ES2321065T3 - Anticuerpos bloqueantes de cripto y usos de los mismos. - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo que se une específicamente a un epitopo de Cripto comprendido en el dominio que abarca los residuos de aminoácidos desde el aminoácido 46 al aminoácido 62 de SEQ ID NO: 1 ó SEQ ID NO:

Description

Anticuerpos bloqueantes de Cripto y usos de los mismos.

Solicitudes relacionadas

Esta es una continuación de US número de serie 60/367002, presentada el 22 de marzo de 2002, que es una continuación en parte de US número de serie 60/301091, presentada el 26 de junio de 2001, que es una continuación en parte de US número de serie 60/293020, presentada el 17 de mayo de 2001, que es una continuación en parte de US número de serie 60/286782, presentada el 26 de abril de 2001.

Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere en general con los campos de la genética y la biología celular y molecular. Más en particular, la invención se refiere a anticuerpos que se unen a y modulan la señalización de Cripto, kits que comprenden tales anticuerpos, y métodos que usan los anticuerpos.

Antecedentes de la invención

Cripto es una proteína de la superficie celular de 188 residuos de aminoácidos aislada de forma fortuita en un cribado de ADNc de una genoteca de carcinoma embrionario humano (Ciccodicola et al., 1989, EMBO J., vol. 8, no. 7, pp. 1987-1991). La proteína Cripto tiene al menos dos dominios notables: un dominio rico en cisteína, y un dominio caracterizado primero como similar al dominio encontrado en la familia del factor de crecimiento epidérmico (EGF). Cripto se clasificó inicialmente como un miembro de la familia del EGF (Ciccodicola et al., supra); sin embargo, análisis posteriores mostraron que Cripto no se une a ninguno de los receptores de EGF conocidos y su dominio similar a EGF era realmente divergente de la familia del EGF (Bianco et al., 1999, J. Biol. Chem., 274:8624-8629).

La vía de señalización de Cripto ha permanecido elusiva a pesar de la investigación continua, apoyando la bibliografía la activación de varias vías diferentes, incluyendo una vía de MAP quinasa (DeSantis et al., 1997, Cell Growth Differ., 8:1257-1266; Kannan et al., 1997, J. Biol. Chem., 272:3330-3335), la vía del TGF-R (Gritsman et al., 1999, Development, 127:921-932; Schier et al., 2000, Nature, 403:385-389), posibles interacciones con la vía de Wnt (Salomon et al., Endocr Relat Cancer. Dic 2000; 7(4):199-226; e intercomunicación con la vía del EGF (Bianco et al., 1999, J. Biol. Chem., 274:8624-8629).

La patente de EE.UU. 5256643 y dos solicitudes divisionarias relacionadas con la misma (patentes de EE.UU. 5654140 y 5792616), divulgan un gen humano de Cripto, la proteína Cripto, y anticuerpos contra Cripto.

La patente de EE.UU. 5264557 y tres solicitudes divisionarias relacionadas con la misma (patentes de EE.UU. 5620866, 5650285 y 5854399), divulgan un gen y proteína humanos relacionados con Cripto. También se divulgan anticuerpos que se unen a la proteína relacionada con Cripto pero no dan reactividad cruzada uniéndose a la proteína Cripto misma.

La sobreexpresión de la proteína Cripto se asocia con muchos tipos de tumores (incluyendo pero no limitados a mama, testículo, colon, pulmón, ovario, vejiga, útero, cervical, páncreas, y estómago), como se demuestra mediante la inmunotinción de tejido humano con anticuerpos policlonales de conejo preparados contra péptidos pequeños de cripto. Panico et al., 1996, Int. J. Cancer, 65: 51-56; Byrne et al., 1998, J Pathology, 185:108-111; De Angelis et al., 1999, Int J Oncology, 14:437-440. La técnica por lo tanto tiene necesidad de medios de controlar, restringir y/o prevenir tal sobreexpresión, modulando la señalización de Cripto, y modulando las consecuencias de la expresión de Cripto (es decir, fomento y/o mantenimiento de la transformación celular).

Compendio de la invención

La presente invención proporciona nuevos anticuerpos que se unen específicamente a Cripto, y métodos para hacer y usar tales anticuerpos. La invención también proporciona anticuerpos que se unen a Cripto, y modulan la señalización o interacción proteica de Cripto, por ejemplo, un anticuerpo que se une a Cripto de modo que la señal resultante de una interacción proteica se modula por descenso. La invención también proporciona anticuerpos que se unen a Cripto y bloquean la interacción entre Cripto y ALK4. La invención también proporciona anticuerpos que se unen a Cripto y modulan el crecimiento tumoral. La invención también proporciona anticuerpos que se unen a Cripto, modulan la señalización de Cripto y modulan el crecimiento tumoral. La invención también proporciona anticuerpos que se unen a Cripto, bloquean la interacción entre Cripto y ALK4 y modulan el crecimiento tumoral.

En un aspecto de la invención, el anticuerpo de la presente invención se une específicamente a un epítopo seleccionado del grupo de epítopos a los que se unen los anticuerpos AlOB2.18 (NO. DE ACCESO DE LA ATCC PTA-3311) o B3F6.17 (NO. DE ACCESO DE LA ATCC PTA-3319).

En otro aspecto de la invención, el anticuerpo de la presente invención se une específicamente a un epítopo en el dominio de unión ligando/receptor de Cripto. Cripto se puede seleccionar de CR-1 (SEQ ID NO: 1) ó CR-3 (SEQ ID NO: 2).

En otra forma de realización el epítopo al que se unen los anticuerpos de la presente invención está en el dominio que abarca los residuos de aminoácidos 46-62 de Cripto. Los anticuerpos que se unen específicamente al epítopo en el dominio que abarca los residuos de aminoácidos 46-62 de Cripto incluyen pero no están limitados a AlOB2.18 (NO. DE ACCESO DE LA ATCC PTA-3311) y B3F6.17 (NO. DE ACCESO DE LA ATCC PTA-3319).

La presente invención también contempla anticuerpos que se unen específicamente a Cripto y bloquean la interacción entre Cripto y ALK4.

En otro aspecto, la presente invención contempla anticuerpos que se unen específicamente a Cripto y son capaces de modular el crecimiento tumoral.

En aún otro aspecto, la presente invención contempla anticuerpos que se unen específicamente a Cripto, que son capaces de modular la señalización de Cripto, y que son capaces de modular el crecimiento tumoral.

En aún otro aspecto, la presente invención contempla anticuerpos que se unen específicamente a Cripto, que son capaces de bloquear la interacción entre Cripto y ALK4, y que son capaces de modular el crecimiento tumoral.

En otra forma de realización, la presente invención proporciona un anticuerpo producido por un hibridoma seleccionado del grupo que consiste en AlOB2.18 (NO. DE ACCESO DE LA ATCC PTA-3311) y B3F6.17 (NO. DE ACCESO DE LA ATCC PTA-3319).

Los anticuerpos de la presente invención incluyen pero no están limitados a anticuerpos monoclonales, policlonales, humanizados, quiméricos y humanos.

La presente invención también proporciona una composición para la administración a un sujeto que tiene un tumor que expresa Cripto que comprende al menos uno de los anticuerpos descritos anteriormente. En una forma de realización más particular el sujeto es un ser humano. La composición puede incluir un excipiente farmacéuticamente aceptable. Los anticuerpos descritos anteriormente se pueden conjugar a un agente quimioterapéutico o estar suministrados en combinación con un agente quimioterapéutico no conjugado.

En otro aspecto de la invención se contemplan métodos de modulación del crecimiento de células tumorales in vitro en una muestra que comprende el paso de añadir a la muestra las composiciones descritas anteriormente.

También se contemplan métodos de modular el crecimiento de células tumorales in vivo en un sujeto que comprende el paso de administrar al sujeto una cantidad eficaz de las composiciones descritas anteriormente. En una forma de realización particular el sujeto es un ser humano.

Otro aspecto de la invención son métodos de tratar a sujetos que tienen un tumor que sobreexpresa Cripto que comprenden administrar al sujeto las composiciones descritas anteriormente en una cantidad eficaz. Las composiciones para administración pueden incluir excipientes farmacéuticamente aceptables, anticuerpos conjugados a agentes quimioterapéuticos y anticuerpos administrados en combinación con agentes quimioterapéuticos no conjugados.

Los métodos de la presente invención son particularmente útiles en modular el crecimiento de células tumorales y/o tratar un sujeto (es decir, un ser humano) que tiene un tumor donde la célula tumoral se selecciona de células de tumor de mama, testículo, colon, pulmón, ovario, vejiga, útero, cervical, páncreas, y estómago.

En aún otra forma de realización, la presente invención contempla métodos de determinar si un tejido expresa Cripto, que comprenden el paso de analizar tejido del sujeto en un inmunoensayo usando cualquiera de los anticuerpos descritos anteriormente. También se contemplan métodos de determinar si una línea celular sobreexpresa Cripto, que comprenden el paso de analizar la línea celular en un inmunoensayo usando cualquiera de los anticuerpos descritos anteriormente.

