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ES2312225T3 - Moleculas de acido nucleico que codifican enzimas que poseen actividad fructosiltransferasa y su uso. - Google Patents

Moleculas de acido nucleico que codifican enzimas que poseen actividad fructosiltransferasa y su uso. Download PDF

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ES2312225T3
ES2312225T3 ES99968682T ES99968682T ES2312225T3 ES 2312225 T3 ES2312225 T3 ES 2312225T3 ES 99968682 T ES99968682 T ES 99968682T ES 99968682 T ES99968682 T ES 99968682T ES 2312225 T3 ES2312225 T3 ES 2312225T3
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ES
Spain
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nucleic acid
plant
polyfructose
cells
fructosyltransferase
Prior art date
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ES99968682T
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Arnd Goran Heyer
Jochen Rehm
Regina Wendenburg
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Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften
Original Assignee
Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften
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Abstract

Molécula de ácido nucleico que codifica una fructosiltransferasa seleccionada del grupo compuesto por: (a) moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína que comprende la secuencia aminoacídica dada en la SEC ID Nº 2; (b) moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia nucleotídica de la región de codificación dada por la SEC ID Nº 1 o una correspondiente secuencia ribonucleotídica; (c) moléculas de ácido nucleico que hibridan con la cadena complementaria de una de las moléculas de ácido nucleico citadas en (a) o (b) y que presentan una identidad de al menos un 60% con la molécula de ácido nucleico citada en (a) o (b); y (d) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia nucleotídica se desvía de la secuencia de una de las moléculas de ácido nucleico citadas en (c) debido a la degeneración del código genético; así como las moléculas de ácido nucleico complementarias de estas.

Description

Moléculas de ácido nucleico que codifican enzimas que poseen actividad fructosiltransferasa y su uso.
La presente invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos con la actividad enzimática de una fructosiltransferasa. Además, esta invención se refiere a vectores y hospedadores que contienen dichas moléculas de ácido nucleico. La presente invención se refiere igualmente a procedimientos para la preparación de fructosiltransferasa y a la producción de polifructosas de tipo inulina en distintos organismos hospedadores o in vitro, así como a las fructosiltransferasas codificadas por las moléculas de ácido nucleico descritas, con cuya ayuda pueden producirse polifructosas de tipo inulina.
Los polímeros lineales solubles en agua poseen numerosas aplicaciones, por ejemplo, para la elevación de la viscosidad de sistemas acuosos, como detergentes, como agentes de suspensión o para la aceleración de la sedimentación y complejación, pero también para la unión de agua. Los polímeros basados en sacáridos, por ejemplo, fructosilpolisacáridos, son materias primas especialmente interesantes, ya que son biodegradables.
Además del uso como materias primas renovables para fabricación y procesamiento industriales, los polímeros de fructosilo son también interesantes como aditivos alimentarios, por ejemplo, como edulcorantes. Son necesarios polímeros de diferentes longitudes de cadena para distintas aplicaciones. Mientras que para el campo alimentario se desean preferiblemente polímeros de cadena corta y media, las aplicaciones técnicas, por ejemplo la preparación de tensioactivos, demandan polímeros con alto grado de polimerización (GP, "grado de polimerización").
Hasta ahora, se han descrito distintos procedimientos para la producción de polisacáridos de fructano en plantas mediante la expresión de fructosiltransferasas de origen bacteriano o para la producción de polifructosas de longitud de cadena media mediante la expresión de fructosiltransferasas de origen vegetal. Así, se describe en el documento PCT/US89/02729 la posibilidad de producción de polímeros de hidratos de carbono, particularmente dextrano o polifructosa, en plantas transgénicas, y a saber especialmente en frutos de plantas transgénicas. Para la producción de dicho tipo de plantas modificadas, se propone el uso de levansucrasas de microorganismos, particularmente de Aerobacter levanicum, Streptococcus salivarius y Bacillus subtilis, o de dextransucrasas de Leuconostoc mesenteroides. No se describen ni la formación de enzimas activas ni de levano o dextrano, así como la preparación de plantas transgénicas.
El documento PCT/EP93/02110 da a conocer un procedimiento para la preparación de plantas transgénicas que expresan el gen lsc de levansucrasa a partir de la bacteria gramnegativa Erwinia amylovora. Las plantas producen un levano de alto peso molecular fuertemente ramificado.
En el documento PCT/NL93/00279, se describe la transformación de plantas con genes quiméricos que contienen el gen sacB de Bacillus subtilis. Dichas plantas producen un levano ramificado.
Las fructosiltransferasas bacterianas usadas en los documentos PCT/US89/02729, PCT/EP93/02110 y PCT/NL93/
00279 sintetizan levano, un polímero de fructosilo con ligamiento \beta-2,6 que presenta numerosas ramificaciones \beta-2,1. El levano entraña sin embargo desventajas decisivas para el procesamiento técnico a causa de las numerosas ramificaciones, y por tanto es mucho menos demandado como materia prima que la inulina, en la que se presentan ligamientos \beta-2,1. Actualmente, es sólo conocido un gen bacteriano cuyo producto génico participa en la síntesis de inulina. En este momento, se trata del gen ftf de Streptococcus mutans. El documento PCT/NL93/00279 describe la transformación de plantas con este gen que sintetizan ciertamente inulina de alto peso molecular, pero con un rendimiento tan bajo que no se tiene en consideración un aprovechamiento económico. También el documento PCT/EP97/02195 describe un procedimiento para la preparación de plantas productoras de inulina transgénicas con ayuda del gen ftf de Streptococcus mutans. Pero igualmente que en las plantas descritas en el documento PCT/NL93/00279, el rendimiento de inulina de alto peso molecular es bajo. Es por tanto ciertamente posible una expresión del gen en plantas si el gen se ha procesado previamente por ingeniería genética. Sin embargo, el rendimiento de inulina que puede obtenerse de plantas transgénicas es tan bajo que no se tiene en consideración un aprovechamiento económico de las plantas
transgénicas.
Además, el documento PCT/NL96/00012 da a conocer secuencias de ADN que codifican enzimas sintetizadoras de polímeros de hidratos de carbono, así como la preparación de plantas transgénicas con ayuda de estas secuencias de ADN. Las secuencias dadas a conocer proceden de Helianthus tuberosus. Correspondientemente al documento PCT/NL96/00012, las secuencias dadas a conocer pueden aprovecharse para modificar el perfil de fructano de petunias y patatas, pero también de Helianthus tuberosus mismo. En la expresión de las secuencias dadas a conocer que codifican una sacarosa fructosiltransferasa (SST) dependiente de sacarosa o una fructano fructosiltransferasa en plantas transgénicas, es posible la producción de inulina. El grado de polimerización medio de la inulina se encuentra sin embargo de GP= 6 a GP= 10. A dicho grado de polimerización, no puede hablarse sin embargo de inulina de cadena larga. La producción de inulina de alto peso molecular no es posible con el procedimiento descrito en el documento PCT/NL96/00012.
Hace poco, se ha descrito por Rehm y col. (J. Bacteriology 180 (1998), 1305-1310) la producción de oligosacáridos en levadura mediante la introducción de una SST de Aspergillus foetidus. No obstante, el grado de polimerización del producto obtenido ascendía únicamente a GP= 3.
El documento DE 19708774.4 describe la preparación de 1-kestosa y nistosa con ayuda de enzimas que poseen la actividad fructosilpolimerasa. Pueden prepararse tri- y tetrasacáridos en plantas transgénicas. El rendimiento es alto y corresponde en patata el contenido celular de sacarosa. Sin embargo, no se describe la preparación de inulina de cadena larga.
También se discute variadamente la síntesis de polifructosas mediante hongos. Barthomeuf y Pourrat (Biotechnology Letters 17 (1995), 911-916) describen, por ejemplo, una preparación enzimática de Penicillium rugulosum que presenta una actividad fructosiltransferasa. El preparado tiene sin embargo distintas propiedades enzimáticas, no representa así fructosiltransferasa pura. Las secuencias de ADN del gen de fructosiltransferasa no son conocidas. Cairns y col. (New Phytologist 129 (1995), 299-308) describen una síntesis transitoria de tri-, tetra- y pentasacáridos de sacarosa en medio de cultivo de Monographella nivalis. La actividad enzimática subyacente parece ser sin embargo principalmente hidrolítica, ya que con un empobrecimiento creciente de sustrato, se vuelven a degradar también las polifructosas por la enzima. Ya que no es conocida ninguna secuencia de ADN, tampoco puede estimarse mediante homología con fructofuranosidasas (invertasas) si se presenta una fructosiltransferasa en sentido propio o una
invertasa.
Para el hongo Aspergillus sydowi IAM 2544, se ha mostrado que puede formar polifructosas de tipo inulina. Harada y col. (en: Nishinari and Doi (Ed.), "Food Hydrocolloids: Structures, Properties and Functions", Plenum, Nueva York (1994), 77-82) describen, por ejemplo, la síntesis de inulina con conidios de Aspergillus sydowi. Se incubaron 125 g de conidios en 25 l de disolución de sacarosa al 20%. Se realizó la purificación del producto formado mediante HPLC. Sin embargo, no es adecuado uno de dichos procedimientos para la producción a gran escala de inulina. Además, Maramtsu y col. (Agric. Biol. Chem. 52 (1988), 1303-1304) describen la producción de fructooligosacáridos con micelio de la misma cepa de hongo (A. sydowi IAM 2544). Se da un grado de polimerización de 3 a 13. Las enzimas participantes no se purificaron o sólo parcialmente. No son conocidas las secuencias aminoacídicas o secuencias de ADN del correspondiente gen. No se exponen o sólo parcialmente las instrucciones para la purificación de proteínas.
La presente invención se basa por tanto en el objetivo de poner a disposición moléculas de ácido nucleico y procedimientos con cuya ayuda es posible preparar organismos modificados por ingeniería genética que pueden formar polifructosas de tipo inulina.
Este objetivo se consigue mediante la provisión de las formas de realización caracterizadas en las patentes.
