ES2310647T3 - Proteinas de union como biosensores. - Google Patents
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Abstract
Un biosensor de glucosa, que comprende: al menos una proteína de unión a glucosa/galactosa mutada que posee al menos una sustitución de aminoácido de una cisteína en la posición 149, en la que el número del aminoácido se refiere a la proteína de unión a glucosa/galactosa de E. coli que posee 309 residuos de aminoácidos, y al menos un grupo indicador unido a la misma, de modo que dicho grupo indicador proporciona un cambio de señal detectable y reversible cuando dicha proteína de unión mutada se expone a varias concentraciones de glucosa, en la que dicho cambio de señal detectable y reversible está relacionado con dichas concentraciones variables.
Description
Proteínas de unión como biosensores.
La invención se encuentra en el campo de la
biotecnología. Específicamente, la invención está dirigida a
composiciones que contienen proteínas de unión mutadas de
glucosa/galactosa que contienen dispositivos biosensores de
analitos de grupos indicadores derivados de las mismas, y a su uso
como biosensores de analitos.
La monitorización de las concentraciones de
glucosa para facilitar un control metabólico adecuado en diabéticos
es un objetivo deseable y mejoraría las vidas de muchos individuos.
Actualmente, la mayoría de los diabéticos usando el procedimiento
de la "punción en el dedo" para controlar sus niveles de
glucosa en sangre y el cumplimiento del paciente supone un problema
debido al dolor que causan las frecuentes punciones (varias veces al
día). Como consecuencia, se han realizado esfuerzos para
desarrollar procedimientos in vivo no invasivos o
mínimamente invasivos y más eficaces in vitro para el
control frecuente y/o continuo de la glucosa en sangre o de otros
fluidos biológicos que contienen glucosa. Algunos de estos
procedimientos más prometedores implican el uso de un biosensor. Los
biosensores son dispositivos capaces de proporcionar información
analítica específica cuantitativa o semicuantitativa usando un
elemento de reconocimiento biológico que se combina con un elemento
transductor (de detección).
El elemento de reconocimiento biológico de un
biosensor determina la selectividad, de modo que sólo el compuesto
que se va a medir conduce a una señal. La selección se puede basar
en el reconocimiento bioquímico del ligando cuando la estructura
del ligando (p. ej., glucosa) no varía, o biocatalizadores en los
que el elemento cataliza una reacción bioquímica del analito.
El transductor traduce el reconocimiento del
elemento de reconocimiento biológico en una señal semicuantitativa o
cuantitativa. Las posibles tecnologías de transducción son ópticas,
electroquímicas, acústicas/mecánicas o colorimétricas. Las
propiedades ópticas que se han explotado incluyen la absorbancia,
la fluorescencia/fosforescencia, bio/quimioluminiscencia,
reflectancia, dispersión de luz e índice de refracción. Se pueden
usar grupos indicadores convencionales tales como compuestos
fluorescentes o, como alternativa, existe la oportunidad de
detección óptica directa, Sin la necesidad de un marcador.
Los biosensores diseñados específicamente pata
la detección de glucosa que usan elementos biológicos para la
transducción se la señal normalmente usando detección
electroquímica o colorimétrica de la actividad de glucosa oxidasa.
Este procedimiento está asociado con dificultades, incluida la
influencia de los niveles de oxígeno, los inhibidores en la sangre y
los problemas con los electrodos. Además, la detección tiene como
resultado el consumo del analito, que puede producir dificultades
al medir concentraciones de glucosa bajas.
Un área del desarrollo de biosensores que está
en rápido avance es el uso de proteínas de unión periplásmicas
(PUP) marcadas con fluorescencia. Como ha comunicado Cass (Anal.
Chem. 1994, 66, 3840-3847), se ha demostrado
eficazmente que una proteína de unión a maltosa (PUM) marcada es un
sensor de maltosa utilizable. En este trabajo, la PUM, que no tiene
residuos de cisteína nativa, se mutó para proporcionar una proteína
con un único residuo de cisteína en una posición a 337 (S337C). La
posición de esta mutación está dentro de la hendidura de unión en
la que se produjo la unión a maltosa y, por tanto, experimenta un
gran cambio ambiental tras la unión de la maltosa. Se estudiaron
numerosos fluoróforos, algunos bloquearon la unión al ligando o
interfirieron con el cambio conformacional de la proteína. De los
estudiados, el IANBD tuvo como resultado un incremento considerable
de la intensidad de la fluorescencia (160%) tras la unión de la
maltosa. Este resultado es consistente con la localización del
fluoróforo que cambia de un entorno hidrofílico o expuesto al
disolvente a un entorno más hidrofóbico como el que se habría
predicho teóricamente para el cierre de la bisagra tras la unión de
la maltosa. No obstante, esta proteína mutante y el grupo indicador
asociado no se unen a los azúcares de importancia diagnóstica en los
fluidos corporales de mamífero. Cass también describió (Analytical
Chemistry, 1998, 70(23), 5111-5113) la
asociación de esta proteína sobre superficies de TiO_{2}, no
obstante, la proteína unida a la superficie sufrió una reducción de
la actividad con el tiempo y requería hidratación constante.
Hellinga y col., (documento US 6.277.627) indica
la ingeniería de un biosensor de glucosa mediante la introducción
de un transductor fluorescente en una proteína de unión a
galactosa/glucosa (PUGG) mutada para que contenga un residuo de
cisteína, aprovechándose de los grandes cambios conformacionales
que se producen tras la unión de la glucosa. Hellinga y col.
(documento US 6.277.627) describen que la transmisión de los cambios
conformacionales en las PUGG mutadas se puede explotar para
construir funciones de transducción de señal integradas que
convierten un suceso de unión a glucosa en un cambio en la
fluorescencia a través de un mecanismo de acoplamiento alostérico.
Se ha comunicado que las funciones de transducción de fluorescencia
interfieren mínimamente en las propiedades de unión intrínsecas del
hueco de unión al azúcar en la PUGG.