Estos y otros aspectos de la invención se explican en mayor detalle a continuación en la descripción detallada de la invención.

Descripción detallada de la invención

Se han descubierto anticuerpos que se unen específicamente a Cripto y sus usos para modular la señalización o interacción proteica de Cripto, y/o bloquear la interacción entre Cripto y ALK4, y/o modular el crecimiento de células tumorales. Se han descubierto varias clases de anticuerpos que se unen a Cripto específicamente, incluyendo, por ejemplo, anticuerpos que se unen específicamente a un epítopo en el dominio de unión ligando/receptor de una proteína Cripto nativa o una forma desnaturalizada de Cripto; anticuerpos que se unen a un dominio similar a EGF, un dominio rico en cisteína, o un péptido (por ejemplo, desde alrededor de 3 hasta alrededor de 20 aminoácidos) de la región que comprende los residuos de aminoácidos 46 a 150; anticuerpos que se unen a Cripto y modulan la señalización de Cripto; anticuerpos que se unen a Cripto y modulan el crecimiento de células tumorales; y anticuerpos que se unen a Cripto, modulan la señalización de Cripto, y modulan el crecimiento de células tumorales. Estos anticuerpos se seleccionan usando ensayos convencionales in vitro para la selección de anticuerpos que se unen al dominio de unión ligando/receptor, modulan la señalización de Cripto, o modulan el crecimiento de células tumorales.

Los métodos de esta invención son útiles en la terapia contra tumores malignos o benignos de mamíferos donde la velocidad de crecimiento del tumor (que es una velocidad anormal para el tejido normal) es al menos parcialmente dependiente de Cripto. Velocidad anormal de crecimiento es una velocidad de crecimiento que está por encima de la requerida para la homeostasis normal y está por encima de la de tejidos normales del mismo origen.

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Definiciones

Se hacen varias definiciones a lo largo de este documento. La mayoría de las palabras tienen el significado que se les atribuiría a esas palabras por un experto en la materia. Las palabras específicamente definidas bien a continuación o en otra parte en este documento tienen el significado proporcionado en el contexto de la presente invención como un todo y como se entienden típicamente por los expertos en la materia.

Como se usa aquí, el término "región" significa una parte físicamente contigua de la estructura primaria de una biomolécula. En el caso de proteínas, una región se define mediante una parte contigua de la secuencia de aminoácidos de esa proteína.

Como se usa aquí, el término "dominio" se refiere a una parte estructural de una biomolécula que contribuye a una función conocida o sospechada de la biomolécula. Los dominios pueden ser de la misma extensión que regiones o partes de las mismas; los dominios también pueden incorporar una parte de una biomolécula que es distinta de una región particular, además de toda o parte de esa región. Los ejemplos de dominios de proteínas incluyen, pero no están limitados al dominio extracelular (abarca desde alrededor del residuo 31 hasta alrededor del residuo 188 de Cripto, incluyendo Cripto, CR-1 (SEQ ID NO: 1) y CR-3 (SEQ ID NO: 2)) y dominio transmembrana (abarca desde alrededor del residuo 169 hasta alrededor del residuo 188 de Cripto, incluyendo Cripto, CR-1 (SEQ ID NO: 1) y CR-3 (SEQ ID NO: 2)). Un dominio de unión ligando/receptor de la proteína Cripto abarca desde alrededor del residuo 75 hasta alrededor del residuo 150 de Cripto, incluyendo Cripto, CR-1 (SEQ ID NO: 1) y CR-3 (SEQ ID NO: 2) e incluye el dominio similar a EGF de Cripto que abarca, por ejemplo, desde alrededor del residuo 75 hasta alrededor del residuo 112 de Cripto, incluyendo Cripto, CR-1 (SEQ ID NO: 1) y CR-3 (SEQ ID NO: 2) y el dominio rico en cisteína de Cripto, que abarca, por ejemplo, desde alrededor del residuo 114 hasta alrededor del residuo 150 de Cripto, incluyendo Cripto, CR-1 (SEQ ID NO: 1) y CR-3 (SEQ ID NO: 2). Por ejemplo, se han identificado muchos anticuerpos monoclonales como que se unen a los dominios similar a EGF o rico en cisteína. Además se han identificado los anticuerpos monoclonales AlOB2.18 (NO. DE ACCESO DE LA ATCC PTA-3311), B3F6.17 (NO. DE ACCESO DE LA ATCC PTA-3319) y A17A2.16 como que se unen a un epítopo formado en un dominio en la región que abarca los residuos de aminoácidos 46-62, anterior al dominio similar a EGF. Ver el ejemplo 3 más adelante. Un epítopo en el dominio de unión ligando/receptor es un epítopo, que esté formado en la proteína Cripto nativa conformacional o en la proteína Cripto desnaturalizada, al que se pueden unir anticuerpos.

Como se usa aquí, el término "anticuerpo" se pretende que se refiera a anticuerpos completos, intactos, y a fragmentos Fab, Fab', F(ab)2, y otros fragmentos de los mismos. Los anticuerpos completos, intactos incluyen, pero no están limitados a, anticuerpos monoclonales tal como anticuerpos monoclonales murinos, anticuerpos policlonales, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanos y anticuerpos humanizados. Se pueden producir varias formas de anticuerpos usando técnicas estándar de ADN recombinante (Winter y Milstein, Nature 349: 293-99, 1991). Por ejemplo, se pueden construir anticuerpos "quiméricos", en los que el dominio de unión a antígeno de un anticuerpo animal se una a un dominio constante humano (un anticuerpo derivado inicialmente de un mamífero no humano en el que se ha usado la tecnología del ADN recombinante para cambiar todo o parte de las regiones bisagra y constante de la cadena pesada y/o la región constante de la cadena ligera, con las regiones correspondientes de una cadena ligera o cadena pesada de una inmunoglobulina humana) (ver, por ejemplo, Cabilly et al., Patente de Estados Unidos 4816567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 6851-55, 1984). Los anticuerpos quiméricos reducen las respuestas inmunogénicas provocadas por anticuerpos animales cuando se usan en tratamientos clínicos humanos.

Además, se pueden sintetizar anticuerpos recombinantes "humanizados". Los anticuerpos humanizados son anticuerpos inicialmente derivados de un mamífero no humano en los que se ha usado la tecnología del ADN recombinante para cambiar parte o todos los aminoácidos no requeridos para la unión al antígeno con aminoácidos de regiones correspondientes de una cadena ligera o pesada de inmunoglobulina humana. Esto es, son quimeras que comprenden mayoritariamente secuencias de inmunoglobulinas humanas en las que se han insertado las regiones responsables para la unión específica al antígeno (ver, por ejemplo, solicitud de patente PCT WO 94/04679). Los animales se inmunizan con el antígeno deseado, los anticuerpos correspondientes se aíslan y la parte de las secuencias de la región variable responsable de la unión específica al antígeno se eliminan. Las regiones de unión al antígeno derivadas del animal se clonan después en la posición apropiada de los genes de anticuerpos humanos en los que han delecionado las regiones de unión a antígeno. Los anticuerpos humanizados minimizan el uso de secuencias heterólogas (inter-especies) en anticuerpos para su uso en terapias humanas, y es menos probable que provoquen respuestas inmunes no deseadas. Se pueden producen anticuerpos primatizados de forma similar.

Otra forma de realización de la invención incluye el uso de anticuerpos humanos, que se pueden producir en animales no humanos, tal como animales transgénicos que llevan uno o más transgenes de inmunoglobulinas humanas. Tales animales se pueden usar como fuente de esplenocitos para producir hibridomas, como se describe en la patente de EE.UU. 5569825.

También se pueden usar fragmentos de anticuerpo y anticuerpos univalentes en los métodos y composiciones de esta invención. Los anticuerpos univalentes comprenden un dímero cadena ligera/cadena pesada unido a la región Fc (o tallo) de una segunda cadena pesada. "Región Fab" se refiere a aquellas partes de las cadenas que son aproximadamente equivalentes, o análogas, a las secuencias que comprenden las partes de las ramas de la Y de la cadena pesada y a la cadena ligera en su totalidad, y que se ha mostrado que colectivamente (en agregados) muestran actividad de anticuerpo. Una proteína Fab incluye agregados de una cadena pesada y una ligera (normalmente conocido como Fab'), así como tetrámeros que corresponden a los dos segmentos de las ramas de la Y del anticuerpo, (normalmente conocido como F(ab)2), que estén cualquiera de los anteriores agregados de forma covalente o no covalente, mientras la agregación sea capaz de reaccionar específicamente con un antígeno o familia de antígenos particular.

Cualquiera de los anticuerpos de la invención se puede conjugar opcionalmente a un agente quimioterapéutico, como se define más adelante.

