ES2312595T3 - Piruvato-quinasa como nueva molecula diana. - Google Patents
Piruvato-quinasa como nueva molecula diana. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2312595T3 ES2312595T3 ES02748716T ES02748716T ES2312595T3 ES 2312595 T3 ES2312595 T3 ES 2312595T3 ES 02748716 T ES02748716 T ES 02748716T ES 02748716 T ES02748716 T ES 02748716T ES 2312595 T3 ES2312595 T3 ES 2312595T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- pyruvate kinase
- cells
- activity
- apoptosis
- gfp
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6875—Nucleoproteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/91—Transferases (2.)
- G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2510/00—Detection of programmed cell death, i.e. apoptosis
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Un método de identificación de nuevos moduladores de apoptosis que comprende cribado respecto a sustancias capaces de modular la actividad de piruvato-quinasa M2, en el cual la actividad comprende una translocación al núcleo.
Description
Piruvato-quinasa como nueva
molécula diana.
La presente invención se refiere al uso de una
piruvato-quinasa o un ácido nucleico que codifica la
misma como diana para la modulación de procesos apoptóticos,
particularmente como molécula diana para la diagnosis, la
prevención o el tratamiento de trastornos asociados con apoptosis,
tales como tumores.
La piruvato-quinasa (ATP:
piruvato-2-O-fosfotrans-ferasa,
PK), es una enzima glicolítica controladora de la velocidad y
cataliza la formación de piruvato y ATP a partir de
fosfoenolpiruvato y ADP. En los mamíferos, PK existe como cuatro
isoenzimas designadas como tipos M1, M2, L y R, cuya expresión
difiere de un tipo de célula a otra (Tanaka et al. 1967,
Ibsen et al. 1974, Nowak et al. 1981). El tipo M2,
considerado como el prototipo, es predominante en el feto, en las
neuplasias (sic) y en tejidos no diferenciados o proliferantes,
pero está también distribuido ampliamente en tejidos adultos
(Mallati et al. 1992, Guminska et al. 1988). Esta
forma es reemplazada progresivamente por el tipo M1 en el músculo
esquelético, el corazón y el cerebro durante la diferenciación. La
carcinogénesis invierte aparentemente este proceso. Los tipos M1 y
M2 son producidos a partir del mismo gen, por remodelación
alternativa. La diferencia entras dos isoformas reside en un exón
que codifica 51 residuos de aminoácidos, en los cuales 21 residuos
son diferentes. La propiedad enzimológica de la isoenzima tipo M1
es muy diferente de las otras tres formas, dado que la misma es la
única que no está regulada alostéricamente. El tipo M1 exhibe
cinética hiperbólica y no es activado por
fructosa-1,6-bisfosfato (FBP); en
contraste, el tipo M2 exhibe curva cinética que es activado por FBP
(Saheki et al. 1982).
La enzima glicolítica
gliceraldehído-3-fosfato-des-hidrogenasa
exhibe funciones no relacionadas con su actividad glicolítica y
juega un papel en diversos procesos celulares. Por ejemplo, se ha
demostrado que GAPDH sufre translocación al núcleo e induce
apoptosis, para fijar t-RNAs específicos y
posiblemente está implicada en la activación de la transcripción.
Sin embargo, no se ha hecho sugerencia alguna en la bibliografía
publicada en el sentido de que la piruvato-quinasa
esté asociada con procesos apoptóticos.
Así, fue sorprendente que el análogo
anti-proliferativo de somatostatina
TT-232 (Kéri et al., 1993a, Kéri et
al. 1993b y Kéri et al. 1996) se fije a
piruvato-quinasa, particularmente la isoenzima de
piruvato-quinasa M2. La fijación de
TT-232 a piruvato-quinasa conduce a
una translocación nuclear y una inducción de apoptosis. Este
resultado demuestra que la piruvato-quinasa está
implicada en procesos apoptóticos y representa una molécula diana
para el desarrollo de nuevos fármacos, particularmente de fármacos
contra el cáncer y las enfermedades inflamatorias.
La presente invención se refiere a un método de
identificación de nuevos moduladores de apoptosis que comprende
cribado en busca de sustancias capaces de modular la actividad de
piruvato-quinasa, en donde la actividad comprende
una translocación al núcleo.
Un aspecto adicional de la presente invención se
refiere a una isoforma M2 de piruvato-quinasa
nuclear, que exhibe mayor movilidad electroforética comparada con
la isoforma citosólica de piruvato-quinasa.
El término
"piruvato-quinasa", tal como se utiliza en la
presente solicitud, hace referencia a la isoenzima de
piruvato-quinasa M2. Particularmente, la
piruvato-quinasa es la isoenzima M2
(Swiss-Prot. número 14786). La secuencia de DNA que
codifica las isoformas de piruvato-quinasa se
describe en Genbank, número de acceso X56494. Las
piruvato-quinasas pueden obtenerse a partir de
fuentes animales humanas o no humanas, particularmente de fuentes
de mamífero, tales como hombre, ratón, rata, hámster, mono, cerdo,
etc. Es especialmente preferida la piruvato-quinasa
M2 humana que comprende:
- a)
- la secuencia de aminoácidos que se muestra en Swiss-Prot. número P14786 o
- b)
- una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 80%, particularmente de al menos 90% y más particularmente de al menos 95% con aquélla, en donde la identidad de secuencia de aminoácidos puede determinarse por un programa de computadora adecuado, tal como GCG o BLAST.