\newpage
Con el fin de determinar con precisión la
concentración de la glucosa en soluciones biológicas tales como
sangre, fluidos intersticiales, soluciones oculares o
transpiración, etc., puede ser deseable ajustar la constante de
unión a la molécula sensora de un biosensor de modo que coincida
con el intervalo de funcionamiento fisiológico y/o patológico de la
solución biológica de interés. Sin la constante de unión adecuada,
una señal puede estar fuera del intervalo para una concentración
fisiológica y/o patológica concreta. Además, los biosensores se
pueden configurar usando más de una proteína, cada una de ellas con
una constante de unión diferente, para proporcionar mediciones
precisas en un amplio intervalo de concentraciones de glucosa tal y
como describen Lakowicz (documento US 6.197.534).
A pesar de la utilizada de las PUGG mutadas,
pocas de estas proteínas se han diseñado e investigado, con o sin
grupos indicadores. Mutaciones específicas de sitios y/o unión de
ciertos grupos indicadores pueden actuar para modificar una
constante de unión de un modo impredecible. Además, un biosensor
que contiene grupos indicadores pueden tener una constante de unión
deseable, pero no dar lugar a un cambio de señal fácilmente
detectable tras la unión del analito. Algunos de los factores
primordiales que determinan la sensibilidad de una sonda indicadora
concreta unida a una proteína concreta para la detección de un
analito específico es la naturaleza de las interacciones
específicas entre la sonda seleccionada y los residuos de aminoácido
de la proteína. Actualmente no es posible predecir estas
interacciones dentro de las proteínas usando los procedimientos de
computación existentes, ni tampoco es posible emplear una
metodología de diseño racional para optimizar la elección de sondas
indicadoras. Actualmente no es posible predecir el efecto sobre la
constante de unión o la selectividad basada en la posición de
cualquier grupo indicador o una sustitución de aminoácidos en la
proteína (o viceversa).
Para desarrollar biosensores sin reactivos,
incorporados y/o implantables y/o reutilizables usando proteínas,
el elemento de transducción debe estar en comunicación con un
dispositivo de detección para emitir la señal hacia y desde el
elemento de transducción. Por "emitir" se quiere decir el
procedimiento de enviar luz a una muestra y medir la luz emitida
desde la misma. Los métodos típicos incluyen la colocación de
proteínas en el interior o sobre la superficie de fibras ópticas o
guías de ondas organizadoras utilizando estrategias de
inmovilización. Tales estrategias de inmovilización incluyen el
atrapamiento de la proteína dentro de membranas semipermeables,
matrices de polímeros orgánicos o matrices de polímeros
inorgánicos. La estrategia de inmovilización puede, en último
término, determinar el rendimiento del biosensor en funcionamiento.
La técnica anterior detalla numerosos problemas asociados con la
inmovilización de moléculas biológicas. Por ejemplo, muchas
proteínas sufren cambios conformacionales irreversibles,
desnaturalización y pérdida de actividad bioquímica. Las proteínas
inmovilizadas pueden existe en un gran número de posibles
orientaciones sobre cualquier superficie concreta, por ejemplo con
algunas proteínas orientadas de modo que sus sitios activos están
expuestos, mientras que otras pueden estar orientadas de modo que
sus sitios activos no estén expuestos y, por tanto, no pueden
sufrir reacciones de unión selectiva con el analito. Las proteínas
inmovilizadas son también sujeto de desnaturalización dependiente
del tiempo, desnaturalización durante la inmovilización y pérdida
de la proteína atrapada después de la inmovilización. Por tanto, se
producen problemas, incluida una incapacidad para mantener la
calibración del dispositivo sensor y deriva de la señal. En general,
las proteínas de unión requieren el control de la orientación para
permitir su uso, por tanto, en general, la absorción física y las
estrategias de inmovilización o unión covalente total la
superficie, tal y como se enseña en la literatura, no tienen
éxito.
Por tanto, en la técnica existe la necesidad de
diseñar proteínas mutadas útiles adicionales y proteínas PUGG
mutadas que generen cambios en la señal detectable tras la unión del
analito para usar como biosensores y, además, existe una necesidad
en la técnica de diseñar proteínas de unión mutadas útiles y PUGG
mutadas que contienen grupos indicadores que generan cambios de
señal detectables y reversibles tras la unión del analito o la
glucosa para usar como biosensores.
La invención proporciona un biosensor de glucosa
que comprende:
al menos una proteína de unión a
glucosa/galactosa mutada que posee al menos una sustitución de
aminoácido cisteína en la posición 149, en la que el número del
aminoácido se refiere a la proteína de unión a glucosa/galactosa de
E. coli que posee 309 residuos de aminoácidos, y al menos un
grupo indicador unido a la misma, de modo que dicho grupo indicador
proporciona un cambio de señal detectable y reversible cuando dicha
proteína de unión mutada se expone e varias concentraciones de
glucosa,
en la que dicho cambio de señal detectable y
reversible está relacionado con dichas concentraciones
variables.
Además, la invención proporciona un
procedimiento para la detección de glucosa in vitro que
incluye a) proporcionar al menos una proteína de unión de
glucosa/galactosa mutada como se ha definido antes y al menos un
grupo indicador unido a la misma; b) exponer dicha proteína de
unión de glucosa/galactosa mutada a concentraciones de glucosa
variables; c) detectar un cambio de señal detectable y reversible a
partir de dicho grupo indicador, en el que dicho cambio de señal
detectable y reversible corresponde a dichas concentraciones de
glucosa variables.
La invención también proporciona el uso de la
proteína de unión de glucosa/galactosa mutada como se ha definido
antes para preparar un agente diagnóstico para la detección de
glucosa in vivo.
La invención además proporciona una composición
que comprende una proteína de unión de glucosa/galactosa mutada que
tiene al menos una sustitución de aminoácido que es una cisteína en
la posición 149, en la que el número de aminoácido se refiere a la
proteína de unión a glucosa/galactosa de E. coli que posee
309 residuos de aminoácidos.