Como se usa aquí, el término "unión" significa la interacción física o química entre dos proteínas o compuestos o proteínas o compuestos asociados o combinaciones de los mismos, incluyendo la interacción entre un anticuerpo y una proteína. La unión incluye interacciones iónicas, no fónicas, por puentes de hidrógeno, de Van der Waals, hidrofóbicas, etc. La interacción física, la unión, puede ser directa o indirecta, siendo indirecta a través de o debido a los efectos de otra proteína o compuesto. La unión directa se refiere a interacciones que no tienen lugar a través de debido al efecto de otra proteína o compuesto pero en su lugar son sin otros intermedios químicos sustanciales. La unión se puede detectar de muchas maneras diferentes. Los métodos para detectar la unión son conocidos para los expertos en la materia.

Como se usa aquí, "un anticuerpo capaz de internalizar Cripto" significa un anticuerpo que entra en la célula al tiempo que elimina Cripto de la superficie celular. Se puede cribar para anticuerpos contra Cripto que sean capaces de internalizar Cripto usando anticuerpos monoclonales contra Cripto marcados con fluorescencia. Para determinar que anticuerpos internalizan en las células positivas para Cripto se puede ensayar para la absorción de la señal fluorescente de los anticuerpos en las células viendo las células en un microscopio de fluorescencia y/o confocal. Aquellos anticuerpos que se internalizan se verán como señales fluorescentes en las vesículas citoplásmicas o celulares. Ejemplos no limitantes de anticuerpos anti Cripto capaces de internalizar Cripto incluyen A27F6.1 y B3F6.17.

Como se usa aquí, el término "compuesto" significa cualquier molécula o sustancia química identificable, incluyendo, pero no limitado a, ión, átomo, molécula pequeña, péptido, proteína, azúcar, nucleótido, o ácido nucleico, y tal compuesto puede ser natural o sintético.

Como se usa aquí, los términos "modula" o "modifica" significa un aumento o descenso en la cantidad, calidad, o efecto de una actividad o proteína particulares.

Como se usa aquí, el término "modular la señalización de Cripto" significa un aumento o descenso en la cantidad, calidad o efecto de la actividad de Cripto, en alrededor del 5%, preferiblemente del 10%, más preferiblemente del 20%, más preferiblemente el 30%, más preferiblemente el 40%, más preferiblemente el 50%, más preferiblemente el 60%, más preferiblemente el 70%, más preferiblemente el 80%, más preferiblemente el 90%, y lo más preferiblemente el 100%. La actividad se puede medir mediante ensayos conocidos en la técnica, tal como el ensayo de células nulas mostrado en el ejemplo 3. En otra forma de realización, la interacción proteica entre Cripto y otra proteína se modula similarmente en descenso a través de la unión de los anticuerpos de la invención.

Como se usa aquí, el término "bloquear la interacción entre Cripto y ALK4" significa un aumento o descenso en la interacción, es decir, la unión, entre Cripto y ALK4, en alrededor del 5%, preferiblemente el 10%, más preferiblemente del 20%, más preferiblemente el 30%, más preferiblemente el 40%, más preferiblemente el 50%, más preferiblemente el 60%, más preferiblemente el 70%, más preferiblemente el 80%, más preferiblemente el 90%, y lo más preferiblemente el 100%. La actividad se puede medir mediante ensayos conocidos en la técnica, tal como el ensayo de unión mostrado en el ejemplo 8.

Como se usa aquí, el término "modular el crecimiento de células tumorales in vitro" significa un aumento o descenso en el número de células tumorales, in vitro, en alrededor del 5%, preferiblemente el 10%, más preferiblemente del 20%, más preferiblemente el 30%, más preferiblemente el 40%, más preferiblemente el 50%, más preferiblemente el 60%, más preferiblemente el 70%, más preferiblemente el 80%, más preferiblemente el 90%, y lo más preferiblemente el 100%. La modulación in vitro del crecimiento de células tumorales se puede medir mediante ensayos conocidos en la técnica, tal como el ensayo en agar blando de células GEO mostrado en el ejemplo 4.

Como se usa aquí, el término "modular el crecimiento de células tumorales in vivo" significa un aumento o descenso en el número de células tumorales, in vivo, en alrededor del 5%, preferiblemente el 10%, más preferiblemente del 20%, más preferiblemente el 30%, más preferiblemente el 40%, más preferiblemente el 50%, más preferiblemente el 60%, más preferiblemente el 70%, más preferiblemente el 80%, más preferiblemente el 90%, y lo más preferiblemente el 100%. La modulación in vivo del crecimiento de células tumorales se puede medir mediante ensayos conocidos en la técnica, tal como el mostrado en el ejemplo 5.

El término "prevenir" se refiere a la disminución de la probabilidad de que un organismo contraiga o desarrolle una anomalía.

El término "tratar" se refiere a tener un efecto terapéutico y aliviar o abrogar al menos parcialmente una anomalía en el organismo. Tratar incluye el mantenimiento de crecimiento tumoral inhibido, e inducción de remisión.

El término "efecto terapéutico" se refiere a la inhibición de una anomalía. Un efecto terapéutico alivia en algún grado uno o más de los síntomas de la anomalía. En referencia al tratamiento de anomalías, un efecto terapéutico se puede referir a uno o más de los siguientes: (a) un aumento o disminución en la proliferación, crecimiento, y/o diferenciación de células; (b) inhibición (es decir desacelerar o parar) o fomento de la muerte celular; (c) inhibición de degeneración; (d) aliviar en algún grado uno o más de los síntomas asociados con la anomalía; y (e) aumentar la función de una población de células. Se pueden identificar compuestos que demuestran eficacia contra las anomalías como se describe aquí.

El término "administrar" se refiere a un método de incorporar un compuesto en células o tejidos de un organismo. La anomalía se puede prevenir o tratar cuando las células o tejidos del organismo existen dentro del organismo o fuera del organismo. Las células que existen fuera del organismo se pueden mantener o hacer crecer en placas de cultivo celular, o en otro organismo. Para las células que están en el organismo, existen muchos métodos en la técnica para administrar compuestos, incluyendo (pero no limitado a) aplicaciones oral, parenteral, dérmica, en inyección, y en aerosol. Para células fuera del organismo, existen múltiples métodos en la técnica para administrar los compuestos, incluyendo (pero no limitado a) técnicas de microinyección celular, técnicas de transformación y técnicas de transportadores. La administración se puede realizar mediante los muchos modos conocidos en la técnica, por ejemplo, oral, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, y similares. Cuando se usan en terapia in vivo, los anticuerpos del objeto de la invención se administran a un paciente en cantidades eficaces. Como se usa aquí una "cantidad eficaz" es una cantidad suficiente para llevar a cabo resultados clínicos beneficiosos o deseados (es decir, cantidades que eliminan o reducen la carga tumoral del paciente). Una cantidad eficaz se puede administrar en una o más administraciones. Para los fines de esta invención, una cantidad eficaz de los anticuerpos de la presente invención es una cantidad de los anticuerpos que es suficiente para mejorar, estabilizar, o retrasar el desarrollo del estado de enfermedad asociado a Cripto, particularmente tumores asociados a Cripto. La detección y medida de estos indicadores de eficacia se discute posteriormente. Un ejemplo de una pauta de tratamiento típica incluye administrar mediante infusión intravenosa al sujeto los anticuerpos de la invención en un programa semanal, a una dosis de alrededor de 2-5 mg/kg. Los anticuerpos se administran en una unidad de quimioinfusión ambulatoria, a menos que el paciente requiera hospitalización. También se contemplan otras pautas de administración conocidas.

La anomalía también se puede prevenir o tratar administrando un anticuerpo de la invención a un grupo de células que tienen una aberración en una vía de transducción de señales a un organismo. El efecto de administrar un compuesto sobre la función del organismo se puede controlar después. El organismo es preferiblemente un ser humano.

"Sobreexpresión de Cripto" se pretende que signifique la expresión de Cripto por un tejido cuya expresión es mayor que la expresión de Cripto de tejido adyacente normal en una cantidad estadísticamente significativa.

"Agentes quimioterapéuticos" se refiere a cualquier agente identificado en la técnica como que tiene efecto terapéutico sobre la inhibición de crecimiento tumoral, mantenimiento del crecimiento tumoral inhibido, y/o inducción de remisión, tal como compuestos naturales, compuestos sintéticos, proteínas, proteínas modificadas, y compuestos radioactivos.

Los agentes quimioterapéuticos contemplados aquí incluyen agentes que se pueden conjugar con los anticuerpos de la presente invención o de forma alternativa agentes que se pueden usar en combinación con anticuerpos de la presente invención sin estar conjugados al anticuerpo. Los agentes quimioterapéuticos ejemplares que se pueden conjugar a los anticuerpos de la presente invención incluyen, pero no están limitados a radioconjugados (90Y, 131I, 99mTc, 111In, 186Rh, et al.), profármacos activados por tumor (maitansinoides, análogos de CC-1065, derivados de caliqueamicina, antraciclinas, alcaloides de la vinca, et al.), ricina, toxina de la difteria, exotoxina de pseudomonas.