Por tanto, la presente invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican una fructosiltransferasa seleccionadas del grupo compuesto por:
(a)
moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína que comprende la secuencia aminoacídica dada en la SEC ID Nº 2;
(b)
moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia nucleotídica de la región de codificación dada por la SEC ID Nº 1 o una correspondiente secuencia ribonucleotídica;
(c)
moléculas de ácido nucleico que hibridan con una cadena complementaria de la molécula de ácido nucleico citada en (a) o (b) y presentan una identidad de al menos un 60% con la molécula de ácido nucleico citada en (a) o (b);
(d)
moléculas de ácido nucleico cuya secuencia nucleotídica se desvía de la secuencia de la molécula de ácido nucleico citada en (c) debido a la degeneración del código genético;
así como las moléculas de ácido nucleico complementarias de estas.
La secuencia representada por la SEC ID Nº 1 codifica una fructano fructosiltransferasa dependiente de sacarosa de Aspergillus sydowi que conduce en células vegetales a la síntesis de un polifructano de cadena larga de tipo inulina. Se ha encontrado sorprendentemente que, con ayuda de esta secuencia, es posible preparar polifructanos de cadena larga de tipo inulina con altos rendimientos en organismos hospedadores, particularmente en plantas transgénicas, bacterias u hongos.
En el marco de la presente invención, se han desarrollado instrucciones para la purificación de la enzima a partir de Aspergillus sydowi. La enzima se ha purificado hasta homogeneidad para poder identificar las secuencias aminoacídicas. Mediante las informaciones de secuencia obtenidas, se identificaron los cebadores para una reacción en cadena de la polimerasa. Con ayuda del cebador, se amplificaron fragmentos génicos que se utilizaron para el muestreo de genotecas de ADNc. Se prepararon y compararon varias moléculas de ADNc con homología de secuencia con los amplificados por PCR. La mayoría de las moléculas de ADNc obtenidas presentaron respectivamente inserciones igualmente grandes. Se mostró la totalidad de las moléculas de ADNc en la expresión funcional de las secuencias de ADN en Saccharomyces o en patata.
La purificación de la enzima, el diseño de los cebadores para la PCR, la identificación de las moléculas de ADNc y la expresión heteróloga se describen en los ejemplos. La secuencia de ADN aislada y la secuencia proteica derivada de la misma se reproducen como SEC ID Nº 1 ó 2. La secuencia de ADN según la invención es la primera que codifica una fructano fructosiltransferasa dependiente de sacarosa a partir de hongos. La secuencia de ADN y la secuencia proteica codificada por ella se diferencian mucho de las secuencias de ADN que codifican fructosiltransferasas ya conocidas. Así, existe por ejemplo únicamente una identidad de 22,6% o 39% con la fructosiltransferasa de Aspergillus naeslundii lev j a nivel de proteína o ADN. Por el contrario, existe ciertamente un 64 o 60,6% de identidad a nivel de proteína o ADN con un gen invertasa de Aspergillus niger. La proteína codificada por este gen tiene sin embargo una actividad enzimática totalmente distinta. Esto muestra que, en las moléculas de ácido nucleico según la invención y las fructosiltransferasas codificadas por ellas, se trata de moléculas no descritas hasta ahora.
En relación con la presente invención, se entiende por tanto por fructosiltransferasa una proteína que es capaz de catalizar el ligamiento de enlaces \beta-2,1-glucosídicos y/o \beta-2,6-glucosídicos entre unidades de fructosa. A este respecto, el resto fructosilo para transferir procede de la sacarosa.
La reacción catalizada por una fructano fructosiltransferasa dependiente de sacarosa según la invención puede representarse de la siguiente manera:
n(G – F) \rightarrow G – F_{n} + (n – 1)G
en la que G= glucosa, F= fructosa y G-F= sacarosa. Es decir, la enzima transfiere restos de fructosa desde la sacarosa a un polifructano, que se forma a partir de una molécula de sacarosa mediante enlaces \beta-2,1-glucosídicos, en los que pueden aparecer dado el caso también enlaces \beta-2,6-glucosídicos.
Un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico según la invención con la actividad de una fructosiltransferasa conduce a la síntesis de polifructosa, y particularmente en células vegetales, a la síntesis de polifructosa de tipo inulina (en adelante también inulina).
En relación con la presente invención, se entiende por polifructosa un polifructano con un grado de polimerización GP \geq 4, preferiblemente GP \geq 6, y particularmente GP \geq 8. Por "polifructosa de tipo inulina" o "inulina", se entiende un polímero de fructano de cadena larga cuyas moléculas tienen ligamientos predominadamente \beta-1,2-glucosídicos, y dado el caso también presentan ramificaciones \beta-2,6. "Cadena larga" significa a este respecto que se presenta un grado de polimerización (GP) de más de 20, preferiblemente de más de 50, además preferiblemente de más de 100 y con especial preferencia de más de 200. El polímero de fructosa puede portar un resto de glucosa terminal que está ligado por el grupo OH C-1 de la glucosa y el grupo OH C-2 de un resto fructosilo. En este caso, el polímero de fructosilo contiene así pues una molécula de sacarosa.
En el uso de la enzima para la síntesis de polifructano in vitro, se obtiene un producto oligomérico (GP= 4 a 10).
La enzima codificada por las moléculas de ácido nucleico según la invención puede diferenciarse de fructosiltransferasas conocidas particularmente debido a la reacción catalizada. Así, las SST vegetales conocidas catalizan la reacción:
G – F + G – F \rightarrow G – F – F + G.
Las fructano fructosiltransferasas dependientes de fructano vegetales catalizan por el contrario la reacción:
G – F_{n} + G - F_{m} \rightarrow G – F_{n+1} + G - F_{m+1},
en la que esta reacción es totalmente reversible.
Las fructosiltransferasas bacterianas, por ejemplo, las codificadas por el gen sacB a partir de Bacillus subtilis, catalizan igualmente una reacción según el esquema:
nG – F \rightarrow G – F_{n} + (n - 1)G.
No obstante, estas enzimas sintetizan levano, es decir, un polifructano con ligamiento \beta-1,6-glucosídico, que presenta ramificaciones \beta-2,1.
La proteína codificada por el gen ftf a partir de Streptococcus mutans (una FTF) conduce ciertamente también a la síntesis de inulina con un peso molecular de varios millones de Da. No obstante, el gen ftf o la proteína codificada no presenta ninguna homología apreciable con la secuencia de ácido nucleico representada por la SEC ID Nº 1 (sólo un 37,3%) o con la secuencia aminoacídica representada por la SEC ID Nº 2 (sólo un 22,6%).
El término "hibridación" significa en el marco de esta invención una hibridación en condiciones de hibridación convencionales, preferiblemente en condiciones rigurosas como se describen, por ejemplo, en Sambrook y col., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2ª ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. Es un ejemplo de condiciones de hibridación rigurosas la hibridación en 50% de formamida, 5 x SSC, 5 x disolución de Denhardt, fosfato de sodio 40 mM a pH 6,8; 0,5% (p/v) de BSA, 1% (p/v) de SDS, ADN de esperma de salmón 0,1 mg/ml a una temperatura de hibridación de 42ºC, y a continuación lavado del filtro con 0,5 x SSC/0,5% de SDS a 60ºC.
Es un ejemplo de condiciones de hibridación convencionales no rigurosas una hibridación en las condiciones dadas con la excepción de que se usa 30% de formamida en lugar de 50% y el filtro se lava a continuación con 2 x SSC/0,5% de SDS a 56ºC. Las moléculas de ácido nucleico que hibridan con las moléculas según la invención pueden aislarse, por ejemplo, a partir de genotecas genómicas o de ADNc que se han preparado preferiblemente a partir de hongos. La identificación y aislamiento de dichas moléculas de ácido nucleico puede realizarse a este respecto usando las moléculas según la invención o partes de estas moléculas o los complementos inversos de estas moléculas, por ejemplo, mediante hibridación según procedimientos estándar (véase, por ejemplo, Sambrook y col., 1989, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Como sondas de hibridación pueden usarse, por ejemplo, moléculas de ácido nucleico que presentan exactamente o esencialmente la secuencia nucleotídica dada en la SEC ID Nº 1 o parte de esta secuencia. En los fragmentos usados como sondas de hibridación, puede tratarse también de fragmentos sintéticos que se han preparado con la ayuda de técnicas de síntesis habituales y cuya secuencia coincide esencialmente con la de una molécula de ácido nucleico según la invención.
Las moléculas que hibridan con las moléculas de ácido nucleico según la invención comprenden también fragmentos, derivados y variantes alélicas de las moléculas de ácido nucleico anteriormente descritas que codifican una proteína según la invención.
Por "fragmentos", se entienden a este respecto partes de las moléculas de ácido nucleico que son suficientemente largas para codificar una proteína con actividad fructosiltransferasa. La expresión "derivado" significa en este contexto que las secuencias de estas moléculas se diferencian de las secuencias de las moléculas de ácido nucleico anteriormente descritas en una o varias posiciones, pero también presentan un alto grado de homología con estas secuencias. Homología significa a este respecto una identidad de secuencia de al menos un 60%, preferiblemente más de un 80%, y con especial preferencia más de un 90%. A este respecto, las proteínas codificadas por estas moléculas de ácido nucleico presentan preferiblemente una identidad de secuencia con la secuencia aminoacídica dada en la SEC ID Nº 2 de al menos un 60%, preferiblemente al menos un 70%, particularmente al menos un 80%, con especial preferencia al menos un 90% y con muy especial preferencia al menos un 95%. Las desviaciones de las moléculas de ácido nucleico anteriormente descritas pueden generarse a este respecto, por ejemplo, mediante deleción, sustitución, inserción y/o recombinación. Las moléculas de ácido nucleico según la invención pueden ser también derivados ulteriores de las secuencias de origen fúngico. Puede no ser necesaria una derivatización de las secuencias para posibilitar la expresión en determinadas células hospedadoras.
En las moléculas de ácido nucleico que son homólogas de las moléculas anteriormente descritas y representan derivados de estas moléculas, se trata generalmente de variaciones de estas moléculas que representan modificaciones que ejercen la misma función biológica. Puede tratarse a este respecto tanto de variaciones de origen natural, por ejemplo de secuencias de otras cepas u organismos, como de mutaciones, en las que estas mutaciones pueden aparecer de modo natural o introducirse mediante mutagénesis dirigida. Además, puede tratarse en las variaciones de secuencias preparadas sintéticamente. En las variantes alélicas, puede tratarse tanto de variantes de origen natural como de variantes preparadas sintéticamente o producidas mediante técnicas de ADN recombinante.
