ES2316658T3 - Composicion deshidratada de factor sanguineo que comprende trehalosa. - Google Patents

Abstract

Utilización de trehalosa en ausencia de albúmina para estabilizar el Factor VIII a temperaturas ambiente en una composición seca adecuada para la reconstitución con agua o con una solución acuosa para formar una solución para la administración a un paciente hemofílico por inyección.

Description

Composición deshidratada de factor sanguíneo que comprende trehalosa.

La presente invención se refiere a composiciones deshidratadas de factores sanguíneos para su reconstitución con agua o soluciones acuosas.

Los factores sanguíneos, particularmente el Factor VIII y el Factor IX, constituyen en la actualidad el tratamiento estándar para enfermedades causadas por una carencia del factor apropiado, en particular la hemofilia. El factor sanguíneo se ha derivado generalmente de sangre humana mediante diversas técnicas de extracción, por ejemplo tal como se da a conocer en el documento EP-A-0083483, o mediante la expresión en microorganismos genéticamente modificados, por ejemplo tal como se da a conocer en los documentos EP-A-0160457 y EP-A-0182448.

Los productos basados en factores sanguíneos, tales como el Factor VIII, son proteínas inestables, muy delicadas. Estos productos se proporcionan normalmente en forma de soluciones congeladas en una solución tampón apropiada, o más generalmente, en forma de polvos liofilizados. Incluso los polvos liofilizados deben mantenerse fríos durante el almacenamiento. Con el fin de estabilizar el material liofilizado, los productos comerciales contienen una proteína estabilizadora, en particular albúmina de suero humano (HSA). No se ha creído que fuese posible preparar un composición de factor sanguíneo que sea estable a temperaturas ambientes y a las temperaturas de pasteurización (p.ej. 60ºC) en ausencia de HSA. Sin embargo, la presencia de HSA plantea considerables problemas de purificación ya que es esencial que la proteína esté exenta de contaminación vírica. La utilización de HSA recombinante para resolver dichos problemas resulta costosa.

Se cree que es deseable que el producto comercial para inyecciones presente una concentración de sal isotónica. Sin embargo, las formulaciones para elaboración que se liofilizan son deseablemente hipertónicas, conteniendo típicamente NaCl aproximadamente 500 mM (NaCl isotónico = 150 mM), ya que esto se considera que ayuda a estabilizar el factor sanguíneo. Como resultado de ello, las formulaciones liofilizadas comerciales presentan generalmente un alto contenido de sal y se reconstituyen para inyección con la cantidad apropiada de agua estéril para obtener una solución isotónica.

Es conocido que la trehalosa es un agente estabilizador muy eficaz para proteínas delicadas, tal como se da a conocer en el documento US-A-4891319 y en Roser, Biopharm. 1991, vol. 4(8): 47-53, lo cual hace posible que las proteínas se sequen a temperaturas por encima del punto de congelación.

Se ha descubierto en la actualidad que si la trehalosa es utilizada para estabilizar un producto de factor sanguíneo, el producto no únicamente puede ser secado con o sin liofilización, sino que el producto es asimismo estable incluso cuando es mantenido a una temperatura de 60ºC durante un periodo prolongado, en ausencia total de HSA. Según la presente invención, por lo tanto, una composición de factor sanguíneo deshidratada estable contiene una cantidad estabilizante de trehalosa en ausencia de albúmina.

En general, se puede utilizar cualquier cantidad estabilizadora de trehalosa y en general un exceso no causa problemas. En realidad, la presencia de trehalosa favorece el procedimiento de rehidratación y es fisiológicamente aceptable para inyecciones, siendo metabolizada rápidamente para formar glucosa. En general, es deseable una relación de 0,15 mg a 2,5 mg de trehalosa por cada unidad de Factor VIII. La composición es particularmente adecuada para formulaciones de Factor VIII, que pueden contener asimismo sales reguladoras de pH y de refuerzo iónico apropiadas, en particular una fuente de calcio.

Pueden estar presentes asimismo otros agentes de regulación de pH y modificadores en el material seco para la reconstitución de la solución para inyección, por ejemplo, histidina. Sin embargo, se ha descubierto que el nivel de las sales, particularmente cloruro sódico, presentes puede afectar la preservación sobre el secado.

Resulta preferido un contenido en sal considerablemente reducido para el material deshidratado de la invención, y en general una solución de aproximadamente 500 unidades de Factor VIII por cada ml que se ha de secar deberá contener preferentemente una cantidad inferior a 200 mM, p.ej. de 75 a 150 mM, de NaCl, especialmente aproximadamente 100 mM, o incluso inferior, p.ej. de 20 a 50 mM, especialmente de 22 a 30 mM. Las preparaciones con bajo contenido de sal presentan una estabilidad en seco superior. El producto seco se puede reconstituir al nivel de sal deseado con una solución salina en lugar del agua convencional. En general, la relación molar de trehalosa a sal deberá ser superior a 1:1, especialmente superior a 2,5:1, p.ej. superior a 10:1, preferentemente superior a 12,5:1.

La composición deshidratada se puede obtener secando una solución apropiada del factor sanguíneo que contiene las proporciones correctas de trehalosa y otros componentes deseados. En general, la solución que se seca deberá contener simplemente todos los componentes necesarios en la solución para inyección reconstituida, aunque la solución para el secado puede no encontrarse necesariamente en la misma dilución. Típicamente, la solución para el secado contendrá de 1 a 1.000 unidades de Factor VIII por cada ml. Los procedimientos de secado pueden incluir secado por congelación (liofilización), secado a vacío y secado por aspersión. Un procedimiento particularmente preferido según la invención comprende secar a vacío a una temperatura no superior a 25ºC, preferentemente no superior a 10ºC, para formar una espuma, maximizando de este modo la superficie expuesta y el efecto del secado.