La proteína de unión de glucosa/galactosa mutada
mencionada en lo que antecede utilizada en el biosensor, agente,
procedimiento o composición de diagnóstico puede presentar
sustituciones adicionales seleccionadas de cisteína en la posición
1, una serina en la posición 1, una cisteína en la posición 11, una
cisteína en la posición 14, una cisteína en la posición 19, una
cisteína en la posición 43, una cisteína en la posición 74, una
cisteína en la posición 107, una cisteína en la posición 110, una
cisteína en la posición 112, una cisteína en la posición 113, una
cisteína en la posición 137, una cisteína en la posición 213, una
cisteína en la posición 216, una cisteína en la posición 238, una
cisteína en la posición 287, una cisteína en la posición 292, una
cisteína en la posición 152, una cisteina en la posición 182, una
cisteína en la posición 236, y una cisteína en la posición 296.
También se proporciona en la presente invención
un biosensor, agente, procedimiento o composición diagnóstico que
comprende una proteína de unión de glucosa/galactosa mutada que
posee al menos dos sustituciones de aminoácidos seleccionados del
grupo compuesto por una cisteina en la posición 112 y una serina en
la posición 238, una cisteína en la posición 149 y una serina en la
posición 238, una cisteína en la posición 152 y una cisteína en la
posición 182, una cisteína en la posición 152 y una serina en la
posición 213, una cisteína en la posición 213 y una cisteína en la
posición 238, una cisteína en la posición 149 y una arginina en la
posición 213, una cisteina en la posición 149 y una serina en la
posición 213 y una serina en la posición 238 y una cisteína en la
posición 149 y una arginina en la posición 213 y una serina en la
posición 238. Ejemplos adicionales de proteínas de unión de
glucosa/galactosa mutadas se muestran a continuación en la Tabla 1.
Los números de residuos de aminoácidos se refieren a la secuencia
publicada de E. coli que posee 309 residuos, como se detalla
más adelante, o el residuo de aminoácido correspondiente en
cualquier secuencia sustancialmente homóloga de una fuente
alternativa (p. ej., proteínas de unión de glucosa/galactosa de
Citrobacter freundii o Salmonella typhimurium, números
de registro de la secuencia P23925 y P23905, respectivamente).
La Figura 1 ilustra el cambio en la respuesta de
fluorescencia a una serie de concentraciones de glucosa para
A213C/L238C NMD amida PUGG H_{6} en solución.
La Figura 2 ilustra el cambio en la respuesta de
fluorescencia a una serie de concentraciones de glucosa para
E149C/A213R NBD amida PUGG H_{6} en solución.
La Figura 3 ilustra la transducción de señal
reversible de una proteína de unión mutada tras la exposición a
soluciones de glucosa a las concentraciones indicadas.
El término biosensor normalmente se refiere a un
dispositivo que isa reacciones bioquímicas específicas mediadas por
enzimas aisladas, inmunosistemas, tejidos, orgánulos o células
enteras para detectar compuestos químicos, normalmente mediante
señales eléctricas, térmicas u ópticas. Como se usa en la presente
memoria descriptiva, un "biosensor" se refiere a una proteína
capaz de unirse a un analito que pueda usarse para detectar un
analito o un cambio en la concentración del analito mediante un
detector, como se describe en la presente memoria descriptiva.
El término "proteínas de unión" se refiere
a proteínas que interaccionan con analitos específicos de un modo
capaz de proporcionar o translucir una señal detectable y/o
reversible diferenciable de cuando el analito no está presente, el
analito está presente en concentraciones variables en el tiempo o
de un modo dependiente de la concentración, por medio de los
procedimientos descritos en la presente memoria descriptiva. El
suceso de transducción incluye medios continuos, programados y
episódicos, incluidas las aplicaciones de un solo empleo o
reutilizables. La transducción de señal reversible puede ser
instantánea o puede depender del tiempo siempre que se establezca
una correlación con la presencia o la concentración del analito. Se
prefieren las proteínas de unión mutadas de tal modo que efectúen
la transducción.
El término "proteína de unión a
galactosa/glucosa" o "PUGG", como se usa en la presente
memoria descriptiva, se refiere a un tipo de proteína natural del
compartimento periplásmico de las bacterias. Estas proteínas están
implicadas de forma natural en la quimiotaxis y el transporte de
moléculas pequeñas (p. ej., azúcares, aminoácidos y péptidos
pequeños) en el citoplasma. La PUGG es una proteína de cadena
sencilla constituida por dos dominios \alpha/\beta globulares
que están conectados por tres hebras para formar una bisagra. El
sitio de unión se localiza en la hendidura entre los dos dominios.
Cuando la glucosa entra en el sitio de unión, la PUGG sufre un
cambio conformacional, centrado en la bisagra, que junta los dos
dominios y atrapa a la glucosa en el sitio de unión. Se han
determinado estructuras cristalográficas por rayos X pata la forma
cerrada de la PUGG de E. coli (N. K. Vyas, M. N. Vyas, F. A.
Quiocho Science 1988, 242, 1290-1295) y S.
typhimurium (S. L. Mowbray, R. D. Smith, L. B. Cole Receptor,
1990, 1, 41-54) Y ESTÁN DISPONIBLES en el banco de
datos de proteínas (http://www.resb.org/pdb/) COMO 2PUG y
3PUG, respectivamente. El ADN de OUGG de E. coli natural y la
secuencia de aminoácidos se pueden encontrar en
www.ncbi.nim.nih.gov/entrez/accesionnumber D90885 (clon
genómico) y número de registro 230520 (secuencia de aminoácidos).
La PUGG preferida procede de E. coli.
La "proteína de unión mutada" (por ejemplo
"PUGG mutada"), como se usa en la presente memoria
descriptiva, se refiere a las proteínas de unión de bacterias que
contienen aminoácidos que han sido sustituidos, delecionados o
añadidos a los aminoácidos presentes en la proteína natural.