Los agentes quimioterapéuticos se pueden usar en combinación con los anticuerpos de la invención, más que ser conjugados a los mismos (es decir, agentes quimioterapéuticos no conjugados), incluyen, pero no están limitados a los siguientes: platinos (es decir, cisplatino), antraciclinas, análogos de nucleósidos (purina y pirimidina), taxanos, camptotecinas, epipodofilotoxinas, agentes alquilantes de ADN, antagonistas de folato, alcaloides de la vinca, inhibidores de la ribonucleótido reductasa, inhibidores de estrógeno, inhibidores de progesterona, inhibidores de andrógeno, inhibidores de aromatasa, interferones, interleuquinas, anticuerpos monoclonales, taxol, camptosar, adriamicina (dox), 5-FU y gemcitabina. Tales agentes quimioterapéuticos se pueden emplear en la práctica de la invención en combinación con los anticuerpos de la invención mediante coadministración del anticuerpo y el agente quimioterapéutico no conjugado.

"Soporte o excipiente farmacéuticamente aceptable" se refiere a compuestos biológicamente inertes conocidos en la técnica y empleados en la administración de los anticuerpos de la invención. Los soportes aceptables son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., 1990. Los soportes aceptables pueden incluir sales biocompatibles, inertes o bioabsorbibles, agentes tamponantes, oligo- y polisacáridos, polímeros, compuestos viscoelásticos tal como ácido hialurónico, agentes que mejoran la viscosidad, conservantes, y similares.

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Un "sujeto" se refiere a vertebrados, particularmente miembros de las especies de mamíferos e incluye pero no está limitado a animales domésticos, animales deportivos, y primates, incluyendo los seres humanos.

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Anticuerpos de la invención

Los anticuerpos de la invención se unen específicamente a Cripto: Como se usa aquí, Cripto incluye la proteína Cripto CR-1, la proteína Cripto CR-3, y fragmentos de las mismas. Tales fragmentos pueden ser dominios enteros, tal como los dominios extracelular o intracelular, el dominio similar a EGF, el dominio rico en cisteína, el dominio de unión al receptor, y similares. Tales fragmentos también pueden incluir epítopos contiguos y no contiguos en cualquier dominio de la proteína Cripto.

La secuencia de 188 aminoácidos para CR-1 es como sigue [SEQ ID NO: 1]:

1

La secuencia de 188 aminoácidos para CR-3 es como sigue [SEQ ID NO: 2]:

2

El dominio similar a EGF abarca desde alrededor del residuo de aminoácido 75 hasta alrededor del residuo de aminoácido 112 de la proteína Cripto madura. Los epitopos en el dominio similar a EGF pueden comprender extensiones lineales o no lineales de residuos de aminoácidos. Ejemplos de epítopos lineales contemplados incluyen pero no están limitados a alrededor de los residuos 75-85, 80-90, 85-95, 90-100, 95-105, 100-110, ó 105-112.

El dominio rico en cisteína abarca desde alrededor del residuo de aminoácido 114 hasta alrededor del residuo de aminoácido 150 de la proteína Cripto madura. Los epitopos en el dominio rico en cisteína pueden comprenden extensiones lineales o no lineales de residuos de aminoácidos. Ejemplos de epítopos lineales contemplados incluyen pero no están limitados a los residuos alrededor de 114-125, 120-130, 125-135, 130-140, 135-145 ó 140-150.

Una vez se han generado los anticuerpos, la unión de los anticuerpos a Cripto se puede ensayar usando métodos estándar conocidos en la técnica, tal como ELISA, al tiempo que la presencia de Cripto en la superficie celular se puede ensayar usando citometría de flujo (FACS), como se muestra en el ejemplo 2. Alternativamente se puede usar cualquier otra técnica de medir tal unión.

La presente invención proporciona anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales y policlonales, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos quiméricos, anticuerpos bifuncionales/biespecíficos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, y anticuerpos con regiones determinantes de complementariedad (CDR) injertadas, incluyendo compuestos que incluyen secuencias CDR que específicamente reconocen un polipéptido de la invención) específicos para Cripto o fragmentos de los mismos. La invención también proporciona fragmentos de anticuerpo, incluyendo Fab, Fab', F(ab')_{2}, y F_{v}. Los términos "específico" y "selectivo", cuando se usan para describir la unión de los anticuerpos de la invención, indican que las regiones variables de los anticuerpos de la invención reconocen y se unen a polipéptidos de Cripto. Se entenderá que los anticuerpos específicos de la invención también pueden interaccionar con otras proteínas (por ejemplo, proteína A de S. aureus u otros anticuerpos en técnicas de ELISA) a través de interacciones con secuencias fuera de la región variable de los anticuerpos, y, en particular, en la región constante de la molécula. Los ensayos de cribado para determinar la especificidad de unión de un anticuerpo de la invención (es decir, anticuerpos que se unen específicamente a un epítopo del dominio de unión ligando/receptor y el dominio que abarca los residuos de aminoácidos 46-62) son bien conocidos y practicados de forma rutinaria en la técnica. Para una discusión completa de tales ensayos, ver Harlow et al. (Eds.), Antibodies A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, NY (1988), capítulo 6. También se contemplan anticuerpos que reconocen y se unen a fragmentos de la proteína Cripto, siempre que los anticuerpos sean específicos para polipéptidos de Cripto. Los anticuerpos de la invención se pueden producir usando cualquier método bien conocido y practicado rutinariamente en la técnica.

La especificidad de los anticuerpos se describe con mayor detalle posteriormente. Sin embargo, se debe enfatizar que los anticuerpos que se pueden generar de otros polipéptidos que se han descrito previamente en la bibliografía y que son capaces de dar reactividad cruzada fortuita con Cripto (por ejemplo, debido a la existencia fortuita de un epítopo similar en ambos polipéptidos) se consideran "anticuerpos transreactivos". Tales anticuerpos transreactivos no son anticuerpos que sean "específicos" para Cripto. La determinación de si un anticuerpo se une específicamente a un epitopo de Cripto se hace usando cualquiera de varios ensayos, tal como ensayos de inmunotransferencia, que son bien conocidos en la técnica. Para identificar células que expresan Cripto y también para modular la actividad de unión ligando/receptor de Cripto, los anticuerpos que se unen específicamente a un epitopo extracelular de la proteína Cripto (es decir, partes de la proteína Cripto que se encuentran fuera de la célula) son particularmente útiles.

En una forma de realización, la invención proporciona una composición libre de células que comprende anticuerpos policlonales, en donde al menos uno de los anticuerpos es un anticuerpo de la invención específico para Cripto. Los antisueros aislados de un animal es una composición de ejemplo, como es una composición que comprende una fracción de anticuerpo de un antisuero que se ha resuspendido en agua o en otro diluyente, excipiente, o soporte.

En otra forma de realización, la invención proporciona anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales son muy específicos, están dirigidos contra un sitio antigénico individual. Además en contraste con las preparaciones policlonales que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes epítopos, cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un determinante individual en el antígeno. Los anticuerpos monoclonales son útiles para mejorar la selectividad y especificidad de métodos de ensayo diagnóstico y analítico usando la unión antígeno-anticuerpo. Otra ventaja de los anticuerpos monoclonales es que se sintetizan mediante un cultivo de hibridoma, no contaminado por otras inmunoglobulinas. Los hibridomas que producen tales anticuerpos también se pretende que sean aspectos de la invención.

En aún otra forma de realización relacionada, la invención proporciona un anticuerpo anti-idiotípico específico para un anticuerpo que es específico para Cripto. Para una discusión más detallada de los anticuerpos anti-idiotípicos, ver por ejemplo las patentes de EE.UU. 6063379 y 5780029.

Es bien sabido que los anticuerpos contienen dominios de unión al antígeno relativamente pequeños que se pueden aislar de forma química o mediante técnicas recombinantes. Tales dominios son en Si mismos moléculas de unión a Cripto útiles, y también se pueden reintroducir en anticuerpos humanos, o fusionar a un agente quimioterapéutico o polipéptido. De esta manera, en aún otra forma de realización, la invención proporciona un polipéptido que comprende un fragmento de un anticuerpo específico para Cripto, en donde el fragmento y la molécula asociada, si hay alguna, se unen a Cripto. A modo de ejemplo no limitante, la invención proporciona polipéptidos que son anticuerpos de cadena sencilla y anticuerpos con CDR injertada. Para una discusión más detallada de los anticuerpos con CDR injertada, ver por ejemplo, la patente de EE.UU. 5859205.