\vskip1.000000\baselineskip
Adicionalmente, el término
"piruvato-quinasa" abarca derivados
recombinantes o variantes de la misma, así como fragmentos de la
misma que tienen actividad biológica. Estos derivados, variantes y
fragmentos de aquélla pueden obtenerse como productos de expresión
de genes alélicos variantes o de genes alterados recombinantemente,
v.g. genes modificados o truncados y/o como productos de la escisión
proteolítica. El término "actividad biológica" o
"actividad" en el contexto de la
piruvato-quinasa comprende preferiblemente la
aptitud para modular la apoptosis, particularmente la fijación al
análogo de somatostatina TT-223 y/o la translocación
en el núcleo. Residuos particularmente importantes para actividad
de piruvato-quinasa son los residuos de aminoácidos
334-420 que contienen una señal de localización
nuclear.
Una variante de piruvato-quinasa
particularmente preferida es una isoforma nuclear de
piruvato-quinasa M2 que difiere de la
piruvato-quinasa citosólica en que la misma exhibe
una movilidad electroforética mayor. La isoforma nuclear puede
obtenerse a partir de la isoforma citosólica por translocación y
procesamiento nucleares.
La proteína piruvato-quinasa es
codificada por un ácido nucleico que puede ser un DNA o un RNA.
preferiblemente, el ácido nucleico comprende:
- (a)
- la secuencia de ácido nucleico que se muestra en Genbank, número de acceso X56494 o complementaria de la misma
- (b)
- una secuencia de ácido nucleico que corresponde a la secuencia correspondiente a (a) dentro del alcance de la degeneración del código genético o
- (c)
- una secuencia de ácido nucleico que se hibrida en condiciones severas con una secuencia de (a) y/o (b).
El término "hibridación en condiciones
severas" de acuerdo con la presente solicitud se utiliza como se
describe en Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbour, Laboratory Press (1989),
1101-1104. Por consiguiente, la hibridación en
condiciones severas ocurre cuando una señal de hibridación positiva
se detecta todavía después de lavado durante una hora con 1 x SSC y
0,1% SDS a 55ºC, preferiblemente a 62ºC y muy preferiblemente a
68ºC, en particular durante 1 h en 0,2 x SSC y 0,1% SDS a 55ºC,
preferiblemente a 62ºC y muy preferiblemente a 68ºC. Una secuencia
de nucleótidos que se hibrida en tales condiciones de lavado con
una secuencia como se muestra en el listado de secuencias o una
secuencia de nucleótidos complementaria o una secuencia dentro del
alcance de la degeneración del código genético está abarcada por la
presente invención.
Las moléculas de ácido nucleico de la invención
pueden ser moléculas de ácido nucleico recombinantes generadas por
métodos recombinantes, v.g. por procedimientos de amplificación
conocidos tales como PCR. Por otra parte, las moléculas de ácido
nucleico pueden ser también ácidos nucleicos sintetizados
químicamente. Preferiblemente, las moléculas de ácido nucleico
están presentes en un vector, que puede ser cualquier vector
procariota o eucariota, en el cual la secuencia de ácido nucleico
está presente preferiblemente bajo control de una señal de
expresión adecuada, v.g. promotor, operador, intensificador, etc.
Ejemplos de vectores procariotas son vectores cromosómicos tales
como bacteriófagos y vectores extracromosómicos tales como
plásmidos, prefiriéndose vectores plasmídicos circulares. Ejemplos
de vectores eucariotas son vectores de levadura o vectores adecuados
para células superiores, v.g. células de insecto o células de
mamífero, plásmidos o virus.
La piruvato-quinasa es capaz de
fijar el análogo de somatostatina TT-232 y mediar su
efecto, particularmente su efecto para estimular procesos
apoptóticos. Así, una estimulación de la apoptosis puede obtenerse
por aumento de la cantidad y/o actividad de
piruvato-quinasa, particularmente la actividad de
translocación nuclear. En contraste con ello, puede obtenerse una
inhibición de la apoptosis por reducción de la actividad de
piruvato-quinasa, particularmente la actividad de
translocación nuclear.
Debido a su actividad, la
piruvato-quinasa es una diana adecuada para agentes
para el diagnóstico, la prevención o el tratamiento de un trastorno
asociado con apoptosis, particularmente una enfermedad
hiperproliferativa que puede seleccionarse de tumores, v.g. cáncer
de colon, cáncer de mama o melanomas y enfermedades inflamatorias,
v.g. enfermedades inflamatorias neuronales, tales como
neuroartritis, o una enfermedad degenerativa.
La presente invención se refiere a un método de
identificación de nuevos moduladores de la apoptosis que comprende
cribado respecto a sustancias capaces de modular la actividad de
piruvato-quinasa M2. Particularmente, la invención
se refiere a un método de identificación de sustancias capaces de
fijarse a piruvato-quinasa y estimular la
translocación al núcleo.
El método de cribado puede ser un ensayo de
cribado de alta capacidad, en el cual se testan en paralelo una
pluralidad de sustancias. El ensayo de cribado puede ser un ensayo
celular o un ensayo molecular, en el cual se determina una
interacción de una sustancia a testar con la actividad de
piruvato-quinasa. La
piruvato-quinasa puede proporcionarse en un sistema
celular, preferiblemente en un sistema celular que sobreexpresa
piruvato-quinasa, v.g. un cultivo de células o un
modelo animal no humano. Por otra parte, pueden utilizarse sistemas
no celulares, v.g. fracciones de células que contienen
piruvato-quinasa o piruvato-quinasa
sustancialmente aislada y purificada. Cualquier sustancia activa
identificada por este método, v.g. cualquier sustancia capaz de
modular, particularmente estimular la translocación nuclear de
piruvato-quinasa puede utilizarse como un agente
farmacéutico o como una estructura conductora que se modifica
ulteriormente para mejorar las propiedades farmacéuticas. Así pues,
la invención comprende adicionalmente formular un modulador de
piruvato-quinasa, como se identifica por el método
que se ha descrito arriba o una sustancia obtenida a partir del
mismo, v.g. por derivatización química o por modelización
molecular, como una composición farmacéutica junto con vehículos,
diluyentes o adyuvantes farmacéuticamente aceptables.
