ES2326649T3 - Recuperacion de dna. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para recuperación por RT-PCR de cDNA de mRNA en complejos de presentación ribosomal, comprendiendo dicho procedimiento: (a) RT que usa un cebador que comprende una secuencia 5'' que es similar o idéntica a la secuencia de la región 5'' de mRNA y una secuencia 3'' complementaria a una región 3'' de mRNA, seguida por, (b) PCR que usa un cebador individual para amplificar el cDNA de cadena simple obtenido en (a); en el que el cebador individual usado para PCR es idéntico, solapante con o similar a, la secuencia 5'' del cebador usado para la etapa de reacción de RT.
Description
Recuperación de DNA.
La presente invención se refiere a la
recuperación de DNA, y más particularmente se refiere a un
procedimiento altamente sensible para la generación y recuperación
de cDNA y a cebadores adecuados para usar en tales
procedimientos.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
amplifica las secuencias de DNA a través de ciclos repetidos de
desnaturalización de plantilla, fusión del cebador y elongación. La
transcripción reversa (RT) acoplada con PCR
(RT-PCR) combina síntesis de cDNA a partir de
plantillas de mRNA con amplificación de PCR para proporcionar un
procedimiento para detección, conversión y recuperación de mRNA como
DNA rápido y sensible. El procedimiento de RT-PCR
se puede llevar a cabo bien en formato de un tubo o bien en formato
de dos tubos. En RT-PCR de un tubo, la RT y la PCR
tienen lugar sucesivamente en un único tubo usando un tampón mutuo
para ambas reacciones. En RT-PCR de dos tubos, la
RT y la PCR se llevan a cabo por separado. Se ha mostrado que
RT-PCR de un tubo tiene la sensibilidad mayor y que
se puede amplificar tan poco como 100 copias de mRNA (#TB220,
Promega). En RT-PCR de dos tubos, cada etapa se
puede optimizar separadamente y puede producir mayores rendimientos
de DNA en algunas circunstancias (TechNotes 9[6],
Ambion).
La alta sensibilidad (es decir obtener
suficiente cantidad de DNA a partir de tan poca plantilla como sea
posible) y la alta especificidad (es decir amplificar sólo la
plantilla deseada) son claves para PCR exitosa. Están afectadas por
muchos factores incluyendo la elección de DNA polimerasas adecuadas,
diseño de cebadores adecuados, tampones adecuados, parámetros de
termociclación y también la calidad de las plantillas.
Se ha desarrollado una aproximación de PCR de
cebador único para clonar secuencias desconocidas de DNA (Hermann y
col., (2000) BioTechniques 29: 117p-1180) y para
eliminación de acumulación de dímero de cebadores en PCR (Brownie y
col., (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3235-3241). La
PCR de cebador individual usa un cebador en la mezcla de PCR para
amplificar DNA que tiene secuencias flanqueantes idénticas en ambos
extremos. Recientemente, esta aproximación se ha usado para
amplificar moléculas individuales de DNA de cadena doble durante 80
ciclos, un procedimiento llamado PCR de molécula individual
(SM-PCR) (Rungpragayphan y col., (2002) J. Mol.
Biol. 318: 395-405). En este procedimiento, el DNA
de cadena doble se amplifica primero por PCR usando dos cebadores
para introducir una secuencia de marca en ambos extremos, después de
lo que el DNA modificado se diluye y se usa como la plantilla para
SM-PCR (Rungpragayphan y col., (2002) J. Mol. Biol.
318: 395-405). Sin embargo, ninguno de estos
procedimientos proporciona un procedimiento sensible para
recuperación de cDNA a partir de mRNA.
Se ha desarrollado un número de tecnologías de
presentación para selección de proteínas. Usando el principio de
fenotipo (proteína) acoplado a genotipo (gen), las proteínas se han
presentado exitosamente en fago, superficie celular y virus o
ribosoma, plásmido y mRNA. Los sistemas de presentación ribosomales
procarióticos y eucarióticos se han usado para selección de
péptidos, anticuerpos de cadena simple, enzimas, armazones de
proteína estables y otros dominios de unión a ligando. La
tecnología de presentación recupera DNA a través de la funcionalidad
de la proteína codificada. Se proporciona una revisión de la
tecnología de presentación ribosomal por He *& Taussig (2002)
Briefings in Functional Genomics and Proteomics, 1 (2):
204-212.
La recuperación de DNA sensible de mRNA se
requiere en presentación ribosomal. Este procedimiento de
presentación de proteína libre de células permite la selección y
evolución de proteínas in vitro (He y Taussig (1997) Nucleic
Acids Res. 25: 5153-5134; Hanes y Pluckthun, (1997)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4937-4942). El
procedimiento genera una biblioteca de complejos de presentación de
ribosomas, que son complejos de
proteína-ribosoma-mRNA (PRM), a
partir de una diversidad de moléculas de DNA por expresión libre de
células, seguida por captura de complejos de PRM específicos con un
ligando a través de interacción de unión de la proteína naciente
presentada. El mRNA asociado se recupera y amplifica después como
cDNA por RT-PCR. Una etapa clave en presentación de
ribosomas es la recuperación eficiente de material genético a partir
de complejos de DNA después de selección. Un procedimiento de
selección altamente sensible permitiría aislar especies raras de
bibliotecas muy grandes. Actualmente, se emplean dos procedimientos
de recuperación principales. Uno es un procedimiento de disrupción
ribosomal usado en la presentación ribosomal procariótica, que
libera mRNA por la disociación de complejos ribosomales con EDTA
seguida por RT-PCR (Hanes y Pluckthun, 1997). El
otro procedimiento es un procedimiento RT-PCR in
situ usado en presentación ribosomal eucariótica (He y Taussig,
1997), que recupera DNA directamente de complejos de PRM sin
disrupción ribosomal a través del uso de una hibridación de cebador
al menos 60 nucleótidos cadena arriba del extremo 3' del mRNA con
el fin de evitar la región ocupada por ribosoma detenido. Se ha
demostrado que el procedimiento in situ de
RT-PCR es más efectivo para recuperar DNA de
complejos ribosomales eucarióticos que el procedimiento de
disrupción ribosomal procariótico (He y Taussig, 2002 Briefings Func
Genomics & Proteomics 1: 204-212). Sin embargo,
ambos procedimientos requieren un procedimiento sensible para
recuperar cDNA a partir de mRNA.
