente transferido a DMEM conteniendo 0,5% manitol. El manitol y los crioprotectores residuales se extrajeron mediante dilución con soluciones 0,5, 0,25 y 0,0 M de manitol en DMEM. A continuación de estos lavados, se realizó la implantación de conducto bovino acelular (es decir, la matriz de tejido tubular resultante) como un injerto interposicional extremo-a-lado en las arterias carótida izquierda y derecha y femoral izquierda de un perro mestizo adulto. Las longitudes del injerto estuvieron entre 9 y 12 cm y el diámetro interno de los injertos fue de entre 5 y 10 mm. La implantación se realizó utilizando técnicas quirúrgicas estándar para implantación de injerto vascular en estas posiciones. Se administró un régimen de anticoagulante oral de 325 mg Aspirina y 75 mg Persantin diariamente al animal comenzando dos días antes del procedimiento quirúrgico.

Dos semanas y cuatro semanas después de la cirugía, se realizaron arteriogramas para determinar la evidencia de los injertos implantados. El animal fue sacrificado y los injertos explantados inmediatamente a continuación del segundo arteriograma cuatro semanas después de la cirugía. Los injertos explantados se evaluaron para evidencia y apariencia bruta y adicionalmente se examinaron histológicamente para determinar la integridad microscópica del injerto.

Resultados

Durante las cuatro semanas de duración del estudio, el animal se comportó normalmente y no hubo complicaciones a continuación de la cirugía. Dos semanas y cuatro semanas después de la cirugía, los tres injertos de uréter bovino fueron determinados como completamente evidentes en un examen angiográfico. Cuatro semanas después de la cirugía, el análisis grueso del tejido de injerto explantado indicaba que no había habido una respuesta curativa que hubiera estabilizado los injertos en el sitio quirúrgico y la evidencia de todos los injertos fue confirmada mediante la observación del flujo a través del injerto antes de colocar los injertos en formalina para fijación. Después de la fijación cada injerto se cortó en siete muestras separadas para análisis histológico. Se tomaron muestras de la arteria nativa en ambos extremos proximal y distal lejos del injerto. Secciones de las anastomosis de los sitios proximal y distal se tomaron junto con la porción proximal, media y distal de cada injerto. A continuación del procesamiento, inclusión de parafina y seccionado, muestras del injerto se tiñeron utilizando una hematoxilina estándar y tinte eosina. El análisis microscópico reveló que los injertos estaban estructuralmente intactos. La matriz del uréter bovino había comenzado a volverse re-vitalizado a través del movimiento de componentes celulares a partir de los bordes exteriores del área quirúrgica. A través de esta remodelación los injertos fueron tomando la apariencia de conductos naturales portadores de sangre arterial.

Ejemplo 2 Implantación de Uréter Porcino Descelularizado como un Injerto Vascular Periférico en el Perro Procedimientos

Tejido de uréter porcino se recogió y preparó y preservó exactamente como se describió en el Ejemplo 1 con la excepción de que las dimensiones de los tejidos seleccionados para procesamiento fueron de 3 mm de diámetro interno y 25 cm de longitud. La implantación de uréteres porcinos tratados se realizó en un perro mestizo adulto como un injerto vascular interposicional extremo-a-extremo en las arterias femorales izquierda y derecha y en las arterias carótidas izquierda y derecha. Todos los injertos fueron examinados mediante arteriograma dos semanas después de la cirugía. El animal fue sacrificado cuatro semanas después de la cirugía y los injertos fueron explantados para examen grueso y evaluación histológica de rendimiento. Se tomaron y tiñeron muestras histólogicas y como se describió en el Ejemplo 1.

Resultados

Arteriogramas realizados dos semanas después de la implantación mostraron que los injertos eran patentes. En la explantación, el examen grueso indicó que los injertos eran completamente patentes y difíciles de distinguir del vaso sanguíneo nativo. El examen histológico mostró que los injertos se habían recelularizado parcialmente con células en forma de huso. Esta recelularización probablemente representa las primeras etapas de remodelación en un conducto portador de sangre completamente funcional que sería indiscernible del tejido nativo.

