JP2013165740A - 無細胞化方法及び人体移植用人工組織 - Google Patents

Abstract

【課題】 ウシ等の動物から採取した腱や靭帯について、ＤＮＡの残存量をゼロにする無細胞化を可能にすること。
【解決手段】 本発明に係る無細胞化方法は、流れが付与された界面活性剤に動物組織を浸漬した状態で、当該動物組織にマイクロ波を照射する拍動循環処理の後で、核酸分解酵素溶液中に前記動物組織を浸漬し、振とう処理を行うことにより、前記動物組織の原細胞を除去し、コラーゲン、エラスチン等からなる基質のみにする。前記核酸分解酵素溶液としては、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）、或いは、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）とリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）の混合液が挙げられる。
【選択図】 なし

Description

本発明は、あらゆる種類の動物組織を無細胞化するのに好適となる無細胞化方法、及びその方法によって得られた人体移植用人工組織に関する。

本出願人らは、ウシやブタ等の動物から採取した心臓弁等の動物組織を人体に移植するために、当該動物組織を無細胞化させる方法を既に提案している（特許文献１、２参照）。この無細胞化方法は、拍動流が付与された界面活性剤に動物組織を浸漬した状態で、当該動物組織にマイクロ波を照射することで、前記動物組織の原細胞を除去する手法である。
国際公開第２００４／１００８３１号パンフレット 特開２００７−３０１２６２号公報

しかしながら、本発明者らが、鋭意実験研究を行った結果、動物から採取した心臓弁について前述の手法による無細胞化処理を行った場合には、組織中の残存細胞がほぼゼロになるものの、動物から採取した腱や靭帯について同様の無細胞化処理を行った場合には、組織中に細胞が残存することを知見した。

本発明は、このような知見に着目して案出されたものであり、その目的は、動物から採取した腱や靭帯についても無細胞化することができる無細胞化方法及びその方法によって得られた人体移植用人工組織を提供することにある。

（１）前記目的を達成するため、本発明は、流れが付与された界面活性剤に動物組織を浸漬した状態で、当該動物組織にマイクロ波を照射する拍動循環処理を経て、前記動物組織の原細胞を除去する無細胞化方法であって、
前記拍動循環処理の後で、核酸分解酵素溶液中に前記動物組織を浸漬する、という手法を採っている。

（２）また、本発明に係る人体移植用人工組織は、流れが付与された界面活性剤に動物組織を浸漬した状態で、当該動物組織にマイクロ波を照射してから、当該動物組織を核酸分解酵素溶液中に浸漬することにより無細胞化された前記動物組織からなる、という構成を採っている。

本発明によれば、動物から採取した血管や心臓弁等の他、従来の手法では、ＤＮＡ量をゼロにすることができなかった動物の腱や靭帯についても、無細胞化することができる。

本実施形態に係る無細胞化方法に用いられる生体組織処理装置の概略斜視図。

以下、本発明の実施形態について図面を参照しながら説明する。

図１には、本実施形態に係る無細胞化方法に用いられる生体組織処理装置の概略斜視図が示されている。この図において、生体組織処理装置１０は、ウシ等の動物から採取した腱や靭帯からなる動物組織Ｔを脱細胞する際に用いられる装置である。

前記生体組織処理装置１０は、動物組織Ｔを脱細胞するための細胞除去溶液を所定の回路によって一方向（図中矢印方向）に循環させる溶液循環部１１と、この溶液循環部１１の途中に設けられ、動物組織Ｔに対し細胞除去溶液を浸漬した状態で保持する組織保持部１２と、組織保持部１２の周囲に配置され、動物組織Ｔにマイクロ波を照射可能なマイクロ波照射手段１３とを備えて構成されている。

前記溶液循環部１１は、細胞除去溶液に拍動流を付与する拍動ポンプ１５と、この拍動ポンプ１５から吐出した細胞除去溶液が拍動ポンプ１５に戻るように配置された循環路１６と、この循環路１６内の細胞除去溶液が所望の状態になるように拍動ポンプ１５の動作を制御する制御手段１７と、循環路１６の途中に設けられて細胞除去溶液を冷却する冷却手段１８と、組織保持部１２から流出した循環路１６内の細胞除去溶液の流量及び圧力を測定する計測装置２５と、組織保持部１２から流出した直後の循環路１６内の細胞除去溶液の温度を測定する温度センサ２９とを備えて構成されている。

前記拍動ポンプ１５は、吐出時に拍動流を生成可能な拍動型ポンプであれば何でも良く、例えば、本出願人によって既提案された（特願２００２−１６７８３６号等参照）ポンプが挙げられる。

前記循環路１６は、拍動ポンプ１５の流出ポート２０から吐出した細胞除去溶液が、外気に非接触となる状態で流入ポート２１に流入する閉ループ状に構成されている。この循環路１６は、人体の血液の体循環状態を模擬可能となる構造が採用されており、本出願人によって既提案された構造（国際公開第２００４／１００８３１号パンフレット）と実質的に同一の構造となっている。