La recuperación sensible de niveles bajos de
mRNA sería también extremadamente útil en técnicas tales como
RT-PCR de célula única donde por ejemplo están
estudiándose los patrones de expresión génica. Muchos genes
celulares se expresan a niveles muy bajos. Son difíciles o incluso
imposibles de recuperar por procedimientos tradicionales de
RUT-PCR. Actualmente, se llevan a cabo usualmente
rondas repetidas de reacciones de PCR (Gaynor y col., (1996)
Biotechniques 21: 286-291). Esto puede conducir a
errores artificiales y se requieren controles meticulosos. El
procedimiento RT-PCR descrito aquí es bastante
sensible de tal forma que se requiere sólo un procedimiento de
reacción de PCR, incluso cuando sólo está presente una molécula de
cDNA individual o un pequeño número de moléculas de DNA como la
plantilla inicial de PCR.
El documento US 629.170 revela amplificación de
RNA usando un cebador en el que la región 5' corresponde a la región
promotora T7 (en la que el promotor T7 no es parte del mRNA
transcrito).
El documento EP 0549107-A
describe diversos procedimientos del PCR de cebador individual para
el propósito de amplificación de ácido nucleico.
La presente invención proporciona un
procedimiento de recuperación de cDNA a partir de mRNA de
RT-PCR en complejos de presentación ribosomal como
se definen en la reivindicación 1 de las reivindicaciones
adjuntas.
La invención usa un cebador diseñado para usar
con mRNA que comprende una secuencia 5' basada en una región 5' del
mRNA y una secuencia 3' capaz de hibridar a una región 3' del
mRNA.
Un cebador diseñado para usar con mRNA se
refiere en el presente documento a un cebador de transcriptasa
reversa (RT).
La secuencia del cebador 5' es una secuencia
idéntica o similar a la secuencia de la región 5' de mRNA.
La secuencia del cebador 3' es una secuencia
complementaria a la región 3' de mRNA.
La secuencia 5' está diseñada a partir de un
conocimiento de la región 5' del mRNA, y es una secuencia que
hibridará específicamente con DNA complementario a una parte de la
región 5' del mRNA bajo las condiciones en las que se lleva a cabo
la reacción de RT. Típicamente la región 5' es idéntica a una parte
de la región 5' de mRNA o es similar a una parte de la región 5' de
mRNA, por "similar" se quiere decir que la secuencia no es
idéntica, pero tiene un alto grado de homología con la región 5' de
mRNA (por ejemplo homología del 80 al 99%, preferiblemente
homología del 85 al 99%, más preferiblemente homología del 90 al
99%, aún más preferiblemente homología del 95 al 99% con la región
5' del mRNA). Secuencias idénticas y similares son capaces de
hibridar específicamente con DNA complementario a una parte de la
región 5' del mRNA en las condiciones en las que la reacción se
lleva a cabo como se describe en el presente documento,
opcionalmente con etapa de precalentamiento. La región 5' está
usualmente en el intervalo de un 8-mero a un
30-mero, tal como un 10-mero a un
20-mero, preferiblemente alrededor de un
15-mero.
La secuencia de hibridación se diseña a partir
de un conocimiento de la región 3' del mRNA y es capaz de hibridar
específicamente a una parte de la región 3' de mRNA. Típicamente la
secuencia de hibridación es idéntica o similar a una secuencia
complementaria a una parte de la región 3' de mRNA. Por
"similar" se quiere decir que la secuencia está degenerada, es
decir no corresponde exactamente con la secuencia complementaria a
una parte de la región 3' de mRNA; secuencias idénticas y similares
son capaces de hibridación específica a una secuencia
complementaria a una parte de la región 3' de mRNA. Una secuencia
"similar" tiene un alto grado de homología con una secuencia
complementaria a una parte de la región 3' del mRNA (por ejemplo
homología del 80 al 99%, preferiblemente homología del 85 al 99%,
más preferiblemente homología del 90 al 99%, aún más
preferiblemente homología del 95 al 99% con una secuencia
complementaria a una parte de la región 3' del mRNA). Una secuencia
"similar" es capaz de hibridación específica a DNA
complementaria a una parte de la región 3' de mRNA bajo condiciones
en las que la reacción de RT se lleva a cabo como se describe en el
presente documento, opcionalmente con etapa de precalentamiento,
y/o en condiciones en las que se lleva a cabo una reacción de PCR
como se describe anteriormente. La secuencia de hibridación está
usualmente en el intervalo de un 8-mero a un
30-mero, tal como un 10-mero a un
20-mero, preferiblemente alrededor de un
15-mero. En el cebador, la secuencia de hibridación
está 3' en relación a la secuencia 5'.
La presente invención proporciona adicionalmente
un procedimiento para generar una molécula de cDNA que comprende
transcripción reversa de mRNA usando un cebador (cebador de RT) de
acuerdo con la invención. También se ha proporcionado un
procedimiento para recuperación de cDNA de cadena doble que
comprende generar cDNA de cadena simple por transcripción reversa
de mRNA usando un cebador de RT de acuerdo con la invención
(formando un dúplex mRNA/cDNA de cadena simple), y PCR para generar
y amplificar cDNA de cadena doble usando un cebador de PCR
individual como se describe anteriormente.
La presente invención proporciona un
procedimiento de RT-PCR ultrasensible que es
aplicable para generar y recuperar cDNA de cadena doble a partir de
cDNA. La alta sensibilidad y especificidad de este procedimiento se
hace posible por el uso de un cebador de RT introducir una secuencia
5' dentro de un DNA de cadena simple que puede después usarse como
una plantilla para la amplificación subsiguiente para llevar a cabo
por PCR de cebador individual, usando un cebador que se fusiona en
la secuencia 5'. La presente invención usa mRNA como la plantilla.
La secuencia 5', más que ser una secuencia diseñada artificialmente,
está diseñada a partir de la región 5' del mRNA y se introduce
dentro de DNA de cadena simple más que dentro de DNA de cadena
doble.