Ejemplo comparativo 3

Implantación de Arteria Uterina Bovina Descelularizada como un Injerto Vascular Periférico en el Perro Procedimientos

Tejido de arteria uterina bovina se recogió y preparó y preservó exactamente como se describió en el Ejemplo 1. La implantación de arteria uterina bovina tratada se realizó en un perro mestizo adulto como un injerto interposicional extremo-a-lado en la arteria carótida. Después de 4 semanas de implantación, los injertos fueron explantados y tomados para análisis histológico.

Resultados

Cuatro semanas después de la implantación, los injertos eran patentes. La histología indicó que estos injertos habían comenzado a tomar células del animal huésped.

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Ejemplo comparativo 4

Implantación de Arteria Gástrica Bovina Descelularizada como un Injerto Vascular Periférico en el Perro Procedimientos

Tejido de arteria gástrica bovina se recogió y preparó y preservó exactamente como se describió en el Ejemplo 1. La implantación de arteria uterina bovina tratada se realizó en un perro mestizo adulto como un injerto interpositional extremo-a-lado en la arteria carotida. Después de 4 semanas de implantación, los injertos fueron explantados y llevados para análisis histológico.

Resultados

Ejemplo 5 Determinación de Características Fuerza de Estallido de Uréter Bovino Descelularizado Procedimientos

Tres segmentos de tejido de uréter bovino fueron recogidos y preparados y preservados exactamente como se describió en el Ejemplo 1. Utilizando gas nitrógeno comprimido, se determinó la presión requerida para estallar el injerto incrementando lentamente la presión de carga de nitrógeno aplicada al injerto. El gas fue contenido dentro del injerto utilizando ajustes de tubería de alta presión estándar y ataduras de cable. Cada segmento de injerto fue probado por duplicado y se calculó la fuerza de estallido promedio para cada injerto.

Resultados

Se encontró que los tres injertos estallaron a 448, 327 y 310 kPa (3361, 2456 y 2327 mm Hg), siendo el promedio 361 kPa (2715 mm Hg). Esta magnitud representa una fuerza de estallido de alrededor de 1,5 veces de la vena safena fresca humana que es comúnmente utilizada en procedimientos de bypass quirúrgico.

Ejemplo 6 Determinación de Características de Fuerza de Estallido de Uréter Porcino Descelularizado Procedimientos

Seis segmentos de tejido de uréter porcino fueron recogidos y preparados y preservados exactamente como se describió en el Ejemplo 2. Utilizando gas nitrógeno comprimido, se determinó la presión requerida para estallar el injerto incrementando lentamente la presión de carga de nitrógeno aplicada al injerto. El gas fue contenido dentro del injerto utilizando ajustes de tubería de alta presión estándar y ataduras de cable. Cada segmento de injerto fue probado por duplicado y se calculó la fuerza de estallido promedio para cada injerto.

Resultados

Se encontró que los seis injertos estallaron a 275, 689, 896, 816, 758, y 483 kPa (2068, 5171, 6722, 6722, 5688 y 3520 mm Hg), siendo el promedio 666 kPa (4999 mm Hg). Este valor representa una fuerza de estallido de casi 3 veces la vena safena fresca humana que es comúnmente utilizada en procedimientos de bypass quirúrgico.

Ejemplo comparativo 7

Recelularización In Vitro de Uréter bovino Descelularizado con Células de Conducto Vascular Procedimientos

Tres segmentos de tejido de uréter bovino fueron recogidos y preparados y preservados exactamente como se describió en el Ejemplo 1. Cada pieza de tejido se colocó en un matraz de cultivo de tejido de 75cc conteniendo DMEM y suplementado con 10% de suero fetal bovino. Cada injerto se sembró con células endoteliales o células de músculo liso para permitir el crecimiento celular dentro de los segmentos de injerto. Los cultivos se alimentaron utilizando suero fresco suplementado con DMEM dos veces cada semana durante 4 semanas. Después de 4 semanas, los tejidos se extrajeron del sistema de cultivo y se examinaron utilizando seccionamiento histológico del tejido y teñido H&E.