Las proteínas codificadas por las distintas variantes de moléculas de ácido nucleico según la invención presentan preferiblemente, por ejemplo, determinadas características comunes como actividad enzimática, peso molecular, reactividad o conformación inmunitaria, o propiedades físicas como comportamiento de movilidad en electroforesis en gel, comportamiento cromatográfico, coeficientes de sedimentación, solubilidad, propiedades espectroscópicas, estabilidad, pH óptimo o temperatura óptima.
En una forma de realización preferida, las secuencias de ácido nucleico según la invención codifican un polipéptido con las propiedades de una fructosiltransferasa de hongos, con especial preferencia de Aspergillus y con muy especial preferencia de una fructosiltransferasa de Aspergillus sydowi.
En las moléculas de ácido nucleico según la invención, puede tratarse tanto de moléculas de ADN como de ARN. Las correspondientes moléculas de ADN son, por ejemplo, moléculas de ADN genómico o ADNc. Las moléculas de ácido nucleico según la invención pueden aislarse de fuentes naturales, preferiblemente de hongos, particularmente Aspergillus y preferiblemente Aspergillus sydowi, o pueden sintetizarse mediante procedimientos conocidos.
Mediante técnicas de biología molecular corrientes, es además posible (véase, por ejemplo, Sambrook y col., 1989, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2ª ed., Cold. Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) introducir diferentes tipos de mutaciones en las moléculas de ácido nucleico según la invención, mediante las que se llega a la síntesis de proteínas con propiedades biológicas eventualmente modificadas. En este momento, es posible por un lado la producción de mutantes de deleción, en los que se producen moléculas de ácido nucleico mediante deleciones graduales de los extremos 5' o 3' de la secuencia de ADN codificante, que conducen a la síntesis de las correspondientes proteínas acortadas. Por otro lado, pueden prepararse también enzimas dirigidas, que debido a la adición de secuencias señal se localizan en distintos compartimentos. Para conseguir la localización de las proteínas según la invención en el citosol, no debe añadirse a la secuencia dada por la SEC ID Nº 2 ninguna secuencia señal.
Además, es también concebible la incorporación de mutaciones puntuales en posiciones en las que una modificación de la secuencia aminoacídica tiene influencia, por ejemplo, sobre la actividad enzimática o la regulación de la enzima. De este modo, pueden prepararse, por ejemplo, mutantes que poseen un valor de K_{m} modificado o que ya no están sujetos a los mecanismos de regulación presentes normalmente en las células, por ejemplo, regulación alostérica o modificación covalente.
Además, pueden prepararse mutantes que presentan una especificidad de sustrato o producto modificada. Además, pueden prepararse mutantes que presentan un perfil de actividad-temperatura modificado.
Para la manipulación por ingeniería genética en células procarióticas, pueden incorporarse moléculas de ácido nucleico según la invención o partes de estas moléculas a plásmidos que permitan una mutagénesis o una modificación de secuencia mediante recombinación de secuencias de ADN. Con ayuda de procedimientos estándar (véase Sambrook y col., 1989, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY., EE.UU.), pueden proponerse cambios de bases o añadirse secuencias naturales o sintéticas. Para la unión de fragmentos de ADN entre sí, pueden implantarse en los fragmentos adaptadores o ligadores. Además, pueden utilizarse manipulaciones que ponen a disposición sitios de corte de restricción compatibles o eliminan el ADN o sitios de corte de restricción superfluos. Cuando se tienen en cuenta inserciones, deleciones o sustituciones, pueden usarse mutagénesis in vitro, "reparación de cebador", restricción o ligamiento. Como procedimiento de análisis, se llevan a cabo en general un análisis de secuencia, un análisis de restricción y otros procedimientos bioquímicos-de biología molecular.
La invención se refiere además a vectores que contienen las moléculas de ácido nucleico según la invención. Preferiblemente, se trata a este respecto de plásmidos, cósmicos, virus, bacteriófagos y otros vectores habituales en la ingeniería genética.
Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico según la invención en el factor según la invención está unida operativamente con elementos reguladores que garantizan la transcripción y síntesis de un ARN traducible en células procarióticas y/o eucarióticas. Por ejemplo, un vector según la invención contiene los siguientes elementos:
1.
Un promotor que asegura la transcripción de regiones de codificación conectadas posteriormente en células del organismo hospedador, y dado el caso elementos potenciadores.
2.
Una región de codificación en forma de fusión con el promotor, que contiene al menos un marco abierto de lectura para la traducción de un polipéptido. Según la invención, se trata en la región de codificación de una molécula de ácido nucleico según la invención.
3.
Dado el caso, secuencias adicionales en forma de fusión con la región de codificación, por ejemplo, señales de terminación de la transcripción, si esto es necesario para una expresión génica exitosa en un organismo hospedador determinado, o secuencias señal que influyen en la localización subcelular del producto génico o afectan a la secreción de la proteína.
Uno de dichos vectores puede contener otros genes, como genes marcadores, que permiten la selección del vector en una célula hospedadora adecuada y en condiciones adecuadas. La expresión de la molécula de ácido nucleico según la invención comprende la transcripción de la molécula de ácido nucleico a ARNm traducible. Los elementos reguladores que garantizan la expresión de la molécula de ácido nucleico en células procarióticas o eucarióticas son conocidos por el experto. Los posibles elementos reguladores que son adecuados para la expresión de la molécula de ácido nucleico según la invención en células hospedadoras procarióticas comprenden, por ejemplo, el promotor P_{L}, lac, trp o tac en E. coli. Se usa con especial preferencia el promotor lacZ inducible por IPTG en E. coli. Son ejemplos de elementos reguladores que permiten la expresión en células hospedadoras eucarióticas los promotores AOX1 y GAL1 en levadura o los promotores CMV, SV40, RSV, potenciador CMV, potenciador SV40 o un intrón de globina en células de mamífero u otras células animales. Para la expresión en levadura, se usa preferiblemente el promotor de alta actividad en levadura del gen de alcohol deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae. Se describen en el estado de la técnica otros sistemas de vector adecuados, por ejemplo, en Sambrook y col., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual" (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY. y en Ausubel, "Current Protocols in Molecular Biology" (1989), Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.
Los elementos reguladores para la expresión de las moléculas de ácido nucleico según la invención en células vegetales son principalmente cualquier promotor, potenciador, terminador, etc. activo en células vegetales. El promotor puede seleccionarse a este respecto de modo que se realice la expresión constitutiva en las plantas según la invención o sólo en un tejido determinado en un momento determinado del desarrollo de las plantas o en un momento determinado por influencias externas. Con respecto a las plantas, el promotor puede ser homólogo o heterólogo.
Son promotores significativos, por ejemplo, el promotor de ARN de 35S del virus del mosaico de la coliflor (véase, por ejemplo, el documento US 5.352.605) y el promotor de ubiquitina (véase, por ejemplo, el documento US 5.614.399) para una expresión constitutiva, el promotor del gen de la patatina B33 (Rocha-Sosa, EMBO J, 8 (1989), 23-29) para una expresión específica de tubérculo en patatas o un promotor que asegura la expresión únicamente en tejidos fotosintéticos activos, por ejemplo, el promotor ST-LS1 (Stockhaus, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7943-7947; Stockhaus, EMBO J. 8 (1989), 2445-2451), el promotor Ca/b (véanse, por ejemplo, los documentos US 5.656.496, US 5.639.952, Bansal, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 3654-3658) y el promotor SSU de rubisco (véanse, por ejemplo, los documentos US 5.034.322, US 4.962.028). Sin embargo, pueden usarse también promotores que activan sólo en un momento determinado por influencias externas (véase, por ejemplo, el documento WO 93/07279). Puede ser de especial interés a este respecto promotores de proteínas de choque térmico, que permiten una fácil inducción. Además, pueden usarse promotores específicos de semilla como, por ejemplo, el promotor USP de Vicia faba, que garantiza una expresión específica de semilla en Vicia faba y otras plantas (Fiedler, Plant. Mol. Biol. 22 (1993), 669-679; Bäumlein, Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 459-467). Además, pueden utilizarse también promotores específicos de frutos como se describen, por ejemplo, en el documento WO 91/01373. Para la expresión en frutos de tomate maduros, son adecuados, por ejemplo, elementos reguladores en cis de un promotor de poligalacturonasa de tomate, que son activos en pericarpio externo o interno (Nicholass y col., Plant. Mol. Biol. 28 (1995), 423-435; Montgomery y col., Plant Cell 5 (1993), 1049-1062). Describen otro promotor específico de fruto para tomates Van Haaren y col. (Plant Mol. Biol. (1993), 625-640).
Además, pueden usarse promotores para una expresión específica de endospermo como, por ejemplo, el promotor de glutelina (Leisy, Plant. Mol. Biol. 14 (1990), 41-50; Zheng, Plant. J. 4 (1993), 357-366), el promotor HMG de trigo, el promotor USP, el promotor de faseolina o promotores de genes de zeína del maíz (Pedersen, Cell 29 (1982), 1015-1026; Quattrocchio, Plant Mol. Biol. 15 (1990), 81-93) o el promotor Shrunken-1 (sh-1) del maíz (Werr, EMBO J. 4 (1985), 1373-1380).
La expresión de las moléculas de ácido nucleico según la invención es particularmente ventajosa en aquellos órganos de las plantas que presentan un contenido elevado de sacarosa o almacenan sacarosa. Dichos órganos son, por ejemplo, tubérculos de remolacha azucarera o la raíz de caña de azúcar y sorgo dulce. Se usan con especial preferencia por tanto promotores que median la expresión en estos órganos como, por ejemplo, el promotor de patatina B33 de Solanum tuberosum. Para una expresión específica en raíz de plantas de caña de azúcar, puede usarse el promotor de ubiquitina en combinación con el primer intrón.
Los vectores según la invención pueden poseer además otras unidades funcionales que causen una estabilización del vector en un organismo hospedador, como un origen de replicación bacteriano o ADN de 2 \mum para estabilización y replicación autónoma en levadura. Además, pueden contener secuencias del "margen izquierdo" y el "margen derecho" de ADN-T agrobacteriano, mediante las que se posibilita una integración estable en el material genético de plantas.