La presente invención se explica con mayor
detalle en las figuras y ejemplos siguientes:
Figura 1. Representación esquemática de los
mutantes de piruvato-quinasa generados.
Figura 2. Efecto de diferentes mutantes de
deleción de piruvato-quinasa sobre la muerte celular
inducida por TT-232.
Figura 3. Localización de
piruvato-quinasa. Células NIH3T3 se dejaron sin
tratar (A) o se trataron con TT-232 50 \muM
durante 4 horas (B). Las células se fijaron con metanol, se
bloquearon con PBS + 3% BSA y se sometieron a inmunotinción con
anticuerpo policlonal PK-M2 primario específico y
secundario marcado con FITC (verde). Los núcleos se visualizaron
por tinción con yoduro de propidio (rojo, imagen insertada).
Figura 4. Translocación nuclear de la
piruvato-quinasa después de diferentes estímulos
apoptóticos. Se transfectaron transitoriamente células
Cos-7 con plásmido de expresión eucariota
pEGFP-PK-M2 (produciendo
piruvato-quinasa de tipo salvaje fusionada en el
terminal N a GFP).
Figura 5. Translocación nuclear de los mutantes
de deleción de piruvato-quinasa después de estímulos
apoptóticos. Se transfectaron transitoriamente células
Cos-7 con el plásmido de expresión eucariota
pEGFP-PK-M2 (produciendo mutantes
de deleción diferentes de la piruvato-quinasa
fusionada en el terminal N a GFP) y 48 horas después de la
transfección las células se dejaron sin tratar (A-L)
o se trataron con TT-232 50 \muM durante 4 horas
(D'-L'). (Ex: 485 nm = GFP, Ex: 390 = yoduro de
propidio).
Fig. 6. Fijación in vitro de
somatostatina y TT-232 a
piruvato-quinasa muscular de conejo.
Fig. 7. Efecto de la sobreexpresión de
piruvato-quinasa sobre la sensibilidad hacia
TT-232. (A) Transferencia Western de lisados de
células totales de 293 HEK con o sin sobreexpresión marcada con HA
de PK-M2 de tipo salvaje (B) Células transfectadas
de manera estable se trataron con concentración creciente de
TT-232 durante 24 horas la cantidad de células
vivas se midió por el ensayo MTT (n = 32, *: p < 0,005, **: p
< 0,001 determinado por el test T de Student).
Fig. 8. Localización subcelular de
PK-M2 endógena después de la estimulación con
peróxido o UV. Células Cos-7 se dejaron sin tratar,
se trataron con TT-232 50 \muM (A), peróxido de
hidrógeno 100 \muM (B), o 120 mJ/cm^{2} de UV (C) y se
incubaron durante periodos de tiempo diferentes como se indica. Las
células se separaron en fracciones citosólica (c) o nuclear (n)
cargadas por triplicado y se sometieron a transferencia con
PK-M2 (paneles superiores, Erk-2
(paneles centrales) o Histona H1 (paneles inferiores).
Fig. 9. Efecto de PK-M2
direccionada al núcleo sobre el crecimiento celular. (A y C). Se
transfectaron células Cos-7 durante 5 horas con
vectores vacíos, pEGFP-PK-M2 (PKM2)
o con pEYFP-PKM2-NLS
(PKM2-NLS) (A) o
pEGFP-PK-M1 (PKM2) o con
pEYFP-PKM1-NLS (B). Las células se
tripsinizaron, se extendieron en placas de 96 pocillos, se
incubaron durante 24, 48, y 72 horas en medio que contenía FCS, y se
midió la densidad de células por el ensayo MTT. Las células se
dejaron adherir durante 10 horas, se midieron y se consideró esto
como el momento cero (n = 12 de tres experimentos independientes).
(B y D) Una porción de las células transfectadas se incubó durante
48 horas, se separó por electroforesis en gel con gradiente de SDS
6-15% y se analizó en transferencia Western con
anticuerpo GFP (panel superior). La re-exploración
del filtro con anticuerpo de tubulina (panel inferior) exhibió una
carga igual.
Fig. 10. Efecto de PK-M2
direccionada al núcleo sobre la apoptosis. Se transfectaron células
Cos-7 con pEGFP (A, A'), pEYFP-NLS
(B, B'), pEGFP-PKM2 (C', C') o
pEYFP-PKM2-NLS (D, D'),
pEGFP-PKM1 (E, E') o
pEYFP-PKM1-NLS (F, F') incubados
durante 48 horas en medios que contenían FCS. Las células se
fijaron, se tiñeron los núcleos con Hoechst y se analizaron bajo
microscopio fluorescente respecto a GFP (A-F) y
respecto a tinción nuclear (A'-F'). Los núcleos
altamente fluorescentes, condensados, y fragmentados se consideraron
como apoptóticos (flechas).
Fig. 11. Detección de la degradación del DNA. (A
y B) Se transfectaron células Cos-7 con constructos
diferentes, se incubaron durante 48 horas en medios que contenían
FCS, se dividieron las muestras en dos partes, y el DNA se extrajo
y analizó en gel de agarosa al 0,6%. (C y D) Se analizó la segunda
parte de la muestra respecto a expresión de proteínas. Se cargaron
lisados de células totales en gel en gradiente al
6-15% y se analizaron en transferencia Western con
anticuerpo GFP (panel superior). La re-exploración
del filtro con anticuerpo de tubulina (panel inferior) exhibió
carga igual.