La presente invención puede proporcionar un
procedimiento para recuperación de cDNA de mRNA en complejos
ribosomales, estando dicho procedimiento definido en las
reivindicaciones adjuntas.
En un aspecto de un procedimiento para
recuperación de DNA de acuerdo con la invención, la plantilla de DNA
de cadena simple para la reacción de PCR puede presentarse como una
mezcla de un número pequeño de moléculas o como una molécula
individual. Esto se puede llevar a cabo antes de la reacción de PCR
por separación de moléculas de DNA de cadena simple producidas en
la etapa de RT. La separación se puede llevar a cabo por dilución
por ejemplo dilución en serie del producto de reacción de RT, y/o
por un procedimiento electroforético o un procedimiento bioquímico
tal como hibridación de cebador.
En procedimientos de la invención que incluyen
recuperación de cDNA, se prefiere que el mRNA esté primero al menos
parcialmente desnaturalizado antes de la reacción de RT, por ejemplo
por tratamiento con calor o por un procedimiento químico. Esto
reduce la estructura secundaria en el mRNA y permite al cebador
acceder a su secuencia objetivo. Preferiblemente la muestra que
contiene mRNA se calienta a una temperatura en el intervalo de 40ºC
a 75ºC, preferiblemente a una temperatura en el intervalo de 42ºC a
70ºC, más preferiblemente a 65ºC o mayor. Adecuadamente el
tratamiento de calor se aplica durante 2 a 20 minutos,
preferiblemente 3 a 10 minutos, lo más preferiblemente
aproximadamente 5 minutos. En el procedimiento de la invención que
implica recuperación de cDNA a partir de de complejos de
presentación ribosomal, (complejos de proteína-mRNA,
tal como complejos de
anticuerpo-ribosoma-mRNA) esta etapa
de tratamiento se optimiza, por ejemplo se escogen temperatura y
condiciones de reacción, para mantener asociación del ribosoma con
el mRNA. Las condiciones de temperatura adecuada que mantienen
integridad de complejos proteína-mRNA son calentando
a una temperatura en el intervalo de 40ºC a 70ºC, preferiblemente
42ºC a 65ºC durante 2 a 10 minutos, preferiblemente durante
alrededor de 5 minutos.
En un procedimiento de la invención para
recuperación de fragmentos de DNA, el cebador de RT usado es
adecuadamente cualquier oligonucleótido o mezcla de
oligonucleótidos en el/los que una región cebadora 3' es
complementaria a una región 3' de la plantilla de mRNA y en el/los
que la región 5' tiene una secuencia idéntica o similar a la región
5' del mRNA. Preferiblemente, el cebador de RT es cualquier
oligonucleótido o mezcla de oligonucleótidos en el/los que una
región cebadora 3' es complementaria a una región 3' del mRNA
plantilla incluyendo (pero no exclusivamente) a la cola de poli A,
es decir la región cebadora 3' puede ser opcionalmente
complementaria a una región que incluye al menos parte de la cola
de poli A y en el/los que la región cebadora 5' tiene una secuencia
similar o idéntica a la región 5' del mRNA.
Preferiblemente el cebador de RT usado es
cualquier oligonucleótido o cualquier mezcla de oligonucleótidos en
el/los que una región cebadora 3' es complementaria a una región 3'
del mRNA de plantilla y en el/los que la región del cebador 5'
tiene una secuencia similar o idéntica a la región 5' del mRNA
incluyendo el sitio de partida transcripcional, los elementos
reguladores, la secuencia de kozak, el codón de partida
traduccional, cualquier parte de la secuencia traducida o cualquier
secuencia consenso específica familiar encontrada en la región
5'.
Más preferiblemente el cebador de RT usado es
cualquier oligonucleótido o cualquier mezcla de oligonucleótidos en
el/los que una región cebadora 3' es complementaria a una región 3'
del mRNA de plantilla que incluye (pero no exclusivamente) la cola
de poli A, y en el/los que la región cebadora 5' tiene una secuencia
similar o idéntica a la región 5' del mRNA incluyendo el sitio de
partida transcripcional, los elementos reguladores, la secuencia de
kozak, el codón de partida traduccional, cualquier parte de la
secuencia traducida o cualquier secuencia consenso específica
familiar hallada en la región 5'.
En un procedimiento preferido que incluye una
etapa de PCR, el procedimiento de PCR individual usado para PCR es
idéntico, solapante con o similar a, la secuencia de región 5' del
cebador de RT usado para transcriptasa reversa.
La región cebadora 3' de un cebador RT de
acuerdo con la invención pueden ser complementaria a una región 3'
del mRNA de plantilla incluyendo la cola de poli A, es decir la
región cebadora 3' puede opcionalmente ser complementaria a una
región que incluya al menos parte de la cola de poli A.
En la recuperación de cDNA de ribosoma se puede
llevar a cabo presentación de complejos RT y PCR por separado en un
formato de dos etapas y cada etapa se puede optimizar para mejorar
la sensibilidad y la especificidad de recuperación de DNA.
La presentación ribosomal es un sistema de
presentación de proteína in vitro que une proteínas al mRNA
que las codifica, de tal forma que la selección de una proteína (por
ejemplo por unión a un ligando) captura simultáneamente el mRNA que
codifica la proteína. El engarce entre proteína y mRNA en complejos
de presentación ribosomal se produce por traducción de mRNA para
proporcionar complejos
proteína-ribosoma-mRNA (PRM) in
vitro. El mRNA capturado puede trascribirse de forma reversa en
cDNA de cadena simple que se puede convertir en cDNA de cadena
doble y se puede amplificar por PCR, proporcionando el gen que
codifica la proteína seleccionada. La reacción de RT se puede
llevar a cabo en mRNA en el complejo de presentación.