Resultados

Después de cuatro semanas de cultivo celular, se observaron células endoteliales creciendo sobre la superficie del tejido de injerto pero no internamente. Además, se encontraron células del músculo liso creciendo sobre la superficie de los injertos y en la pared del material de injerto material una vez que podían ganar el acceso a la superficie del injerto.

Ejemplo 8 Injerto de tejido Derivado de Uréter como Injerto Aórtico en el Perro Procedimientos

Uréteres bovinos fueron utilizados para proporcionar la matriz de conducto para el injerto de tejido vascular. Estos tejidos están disponibles en longitudes y diámetros adecuados para un número de aplicaciones vasculares y no contienen válvulas en el lumen o poseen tributarios que requieran ligadura. Los uréteres fueron obtenidos de mataderos aprobados por el U.S Department of Agriculture. Los tejidos fueron lavados en solución de sal fisiológica y transportados para la preparación del tejido sobre hielo dentro de las 24 horas de recolección. Los uréteres fueron primero diseccionados libres de tejido conectivo adherente y grasa y sólo segmentos con un diámetro interno de 6 mm se tomaron para procesamiento adicional.

El procesamiento inicial consistió en la reducción de la biocarga utilizando una solución de múltiples antibióticos como se describió en el Ejemplo 1. La extracción de más del 95% de todo el material celular logró en diferentes etapas. Primero, incubación en agua estéril produjo la lisis hipotónica de las células. La matriz de tejido resultante se equilibró entonces en tampón (PBS) y se trató con una solución que contenía ribonucleasa y deoxiribonucleasa (ver Ejemplo 1). Un lavado isotónico durante varios días completó la extracción de la proteína celular. La extracción de restos celulares se monitorizó utilizando el teñido con hematoxilina y eosina de secciones histológicas. Las matrices de tejido se esterilizaron entonces mediante irradiación gamma (25 kGy a 40 kGy) antes del uso y se llevó a cabo un análisis de esterilidad en cada lote de procesamiento.

Ocho perros mestizos que pesaban 22,6-27,2 kg (50 a 60 lb) se anestesiaron con tiopental sódico, se intubaron endotraquealmente y se colocaron en isoflurano inhalado. Se prepararon los abdómenes y se cubrieron de manera estéril. Se realizó una incisión media y se aisló la aorta distal abdominal de las arterias renales en cada perro. Los conductos vasculares se prepararon mediante el lavado de la matriz de tejido en 100 ml de HEPES- Dulbecco's Modified Eagle Medium estéril tamponado y un segmento de aproximadamente 6cm de longitud y 6 mm de diámetro interno se insertó como un injerto de interposición aórtica utilizando suturas de proleno interrumpidas para construir anastomosis proximal y distal, extremo a extremo. Todos los animales recibieron 325 mg de aspirina y 75 mg de dipiridamole p.o. diariamente durante 2 días antes, y durante 14 días a continuación de la cirugía.

Se observaron evidencia y estabilidad estructural con el examen angiográfico a continuación de la cirugía cada 6 semanas en los supervivientes más prolongados y una vez inmediatamente antes de la eutanasia. Dos animales fueron sacrificados a las 3 semanas, 3 a las 6 semanas, y 1 animal a las 13 semanas después de la cirugía. Los 2 animales restantes fueron finalmente evaluados a las 43 semanas y aún viven. Después del sacrificio, se extrajeron los injertos en bloque incorporando las anastomosis proximal y distal inspeccionadas gruesamente y procesadas para análisis histológico.

A continuación de la recolección, los injertos se fijaron en solución 10% formaldehido tamponado. La totalidad del injerto junto con los sitios de anastomosis y aorta nativa proximal y distal se dividió en 7 segmentos de tejido y se colocó en bloques de parafina para el procesamiento. Secciones teñidas con hematoxilina y eosina de estos tejidos se examinaron y se llevó a cabo el análisis inmunohistoquímico utilizando antibióticos específicos para identificar la presencia de \alpha-actina de músculo liso (\alpha-SMA), desmina y filamentos contráctiles vimentina.

