ES2311789T3

ES2311789T3 - Composiciones liofilizadas estabilizadas que comprenden inhibidor de la via del factor tisular o variantes del inhibidor de la via del factor tisular.

Info

Publication number: ES2311789T3
Application number: ES04700827T
Authority: ES
Inventors: Bao-Lu Chen; Maninder Hora
Original assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 2003-01-08
Filing date: 2004-01-08
Publication date: 2009-02-16
Anticipated expiration: 2024-01-08
Also published as: ATE404176T1; US20040180827A1; JP2008500942A; EP1589949B1; DE602004015725D1; US20060159679A1; EP1589949A1; WO2004062646A1; PT1589949E; CA2512680A1; WO2004062646A9

Abstract

Una composición liofilizada que comprende TFPI o ala-TFPI, en la que antes de la liofilización el TFPI o ala- TFPI está presente en una formulación acuosa seleccionada entre el grupo de formulaciones constituido por: arginina al 3% (p/v), manitol al 4% (p/v), y citrato sódico 10 mM, con un pH de 6; arginina al 3% (p/v), glicina al 2% (p/v), y citrato sódico 10 mM, con un pH de 6; sacarosa al 1% (p/v), manitol al 4% (p/v), y L-histidina 10 mM, con un pH de 6; sacarosa al 1% (p/v), glicina al 2% (p/v), e histidina 10 mM, con un pH de 6; sacarosa al 1% (p/v), manitol al 4% (p/v), e imidazol 10 mM, con un pH de 6,5; y sacarosa al 1% (p/v), glicina al 2% (p/v), e imidazol 10 mM, con un pH de 6,5.

Description

Composiciones liofilizadas estabilizadas que comprenden inhibidor de la vía del factor tisular o variantes del inhibidor de la vía del factor tisular.

Campo de la invención

La invención se refiere en líneas generales al campo de la formulación estabilizada de proteínas. Más específicamente, la invención se refiere a composiciones liofilizadas estabilizadas de inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI) y variantes de TFPI.

Antecedentes de la invención

El inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI) es de 276 aminoácidos de longitud y funciona como un inhibidor de la coagulación sanguínea mediada por el factor tisular. Su secuencia de aminoácidos se muestra en la SEC ID Nº 1. El extremo amino terminal de TFPI está cargado negativamente, y el extremo carboxi terminal está cargado positivamente. La proteína TFPI contiene tres dominios inhibidores enzimáticos tipo Kunitz. TFPI contiene 18 restos de cisteína y forma 9 puentes disulfuro cuando se pliega correctamente. La secuencia primaria contiene tres sitios de glicosilación consenso unidos a N (Asn-X-Ser/Thr). Los restos de asparagina de los sitios de glicosilación están localizados en las posiciones 145, 195 y 256. TFPI también se conoce como inhibidor de coagulación asociado a lipoproteína (LACI), inhibidor del factor tisular (TFI), y inhibidor de la vía extrínseca (EPI).

El uso de TFPI se ha propuesto para el tratamiento de diversas indicaciones, incluyendo sepsis (documentos U.S. 6.063.764 y WO 93/24143), trombosis venosa profunda (documentos U.S. 5.563.123, U.S. 5.589.359, y WO 96/04378), isquemia (documentos U.S. 5.885.781, U.S. 6.242.414, y WO 96/40224), reestenosis (documentos U.S. 5.824.644 y WO 96/01649), y cáncer (documentos U.S. 5.902.582 y WO 97/09063). Una variante de TFPI, que difiere de TFPI por la adición de un resto de alanina en el extremo amino terminal ("ala-TFPI"), ha demostrado ser eficaz en modelos animales para el tratamiento de sepsis. Carr y col., Circ Shock 1994 Nov; 44(3):126-37.

TFPI es una proteína hidrófoba con solubilidad limitada en soluciones acuosas. La agregación de TFPI en solución se ha correlacionado con pérdida de actividad biológica. Se han fabricado diversas formulaciones; véanse, por ejemplo, los documentos U.S 5.888.968 y WO 96/40784. Existe, sin embargo, una necesidad continuada en la técnica de composiciones estabilizadas de TFPI o variantes de TFPI. 17.

Breve sumario de la invención

La invención proporciona una composición liofilizada de acuerdo con las reivindicaciones. La composición liofilizada de TFPI o variante de TFPI comprende (1) TFPI o variante de TFPI y (2) un agente formador de vidrio de carbohidrato o aminoácido. La composición liofilizada puede tener aproximadamente un 45% o más estabilidad de agregación.

Antes de la liofilización el TFPI o variante de TFPI puede estar presente en una formulación acuosa que comprende un agente formador de vidrio de carbohidrato o aminoácido, donde la formulación acuosa tiene un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 8.

Una composición liofilizada de TFPI o variante de TFPI puede prepararse por el siguiente procedimiento. El procedimiento comprende la etapa de liofilizar una formulación acuosa que comprende (1) TFPI o variante de TFPI y (2) un agente formador de vidrio de carbohidrato o aminoácido, donde la formulación acuosa tiene un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 8, por lo cual se forma una composición liofilizada del TFPI o variante de TFPI que tiene aproximadamente un 45% o más de estabilidad de agregación.

La preparación de una composición de TFPI o variante de TFPI para liofilización puede asistirse por el siguiente procedimiento. El procedimiento comprende la etapa de retirar un caótropo de una primera formulación que comprende (1) TFPI o variante de TFPI y (2) el caótropo para formar una segunda formulación que comprende el TFPI o variante de TFPI y está esencialmente libre del caótropo, donde la segunda formulación tiene un pH de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 4,5. 19. El caótropo puede ser urea. En algunas realizaciones, la segunda formulación tiene un pH de aproximadamente 4. La primera formulación puede comprender arginina aproximadamente 300 mM y citrato sódico aproximadamente 20 mM con un pH de aproximadamente 5,5; urea aproximadamente 2 M, cloruro sódico aproximadamente 150 mM, y fosfato sódico aproximadamente 20 mM con un pH de aproximadamente 7,2; urea aproximadamente 2 M, cloruro sódico aproximadamente 250 mM, y fosfato sódico aproximadamente 20 mM con un pH de aproximadamente 7,2; o urea aproximadamente 1 M, cloruro sódico aproximadamente 125 mM, y fosfato sódico aproximadamente 10 mM con un pH de aproximadamente 7. La segunda formulación puede comprender arginina aproximadamente 300 mM y citrato sódico aproximadamente 20 mM con un pH de aproximadamente 5,5; sacarosa aproximadamente al 1% (p/v), manitol aproximadamente al 4% (p/v), histidina aproximadamente 10 mM con un pH de aproximadamente 6; sacarosa aproximadamente al 1% (p/v), manitol aproximadamente al 4% (p/v), y glutamato aproximadamente 10 mM con un pH de aproximadamente 4; o arginina aproximadamente al 3% (p/v), manitol aproximadamente al 4% (p/v), e histidina aproximadamente 10 mM con un pH de aproximadamente 6. La etapa de retirada puede realizarse por al menos un procedimiento seleccionado entre el grupo constituido por diafiltración, diálisis, y cromatografía por exclusión de tamaño.

La preparación de una composición de TFPI o variante de TFPI para liofilización puede asistirse por el siguiente procedimiento. El procedimiento comprende la etapa de remplazar un soluto de bajo peso molecular de la primera formulación en una primera formulación que comprende (1) TFPI o variante de TFPI y (2) el soluto de bajo peso molecular de la primera formulación con un soluto de bajo peso molecular de la segunda solución para formar una segunda formulación, donde la segunda formulación tiene un pH de aproximadamente 3,5 a aproximadamente 4,5. El procedimiento puede comprender la etapa de remplazar el soluto de la segunda formulación con un soluto de la tercera formulación para forma una tercera formulación. La etapa de reemplazo puede realizarse por diafiltración. La tercera formulación puede ser una formulación farmacéuticamente aceptable. La etapa de reemplazo del soluto de la segunda formulación puede realizarse por un procedimiento seleccionado entre el grupo constituido por diafiltración, diálisis, y cromatografía por exclusión de tamaño. Si se desea, la tercera formulación puede comprender sacarosa aproximadamente al 1% (p/v), manitol aproximadamente al 4% (p/v), e histidina aproximadamente 10 mM con un pH de aproximadamente 6; y sacarosa aproximadamente al 1% (p/v), manitol aproximadamente al 4% (p/v), e imidazol aproximadamente 10 mM con un pH de aproximadamente 6,5.

La composición liofilizada de TFPI o variante de TFPI puede comprender (1) TFPI o variante de TFPI y (2) un tampón citrato, donde la composición liofilizada tiene aproximadamente un 45% o más de solubilidad de agregación.

La composición liofilizada de TFPI o variante de TFPI puede comprender (1) TFPI o variante de TFPI, (2) sulfato, y (3) un tampón fosfato, donde la composición liofilizada tiene aproximadamente un 45% o más de solubilidad de agregación.

Una composición liofilizada de TFPI o variante de TFPI puede prepararse por el siguiente procedimiento. El procedimiento comprende la etapa de liofilizar una formulación acuosa seleccionada entre el grupo constituido por TFPI o variante de TFPI y un tampón citrato; y TFPI o variante de TFPI, sulfato, y un tampón fosfato, por lo cual se forma una composición liofilizada del TFPI o variante de TFPI que tiene aproximadamente un 45% o más de solubilidad de agregación.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 muestra cromatogramas de cromatografía líquida de alta resolución de intercambio catiónico de ala-TFPI para ensayar la estabilidad de muestras preparadas en formulación acuosa a pH 7. Las formulaciones acuosas contenían 150 \mug/ml de ala-TFPI, fosfato sódico 10 mM a pH 7, NaCl 150 mM y polisorbato-80 al 0,015% (p/v). Las formulaciones acuosas se almacenaron a 40ºC durante 0, 3, 5, 10, ó 20 días (de la parte superior a la parte inferior, respectivamente).

La Fig. 2 muestra la constante de velocidad de primer orden para la pérdida de ala-TFPI soluble como función del pH a 40ºC en formulaciones acuosas. Las formulaciones acuosas contenían 150 \mug/ml de ala-TFPI, fosfato sódico 10 mM, NaCl 150 mM y polisorbato-80 al 0,015% (p/v).

La Fig. 3 muestra cromatogramas de cromatografía líquida de alta resolución de intercambio catiónico de ala-TFPI para ensayar la estabilidad de muestras preparadas en formulación acuosa a pH 4. Las formulaciones acuosas contenían 150 \mug/ml de ala-TFPI, fosfato sódico 10 mM a pH 4, NaCl 150 mM y polisorbato-80 al 0,015% (p/v). Las formulaciones acuosas se almacenaron a 40ºC durante 0, 3, 5, 10, ó 20 días (de la parte superior a la parte inferior, respectivamente).

La Fig. 4 muestra cromatogramas de cromatografía líquida de alta resolución de intercambio catiónico de ala-TFPI para ensayar la estabilidad de muestras preparadas en formulación acuosa a diversos valores de pH. Las formulaciones acuosas contenían 150 \mug/ml de ala-TFPI, fosfato sódico 10 mM, NaCl 150 mM y polisorbato-80 al 0,015% (p/v). Las formulaciones acuosas se almacenaron a 40ºC durante 10 días. Los valores de pH son pH 4, 5, 6 ó 7 (de la parte superior a la parte inferior, respectivamente).

La Fig. 5 muestra cromatogramas de cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa para los efectos de polifosfato sobre la estabilidad de ala-TFPI. Las formulaciones acuosas contenían 5 mg/ml de ala-TFPI, L-histidina 10 mM a pH 7 y 2,5 mg/ml de polifosfato. Las formulaciones acuosas se almacenaron durante tres meses a 40ºC, 30ºC o -70ºC (de la parte superior a la parte inferior, respectivamente).