Preferentemente, tales sustituciones, deleciones o inserciones
implican menos de 5 residuos de aminoácidos, más preferentemente
uno o dos residuos. Ejemplos de mutaciones de proteínas de unión
incluyen la adición o sustitución de grupos de cisteina,
aminoácidos no naturales (Turcatti y col., J. Bio, Chem. 1996 271,
33, 19991-19998) y sustitución de aminoácidos
sustancialmente no reactivos con aminoácidos reactivos para
proporcionar la unión covalente de grupos indicadores
electroquímicos o fotorespondedores. Por aminoácido "reactivo"
se quiere decir un aminoácido que se puede modificar con un agente
marcador análogo al marcaje de cisteína con un pigmento reactivo al
tiol. Entre los aminoácidos no reactivos se incluyen alanina,
leucina, fenilalanina, y otros, que poseen cadenas laterales que no
pueden modificarse con facilidad una vez que se han incorporado en
una proteína (véase Greg T. Hermanson, Bioconjugate Techniques,
Academic Press, 1996, San Diego, pág. 4-16 para la
clasificación de la reactividad de las cadenas laterales de
aminoácidos).
Además de la sustitución de al menos un
aminoácido que es una cisteína en la posición 149, entre los
ejemplos de mutaciones de la proteína PUGG se incluyen una cisteína
sustituida por una lisina en la posición 11 (K11C); una cisteína
sustituida por ácido aspártico en la posición 14 (D14C); una
cisteína sustituida por valina en la posición 19 (V 19C); una
cisteína sustituida por asparagina en la posición 43 (N43C); una
cisteína sustituida por glicina en la posición 74 (G74C); una
cisteína sustituida por tirosina en la posición 197 (Y107C); una
cisteína sustituida por treonina en la posición 110 (T110C); una
cisteína sustituida por serina en la posición 112 (S112C); un
mutante doble que incluye una cisteína sustituida por serina en la
posición 112 y una serina sustituida por leucina en la posición 238
(S112C/L238S); una cisteina sustituida por lisina en la posición
113 (K113C); una cisteína sustituida por lisina en la posición 137
(K137C); una cisteína sustituida por ácido glutámico en la posición
149 (E149C); un doble mutante que incluye una cisteína sustituida
por ácido glutámico en la posición 149 y una serina sustituida por
leucina en la posición 238 (E149/L238S); un doble mutante que
comprende una cisteína sustituida por histidina en la posición 152 y
una cisteína sustituida por metionina en la posición 182
(H152C/M182C); un doble mutante que incluye una serina sustituida
por alanina en la posición 213 y una cisteína sustituida por
histidina en la posición 152 (H152C/A213S); una cisteína sustituida
por metionina en la posición 182 (M182C); una cisteína sustituida
por alanina en la posición 213 (A213C); un doble mutante que
incluye una cisteina sustituida por alanina en la posición 213 y
una cisteína sustituida por leucina en la posición 238
(A213C/L238C); una cisteina sustituida por metionina en la posición
216 (M216C); una cisteína sustituida por ácido aspártico en la
posición 236 (D236C); una cisteína sustituida por leucina en la
posición 238 (L238C); una cisteina sustituida por ácido aspártico
en la posición 287 (D287C), una cisteína sustituida por arginina en
la posición 292 (R292C); una cisteina sustituida por una valina en
la posición 296 (V296C); un mutante triple que incluye una cisteína
sustituida por ácido glutámico en la posición 149, una alanina
sustituida por serina en la posición 213 y una serina sustituida por
leucina en la posición 238 (E149C/A213S/L238S); y un mutante triple
que incluye una cisteína sustituida por ácido glutámico en la
posición 149, una arginina sustituida por una alanina en la
posición 213 y una serina sustituida por leucina en la posición 238
(E149C/A213r/L238S). También están incluidos los mutantes
cuádruples (y mayores), por ejemplo un mutante en el que la serina
sustituye a la alanina en la posición 1, la cisteína sustituye al
ácido glutámico en la posición 149, la arginina sustituye a la
alanina en la posición 213 y la serina sustituye a la leucina en la
posición 238 (Al S, E149C, A213R, L238S); un mutante en el que la
serina sustituye a la alanina en la posición 1, la cisteína
sustituye al ácido glutámico en la posición 149, la serina sustituye
a la alanina en la posición 213 y la serina sustituye a la leucina
en la posición 238 (A1S, E149C, A213S, L238S); y un mutante en el
que la cisteína sustituye al ácido glutámico en la posición 149, la
cisteína sustituye a la metionina en la posición 182, la cisteina
sustituye a la alanina en la posición 213 y la serina sustituye a
la leucina en la posición 238 (E149C, M182C, A213S, L238S).
La mutación puede servir para uno o varios
propósitos. Por ejemplo, una proteína natural puede mutar con el
fin de cambiar la estabilidad a largo plazo de la proteína;
conjugar, unir, acoplar o asociar de otro modo la proteína con una
matriz o polímero de encapsulación concreto; proporcionar sitios de
unión para grupos indicadores detectables; ajustar su constante de
unión con respecto a un analito concreto; o cualquier combinación
de estos.
En la presente invención, el analito y la
proteína mutada actúan como socios de unión. El término
"asocia" o "une", como se usa en la presente memoria
descriptiva, se refiere a socios de unión que tienen una constante
de unión relativa (K_{d}) suficientemente fuerte para permitir la
detección de la unión a la proteína a través de un medio de
detección. La K_{d} puede calcularse como la concentración de
analito libre a la que se unen la mitad de la proteína, o
viceversa. Cuando el analito de interés es glucosa, los
valores de K_{d} para los socios de unión son, preferentemente,
entre aproximadamente 0,0001 mM a aproximadamente 30 mM, más
preferentemente los valores de K_{d} varían de aproximadamente 1
mM a 15 mM en la presente invención.
En la presente invención se ha mostrado que PUGG
mutadas pueden usarse para detectar la unión a glucosa mediante su
fijación a un grupo indicador que traduce un cambio de señal
detectable tras la unión de la glucosa. "Proporcionar un cambio
de señal detectable", como se usa en la presente invención, se
refiere a la capacidad para reconocer un cambio en una propiedad de
un grupo indicador de modo que permita la detección de la unión
ligando-proteína. Por ejemplo, en una forma de
realización, las PUGG mutadas comprenden un grupo indicador
detectable cuyas características detectables se alteran tras un
cambio en la conformación de la proteína que se produce en la unión
de la glucosa. En una forma de realización preferida, el grupo
indicador es un marcador luminiscente que tiene como resultado una
PUGG mutada con afinidad por glucosa que produce una deriva
detectable en las características de la luminiscencia sobre la
unión a la glucosa. El cambio en las características detectables
puede deberse a una alteración en el ambiente del marcador, que se
une a la PUGG mutada.