En la presentación ribosomal, los complejos de
PRM se producen por detención del ribosoma de tal forma que la
proteína naciente y el mRNA permanezcan asociados. Las estrategias
para lograr esto incluyen la adición de antibióticos tales como
rifampicina o cloranfenicol (para ribosomas procarióticos), o tales
como ciclohexaminda (para ribosomas eucarióticos) para parar
traducción de forma aleatoria. Alternativamente, el ribosoma puede
determinarse para detenerse en el extremo 3' de la plantilla de mRNA
debido a la deleción del codón de parada de la plantilla de mRNA;
el codón de parada que normalmente está reconociéndose por factores
de liberación que activan desprendimiento del polipéptido
naciente.
En general, el ribosoma presenta construcciones
que contendrían un promotor (T7, SP6 o T3) y una señal de
iniciación de traducción tal como una secuencia de
Shine-Dalgarno (procariótica) o de Kozak
(eucariótica). Se ha descrito también una secuencia consenso para
iniciación de proteína tanto en E. coli como en sistemas
eucariotas. Para permitir a la proteína naciente completa
presentarse y plegarse en su conformación activa, se requiere al
menos un dominio espaciador de al menos 23-30
aminoácidos de longitud en el extremo C terminal, para permitir a
la proteína salir completamente del "túnel" ribosomal. El
espaciador proporciona también una secuencia conocida para el
diseño de cebadores para la recuperación de RT-PCR.
Se ha usado exitosamente un número de espaciadores diferentes,
incluyendo la región constante de la cadena kappa de inmunoglobulina
(C), el gen III de fago filamentoso M13 y el dominio C_{H}3 de
IgM humana. Se ha encontrado que la longitud del espaciador afecta
la eficiencia de la presentación: un espaciador de 116 aminoácidos
fue más eficiente en presentación de proteínas que sus compañeros
más cortos. Para eliminar el codón de parada de DNA, se usa un
cebador 3' que carece del codón de parada durante la construcción de
PCR. Las construcciones diseñadas para presentarse en E.
coli procariota incorporarían secuencias que contienen
estructuras de tallo-lazo en los extremos 5' y 3'
del DNA para estabilizar mRNA contra degradación por actividades de
RNasa en sistemas libres de células de E. coli.
El polipéptido/proteína presentado puede ser una
proteína de longitud total, o un fragmento de la misma, un dominio
de proteína, o un polipéptido, o un anticuerpo de cadena simple, y
puede estar codificado por DNA sintético.
Una forma de complejo PRM es complejo
anticuerpo-ribosoma-mRNA (ARM) en el
que un complejo proteína anticuerpo de cadena
simple-ribosoma-mRNA se produce por
traducción in vitro. La proteína de anticuerpo de cadena
simple puede ser de longitud total o puede ser un fragmento de unión
de un anticuerpo de cadena simple, un fragmento de unión es capaz
de unir un ligando. En complejos
proteína-ribosoma-mRNA, el
anticuerpo de cadena simple puede ser, por ejemplo, un fragmento
V_{H}/K de cadena simple en el que el dominio VH está unido a la
cadena ligera completa, es decir
VH-engarce-VL-CL o
un fragmento scFv.
En una realización preferida, el complejo de
presentación ribosomal se trató antes de RT para reducir estructura
secundaria y hacer el mRNA accesible a cebador(es), esto se
puede llevar a cabo por calor y/o por tratamiento químico como se
describe anteriormente.
Inmediatamente antes de la etapa de RT el
complejo de mRNA ribosoma se mantiene usualmente a una temperatura
en el intervalo de 4ºC a 10ºC, generalmente a alrededor de 4ºC (por
ejemplo en hielo).
La reacción de RT se lleva a cabo en mRNA
asociado con el complejo, y se encontró que una etapa de
calentamiento a una temperatura en el intervalo de 40ºC a 70ºC,
preferiblemente 42ºC a 65ºC es útil antes de RT in situ para
asegurar síntesis de DNA de longitud completa.
La temperatura que se puede usar en la etapa de
calentamiento está dictada por la estructura secundaria de mRNA,
que se determina por la secuencia de mRNA. La temperatura óptima
durante una etapa de calentamiento para una secuencia dada se puede
determinar fácilmente experimentalmente, pero son generalmente
adecuadas temperaturas en el intervalo de 40ºC a 70ºC,
preferiblemente 42ºC a 65ºC.
Un cebador de RT preferido, adecuado para usar
en procedimientos de la invención que implican una reacción de RT,
es HuRT (SEQ ID Nº: 3).
Un cebador de PCR individual preferido, adecuado
para usar en procedimientos de la invención que incluyen una
reacción de PCR, es Kz1 (SEQ ID Nº: 1).
El diseño de la secuencia 5' está basado en una
secuencia presente en la región 5' de la población de mRNA (figura
1). En el ejemplo descrito aquí, la secuencia tiene lugar desde el
sitio de partida de transcripción al sitio de iniciación de
traducción (ATG).
5'-GAACAGACCACCATG-3' (SEQ ID Nº: 1,
cebador KZ1). La secuencia de hibridación está basada en una
secuencia consenso localizada en región 3' del mRNA (figura 1)
5'-ACTTCGCA GGCGTAGAC-3' (SEQ ID
Nº: 2). La transcripción reversa que usa el cebador de RT novedoso,
que comprende tanto la secuencia flanqueante como la secuencia de
hibridación de acuerdo con la invención (por ejemplo como se
muestra en la figura 1 como HURT
5'-GAACAGACCACCATGACTTCGCAGGCGTAGAC-3'
SEQ ID Nº: 3), incorpora la secuencia de 5' dentro del cDNA de
cadena simple en ambos extremos, permitiendo al cDNA resultante
amplificarse por un cebador individual compuesto de la secuencia 5'
SEQ ID Nº: 1 (figura 2). La PCR de cebador individual evita la
necesidad de optimizar las relaciones de cebador y las temperaturas
de fusión, incrementando así la sensibilidad y la especificidad de
PCR con una amplia elección de DNA polimerasas. Para recuperar DNA a
partir de complejos ribosomales, la introducción de la secuencia 5'
al cDNA también lo distingue de la entrada de DNA original,
eliminando cualquier amplificación por PCR potencial de la plantilla
de entrada. Tras esta recuperación de RT-PCR
altamente sensible, una segunda PCR se lleva a cabo fácilmente
usando dos cebadores para recrear una construcción de DNA de
longitud total (figura 2). Una construcción tal obtenida a partir de
cDNA de un complejo de presentación ribosomal es adecuada para
ciclos subsiguientes de presentación ribosómica.