La Fig. 6A muestra cromatogramas de cromatografía líquida de alta resolución de intercambio catiónico de muestras de ala-TFPI preparadas como composición liofilizadas. Estas composiciones liofilizadas contenían 0,5 mg/ml de ala-TFPI, L-histidina 10 mM a pH 6, manitol al 4% (p/v) y sacarosa al 1% (p/v). Las composiciones liofilizadas se almacenaron durante tres meses a 50ºC, 40ºC, 30ºC o -70ºC (de la parte superior a la parte inferior, respectivamente).

La Fig. 6B muestra cromatogramas de cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa de muestras de ala-TFPI preparadas como composiciones liofilizadas. Estas composiciones liofilizadas contenían 0,5 mg/ml de ala-TFPI, L-histidina 10 mM a pH 6, manitol al 4% (p/v) y sacarosa al 1% (p/v). Las composiciones liofilizadas se almacenaron durante tres meses a 50ºC, 40ºC, 30ºC o -70ºC (de la parte superior a la parte inferior, respectivamente).

La Fig. 6C muestra cromatogramas de cromatografía líquida de alta resolución de exclusión de tamaño de muestras de ala-TFPI preparadas como composiciones liofilizadas. Estas composiciones liofilizadas contenían 0,5 mg/ml de ala-TFPI, L-histidina 10 mM a pH 6, manitol al 4% (p/v) y sacarosa al 1% (p/v). Las composiciones liofilizadas se almacenaron durante tres meses a 50ºC, 40ºC, 30ºC o -70ºC (de la parte superior a la parte inferior, respectivamente).

La Fig. 7A muestra cromatogramas de cromatografía líquida de alta resolución de intercambio catiónico de ala-TFPI para ensayar la estabilidad de muestras preparadas como diversas composiciones liofilizadas (formulaciones 2, 4, 13, 15 y 17). Véase la Tabla 4 para las composiciones de formulación. Las composiciones liofilizadas se almacenaron durante 6 meses a 50ºC.

La Fig. 7B muestra cromatogramas de cromatografía líquida de alta resolución de intercambio catiónico de ala-TFPI para ensayar la estabilidad de muestras preparadas como diversas composiciones liofilizadas (formulaciones 2, 4, 13, 15 y 17). Véase la Tabla 4 para las composiciones de formulación. Las composiciones liofilizadas se almacenaron durante 6 meses a 2-8ºC.

La Fig. 8 muestra cromatogramas de cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa de ala-TFPI para ensayar la estabilidad de muestras preparadas como composiciones liofilizadas. Las composiciones liofilizadas contenían 5 mg/ml de ala-TFPI, L-histidina 10 mM a pH 7, manitol al 4% (p/v), sacarosa al 1% (p/v) y 2,5 mg/ml de polifosfato. Las composiciones liofilizadas se almacenaron durante tres meses a 50ºC, 40ºC o -70ºC (de la parte superior a la parte inferior, respectivamente).

La Fig. 9 muestra una comparación de estabilidad de formulaciones liofilizadas de ala-TFPI en comparación con formulaciones acuosas de ala-TFPI de elevada concentración. El gráfico muestra el porcentaje de ala-TFPI soluble restante después de almacenamiento a 50ºC.

La Fig. 10 muestra el registro de temperatura para secar por congelación composiciones que contienen ala-TFPI y diversas formulaciones de polifosfato. La línea continua indica la temperatura en almacenamiento durante el transcurso del secado por congelación. La línea de puntos indica la temperatura promedio de la formulación medida por cuatro sondas de temperatura insertadas en las formulaciones de ala-TFPI/polifosfato en viales de 5 cc.

La Fig. 11 muestra el porcentaje de ala-TFPI soluble restante después de incubación a 50ºC durante hasta seis meses. Las formulaciones acuosas contenían diversas cantidades de ala-TFPI en citrato sódico 20 mM a pH 5,5 y arginina 300 mM. Después de incubación a 50ºC durante los tiempos indicados, se ensayó ala-TFPI soluble por HPLC de intercambio catiónico para determinar la cantidad de ala-TFPI soluble restante en solución.

Fig. 12. Representaciones de supervivencia de Kaplan-Meier. Eje X, supervivencia; eje Y, tiempo (horas).

Descripción detallada de la invención

Los tampones de elevado pH favorecen la agregación de TFPI o variantes de TFPI en composiciones acuosas. La agregación de un TFPI o variante de TFPI causa la desnaturalización e inactivación de la molécula. Los tampones de bajo pH causan la hidrólisis catalizada por ácido de TFPI o variantes de TFPI en composiciones acuosas. Por tanto, el intervalo de pH óptimo para composiciones acuosas estables de TFPI o variantes de TFPI es de aproximadamente pH 4 a aproximadamente pH 8. Una composición de TFPI o variante de TFPI que tiene un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 8 y que contiene un agente formador de vidrio puede liofilizarse para producir una composición altamente estable.

La liofilización ("secado por congelación") es la retirada de agua de una formulación. La liofilización puede realizarse por cualquier procedimiento conocido en la técnica, por ejemplo, por el uso de un Hull Freeze Dryer, descrito a continuación. La retirada de agua evita que sucedan reacciones de degradación dependientes de agua. Dichas reacciones incluyen, por ejemplo, hidrólisis de enlaces peptídicos y desamidación.

Las composiciones liofilizadas de la invención pueden prepararse liofilizando una formulación acuosa que comprende aproximadamente 10 mg/ml o menos de TFPI o variante de TFPI (es decir,10, 7,5, 5, 2,5, 1, 0,5, ó 0,2 mg/ml o menos) y un agente formador de vidrio. La formulación acuosa antes de la liofilización preferiblemente tiene un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 8 (es decir,4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, o 8), más preferiblemente un pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 8, incluso más preferiblemente un pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 7, aún más preferiblemente un pH de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,5, e incluso más preferiblemente un pH de aproximadamente 6. Opcionalmente, la formulación acuosa puede comprender un tampón y/o uno o más agentes formadores de cristales.

Pueden prepararse otros TFPI y composiciones de TFPI liofilizando una formulación acuosa que comprende el TFPI o variante de TFPI y (a) un tampón citrato, (b) una mezcla de sulfato y un tampón fosfato, o (c) sulfato y un tampón que tiene un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 8. Los componentes de las composiciones liofilizadas se describen por separado, a continuación.

Un producto liofilizado preferido contiene 20 mg/ml de TFPI o variante de TFPI, 10 mg/ml de polifosfato, L-histidina 10 mM a pH 7, manitol al 4%, y sacarosa al 1%.

Estabilidad de agregación de composiciones liofilizadas

Las composiciones liofilizadas de la invención tienen aproximadamente un 45% o más de solubilidad de agregación. El "porcentaje de solubilidad de agregación" se refiere a la proporción de una muestra de TFPI o variante de TFPI que es soluble medida en un ensayo de estabilidad acelerada a 40ºC. En un ensayo de estabilidad acelerada a 40ºC, se incuba una muestra de TFPI o variante de TFPI durante tres meses a 40ºC. Después de la incubación, la muestra de TFPI o variante de TFPI liofilizada se reconstituye con agua estéril, se filtra a través de un filtro de 0,2 \mum, y se somete a un ensayo de cromatografía líquida de alta resolución de intercambio catiónico (CEX-HPLC) para determinar la cantidad de TFPI o variante de TFPI soluble restante en solución. A continuación se describe un ensayo de CEX-HPLC. Por tanto, por ejemplo, una composición de TFPI o variante de TFPI que tiene una solubilidad de agregación del 60% es una composición en la que el 60% del TFPI o variante de TFPI es soluble medido en el ensayo de estabilidad acelerada a 40ºC. Una composición de TFPI o variante de TFPI que tiene una solubilidad de agregación del 80% es una composición en la que el 80% del TFPI o variante de TFPI es soluble medido en el ensayo de estabilidad acelerada a 40ºC. El porcentaje de solubilidad de agregación de composiciones de TFPI o variante de TFPI de la invención preferiblemente es de aproximadamente el 45, 50, 60, 70, o 75% o mayor, más preferiblemente de aproximadamente el 80, 82, 84, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, o 99% o mayor medido en el ensayo de estabilidad acelerada a 40ºC y puede variar, por ejemplo, de aproximadamente el 45% o mayor a aproximadamente el 90% o mayor, de aproximadamente el 45% o mayor a aproximadamente el 96% o mayor, del 50% o mayor a aproximadamente el 99% o mayor, de aproximadamente el 50% o mayor a aproximadamente el 70% o mayor, de aproximadamente 60% o mayor a aproximadamente el 80% o mayor, de aproximadamente el 70% o mayor a aproximadamente el 95% o mayor, o de aproximadamente el 85% o mayor a aproximadamente el 96% o mayor medido en el ensayo de estabilidad acelerada a 40ºC. Preferiblemente, el TFPI o variante de TFPI en composiciones acuosas de la invención se biológicamente activo, determinado, por ejemplo, por un ensayo de tiempo de protrombina, como se describe a continuación.

Temperatura de almacenamiento

Las temperaturas de almacenamiento para composiciones de la invención pueden variar de aproximadamente
-70ºC a aproximadamente 25ºC (por ejemplo, aproximadamente -70, -60, -50, -40, -30, -20, -10, 0, 5, 10, 15, 20, ó 25ºC). Preferiblemente, las composiciones liofilizadas de la invención se almacenan a aproximadamente 25ºC.

TFPI y variantes de TFPI

TFPI es un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 1. Preferiblemente, TFPI es una proteína humana recombinante generada en un huésped microbiano. TFPI se caracteriza adicionalmente y se describe con respecto a su actividad biológica en el documento WO 01/24814.

Las variantes de TFPI incluyen análogos y derivados de TFPI, así como fragmentos de TFPI, Análogos de TFPI, y Derivados de TFPI. Las variantes de TFPI pueden obtenerse de fuentes humanas u otras fuentes de mamífero, sintetizarse, u obtenerse por técnicas recombinantes. Los análogos son Moléculas de TFPI con una o más sustituciones, inserciones, deleciones y/o adiciones de aminoácidos. Se prefieren las sustituciones conservativas, en las que se intercambia un aminoácido por otro que tiene propiedades similares. Los ejemplos de sustituciones conservativas incluyen, aunque sin limitación, Gly<=>Ala, Val<=>Ile<=>Leu, Asp<=>Glu, Lys<=>Arg, Asn<=>Gln, y Phe<=>Trp<=>Tyr. Típicamente están en el intervalo de aproximadamente 1 a 5 aminoácidos (es decir,1, 2, 3, 4 ó 5 aminoácidos). Pueden añadirse aminoácidos adicionales en cualquier posición en la molécula, particularmente en el extremo amino o carboxi terminal. Por ejemplo, un análogo de TFPI, N-L-alanil-TFPI ("ala-TFPI"), tiene un resto de alanina adicional en el extremo amino termina. Las adiciones de aminoácidos pueden ser 1, 2, 5, 10, 25, 100, o más aminoácidos adicionales. Las proteínas de fusión se incluyen dentro de la definición.