El marcador luminiscente puede ser un marcador
fluorescente o un marcador fosforescente. Se prefiere el uso de
marcadores fluorescentes que pueden excitarse para emitir
fluorescencia mediante la exposición a ciertas longitudes de onda
de luz.
\global\parskip0.870000\baselineskip
En una forma de realización, el grupo indicador
es un fluoróforo. Como se usa en la presente memoria descriptiva,
"fluoróforo" se refiere a una molécula que absorbe energía y
después emite luz. Ejemplos no limitantes de fluoróforos útiles
como grupos indicadores en esta invención incluyen fluoresceína,
cumarinas, rodaminas, 5-TMRIA
(tetrametilrodamina-5-yodoacetamida),
Quantum Red^{TM}, Texas Red^{TM}, Cy3,
N-((-2-yodoacetoxi)etil)-N-metil)amino-7-nitrobenzoxadiazol
(IANBD),
5-acriloil-2-dimetilaminonaftaleno
(acrilodán), pireno, amarillo lucifer, Cy5, Dapoxyl®
(2-bromoacetamidoetil)sulfonamida,
(N-(4,4-difluoro-1,3,5,7-tetrametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-2-il)yodoacetamida
(Bodipy597/545IA),
N-(4,4-difluoro-5,7-difenil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-propionil)-N-yodoacetiletilendiamina
(BODIPY® 530/550 IA) ácido
5-((((2-yodoacetil)amino)etil)amino)naftaleno-1-sulfónico
(1,5-IAEDANS) y
carboxi-X-rodamina,
5/6-yodoacetamida (XRIA 5,6). Preferentemente Se
usa IANBD. Muchas propiedades intrínsecas detectables de un grupo
indicador fluoróforo pueden controlarse para detectar la unión de
glucosa. Algunas propiedades que exhiben cambios tras la unión de la
glucosa incluyen duración de la fluorescencia, intensidad de la
fluorescencia, anisotropía o polarización de la fluorescencia y los
desplazamientos espectrales de la emisión de fluorescencia. Los
cambios en estas propiedades del fluoróforo pueden inducirse a
partir de cambios en el ambiente del fluoróforo tal como los
resultantes de los cambios en la conformación de la proteína. Los
pigmentos sensibles al ambiente, como IANBD, son particularmente
útiles a este respecto. Otros cambios de las propiedades del
fluoróforo pueden resultar de las interacciones con el propio
analito o de interacciones con un segundo grupo indicador, por
ejemplo cuando se usa FRET (transferencia de energía de resonancia
de fluorescencia) para controlar los cambios en la distancia entre
dos fluoróforos.
Aunque se desea el uso de marcadores
fluorescentes, se ha contemplado que se pueden usar otros grupos
indicadores. Por ejemplo, se pueden usar grupos indicadores
electroquímicos en los que una alteración en el ambiente del
indicador dará lugar a un cambio en su estado redox. Tal cambio se
puede detectar usando un electrodo.
Además, se ha previsto que se pueden usar otros
marcadores espectroscópicamente detectables, por ejemplo marcadores
detectables mediante RMN (resonancia magnética nuclear), como se
conocen en la técnica.
El grupo indicador se puede fijar a la proteína
mutada o a las PUGG por cualquier medico convencional conocido en
la técnica. Por ejemplo el grupo indicador puede fijarse a través
de residuos de aminas o de carboxilo sobre la proteína. No
obstante, es especialmente preferido el acoplamiento covalente a
través de grupos tiol sobre los residuos de cisteína. Por ejemplo,
para PUGG mutadas, en la presente invención se prefieren las
cisteínas localizadas en la posición 11, posición 14, posición 19,
posición 43, posición 74, posición 107, posición 110, posición 112,
posición 113, posición 137, posición 149, posición 152, posición
213, posición 216, posición 238, posición 287 y posición 292.
Cualquier grupo reactivo frente a tiol conocido
en la técnica se puede usar para fijar grupos indicadores tales
como fluoróforos a una cisteína de una proteína sometida a
ingeniería. Por ejemplo, una yodoacetamida, bromoacetamida o
maleimida son restos reactivos frente a tiol bien conocidos que
pueden usarse para este propósito.
Los fluoróforos que funcionan a longitudes de
onda prolongadas de excitación y emisión (por ejemplo, a longitudes
de onda de excitación y emisión de aproximadamente 600 nm o
mayores) se prefieren cuando el sensor molecular debe usarse in
vivo, por ejemplo, se va a incorporar en un dispositivo
biosensor implantable (donde la piel es opaca por debajo de 600 nm).
Actualmente, se dispone de pocas sondas sensibles al ambiente en
esta región del espectro y, quizá ninguna con grupos funcionales
reactivos frente a tiol. No obstante, se pueden preparar derivados
reactivos a tiol de Cy-5, por ejemplo tal y como
indican H. J. Gruber y col., Bioconjugate Chem. (2000), 11,
161-166. Los conjugados que contienen estos
fluoróforos, por ejemplo, fijados a varios mutantes de cisteína
construidos en PUGG mutadas, se pueden someter a detección
selectiva para identificar aquéllos que producen el mayor cambio en
la fluorescencia tras la unión de la glucosa.
Las PUGG mutadas se pueden someter a ingeniería
para que tengan una marca de histidina sobre el extremo N, el
extremo C, o de ambos, de las proteínas. Las proteínas de fusión de
histidina son ampliamente usadas en el campo de la biología
molecular para ayudar en la purificación de proteínas, Ejemplos de
sistemas de marcaje producen proteínas con una cola que contiene
aproximadamente seis histidinas y, preferentemente, tal marcaje no
compromete la actividad de unión a la PUGG mutada.
La presente invención también proporciona un
biosensor y un procedimiento para preparar un agente diagnóstico
pata la detección de glucosa in vivo. En este aspecto, el
biosensor está compuesto por una o más proteínas de unión mutadas
que están encapsuladas en una matriz. El 5 biosensor encapsulado
puede, después, usarse como un dispositivo implantable o parte del
mismo.