En otra forma de realización, los anticuerpos no humanos se pueden humanizar mediante cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. Los anticuerpos humanizados son útiles para aplicaciones terapéuticas in vivo. Además, se pueden sintetizar anticuerpos recombinantes "humanizados". Los anticuerpos humanizados son anticuerpos inicialmente derivados de un mamífero no humano en los que se ha usado la tecnología de ADN recombinante para sustituir algunos o todos de los aminoácidos no requeridos para la unión al antígeno con aminoácidos de las regiones correspondientes de un cadena ligera o pesada de inmunoglobulina humana. Es decir, son quimeras que comprenden mayoritariamente secuencias de inmunoglobulina humana en las que se han insertado las regiones responsables para la unión específica al antígeno (ver, por ejemplo solicitud de patente PCT WO 94/04679). Los animales se inmunizan con el antígeno deseado, los anticuerpos correspondientes se aíslan y las partes de las secuencias de las regiones variables responsables de la unión específica al antígeno se eliminan. Las regiones de unión al antígeno derivadas del animal se clonan entonces en la posición adecuada de los genes de anticuerpos humanos en los que se han delecionado las regiones de unión al antígeno. Los anticuerpos humanizados minimizan el uso de secuencias heterólogas (inter-especie) en anticuerpos para su uso en terapias humanas, y es menos probable que provoquen respuestas inmunes no deseadas. De forma similar se pueden producir anticuerpos primatizados usando genes de anticuerpos de primates (por ejemplo, rhesus, babuino y chimpancé). Se pueden introducir después cambios adicionales en el marco del anticuerpos para modular la afinidad o inmunogenicidad. Ver, por ejemplo, las patentes de EE.UU. Nos. 5585089, 5693761, 5693762, y 6180370.

Otra forma de realización de la invención incluye el uso de anticuerpos humanos, que se pueden producir en animales no humanos, tal como animales transgénicos que llevan uno o más transgenes de inmunoglobulinas humanas. Tales animales se pueden usar como fuente de esplenocitos para producir hibridomas, como se describe en la patente de Estados Unidos 5569825, WO00076310, WO00058499 y WO00037504.

Modulación de la señal

En otra forma de realización, los anticuerpos de la invención se unen a Cripto, y modulan la señalización de Cripto o las interacciones proteicas de Cripto. La sobreexpresión de la actividad Cripto puede producir un estado desdiferenciado que fomenta las características de célula mesenquimatosa, proliferación aumentada, y migración celular (Salomon et al., BioEssays 21: 61-70, 1999; Ciardiello et al., Oncogene 9: 291-298, 1994; y Baldassarre et al., Int. J. Cancer 66:538-543, 1996), fenotipos asociados con las transformación celular vista en neoplasia.

Un método de probar la actividad de los anticuerpos anti-Cripto y su capacidad para modular la señalización de Cripto es una línea celular F9-deficiente en Cripto (Minchiotti et al., Mech. Dev. 90: 133-142, 2000). Cripto estimula la fosforilación de smad2 y el factor de transcripción FAST en embriones de Xenopus, y la actividad del factor de transcripción FAST se puede controlar midiendo la actividad luciferasa de un gen indicador luciferasa con un elemento regulador de FAST (Saijoh et al., Mol. Cell 5:35-47, 2000). A las células F9-decifientes en Cripto se les delecionado el gen de Cripto y por lo tanto son nulas para Cripto y la señalización dependiente de Cripto (Minchiotti et al., Mech. Dev. 90: 133-142, 2000). La señalización de Cripto se puede ensayar en las células F9 deficientes en Cripto transfectando Cripto, FAST y la construcción elemento regulador FAST-gen de luciferasa. No se verá actividad luciferasa por FAST dependiente de Cripto en estas líneas celulares a menos que se transfecte en ellas el ADNc de Cripto y el ADNc de FAST. Los anticuerpos capaces de bloquear la señalización de Nodal dependiente de Cripto son anticuerpos que bloquean la función de señalización de Cripto.

Los expertos en la materia pueden emplear otros ensayos capaces de medir la actividad de Cripto, tal como el ensayo de crecimiento en agar blando (ver el ejemplo 4 más adelante). La capacidad de las células de crecer en agar blando está asociada con la transformación celular y el ensayo es un ensayo clásico in vitro para medir la inhibición del crecimiento de células tumorales. Otros ensayos útiles en determinar la inhibición de la actividad incluyen ensayos in vitro en plástico, y similares.

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Usos terapéuticos

Los anticuerpos de la invención también son útiles para fines terapéuticos, tal como modulación de crecimiento de células tumorales, fines diagnósticos para detectar o cuantificar Cripto, y purificación de Cripto.

En una forma de realización de la invención, se proporcionan anticuerpos que son capaces de unirse específicamente a Cripto y que modulan el crecimiento de células tumorales en un paciente. En una forma de realización, las células tumorales son células de tumor de testículo, mama, testículo, colon, pulmón, ovario, vejiga, útero, cervical, páncreas y estómago.

En otra forma de realización, se proporcionan anticuerpos que son capaces de unirse específicamente a Cripto y que modulan el crecimiento de células tumorales que sobreexpresan Cripto. En una forma de realización, las células tumorales, son líneas celulares que sobreexpresan Cripto, tal como líneas celulares derivadas de cáncer de mama, testículo, colon, pulmón, ovario, vejiga, útero, cervical, páncreas y estómago.

Se pueden cribar anticuerpos anti-Cripto para actividad in vivo como potenciales agentes anticancerosos siguiendo protocolos estándar usados por los expertos en la materia, como se ilustra en el ejemplo 4 posteriormente. El Instituto Nacional del Cáncer (NCI) da ejemplos de tales protocolos en sus protocolos de "cribado de modelos de cáncer in vivo", publicación del NIH número 84-2635 (febrero 1984).

En otra forma de realización de la invención, los anticuerpos de la invención se usan para tratar a un paciente que tiene un tumor canceroso.

Los anticuerpos de la presente invención se pueden combinar con un excipiente farmacéuticamente aceptable y administrar al paciente en una dosis terapéuticamente eficaz. Para una discusión de los métodos de inhibir el crecimiento de tumores, ver, por ejemplo, la patente de EE.UU. 6165464.

También se contemplan métodos de tratar a un sujeto que padece un trastorno asociado con niveles anormales (es decir, elevados o disminuidos) de Cripto en donde el método comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo de Cripto.

También se contemplan métodos de tratar a un sujeto que padece un trastorno asociado con niveles anormales (es decir, elevados o disminuidos) de Cripto en donde el método comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo que específicamente forma un complejo con Cripto y está dirigido al epitopo al que se dirige un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en AlOB2.18 (NO. DE ACCESO DE LA ATCC PTA-3311) y B3F6.17 (NO. DE ACCESO DE LA ATCC PTA-3319).

El diagnóstico a través de la detección Cripto se lleva a cabo fácilmente mediante ensayos de unión estándar usando los anticuerpos nuevos de la invención, que permiten a los expertos en la materia detectar la presencia de Cripto específicamente en un amplia variedad de muestras, cultivos, y similares.

También están comprendidos kits que comprenden un anticuerpo de la invención para cualquiera de los fines descritos aquí. En general, un kit de la invención también incluye un antígeno control para el que el anticuerpo es inmunoespecífico. Las formas de realización incluyen kits que comprenden todos los reactivos e instrucciones para el uso de los mismos.

Las características adicionales de la invención serán aparentes a partir de los siguientes ejemplos ilustrativos.

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Ejemplos comparativos Ejemplo 1 Expresión y purificación de Cripto

Se construyó un plásmido de expresión designado pSGS480 mediante subclonación de un ADNc que codifica los residuos de aminoácidos de Cripto humana 1 a 169 de Cripto [aminoácidos 1-169 de SEQ ID NO: 1], fusionada al dominio Fc de la IgG_{1} humana (es decir, "CR(del C)-Fc") en el vector pEAG1100. Para una descripción más detallada de este vector, ver la solicitud de patente de EE.UU., en tramitación junto a esta, No. de serie 60/233148, presentada el 18 de septiembre de 2000. El vector pEAG1100 es un derivado del plásmido pCMV-Sport-betagal de GIBCO-BRL Life Techonologies, cuyo uso en transfecciones transitorias en CHO fue descrito por Schifferli et al., 1999, Focus 21: 16. Se hizo eliminando el fragmento NotI del gen indicador beta-galactosidasa del plásmido pCMV-Sport-Betagal (número de catálogo 10586-014) como sigue: el plásmido se digirió con NotI y EcoRV, el fragmento NotI del esqueleto del plásmido de 4,38 kb se purificó por gel y se ligó. El ADN ligado se transformó en células competentes de E. coli DH5alfa. pEAG1100 se aisló como un plásmido que contenía el recombinante deseado de una colonia aislada individual. Se confirmó la secuencia de pEAG1100 que abarca el promotor, sitio de multiclonación y señal de terminación de la transcripción.

El plásmido pSGS480 se transfectó de forma transitoria en células CHO y las célula se hicieron crecer a 28ºC durante 7 días. Se examinó la presencia de la proteína CR(del C)-Fc en estas células y los medios condicionados mediante análisis de inmunotransferencia. Para el análisis de inmunotransferencia, los medios condicionados y las células de las células transfectadas con Cripto se sometieron a SDS-PAGE en geles en gradiente del 4-20% en condiciones reductoras, se transfirieron electroforéticamente a nitrocelulosa y la proteína de fusión de Cripto se detectó con un anticuerpo policlonal de conejo preparado contra un conjugado del péptido 17-mero de Cripto (que comprendía los residuos 97-113 de SEQ ID NO: 1)-hemocianina de lapa californiana. Tras la centrifugación para eliminar las células, el análisis de inmunotransferencia mostró que la proteína CR(del C)-Fc se secretaba de forma eficaz al medio condicionado (sobrenadante). El sobrenadante se aplicó a Proteína A-Sepharosa (Pharmacia), y la proteína unida se eluyó con fosfato de sodio 25 mM pH 2,8, NaCl 100 mM. La proteína eluida se neutralizó con fosfato de sodio 0,5 M a pH 8,6, y se analizó para el contenido total de proteína a partir de medidas de absorbancia a 240-340 nm, y para la pureza mediante SDS-PAGE. La proteína eluida se filtró a través de un filtro de 0,2 micrómetros, y se almacenó a -70ºC.