Los fragmentos son partes de TFPI, análogos de TFPI, o derivados de TFPI. Los ejemplos de fragmentos incluyen los dominios Kunitz 1, 2 ó 3, los dominios Kunitz 1 y 2 ó 2 y 3, o deleciones del extremo N-terminal, C-terminal o ambos. Se encuentran directrices sustanciales para preparar variantes en el documento U.S. 5.106.833. Los fragmentos de TFPI comprenden al menos 20 aminoácidos consecutivos de la SEC ID Nº 1. Por ejemplo, un fragmento puede ser de 20, 25, 30, 50, 100, 150, 200, 250, ó 275 aminoácidos consecutivos de longitud. Los fragmentos de TFPI que no tienen actividad biológica se describen en el documento U.S. 5.106.833. El uso de dichos fragmentos en la presente invención también se contempla.

Los derivados se definen como TFPI, análogos de TFPI, o fragmentos de TFPI que tienen restos adicionales. Los ejemplos de dichas adiciones incluyen glicosilación, fosforilación, acetilación, o amidación.

El porcentaje de homología entre una variante de TFPI y la SEC ID Nº 1 se determina usando el programa de alineación Blast2 (Blosum62, Esperado 10, códigos genéticos convencionales, abrir hueco 11, extensión de hueco 1, disminución x de hueco 50, y filtro de baja complejidad). Las variantes de TFPI generalmente tendrán al menos aproximadamente un 70%, preferiblemente al menos aproximadamente un 80%, más preferiblemente al menos aproximadamente un 90% a un 95% (es decir,90, 91, 92, 93, 94, o 95%) o más, y mucho más preferiblemente al menos aproximadamente un 98% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con SEC ID Nº 1.

Las variantes de secuencia de aminoácidos de TFPI pueden prepararse haciendo alteraciones en una secuencia de ADN que codifica TFPI. Los procedimientos para hacer alteraciones en la secuencia de nucleótidos son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Walker y Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, Nueva York), Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492, Kunkel y col. (1987) Methods Enzymol. 154:367-382, Sambrook y col. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, Nueva York), documento U.S. 4.873.192.

Las variantes de TFPI preferiblemente tienen una cantidad sustancial de actividad biológica, por ejemplo un 10%, 30%, 50%, 60%, 80%, 90% o más de la actividad biológica de TFPI medida en el ensayo PT descrito a continuación. Obviamente, cualquier alteración hecha en el ADN que codifica una variante de TFPI no debe colocar la secuencia fuera de la fase de lectura y preferiblemente no creará regiones complementarias que podrían producir estructura de ARNm secundaria. Las directrices para determinar qué restos aminoacídicos pueden sustituirse, insertarse, o delecionarse sin eliminar la actividad biológica o inmunológica de TFPI o variante de TFPI pueden encontrarse usando programas informáticos bien conocidos en la técnica, tales como el software DNASTAR, o en Dayhoff y col. (1978) en Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.). También se contempla la estabilización de variantes de TFPI que no son biológicamente activas.

TFPI o las variantes de TFPI pueden producirse de forma recombinante como se muestra en el documento U.S. 4.966.852. Por ejemplo, puede incorporarse un ADNc para la proteína deseada en un plásmido para la expresión en procariotas o eucariotas. Hay muchas referencias conocidas para los especialistas en la técnica que proporcionan detalles sobre la expresión de proteínas usando microorganismos. Véase el documento U.S. 4.847.201 y Maniatas y col., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, Nueva York).

Está disponible una diversidad de técnicas para transformar microorganismos y usar el microorganismo transformado para expresar TFPI o variantes de TFPI. A continuación hay simplemente ejemplos de posibles enfoques. Las secuencias de ADN de TFPI o variante de TFPI pueden conectarse a secuencias de control apropiadas. Las secuencias de ADN de TFPI o variante de TFPI pueden incorporarse en un plásmido, tal como pUC13 o pBR322, que están disponibles en el mercado en compañías tales como Boehringer-Mannheim. Una vez que el ADN de TFPI o variante de TFPI se ha insertado en un vector, puede clonarse en un huésped adecuado. El ADN puede amplificarse por técnicas tales como las mostradas en los documentos U.S. 4.683.202 y U.S. 4.683.195. El ADNc puede obtenerse induciendo células, tales como células de hepatoma HepG2 o SKHep, a fabricar el ARNm, después identificando y aislando el ARNm y transcribiéndolo de forma inversa para obtener el ADNc. Después de se haya introducido por transformación el vector de expresión en un huésped tal como E. coli, las bacterias pueden cultivarse y expresarse la proteína. Las bacterias son microorganismo procariotas preferidos, y E. coli es especialmente preferida. Un microorganismo preferido útil en la presente invención es E. coli K-12, cepa MM294 depositada según las disposiciones del Tratado de Budapest el 14 de febrero, 1984 en la American Type Culture Collection, ahora localizada en 10801 University Blvd., Manassas, Virginia (Número de Acceso 39607).

Puede producirse TFPI o variantes de TFPI en bacterias o levaduras y purificarse posteriormente. Generalmente, pueden emplearse procedimientos que se muestran en los documentos U.S. 5.212.091, U.S. 6.063.764, y U.S. 6.103.500 o WO 96/40784. TFPI o variantes de TFPI pueden purificarse, solubilizarse, y replegarse de acuerdo con el documento WO 96/40784 y Gustafson y col., Prot. Express. Pur. 5:233 (1994). Por ejemplo, cuando se prepara de acuerdo con el Ejemplo 9 del documento WO 96/40784, se obtienen preparaciones de ala-TFPI que contienen de aproximadamente el 85% al 90% de la proteína total en peso como ala-TFPI biológicamente activo.

Agentes formadores de vidrio

Un "agente formador de vidrio" es un agente químico con la capacidad de formar vidrio por debajo de una temperatura crítica, la temperatura de transición vítrea (Tg). Si un agente formador de vidrio se liofiliza por debajo de su Tg, se formará vidrio y permanecerá en la composición liofilizada. Sin embargo, si el agente formador de vidrio se liofiliza por encima de la Tg, entonces no se formará vidrio. Durante la formación de vidrio, las proteínas llegan a incluirse dentro de la estructura del vidrio. Los agentes formadores de vidrio adecuados para su uso con la presente invención incluyen, aunque sin limitación, polímeros cargados, monosacáridos, disacáridos, trisacáridos, y aminoácidos de origen natural. Se prefieren agentes formadores de vidrio de carbohidrato y aminoácido. También se contempla una combinación de agentes formadores de vidrio dentro de una única formulación.

Un "polímero cargado" es cualquier compuesto formado por una estructura de unidades estructurales repetitivas unidas de modo lineal o no lineal, algunas de las cuales contienen grupos químicos cargados positivamente o negativamente. Las unidades estructurales repetitivas pueden ser orgánicas o inorgánicas. Las unidades repetitivas pueden variar de dos a varios millones.

Los polímeros cargados adecuados para su uso como agentes formadores de vidrio incluyen, aunque sin limitación, polifosfato, heparinas, sulfatos de dextrano, agaropectinas, ácidos algínicos, carboximetilcelulosas, compuestos poliinorgánicos, poliaminoácidos, poliaspartatos, poliglutamatos, polihistidinas, compuestos poliorgánicos, DEAE dextranos, aminas poliorgánicas, polietileniminas, polietilenimina celulosas, poliaminas, polilisinas, y poliargininas.

Un "polifosfato" es un polímero que consta de unidades repetitivas de ortofosfato unido en un enlace fosfo anhídrido. La cantidad de unidades repetitivas puede variar de dos (pirofosfato) a varios miles. Polifosfato frecuentemente se menciona como hexametafosfato sódico (SHMP). Otros nombres comunes incluyen sal de Grahams, calgón, vidrio de fosfato, tetrametafosfato sódico, y H vítreo.

Los monosacáridos usados como agentes formadores de vidrio incluyen, aunque sin limitación, glicolaldehído, gliceraldehído, eritrosa, treosa, ribosa, lixosa, xilosa, arabinosa, alosa, talosa, gulosa, manosa, glucosa, idosa, galactosa, altrosa, dihidroxiacetona, eritrosa, ribulosa, xilocetosa, psicosa, tagatosa, sorbosa, y fructosa. También pueden usarse monosacáridos sulfatados.

Dos monosacáridos unidos juntos forman un disacárido. Los dos monosacáridos usados para formar un disacárido pueden ser iguales o diferentes. Los ejemplos de disacáridos que pueden usarse como agentes formadores de vidrio incluyen, sacarosa, trehalosa, lactosa, maltosa, isomaltosa, gentiobiosa, laminaribiosa, y celobiosa. También pueden usarse disacáridos sulfatados.

Tres monosacáridos unidos juntos forman un trisacárido. Los monosacáridos usados para forma un trisacárido pueden ser iguales o diferentes. Los ejemplos de trisacáridos adecuados para su uso como agentes formadores de vidrio incluyen, rafinosa y melezitosa. También pueden usarse trisacáridos sulfatados.

Los aminoácidos de origen natural adecuados para su uso como agentes formadores de vidrio en la presente invención incluyen, aunque sin limitación, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, tirosina, triptófano, fenilalanina, lisina, serina, treonina, ácido aspártico, ácido glutámico, asparagina, glutamina, prolina, cisteína, histidina, arginina, y cualquier combinación de los mismos. Los aminoácidos pueden ser estereoisómeros L o D. Se prefieren L-aminoácidos.

Los agentes formadores de vidrio están presentes en una cantidad de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 600 mM (es decir,aproximadamente 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, ó 600 mM) en una formulación acuosa para liofilización. Preferiblemente, los agentes formadores de vidrio están presentes en una cantidad de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 500 mM, más preferiblemente, de aproximadamente 200 mM a aproximadamente 400 mM, incluso más preferiblemente de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 300 mM, y mucho más preferiblemente aproximadamente 300 mM.

Los polímeros, tales como polifosfato, generalmente no están bien definidos en términos de peso molecular. Algunos polímeros son largos mientras que otros son cortos de modo que el peso molecular varía entre los polímeros. Si un agente formador de vidrio no es una molécula bien definida, por ejemplo, un polímero tal como polifosfato, la cantidad presente en la formulación acuosa se expresa como una proporción del peso de TFPI o variante de TFPI al peso del polímero cargado. Preferiblemente, la proporción de TFPI o variante de TFPI al polímero cargado es aproximadamente 8:1 o menos, más preferiblemente, aproximadamente 6:1, y mucho más preferiblemente aproximadamente 2:1.

Tampones

El pH de las composiciones de TFPI o variante de TFPI afecta a la solubilidad de la proteína y por tanto a su estabilidad. Véase Chen y col. (1999) J. Pharm. Sciences 88(9): 881-888. Un intervalo de pH preferido para la composición de la presente invención es de aproximadamente 4 a aproximadamente 8 (es decir,aproximadamente pH 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, u 8), más preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 6,5. Como el pH es un factor significativo en la solubilidad de TFPI, el uso de un tampón para mantener el pH apropiado puede mejorar adicionalmente la estabilidad de las formulaciones. Por tanto, las composiciones acuosas de la presente invención opcionalmente pueden comprender adicionalmente un tampón para mantener el pH de la solución.

Los tampones típicos adecuados para su uso con la presente invención incluyen, aunque sin limitación, acetato, fosfato, succinato, glutamato, L-glutamato, imidazol, citrato, histidina, L-histidina, glicina, arginina, L-arginina, y una combinación de los mismos. Los tampones preferidos son fosfato, L-glutamato, citrato, histidina, L-arginina y L-histidina. Los tampones más preferidos son L-arginina y L-histidina. Los tampones se proporcionan en la formulación acuosa en una cantidad de aproximadamente 0 mM a aproximadamente 600 mM (es decir,aproximadamente 0, 5, 10, 20, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, ó 600 mM). Preferiblemente, la concentración de tampón es de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 100 mM y más preferiblemente de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 50 mM.