前記制御手段１７は、前記計測装置２５により測定された細胞除去溶液の流量及び圧力に基づき、循環路１６内の細胞除去溶液に所望の拍動流が付与されるように拍動ポンプ１５の駆動を制御するようになっている。

前記冷却手段１８は、流入ポート２１に流入する直前の循環路１６の一部分を水に浸漬させることで細胞除去溶液を冷却する水槽２７と、この水槽２７内の水温を低下させる冷却装置２８とを備えている。この冷却装置２８は、マイクロ波の照射によって加温された循環路１６内の細胞除去溶液を冷却するように機能する。

前記組織保持部１２は、循環路１６内を流れる細胞除去溶液を導き、当該細胞除去溶液に動物組織Ｔを浸漬させた状態で保持可能となっている。

前記マイクロ波照射手段１３は、組織保持部１２の下側位置に設けられて当該組織保持部１２に対して回転可能に設けられた円盤状のテーブル３１と、このテーブル３１上に載るとともに、組織保持部１２の側方からマイクロ波を照射する照射装置３２とを備えて構成されている。

前記テーブル３１は、図示しないモータ等によって回転速度が制御された状態で回転されるようになっており、テーブル３１の回転により、組織保持部１２の側方ほぼ全周から動物組織Ｔに万遍なくマイクロ波が照射されることになる。

前記照射装置３２は、マイクロ波の発生源として図示しないマグネトロンを利用した公知の装置である。この照射装置３２は、周波数が２．４５ＧＨｚ、出力が０Ｗ〜１５００Ｗ程度のマイクロ波を照射可能となるものが用いられており、前記温度センサ２９の計測値に基づき、自動的にマイクロ波の照射を停止若しくは開始するようになっている。すなわち、循環路１６内の細胞除去溶液がマイクロ波の照射によって加温されて、ヒトの体温程度（約３７℃）以上になった場合には、マイクロ波の照射を自動的に停止するようになっている。そして、前述したように、冷却装置２８により、循環路１６内の細胞除去溶液の温度がヒトの体温程度（約３７℃）未満に低下すると、再びマイクロ波の照射を開始するようになっている。

なお、図中一点鎖線で描かれた部材は、組織保持部１２が収容されてテーブル３１と一体回転可能なケース３４である。当該ケース３４は、その内部に照射装置３２の照射部３２Ａが入り込んでおり、当該照射部３２Ａから照射されたマイクロ波をケース３４の外側に漏出させないように設計されている。

また、図中符号３５は、テーブル３１の回転に伴う照射装置３２のコードＣの絡まりを防止するために設けられたスリップリングである。

次に、本発明に係る無細胞化方法について説明する。

先ず、動物の腱や靭帯などの動物組織Ｔを組織保持部１２にセットして、生体組織処理装置１０内に細胞除去溶液を注入し、当該細胞除去溶液を循環させる。ここで、細胞除去溶液として、例えば、デオキシコール酸（胆汁酸）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、トリトンＸ−１００等の界面活性剤が用いられる。そして、図示しない所定のスイッチを投入すると、拍動ポンプ１５が駆動し、循環路１６内を細胞除去溶液が循環し、拍動ポンプ１５から吐出した細胞除去溶液は、拍動流となって組織保持部１２内を流れ、更に循環路１６を流れながら拍動ポンプ１５に流入する。

この際、テーブル３１の回転により、照射装置３２が回転しながら動物組織Ｔの側方ほぼ全周に満遍なくマイクロ波が照射される。

その後、動物組織Ｔを生体組織処理装置１０から取り出し、核酸分解酵素溶液に所定時間浸漬すると、動物組織Ｔが無細胞化されて人体移植用人工組織が得られる。すなわち、ここで得られた動物組織Ｔは、各種の原細胞（内皮細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞）が除去され、コラーゲン、エラスチン等からなる基質のみになる。ここで用いられる核酸分解酵素溶液としては、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）、或いは、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）とリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）の混合液が挙げられる。

なお、生体組織処理装置１０を用いずに、定常流が与えられた細胞除去溶液中に動物組織Ｔを浸漬した状態で、当該動物組織Ｔの周囲からマイクロ波を照射し、その後、前述の核酸分解酵素溶液による処理を行ってもよい。

本発明者らは、前述の無細胞化処理の効果を実証するための実験を行った。

この実験では、動物組織として、幅４ｍｍ、厚さ４ｍｍ、長さ５０ｍｍのウシ指伸筋腱を用い、以下の各処理を行い、当該処理後における動物組織のＤＮＡ量を測定し、未処理の動物組織に対するＤＮＡの残存割合（％）を算出した。