Resultados

Después del procesamiento, los tejidos de injerto vascular preparados a partir de uréter bovino mostraron la extracción mayor del 95% de material celular bovino. Lo restante consistía en restos celulares y no en células intactas. Se demostraron la esterilidad del injerto de conducto y los niveles de pirógeno por debajo de 20 unidades de endotoxina. La implantación de estos injertos de interposición en la aorta infrarenal canina no fue complicada y las propiedades de manipulación de los injertos fueron similares al tejido vascular normal.

Arteriogramas realizados en cada uno de los perros indicaron que los injertos eran completamente funcionales a lo largo del período de implante de 43 semanas sin la aparición de dilatación o estenosis. La evaluación gruesa de todos los injertos explantados después de 3, 6 y 13-semanas de implantación confirmó injertos completamente patentes. El examen histológico mostró una respuesta de curación alrededor de la adventicia del injerto con recelularización del medio. Una capa de células sobre la superficie lumenal se asemejaba al endotelio. Todas las células encontradas en el injerto se presumió que se había originado a partir del huésped por el material de injerto original era acelular. La extensión de la recelularización intermedia fue aproximadamente 20% a las 3-semanas, 30% a las 6-semanas y 50% a las 13-semanas. La revitalización del medio de injerto parecía producirse desde el área adventicia hacia el lumen y al progresar la recelularización, había una organización circunferencial de células creciendo perpendiculares al flujo de sangre en el conducto.

Análisis de los sitios de anastomosis mostraron que la hiperplasia íntima era mínima y el sobrecrecimiento celular fue evidente en la línea de sutura creando una transición suave desde la aorta nativa al injerto. Histológicamente, no había evidencia de reacción hiperplástica estrechando el lumen en el injerto explantado después de 13-semanas. También, no se observó estrechamiento angiográficamente hasta 43-semanas después de la implantación.

Se utilizó teñido inmunohistoquímico para identificar el tipo de células presentes en los injertos recelularizados. La proporción de células que expresaban proteínas contráctiles de músculo liso fueron demostradas utilizando tintes que contenían anticuerpos para \alpha-SMA, desmin y vimentin. Un porcentaje muy alto de células intermedias a las 3, 6 y 13 semanas, fueron \alpha-SMA positivas. Vimentin también se expresó comúnmente mediante células \alpha-SMA positivas. Las células desmin positivas fueron menos abundantes pero presentes en una subpoblación. La mayoría de las células presentes en los injertos se tiñeron positivamente para al menos una de estas proteínas contráctiles. Como no había células intactas presentes en los conductos del injerto antes del implante, todo el inmunoteñido específico demostrable de célula para \alpha-SMA, desmin y vimentin estaba presente en células que se habían originado a partir del
huésped.

Ejemplo 9 Uso del Injerto de Tejido Derivado a partir de Uréter como una Fistula Arterio-Venosa en el Perro Procedimientos

Nueve segmentos de conducto tejido de injerto de uréter bovino tratados, preparados como se describió en el Ejemplo 9, (20 cm x 6 mm ID) fueron implantados como injertos arteriovenosos en la arteria carótida (CA) y la vena yugular (JV) (n=5), o en la arteria femoral (FA) y la vena femoral (FV) (n=4) en 6 perros adultos. Un grupo de control de 7 perros recibió 11 injertos (6 mm ID) politetrafluoroetileno (PTFE) (7 en la CA y JV, y 4 en la FA y FV). Todos los injertos fueron madurados durante 14 días y entonces se accedieron de manera simulada una vez a la semana con dos agujas de hemodiálisis calibre 17. Rutinariamente durante un período de 6 meses, se determinó la evidencia y se extrajo sangre para monitorizar CBC y factores de coagulación. Se realizó el análisis histológico en un sub-grupo de injertos explantados a las 2, 4, 10 y 24 semanas.