Los autores de la presente invención han
mostrado que el cDNA con una secuencia 5' se puede amplificar hasta
100 ciclos sin producir bandas de DNA no específicas o corridas.
Así, una molécula de cDNA única se puede amplificar eficazmente a
través de 65 ciclos de PCR.
Los procedimientos de la invención pueden
llevarse a cabo de forma totalmente o parcialmente automatizada. La
presentación de complejo de mRNA proteína puede automatizarse,
la(s) reacción/reacciones de RT puede(n) automatizarse
y la(s) reacción/reacciones de PCR puede(n)
automatizarse.
Usando la presente invención, es posible
automatizar la presentación ribosomal, ofreciendo una herramienta
poderosa para rastrear simultáneamente librerías de
multipresentación o selección de diferentes ligandos para diversos
antígenos.
El producto de cebador de PCR individual se
puede convertir fácilmente en una forma adecuada para manipulaciones
adicionales tales como expresión de proteínas en un sistema libre
de células o en E. coli, o en ciclos repetidos de
presentación ribosomal por una segunda PCR para introducir algunos
elementos necesarios (por ejemplo promotor T7, sitios de enzimas de
restricción, marca de purificación, etc.) dentro de la construcción
del DNA.
Dado que esta invención es capaz de amplificar
una molécula individual de cDNA, también es posible clonar DNA de
cadena doble por PCR a través de presentación ribosomal de proteínas
funcionales sin usar células de E. coli, proporcionando una
vía para obtener clones de PCR a través de la función de proteína
codificada. Esta clonación de PCR in vitro ofrecería un
número de ventajas por encima de la estrategia de clonación de
E. coli en que (i) las moléculas de cDNA se separan (por
ejemplo por dilución) antes de amplificarse, de tal forma que las
especies de cDNA individuales se puedan obtener rápidamente por PCR,
evitando el procedimiento consumidor de tiempo y laborioso de
identificar clones de E. coli después de amplificación de DNA
y de transformación celular y (ii) es posible obtener clones de DNA
individuales que abarquen una población entera de cDNA por PCR de
alto rendimiento, mientras que la clonación de E. coli
generalmente recupera sólo una fracción de la población debido a la
manipulación de DNA y a la transformación celular, procedimientos
que dan como resultado pérdida de material.
La separación de moléculas de ácido nucleico,
por ejemplo por dilución se puede llevar a cabo para proporcionar
un único ácido nucleico y molécula, o un pequeño número de ácidos
nucleicos y moléculas en cada reacción. Así, mRNA en la forma de un
complejo, se puede diluir antes de la reacción de RT. La dilución
del cDNA se puede llevar a cabo antes de la reacción de PCR para
proporcionar una única molécula de ácido nucleico o un pequeño
número de moléculas de ácido nucleico por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5 ó 6
moléculas de ácidos nucleicos por reacción. Las moléculas de ácido
nucleico individuales y/o los pequeños grupos de moléculas de ácido
nucleico se pueden producir por diluciones seriadas.
Figura 1: construcción de DNA para la generación
de complejo de presentación de ribosomas.
Figura 2: el principio del
RT-PCR novedoso para recuperación de cDNA a partir
de complejo ribosómico.
Figura 3: eficiencia de RT-PCR
de dos tubos.
Los carriles 1 y 2 muestran los resultados de la
reacción de PCR de dos tubos, los carriles 3 y 4 muestran el
resultado de la reacción de PCR de un tubo, el carril 5 muestra un
marcador de tamaño de DNA.
Figura 4: curso temporal de PCR de 'cebador
individual'.
El carril 1 es un DNA marcador, el carril 2, 35
ciclos de PCR; el carril 3, 45 ciclos de PCR; el carril 4, 55 ciclos
de PCR; el carril 5, 65 ciclos de PCR; el carril 6, 75 ciclos de
PCR; el carril 7, 85 ciclos de PCR; el carril 8, 100 ciclos.
Figura 5: elección de enzimas de PCR.
Figura 6: amplificación de PCR de una molécula
de cDNA individual (a) muestra los resultados de la PCR del cebador
individual, (b) muestra los resultados de los experimentos de
identificación genética.
Figura 7: efecto de precalentamiento en
eficiencia de recuperación de DNA.
Figura 8: integridad de complejos de ARM.
Figura 9: efecto de precalentamiento a 42ºC y a
65ºC antes de la etapa de RT en eficacia de recuperación de DNA.
Se usa recuperación de presentación de ribosomas
en este ejemplo:
\vskip1.000000\baselineskip
(a) HuRT:
5'-GAACAGACCACCATGACTTCGCAGGCGTAGAC-3' se usa
para transcripción reversa (SEQ ID Nº: 3). La secuencia 5' (SEQ ID
Nº: 1) está subrayada.
(b) Kz1:
5'-GAACAGACCACCATG-3' (SEQ ID Nº: 1)
es la secuencia 5' y se usa para PCR de cebador individual.
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes cebadores (c y d) se usan para
recreación de la construcción de DNA de longitud total original para
ciclos de presentación ribosomal subsiguientes:
(c) T7Ab:
El promotor T7 está indicado en negrita.
\vskip1.000000\baselineskip
(d) Hurex-Ck:
\vskip1.000000\baselineskip
(a) ThermoScript (Invitrogen)
(b) RNAsa H SuperScript^{TM} II -
Transcriptasa reversa (Invitrogen)
(c) SUPERasa In (Ambion)
(d) DNA polimerasas Taq (Qiagen)
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 2 muestra el principio de la
RT-PCR para la recuperación del DNA a partir de
complejos ribosomales. RT se lleva a cabo primero en complejos
ribosomales sin aislamiento de mRNA a partir de los complejos usando
el cebador HuRT (SEQ ID Nº: 3). El cDNA resultante con la secuencia
5' se amplifica después por PCR usando el cebador Kz1 (SEQ ID Nº:
1).