Fig. 12. Expresión de
piruvato-quinasa deficiente en quinasa en células
Cos-7. Se cargaron lisados de células totales en
gel en gradiente 6-15% y se analizaron en
transferencia Western con anticuerpo GFP (panel superior, GFP se
indica por puntas de flecha y las proteínas de fusión
GFP-piruvato-quinasa M2 por
flechas). La re-exploración del filtro con
anticuerpo de tubulina (panel inferior) exhibía una carga igual.
Fig. 13. Actividad de
piruvato-quinasa de células Cos-7
que sobreexpresan piruvato-quinasa de tipo
salvaje
(PKM2wt) o piruvato-quinasa M2 deficiente en quinasa (PKM2KM). Los lisados de células totales se ensayaron respecto a actividad de piruvato-quinasa por ensayo de LDH acoplada. (n = 6).
(PKM2wt) o piruvato-quinasa M2 deficiente en quinasa (PKM2KM). Los lisados de células totales se ensayaron respecto a actividad de piruvato-quinasa por ensayo de LDH acoplada. (n = 6).
Fig. 14. Efecto de PK-M2
deficiente en quinasa y direccionada al núcleo sobre la apoptosis.
Se transfectaron células Cos-7 con
pEYFP-NLS (GFP-NLS),
pEYFP-PKM2wtNLS (GFP-NLS PKM2wt) o
pEYFP-PKM2 K/M-NLS
(GFP-NLS PKM2 K/M), incubadas durante 48 horas en
medios que contenían FCS. Se fijaron las células, se tiñeron los
núcleos con Hoechst y se analizaron bajo microscopio fluorescente
respecto a GFP (parte superior) y respecto a tinción nuclear (parte
inferior). Los núcleos altamente fluorescentes, condensados y
fragmentados se consideraron como apoptóticos (flechas).
Se estudió el efecto apoptótico de un nuevo
análogo de somatostatina selectivo de tumores;
TT-232, y se encontró que el compuesto se fija a
piruvato-quinasa M2. La isoforma de
piruvato-quinasa M2 se clonó a partir de RNA
derivado de la línea de células de carcinoma epidermoide A431, con
PCR. Se generaron varios mutantes de deleción de la isoforma M2 de
piruvato-quinasa en el vector de expresión eucariota
pCDNA3.1 (Invitrogen) se muestra en la Figura 1.
Efecto de los mutantes sobre la inducción de
apoptosis por TT-232 se investigó en células
Cos-7 que sobreexpresaban transitoriamente estos
mutantes. Las células se transfectaron a 70% de confluencia con 1
\mug de DNA utilizando el método de lipofectamina. Se indujo la
apoptosis 48 horas después de la transfección con
TT-232 25 \muM y las células se sometieron a
recuento 24 horas más tarde. Con objeto de discriminar entre células
vivas o muertas se utilizó la exclusión con azul de metilo (Figura
2).
La sobreexpresión del aminoácido 100
N-terminal (sic) de la molécula de
piruvato-quinasa era suficiente para bloquear el
efecto del análogo de somatostatina TT-232. Este
resultado sugiere que la piruvato-quinasa,
análogamente a GAPDH, juega un papel en la apoptosis. Sin embargo,
dado que la actividad de piruvato-quinasa no se veía
afectada por tratamiento con TT-232, este efecto
apoptótico es independiente de la actividad catalítica de la
enzima.
Se ha informado previamente de la fijación de PK
a tubulina (Ovadi et al. 1999) y se ha encontrado que
TT-232 inhibe esta interacción. Por esta razón, se
estudió en detalle la localización de la
piruvato-quinasa. Células NIH3T3 se dejaron sin
tratar (Figura 3A) o se trataron con TT-232 50
\muM durante 4 horas (Figura 3B), se fijaron con metanol y se
sometieron a inmuno-tinción con la isoforma
PK-M2 policlonal específica y el anticuerpo
secundario marcado con FITC. El núcleo se visualizó con yoduro de
propidio y se detectó la tinción por microscopia láser
confocal.
La Figura 3 demuestra que la
piruvato-quinasa sufre translocación al núcleo
durante el tratamiento con el análogo de somatostatina
TT-232. A fin de ver si este efecto es un proceso
general durante la apoptosis, se investigó la translocación nuclear
después de tratamiento con peróxido de hidrógeno y UV. Se
transfectaron transitoriamente células Cos-7 con el
plásmido de expresión eucariota
pEGFP-PK-M2 y, 48 horas después de
la transfección se trataron las células con peróxido de hidrógeno 1
mM durante 4 horas. Las células se trataron con 60 J/cm^{2} de
radiación UV y se incubaron durante tiempos diferentes. Las células
se fijaron con aldehído glutárico al 1% y se analizaron con
microscopía fluorescente y software de formación de imágenes
confocales InoVision. La Figura 4 muestra que la translocación
nuclear de la piruvato-quinasa se produce después de
tratamiento con peróxido-peróxido y UV, confirmando
que la translocación de la piruvato-quinasa es un
fenómeno general.
Finalmente, los autores de la invención
estudiaron la ubicación de la señal de localización nuclear. Por
esta razón, varios fragmentos truncados de la
piruvato-quinasa se fusionaron a GFP y se estudió la
localización de estos fragmentos por tratamiento con el análogo de
somatostatina TT-232. Las células
Cos-7 transfectadas transitoriamente se dejaron sin
tratar o se trataron con TT-232 50 \muM durante 4
horas. Se fijaron las células con aldehído glutárico al 1% y la
localización de GFP se detectó y analizó con microscopía
fluorescente y software de formación de imágenes confocales
InoVision. Los núcleos se tiñeron con propidio-yodo
(sic) (Figura 5).