Ejemplo 2 Generación y cribado de anticuerpos

La proteína CR(del C)-Fc eluida se inyecta a ratones, y se usan técnicas estándar de hibridoma conocidas por los expertos en la materia para generar anticuerpos monoclonales.

A. Generación de anticuerpos

En particular, se inmunizaron intraperitonealmente ratones hembras Robertsonian (Jackson Labs) con 25 \mug de CR del C-Fc humana purificada emulsionada con adyuvante de freund completo (GibcoBRL #15721-012). Recibieron dosis de refuerzo intraperitonealmente dos veces con 25 \mug de CR del C-Fc emulsionada con adyuvante de freund incompleto (GibcoBRL #15720-014) y una vez con bolas de proteína A. Se cribaron los sueros y 3 semanas después de la última dosis, el ratón con mejor título recibió una dosis de refuerzo intraperitonealmente con 50 \mug de CR del C-Fc soluble tres días antes de la fusión. El ratón recibió una dosis de refuerzo intravenosa con 50 \mug de CR del C-Fc el día antes de la fusión. Las células del bazo del ratón se fusionaron con células de mieloma FL653 a una proporción 1 de bazo: 6 de mieloma y se sembraron a 100.000, 33.000 y 11.000 células por pocillo en placas de cultivo de 96 pocillos en medio de selección. Los pocillos positivos para crecimiento se cribaron mediante FACS y ELISA una semana después. Se realizaron dos fusiones.

B. Cribado de anticuerpos

Los sobrenadantes resultantes del la primera o segunda fusión se cribaron primero en placas de ELISA para el reconocimiento de las proteína Cripto del C y/o dominio similar a EGF de Cripto. Se recubrieron las placas de ELISA con una proteína de fusión control (receptor de LT-beta-Fc) para descartar anticuerpos monoclonales que reconocieran el epítopo Fc humano. El ELISA se realizó como se describe a continuación en la sección C. En la primera fusión, también se cribaron los sobrenadantes primarios para su capacidad para reconocer la proteína Cripto de la superficie celular en la línea de células de tumor de testículo NCCIT mediante FACS. En el caso de la segunda fusión, se analizó la capacidad de los sobrenadantes de reconocer Cripto en dos líneas de células tumorales, NCCIT y la línea de cáncer de mama DU4475 mediante FACS. Los cribados secundarios incluyeron probar la capacidad del sobrenadante del anticuerpo monoclonal para reconocer Cripto de la superficie celular en un panel de líneas de células tumorales (ver las tablas 1 y 2 para los resultados), la capacidad de los anticuerpos monoclonales para reconocer Cripto humana inmunohistoquímicamente en secciones de tejido tumoral de mama y de colon humanos, la capacidad de los anticuerpos monoclonales de bloquear el ensayo de señalización Cripto-Nodal, la capacidad de bloquear el crecimiento de líneas de células tumorales en ensayos plástico o agar blando, y la capacidad de internalizar Cripto de la superficie celular.

C. ELISA

Los ensayos de ELISA se realizaron como sigue:

Materiales

Placas: placas de 96 pocillos de Costar de alta unión y lavado fácil (07-200-642).

Anticuerpo 2': IgG (H + L) de cabra anti-ratón-HRP de Pierce (P131430)

Sustrato: Kit de sustrato TMB de Pierce (34021)

Solución de parada: H2SO4 1 N

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Tampones

Tampón de unión: NaHPO4 0,1 M pH 9,0

Tampón de bloqueo: PBS + suero de ternera donante al 10%

Tampón de lavado: PBS + Tween-20 al 0,1%.

Se diluyeron los antígenos CR-del-C-Fc y CR-EGF-fc, la proteína de fusión hu IgG1 control en tampón de unión a 500 ng/ml. Se añadieron 100 \mul por pocillo y se incubaron durante 1 hora a 37ºC o durante la noche a 4ºC. El líquido se decantó y la placa se invirtió y se absorbió hasta que estuvo seca. Se añadieron después 250 \mul/pocillo de tampón de bloqueo, seguido mediante incubación durante 30 minutos a 37ºC. De nuevo, el líquido se decanto, y la \mulaca se invirtió y se absorbió hasta que estuvo seca. Los sobrenadantes se diluyeron 1:50 en tampón de lavado, y se añadieron a 50 \mul/pocillo, seguido mediante incubación durante 1 hora a temperatura ambiente. Las \mulacas se lavaron 3X vigorosamente con 250 \mul/pocillo de tampón de lavado. Después se añadieron 100 \mul/pocillo de anticuerpo 2' diluido en tampón de lavado a 1:10.000, seguido mediante incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las \mulacas se lavaron después 3X vigorosamente con 250 \mul/pocillo de tampón de lavado, después se añadió el sustrato a 100 \mul/pocillo. Se dejó desarrollar el color hasta que fue lo suficientemente oscuro, después se añadieron 100 \mul/pocillo de solución de parada y se leyó la absorbancia de las \mulacas a 450 nm.

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D. Citometria de flujo

Las líneas celulares positivas para Cripto se pueden usar para ensayar los anticuerpos monoclonales para la unión a Cripto usando tinción de la superficie celular y citometría de flujo como sigue:

Liberar las células de botellas T162 con 2 ml de PBS con EDTA 5 mM, 10 minutos, a 37ºC. Llevar a 20 ml con medio con suero, pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces para separar las células. Centrifugar a 1200 rpm durante 5 minutos. Lavar las células con 5-10 ml de PBS a 4ºC con BSA al 0,1% (tampón de lavado). Centrifugar a 1200 rpm durante 5 minutos. Resuspender a 4x10^{6}-10^{7}/ml en tampón de lavado. Mantener en hielo.

Preparar los anticuerpos para la tinción. Los anticuerpos purificados se diluyen a 1-10 \mug/ml en tampón de lavado. Añadir 50 \mul de células a una placa de 96 pocillos de fondo en V de Linbro (ICN 7632105). Sembrar un pocillo de células por cada control por cada línea celular a ser analizada, incluyendo células sin anticuerpo, anticuerpo 2º solo, medio de hibridoma, sobrenadante de anticuerpo control positivo, si hay, o purificado, y una subclase de IgG control (si se usan anticuerpos purificados).

Sembrar un pocillo de células por cada muestra experimental por cada línea celular a ser analizada. Centrifugar la placa, 12000 rpm durante 5 minutos, usando una centrífuga de mesa a 4ºC. Eliminar el tampón invirtiendo la placa y agitando hasta que el líquido esté sustancialmente descartado. Añadir 40- 50 \mul de anticuerpos (o tampón de lavado para los pocillos control sin anticuerpo y sólo anticuerpo 2º) a los pocillos. Incubar al menos 30 minutos-1 hora a 4ºC. Centrifugar la placa, 1200 rpm durante 5 minutos. Eliminar las soluciones de anticuerpo. Lavar los pocillos dos veces con 200 \mul de tampón de lavado por pocillo, centrifugando tras cada lavado. Eliminar el tampón.

Resuspender las células en cada pocillo en 50 \mul de una dilución 1:200 (en tampón de lavado) de IgG de cabra anti-ratón con etiqueta R-PE, específica de Fc (Jackson Immunoresearch Laboratories Cat# 115-116-071). Incubar 20 minutos, 4ºC, en la oscuridad. Añadir 150 \mul de tampón de lavado a las células en cada pocillo. Centrifugar la \mulaca a 1200 rpm durante 5 minutos. Lavar una vez con 200 \mul de tampón de lavado por pocillo. Resuspender las células en 150 \mul de PFA al 1% en PBS. Transferir el contenido de cada pocillo a tubos separados (tubos de 5 ml de poliestireno con fondo redondeado Falcon 352052). Envolver los tubos en papel de aluminio.

El contenido de los tubos se lee después mediante citometría de flujo.

Los resultados de dos cribados de anticuerpos monoclonales producidos mediante este método produjo los resultados siguientes, resumidos en las tablas 1 y 2 a continuación, en donde la primera columna proporciona los nombres designados para los subclones de hibridoma, las siguientes dos columnas muestran los resultados de los cribados de ELISA, y las columnas restantes muestran los resultados del análisis de citometría de flujo en cuatro líneas celulares positivas para cripto. Los resultados se dan en unidades de índice medio de fluorescencia (IMF).

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TABLA 1 Caracterización de anticuerpos monoclonales anti-cripto

3

TABLA 2 Caracterización de anticuerpos monoclonales anti-cripto

4

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Ejemplo 3 Ensayo en célula nula para la inhibición de la señalización de Cripto

A continuación se describe un ensayo de señalización en células F9 nulas para Cripto usado para evaluar la inhibición de la señalización de Cripto.