Además, puede proporcionarse una secuencia de terminación que sirva para la terminación correcta de la transcripción, así como la adición de una cola de poli-A al transcrito, a la que se atribuye una función de estabilización de los transcritos. Dichos elementos se describen en la bibliografía (véase, por ejemplo, Gielen, EMBO J. 8 (1989), 23-29) y son intercambiables a voluntad.
En una forma de realización preferida, la molécula de ácido nucleico contenida en el vector según la invención comprende una región que contiene una secuencia señal funcional para la secreción de la enzima codificada. Dichas secuencias son conocidas.
Es un péptido señal que garantiza la localización de la proteína en las vacuolas, por ejemplo, el péptido señal de carboxipeptidasa Y de levadura (CPY). El correspondiente gen se describe, por ejemplo, en Valls y col. (Cell 48, 887-899). Son secuencias señal vegetales, por ejemplo, el gen de lectina de cebada (Raikhel y Lerner, Dev. Genet. 12 (1991), 255-269) o los 43 aminoácidos de la zona N-terminal de fitohemaglutinina madura de judías (Tague y col., Plant Cell 2 (1990), 533-546). Es un ejemplo de un péptido señal C-terminal la quitinasa (Neuhaus y col., Plant J. 5 (1994), 45-54).
Es una secuencia señal preferida, por ejemplo, la secuencia señal del gen inhibidor de proteinasa II de patata. Sin embargo, puede usarse también cualquier otra secuencia señal que conduzca a la secreción de un polipéptido en el hospedador seleccionado. La fructosiltransferasa secretada puede obtenerse a partir del medio de cultivo y utilizarse para síntesis in vitro.
En una forma de realización especialmente preferida, la molécula de ácido nucleico contenida en el vector contiene una región que codifica una secuencia señal para localización vacuolar en células vegetales, preferiblemente del gen de patatina de patata (Sonnewald, Plant J. 1 (1998), 95-106). Esto permite la localización subcelular de la fructosiltransferasa en las vacuolas de células vegetales y plantas modificadas por ingeniería genética, por ejemplo, remolacha azucarera o patata, y la acumulación de polifructosas de alto peso molecular de tipo inulina en las vacuolas. Se describen otras secuencias señal vacuolares, por ejemplo, en Matsuoka (Journal of Experimental Botany 50 (1999), 165-174), Chrispeels (Cell 68 (1992), 613-616), Matsuoka (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 834-838), Bednarek (Plant Cell 3 (1991), 1195-1206), Nakamura (Plant Phys. 101 (1993), 1-5).
En una forma de realización adicional de la invención, la molécula de ácido nucleico contenida en el vector contiene una región que codifica una secuencia señal para localización plastídica en células vegetales.
Como secuencia señal puede usarse, por ejemplo, la secuencia señal de ferrodoxina:NADP(+)-oxidorreductasa (FNR) de espinaca. La secuencia contiene la zona 5' no traducida, así como la secuencia del péptido de tránsito flanqueante del ADNc de la proteína plastídica ferredoxina:NADP(+)-oxidorreductasa de espinaca (nucleótidos -171 a +165; Jansen, Current Genetics 13 (1988), 517-522).
Además, puede usarse como secuencia señal, por ejemplo, el péptido de tránsito de la proteína cerosa del maíz más los primeros 34 aminoácidos de la proteína cerosa madura (Klösgen, Mol. Gen. Genet. 217 (1989), 155-161). En una forma de realización preferida de la invención, se usa el péptido de tránsito de la proteína cerosa del maíz sin los primeros 34 aminoácidos de la proteína cerosa madura.
En una forma de realización especialmente preferida, la invención se refiere a los plásmidos pSK-as1, p112-as1, pA7-as1, p35-as1, p35-s3-as1, cuya construcción se describe en los ejemplos (Fig. 1 a 5).
Las moléculas de ácido nucleico y vectores de expresión según la invención permiten la preparación de polifructosas de tipo inulina en distintos organismos hospedadores, particularmente plantas, hongos y bacterias. Las enzimas codificadas pueden utilizarse también fuera de los organismos hospedadores para la producción de polifructosas de tipo inulina. Es decir, es particularmente posible usar las moléculas de ácido nucleico según la invención para la producción de las proteínas codificadas por ellas en cualquier célula hospedadora, obtener la proteína a partir de las células hospedadoras y/o del medio de cultivo y utilizarla para la síntesis in vitro de inulina.
Así, puede utilizarse, por ejemplo, un constructo que contiene el promotor de alcohol deshidrogenasa y una molécula de ácido nucleico según la invención para la transformación de Saccharomyces cerevisiae. Ya que la levadura no es capaz de captar sacarosa, deberían usarse células que expresen un transportador de sacarosa debido a la introducción de una secuencia de ADN heteróloga. La preparación de dichas células se describe, por ejemplo, en Riesmeier y col. (EMBO J., 11 (1992), 4705-4713). Con levaduras transformadas con el constructo anteriormente descrito, se forman polifructosas de cadena larga de tipo inulina. Ya que la fructosiltransferasa de Aspergillus sydowi no posee péptido señal, no se secreta. Las polifructosas de cadena larga se generan por tanto en las células de levadura. Las células de levadura que contienen estas polifructosas pueden utilizarse directamente como aditivos alimentarios. En caso de obtener las polifructosas por fermentación en medio de cultivo, puede fusionarse una secuencia señal para la secreción con una molécula de ácido nucleico según la invención.
En una forma de realización adicional, la invención se refiere a células hospedadoras que contienen las moléculas de ácido nucleico o vectores según la invención de forma transitoria o estable, en las que las moléculas de ácido nucleico son heterólogas con respecto a las células hospedadoras. Por célula hospedadora se entiende un organismo que es capaz de captar ADN recombinado in vitro y dado el caso sintetizar las proteínas codificadas por las moléculas de ácido nucleico según la invención. Las células hospedadoras pueden ser de origen procariótico o eucariótico. El término "procariótico" incluye a este respecto todas las bacterias que pueden transformarse o transfectarse con una molécula de ácido nucleico según la invención, y que permiten ventajosamente la expresión de una proteína con actividad fructosiltransferasa. Las células hospedadoras procarióticas incluyen, por ejemplo, bacterias gramnegativas así como grampositivas como, por ejemplo, E. coli, S. typhimurium, Serratia marcescens y Bacillus subtilis. El término "eucariótico" incluye células de insecto, células fúngicas, células vegetales, células animales y humanas. Son células fúngicas preferidas, por ejemplo, aquellas que se emplean o pueden emplearse para la fermentación, particularmente Saccharomyces, a este respecto con especial preferencia S. cerevisiae, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, etc. Se prefiere como una de dichas células hospedadoras fúngicas una célula del género Aspergillus, y con especial preferencia de la especie Aspergillus niger. Es particularmente interesante la expresión de la fructosiltransferasa según la invención en estas células en combinación con una secuencia señal secretora, por ejemplo, del gen de patatina o del gen 1-SST de Aspergillus foetidus (Rehm y col., J. Bac. 180 (1998), 1305-1319). De este modo, se secreta la fructosiltransferasa al medio. Ventajosamente, se usan células que poseen una actividad invertasa secretora reducida o incluso nula. Son especies de hongos que no muestran actividad invertasa propia, por ejemplo, Trichoderma reesei. Se describe, por ejemplo, un protocolo para la expresión de una \beta-fructofuranosidasa (la invertasa de A. niger) en Bergès y col. (Curr. Genet. 24 (1993), 53-59). Puede transfectarse o transformarse en las células hospedadoras una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína con actividad fructosiltransferasa, o un correspondiente vector, mediante técnicas familiares para el experto. Los procedimientos para la preparación de genes fusionados ligados operativamente y su expresión en células hospedadoras adecuadas son completamente conocidos por el experto y se describen, por ejemplo, en Sambrook o Ausubel, véase anteriormente. Son hospedadores adecuados E. coli, hongos, particularmente levaduras, y células vegetales.
En la expresión de moléculas de ácido nucleico según la invención en plantas, existe en principio la posibilidad de que la proteína sintetizada pueda localizarse en cualquier compartimento de la célula vegetal. Para conseguir la localización en un compartimento determinado, puede ligarse la molécula de ácido nucleico según la invención con moléculas de ADN que garanticen la localización en el compartimento respectivo, véase anteriormente. Dichas secuencias son conocidas (véase, por ejemplo, Braun, EMBO J. 11 (1992), 3219-3227; Wolter, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 846-850; Sonnewald, Plant J. 1 (1991), 95-106; Rocha-Sosa, EMBO J. 8 (1989), 23-29).
Los hospedadores según la invención comprenden por tanto también células vegetales transgénicas, tejidos vegetales y plantas que se han transformado con una o varias moléculas de ácido nucleico según la invención, así como células vegetales transgénicas que derivan de dichas células transformadas. Dichas células contienen una o varias moléculas de ácido nucleico según la invención, en las que ésta(s) está(n) ligadas preferiblemente con elementos de ADN reguladores que garantizan la transcripción en células vegetales, particularmente con un promotor. Dichas células pueden diferenciarse de células vegetales de fuente natural en que contienen al menos una molécula de ácido nucleico según la invención que no se presenta naturalmente en estas células.
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En una forma de realización adicional, la presente invención se refiere a células vegetales que contienen la proteína según la invención en el citosol. Para ello, se usa la secuencia dada como SEC ID Nº 2 sin secuencias señal adicionales.
En una forma de realización preferida adicional, la presente invención se refiere a células vegetales que contienen la proteína según la invención en los plastos. Para la obtención de una localización plastídica de la proteína según la invención, pueden modificarse las moléculas de ácido nucleico según la invención y/o los vectores según la invención del modo descrito anteriormente.
Ya que las vacuolas pueden almacenar generalmente grandes cantidades de sacarosa, que sirve como sustrato para la proteína según la invención, este compartimento es bien adecuado para obtener células vegetales que producen polifructosa en las vacuolas debido a la actividad de una proteína polifructosa según la invención.