La translocación nuclear era detectable con el
tipo salvaje y el mutante \DeltaC (aminoácidos
1-420) pero no con el mutante truncado
PK1-334. Por consiguiente, la proteína
piruvato-quinasa tiene una señal de localización
nuclear entre los aminoácidos 334 y 420.
Se aisló previamente la
piruvato-quinasa M2 como el receptor para el fármaco
anticáncer TT-232. Para confirmar la interacción
entre la piruvato-quinasa M y la somatostatina o
TT-232 se realizó un ensayo de fijación in
vitro con piruvato-quinasa aislada de músculo de
conejo y ^{125}I-somatostatina
(SS-14). La constante de fijación (dada como
valores CI_{50}) para SS-14 o
TT-232 se midió por competición entre
SS-14 radiomarcada y péptidos "fríos" (Figura
6) y se midió la radiactividad con PhosphoImager después de
electroforesis en gel de las proteínas reticuladas.
Para investigar el papel biológico de
PK-M2 en el efecto anticáncer de
TT-232 se generaron células 293HEK estables que
sobreexpresaban PK-M2 de tipo salvaje marcada con HA
y se midió la sensibilidad de estas células a las concentraciones
de TT-232. Como se muestra en la Figura 7, el
aumento de la cantidad de proteína piruvato-quinasa
en las células da como resultado una sensibilidad incrementada a
TT-232, lo que sugiere que dicha
piruvato-quinasa juega un papel importante en el
efecto del fármaco.
En las células sin tratar, PK-M2
era citoplásmica. TT-232, peróxido de hidrógeno y UV
inducían la translocación nuclear de PK-M2 que
precedía a la aparición de la morfología apoptótica. Este resultado
soportaba los datos previos de los autores de la invención de que,
como la GAPDH, la piruvato-quinasa sufre
translocación al núcleo después de los estímulos apoptóticos. Con
objeto de investigar ulteriormente, se trataron células
Cos-7, se separaron en fracciones citosólica y
nuclear por lisis con NP-40 y se analizaron con
anticuerpo policlonal PK-M2 específico (Weernink
et al., 1988) respecto a PK-M2 endógena por
transferencia Western. Para excluir la contaminación cruzada, se
cargaron las muestras por triplicado y se sometieron a transferencia
con anticuerpos PK-M2, Erk-2 o
Histona H1. Como se muestra en la Figura 8, el tratamiento con
TT-232, peróxido de hidrógeno y UV inducía la
translocación de la PK-M2 endógena al núcleo con
cinéticas similares.
Sin embargo, la enzima presente en el núcleo
exhibía movilidad electroforética incrementada, lo cual es debido
probablemente a escisión proteolítica o a desfosforilación. Para
testar el papel de las proteasas, se pretrataron células
Cos-7 con serina-proteasa (AEBSF,
TPCK), caspasa (zDEVD) o inhibidor de calpaína (ALLN), pero no se
logró invertir este efecto. Esto sugiere que ninguna de estas
proteasas es responsable de la transformación aparente.
Adicionalmente, se investigó el papel de la
isoforma M2 en el núcleo. Por esta razón, se subclonaron
PK-M2 y PK-M1 en el vector
pEYFP-Nuc que llevaba la señal de localización
nuclear del antígeno T grande de SV-40 fusionada a
GFP, y se transfectaron células Cos-7 con los
diferentes constructos. Después de 5 horas, se tripsinizaron las
células y se extendieron en placas de 96 pocillos y de 6 pocillos, y
se dejaron crecer durante tiempos diferentes. Después de 10 horas,
se añadió MTT a una de las placas, se midió y se consideró esto como
el momento cero. Los ensayos de MTT demostraron una inhibición
significativa del crecimiento celular en las células transfectadas
con la NLS-PK-M2 direccionada al
núcleo, mientras que las propiedades de crecimiento de las células
Cos-7 que llevaban GFP, GFP-NLS,
PK-M1, NLS-PK-M1 o
PK-M2 no se veían afectadas (Fig. 9A y C). Para
confirmar la expresión del constructo GFP, se llevaron a cabo
transferencias Western con un anticuerpo GFP a partir de los
lisados de células totales de las placas de 6 pocillos y se
re-exploraron con anticuerpo de tubulina (Fig. 9B y
D).
Este resultado sugería que la translocación
nuclear de PK-M2 inhibe el crecimiento celular y/o
induce apoptosis. Se analizaron células Cos-7
transfectadas teñidas con tinte Hoechst por microscopía
fluorescente. Los núcleos altamente fluorescentes, condensados o
fragmentados que exhibían manchas de cromatina compacta se
consideraron como apoptóticos. La Figura 10 muestra que las células
que expresaban la proteína de fusión GFP-PKM2,
GFP-PKM1 o
GFP-NLS-PKM1 exhibían tinción
nuclear normal (Fig. 4C, E, F, C', E' y F') similar a las células
que llevaban GFP o GFP-NLS (Fig.
10A-B'). Al mismo tiempo, se encontró en el núcleo
GFP-PK-M2-NLS y las
células que expresaban la proteína exhibían morfología apoptótica
(Fig. 10D y D').
Este resultado respalda que la translocación de
la piruvato-quinasa después de estímulos apoptóticos
es importante para la entrega a la muerte celular. Esto está en
asociación con resultados previos que demuestran que la
translocación nuclear de GAPDH está implicada en la apoptosis. Con
objeto de testar el efecto de la sobreexpresión de
PK-M2-NLS sobre la fragmentación del
DNA, se trasfectaron células Cos-7 con constructos
diferentes, después de 48 horas de incubación, y el DNA se extrajo
y se analizó por electroforesis en gel de agarosa. La expresión de
PK-M2 direccionada al núcleo inducía la degradación
de DNA en fragmentos mayores diferenciados (3500, 7000 pb), lo que
era diferente del escalonamiento clásico del DNA (Fig. 11).