La ``matriz puede estar en cualquier forma o
conformación deseable, incluidos un disco, cilindro, parche,
microesfera, polímero poroso, espuma de células abiertas o
similares, siempre que sea permeable al analito. La matriz además
impide la fuga del biosensor. La matriz permite que la luz
procedente de fuentes ópticas o de cualquier otra luz emitida que
se dirija o proceda del grupo indicador atraviese el biosensor. El
medio de determinación o detección de un cambio en la concentración
del analito puede, en una forma de realización, ser continuo. Como
alternativa, el medio de determinación o detección de la
concentración del analito puede estar programado o ser
episódico.
El biosensor in vivo previsto de la
presente invención comprende al menos una proteína de unión mutada
en una matriz de atrapamiento o encapsulación permeable al analito,
de modo que la proteína de unión mutada proporcione un cambio de
señal detectable y reversible cuando la proteína de unión mutada
esté expuesta a varias concentraciones del analito y la señal
detectable y reversible puede estar relacionada con la concentración
del analito.
\global\parskip1.000000\baselineskip
En este aspecto de la invención, la
configuración del elemento de transducción puede, por ejemplo,
incorporarse en el extremo distal de una fibra o de otra sonda
pequeña mínimamente invasiva e insertarse dentro del tejido de un
paciente para los procedimientos de uso, incluida la lectura
episódica, continua o programada, en el paciente. Los biosensores
implantables pueden, en algunas formas de realización, implantarse
en el interior o debajo de la piel de un pliegue
epidérmico-dérmico de un mamífero para que
interaccionen con el fluido intersticial, tejido u otros fluidos
biológicos.
Un ejemplo de procedimiento que puede usarse
para detectar la presencia de un analito usando el biosensor para el
uso in vivo descrito en la presente memoria descriptiva
incluye la emisión del implante con una fuente de luz remota, la
detección de la seña del grupo indicador-proteína y
la determinación de la cantidad de glucosa sobe la base de una
relación con la señal detectada, como se conoce en la técnica
(véanse los documentos US 5.517.313, US 5.910.661 y US
5.342.789).
Los biosensores de proteína de unión de esta
invención son capaces de medir o detectar concentraciones del
analito dentro del intervalo micromolar (10^{-6} molar) a molar,
sin consumo de reactivos. En algunas formas de realización, su
sensibilidad para el analito puede permitir el uso de los
biosensores para medir las concentraciones bajas del analito que se
sabe que están presentes en volúmenes pequeños de muestras de
fluido intersticial u ocular y de perspiración. Los biosensores de
proteína de unión de la presente invención proporcionan los medios
para controlar el analito de forma continua, episódica o "a
demanda", como sea adecuado para el usuario o para el
tratamiento de una afección.
En otras formas de realización, la sensibilidad
de los biosensores al analito (por ejemplo, glucosa) es tal que
pueden usarse para analizar los niveles en sangre del analito o se
pueda determinar la concentración del analito en una solución
biológica u otra solución. Como se usa en la presente memoria
descriptiva, una "solución biológica" incluye, entre otras,
sangre, transpiración y/o fluido ocular o intersticial, incluidas
combinaciones de estos.
Los ejemplos siguientes ilustran ciertas formas
de realización preferidas de la presente invención pero no se
pretende que sean ilustrativos de todas las formas de
realización.
La PUGG está codificada en el gen
Mg1B-1 en E. coli. Esta proteína se alteró
introduciendo el aminoácido cisteína en varias posiciones mediante
mutagénesis dirigida por sitio del gen Mg1 B-1. A
continuación, estas proteínas se expresaron en E. coli y se
purificaron.
La mutagénesis por casete del
Mg1B-1 se consiguió del siguiente modo. El gen de
Mg1B-1 natural se clonó en un vector Ptz18r (Dr.
Anthony Cass, Imperial College, Londres, Inglaterra). A partir de
este plásmido parental se generaron plásmidos mutantes usando
mutagénesis por casete mediante la que se produjeron secuencias
aminoacídicas aleatorizadas, esencialmente como ha descrito Kunkel
(1991), y se clonaron en E. coli JM109 (Promega Life Science,
Madison WI). Los plásmidos mutantes se identificaron mediante
secuenciación. La proteína mutante se indujo en JM109 y se purificó
tal y como se ha descrito más adelante. Una colonia de E.
coli JM109 que contiene el plásmido mutante se cultivó durante
la noche a 37ºC con agitación (220 rpm) en caldo LB que contiene 50
\mug/ml de ampicilina (LB/Amp). el cultivo durante la noche se
diluyó a 1:100 en 1 l de LB/Amp reciente y se incubó a 37ºC con
agitación hasta que la DO600 del cultivo fue
0.3-0,5. La expresión del mutante se indujo
mediante la adición de IPTG 1 mM (Life Technologies, Gaithersburg,
MD) a concentración final con incubación continua y agitando a 37ºC
durante 4-6 horas. Las células se recogieron
mediante centrifugación (10.000 x g, 10 min, 4ºC).
La proteína mutante se recolectó mediante choque
osmótico y se purificó mediante cromatografía en columna. El
sedimento celular se resuspendió en un tampón de sacarosa
(Tris-HCL 30 Mm, pH 8,0, sacarosa al 20%, EDTA 1
mM), se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos y después
se centrifugó (4000 x g, 15 min, 4ºC). El sobrenadante se extrajo y
se mantuvo en hielo. El sedimento celular se resuspendió y repitió
con 10 ml de H_{2}O desionizada estéril y helada, y la suspensión
se incubó en hielo y se centrifugó. El sobrenadante restante se
combinó con los demás sobrenadantes recolectados y se centrifugó
una vez más (12.000 x g, 10 min, 4ºC). El producto de choque
osmótico combinado se filtró a través de un filtro de 0,8 \mum y,
después, de 0,45 \mum. Al producto de choque osmótico se añadió
sulfato de estreptomicina (Sigma Chemical Co., San Luis, MO), 5%
v/v, y se agitó una vez durante 30 min, seguido por centrifugación
(12.000 x g, 10 min, 4ºC). A continuación, el SHOCKATE se concentró
usando filtros de Amicon Centriprep 10 (10.000 COPM) (Charlotte,
NC) y se dializaron durante la noche frente a
Tris-HCl 5 mM, pH 8,0, MgCl_{2} 1 mM. El producto
de choque osmótico dializado se centrifugó (12.000 x g, 30 min,
4ºC). El sobrenadante resultante se añadió a una columna de
sefarosa de flujo rápido con DEAR y pre-equilibrada
(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) a 0,5 ml/min. La
columna se lavó con 5-10 volúmenes de columna. A la
columna se aplicó un gradiente lineal de NaCl 0-0.2M
y se recogieron las fracciones. La proteína mutante que contiene
las fracciones se identificó mediante SDS-PAGE con
tinción con azul de Coomassie brillante (pm aprox., 32 kDa). Las
fracciones se combinaron y dializaron durante la noche (4ºC) contra
solución salina tamponada con fosfato (PBS) o bicarbonato amónico
10 mM (pH 7,4) concentrado usando filtros de Amicon Cetriprep y se
almacenó a 4ºC o -20ºC con glicerol. La proteína dializada con
bicarbonato amónico se liofilizó.