En una forma de realización especialmente preferida, la presente invención se refiere por tanto a células vegetales que contienen la proteína según la invención en vacuolas. Ya se ha ilustrado anteriormente cómo deben construirse las moléculas de ácido nucleico y/o vectores según la invención para mediar una localización vacuolar de la proteína según la invención.
Las células vegetales y tejidos vegetales transgénicos pueden regenerarse mediante técnicas conocidas por el experto hasta plantas enteras. Las plantas obtenibles mediante regeneración de las células vegetales transgénicas según la invención que contienen dichas células vegetales son igualmente objeto de la presente invención. Además, son objeto de la invención plantas que contienen las células vegetales transgénicas anteriormente descritas. Las células vegetales según la invención pueden pertenecer a cualquier especie de planta, preferiblemente a plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas. Preferiblemente, se trata de células vegetales de plantas útiles agrícolamente, es decir, plantas que se cultivan por la gente con fines de alimentación o con fines técnicos, particularmente industriales. Preferiblemente, la invención se refiere a plantas fibrosas (por ejemplo, lino, cáñamo, algodón), oleaginosas (por ejemplo, colza, girasol, judía de soja), azucaradas (por ejemplo, remolacha azucarera, caña de azúcar, sorgo dulce, plátanos) y proteínicas (por ejemplo, leguminosas).
En una forma de realización preferida adicional, la invención se refiere a plantas de pienso (por ejemplo, hierbas de pienso y pasto, alfalfa, trébol, etc.), verduras (por ejemplo, melón, tomate, plátano, endibia, puerro, espárrago, zanahoria) o plantas de almidón (trigo, cebada, avena, centeno, patata, maíz, arroz, guisantes, mandioca, judías mungo).
En una forma de realización preferida adicional, la invención se refiere a células vegetales de plantas que contienen sacarosa (por ejemplo, remolacha azucarera, patata, arroz, trigo, caña de azúcar, etc.). Se prefieren especialmente remolacha azucarera, endibia, arroz, maíz, patata, caña de azúcar y trigo. La invención comprende igualmente material de propagación y productos de cosecha de las plantas según la invención, por ejemplo, frutos, semillas, tubérculos, rizomas, plántulas, plantones, callos, cultivos celulares, etc.
La presente invención se refiere también a procedimientos para la preparación de plantas transgénicas, en los que
(a)
se modifica por ingeniería genética una célula vegetal mediante la introducción de una molécula de ácido nucleico según a invención y/o un vector según la invención, en la que la molécula de ácido nucleico es heteróloga respecto a la célula; y
(b)
se regenera una planta a partir de la célula; y dado el caso
(c)
se obtienen plantas adicionales a partir de la planta según (b).
El término "modificada por ingeniería genética" significa a este respecto con relación a la presente invención que en las células vegetales se modifica su información genética mediante la introducción de una molécula de ácido nucleico según la invención, y que la presencia o la expresión de la molécula de ácido nucleico según la invención conduce a una modificación fenotípica. Modificación fenotípica significa a este respecto preferiblemente una modificación medible de una o varias funciones de las células. Por ejemplo, las plantas modificadas por ingeniería genética según la invención muestran una actividad de la proteína según la invención o una actividad fructosiltransferasa total elevada.
La regeneración de plantas según la etapa (b) puede realizarse mediante procedimientos conocidos por el experto.
La producción de plantas adicionales según la etapa (c) del procedimiento según la invención puede realizarse, por ejemplo, mediante propagación vegetativa (por ejemplo, mediante plantones, tubérculos o cultivo de callo y regeneración de plantas enteras) o mediante propagación generativa. La propagación generativa tiene lugar a este respecto preferiblemente controlada, es decir, se cruzan y propagan entre sí plantas seleccionadas con determinadas propiedades.
La presente invención se refiere también a plantas obtenibles mediante el procedimiento según la invención, a condición de que éstas contengan células vegetales según la invención.
La presente invención se refiere también a material de propagación de plantas según la invención, en el que el material de propagación contiene células vegetales según la invención. El término material de propagación comprende a este respecto cualquier componente de las plantas que sea adecuado para la producción de descendencia de modo vegetativo o generativo. Para la propagación vegetativa, son adecuados, por ejemplo, frutos, semillas, plántulas, protoplastos, cultivos celular, etc. Preferiblemente, se trata en el material de propagación de tubérculos y
semillas.
En una forma de realización adicional, la presente invención se refiere a partes de planta cosechables de plantas según la invención como frutos, hojas, raíces de almacenamiento, raíces, flores, yemas, brotes o troncos, preferiblemente semillas o tubérculos, en los que las partes de planta contienen células vegetales según la invención.
En una forma de realización adicional, la presente invención se refiere a piensos y/o alimentos que contienen las partes de planta cosechables según la invención, preferiblemente semillas o tubérculos.
Preferiblemente, las partes de planta según la invención actúan ventajosamente después del consumo, en comparación con las correspondientes partes de planta que no se han modificado por ingeniería genética del modo según la invención, sobre la salud de las personas y/o animales. Lo correspondiente es válido para los piensos y/o alimentos según la invención. En personas, el consumo del alimento según la invención puede conducir, por ejemplo, a una composición mejorada de la flora intestinal, particularmente a un aumento del contenido de bifidobacterias en el intestino, lo que se supone que afecta positivamente la salud de las personas (Izzo, Trends in Food Science & Technology 9 (1998), 255-257). En estos efectos positivos, se trata preferiblemente de efectos profilácticos o auxiliares del aprovechamiento alimentario.
Son también objeto de la invención procedimientos para la preparación de células hospedadoras según la invención, en los que se transforman células hospedadoras adecuadas con una molécula de ácido nucleico o vector según la invención. Los procedimientos para la transformación de las distintas células hospedadoras tenidas en consideración son familiares para el experto.
En una forma de realización adicional, la presente invención se refiere a procedimientos para la preparación de una frucosiltransferasa, en los que se cultiva un hospedador según la invención en condiciones que bastan para la expresión de la molécula de ácido nucleico según la invención y a continuación se aísla la fructosiltransferasa a partir del cultivo, es decir, de las células y/o el medio de cultivo posiblemente presente. En los procedimientos anteriormente citados, se cultivan las células hospedadoras transformadas o transfectadas, por ejemplo en fermentadores, hasta alcanzar una densidad celular óptima. Dado el caso, puede inducirse en promotores inducibles antes del final de la fermentación la expresión de la proteína que se codifica por la molécula de ácido nucleico según la invención. La proteína así expresada puede purificarse después mediante técnicas conocidas del medio, lisados celulares o fracciones de membrana celular según técnicas conocidas. El aislamiento y purificación de las proteínas expresadas, por ejemplo por microbios, puede conseguirse mediante técnicas preparativas de separación cromatográfica o también inmunológica, por ejemplo, con la ayuda de anticuerpos monoclonales o policlonales que reconocen la proteína codificada por la molécula de ácido nucleico según la invención. En este contexto, puede mencionarse que la proteína codificada por la molécula de ácido nucleico según la invención con actividad fructosiltransferasa puede contener también otras secuencias aminoacídicas funcionales, por ejemplo, marcajes proteicos (GST, GFP, Flag, péptido HA, cola His), que pueden proceder de proteínas heterólogas o se han producido sintéticamente.
La invención se refiere además a proteínas que poseen actividad fructosiltransferasa, es decir, fructosiltransferasas que se codifican por las moléculas de ácido nucleico según la invención o son obtenibles mediante el procedimiento según la invención. Las fructosiltransferasas según la invención pueden usarse preferiblemente para la preparación de polifructosas de tipo inulina. Por otro lado, pueden servir también para la preparación de anticuerpos que pueden emplearse de nuevo para la detección y/o para la purificación de fructosiltransferasas.
Son también objeto de la invención moléculas de ácido nucleico que codifican una fructosiltransferasa y que hibridan específicamente con moléculas de ácido nucleico según la invención o partes de las mismas, en las que la hibridación se realiza en las siguientes condiciones: hibridación en 50% de formamida, 5 x SSC, 5 x disolución de Denhardt, fosfato de sodio 40 mM, pH 6,8; 0,5% (p/v) de BSA, 1% (p/v) de SDS, ADN de esperma de salmón 0,1 mg/ml a una temperatura de hibridación de 42ºC y a continuación lavado del filtro en 0,5 x SSC/0,5% de SDS a 60ºC. A este respecto, se trata preferiblemente de oligonucleótidos con una longitud de al menos 10, particularmente al menos 15 y con especial preferencia al menos 50 nucleótidos. Los oligonucleótidos según la invención pueden usarse, por ejemplo, como cebadores para una reacción de PCR, como sondas de hibridación o similar.
Son también objeto de la presente invención procedimientos para la preparación de polifructosa, particularmente de tipo inulina, en los que se cultivan células hospedadoras según la invención u organismos hospedadores que contienen éstas en condiciones que permiten la expresión de fructosiltransferasa según la invención, así como la síntesis de polifructosa.
Mediante la provisión de las moléculas de ácido nucleico según la invención, es posible preparar polifructosas, particularmente aquellas de tipo inulina, con la ayuda de procedimientos de ingeniería genética, en organismos como no era posible hasta ahora mediante procedimientos convencionales. Es posible por tanto la expresión de las moléculas de ácido nucleico según la invención en hospedadores como bacterias, hongos o células vegetales para elevar la actividad de las correspondientes fructosiltransferasa, o la introducción en células que normalmente no expresan esta enzima. Las células hospedadoras según la invención sintetizan debido a la expresión o expresión añadida al menos una molécula de ácido nucleico de polifructosa según la invención, particularmente aquellas de tipo inulina. Son por tanto también objeto de la presente invención las polifructosas, particularmente aquellas de tipo inulina, obtenibles a partir de las células hospedadoras según la invención, así como a partir de material de propagación y en plantas a partir de las plantas o a partir de sus productos de cosecha.
Por tanto, la presente invención se refiere particularmente a procedimientos para la preparación de polifructosas, particularmente aquellas de tipo inulina, que comprenden:
(a)
El cultivo de una célula hospedadora según la invención, o de uno de dichos hospedadores que contienen células, en condiciones que permiten la producción de fructosiltransferasa y la reacción de sacarosa añadida dado el caso desde fuera, o un sustrato equivalente, hasta polifructosa de tipo inulina; y
(b)
la obtención de la polifructosa así preparada a partir de las células hospedadoras cultivadas, hospedadores o a partir del medio.