El mRNA unido a ribosomas generado por
presentación ribosomal en la forma de complejo PRM se captura
usualmente por tubos recubiertos de ligandos o por perlas
magnéticas, se lava cinco veces con un tampón de lavado frío (4ºC)
(PBS conteniendo acetato de Mg 5 mM y Tween al 0,1%) (He y col.,
(1999) J. Immuno. Methods. 231: 105-117) y se usa
para recuperación del DNA por el siguiente procedimiento.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añaden a cada muestra 12 \mul de mezcla que
contiene 1 \mul de HuRT 16 \muM y 2 \mul de dNTP 10 mM. La
mezcla se calienta a 42ºC o a 65ºC durante 5 minutos, y después se
sitúa rápidamente en hielo durante al menos 30 segundos.
La transcriptasa reversa se usa sintetizando
cDNA de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los siguientes
son dos ejemplos de la reacción de transcripción reversa:
(a) Usando Thermoscript, se añaden 8 \mul de
mezcla que contienen 4 \mul de tampón de síntesis de cDNA 5x
(incluido en el kit), 1 \mul de DTT 100 mM, 1 \mul de SUPERasa
In (20 U), 1 \mul of Thermoscript (15 U) a la mezcla de la etapa 1
anterior y la incubación se lleva a cabo a 60ºC en un termociclador
durante 45 minutos seguida por 5 minutos a 85ºC. Finalmente la
mezcla se mantiene a 10ºC.
(b) Usando SuperScript^{TM} II, se añaden 8
\mul de mezcla que contienen 4 \mul de tampón de
Primera-Hebra 5 x (incluido en el kit), 1 \mul de
DTT 100 mM, 1 \mul de SUPERasa In (20 U), 1 \mul de
Superscript^{TM}II (200 U). La mezcla se incubó a 42ºC durante 45
minutos seguido por 5 minutos a 85ºC. Finalmente la mezcla se
mantiene a 10ºC.
La mezcla de cDNA producida se transfiere
después a un tubo nuevo para amplificación subsiguiente por PCR de
cebador individual.
\vskip1.000000\baselineskip
La PCR de cebador individual se lleva a cabo
usando una DNA polimerasa de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. La siguiente mezcla de PCR es un ejemplo que usa
polimerasas Taq de Qiagen.
La ciclación térmica se lleva a cabo como sigue:
35 ciclos de 94ºC (1 min), 48ºC (1 min) y 72ºC (1,2 min), seguidos
por un ciclo a 72ºC durante 8 minutos y finalmente se sitúa aparte a
10ºC.
El producto de PCR de cebador individual se
analiza y se extrae de gel de azarosa al 1% si es necesario.
\vskip1.000000\baselineskip
Lo siguiente es un ejemplo de recrear la
construcción de DNA de longitud total para presentación del ribosoma
continuo (véase figura 1). Los cebadores usados son T7Ab (SEQ ID Nº:
4) y Hurex-Ck (SEQ ID Nº: 5) que contienen promotor
T7 y una parte de la región constante para la extensión de la
construcción dentro de su longitud total original (figura 1).
El cDNA de cadena doble se recupera por RT PCR.
Un segundo procedimiento de PCR se lleva a cabo como sigue:
La ciclación térmica se lleva a cabo por
20-30 ciclos de 94ºC (1 minuto), 60ºC (1 minuto) y
72ºC (1,2 minutos), seguida por 72ºC durante 8 minutos y finalmente
se sitúa aparte a 10ºC.
Después del análisis de gel de agarosa, el
producto de PCR está listo para la presentación ribosómica.
\vskip1.000000\baselineskip
La eficiencia de recuperación del DNA se comparó
usando RT-PCR bien en formatos de dos tubos o bien
en formatos de un tubo. Se eligieron el kit de
RT-PCR de un tubo comercialmente disponible y los
sistemas de RT-PCR de dos tubos comercialmente
disponibles de Invitrogen ya que ellos usan la misma enzima. Los
complejos de
anticuerpo-ribosoma-mRNA (ARM)
capturados por antígeno carcinoembriogénico (CEA) después de
presentación ribosomal se sometieron a RT-PCR
usando los dos sistemas de lado a lado con cebadores idénticos. El
análisis de los productos de RT-PCR mostró que
mientas RP-PCR de un tubo no produjo DNA en este
caso, el sistema de dos tubos generó recuperación muy fuerte de DNA
(figura 3), demostrando que el procedimiento de
RT-PCR es más efectivo en formato de dos tubos.
\vskip1.000000\baselineskip
La sensibilidad y especificidad del cebador
individual de PCR para amplificación de cDNA con la secuencia 5' se
probó llevando a cabo un curso temporal de 100 ciclos de PCR. En
este experimento, el cDNA generado después de RT se diluyó 1000
veces y se llevó a cabo PCR como en volumen total de 200 \mul.
Durante ciclos de PCR, se tomaron muestras de 20 \mul en los
puntos siguientes: 35 ciclos, 45 ciclos, 55 ciclos, 65 ciclos, 75
ciclos, 85 ciclos y 100 ciclos: el análisis de gel de producto de
PCR mostró que un fragmento de DNA individual se amplificó
específicamente hasta 100 ciclos sin detección de DNA corrido o de
productos adicionales (figura 4).
\vskip1.000000\baselineskip
Se probó una diversidad de DNA polimerasas de
diferentes compañías comerciales incluyendo Qiagen, KlenTag, Gibco,
Bioline e Invitrogen para la PCR de cebador individual. La figura 5
mostró que la mayoría de las polimerasas Taq y la mayoría de las
enzimas correctoras amplifican el DNA resultante de forma muy
efectiva, indicando que el procedimiento de PCR de cebador
individual inventado es adecuado para usar con un amplio intervalo
de DNA polimerasas sin la necesidad de optimización.
\vskip1.000000\baselineskip
Para ver si una molécula de cDNA individual se
puede recuperar por PCR de cebador individual a partir de una
mezcla de cDNA generada por presentación ribosomal, se sometió a
presentación ribosomal y a selección de BSA una biblioteca de
anticuerpos humanos no usados anteriormente. Después de RT, el cDNA
resultante se cuantificó primero por comparación de PCR con una
cantidad conocida de plantilla. Esto dio una indicación de que la
concentración de DNA obtenida fue 10 fg/\mul (equivalente a 1000
moléculas, datos no mostrados). El cDNA se diluyó después en serie
hasta un punto donde no contiene más de una molécula por 1 \mul.