（実施例１）
前記動物組織に対し、先ず、生体組織処理装置１０による脱細胞化処理（以下、「拍動循環処理」と称する。）を行った後で、核酸分解酵素溶液による振とう処理を行った。ここで、拍動循環処理は、界面活性剤としてデオキシコール酸を用い、その平均流量を毎分６リットル、平均液圧を９０ｍｍｈｇとした。また、照射装置３２で照射されるマイクロ波については、周波数を２．４５ＧＨｚとし、出力６００Ｗで延べ７２時間照射した。更に、核酸分解酵素溶液として、１００Ｕ／ｍｌのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）溶液を用い、振とう処理を２４時間行った。
その結果、動物組織のＤＮＡ量はゼロになり、未処理の動物組織に対するＤＮＡの残存割合は０％となった。

（実施例２）
前記実施例１に対し、マイクロ波の照射時間を４８時間とした他は、実施例１の条件と同一とし、実施例１と同様の処理を行った。
本実施例についても、実施例１と同様の結果が得られた。

（実施例３）
前記実施例１に対し、マイクロ波の照射時間を２４時間とした他は、実施例１の条件と同一とし、実施例１と同様の処理を行った。
本実施例についても、実施例１と同様の結果が得られた。

（実施例４）
図示しない定常流発生装置によって定常流が与えられた界面活性剤に前記動物組織を浸漬させながら、当該動物組織の周囲にマイクロ波を照射し、その後、実施例１と同様の核酸分解酵素溶液による振とう処理を行った。ここでの処理は、界面活性剤としてデオキシコール酸を用い、その流量を毎分６リットル、液圧を９０ｍｍｈｇとした。また、照射されるマイクロ波については、周波数を２．４５ＧＨｚとし、出力６００Ｗで延べ２４時間照射した。
本実施例についても、実施例１と同様の結果が得られた。

（実施例５）
前記実施例１に対し、核酸分解酵素溶液として、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）溶液の代わりに、ＤＮａｓｅ（１５０Ｕ／ｍｌ）とＲＮａｓｅ（１００Ｕ／ｍｌ）の混合液を用い、その他は、実施例１の条件と同一とした。
本実施例についても、実施例１と同様の結果が得られた。

（比較例１）
前記実施例１に対し、拍動循環処理のみを同一条件で行い、振とう処理は行わなかった。
その結果、未処理の動物組織に対するＤＮＡの残存割合は、６１％となった。

（比較例２）
前記実施例１に対し、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）溶液による振とう処理のみを同一条件で行い、拍動循環処理は行わなかった。
その結果、未処理の動物組織に対し、ＤＮＡを殆ど除去できなかった。

（比較例３）
前記実施例５に対し、ＤＮａｓｅとＲＮａｓｅの混合液による振とう処理のみを同一条件で行い、拍動循環処理は行わなかった。
その結果、未処理の動物組織に対するＤＮＡの残存割合は、３７％となった。

（比較例４）
前記実施例１に対し、拍動循環処理と振とう処理をそれぞれ同一条件とし、逆の手順でこれら各処理を行った。すなわち、振とう処理の後で拍動循環処理を行った。
その結果、未処理の動物組織に対するＤＮＡの残存割合は、４１％となった。

以上の結果により、本実施形態に係る無細胞化方法によれば、ウシ指伸筋腱を完全に無細胞化させることが可能になる。

なお、その他の腱や靭帯の他、血管、心臓弁、心膜等の動物組織についても、本発明の無細胞化方法を用いることにより、前記実施形態と同様の効果が得られる。

また、前記実施例１と実施例５でそれぞれ得られた処理後の動物組織は、本発明者らの強度実験（引張試験）によれば、実施例１の処理による動物組織の方が、高強度であることが判明した。従って、振とう処理時に用いる核酸分解酵素溶液としては、ＤＮａｓｅとＲＮａｓｅの混合液よりも、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）溶液を用いることが好ましい。

更に、本発明に係る無細胞化方法は、前記実施形態での生体組織処理装置１０の利用が必須ではなく、細胞除去溶液に流れが与えられた動物組織Ｔにマイクロ波を照射できる限りにおいて、種々の装置や手段を用いて行うことができる。

本発明によれば、生体適合性が優れた移植用の人工靭帯や人工腱等の人工組織の生産が可能になる。

１０ 生体組織処理装置
Ｔ 動物組織

Claims (2)

1. 流れが付与された界面活性剤に動物組織を浸漬した状態で、当該動物組織にマイクロ波を照射する拍動循環処理を経て、前記動物組織の原細胞を除去する無細胞化方法であって、
   前記拍動循環処理の後で、核酸分解酵素溶液中に前記動物組織を浸漬することを特徴とする無細胞化方法。
2. 流れが付与された界面活性剤に動物組織を浸漬した状態で、当該動物組織にマイクロ波を照射してから、当該動物組織を核酸分解酵素溶液中に浸漬することにより無細胞化された前記動物組織からなる人体移植用人工組織。

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