En las células hospedadoras, se trata preferiblemente de células vegetales y en los hospedadores preferiblemente de plantas. Se describe un procedimiento para la obtención de polifructosa, particularmente aquella de tipo inulina, a partir de plantas, por ejemplo, en Vogel (en: "Inulin and Inulin-containing Crops", Elsevier Science Publishers B.V. Ámsterdam, A. Fuchs (Ed.) (1993), 65-75).
Es también objeto de la presente invención un procedimiento in vitro para la preparación de polifructosa, particularmente aquella de tipo inulina, que comprende:
(a)
la puesta en contacto de sacarosa o un sustrato equivalente con una fructosiltransferasa según la invención en condiciones que permitan la reacción hasta polifructosa; y
(b)
la obtención de la polifructosa así preparada.
Es un sustrato equivalente a sacarosa, a este respecto, por ejemplo un sustrato que se hace reaccionar en células hospedadoras o por una o varias de otras enzimas presentes hasta sacarosa. Puede ser también un sustrato equivalente a sacarosa aquellos di- u oligosacáridos que pueden emplearse como sustrato alternativo de la fructosiltransferasa según la invención. Se cuentan entre ellos, por ejemplo, el trisacárido rafinosa. Pero pueden usarse también sacarosas derivatizadas. La inulina obtenida según uno de los procedimientos anteriormente citados es preferiblemente de cadena larga y presenta preferiblemente un grado de polimerización GP > 20, preferiblemente GP > 50, particularmente GP > 100 y con especial preferencia un grado de polimerización GP > 200.
La presente invención se refiere además a un procedimiento para la preparación de polifructosa, particularmente de aquella de tipo inulina, que comprende la etapa de extracción de polifructosa a partir de una de las (células de) plantas y/o a partir de partes de dichas plantas anteriormente descritas según la invención. Preferiblemente, uno de dichos procedimientos comprende también la etapa de cosecha de las plantas cultivadas y/o partes de estas plantas antes de la extracción de polifructosa, y con especial preferencia además, la etapa de cultivo de plantas según la invención antes de la cosecha. Los procedimientos para la extracción de polifructosa a partir de plantas o partes de plantas son conocidos por el experto y se han descrito, por ejemplo, en Gibson (International Sugar Journal 96 (1994), 381-387), Vogel (Stud. Plant Sci. 3 (1993), Inulin and Inulin-Containing Crops, 65-75).
La polifructosa, particularmente aquella de tipo inulina, que es obtenible a partir de una célula hospedadora según la invención o según uno de los procedimientos anteriormente descritos según la invención, puede emplearse preferiblemente en la preparación de tensioactivos, para la elevación de la viscosidad de sistemas acuosos, como detergente, como agente de suspensión, para acelerar la sedimentación y complejación o para unión de agua.
Además, las células hospedadoras según la invención que sintetizan polifructosa, particularmente aquella de tipo inulina, se usan como aditivos alimentarios. Esto es ventajoso, ya que los fructanos tienen efectos positivos sobre la salud (Roberfroid y col., J. of Nutrition 128 (1998), 11-19; Kleesen y col., Am. J. Clin. Nutr. 65 (1997), 1397-1402).
La presente divulgación se refiere además a un procedimiento para la preparación de polifructosa, particularmente aquella de tipo inulina, caracterizado porque se usa para la preparación de la polifructosa una fructosiltransferasa fúngica o un organismo hospedador que expresa una fructosiltransferasa fúngica. Preferiblemente, pueden usarse a este respecto fructosiltransferasas según la invención o células hospedadoras según la invención. La presente invención muestra en primer lugar que es posible usar dichas fructosiltransferasas fúngicas para la preparación de polifructosa de tipo inulina.
Finalmente, la presente divulgación se refiere también al uso de fructosiltransferasas fúngicas para la preparación de polifructosa, particularmente aquella de tipo inulina.
Estas y otras formas de realización están dadas a conocer y publicadas para el experto y están comprendidas por la descripción y los ejemplos en la presente invención. Puede tomarse del estado de la técnica una bibliografía continua sobre cualquiera de los procedimientos, agentes y usos anteriormente indicados que pueden emplearse en el sentido de la presente invención, por ejemplo, de bibliotecas públicas, por ejemplo, empleando herramientas electrónicas. Con este fin, se ofrecen entre otros bancos públicos de datos como "Medline", que está puesto a disposición en Internet, por ejemplo, en la dirección http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html. Son familiares para el experto otros bancos de datos y direcciones y pueden tomarse de Internet, por ejemplo, con la dirección http://www.lycos.com. Se da una visión general sobre las fuentes e informaciones de patentes o solicitudes de patente en biotecnología en Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364.
La Figura 1 representa la construcción de pSK-as1 para la transformación de bacterias.
La Figura 2 representa la construcción del plásmido p112-as1 para la transformación de células de levadura.
La Figura 3 representa la construcción del plásmido pA7-as1 para la transformación de células vegetales
La Figura 4 representa la construcción del plásmido p35-as1 para la transformación de plantas.
La Figura 5 representa la construcción del plásmido p35-s3-as1 para la transformación de plantas.
La Figura 6 representa el análisis por cromatografía en capa fina de E. coli transformada con pSK-as1. El carril 1 muestra un ensayo de control con el vector vacío pBluescript SK. El carril 2 reproduce un experimento con el plásmido pas1, en el que la región codificadora de as1 no está en el marco de lectura del gen lacZ (carril 2). En este caso, la traducción de la región codificadora de as1 no se realiza en forma de fusión con \beta-glucuronidasa sino que se realiza, con eficacia reducida, a partir del codón de inicio endógeno. Los carriles 3 a 6 muestran ensayos con distintos transformantes del constructo pSK-as1. Después del cultivo de las bacterias hasta una DO_{600} de 0,4, se indujeron los cultivos con IPTG 100 mM. Después de 2 h de inducción, se recogieron las células y se lisaron en tampón fosfato de sodio 50 mM a pH 6,0. Se incubaron los extractos proteicos durante 12 h con sacarosa 600 mM a 37ºC. Se aplicaron como patrones para la cromatografía en capa fina en los carriles 7-9 1-kestosa (7), sacarosa (8) o fructosa (9).
La Figura 7 representa el análisis de cromatografía en capa fina de células de levadura transformadas que contienen el plásmido p112-as1 (carril 2) o p112-as1L (carril 3). El vector p112-as1L contiene la secuencia líder 5' del transportador de sacarosa de espinaca. El carril 1 muestra un ensayo de control con células de levadura no transformadas. Se detectó la actividad fructosiltranferasa en extractos proteicos de las células de levadura. Se aplicaron como patrones fructosa (carril 4), una mezcla de 1-kestosa, nistosa y fructosilnistosa (carril 5) y sacarosa (carril 6).
La Figura 8 representa el análisis de cromatografía en capa fina de células vegetales que contienen el plásmido pA7-as1. El carril 1 muestra una transformación con el vector vacío pA7 (50 \mug); los carriles 2 a 5 muestran transformaciones con el vector pA7-as1 (carril 2: 10 \mug; carril 3: 20 \mug; carril 4 y 5: 50 \mug). Como patrón, se aplicó una mezcla de 1-kestosa, nistosa y fructosilnistosa (carril 6), sacarosa (carril 7) y fructosa (carril 8).
Para cada experimento, se usaron 500.000 protoplastos. Se incubaron los protoplastos después de la transformación durante dos días a 25ºC, a continuación se obtuvo un extracto proteico en fosfato de sodio 50 mM a pH 6, que se incubó durante 20 horas a 28ºC con sacarosa 500 mM. Se aplicaron 4 \mul de una dilución 1/10 de la preparación.
La Figura 9 representa el análisis por cromatografía en capa fina de plantas que se han transformado con el constructo 35-as1. Se seleccionaron aleatoriamente 12 plantas. Se extrajeron respectivamente 20 mg de material de hoja en 200 \mul de agua. Se aplicaron 4 \mul del extracto. Se aplicaron como patrón fructosa (carril F), sacarosa (carril S) y una mezcla de 1-kestosa, nistosa y fructosilnistosa (carril St).
La Figura 10 representa el análisis por cromatografía en capa fina de plantas que se han transformado con el constructo 35-S3a1. Se seleccionaron aleatoriamente 12 plantas. Se extrajeron respectivamente 20 mg de material de hoja en 200 \mul de agua. Se aplicaron 4 \mul del extracto. Se aplicaron como patrón fructosa (carril F), sacarosa (carril S) y una mezcla de 1-kestosa, nistosa y fructosilnistosa (carril St).
La Figura 11 representa el eluido "sulfato de sodio 400 a 0 mM" de una columna de Phenylsuperose que se ha recubierto con un extracto proteico enriquecido en fructosiltransferasa de Aspergillus sydowi (carril E). En los carriles caracterizados como "M", se separa un marcador de tamaño. Las masas moleculares de las proteínas marcadoras se dan a la derecha en kDa.
Los ejemplos ilustran la invención.
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Ejemplo 1 Purificación de af1-SST de Aspergillus sydowi
Se cultivó Aspergillus sydowi IAM 2544 en un medio de cultivo que contenía 2% de extracto de malta, 0,5% de peptona y 2% de sacarosa. Se consolidó el medio mediante la adición de 2% de agar. Se sembraron esporas y se mantuvo el cultivo hasta el secado total de las placas a 25ºC. Se recogieron los conidios de las placas y se suspendieron en fosfato de sodio 50 mM a pH 6,0. La lisis de los conidios se realizó en tres pasadas mediante una "celda de prensa francesa". Para la purificación, se adsorbió el homogeneizado en Sepharose Q. Se eluyó la proteína unida con un gradiente lineal de KCl 0 a 1000 mM. Se obtuvieron fracciones activas sucrolíticas a KCl entre 500 y 700 mM. Se purificaron estas fracciones y se dializaron frente a fosfato de sodio a pH 6,0. Para el enriquecimiento de la proteína, se adsorbió una vez más en Sepharose Q (volumen de lecho 2 ml) y se eluyó en un volumen de 10 ml.