Día 0 Recubrir placas de 6 pocillos con gelatina al 0,1%, 2 ml/pocillo a 37ºC durante 15 minutos.

Sembrar las células a 6x10^{5} células F9 nulas para Cripto por pocillo.

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Día 1 Transfección:

Se añade cada una de las siguientes muestras a 300 \mul de OptiMeml para dar la Solución A para cada muestra:

Muestra 1: 0,5 \mug de ADNc de indicador (N_{2})_{7} luciferasa FAST más 1,5 \mug de ADNc de vector vacío.

Muestra 2: 0,5 \mug de ADNc de (N_{2})_{7} luciferasa, 0,5 \mug de FAST, y 1,5 \mug de vector vacío.

Muestra 3: 0,5 \mug de ADNc de (N_{2})_{7} luciferasa, 0,5 \mug de Cripto ADD 0,5 FAST, y 0,5 \mug de vector vacío.

Muestra 4: 0,5 \mug de ADNc de (N_{2})_{7} luciferasa, 0,5 \mug de Cripto, 0,5 FAST, y 0,5 \mug de vector vacío.

Muestra 5: 0,5 \mug de ADNc de (N_{2})_{7} luciferasa, 0,5 \mug de Cripto, 0,5 FAST, y 0,5 \mug de vector vacío.

Muestra 6: 0,5 \mug de ADNc de (N_{2})_{7} luciferasa, 0,5 \mug de Cripto, 0,5 FAST, y 0,5 \mug de vector vacío.

Muestra 7: 0,5 \mug de ADNc de (N_{2})_{7} luciferasa, 0,5 \mug de Cripto, 0,5 FAST, y 0,5 \mug de vector vacío.

Muestra 8: 0,5 \mug de ADNc de (N_{2})_{7} luciferasa, 0,5 \mug de Cripto, 0,5 FAST, y 0,5 \mug de vector vacío.

Muestra 9: 0,5 \mug de ADNc de (N_{2})_{7} luciferasa, 0,5 \mug de Cripto, 0,5 FAST, y 0,5 \mug de vector vacío.

La solución B comprende 30 \mul de Lipofectamina más 270 \mul de OptiMeml.

Para cada muestra, mezclar la solución A y la solución B.

Incubar 45 minutos a temperatura ambiente. Enjuagar los pocillos con 2 ml/pocillo de OptiMeml. Aspirar justo antes del siguiente paso.

Añadir 2,4 ml de OptiMeml a cada mezcla de soluciones A+B, mezclar, añadir 1,5 ml/pocillo a pocillos en duplicado. Incubar 5 horas a 37ºC. Añadir 1,5 ml/pocillo de DMEM + SFT al 10%, Gln 2 mM, P/S a los pocillos que recibieron las muestran 1-3. Añadir anticuerpos anti-Cripto como sigue: pocillos de la muestra 4: A27F6.1, 10 \mug/ml; pocillos de la muestra 5: A27F6.1, 2 \mug/ml; pocillos de la muestra 6: A40G12.8, 10 \mug/ml; pocillos de la muestra 7: A40G12.8, 2 \mug/ml; pocillos de la muestra 8: A10B26.18, 10 \mug/ml; pocillos de la muestra 5: A10B2.18, 2 \mug/ml.

Día 2 Eliminar el medio, lavar las células con PBS, 2 ml/pocillo. Añadir DMEM + SFT al 0,5%, Gln 2 mM, P/S con la misma cantidad de anticuerpos anti-Cripto que el día anterior, a los mismos pocillos.

Día 3 Revelar la señal de luciferasa. Lavar los pocillos con PBS + Ca^{2+} y Mg^{2+}, 2 ml/pocillo. Usar el kit LucLite, Packard cat# 6016911. Llevar el tampón y el sustrato a temperatura ambiente. Apagar las luces. Reconstruir el sustrato con 10 ml de tampón. Diluir 1:1 con PBS + Ca^{2+} y Mg^{2+}. Aspirar los pocillos. Añadir rápidamente 250 \mul de sustrato diluido por pocillo usando una pipeta de repetición. Agitar la solución y transferir 200 \mul a los pocillos de una placa de 96 pocillos con fondo blanco opaco, Falcon 35-3296. Leer la placa en un luminómetro usando Winglow, exportando los datos a Excel.

Los resultados de este ensayo se resumen a continuación en la Tabla 3.

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TABLA 3 Ensayo de señalización de Cripto: Inhibición con anticuerpos monoclonales anti-Cripto

6

Ejemplo 4 Ensayo para la inhibición in vitro del crecimiento de células tumorales

La inhibición de la señalización de Cripto también se puede ensayar midiendo el crecimiento de células GEO en agar blando. Ver, por ejemplo, Ciardiello et al., Oncogene. Ene 1994; 9(1):291-8; Ciardiello et al., Cancer Res. 1 Feb 1991; 51(3):1051-4.

Primero, fundir bactoagar al 3%. Mantener a 42ºC en un baño de agua. Después, mezclar la solución de bactoagar al 3% con medio completo precalentado para hacer una solución de bactoagar al 0,6%, manteniendo a 42ºC. Plaquear 4 ml de la solución en una placa de 6 cm y dejar enfriar durante al menos 30 minutos para formar la capa inferior de agar. Tripsinizar las células GEO y resuspender a 10^{5} células/ml en medio completo. Añadir los anticuerpos a ensayar, o controles, a las suspensiones de células, titulando los anticuerpos desde 20 \mug a 1 \mug. Mezclar volúmenes iguales de las suspensiones de células GEO y bactoagar al 0,6% y cubrir con 2 ml encima de la capa de agar inferior. Dejar enfriar durante al menos 1 hora. Incubar 14 días a 37ºC en un incubador de CO_{2}. Contar las colonias visibles sin el uso de un microscopio. La ausencia de colonias, comparada con los controles negativos, indica que el anticuerpo probado inhibe el crecimiento in vitro de las células tumorales.

Este ensayo se usó para dar los resultados mostrados en la tabla 4, para los anticuerpos A27F6.1 y B6G7.10, ambos de los cuales demostraron la capacidad de disminuir el crecimiento de las colonias de células GEO.

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TABLA 4 Resultados del ensayo de crecimiento en agar blando

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Ejemplo 5 Ensayo para la inhibición in vivo del crecimiento de células tumorales

Para evaluar la inhibición del crecimiento de células tumorales, se implanta una línea de células tumorales humanas subcutáneamente en ratones desnudos atimicos y se observan los efectos de los anticuerpos de la invención, con y sin tratamientos quimioterapéuticos adicionales que pueden proporcionar efectos sinergísticos o aditivos sobre la inhibición tumoral.

Este ensayo se puede realizar alternativamente usando diferentes líneas de células tumorales, tal como, por ejemplo, GEO (una línea celular in vitro de cáncer de colon humano bien diferenciada, obtenida de la Colección de Americana de Cultivos Tipo (ATCC)), DU-4475 (una línea de células in vitro de cáncer de mama obtenida de la ATCC), NCCTI (una línea celular de tumor de testículo obtenida de la ATCC), u otras conocidas en la técnica. Un ejemplo de tales ensayos es como sigue:

Los animales se marcan individualmente mediante perforaciones en las orejas. La línea de células GEO se pasa in vitro o in vivo durante 1-4 pases. A los animales se les implanta las células GEO subcutáneamente en la zona del flanco derecho. Se pueden usar los siguientes grupos de animales:

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Día 0: Implantar el tumor, registrar el peso corporal inicial de los animales.

Día 1: Iniciar los tratamientos como se ha indicado anteriormente.

Día 5: Empezar las medidas de tamaño del tumor y peso corporal y continuar dos veces por semana hasta la terminación del experimento.

Se examinan el peso corporal inicial, medidas del tamaño del tumor y el peso corporal, histología en el sacrificio, y análisis de inmunohistoquímica en los tumores, analizando la expresión de Cripto, el crecimiento del tumor, y la inhibición de los mismos.

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Ejemplo 6 Modelo tumoral de xenoinjerto in vivo - Anticuerpo bloqueante anti-Cripto rico en cisteina

Para evaluar la respuesta de NCCIT, se implantó subcutáneamente una línea celular de carcinoma de testículo humano con un anticuerpo que se une a un dominio rico en cisteina de Cripto. Los métodos experimentales se enumeran a continuación. Los resultados se muestran en la figura 1.

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Métodos y materiales

Animales: Se usaron ratones desnudos atimicos macho. Los animales se numeraron individualmente mediante perforaciones en las orejas.

Tumor: NCCIT, línea celular humana in vitro de carcinoma de testículo mezcla de células mediastinales y germinales originalmente obtenido de la Colección Americana de Cultivos Tipo. La línea celular se pasó in vitro durante seis pases en RPMI-1640/SBF al 10% sin antibióticos. Los animales se implantaron subcutáneamente con 5 x 10^{6} células/0,2 ml de matrigel en el flanco derecho de los animales.