Esto se probó por PCR de diluciones seriadas (1:10, 1:10^{2},
1:10^{3} y 1:10^{4}), mostrando que no se detectó ningún
producto de PCR en la dilución de 1:10^{4} en 80 ciclos y que
sólo la mitad de las muestras de dilución 1:10^{3} produjo
producto de PCR, sugiriendo que en la dilución 1:10^{3} se produjo
concentración de cDNA de no más de una molécula/1 \mul (datos no
mostrados). Con el fin de probar si las moléculas de cDNA podrían
recuperarse por PCR a partir de la dilución 1:10^{3}, se usaron
identificación genética de DNA por restricción con MvaI y
secuenciación directa de DNA. La figura 6a mostró que una dilución
1:10 produjo una banda de V_{H}/K por 35 ciclos de PCR, las
plantillas de diluciones 1:10^{2} y 1:10^{3} requirieron 65
ciclos para revelar la banda. La identificación genética de DNA
reveló que mientras que el fragmento de PCR de dilución 1:10 y el
fragmento de PCR de dilución 1:10^{2} dieron un patrón de
digestión similar, las plantillas de 1:10^{3} produjeron
diferentes patrones de DNA entre los duplicados (figura 6b),
sugiriendo que un cDNA individual se amplificó a partir de dilución
1:10^{3}. La secuenciación de DNA directa de los fragmentos de PCR
de dilución a partir de dilución 1:10^{3} mostró sólo una
secuencia única a partir de cada mezcla, confirmando adicionalmente
la recuperación de moléculas de cDNA individuales por PCR de cebador
individual.
\vskip1.000000\baselineskip
Se encontró que el calentamiento de complejos de
ARM ribosomales (por ejemplo a 65ºC) antes de RT mejora la
recuperación de cDNA de longitud total. La figura 7a muestra una
comparación de RT-PCR con o sin una etapa de
precalentamiento a 65ºC. En este experimento, se seleccionaron los
complejos ARM por CEA. Después del lavado final con agua helada (He
y col., (1999) J. Immuno. Methods. 231: 105-117),
los complejos ARM se trataron bien calentando a 65ºC durante 5
minutos o bien sin la etapa de precalentamiento, seguido por
síntesis de cDNA a 60ºC usando ThermoScript (Invitrogen). Esto
mostró que aproximadamente se recuperó 10 veces más de DNA de
V_{H}/K a partir de la muestra precalentada. Las muestras sin
precalentamiento dieron detección de DNA muy baja incluso a
temperaturas optimizadas (50ºC a 60ºC) para la actividad de
ThermoScript (figura 7).
\vskip1.000000\baselineskip
Se probó la integridad de complejos ARM a la
temperatura elevada durante la etapa de calentamiento por
transcripción reversa del mRNA unido a ribosomas con cebador 1, que
se fusiona a aproximadamente 100 pares de bases cadena arriba del
complejo ribosomal detenido (figura 8a) y con cebador 0 que se
fusiona en la región 3' de mRNA recubierto por el ribosoma
detenido. El proceso de RT se llevó a cabo como se describe
anteriormente usando Thermoscript. Mientras que se observaron pocos
o ningún producto de PCR con cebador 0, que se bloquea en un
complejo intacto (figura 8b, carril 4), se generó el producto de
longitud total con el cebador 1 cadena arriba (figura 8b, carril
7). Se empleó después una plantilla de PCR que termina en el sitio
del cebador 1 que trabajó en la primera ronda (figura 8a). De
nuevo, mientras el cebador 1 del extremo 3' no produjo producto de
PCR de longitud total (figura 8b carril 11), un cebador 2 cadena
arriba fue exitoso (carril 14). Esto mostró que el extremo 3' del
mRNA era inaccesible a un cebador, probablemente debido a la
ocupación de un ribosoma detenido bajo las condiciones de RT. Esto
sugiere que los complejos ribosomales permanecieron intactos después
de precalentar a 65ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se probó el efecto de una etapa de calentamiento
a 42ºC en recuperación de DNA usando SuperScript^{TM} II
(Invitrogen). En este experimento, los complejos ARM
anti-progesterona se generaron y capturaron por dos
tubos separados pre-recubiertos con progesterona.
Después del lavado final con agua helada como se describe (He y
col., (1999) J. Immuno. Methods. 231: 105-117), uno
de los tubos se sometió a 42ºC durante 5 minutos. El otro tubo se
trató con calor a 65ºC durante 5 minutos como se describe
anteriormente. Las reacciones de RT se llevaron a cabo a 42ºC
durante 45 min en paralelo seguidas por PCR usando el procedimiento
de cebador individual durante 35 ciclos.
El producto de PCR se analizó en un gel de
agarosa, esto mostró que se recuperó un nivel de DNA similar tanto a
partir de tratamientos de 42ºC como a partir de tratamientos de 65ºC
(figura 9). Esto sugiere que la reacción de RT puede llevarse a cabo
usando una etapa de pretratamiento a 42ºC y usando
Superscript^{TM} II.
\vskip1.000000\baselineskip
La presentación ribosomal puede llevarse a cabo
por el siguiente procedimiento usando un robot tal como Tecan
miniprep 75. Se añaden 10 ul de biblioteca de PCR a cada pocillo de
una placa de microvaloración, esto se continúa por adición de 40
\mul de la mezcla de TNT que contiene metionina 0,02 mM y acetato
de Mg 1 mM; la incubación se lleva a cabo a 30ºC durante 1 hora;
después se añaden a cada pocillo 20 \mul de una mezcla que
contiene 7 \mul de tampón de DNasa I 10x y 100 U de DNasa I. La
mezcla de reacción se incuba a 30ºC durante 20 min; después se
añaden 70 \mul de tampón de dilución 2x frío a cada pocillo. La
mezcla (140 \mul) se transfiere después a los pocillos de las
tiras de Nucleolink^{TM} (NUNC) recubiertas con ligando(s)
e incubadas a 4ºC durante 2 horas, con agitación suave, permitiendo
unión del complejo PRM con el ligando inmovilizado. Los pocillos se
lavan después 5 veces usando tampón de lavado, después dos veces
usando H_{2}O estéril destilada.