Se ajustó el eluido a sulfato de amonio 2 M y se adsorbió en Phenylsuperose. Se realizó la elución después de lavar con sulfato de sodio 2 M, fosfato de sodio 100 mM a pH 7,0 con un gradiente lineal de sulfato de amonio 2 M a 0 M. Se obtuvieron fracciones activas en los gradientes de elución entre sulfato de amonio 400 y 0 mM. Se analizó la mezcla de proteínas obtenida mediante PAGE-SDS. Se reproduce el resultado en la Fig. 11. Se describe un enriquecimiento similar de la actividad sucrolítica, pero a partir de micelio de Aspergillus sydowi, en Muramatsu y Nakakuki (Biosci. Biotech. Biochem. 59 (1995), 208-212). La purificación no da como resultado una proteína homogénea que sería adecuada, por ejemplo, para una secuenciación.
Para identificar la fructosiltransferasa, se utilizó un gel de poliacrilamida semi-nativo al que se aplicaron 10 \mug de proteína del eluido de la columna de Phenylsuperose en 0,1% de SDS, 10% de glicerina, Tris 50 mM a pH 6,8. Después de la electroforesis, se tamponó el gel con fosfato de sodio 50 mM a pH 6,0, 1% de Triton X 100 tres veces durante 10 minutos y después se incubó durante 30 minutos en fosfato de sodio 50 mM a pH 6,0, 1% de Triton X 100, sacarosa 500 mM. A continuación, se calentó el gel en 0,1% (p/v) de cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC), NaOH 0,5 M. El TTC forma en este momento con azúcares reductores un colorante de formazano rojo. Las bandas de proteína marcadas en la Fig. 11 dieron como resultado una coloración debido a la actividad sucrolítica de la proteína, que pudo identificarse así como fructosiltransferasa de Aspergillus sydowi. A partir de un gel preparativo, se aislaron las bandas, se eluyó la proteína del gel y se usó para una secuenciación. Ya que la proteína está bloqueada N-terminal, se efectuaron escisiones con endopeptidasas LysC y AspN, se purificaron los péptidos mediante HPLC y se sometieron a secuenciación según Edmann. Se obtuvieron en este momento las siguientes secuencias:
LysC: VLPSTSQASEK (SEC ID Nº 3)
AspN: DDLVTYR (SEC ID Nº 4)
DPYVFQNHEV (SEC ID Nº 5)
Para la clonación del gen, se dispuso una genoteca de ADNc en fagos lambda Zap II (Stratagene, Heidelberg). Ya que no era posible una preparación de ARN a partir de conidios, se preparó ARN a partir de micelio según Logemann y col. (Anal. Biochem. 163 (1987), 16-20). Se obtuvo ARN poli A+ con el sistema polyATract (Promega, Madison, EE.UU.). Se realizó la síntesis de ADNc y la clonación en lambda Zap II según las instrucciones del fabricante (Stratagene, Heidelberg). Correspondientemente a las secuencias de proteína, se diseñaron los siguientes cebadores:
Cebador asp19down 5'-GAYGAYYTNGTNACNTAYMG (SEC ID Nº 6)
Cebador asp19up 5'-CKRTANGTNACNARRTCRTC (SEC ID Nº 7)
Cebador asp31down 5'-GTNTTYCARAAYCAYGARG (SEC ID Nº 8)
Cebador asp31up 5'-TGRTTYTGRAANACRTANGG (SEC ID Nº 9)
Cebador lys1up 5'-GCYTGNSWNGTNSWNGG (SEC ID Nº 10)
Se obtuvo un fragmento de ADN de aprox. 350 pb en una reacción PCR con la genoteca de ADNc completa como matriz y la combinación de cebadores asp19down/asp31up (temperatura de asociación 40ºC). Se utilizó este fragmento después de marcado radiactivo (Kit Megaprime, Boehringer Mannheim, Mannheim) para el muestreo de la genoteca de ADNc. Se amplificaron los clones obtenidos después de la escisión in vivo en forma de plásmidos pBluescript. Se compararon las inserciones de ADNc después de escisión de restricción y se secuenció totalmente la inserción de un clon. Se reproduce la secuencia de la inserción de ADNc en la SEC ID Nº 1. Se reproduce la secuencia de proteína derivada en la SEC ID Nº 2.
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Ejemplo 2 Preparación de constructos que contienen regiones de codificación de fructosiltransferasas fúngicas para la transformación de distintas células hospedadoras procarióticas y eucarióticas
Para la transformación de distintas células hospedadoras con fructosiltransferasas fúngicas, se preparó una serie de diferentes constructos según procedimientos estándar de biología molecular (Sambrook y col., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Se representan los constructos en las Fig. 1 a 5. En particular, se prepararon los constructos del modo siguiente:
pSK-as1
es un derivado de pas1, que se ha obtenido por la escisión in vivo de un clon lambda ZapII del banco de ADNc de Aspergillus sydowi. El pas1 contiene el ADNc en forma de fragmento EcoRI/XhoI. El pSK-as1 se generó a partir de pas1 mediante escisión con BamHI y SmaI, relleno del extremo BamHI protuberante y religamiento del vector. Mediante la eliminación de 4 nucleótidos, se lleva la región de codificación de as1 al marco de lectura del gen lacZ (figura 1).
p112-as1
en el vector p112A1NE (véase Riesmeier y col., EMBO J. 11 (1992), 4705-4713), cortado con BamHI, rellenado y después cortado con NotI, se clonó el fragmento as1 a partir de pas1 (cortado por Asp718, rellenado y después cortado con NotI) (Figura 2).
pA7-as1
se produjo a partir de pA7 clonando la región de codificación de pas1 en forma de fragmento SmaI/Asp718 cuyos extremos protuberantes se han rellenado entre los sitios de corte de Asp718 y SmaI rellenados del vector. Se ensayó la orientación correcta del fragmento mediante un corte con HindIII que dio como resultado un fragmento de aprox. 1900 pb de tamaño. El pA7 es un derivado de pUC18 que contiene entre EcoRI y Asp718 el promotor de ARN de 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV, 528 pb, nt 6909-7437; Franck y col., Cell 21 (1980), 285-294), así como entre SphI e HindIII el terminador del gen de octopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens (Gielen y col., EMBO J., 3 (1984), 835-846) (Figura 3).
p35-as1
se produjo a partir de pBinAR ligando el fragmento as1 de pas1 (cortado con Asp718/NotI y después rellenado) en el vector cortado con SmaI. El pBinAR es un derivado de pBin19 (Bevan, Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711) que contiene entre EcoRI y Asp718 el promotor de ARN de 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV; 528 pb, nt 6909-7437; Franck y col., op. cit.), así como entre SphI e HindIII el terminador del gen de octopina sintasa de Agroabcterium tumefaciens (Gielen y col., op. cit.) (figura 4).
p35-s3-as1
se clonó en dos etapas. En primer lugar, se clonó un fragmento BamHI/Asp718 de pas1, cuyos extremos protuberantes se rellenaron con polimerasa T4, en el vector pS3, que se había cortado y rellenado anteriormente con BamHI. En este momento, se obtiene pS3-as1. El vector pS3 contiene un fragmento de PCR del gen de patatina B33 (Rosahl y col., Mol. Gen. Genet. 203 (1986), 214-220) que comprende los nucleótidos 725 a 1.400. El fragmento de PCR está dotado en el nt 725 con un sitio de corte de Asp718 (GGTACC) y en el nt 1.400 con una secuencia ATGG que da como resultado un sitio de corte de NcoI junto con los nt 1399 y 1400. El fragmento de PCR se inserta entre los sitios de corte de Asp718 y SmaI. Se preparó un fragmento SacI(relleno)/XbaI a partir de pS3-as1 que contiene la fusión S3-as1. Se clonó este fragmento entre los sitios de corte de SmaI y XbaI de pBinAR (Figura 5).
Se realizó la transformación de los hospedadores respectivos según procedimientos estándar. Se transformó E. coli según el procedimiento de Hanahan (J. Mol. Biol. 166 (1983), 557-580), se transformó Saccharomyces cerevisiae según el procedimiento de Dohmen y col., (Yeast 7 (1991), 691-692), se realizó la expresión génica transitoria en protoplastos de tabaco según el procedimiento de Damm y Willmitzer (Mol. Gen. Genet. 213 (1989), 15-20) y la transformación estable de plantas de patata según el procedimiento de Dietze y col. (en: Potrykus, I. y G. Spangenberg (ed.) "Gene transfer to plants", xxii+361 (1995), 24-29; Springer-Verlag: Berlín, Alemania; Nueva York, Nueva York, EE.UU., ISBN 3-540-58406-4).
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Ejemplo 3 Análisis de la actividad fructosiltransferasa de células u organismos hospedadores transgénicos que expresan fructosiltransferasas fúngicas Síntesis in vivo de inulina
Se cultivaron células u organismos hospedadores transgénicos que expresan fructosiltransferas fúngicas, a menos que se trate de tejidos vegetales, en medios con 2% de sacarosa. En el caso de Escherichia coli K12 como organismo hospedador, se incorporó un gen cscB funcional, que codifica la sacarosa permeasa de E. coli, como constructo al vector pACYC184. En el caso de Saccharomyces cerevisiae, se incorporó el gen del transportador de sacarosa de espinaca al vector p112AINE (Riesmeier y col., EMBO J. 11 (1992), 4705-4713). Se cultivaron las células al menos 24 horas en presencia de sacarosa, a continuación se recogieron y se disgregaron después de lavado en fosfato de sodio 50 mM a pH 6,0.
Se cultivaron en tierra plantas que expresaban fructosiltransferasas fúngicas. Después de 4 semanas, se tomaron muestras de hoja u otros tejidos, se disgregaron en 1 ml de agua/g de peso fresco en presencia de polivinilpirrolidona insoluble y se separaron por centrifugación los residuos celulares.
Se aplicaron respectivamente 4 \mul de los extractos a láminas listas de TLC de gel de sílice (Schleicher y Schüll, Dassel, Alemania) y se desarrollaron dos veces en acetona/agua (87:13). Se realizó la detección de los restos fructosilo con un reactivo de urea-ácido fosfórico (Röber y col., Planta 199 (1992), 528-536).