Algunos agentes formadores de vidrio también son tampones. Un ejemplo de dicho agente formador de vidrio es arginina. Dichos agentes formadores de vidrio tamponan el pH de la formulación acuosa y, cuando la formulación está liofilizada, forma vidrio y ayudan a estabilizar el TFPI o variante de TFPI. Los agentes formadores de vidrio que también son tampones están típicamente presentes en una cantidad de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 600 mM (es decir,aproximadamente 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, ó 600 mM) en la formulación acuosa para liofilización. Preferiblemente, la concentración de tampón agente formador de vidrio es aproximadamente 100 mM a aproximadamente 500 mM, más preferiblemente, de aproximadamente 200 mM a aproximadamente 400 mM, incluso más preferiblemente de aproximadamente 100 mM a aproximadamente 300 mM, y mucho más preferiblemente aproximadamente 300 mM.

Agentes formadores de cristales

Opcionalmente, la formulación acuosa también puede comprender uno o más agentes formadores de cristales. Un "agente formador de cristales" es un agente químico con la capacidad de formar una estructura reticular cristalina. Típicamente, los agentes formadores de cristales se añaden a una formulación acuosa a liofilizar para proporcionar una estructura rígida. El material restante después de la liofilización se llama "torta". Sin un agente formador de cristales presente, la torta generalmente no será rígida y habitualmente se hundirá o contraerá, los que puede ser perjudicial para la morfología de la torta. El soporte rígido de una red cristalina evitará el hundimiento de la torta. La morfología de la torta es deseablemente de un aspecto de apariencia de producto. La estabilidad y bioactividad del TFPI o variante de TFPI liofilizado generalmente no están afectadas por la morfología de la torta.

Los ejemplos de agentes formadores de cristales adecuados para su uso con la presente invención incluyen, aunque sin limitación, manitol, alanina, glicina, cloruro sódico, y cualquier combinación de los mismos. Los agentes formadores de cristales están presentes en la formulación acuosa para liofilización en una cantidad de aproximadamente el 0,5% a aproximadamente el 16% (peso/volumen) (es decir,aproximadamente 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, ó 16%).

Preparación de formulaciones para liofilización

La preparación a granel de TFPI o variante de TFPI puede implicar el uso de un caótropo, tal como urea, para asegurar que el TFPI o variante de TFPI permanece soluble. Puede ser deseable o necesario retirar el caótropo antes de la liofilización. Por tanto, la invención también proporciona un procedimiento para asistir a la preparación de una composición de TFPI o variante de TFPI para liofilización.

La primera etapa en el procedimiento es retirar un soluto de bajo peso molecular de la primera formulación, habitualmente el caótropo, y remplazarlo con un soluto de bajo peso molecular de la segunda formulación tal como citrato sódico, fosfato sódico, arginina, histidina, manitol, y sacarosa. Para evitar la agregación del TFPI o variante de TFPI cuando se retira el soluto de bajo peso molecular de la primera formulación, se baja el pH a un valor de pH que permite la retirada del caótropo sin agregación o precipitación de la proteína TFPI o variante de TFPI. Habitualmente, el pH se reduce a aproximadamente 4. El caótropo puede retirarse por cualquier procedimiento conocido en la técnica. Los ejemplos de dichos procedimientos incluyen, aunque sin limitación diafiltración, diálisis, o cromatografía por exclusión de tamaño. Se prefiere la diafiltración. Puede ser deseable intercambiar solutos en una preparación a granel y liofilizar el TFPI o variante de TFPI a granel antes del almacenamiento.

Como alternativa, puede reducirse la concentración del caótropo diluyendo la preparación de TFPI o variante de TFPI con una formulación que no contiene el caótropo. Esta etapa provoca la formación de una formulación que está preferiblemente, pero no necesariamente, esencialmente libre de caótropo.

Si se desea, pueden intercambiarse algunos solutos en la formulación resultante por otros solutos (por ejemplo, histidina, imidazol, manitol, glicina, o sacarosa). El pH habitualmente se aumenta durante esta etapa a un valor en que el TFPI es estable en formulaciones acuosas. Preferiblemente, el pH se aumenta a aproximadamente 6. Opcionalmente, la formulación puede liofilizarse posteriormente por técnicas conocidas en la técnica. La tercera formulación es preferiblemente una formulación farmacéuticamente aceptable. El término "farmacéuticamente aceptable" significa que no hay efectos biológicos adversos significativos cuando se administra la formulación a un paciente. El término "paciente" abarca pacientes tanto humanos como veterinarios.

Las composiciones liofilizadas de la presente invención pueden reconstituirse para proporcionar una formulación acuosa de TFPI o variante de TFPI. El TFPI liofilizado puede reconstituirse con un medio adecuado, por ejemplo, solución salina o agua.

A continuación se ofrecen ejemplos a modo de ilustración.

Ejemplo 1

Procedimientos Generales

Preparación a Granel de TFPI o Variante de TFPI

Se preparó ala-TFPI a granel en diferentes tampones de formulación por diálisis. La diálisis se realizó a 4ºC usando tubos de diálisis Spec/Por7 con un límite de peso molecular de 3.500 dalton. El tampón de diálisis a un exceso de 50 a 100 veces se renovó cada tres horas para un total de tres veces. Después de la diálisis, se separó el ala-TFPI soluble del TFPI agregado por filtración a través de una unidad de filtro de 0,2 \mum. La concentración de ala-TFPI soluble se midió por absorbancia en UV y se ajustó a valores deseados de acuerdo con las necesidades de formulación. En una campana de flujo laminar estéril, se transfirió 1 ml de la solución de ala-TFPI formulada a viales de vidrio tipo I de 3 cc. Estos viales después se taparon con tapones de goma laminados con fluoro-resina Daikyo D713 de 13 mm, se sujetaron con precintos de aluminio, y se colocaron en cámaras de estabilidad. Para la formulación de liofilización, se llenaron viales de vidrio de 3 cc con 1 ml de soluciones de ala-TFPI formuladas y se taparon a la mitad con tapones de liofili-
zación West 890 Gray de 13 mm. Estos viales se cargaron en un liofilizador para secarlos por congelación. HPLC

Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC): Todos los procedimientos de HPLC se realizaron en un sistema Waters 626 LC con un tomamuestras automático calentador/refrigerador 717. La absorbancia UV se controló por un detector de absorbancia Waters 486, y la fluorescencia se registró por un espectrofotómetro de fluorescencia Hitachi F-1050 o F-1080. La adquisición y procesamiento de datos se realizó en un sistema Perkin-Elmer Turbochrom.

HPLC de Intercambio Catiónico (CEX-HPLC): El procedimiento de CEX-HPLC usó una columna de vidrio Pharmacia Mono-S HR 5/5. La columna se equilibró en tampón A al 80% (acetato sódico trihidrato 20 mM:solución de acetonitrilo (70:30 v/v) a pH 5,4) y tampón B al 20% (acetato sódico trihidrato 20 mM-cloruro de amonio 1,0 M-solución de acetonitrilo (70:30 v/v) a pH 5,4). Después de que se inyectara una muestra, se aplicó un gradiente para eluir el TFPI a un caudal de 0,7 ml/min de tampón B al 20% a tampón B al 85% en 21 minutos. Los picos de proteína se detectaron por absorbancia a 280 nm o fluorescencia usando una excitación a 280 nm y emisión a 320 nm.

HPLC de Exclusión de Tamaño (SEC-HPLC): El procedimiento de SEC-HPLC usó una columna Phenomenex BIOSEP-SECS2000 (300 x 7,8 mm). El ala-TFPI se eluyó de la columna usando un perfil de elución isocrático. El ala-TFPI se eluyó con fosfato sódico 10 mM a pH 6,5 y NaCl 0,5 M. Los picos de proteína se detectaron por absorbancia a 278 nm, y los pesos moleculares de proteína se determinaron por fluorescencia usando excitación a 467 nm y emisión a 467 nm (Dollinger y col., J. Chromatogr. 592:215-228, 1992).

HPLC de Fase Inversa (RP-HPLC): El procedimiento de HPLC de fase inversa usó dos columnas Rainin Dynamax C8 (5 cm x 4,6 mm, 5 \mum, 30 nm (300 \ring{A}) en serie. La columna se preequilibró en tampón A al 86% (acetonitrilo al 30% (v/v):ácido trifluoroacético al 0,45% (v/v)) y tampón B al 14% (acetonitrilo al 60% (v/v):ácido trifluoroacético al 0,45% (v/v)). La proteína inyectada se eluyó aumentando primero el tampón B al 21% en 13 min y después a tampón B al 100% en 30 min a un caudal de 1 ml/min. La elución de proteína se detectó midiendo la absorbancia a
280 nm.

Ensayo de Tiempo de Protrombina (PT)

El ensayo de PT se realizó en un instrumento Coag-A-Mate RA4 (Organon Teknika). Las muestras de ala-TFPI primero se diluyeron a 150 \mug/ml con tampón (urea 2 M, fosfato sódico 20 mM, NaCl 250 mM, pH 7,2), después a 30 \mug/ml con tampón TBSA (Tris 50 mM, NaCl 100 mM, 1 mg/ml de albúmina de suero bovino, pH 7,5) y finalmente de 12 a 15 \mug/ml por tampón TBSA. Para el ensayo, primero se mezclaron 10 \mul de muestra diluida con 90 \mul de Verify I combinado (Organon Teknika, Nº Cat. 59566), se cargaron en una bandeja de ensayo (Organon Teknika, Nº Cat. 35014), y se colocaron en el Coag-A-Mate. Después se añadieron 200 \mul de Simplastin Excel (Organon Teknika, Nº Cat. 52001) para iniciar el procedimiento de coagulación. El tiempo de coagulación se convirtió en la concentración de ala-TFPI de salida comparando con una representación patrón del log del tiempo de coagulación en segundos frente al log de la concentración de ala-TFPI en los patrones.

Adición de PEI

Se añadió PEI a muestras de ala-TFPI/polifosfato para eliminar la interferencia de polifosfato en el análisis de RP-HPLC y el ensayo de PT. Sin PEI, ala-TFPI mostró un perfil de elución en HPLC anormal y actividad específica in vitro reducida (0,6-0,9) en presencia de polifosfato. La adición de PEI al 0,8% (p/v) restauró el perfil de elución normal y la actividad específica in vitro normal. Se observó precipitación de ala-TFPI con PEI añadido a concentraciones del 0,2 y 0,4% (p/v). PEI a concentraciones del 0,6 al 3,2% (p/v) no causaba precipitación de ala-TFPI y no tenía efecto sobre el tiempo de coagulación en el ensayo de PT cuando se usaba solo.

Diafiltración

Diafiltración: El TFPI o variante de TFPI a granel que contenía aproximadamente 10 mg/ml de TFPI o variante de TFPI, urea 2 M, fosfato sódico 20 mM a pH 7 y NaCl 150 mM primero se mezcló con 1,25 a 5 mg/ml de polifosfato (las proporciones ponderales de TFPI a polifosfato variaban de aproximadamente 8:1 a aproximadamente 2:1). Se añadió urea a 6 M. La membrana de diafiltración era una membrana de celulosa regenerada Millipore Pellicon 2 mini 10 K PLGC con área superficial de 0,1 m^{2}. La presión de entrada, la presión de salida, y el caudal de la bomba peristáltica se establecieron de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.