Resultados

27% (3/11) de los injertos PTFE se infectó, mientras que ninguno de los conductos de injerto de tejido preparados según la presente invención se infectó durante el estudio. La tasa de evidencia del conducto de injerto de tejido fue del 86% comparada con el 72% para los injertos PTFE. El recuento de célula blancas de la sangre no fue elevada en ningún grupo a las 2 y 7 semanas y los factores de coagulación de la sangre tampoco cambiaron. Los tiempos de hemostasis después de la adhesión similada de los injertos fue más largo (10 minutos de media) en los injertos PTFE comparado con los conductos de injerto de tejido (3 minutos de media). La histología a las 10-semanas mostró que los conductos de injerto de tejido habían sufrido la recelularización de la media túnica con células huésped en forma de huso así como una excelente incorporación en tejidos circundantes como se evidenció mediante el crecimiento capilar interno dentro de la túnica adventicia. Los injertos PTFE no mostraron crecimiento interno celular significativo y una ausencia de endotelio luminal.

Ejemplo 10 Empaquetado y Esterilización de Injerto de Tejido Empaquetado

El producto de tejido es empaquetado en bolsas de poliéster claro sellado térmicamente conteniendo salino tamponado con fosfato y almacenados a 4º centígrado durante hasta 7 días antes de la esterilización.

Envío

Tres ladrillos de gel frío congelado de 0,9 kg (2 lb) se colocan en el fondo de un contenedor de cartón pre-helado (48x37x56cm) (19'' x 14.5'' x 22'') aislado con 2'' de espuma de poliuretano. Dos separadores de cartón se colocan encima de éstos.

Tres ladrillos de gel de 0,9 kg (2 lb) se añadieron seguidos por la carga de 18 litros de producto (1.100 pulgadas cúbicas).

Dos bolsas de relleno se utilizan como indicadores de temperatura sobre los cuales están presentes varias bandas indicadoras de temperatura, las bolsas de relleno se colocan entre las muestras. También se coloca un registrador de temperatura mecánico de siete días entre las muestras.

Tres ladrillos de gel fríos de 0,9 kg (2 lb) se colocan encima de la carga de producto seguida por un separador de cartón y tres ladrillos de gel congelados 0,9 kg (2 lb). Un tapón de espuma se coloca encima de la última capa de ladrillos y la caja se cierra.

La caja se envía a la instalación de esterilización para esterilización mediante irradiación gamma a 25-40 kGy. La caja se devuelve entonces y el producto es desempaquetado y almacenado a temperatura ambiente hasta el uso. El tiempo de tejido total entre empaquetado y desempaquetado es ventajosamente menos de 100 horas y la temperatura se mantiene a lo largo de todo este período a 2ºC-8ºC.

Almacenamiento

El injerto de tejido puede ser almacenado a temperatura ambiente durante 2 años.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citadas por el solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

\bullet WO 60178632 A [0001]

\bullet WO 9836707 A [0005]

\bullet US 5899936 A [0005]

Documentos no procedentes de patentes citados en la descripción

\bullet Transplantation Techniques and use of Cryopreserverd Allograft Cardiac Valves and Vasular Tissue. Adams Publishing Group, Ltd, 9-23 [0019]

Claims

1. Procedimiento de preparación de un injerto de tejido tubular consistente en:

i): lavar un tejido inicial que es un uréter humano o animal con al menos un agente reductor de biocarga de forma que dicho tejido inicial es desinfectado,

ii): descelularizar el tejido desinfectado resultante a partir de la etapa (i) con una solución que lisa las células de dicho tejido desinfectado de forma que se forma una matriz de tejido,

iii): contactar dicha matriz de tejido resultante de la etapa (ii) con una nucleasa de forma que el ácido nucléico asociado con dicha matriz de tejido es degradado,

iv): lavar dicha matriz de tejido resultante de (iii) de forma que se extraen restos celulares o extracelulares retiradas y se obtiene dicho injerto de tejido y, opcionalmente criopreservar y/o esterilizar dicha matriz de tejido.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en donde dicho al menos un agente reductor de biocarga comprende un agente antimicrobiano.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, en donde el agente antimicrobiano comprende un antibiótico.