Síntesis in vitro de inulina
Se disgregaron células que expresaban fructosiltransferasas fúngicas en fosfato de sodio 50 mM a pH 6,0, PMSF 50 \muM, DTT 1 mM, 10% (v/v) de etilenglicol. Se incubaron extractos de las células en fosfato de sodio 50 mM a pH 6,0, sacarosa 500 mM, PMSF 50 \muM, DTT 1 mM, 0,02% (p/v) de NaN_{3}, 10% (v/v) de etilenglicol durante 12 h a 25ºC. Se diluyeron las preparaciones 1:10 en agua, se aplicaron después 4 \mul sobre láminas preparadas de TLC de gel de sílice (Schleicher y Schüll, Dassel, Alemania) y se desarrollaron dos veces en acetona/agua (87:13). Se realizó la detección de los restos fructosilo con un reactivo de urea-ácido fosfórico (Röber y col., op. cit.).
Se reproduce el resultado de los análisis respectivos en las Fig. 6 a 10. Las figuras muestran láminas de gel de sílice después de separación por cromatografía en capa fina de preparaciones de incubación u homogeneizados celulares y la coloración de azúcares que contienen fructosa. En la cromatografía en capa fina en acetona/agua (87:13), se separan los monómeros, oligómeros y polímeros de hidratos de carbono según su tamaño. La fructosa migra en este momento más que la sacarosa, que migra a su vez más que la kestosa y así. Los oligómeros a partir de un GP > 7 no se separan más y permanecen en el sitio de aplicación.
En la Figura 6, se observa que los clones de E. coli que se han transformado con un vector pBluescript vacío no pueden transformar sacarosa (carril 1), mientras que aquellos que se han transformado con el plásmido pas1, sintetizan el trisacárido kestosa. Los clones que se han transformado con el plásmido pSK-as1 pueden sintetizar también oligómeros superiores (carriles 3-6). Al mismo tiempo, tiene lugar una cesión catalizada por SFT de Aspergillus sydowi de restos de fructosa al agua, en la que se genera fructosa. En la Figura 7, se muestra que los extractos de proteína de levadura que se transforman con el plásmido 112-as1 pueden sintetizar fructanos. La actividad fructosiltransferasa en esta levadura es mayor que en aquellas que se han transformado con el constructo 112-as1L. Por último, puede sintetizarse sólo el trisacárido debido a la baja actividad fructosiltransferasa durante el tiempo disponible en el experimento. El tamaño de los fructanos sintetizados depende de la duración de la reacción y de la actividad fructosiltransferasa. La Figura 8 demuestra que el tamaño de los fructanos sintetizados en extractos a partir de protoplastos de tabaco transformados en el tiempo de reacción dado depende del valor de actividad fructosiltransferasa formada, que depende a su vez de la cantidad de plásmido pA7-as1 transformado. En los carriles 3-5, se observa que se generan oligómeros y polímeros con un GP > 7 que no se separan del sitio de aplicación en la cromatografía. Lo mismo es válido para extractos vegetales de plantas transformadas establemente como se muestra en las Figuras 9 y 10.
<110> Max Planck Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V.
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<120> Moléculas de ácido nucleico que codifican enzimas que poseen actividad fructosiltransferasa y su uso
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<130> C 1056 PCT
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<140>
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<141>
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<160> 10
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 2197
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<212> ADN
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<213> Aspergillus sydowi 
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<400> 1
100 
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<210> 2
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<211> 682
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<212> PRT
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<213> Aspergillus sydowi 
\newpage
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<400> 2
101
102
103 
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<210> 3
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<211> 11
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<212> PRT
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<213> Aspergillus sydowi 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
{}\hskip1cm104 
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<210> 4
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<211> 7
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<212> PRT
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<213> Aspergillus sydowi 
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<400> 4
{}\hskip1cm105 
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<210> 5
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> Aspergillus sydowi 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
{}\hskip1cm106 
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<210> 6
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<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
{}\hskip1cm107 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 7
{}\hskip1cm108 
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<210> 8
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<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
{}\hskip1cm109 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 9
{}\hskip1cm110 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
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<211> 17
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 10
{}\hskip1cm111

Claims (27)

1. Molécula de ácido nucleico que codifica una fructosiltransferasa seleccionada del grupo compuesto por:
(a)
moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína que comprende la secuencia aminoacídica dada en la SEC ID Nº 2;
(b)
moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia nucleotídica de la región de codificación dada por la SEC ID Nº 1 o una correspondiente secuencia ribonucleotídica;
(c)
moléculas de ácido nucleico que hibridan con la cadena complementaria de una de las moléculas de ácido nucleico citadas en (a) o (b) y que presentan una identidad de al menos un 60% con la molécula de ácido nucleico citada en (a) o (b); y
(d)
moléculas de ácido nucleico cuya secuencia nucleotídica se desvía de la secuencia de una de las moléculas de ácido nucleico citadas en (c) debido a la degeneración del código genético;
así como las moléculas de ácido nucleico complementarias de estas.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, que es una molécula de ADN o ARN.
3. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1 ó 2, que codifica un polipéptido de un hongo.
4. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 3, en la que el hongo es del género Aspergillus.
5. Vector que contiene una molécula de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 4.
6. Vector según la reivindicación 5, en el que la molécula de ácido nucleico se liga operativamente con elementos reguladores que garantizan la transcripción y síntesis de un ARN traducible en células procarióticas y/o eucarióticas.
7. Vector según la reivindicación 6, en el que la molécula de ácido nucleico contiene una región que codifica una secuencia señal que influye en la localización intracelular o extracelular de la fructosiltransferasa.
8. Célula hospedadora que contiene una molécula de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 4 o un vector según una de las reivindicaciones 5 a 7, en la que la molécula de ácido nucleico es heteróloga con respecto a la célula hospedadora.
9. Célula hospedadora según la reivindicación 8 que es una célula bacteriana o célula fúngica.
10. Célula vegetal que contiene una molécula de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 4 o un vector según una de las reivindicaciones 5 a 7, en la que la molécula de ácido nucleico es heteróloga con respecto a la célula vegetal.
11. Procedimiento para la preparación de una planta, en el que
(a)
se modifica por ingeniería genética una célula vegetal mediante la introducción de una molécula de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 4 y/o un vector según una de las reivindicaciones 5 a 7, en el que la molécula de ácido nucleico es heteróloga respecto a la célula; y
(b)
se regenera una planta a partir de la célula; y dado el caso
(c)
se obtienen plantas adicionales a partir de la planta según (b).
\vskip1.000000\baselineskip
12. Planta que contiene células vegetales según la reivindicación 10.
13. Planta según la reivindicación 12 que es una planta útil.
14. Material de propagación de una planta según la reivindicación 12 ó 13, en el que el material de propagación contiene células vegetales según la reivindicación 10.
15. Partes de planta cosechables de una planta según la reivindicación 12 ó 13, en las que las partes de planta contienen células vegetales según la reivindicación 10.
16. Piensos y/o alimentos que contienen partes de planta cosechables según la reivindicación 15.
17. Procedimiento para la preparación de células hospedadoras según la reivindicación 8 ó 9, en el que se transforman células adecuadas con una molécula de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 4 o con un vector según una de las reivindicaciones 5 a 7.
18. Procedimiento para la preparación de una fructosiltransferasa en el que se cultiva una célula hospedadora según la reivindicación 8 ó 9 o una parte de planta según la reivindicación 10 en condiciones que permiten la síntesis de fructosiltransferasa y se aísla la fructosiltransferasa de las células cultivadas y/o del medio de cultivo.
19. Fructosiltransferasa codificada mediante una molécula de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 4 u obtenible según el procedimiento según la reivindicación 18.
20. Molécula de ácido nucleico que codifica una fructosiltransferasa que hibrida específicamente con una molécula de ácido nucleico según una de las reivindicaciones 1 a 4 o una cadena complementaria de la misma, en la que la hibridación se realiza en las siguientes condiciones:
hibridación en 50% de formamida, 5 x SSC, 5 x disolución de Denhardt, fosfato de sodio 40 mM a pH 6,8; 0,5% (p/v) de BSA, 1% (p/v) de SDS, ADN de esperma de salmón 0,1 mg/ml a una temperatura de hibridación de 42ºC y posteriormente lavado del filtro en 0,5 x SSC/0,5% de SDS a 60ºC.
21. Procedimiento para la preparación de polifructosa, particularmente aquella de tipo inulina, que comprende:
(a)
el cultivo de una célula hospedadora según la reivindicación 8 ó 9, o de uno de dichos hospedadores que contienen células, en condiciones que permiten la producción de fructosiltransferasa y la reacción de sacarosa añadida dado el caso desde fuera, o un sustrato equivalente, hasta polifructosa de tipo inulina; y
(b)
la obtención de la polifructosa así preparada a partir de las células hospedadoras cultivadas, hospedadores o a partir del medio.
\vskip1.000000\baselineskip
22. Procedimiento para la preparación de polifructosa, particularmente aquella de tipo inulina, que comprende:
(a)
la puesta en contacto de sacarosa o un sustrato equivalente con una fructosiltransferasa según la reivindicación 19 en condiciones que permiten la reacción hasta polifructosa; y
(b)
la obtención de la polifructosa así preparada.
\vskip1.000000\baselineskip
23. Procedimiento para la preparación de polifructosa, particularmente de aquella de tipo inulina, que comprende la etapa de extracción de polifructosa a partir de una célula vegetal según la reivindicación 10, a partir de una planta según la reivindicación 12 ó 13, o a partir de partes de una de dichas plantas.
24. Procedimiento para la preparación de tensioactivos, que comprende las etapas de procedimiento (a) y (b) del procedimiento según la reivindicación 21 ó 22 o la etapa de extracción del procedimiento según la reivindicación 23.
25. Uso de células hospedadoras según la reivindicación 8 ó 9 o de células vegetales según la reivindicación 10 como aditivos alimentarios.
26. Uso de fructosiltransferasa según la reivindicación 19 para la preparación de polifructosa, particularmente aquella de tipo inulina.
27. Uso de polifructosa preparada mediante un procedimiento según una de las reivindicaciones 21 a 23 para la preparación de tensioactivos, para la elevación de la viscosidad de sistemas acuosos, como detergente, como agente de suspensión, para la aceleración de la sedimentación y complejación o para la unión de agua.
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