Dado que la degradación del DNA durante la
apoptosis es un proceso multietápico que da como resultado
primeramente productos de escisión del DNA grandes y finalmente
fragmentos oligonucleosómicos, los autores de la invención proponen
que la piruvato-quinasa está implicada en un paso
inicial de degradación del DNA, y son necesarios otros factores,
como la activación de caspasas, para la transformación ulterior.
Dado que la PK-M2 sobreexpresada direccionada al
núcleo era suficiente para la muerte celular con independencia de la
proteína endógena, este efecto no es debido probablemente a la
inhibición de la glicólisis y el empobrecimiento en ATP de las
células. Esta hipótesis se ve respaldada por el hecho de que,
aunque la GAPDH está relacionada con condiciones degenerativas en
la enfermedad de Huntington, la actividad glicolítica de la enzima
no parece alterarse (Kagedal et al., 2001). Para testar el
requerimiento de la actividad de piruvato-quinasa en
el núcleo, los autores de la invención generaron
PK-M2 deficiente en quinasa (PKM2K/M) y se
transfectó transitoriamente a células Cos-7. En
primer lugar, se testó la expresión y la transformación de las
diferentes proteínas de fusión en transferencias Western (Fig.
12).
A continuación, se midió la actividad catalítica
de piruvato-quinasa de los lisados de células
totales (Fig. 13). La sobreexpresión de la PK-M2 de
tipo salvaje aumentaba significativamente la actividad global de PK
(p > 0,005), mientras que la actividad de PK en las células que
expresaban el mutante deficiente en quinasa era reducida comparada
con las células falsamente transfectadas (p > 0,0001). Esto
sugiere que la mutación PKM2 K269M, que afecta al sitio de fijación
de ATP, conduce a la desactivación catalítica de la proteína PKM.
Esto se ve respaldado por el hecho de que la sobreexpresión del
mutante PKM2K/M interfería también con la actividad endógena de PK
y daba como resultado una actividad global reducida de PK.
Para investigar el requerimiento de la actividad
de piruvato-quinasa en el núcleo se analizaron
células Cos-7 transfectadas transitoriamente
respecto a apoptosis por tinción con Hoechst (Fig. 14).
Considerado en su conjunto, se encontró que la
piruvato-quinasa es el receptor de un potente agente
antitumoral con efecto apoptótico fuerte. Resultados ulteriores
demostraron que la piruvato-quinasa juega un papel
importante en el proceso apoptótico, y ulteriormente la enzima
sufre translocación al núcleo. La translocación nuclear de PK
parece ser un fenómeno general, dado que en la apoptosis inducida
por estrés oxidante (peróxido de hidrógeno) o por UV se encontró
piruvato-quinasa en el núcleo. La isoforma de
piruvato-quinasa nuclear difiere de la
piruvato-quinasa citosólica en el sentido de que
exhibe una mayor movilidad electroforética.
Se llega a la conclusión de que, al igual que
GAPDH, la piruvato-quinasa está implicada en el
proceso apoptótico y podría ser una molécula diana para el
desarrollo de fármacos contra el cáncer y enfermedades
inflamatorias.
\newpage
Tanaka, T., Harano, Y.,
Sue, F. and Morimura, H. (1967) J.
Biochem. (Tokyo) 62, 71-91.
Nowak, T. and Suelter, C,
(1981) Mol. Cell. Biochem. 35,
65-75.
Ibsen, K. and Trippet, P.
(1974) Arch. Biochem. Biophys.
570-580.
Mallati, A., Yucel, M.,
Altinors, N. and Gunduz, U. (1992) Cancer
Biochem. Biophys. 13, 33-41.
Guminska, M., Stachurska, M.B. and
Ignacak, J. (1988) Biochem. Biophys. Acta 966,
207-213.
Saheki, S., Saheki, K. and
Tanaka, T. (1982) Biochem. Biophys. Acta 704,
484-493.
Kéri, Gy., et al. (1993a)
Biochem. Biophys. Res. Comm. 191,
681-687,
Kéri, Gy., et al. (1993b)
Peptide Research 6, 281-288.
Kéri, Gy., et al. (1996),
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93,
12513-12518.
Baselga (2000), Semin. Oncol. 27,
27-32.
Monia (2000), Cancer
Invest. 18, 635-650.
Vertessy, B.G., Bankfalvi, D.,
Kovacs, J., Low, P., Lehotzky, A. and
Ovadi, J. (1999) Biochem. Biophys. Res. Comm.
254, 430-435.
Weernink, P.A.O., Ríjksen, G. and
Staal, G.E.J. (1988) FEBS Letters 236,
391-395.
Kagedal, K., Johansson, U. and
Ollinger, K. FASEB J. 2001 15,
1592-4.
Claims (4)
1. Un método de identificación de nuevos
moduladores de apoptosis que comprende cribado respecto a sustancias
capaces de modular la actividad de piruvato-quinasa
M2, en el cual la actividad comprende una translocación al
núcleo.
2. El método de la reivindicación 1 para
identificación de nuevos estimuladores de apoptosis para uso como
agente farmacéutico o como estructura conductora adecuada para el
diagnóstico, la prevención o el tratamiento de una enfermedad
hiperproliferativa.
3. El método de la reivindicación 2, en el cual
la enfermedad hiperproliferativa se selecciona de tumores, y/o una
respuesta inflamatoria.