4. Procedimiento según la reivindicación 1 en donde dicha solución que lisa dichas células comprende agua estéril.

5. Procedimiento según la reivindicación 1, en donde dicha solución que lisa dichas células comprende un tampón hipotónico acuoso o tampón de baja fuerza iónica.

6. Procedimiento según la reivindicación 1, en donde dicha solución que lisa dichas células comprende una proteasa inhibitoria.

7. Procedimiento según la reivindicación 1, en donde dicha nucleasa comprende una exonucleasa y/o una endonucleasa.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, en donde dicha nucleasa comprende deoxiribonucleasa I (ADNsa I) y ribonucleasa A (ARNsa A).

9. Procedimiento según la reivindicación 8, en donde la etapa (iii) comprende contactar dicha matriz de tejido con dicha nucleasa de 20ºC a 38ºC durante de 1 a 36 horas.

10. Procedimiento según la reivindicación 1, en donde la etapa (iv) comprende lavar dicha matriz de tejido a 2ºC hasta 42ºC.

11. Procedimiento según la reivindicación 1, que consiste además en, después de la etapa (iv), esterilizar dicha matriz de tejido.

12. Procedimiento según la reivindicación 11, en donde dicha matriz de tejido se mantiene en un estado no congelado a una temperatura entre 0ºC y 40ºC

13. Procedimiento según la reivindicación 11, en donde dicha matriz de tejido se mantiene a aproximadamente 25ºC antes de la implantación.

14. Procedimiento según la reivindicación 11, en donde dicha esterilización se efectúa utilizando irradiación gamma, iodo, ácido peracético o rayo de electrones.

15. Procedimiento según la reivindicación 14, en donde dicha esterilización se efectúa utilizando irradiación gamma.

16. Procedimiento según la reivindicación 14, en donde dicha matriz de tejido se mantiene a una temperatura entre 2ºC y 8ºC durante dicha esterilización.

17. Procedimiento según la reivindicación 1, en donde dicha matriz de tejido es criopreservada.

18. Injerto de tejido producido mediante un procedimiento consistente en las etapas de:

i): lavar un tejido inicial que es un uréter humano o animal con al menos un agente reductor de biocarga de forma tal que dicho tejido inicial es desinfectado,

ii): descelularizar el tejido desinfectado resultante de la etapa (i) con agua estéril o un tampón hipotónico acuoso que lisa las células de dicho tejido desinfectado de forma tal que se forma una matriz de tejido descelularizada,

iii): contactar dicha matriz de tejido descelularizada resultante de la etapa (ii) con al menos una nucleasa de forma tal que el ácido nucléico asociado con dicha matriz de tejido descelularizada es degradado,

iv): lavar dicha matriz de tejido decelularizada, tratada con nucleasa resultante de (iii) de forma tal que se extraen restos celulares o extracelulares y se produce dicho injerto, y opcionalmente criopreservar y/o esterilizar dicho injerto.

19. Injerto de tejido según la reivindicación 18, que es un injerto arteriovenoso descelularizado no fijado.

20. Injerto arteriovenoso según la reivindicación 19, en donde dicho tejido inicial es un uréter bovino.

21. Injerto de tejido según la reivindicación 18-20, adecuado para el uso donde el tejido defectuoso del paciente tiene una estructura tubular.

22. Injerto de tejido según la reivindicación 21, en donde dicho injerto de tejido es un injerto vascular, un injerto de uréter o una guía de nervio.

23. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4, 5, 8, 11 y 17, en donde dicho injerto de tejido tubular es un injerto arteriovenoso.

24. Procedimiento según la reivindicación 23, en donde dicho tejido inicial es un uréter bovino.

25. Procedimiento según la reivindicación 23 o la reivindicación 24 en donde dicha nucleasa se selecciona a partir del grupo consistente en ADNsa I y ARNsa A.

26. Injerto arteriovenoso según la reivindicación 19 o la reivindicación 20 en donde dicha al menos una nucleasa se selecciona del grupo consistente en ADNsa I y ARNsa A.

27. Injerto arteriovenoso según la reivindicación 26 en donde dicha al menos una nucleasa es ADNsa I y ARNsa A.