Eficacia de Diafiltración: Si el volumen de la solución en el recipiente de diafiltración se mantiene constante durante el procedimiento de diafiltración completo (es decir,el volumen de suministro entrante de tampón de diafiltración es igual al volumen de solución de permeado saliente), puede usarse una ecuación de intercambio para calcular la eficacia de diafiltración a cada volumen de intercambio de tampón: Cn/Co = exp(-\alpha,Vn/Vo)

Aquí, Cn y Co son las concentraciones de un soluto en el recipiente de diafiltración (pero no presente en el suministro entrante de tampón) a volúmenes n y cero de intercambio de tampón, respectivamente. Vo es el volumen de la formulación de TFPI o variante de TFPI de partida en el recipiente de diafiltración, y Vn es el volumen de tampón suministrado en o la solución de diafiltración que permeado saliente. Por tanto, n = Vn/Vo. El cartucho de diafiltración usaba una membrana con un límite de peso molecular de 10 kilodalton, que se suponía completamente permeable a solutos pequeños tales como urea, NaCl y fosfato. Por lo tanto, el factor de permeación a es igual a 1 para solutos pequeños muy por debajo del límite de peso molecular. Esta ecuación permite el cálculo de la eficacia de diafiltración a cada volumen de intercambio de tampón. Por ejemplo, componentes tamponantes de partida al 98,2% y 99,8% "filtrarán" después de 4 y 6 volúmenes de intercambio de tampón, respectivamente.

Diálisis

En algunos experimentos, se preparó TFPI o variante de TFPI a granel en diferentes tampones de formulación por diálisis. La diálisis se realizó a 4ºC usando tubos de diálisis Spectra/Por7® (Spectrum® Laboratories) con un límite de peso molecular de 3.500 dalton. El tampón de diálisis a un exceso de 50 a 100 veces se remplazó cada tres horas para un total de tres veces. Después de la diálisis, se separó el TFPI o variante de TFPI soluble del TFPI o variante de TFPI agregado por filtración a través de un unidad de filtro de 0,2 \mum. La concentración de TFPI o variante de TFPI soluble se midió por absorbancia UV y se ajustó a valores deseados de acuerdo con las necesidades de formulación.

Liofilización (Secado por congelación)

Se colocaron viales que contenían TFPI o variante de TFPI formulado en bandejas de metal. Estas bandejas se cargaron en un Hull Freeze Dryer (Modelo 8FS 12C) con una temperatura de almacenamiento preequilibrada a 10ºC. El ciclo de secado por congelación estaba compuesto de tres etapas: congelación, secado primario, y secado secundario. Los viales primero se refrigeraron hasta -50ºC para congelar los productos. El secado primario se realizó posteriormente a -25ºC durante 30 horas a un vacío de 135 mbar (100 mtorr). El secado secundario después se realizó a 20ºC durante 12 horas, también a un vacío de 135 mbar (100 mtorr). Después de que se completara el secado por congelación, se bajó la temperatura de almacenamiento a 4ºC y se liberó el vacío purgando nitrógeno en la cámara del liofilizador. A una presión de nitrógeno de 827 mbar (12 psi), se taparon los viales. Estos viales se extrajeron del liofilizador y se sujetaron con precintos de aluminio abatibles de 13-mm.

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Ejemplo 1A

(Ejemplo de referencia)

Diafiltración de TFPI/polifosfato

Se preparó una solución de ala-TFPI/polifosfato añadiendo polifosfato en ala-TFPI a granel (que contenía urea 2 M, fosfato sódico 20 mM, y NaCl 150 mM) antes de diafiltración. Esta mezcla después se diafiltró frente a agua o tampones. Se usó urea a 6 M durante la diafiltración para mantener la proteína soluble durante el procedimiento de intercambio de tampón.

La solución de ala-TFPI/polifosfato diafiltrada mostró buena estabilidad. No se observó precipitación durante el posterior almacenamiento a temperatura ambiente. En contraste, las soluciones de ala-TFPI/polifosfato preparadas directamente a partir del tampón a granel (que contenía solamente urea 2 M) mostraron inestabilidad después del posterior almacenamiento; se formó precipitado después de un día de almacenamiento a temperatura ambiente. Por tanto, urea 6 M ayuda a la solubilización de ala-TFPI durante la transferencia de tampón del tampón a granel a agua/tampón polifosfato.

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Ejemplo 1B

(Ejemplo de referencia)

Precipitación de ala-TFPI Inducida por Congelación

La solución de ala-TFPI/polifosfato diafiltrada mostró inestabilidad después de congelación-descongelación o incubación a temperatura ambiente. Se encontró precipitado visible en algunas soluciones de ala-TFPI/polifosfato después de congelarse-descongelarse desde -70ºC o durante almacenamiento a temperatura ambiente, como se muestra en la Tabla A.

TABLA A

1

Estos resultados muestran que la estabilidad de ala-TFPI es sensible a las condiciones de almacenamiento y los tampones en la formulación. Los tampones citrato y fosfato a menudo causaron precipitación de ala-TFPI tanto en almacenamiento a temperatura ambiente como en almacenamiento en congelado. Para evaluar su el pH había cambiado a -70ºC, se midió el pH en estado congelado por el cambio de color del colorante usando la solución de pH Universal adquirida de Fisher Scientific.

Se descubrió que la solución de ala-TFPI/polifosfato era extremadamente sensible a cambios tanto en la fuerza iónica como en el pH. Un experimento, tritiado por ácido o NaCl, mostró que TFPI precipitaba inmediatamente en soluciones de ala-TFPI/polifosfato a pH por debajo de 5,8 o por encima de NaCl 80 mM. Otro experimento mostró que ala-TFPI formaba finalmente precipitado a temperatura ambiente después de la adición de NaCl tan bajo como NaCl 5 mM. La adición de más NaCl provocaba una precipitación más rápida. La sensibilidad de soluciones de ala-TFPI/polifosfato a cambios de pH y sal en presencia de polifosfato puede explicar porqué ala-TFPI precipitaba después de congelar-descongelar. El pH de tampones tales como citrato y fosfato disminuye después de congelar a causa de la precipitación parcial de diferentes formas salinas en el sistema tamponante. Posiblemente, el cambio de pH y/o concentración de sal después de la congelación debilita la interacción entre ala-TFPI y polifosfato y provoca la precipitación de ala-TFPI. Asimismo, la adición de sal a temperatura ambiente también podría debilitar la interacción electrostática entre ala-TFPI y polifosfato y provocar la precipitación de ala-TFPI.

La L-histidina es un tampón útil para estabilizar el pH después de la congelación. La L-histidina también existe como una forma neutra simple o una forma protonada en soluciones. Por lo tanto, debe tener un efecto mínimo sobre la interacción entre ala-TFPI y polifosfato.

Ejemplo 2

(Ejemplo de referencia)

Estabilidad de Composiciones Acuosas de ala-TFPI

Para determinar la estabilidad a largo plazo de formulaciones acuosas de ala-TFPI, se estudió la agregación de ala-TFPI a temperaturas elevadas. Se almacenaron muestras de ala-TFPI formuladas con cloruro sódico 150 mM, polisorbato-80 al 0,015% (p/v) y fosfato sódico 10 mM que tiene un pH de 7 a 40ºC durante diversos tiempos. Se desarrolló turbidez en las muestras con tiempos de almacenamiento crecientes, lo que indica la formación de precipitados visibles. Después de la filtración a través de un filtro de 0,2 \mum, se analizó el ala-TFPI soluble por HPLC de intercambio catiónico (CEX-HPLC) como se ha descrito anteriormente. La Fig. 1 muestra los cromatogramas de CEX-HPLC para estas muestras. Los cromatogramas de la Fig. 1 muestran que un único pico de proteína eluía a 18 minutos. Este pico es ala-TFPI monomérico.

Se calculó la concentración de ala-TFPI integrando el área bajo los picos en los cromatogramas de la Fig. 1. Se observó una disminución en el área de pico, los que indica pérdida de ala-TFPI soluble en estas muestras. Se usó un ajuste exponencial sencillo del área de pico frente al tiempo de almacenamiento para calcular la pérdida de ala-TFPI soluble. La constante de velocidad calculada se convirtió en el periodo de validez, t_{90} (tiempo transcurrido para la pérdida del 10% del polipéptido ala-TFPI soluble), usando la ecuación cinética de primer orden patrón (Cantor y Schimmel, eds., Biophysical Chemistry, W.H. Freeman y Co., 1980). Asimismo, el periodo de validez se calculó usando los datos de bioactividad determinados por el ensayo de tiempo de protrombina (PT). El periodo de validez para ala-TFPI soluble estaba de acuerdo con el periodo de validad para la bioactividad (Tabla 1). Como la pérdida de ala-TFPI soluble iba en paralelo a la disminución de la bioactividad, se consideró que la agregación era la vía de inactivación más probable.

TABLA 1

3

Para reducir la formación de agregados y por tanto aumentar la estabilidad a largo plazo de las formulaciones acuosas de ala-TFPI, se realizó un estudio de estabilidad de pH. Se preparó ala-TFPI en cloruro sódico 150 mM, polisorbato-80 al 0,015% (p/v) y fosfato sódico 10 mM, y se ajustó el pH de la formulación a diferentes valores entre 4 y 9 por la adición de HCl o NaOH. Después de almacenamiento a 40ºC, se determinó la pérdida de ala-TFPI soluble en estas muestras por CEX-HPLC. La Fig. 2 muestra una representación de la constante de velocidad de primer orden para la pérdida de ala-TFPI soluble como función del pH. La velocidad de agregación fue más lenta por debajo de pH 6 y llega a ser mucho más rápida a pH básico. Por tanto, la agregación de ala-TFPI estaba catalizada por
base.

Aunque la reacción de agregación se minimizaba por debajo de pH 6, se observó una nueva reacción de degradación a condiciones de pH ácido. Se detectaron dos especies más pequeñas de ala-TFPI por SDS-PAGE (datos no mostrados). También se observó una especie de elución tardía a pH 4 en cromatogramas de CEX-HPLC (Fig. 3). Parecía que esta especie correspondía a los productos degradados detectados por SDS-PAGE. La Fig. 3 muestra el ala-TFPI monomérico que eluye a 18 minutos y una nueva especie que surge con incubación más larga de ala-TFPI en condiciones ácidas a 40ºC. Por tanto, aunque la especie ala-TFPI monomérica disminuía con el tiempo de incubación, el pico de elución tardía supuestamente de ala-TFPI degradado aumentaba.

Para determinar si la degradación de ala-TFPI estaba catalizada por hidrólisis ácida, muestras de ala-TFPI a diferente pH se sometieron a análisis de CEX-HPLC. La velocidad de escisión llegó a ser más lenta a condiciones de pH más elevado (Fig. 4). Después de almacenarse durante 10 días a 40ºC, la escisión de TFPI aumentaba según disminuía el pH a pH 4. Por lo tanto, la degradación de ala-TFPI se debe a hidrólisis ácida de los enlaces peptídicos dentro del polipéptido.

En base a los resultados de los dos estudios previos, una selección de formulación adicional se centró aproximadamente a pH 6. Se evaluó la estabilidad acelerada de 11 formulaciones adicionales, que se enumeran en la Tabla 1. Las muestras se almacenaron a 40ºC y se analizaron por análisis de CEX-HPLC para la pérdida de solubilidad y por ensayo de PT para la pérdida de bioactividad. Se descubrió que el periodo de validez (t_{90}), determinado por HPLC de intercambio catiónico, variaba de un día a más de dos semanas y de aproximadamente un día a aproximadamente ocho días determinado por el ensayo de PT. Se realizó análisis de Arrehnius usando estos datos a 40ºC, suponiendo una energía de activación de 10 kcal/mol (que es una estimación razonable para una reacción de agregación). Los resultados sugieren que el TFPI en estas formulaciones acuosas no es estable durante periodos de tiempo más largos, por ejemplo, 18-24 meses.