4. Isoforma nuclear M2 de
piruvato-quinasa, que exhibe mayor movilidad
electroforética comparada con la isoforma citosólica de
piruvato-quinasa.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP01112601 | 2001-05-23 | ||
| EP01112601 | 2001-05-23 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2312595T3 true ES2312595T3 (es) | 2009-03-01 |
Family
ID=8177529
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES02748716T Expired - Lifetime ES2312595T3 (es) | 2001-05-23 | 2002-05-23 | Piruvato-quinasa como nueva molecula diana. |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20040152648A1 (es) |
| EP (2) | EP1390525B8 (es) |
| AT (1) | ATE404691T1 (es) |
| AU (1) | AU2002319180B2 (es) |
| CA (1) | CA2448165A1 (es) |
| DE (1) | DE60228233D1 (es) |
| DK (1) | DK1390525T3 (es) |
| ES (1) | ES2312595T3 (es) |
| PT (1) | PT1390525E (es) |
| WO (1) | WO2002095063A1 (es) |
Families Citing this family (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004016646A2 (en) * | 2002-08-12 | 2004-02-26 | Amynon Bio Tech Gmbh | Peptide modulators of tumour specific pyruvate kinase subtype m2 (m2-pk) |
| WO2004058153A2 (en) * | 2002-12-20 | 2004-07-15 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for treating cancer using 15986, 2188, 20743, 9148, 9151, 9791, 44252, 14184, 42461, 8204, 7970, 25552, 21657, 26492, 2411, 15088, 1905, 28899, 63380, 33935, 10480, 12686, 25501, 17694, 15701, 53062, 49908, 21612, 38949, 6216, 46863, 9235, 2201, 6985, 9883, 12238, 18057, 21617, 39228, 49928, 54476. |
| DE10356218A1 (de) * | 2003-12-03 | 2005-06-30 | Bayer Cropscience Ag | Verfahren zum Identifizieren von fungizid wirksamen Verbindungen basierend auf Pyruvatkinasen aus Pilzen |
| WO2006055880A2 (en) * | 2004-11-16 | 2006-05-26 | Genzyme Corporation | Diagnostic pkm2 methods and compositions |
| WO2006065967A2 (en) * | 2004-12-15 | 2006-06-22 | General Atomics | Allosteric enzyme coupled immunoassay (aecia) |
| WO2009025781A1 (en) * | 2007-08-16 | 2009-02-26 | Beth Israel Deaconess Medical Center | Activators of pyruvate kinase m2 and methods of treating disease |
| EP2344453B1 (en) * | 2008-10-09 | 2016-12-28 | The U.S.A. As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Activators of human pyruvate kinase |
| CN102448951B (zh) | 2009-04-06 | 2017-05-10 | 安吉奥斯医药品有限公司 | 丙酮酸激酶m2调节剂、治疗组合物和相关使用方法 |
| DK2427441T3 (en) | 2009-05-04 | 2017-03-20 | Agios Pharmaceuticals Inc | PKM2 Activators for use in the treatment of cancer |
| LT2448582T (lt) * | 2009-06-29 | 2017-07-10 | Agios Pharmaceuticals, Inc. | Chinolin-8-sulfonamido dariniai, turintys priešvėžinį aktyvumą |
| DK2448581T3 (en) | 2009-06-29 | 2017-03-13 | Agios Pharmaceuticals Inc | Therapeutic compositions and methods for their applications |
| CA2793836C (en) | 2009-10-21 | 2020-03-24 | Agios Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for cell-proliferation-related disorders |
| CA2793835C (en) | 2009-10-21 | 2021-07-20 | Agios Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for cell-proliferation-related disorders |
| US9206426B2 (en) | 2010-03-05 | 2015-12-08 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Inhibitory RNAs to RNA binding proteins hnRNPA1, hnRNPA2 and PTB and uses thereof |
| JP2013525438A (ja) | 2010-04-29 | 2013-06-20 | アメリカ合衆国 | ヒトピルビン酸キナーゼ活性剤 |
| EP2651898B1 (en) | 2010-12-17 | 2015-12-09 | Agios Pharmaceuticals, Inc. | Novel n-(4-(azetidine-1-carbonyl)phenyl)-(hetero-)arylsulfonamide derivatives as pyruvate kinase m2 (pmk2) modulators |
| CA2822432C (en) | 2010-12-21 | 2019-09-24 | Agios Pharmaceuticals, Inc. | Bicyclic pkm2 activators |
| TWI549947B (zh) | 2010-12-29 | 2016-09-21 | 阿吉歐斯製藥公司 | 治療化合物及組成物 |
| HUE065700T2 (hu) | 2011-05-03 | 2024-06-28 | Agios Pharmaceuticals Inc | Piruvát-kináz aktivátorok terápiában történõ alkalmazásra |
| LT3307271T (lt) | 2015-06-11 | 2023-10-25 | Agios Pharmaceuticals, Inc. | Piruvatkinazės aktyvatorių panaudojimo būdai |
| EP3448859B1 (en) | 2017-03-20 | 2019-07-10 | Forma Therapeutics, Inc. | Pyrrolopyrrole compositions as pyruvate kinase (pkr) activators |
| JP7450610B2 (ja) | 2018-09-19 | 2024-03-15 | ノヴォ・ノルディスク・ヘルス・ケア・アーゲー | ピルビン酸キナーゼｒの活性化 |
| EP3853206B1 (en) | 2018-09-19 | 2024-04-10 | Novo Nordisk Health Care AG | Treating sickle cell disease with a pyruvate kinase r activating compound |
| CN114615977B (zh) | 2019-09-19 | 2025-01-14 | 诺沃挪第克健康护理股份公司 | 丙酮酸激酶r(pkr)活化组合物 |
| US12128035B2 (en) | 2021-03-19 | 2024-10-29 | Novo Nordisk Health Care Ag | Activating pyruvate kinase R |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5821254A (en) * | 1995-02-17 | 1998-10-13 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Uses of 9-cis-retinoic acids and derivatives thereof alone or in combination with antineoplastic agents in the prevention or treatment of cancer |