Los mutantes de PUGG se sometieron a ingeniería
mediante mutagénesis dirigida por sitio o mutagénesis de casete. La
mutagénesis dirigida por sitio (QuickChange, Stratagene, La Jolla,
CA) se realizó para alterar los aminoácidos en el vector pQE70
sustituyendo un aminoácido por otro, específicamente el
aminoácido escogido. El procedimiento de la mutagénesis de casete
(Kunkel, 1991) se realizó para aleatorizar los aminoácidos de
una región específica del gen de la PUGG. A continuación, los
casetes mutados se subclonaron en el vector de expresión pQE70.
El plásmido pPUGG-His contenía
el gen de la PUGG clonado en el vector de expresión pQE70 (Qiagen,
Valencia, CA). Este constructor lleva seis residuos de histidina en
el extremo C del gen de la PUGG. Para sobreexpresar la
PUGG-His mutante se usó la cepa de E. coli
SG13009 siguiendo los procedimientos estándar (Qiagen). Tras la
sobreexpresión de un cultivo de 250 ml, las células se recolectaron
mediante centrifugación (6000 rpm) y se resuspendieron en 25 ml de
Bugbuster de (Novagen, Madison, WI), lisozima (se añadieron 25 mg al
lisado y la mezcla se mezcló suavemente a temperatura ambiente (TA)
durante 30 minutos. Mediante centrifugación (6000 rpm) se produjo
un lisado transparente y a éste se añadieron 0,5 ml de imidazol (1M)
y 3 ml de perlas de NI-NTA (Qiagen). Tras 30
minutos de mezcla suave a TA, la mezcla se centrifugó (6000 rpm) y
se extrajo el lisado. Las perlas se lavaron con 25 ml de solución
(NaCl 1M, Tris 10 mM, pH 8,0) y se recentrifugaron. La
PUGG-His mutante se eluyó de las perlas mediante la
adición de 5 ml de solución (imidazol 160 mM, NaCl 1M, Tris 10 mM,
pH 8,0) y la mezcla durante 15 minutos. La solución proteica se
filtró inmediatamente a través de un filtro Centriplus
YM-100 (Amicon, Charlotte, NC) y después se
concentró hasta 1-3 mg/ml usando un Centriplus
YM-10. La proteína se dializó durante la noche
frente a 2 l de solución de almacenamiento (NaCl 1M, Tris 10 mM,
NaPO_{4} 50 mM, pH 8,0).
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Un alícuota de la PUGG mutante que contiene
cisteína (4,0 nmol) en PBS se trató con ditiotreitol 2 mM (5
\mul, 10 nmol) durante 30 min. Una solución madre de
N,N'-dimetil-N-(yodoacetil)-N'-(7-nitrobenc-2-oxa-1,3-diazol-4-il)etilendiamina
(IANBD amida, 0,5 mg) se preparó en DMSO (100 \mul, 11,9 Mm) y
se añadieron 3,36 \mul (40 nmol) a la proteína. La reacción
procedió a temperatura ambiente durante 4 h en un Dynal Rotamix en
oscuridad. La proteína marcada se purificó mediante filtración en
gel en una columna NAP-5 (Amersham Pharmacia). Los
índices de marcaje se determinaron usando un coeficiente de
extinción estimado (50 mM^{-1} cm^{-1}) para la PUGG, que se
calculó en GeneWorks 2,45 (IntelliGenetics), \varepsilon_{478}
(IANBD amida)= 25 mM^{-1} cm^{-1}) y una medición de la DO para
una solución estándar de IANBD amida a 280 nm y 478 nm. La
concentración del pigmento en la proteína se calculó como la
C_{pigmento}= A_{478}/\varepsilon_{478}. La absorbancia de la
proteína a 280 nm se calculó como A_{prot(280)}=
A_{total(280)}-A_{pigmento(280)},
en la que A_{pigmento(280)}= A_{478} x (=
A_{280}/A_{478})_{pigmento \ st}. La concentración de
la proteína fue C_{prot(280)}=
A_{prote(280)}/\varepsilon_{280}. En la tabla 1 se
resumen los cambios en la fluorescencia de varias PUGG mutantes
marcadas con grupos indicadores, incluidos los grupos indicadores
que tienen una excitación o emisión máximas de al menos 600
nanómetros. En la tabla 2 se resumen los cambios en la
fluorescencia y los valores K_{d} determinados de las mutaciones
de una, dos tres y cuatro sustituciones de aminoácidos. Este dato
claramente muestra que las mutaciones de la PUGG marcada con grupo
indicador pueden proporcionar características deseables como
biosensores de glucosa. El dato muestra la relación
mutación-grupo indicador para las muestras
analizadas. La Figura 1 ilustra el cambio en la respuesta de
fluorescencia a varias concentraciones de glucosa de A213C/L238C NBD
amida PUGG-H_{6}, como ejemplo representativo, en
solución. La Figura 2 ilustra el cambio en la respuesta de
fluorescencia a varias concentraciones de glucosa de E149C/A213R
NBD amida PUGG H_{6}, como otro ejemplo representativo, en
solución.