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Ejemplo 3

(Ejemplo de referencia)

Efecto Estabilizador de Polifosfato sobre Formulaciones Acuosas de ala-TFPI

Se evaluó el efecto estabilizador de polifosfato sobre formulaciones de ala-TFPI. El polifosfato se une a ala-TFPI y lo estabiliza conformacionalmente. Se estudió la estabilización de polifosfato a proporciones ponderales de ala-TFPI a polifosfato de 2:1, 6:1 y 8:1. Se prepararon formulaciones a cada proporción de ala-TFPI:polifosfato en histidina 10 mM a pH 7. Además, para evaluar el efecto de histidina sobre la estabilidad de ala-TFPI, se estableció una proporción ponderal de ala-TFPI a polifosfato de 8:1 usando solamente agua. En otra formulación más, se estableció una proporción poderla de ala-TFPI a polifosfato 8:1 con histidina 10 mM que tenía un pH de 6,5 para evaluar los efectos del pH sobre la estabilidad de ala-TFPI.

Como las sales y otros iones cargados pueden impedir la unión de ala-TFPI-polifosfato, se usaron mono y disacáridos tales como manitol, sacarosa, y sorbitol en las formulaciones de TFPI. Se prepararon formulaciones que contenían mono o disacáridos a una proporción ponderal de ala-TFPI a polifosfato 8:1 (véase la Tabla 2 para las formulaciones). Finalmente, se establecieron varias muestras de ala-TFPI de elevada concentración para evaluar la estabilidad de TFPI a dichas concentraciones. Se examinó la estabilidad de estas formulaciones de ala-TFPI a 30ºC y 40ºC. Se extrajeron viales en los momentos puntuales preseleccionados y se filtraron a través de filtros de 0,22 \mum para retirar el precipitado. Las muestras de ala-TFPI filtradas se analizaron posteriormente por SDS-PAGE para la degradación e intensidad de bandas, por HPLC de fase inversa como se ha descrito anteriormente para la pérdida de solubilidad, y por en ensayo de PT como se ha descrito anteriormente para la pérdida de bioactividad.

Los resultados de SDS-PAGE no mostraron escisión de ala-TFPI pero mostraron que la intensidad de bandas disminuía para las formulaciones almacenadas a 40ºC durante 3 meses. Los resultados del análisis de RP-HPLC se muestran en la Fig. 5. La Fig. 5 muestra cromatogramas de una formulación de polifosfato acuosa incubada a 40ºC o 30ºC y en congelado a -70ºC durante tres meses. El ala-TFPI eluía aproximadamente a 12,2 minutos, y las especies minoritarias eluían delante o detrás de la especie principal. Después de incubación a temperaturas elevadas (30ºC o 40ºC), se desarrollaron precipitados visibles en las muestras. El precipitado visible podía filtrarse a través de filtros de 0,22 \mum y propiamente dicho, los cromatogramas mostraron un área de pico disminuida sin que surgieran nuevas especies. Los resultados indican que se perdía ala-TFPI debido a la agregación después de almacenamiento a 30ºC o 40ºC.

La agregación durante la incubación a temperaturas elevadas se identificó como la vía de degradación principal para ala-TFPI a pH por encima de 6. La concentración de ala-TFPI soluble se calculó integrando el área de pico sobre los cromatogramas de RP-HPLC (Fig. 5). Para calcular el porcentaje de ala-TFPI soluble restante, se normalizaron estos datos a los de las mismas formulaciones almacenadas a -70ºC. Los resultados se muestran en la Tabla 2. La formulación 1 contenía solamente agua y era más estable que la formulación correspondiente en histidina 10 mM (formulación 2). A 30ºC, se observó una diferencia del 15% en la proteína soluble restante para muestras con y sin histidina. Los datos de 30ºC también muestran que la disminución aparente en la estabilidad debida a la histidina puede compensarse por la adición de manitol y/o sacarosa (formulaciones 4, 5 y 7). El manitol y sacarosa son estabilizadores débiles para ala-TFPI en presencia de histidina. Se espera que la interacción entre ala-TFPI y histidina y ala-TFPI y manitol o sacarosa sea aditiva (Chen y col., J. Pharm Sci 85: 419-422, 1996).

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TABLA 2

4

La estabilidad de formulaciones de ala-TFPI-polifosfato depende enormemente del pH. Los datos de 30ºC de la Tabla 2 muestran que la estabilidad de ala-TFPI disminuía en más de la mitad cuando se cambiaba el pH de 7 a 6,5 (formulaciones 2 y 3). Además, la estabilidad de ala-TFPI en formulaciones de polifosfato depende de la proporción de ala-TFPI a polifosfato. Los datos de 40ºC de la Tabla 2 muestran que el porcentaje de ala-TFPI soluble restante era 0,9, 2,7 y 6,3 cuando la proporción de ala-TFPI a polifosfato varía de 8:1 a 6:1 a 2:1 (formulaciones 2, 8, y 9), respectivamente. Por tanto, el ala-TFPI es más estable a la proporción ponderal de ala-TFPI a polifosfato de 2:1.

Los datos de 30ºC muestran poca diferencia en la estabilidad entre formulaciones de polifosfato (formulaciones 1-9) y la formulación de ala-TFPI de elevada concentración (formulaciones 10 y 11). Los datos de 40ºC muestran que las formulaciones de TFPI de elevada concentración (formulaciones 10 y 11) son más estables que las formulaciones de TFPI-polifosfato. Después de 3 meses de almacenamiento, las formulaciones de polifosfato (formulaciones 1-9) han dejado menos del 10% de TFPI, mientras que las formulaciones 10 y 11 tienen más del 40% de TFPI restante. Por tanto, un procedimiento alternativo para conseguir estabilidad a largo plazo, por ejemplo,durante 18-24 meses, es usar formulaciones de TFPI de elevada concentración.

Ejemplo 4

(Ejemplo de referencia)

Estabilidad de ala-TFPI en un Ciclo de Congelación-Descongelación

Para determinar si las formulaciones de ala-TFPI podían almacenarse a -70ºC, formulaciones de ala-TFPI-polifosfato (6:1 p/p) (Tabla 3) se sometieron a un ciclo de congelación-descongelación. Se encontró precipitado visible en algunas formulaciones de ala-TFPI-polifosfato después de congelarse a -70ºC y descongelarse, como se muestra en la Tabla 3. Los resultados muestran que los tampones citrato y fosfato pueden causar la precipitación de TFPI tanto en almacenamiento a temperatura ambiente como en almacenamiento a -70ºC.

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TABLA 3

5

Para evaluar si el pH había cambiado a -70ºC, se midió el pH en el estado congelado por un cambio de color del colorante usando la solución de pH Universal adquirida de Fisher Scientific. La formulación de ala-TFPI-polifosfato era altamente sensible a cambios tanto en el pH como en la fuerza iónica. El ala-TFPI precipitaba inmediatamente cuando se formulaba en formulaciones de ala-TFPI-polifosfato por debajo de pH 5,8 o por encima de NaCl 80 mM. El ala-TFPI finalmente formaba un precipitado a temperatura ambiente después de la adición de NaCl o una concentración tan baja como 5 mM a las formulaciones de ala-TFPI-polifosfato. La adición de más NaCl provocaba una precipitación más rápida. La sensibilidad de las formulaciones de ala-TFPI-polifosfato a cambios de pH y sal pueden explicar porqué precipitaba ala-TFPI durante un ciclo de congelación-descongelación. El pH de tampones tales como citrato y fosfato disminuye después de la congelación a causa de la precipitación parcial de diferentes formas salinas que componen el sistema tamponante. Un cambio en el pH o la concentración de las sales después de la congelación puede debilitar la interacción entre ala-TFPI y polifosfato. La interacción debilitada puede provocar la precipitación de ala-TFPI. Asimismo, la adición de sal a temperatura ambiente también podría debilitar la interacción electrostática entre ala-TFPI y polifosfato y provocar la precipitación de ala-TFPI.

Entre las especies de tampón ensayadas, la L-histidina estabilizaba mejor el pH después de la congelación. Además, la L-histidina también existe como una forma neutra simple o una forma protonada en solución. Por lo tanto, debe tener un efecto mínimo sobre la interacción entre ala-TFPI y polifosfato y por tanto es un tampón preferido.

Ejemplo 5

Desarrollo de Formulaciones de ala-TFPI Liofilizadas

Exploración de formulación inicial

La exploración de formulaciones para liofilización usó 18 formulaciones enumeradas en la Tabla 4. La selección de los componentes de la formulación se hizo en base a: 1) los efectos solubilizantes sobre ala-TFPI de solutos tales como L-arginina, citrato, L-histidina, imidazol y polifosfato; 2) la tendencia de solutos tales como sacarosa a formar una matriz vidriosa para estabilizar las proteínas liofilizadas; y 3) la capacidad de solutos tales como manitol y glicina de formar una estructura de torta cristalina. La mayoría de las formulaciones tienen una osmolaridad casi isotónica, excepto las formulaciones 2, 3 y 4, que son aproximadamente dos veces la de una solución isotónica.

TABLA 4

7

8

Se examinaron las propiedades visuales del producto liofilizado después del secado por congelación (liofilización). La morfología de torta se evaluó visualmente. Los resultados se muestran en la Tabla 5. Se consideró que una torta con poco encogimiento o hundimiento retenía "buena" morfología de torta. Las formulaciones 10, 12, 13, 16 y 17 mostraron buena morfología de torta. De ellas, cuatro contenían manitol y una contenía glicina como el agente formador de cristales.

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TABLA 5

9

La humedad residual es uno de los factores limitantes en la conservación de proteínas en estado seco. Se prefiere que la humedad residual sea menor del 1% (p/p). El contenido de humedad residual se determinó por el procedimiento de titulación de Karl Fischer (Angew. Chemie 48:394 (1935)) para las 13 formulaciones, y los resultados se muestran en la Tabla 5. Las formulaciones 9, 10, 12, 13 y 15 contenían menos del 1% (p/p) de humedad residual, y las formulaciones 1 a 8 tenían un contenido de humedad mayor del 1% (p/p).

Las composiciones liofilizadas se reconstituyeron añadiendo 1 ml de "Agua Para Inyección" (WFI), es decir, agua que se ha aprobado por la FDA para inyección en pacientes humanos. La mayoría de las composiciones liofilizadas se disolvían en 1 minuto, y 16 de las 18 formulaciones reconstituidas eran transparentes (Tabla 5). Las formulaciones 9 y 10 reconstituidas eran oscuras (Tabla 5), lo que sugiere que sucedía agregación de ala-TFPI en estas dos formulaciones durante la liofilización.

También se analizaron las formulaciones 1-9 y 13-18 reconstituidas por en el ensayo de PT para la bioactividad y por análisis de CEX-HPLC para la pérdida de ala-TFPI soluble. Los resultados se muestran en la Tabla 5. Las formulaciones 10, 11 y 12 no se incluyeron en este análisis porque el polifosfato en estas formulaciones interfería con los ensayos de HPLC de intercambio catiónico y de PT.

Los resultados del ensayo de PT mostraron que las 15 formulaciones ensayadas eran biológicamente activas e indistinguibles de los controles acuosos no liofilizados. Por lo tanto, el ala-TFPI en estas formulaciones no era particularmente sensible a estrés de secado por congelación.

La concentración de ala-TFPI soluble se midió por análisis de CEX-HPLC y era menos del 10% diferente de las muestras liofilizadas y los controles acuosos. El sutil cambio en la concentración de ala-TFPI estaba muy probablemente causado por un pequeño cambio de volumen durante la reconstitución. Usando la formulación 13 como ejemplo, sucede un aumento de volumen del 5% cuando se reconstituye con Agua Para Inyección.