| AU6333598A (en) * | 1997-02-11 | 1998-08-26 | Regents Of The University Of California, The | Methods of inducing cell cycle stasis |
| US7074895B2 (en) * | 1997-08-21 | 2006-07-11 | Quark Biotech, Inc. | Sequences characteristic of hypoxia-regulated gene transcription |
| US5948628A (en) * | 1997-09-05 | 1999-09-07 | The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma | Methods of screening for compounds which mimic galectin-1 |
| US6458538B1 (en) * | 1999-12-14 | 2002-10-01 | Ptc Therapeutics, Inc. | Methods of assaying for compounds that inhibit premature translation termination and nonsense-mediated RNA decay |
-
2002
- 2002-05-23 DE DE60228233T patent/DE60228233D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-05-23 EP EP02748716A patent/EP1390525B8/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-05-23 EP EP08014232A patent/EP1990422A1/en not_active Withdrawn
- 2002-05-23 US US10/478,679 patent/US20040152648A1/en not_active Abandoned
- 2002-05-23 PT PT02748716T patent/PT1390525E/pt unknown
- 2002-05-23 CA CA002448165A patent/CA2448165A1/en not_active Abandoned
- 2002-05-23 ES ES02748716T patent/ES2312595T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-05-23 WO PCT/EP2002/005684 patent/WO2002095063A1/en active IP Right Grant
- 2002-05-23 AT AT02748716T patent/ATE404691T1/de not_active IP Right Cessation
- 2002-05-23 DK DK02748716T patent/DK1390525T3/da active
- 2002-05-23 AU AU2002319180A patent/AU2002319180B2/en not_active Ceased
-
2007
- 2007-06-29 US US11/771,462 patent/US20080021116A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20080021116A1 (en) | 2008-01-24 |
| AU2002319180B2 (en) | 2007-07-05 |
| PT1390525E (pt) | 2008-11-25 |
| DE60228233D1 (de) | 2008-09-25 |
| EP1390525B8 (en) | 2009-03-04 |
| US20040152648A1 (en) | 2004-08-05 |
| EP1990422A1 (en) | 2008-11-12 |
| EP1390525A1 (en) | 2004-02-25 |
| CA2448165A1 (en) | 2002-11-28 |
| ATE404691T1 (de) | 2008-08-15 |
| DK1390525T3 (da) | 2008-12-08 |
| EP1390525B1 (en) | 2008-08-13 |
| WO2002095063A1 (en) | 2002-11-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2312595T3 (es) | Piruvato-quinasa como nueva molecula diana. | |
| Shinbo et al. | DJ-1 restores p53 transcription activity inhibited by Topors/p53BP3 | |
| Liu et al. | PKM2 methylation by CARM1 activates aerobic glycolysis to promote tumorigenesis | |
| Boudeau et al. | Heat-shock protein 90 and Cdc37 interact with LKB1 and regulate its stability | |
| AU2002319180A1 (en) | Pyruvate-kinase as a novel target molecule | |
| Delobel et al. | Abnormal Tau phosphorylation of the Alzheimer‐type also occurs during mitosis | |
| Kitevska et al. | Caspase-2: controversial killer or checkpoint controller? | |
| JP2005508302A (ja) | アルギニン３でのヒストンｈ４のメチル化 | |
| Misztal et al. | TCF7L2 mediates the cellular and behavioral response to chronic lithium treatment in animal models | |
| García-Yagüe et al. | α-Synuclein induces the GSK-3-mediated phosphorylation and degradation of NURR1 and loss of dopaminergic hallmarks | |
| ES2361660T3 (es) | Ubicutina-ligasa e3 humana para la modulación de nk-kappa b. | |
| Cao et al. | Pseudo-phosphorylation at AT8 epitopes regulates the tau truncation at aspartate 421 | |
| McDermott et al. | Nm23-H1 homologs suppress tumor cell motility and anchorage independent growth | |
| Sekito et al. | Stimulation of transforming activity of DJ-1 by Abstrakt, a DJ-1-binding protein | |
| Liu et al. | Protein kinase C‐δ phosphorylates Ebp1 and prevents its proteolytic degradation, enhancing cell survival | |
| La Cognata et al. | Differential expression of PARK2 splice isoforms in an in vitro model of dopaminergic‐like neurons exposed to toxic insults mimicking Parkinson's disease | |
| Tschöp et al. | Human cyclin B3: mRNA expression during the cell cycle and identification of three novel nonclassical nuclear localization signals | |
| Araki et al. | A palmitoylated RING finger ubiquitin ligase and its homologue in the brain membranes | |
| Liao et al. | The effect of cdk-5 overexpression on tau phosphorylation and spatial memory of rat | |
| Akita et al. | Protein kinase C ε phosphorylates keratin 8 at Ser8 and Ser23 in GH4C1 cells stimulated by thyrotropin‐releasing hormone | |
| US7252944B2 (en) | Methods and compositions for modulating cell proliferation | |
| JP4415145B2 (ja) | ｐ５３タンパク質の活性化を調節する薬物のスクリーニング法 | |
| Ho et al. | Yeast apurinic/apyrimidinic endonuclease Apn1 protects mammalian neuronal cell line from oxidative stress | |
| US6485924B2 (en) | Method for identifying inhibitors of cytokinesis | |
| Warner et al. | C‐terminal domain of the mitotic apparatus protein p62 targets the protein to the nucleolus during interphase |