Para la reacción de transcriptasa reversa, se
añaden 12 ul de mezcla de transcripción reversa 1 a cada pocillo y
la incubación se lleva a cabo a 65ºC durante 5 min, después se lleva
a cabo en hielo durante 1 min. A continuación se añaden 8 \mul de
mezcla de RT 2 a cada pocillo y la incubación se lleva a cabo a 60ºC
durante 45 min seguidos por 85ºC durante 5 min.
El cDNA resultante se puede amplificar por PCR
bien como una plantilla almacenada para ciclos de presentación
ribosomal adicionales (repitiendo el procedimiento de presentación
ribosomal anterior), o bien puede estar sometido a clonación de PCR
in vitro.
Para clonación por PCR in vitro, las
moléculas de cDNA se dividen por dilución seriada en muestras que
contienen una molécula individual o un pequeño número de moléculas
en pocillos de microvaloración. La amplificación de la dilución de
cDNA se lleva a cabo usando PCR de cebador individual como se
describe anteriormente y termociclación en PTC200 (MJ Research)
durante 35-65 ciclos.
Una muestra del producto de PCR se puede
analizar por digestión de restricción y electroforesis en gel de
agarosa y visualización. El producto de PCR se puede someter a
ensamblaje de PCR mezclando fragmentos de PCR individuales con un
plásmido que contiene elementos esenciales para expresión libre de
células (He y Taussig, 2001) llevándose a cabo la reacción por
termociclación como anteriormente. El producto de PCR ensamblado se
puede analizar, por ejemplo por digestión con enzimas de
restricción, electroforesis en gel de agarosa y visualisación de las
bandas de DNA.
SEQ ID Nº: 1
Secuencia de cebador 5' KZ1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº: 2
La secuencia de hibridación se basa en una
secuencia consenso localizada en la región 3' de mRNA.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº: 3
HuRT, un cebador de RT de acuerdo con la
invención, que comprende tanto la secuencia flanqueante KZ1 (SEQ ID
Nº: 1) como la secuencia de hibridación (SEQ ID Nº: 2).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº: 4
T7Ab, el promotor de T7 está indicado en
negrita.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID Nº: 5
Hurex-Ck.
<110> Discerna Ltd
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Recuperación de DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<130> WPP290012
\vskip0.400000\baselineskip
<150> GB0306305.4
\vskip0.400000\baselineskip
<150> GB0311351.11
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
19-3-2003
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Discerna Ltd
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Recuperación de DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<130> WPP290012
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<150> GB0306305.4
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
19-3-2003
\vskip0.400000\baselineskip
<150> GB0311351.1
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
16-5-2003
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
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<210> 4
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<211> 63
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<212> DNA
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<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
Claims (12)
1. Un procedimiento para recuperación por
RT-PCR de cDNA de mRNA en complejos de presentación
ribosomal, comprendiendo dicho procedimiento:
(a) RT que usa un cebador que comprende una
secuencia 5' que es similar o idéntica a la secuencia de la región
5' de mRNA y una secuencia 3' complementaria a una región 3' de
mRNA, seguida por,
(b) PCR que usa un cebador individual para
amplificar el cDNA de cadena simple obtenido en (a);
en el que el cebador individual usado para PCR
es idéntico, solapante con o similar a, la secuencia 5' del cebador
usado para la etapa de reacción de RT.
2. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 en el que en (b), el DNA está presente como mezcla
o como una molécula individual.
3. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 o con la reivindicación 2, en el que los complejos
de presentación ribosomal se tratan antes de RT para hacer mRNA
accesible al cebador(es).
4. Un procedimiento para recuperación de
fragmentos de DNA a partir de mRNA en complejos de presentación
ribosomal, comprendiendo dicho procedimiento:
(a) calentamiento de complejos ribosomales,
seguido por,
(b) RT que usa un cebador que incluye una
secuencia idéntica a o similar a la secuencia en la región 5' del
mRNA y una secuencia 3' capaz de hibridación con una región 3' del
mRNA, seguida por,
(c) PCR que usa un cebador individual para
amplificar el cDNA de cadena simple obtenido en (b);
en el que el cebador individual usado para PCR
es idéntico, solapante con o similar a, la secuencia 5' del cebador
usado para la etapa de reacción de RT.
5. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 4 en el que en (c) el cDNA de cadena simple está
presente como una mezcla o como una molécula individual.
6. Un procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el complejo de
presentación ribosomal es un complejo
anticuerpo-ribosoma-mRNA.
7. Un procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la secuencia 5'
del cebador de RT es una secuencia similar o idéntica a la región 5'
del mRNA, incluyendo la secuencia de uno o más del sitio de partida
transcripcional, los elementos reguladores, la secuencia de kozak,
el codón de partida traduccional, cualquier parte de la secuencia
traducida o cualquier secuencia consenso específica de familia
hallada en la región 5'.
8. Un procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el cebador usado
para RT es HuRT (SEQ ID Nº: 3).
9. Un procedimiento de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el cebador usado
para PCR es Kz1 (SEQ ID Nº: 1).
10. Un cebador de RT, en el que el cebador es
HuRT (SEQ ID Nº: 3).
11. Un cebador de PCR, en el que el cebador es
Kz1 (SEQ ID Nº: 1).
12. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 3, en la que los complejos de presentación ribosómica
se tratan calentando y/o por un procedimiento químico.
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| JP4060892B2 (ja) * | 1997-05-28 | 2008-03-12 | ディサーナ リミテッド | タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏディスプレイ及び進化のための選択粒子としてのリボソーム複合体 |
| US6207424B1 (en) | 1999-11-23 | 2001-03-27 | Maxim Biotech, Inc. | Self-primed amplification system |
| US6379932B1 (en) * | 2000-07-17 | 2002-04-30 | Incyte Genomics, Inc. | Single primer PCR amplification of RNA |
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