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Estabilidad en Almacenamiento a Largo Plazo

Se estudió la estabilidad de almacenamiento a largo plazo de diez composiciones liofilizadas (1, 2, 4, 5 y 13-18 de la Tabla 5). Las muestras de estas formulaciones se almacenaron a diferentes temperaturas y se extrajeron a intervalos de tiempo predeterminados para el análisis de degradación.

Primero, se examinó el grado de agregación en composiciones liofilizadas. La pérdida de proteína soluble se midió por análisis de CEX-HPLC. Los resultados obtenidos para muestras almacenadas hasta 3 meses a 40ºC o 50ºC se muestran en la Tabla 6. El ala-TFPI era bastante estable en estas formulaciones. La bioactividad en las composiciones liofilizadas se determinó por el ensayo de PT y se muestra en la Tabla 6. Las muestras almacenadas hasta 3 meses a 40ºC o 50ºC retuvieron aproximadamente el 40-100% de su bioactividad inicial después de la reconstitución
(Tabla 6).

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 6

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La formulación 13 se seleccionó para el análisis por HPLC de intercambio catiónico, HPLC de fase inversa, y HPLC de exclusión de tamaño como se ha descrito anteriormente. La Fig. 6 muestra cromatogramas de CEX-HPLC, RP-HPLC y SEC-HPLC para muestras de esta formulación almacenadas a diferentes temperaturas durante 3
meses.

El ala-TFPI eluía de la CEX-HPLC como un único pico con un tiempo de retención a aproximadamente 18 min. Este perfil de pico único en los cromatogramas de CEX-HPLC permanecía inalterable para todas las temperaturas de almacenamiento para esta formulación (Fig. 6A).

El perfil de elución de RP-HPLC de ala-TFPI era bastante complejo. Una especie principal de ala-TFPI eluía a 19 min, dos especies oxidadas de ala-TFPI eluían ligeramente más rápido, y varias especies acetiladas minoritarias de TFPI eluían más lento. Como se muestra en la Fig. 6B, este perfil de elución también se observaba para muestras de ala-TFPI liofilizadas que se almacenaron durante 3 meses a diversas temperaturas.

Los perfiles de elución de HPLC de exclusión de tamaño para muestras de ala-TFPI liofilizadas almacenadas a diversas temperaturas estaban esencialmente inalterados después de almacenamiento. No se detectaron cambios para la especie monomérica que eluye a 8,25 minutos y la especie de tampón que eluye aproximadamente a 11 minutos. La muestra a 50ºC mostró más cambios en los picos de tampón (Fig. 6C), pero esto estaba probablemente causado por la oxidación del componente de histidina a la temperatura elevada.

Aunque los ensayos de estabilidad acelerada mostraron una diferencia entre las formulaciones, el examen de estabilidad a tiempo real de las diferentes composiciones almacenadas durante 6 meses a 2-8ºC no mostró cambios detectables por análisis de HPLC de intercambio catiónico. La Fig. 7 muestra cromatogramas de CEX-HPLC para muestras de cinco formulaciones después de almacenamiento durante 6 meses a 2-8ºC o 50ºC. Aunque se observó una degradación extensiva en algunas de las muestras almacenadas a 50ºC (por ejemplo, las formulaciones 4 y 17), no se detectaron cambios en las cinco muestras almacenadas a 2-8ºC.

La agregación de ala-TFPI produjo precipitados visibles que podían filtrarse usando un filtro de 0,22 \mum. Por tanto, se observó una disminución en el área integrada de los picos originales en cromatogramas de HPLC. No se detectaron cambios significativos diferentes a la agregación en estos cromatogramas de HPLC. Asimismo, no se observaron especies degradadas en geles de SDS-PAGE. Por lo tanto, la agregación era la vía de degradación principal para esta proteína en el estado secado por congelación.

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Ejemplo 6

Efecto de especies tamponantes, pH y concentración de ala-TFPI sobre la estabilidad de ala-TFPI liofilizado

Se investigó el efecto de especies tamponantes, el pH, y la concentración de ala-TFPI sobre la estabilidad de composiciones de ala-TFPI liofilizadas. Las especies tamponantes, incluyendo L-histidina, citrato e imidazol, se compararon a pH 6,5 en una formulación que contenía tampón 10 mM y manitol al 4% (p/v). La Tabla 7 muestra la pérdida de ala-TFPI soluble medida por análisis de CEX-HPLC para muestras almacenadas durante 5 semanas a 40ºC o 50ºC. Como se muestra en la Tabla 7, la L-histidina era la mejor especie tamponante para conservar el ala-TFPI soluble, seguido de citrato. Por ejemplo, la fracción del ala-TFPI soluble que aún permanecía después de 5 semanas de almacenamiento a 50ºC era del 95%, 41%, y 10% para L-histidina, citrato, e imidazol, respectivamente. Esto se correlaciona con el orden de su tendencia a formar vidrio en las condiciones de secado por congelación específicas empleadas en este estudio.

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TABLA 7

13

14

En un experimento diferente, se compararon los efectos de citrato y fosfato en dos formulaciones que contenían tampón 10 mM a pH 6,0, L-arginina al 3% (p/v) y manitol al 4% (p/v). El citrato fue mejor que el fosfato para conservar la estabilidad de ala-TFPI (Fig. 7).

El efecto del pH sobre la estabilidad de ala-TFPI liofilizado se ensayó usando la formulación 13 (Tabla 4). El intervalo de pH examinado era un intervalo estrecho de aproximadamente pH 5,5 a aproximadamente pH 6,5. Los resultados del análisis de CEX-HPLC y el ensayo de PT se muestran en la Tabla 7. Había una pequeña diferencia en la estabilidad para el intervalo de valores de pH ensayados. El valor de pH inferior, pH 5,5, produjo mayor estabilidad de ala-TFPI liofilizado que pH 6,0 o pH 6,5.

Se investigó la estabilidad de ala-TFPI en la formulación 13 a concentraciones de proteína que varían de 100 \mug/ml a 1,500 \mug/ml. La Tabla 8 muestra la diferencia en la concentración de proteína entre muestras almacenadas a 50ºC y muestras almacenadas a 2-8ºC. Las muestras que contenían mayor concentración de TFPI eran ligeramente más estables que aquellas que tenían menores concentraciones de ala-TFPI y mostraban una pérdida menor de ala-TFPI a 50ºC. La estabilidad reducida llega a ser notable solamente cuando la concentración de ala-TFPI estaba por debajo de 250 \mug/ml.

TABLA 8

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Ejemplo 7

(Ejemplo de referencia)

Efecto Estabilizador de Polifosfato sobre Composiciones Liofilizadas de ala-TFPI

En estos estudios, se ensayaron proporciones ponderales de ala-TFPI a polifosfato de 2:1, 6:1 y 8:1 para la capacidad de polifosfato de estabilizar composiciones liofilizadas de TFPI. Se añadieron tampones tales como histidina 10 mM e imidazol 10 mM a las formulaciones para mantener el pH a 7. Se añadieron manitol y sacarosa a ciertas formulaciones para aumentar la fuerza de torta y para potenciar la estabilidad, respectivamente. La concentración de ala-TFPI se ajustó a 20 mg/ml en las formulaciones antes de la liofilización.

Los resultados del contenido de humedad residual y la morfología de torta se muestran en la Tabla 9. Las seis formulaciones muestran menos de la mitad del porcentaje de humedad residual. El propio polifosfato parece ser un buen agente para liofilización y da una torta ligeramente encogida sin ningún otro aditivo. Con la adición de histidina, no se observó mejora adicional sobre la morfología de torta. Sin embargo, la adición de manitol y sacarosa en la formulación mejoró la morfología de torta. En un experimento posterior, el secado por congelación de una formulación de ala-TFPI-polifosfato a la proporción ponderal 2:1 con manitol al 4% (p/v) solo también produjo buena estructura de torta. Por lo tanto, se descubrió que el manitol era un buen agente formador de cristales para la elegancia del producto.

TABLA 9

16

Se realizaron ensayos de estabilidad acelerada a 40ºC y 50ºC. Los cromatogramas de RP-HPLC típicos de las muestras ensayadas se muestran en la Fig. 8. Similar a las formulaciones acuosas, se observó pérdida de ala-TFPI debido a la agregación durante el almacenamiento a temperaturas elevadas y produjo una disminución en el área de pico en los cromatogramas.

Los resultados del análisis de RP-HPLC que muestran la pérdida de ala-TFPI en las muestras ensayadas se muestran en la Tabla 10. Todas las formulaciones mostradas en la Tabla 10 eran más estables que la formulación de elevada concentración acuosa sola. Después de 3 meses de almacenamiento a 40ºC, las muestras de formulación acuosa contenían no más del 50% de TFPI soluble por RP-HPLC (Tabla 2), mientras que todas las formulaciones liofilizadas contenían más del 80% de ala-TFPI soluble.

TABLA 10

17

Entre las seis formulaciones mostradas en la Tabla 10, la formulación con una proporción de ala-TFPI a polifosfato de 2:1 mostró la mejor estabilidad de ala-TFPI. Después de 3 meses de almacenamiento a 50ºC, esta formulación aún contenía un 56% de ala-TFPI soluble por RP-HPLC, mientras que otras formulaciones ya estaban completamente degradadas. La cinética de degradación de esta formulación a 50ºC en comparación con la formulación de elevada concentración se muestra en la Fig. 9. La formulación liofilizada es aproximadamente 10 veces más estable que la formulación acuosa examinadas en este ensayo de estabilidad acelerada.

La medición de calorimetría de exploración diferencial (DSC) reveló que la temperatura de transición vítrea (Tg) para el polifosfato en la formulación de histidina/manitol/sacarosa era de aproximadamente -28ºC. Como la temperatura del producto estaba por debajo de -28ºC durante las primeras 11 h de secado primario como se muestra en la Fig. 10, el polifosfato probablemente formaba vidrio después del secado por congelación. Por lo tanto, la estabilización de polifosfato proporcionada a ala-TFPI en forma liofilizada aún puede seguir la teoría de estabilización vítrea, que establece que el vidrio rígido reduce enormemente la difusión de moléculas para eliminar las reacciones de degradación.

Como la sacarosa también es un buen formador de vidrio con una Tg de aproximadamente -32ºC, fue de interés ensayar si el polifosfato solo podía estabilizar la ala-TFPI formando vidrio. En un experimento diferente, se prepararon y liofilizaron dos formulaciones que contenían 20 mg/ml de ala-TFPI, 10 mg/ml de polifosfato, L-histidina 10 mM a pH 7, y manitol al 4% con o sin sacarosa al 1%. Ambas formulaciones mostraron morfología de torta similar y bajos niveles de humedad residual (0,69% sin sacarosa al 1% y 0,49% con sacarosa al 1%). La sacarosa parece tener poco efecto sobre TFPI durante el secado por congelación.

La estabilidad de estas dos formulaciones se comparó examinando la disminución tanto de la concentración de proteína por el ensayo de RP-HPLC como la actividad específica in vitro por el ensayo de PT después del almacenamiento a temperaturas elevadas. Como se muestra en la Tabla 11, la diferencia en la estabilidad para estas dos formulaciones es insignificante. Ambas formulaciones mostraron una pérdida del 2% en ala-TFPI después de almacenarse a 60ºC durante dos semanas. A 50ºC durante 4 semanas, las formulaciones con y sin sacarosa mostraron una pérdida de ala-TFPI del 12% y el 18%, respectivamente. Además, las actividades específicas de estas dos formulaciones a 50ºC durante 4 semanas fueron comparables.