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Programa de ensayo

Día -1: Se separaron los ratones al azar en grupos control y de tratamiento. Se registra el peso corporal inicial de los animales. Se administraron los primeros tratamientos a los grupos de anticuerpo. Se prepararon las soluciones de dosis. Los tratamientos fueron ciegos para los técnicos hasta que el ensayo terminó.

Día 0: Se implantó el tumor. Se corrieron cultivos bacterianos sobre el tumor implantado en los ratones.

Día 1: Se administraron los primeros tratamientos al grupo quimioterapéutico positivo.

Día 4: Se registraron las medidas iniciales de tamaño del tumor para la línea base tumoral en matrigel. Se continuó registrando el tamaño del tumor y los pesos corporales en ratones 2x/semana. Se controló el estudio diariamente y se hicieron anotaciones de cualquier observación inusual en los animales.

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Criterios de valoración

Peso corporal inicial.

Medidas del tamaño del tumor y peso corporal.

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Ejemplo 7 Modelo tumoral de xenoinjerto in vivo - Anticuerpo bloqueante anti-Cripto dominio similar a EGF

Para evaluar la respuesta de NCCIT, se implantó subcutáneamente una línea celular de carcinoma de testículo humano con un anticuerpo que se une a un dominio similar a EGF de Cripto. Los métodos experimentales se enumeran a continuación. Los resultados se muestran en la figura 2.

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Métodos y materiales

Animales: Se usaron ratones desnudos atímicos macho. Los animales se numeraron individualmente mediante perforaciones en las orejas.

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Tumor: NCCIT, línea celular humana in vitro de carcinoma de testículo mezcla de células mediastinales y germinales originalmente obtenido de la Colección Americana de Cultivos Tipo. La línea celular se pasó in vitro durante ocho pases en RPMI-1640/SBF al 10% sin antibióticos. Los animales se implantaron subcutáneamente con 5 x 10^{6} células/0,2 ml de matrigel en el flanco derecho de los animales.

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Programa de ensayo

Día -1: Se separaron los ratones al azar en grupos control y de tratamiento. Se registró el peso corporal inicial de los animales. Se administraron los primeros tratamientos a los grupos de anticuerpo. Se prepararon las soluciones de las dosis.

Los tratamientos fueron ciegos para los técnicos hasta que el ensayo terminó.

Día 0: Implantar el tumor. Se corrieron cultivos bacterianos sobre los tumores implantados en los ratones. Los cultivos bacterianos fueron negativos para contaminación a las 24 y 48 tras el muestreo

Día 1: Se administraron los primeros tratamientos al grupo quimioterapéutico positivo.

Día 4: Se registraron las medidas iniciales de tamaño del tumor para la línea base tumoral en matrigel. Se continuó registrando el tamaño del tumor y los pesos corporales en ratones 2x/semana. Se controló el estudio diariamente y se hicieron anotaciones de cualquier observación inusual en los animales.

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Criterios de valoración

Peso corporal inicial.

Medidas del tamaño del tumor y peso corporal.

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Ejemplo 8 Anticuerpos monoclonales contra Cripto que bloquean la unión a ALK4

Para evaluar si los anticuerpos monoclonales específicos de Cripto pueden interferir con la capacidad de Cripto de unirse a Alk4, el receptor de activina de tipo I, se usó análisis por citometría de flujo usando una línea de células 293 que expresan Alk4 de forma estable. Para generar esta línea celular, las células 293 se cotransfectaron con un plásmido que expresa Alk-4 con etiqueta de epítopo HA en el C-terminal y un plásmido que expresa el fármaco, puromicina, en una proporción 1:10. Las células transfectadas se seleccionaron después en puromicina hasta que se formaron colonias. Se recogieron colonias, se expandieron y después se analizaron para la expresión de Alk4 usando análisis de inmunotransferencia para HA. Se determinó que el clon 21 (293-A1k4-21) expresaba niveles altos de Alk4 comparado con el control, células 293 no transfectadas.

Para analizar la unión Cripto-Alk4 mediante citometría de flujo, se empleó una forma purificada soluble de Cripto humana (aa 1-169) fusionada a la parte Fc de la IgG humana (CrdelC-Fc). Se incubaron aproximadamente 5 \mug/ml de proteína CrdelC-Fc o Fc control con 3x10^{5} células 293-A1k4-21 en hielo durante 30 minutos en un volumen total de 50 \mul de tampón FACS (PBS con BSA al 0,1%). Para las muestras que contenían anticuerpos anti-Cripto, se preincubaron 5 \mug/ml de CrdelC-Fc con 50 \mug/ml de cada anticuerpo contra Cripto (A10.B2.18, A40.G12.8, A27.F6.1, A8.H3.1, A19.A10.30, A6.F8.6, A8.G3.5, A6.C12.11) en hielo antes de la adición de las células. Las células se lavaron después en tampón de FACS y la proteína Fc unida se detectó incubando las células con una IgG anti-humana de cabra conjugada con R-ficoeritrina (específica del fragmento Fc) de Jackson Immunologics. Las muestras se lavaron de nuevo, se fijaron en paraformaldehído al 1% en PBS, y se analizaron usando procedimientos estándar de citometría de flujo. Los resultados del ensayo de FACS se muestran en la figura 3.

Algunas de las formas de realización de la invención descritas anteriormente se esbozan a continuación e incluyen, pero no están limitadas a, las siguientes formas de realización. Como apreciarán los expertos en la materia, se pueden hacer numerosos cambios y modificaciones a las varias formas de realización de la invención. Se pretende que todas esas variaciones estén dentro del ámbito de la invención.

<110> Biogen, Inc.

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Sanicola-Nadel, Michele

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Williams, Kevin

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Schiffer, Susan

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Rayhorn, Paul

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<120> Anticuerpos bloqueantes contra Cripto y usos de los mismos

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<130> A117 PCT

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<140> No asignado aún

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<141> 16-04-2002

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<150> 60/286782

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<151> 26-04-2001

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<150> 60/293020

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<151> 17-05-2001

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<150> 60/301091

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<151> 26-06-2001

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<150> 60/367002

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<151> 22-03-2002

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<160> 2

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<170> FastSEQ para Windows versión 4.0

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<210> 1

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<211> 188

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<212> PRT

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<213> Homo Sapiens

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<400> 1

12

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<210> 2

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<211> 188

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<212> PRT

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<213> Homo Sapiens

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<400> 2

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LISTADO DE SECUENCIAS

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La secuencia de 188 aminoácidos para CR-1 es como sigue [SEQ IE NO: 1]:

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La secuencia de 188 aminoácidos para CR-3 es como sigue [SEQ ID NO: 2]:

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Claims (21)

1. Un anticuerpo que se une específicamente a un epitopo de Cripto comprendido en el dominio que abarca los residuos de aminoácidos desde el aminoácido 46 al aminoácido 62 de SEQ ID NO: 1 ó SEQ ID NO: 2.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo se une a un epítopo seleccionado del grupo de epitopos a los que se unen los anticuerpos producidos por los hibridomas seleccionados del grupo que consiste en AlOB2.18 y B3F6.7.

3. El anticuerpo de la reivindicación 1 ó 2, en donde el anticuerpo es capaz de internalizar Cripto.

4. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que es un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en un fragmento Fab, un Fab' y un F(ab)2.

5. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que es un anticuerpo de longitud completa.

6. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que es un anticuerpo de cadena sencilla.

7. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 que está conjugado a un agente quimioterapéutico.

8. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para su uso en terapia en combinación con un agente quimioterapéutico no conjugado.

9. El anticuerpo de la reivindicación 7, en donde el agente quimioterapéutico se selecciona del grupo que consiste en un profármaco activado por tumor, un radionúclido y una toxina seleccionada del grupo que consiste en ricina, toxina de la difteria y exotoxina de pseudomonas.

10. El anticuerpo de la reivindicación 7 ó 9, en donde el agente quimioterapéutico es un maitansinoide.

11. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 que es humano.

12. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 que es monoclonal.

13. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 que es humanizado.

14. Una composición farmacéutica que comprende al menos uno de los anticuerpos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y 9 a 13 y opcionalmente un soporte.

15. La composición farmacéutica según la reivindicación 14, que comprende además un agente quimioterapéutico no conjugado.

16. La composición farmacéutica de la reivindicación 14 ó 15, en donde el anticuerpo es B3F6.7 humanizado.

17. Uso de un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 o una composición de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16 para disminuir el crecimiento tumoral in vitro.

18. Uso de un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 o una composición de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16 para la preparación de una composición farmacéutica para disminuir el crecimiento tumoral in vitro.

19. El uso según la reivindicación 17 ó 18, en donde la célula tumoral se selecciona del grupo que consiste en células de tumor de mama, testículo, colon, pulmón, ovario, vejiga, útero, cervical, páncreas y estómago.

20. Uso de un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 o una composición de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de proliferación celular no deseada.

21. Un método de modular el crecimiento de células tumorales in vitro en una muestra que comprende el paso de añadir a la muestra el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 o la composición de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16.