Los Ejemplos siguientes ilustran la invención adicionalmente.

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Ejemplo 1

Se recibió Factor VIII recombinante en forma de una solución congelada a baja temperatura que contenía aproximadamente de 2.000 a 2.500 unidades/ml en la solución tampón altamente salina del fabricante. La solución descongelada se dializó contra una solución tampón que contenía NaCl 500 mM, CaCl_{2} 15 mM e histidina 10 mM a un pH de 6,8. La proteína dializada se diluyó en la misma solución tampón, pero con trehalosa añadida, para proporcionar una concentración final de 500 unidades por cada ml y el 10% en peso de trehalosa a un pH de 6,8. Esta solución se secó a vacío en partes alícuotas de 1 ml. El vació se redujo gradualmente de la presión atmosférica a 4 Pa (30 mTorr), para evitar la congelación de la muestra. No se dejó que la temperatura de la muestra se elevara por encima de 12ºC hasta la formación de una espuma, después de lo cual la temperatura se mantuvo por debajo de 30ºC. Los tiempos de secado totales fueron de 24 a 28 horas.

Las muestras se almacenaron durante 0, 1,5, 3 y 6 meses a una temperatura de 40ºC y a continuación se reconstituyeron en partes alícuotas de 5 ml de agua destilada estéril antes de ser ensayadas para determinar su actividad. Los resultados están representados en la tabla siguiente en comparación con un producto liofilizado comercial que contenía HSA. El análisis y las muestras comerciales presenta un alto contenido en sal. Los resultados después del secado muestran que, con la trehalosa, es posible secar Factor VIII satisfactoriamente en ausencia de HSA, pero que un alto contenido de sal es insatisfactorio para un almacenamiento a largo plazo, incluso en presencia de HSA.

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Porcentaje de actividad inicial

1

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Ejemplo 2

Se secaron muestras tal como se ha descrito en el Ejemplo 1, pero utilizando una formulación de solución tampón que comprendía NaCl 100 mM, CaCl_{2} 15 mM, histidina 15 mM y trehalosa 1,27 molar (48%) y se almacenaron a una temperatura de 60ºC antes de su reconstitución. Los resultados se indican en la siguiente tabla, en la que la actividad se mide en un coagulómetro automatizado ACL 100 (Instrumentation Laboratory SpA, Milán, Italia). La muestra de análisis, con un bajo contenido de sal, no mostró ninguna pérdida importante de actividad en el almacenamiento, incluso después de cuatro semanas a una temperatura de 60ºC.

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Porcentaje de actividad inicial recuperada

2

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Ejemplo 3

Se prepararon dos formulaciones que contienen unas concentraciones de sal diferentes como son representadas:

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100

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Se distribuyeron porciones de 10 ml de las formulaciones en viales de 30 ml separados para proporcionar una concentración del Factor VIII de 500 unidades/vial.

La liofilización se realizó en un liofilizador Laconco (Lyph-lock 12 de cierre). Inicialmente, las muestras se enfriaron a -40ºC y se dispusieron a continuación al vacío, antes de su calentamiento hasta -35ºC. Tras 80 horas, las muestras se calentaron a una tasa de 2,5ºC/h hasta que la temperatura de la bandeja alcanzó 25ºC. Las muestras se mantuvieron a continuación a 25ºC durante dos horas antes de su sellado al vacío y su extracción del secador.

Tras el secado, las muestras se rehidrataron con 10 ml de agua y se midió la concentración del Factor VIII dos veces (Ensayos 1 y 2). Los resultados son proporcionados en la tabla siguiente y están expresados como un porcentaje de la concentración del Factor VIII con respecto al control de precarga (que ha sido congelado a -70ºC). A partir de los resultados representados, se puede concluir que el Factor VIII puede ser liofilizado de manera satisfactoria en una formulación a base de trehalosa en ausencia de HSA.

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3

Claims (10)

1. Utilización de trehalosa en ausencia de albúmina para estabilizar el Factor VIII a temperaturas ambiente en una composición seca adecuada para la reconstitución con agua o con una solución acuosa para formar una solución para la administración a un paciente hemofílico por inyección.

2. Utilización según la reivindicación 1, en la que la composición contiene de 0,15 a 2,5 mg de trehalosa por unidad del Factor VIII.

3. Utilización según la reivindicación 1 ó 2, en la que el Factor VIII es recombinante.

4. Utilización según la reivindicación 1, en la que la composición comprende sal y la proporción molar de trehalosa a sal es superior a 1:1.

5. Utilización según la reivindicación 4, en la que la composición contiene más de 2,5 moles de trehalosa por mol de sal.

6. Utilización según la reivindicación 5, en la que la composición contiene más de 10 moles de trehalosa por mol de sal.

7. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la trehalosa está presente en una solución del Factor VIII que es a continuación secada para formar dicha composición seca.

8. Utilización según la reivindicación 7, en la que dicha solución contiene de 1 a 1.000 u/ml del Factor VIII.

9. Utilización según la reivindicación 7 ó 8, en la que dicha solución es liofilizada para formar dicha composición seca.

10. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que la composición comprende histidina.