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TABLA 11

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Ejemplo 8

Preparación de Formulaciones de ala-TFPI para Liofilización

La fabricación de una formulación de ala-TFPI frecuentemente requiere un procedimiento de intercambio de tampón. El ala-TFPI a granel puede contener, por ejemplo, 10 mg/ml de proteína, urea 2 M, fosfato sódico 20 mM a pH 7,2 y NaCl 150 mM. Las formulaciones liofilizadas generalmente no contienen urea o NaCl. Para procesar ala-TFPI a partir de la masa que contiene urea en un tampón de formulación (Tabla 4), tiene que retirarse la urea y NaCl por un procedimiento de intercambio de tampón tal como diálisis, filtración en gel, o diafiItración. Entre estos procedimientos, se prefiere la diafiltración desde un punto de vista de fabricación a causa de los grandes volúmenes de ala-TFPI implicados en la fabricación.

Diafiltración de una etapa

La diafiltración de ala-TFPI a granel que contiene, por ejemplo, 10 mg/ml de proteína, urea 2 M, fosfato sódico 20 mM a pH 7,2, y NaCl 150 mM directamente en varios tampones de formulación a pH 6 ó 6,5 produjo una precipitación de proteína extensiva. Como se muestra en la Tabla 12, la diafiltración en cuatro tampones a pH 6 ó 6,5 produjo una solución turbia o un rendimiento inferior. Sin embargo, la diafiltración en un tampón a pH 4 que contenía L-glutamato 10 mM, manitol al 4% (p/v) y sacarosa al 1% (p/v) produjo una solución transparente con un alto rendimiento.

TABLA 12

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La concentración de ala-TFPI usada en la diafiltración (1 mg/ml) era muy inferior al límite de solubilidad tanto en el tampón de partida como en los tampones de formulación final (5-10 mg/ml de solubilidad). Estos dos sistemas tamponantes aparentemente solubilizan ala-TFPI por dos mecanismos diferentes. El tampón de partida contiene urea y sal y es de fuerza iónica relativamente elevada, mientras que algunos de los tampones de formulación son de baja fuerza iónica. La diafiltración es un procedimiento relativamente lento. La urea y sal en el tampón a granel se extraen por diafiltración gradualmente, y los componentes del tampón de formulación se introducen por diafiltración gradualmente. Durante la diafiltración, el ala-TFPI puede experimentar condiciones de disolvente transitorias que afectan a la solubilidad de ala-TFPI o la estabilidad de ala-TFPI.

Se examinó el cambio de turbidez de la formulación de ala-TFPI en el recipiente de diafiltración a cada volumen de intercambio de tampón. La formulación de partida era de 1 a 1,5 mg/ml de TFPI en urea 1 M, fosfato sódico 10 mM a pH 7 y NaCl 125 mM. Los resultados se muestran en la Tabla 13.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 13

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El ala-TFPI diafiltrado a pH 4 mostró un cambio transitorio en la turbidez en el primer o segundo volumen de intercambio de tampón; después se volvió transparente y permaneció así todo el tiempo hasta el final de la diafiltración. Usando un tampón acetato sódico pH 5,5, se observó cambio de turbidez a 1, 2 y 5 volúmenes de intercambio de tampón. La diafiltración usando pH 6 o pH 6,5 produjo soluciones turbias en la última fase de diafiltración, excepto para una solución que contenía L-arginina al 3% (p/v). Por lo tanto, tanto el bajo pH como L-arginina evitaban la precipitación de ala-TFPI durante la diafiltración.

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Diafiltración de dos etapas

La precipitación de ala-TFPI durante la diafiltración puede evitarse por el uso de tampones que tienen un pH de aproximadamente 4. Para ensayar si un tampón que tiene un pH de aproximadamente 4 podría servir como puente entre el tampón a granel y el tampón de formulación final, se realizó un experimento de diafiltración de dos etapas. En la primera etapa, se diafiltró TFPI frente a tampón a pH 4 para cuatro volúmenes de intercambio de tampón. En la segunda etapa, el tampón de diafiltración se cambió al tampón de formulación, y se realizaron seis volúmenes de intercambio de tampón. Se registraron los cambios de turbidez durante la diafiltración para varios sistemas de tampón de diafiltración de dos etapas y se muestran en la Tabla 14.

El tampón de pH 4 preferiblemente es un tampón L-glutamato. Después de cuatro cambios de cambios de volumen con el tampón glutamato, se introduce el tampón de producto final deseado con un agente solubilizante adecuado como la segunda etapa. Este procedimiento produce un producto final formulado, transparente con mucha menos pérdida de proteína incurrida durante el procesamiento.

En un experimento, la solución de partida era ala-TFPI a 1 mg/ml en urea 1 M, fosfato sódico 10 mM, NaCl 125 mM, pH 7, se diafiltró primero por un tampón L-glutamato (ácido glutámico 10 mM/L-glutamato, manitol al 4% (p/v), sacarosa al 1% (p/v) a pH 4,0) para cuatro cambos de volumen (etapa 1), y después por un tampón L-histidina o imidazol para seis cambios adicionales de volumen (etapa 2). Se registró la transparencia de la solución diafiltrada. La solución diafiltrada se filtró a través de una unidad de filtro de 0,22 \mum, y se midió la concentración de ala-TFPI de la solución filtrada por absorbancia UV y se comparó con la anterior a la diafiltración para calcular la recuperación. Los resultados se muestran en la Tabla B.

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TABLA B (para referencia)

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Este procedimiento puede usarse para la preparación de formulaciones líquidas (o en solución) de TFPI o variante de TFPI para uso terapéutico a una escala comercial apropiada.

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TABLA 14

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Como se muestra en la Tabla 14, si la primera etapa de diafiltración usaba un tampón de fuerza iónica relativamente elevada, tal como L-glutamato 10 mM a pH 4 y NaCl 140 mM, no se observaba cambio transitorio en la turbidez durante la diafiltración. Sin embargo, ala-TFPI precipitaba en la segunda etapa de diafiltración, que usaba un tampón de baja fuerza iónica. Por otro lado, si la primera etapa de diafiltración usaba un tampón de baja fuerza iónica, tal como L-glutamato 10 mM a pH 4, manitol al 4% (p/v) y sacarosa al 1% (p/v), la solución de ala-TFPI pasaba una corta fase turbia transparente en aproximadamente el volumen 1 de intercambio de tampón, y después no se detectaba cambio de turbidez durante el resto de diafiltración. Por tanto, usando un tampón de pH 4 de baja fuerza iónica, el procedimiento de diafiltración de dos etapas produce un producto final formulado transparente.

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Ejemplo 9

(Ejemplo de referencia)

Ensayo de estabilidad acelerada a 50ºC

Se usó el ensayo de estabilidad acelerada para determinar la estabilidad de diversas concentraciones de ala-TFPI. Se prepararon muestras en citrato sódico 20 mM a pH 5,5 y arginina 300 mM. Las concentraciones de ala-TFPI variaban de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 7,4 mg/ml. Las muestras acuosas se incubaron a 50ºC durante hasta aproximadamente seis meses. Cada mes, se determinaba el porcentaje de ala-TFPI soluble restante para cada concentración. El ala-TFPI soluble se determinó por HPLC de intercambio catiónico, y los resultados se muestran en la Fig. 11. Como se muestra en la Fig. 11, el ala-TFPI es ligeramente más estable a concentraciones por debajo de 4 mg/ml.

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Ejemplo 10

(Ejemplo de referencia)

Estudios de supervivencia

Se realizó un estudio de ligamiento y punción del ciego murino para comparar un lote de calidad clínica recién preparado de ala-TFPI recombinante (rTFPI) (TFPI 92) con material de calidad clínica que se había desamidado y oxidado parcialmente (TFPI 78). Este modelo induce una infección intraperitoneal y sistémica polimicrobiana por contaminación fecal directa y necrosis del ciego, que imita de forma estrecha la sepsis intra-abdominal humana. Opal y col., Critical Care Medicine 29, 13-18, 2001.

Ambas preparaciones de TFPI se prepararon como se describe en el documento Nº de Serie 60/494.546 presentado el 13 de agosto de 2003, el documento Nº de Serie 60/60/509.277 presentado el 8 de octubre de 2003, y el documento Nº de Serie 60/512.199 presentado el 20 de octubre de 2003. Se dio rTFPI 78, rTFPI 92 o diluyente de control de modo ciego durante 48 horas (SQ q12 horas x cuatro dosis). Antes de y 48 horas después del procedimiento quirúrgico, se extrajo sangre para determinar el nivel de bacteremia cuantitativa, endotoxinas y citoquinas (factor de necrosis tumoral-alfa e interleuquina-6). Los animales se observaron diariamente y se registraron las muertes según ocurrieron. Todos los animales experimentaron evaluación por necropsia para las evidencias histológicas de lesión orgánica y bacteriología cuantitativa al final del periodo experimental.

Las representaciones de supervivencia de Kaplan-Meier se representan en la Fig. 12. Hubo una ventaja de supervivencia significativa para los ratones que recibieron el rTFPI recién preparado en comparación con la forma parcialmente oxidada y desamidada de rTFPI. Ambos grupos de rTFPI resistieron mejor que los ratones que recibieron diluyente en el grupo de control. Como se esperaba, los ratones con operación simulada (intervención quirúrgica con identificación del ciego pero sin ligamiento y punción) sobrevivieron al periodo de estudio de siete días. No hubo diferencias significativas en los criterios de valoración secundarios de bacteremia, endotoxemia, o producción de citoquinas entre los dos grupos tratados con rTFPI.

Este estudio demuestra que TFPI parece ofrecer una ventaja de supervivencia a través de un mecanismo no explicado por los niveles sanguíneos de bacterias, endotoxinas, o citoquinas. El TFPI desamidado y oxidado ofreció menos protección que el TFPI recién preparado.

<110> Chiron Corporation

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<120> Composiciones Liofilizadas Estabilizadas Que Comprenden Inhibidor De La Vía Del Factor Tisular O Variantes Del Inhibidor De La Vía Del Factor Tisular

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<130> 012441.00053

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<150> US 60/438.524

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<151> 08-01-2003

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<150> US 60/494.547

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<151> 13-08-2003

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<150> US 60/509.276

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<151> 08-10-2003

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<150> US 60/512.092

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<151> 20-10-2003

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<160> 1

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<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

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<210> 1

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<211> 276

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

25

Claims

1. Una composición liofilizada que comprende TFPI o ala-TFPI, en la que antes de la liofilización el TFPI o ala-TFPI está presente en una formulación acuosa seleccionada entre el grupo de formulaciones constituido por:

arginina al 3% (p/v), manitol al 4% (p/v), y citrato sódico 10 mM, con un pH de 6;

arginina al 3% (p/v), glicina al 2% (p/v), y citrato sódico 10 mM, con un pH de 6;

sacarosa al 1% (p/v), manitol al 4% (p/v), y L-histidina 10 mM, con un pH de 6;

sacarosa al 1% (p/v), glicina al 2% (p/v), e histidina 10 mM, con un pH de 6;

sacarosa al 1% (p/v), manitol al 4% (p/v), e imidazol 10 mM, con un pH de 6,5; y

sacarosa al 1% (p/v), glicina al 2% (p/v), e imidazol 10 mM, con un pH de 6,5.

2. La composición liofilizada de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la formulación acuosa comprende una concentración de TFPI o ala-TFPI seleccionada entre el grupo de concentraciones constituido por:

no más de 10 mg/ml del TFPI o ala-TFPI;

no más de 1 mg/ml del TFPI o ala-TFPI; y

no más de 0,2 mg/ml del TFPI o ala-TFPI.

3. La composición liofilizada de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2 que comprende ala-TFPI.