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EL cambio en la fluorescencia (\DeltaF, Tabla
2) se midió en forma del porcentaje de diferencia en la
fluorescencia entre 0 y 1 mM de glucosa a 0,5 \muM de proteína
usando un fluorímetro SLM Aminco (Ontario, Canadá) con parámetros
en hendidura de 8 y 4 para la excitación y configuraciones de 5 y 5
sobre el monocromador de emisión MC250.
Las constantes de unión (Tabla 2) se
determinaron mediante titulación de concentraciones crecientes de
glucosa en una solución proteica (PBS) 0,1 \muM con mezclado tras
cada adición de glucosa. Los parámetros en hendidura fueron los
mismos que se han indicado antes. La K_{d} se determinó a partir
de las relaciones siguientes mediante adaptación de Pisarchick y
Thompson (1990):
\vskip1.000000\baselineskip
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en la que F es la intensidad de la
fluorescencia, F_{inf} es la fluorescencia en el infinito,
F_{0} es la fluorescencia a glucosa 0 y x es la concentración de
glucosa libre ([Glc]I_{ibre}) determinada mediante la
relación:
\vskip1.000000\baselineskip
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en la que [Glc]_{tot} y
[Prot]_{tot} son las concentraciones totales de glucosa y
proteínas,
respectivamente.
Usando un fluorímetro Varian Eclipse con un
dispositivo de fibra óptica, la proteína PUGG L238/A213C (2M en
tampón PBS) atrapada en una membrana de diálisis y con un punto de
corte molecular de 3500 dalton se fijó al extremo distal de la
fibra. Se prepararon soluciones que contenían tampón PBS, 2 mM y
glucosa 20 mM en tampón PBS. Con la sonda en la solución de PBS,
las lecturas se registraron a intervalos de 0,02 segundos de la
longitud de onda de emisión a 521 nm, seguido por la inserción de
la fibra en las soluciones de glucosa. La sustitución de la fibra
en solución con únicamente tampón tuvo como resultado el retorno de
la señal inicial. La Figura 3 representa múltiples ciclos que
alternan entre las soluciones de tampón y de glucosa, lo que
demuestra la reversibilidad del biosensor atrapado dentro de una
matriz permeable dentro del intervalo fisiológico.
Claims (28)
1. Un biosensor de glucosa, que comprende:
- al menos una proteína de unión a glucosa/galactosa mutada que posee al menos una sustitución de aminoácido de una cisteína en la posición 149, en la que el número del aminoácido se refiere a la proteína de unión a glucosa/galactosa de E. coli que posee 309 residuos de aminoácidos, y al menos un grupo indicador unido a la misma, de modo que dicho grupo indicador proporciona un cambio de señal detectable y reversible cuando dicha proteína de unión mutada se expone a varias concentraciones de glucosa, en la que dicho cambio de señal detectable y reversible está relacionado con dichas concentraciones variables.
2. El biosensor de la reivindicación 1, en el
que dicha proteína de unión a glucosa/galactosa mutada comprende al
menos una sustitución de aminoácidos adicional, al menos dos
sustituciones de aminoácidos adicionales o al menos tres
sustituciones de aminoácidos adicionales.
3. El biosensor de la reivindicación 1 ó 2, en
el que proteína de unión a glucosa/galactosa mutada presenta
sustituciones de aminoácidos adicionales seleccionados de una
cisteína en la posición 1, una serina en la posición 1, una
cisteína en la posición 11, una cisteína en la posición 14, una
cisteína en la posición 19, una cisteína en la posición 43, una
cisteína en la posición 74, una cisteína en la posición 107, una
cisteína en la posición 110, una cisteína en la posición 112, una
cisteína en la posición 113, una cisteína en la posición 137, una
cisteína en la posición 213, una cisteína en la posición 216, una
cisteína en la posición 238, una cisteína en la posición 287, una
cisteína en la posición 292, una cisteína en la posición 152, una
cisteína en la posición 182, una cisteína en la posición 236, y una
cisteína en la posición 296.
4. El biosensor de la reivindicación 2, en el
que dicha proteína de unión a glucosa/galactosa mutada comprende al
menos dos sustituciones de aminoácidos que se seleccionan de una
cisteína en la posición 149 y una serina en la posición 238, una
cisteína en la posición 149 y una arginina en la posición 213, una
cisteína en la posición 149 y una cisteína en la posición 213, una
cisteina en la posición 149 y una treonina en la posición 213, una
cisteina en la posición 149 y una leucina en la posición 213, una
cisteína en la posición 149 y una tirosina en la posición 213, una
cisteína en la posición 149 y una asparagina en la posición 223,
una cisteína en la posición 149 y una cisteína en la posición 238,
una cisteína en la posición 149 y una serina en la posición 256, y
una cisteína en la posición 149 y una arginina en la posición
256.
5. El biosensor de la reivindicación 2, en el
que dicha proteína de unión a glucosa/galactosa mutada comprende al
menos tres sustituciones de aminoácidos que se seleccionan de una
cisteína en la posición 149, una serina en la posición 213 y una
serina en la posición 238; una cisteína en la posición 149, una
arginina en la posición 213 y una serina en la posición 238; una
cisteína en la posición 149, una cisteína en la posición 213 y una
cisteína en la posición 238; una cisteína en la posición 149, una
cisteína en la posición 213 y una asparagina en la posición 223; y
una cisteína en la posición 149, una asparagina en la posición 223
y una arginina en la posición 256.
6. El biosensor de la reivindicación 2, en el
que dicha proteína de unión a glucosa/galactosa mutada comprende al
menos cuatro sustituciones de aminoácidos que se seleccionan de una
serina en la posición 1, una cisteína en la posición 149, una
arginina en la posición 213 y una serina en la posición 238; una
serina en la posición 1, una cisteína en la posición 149, una serina
en la posición 213 y una serina en la posición 238; y una cisteína
en la posición 149, una cisteína en la posición 182, una cisteína
en la posición 213 y una serina en la posición 238.
7. El biosensor de la reivindicación 6, en el
que dichas cuatro sustituciones de aminoácidos son una serina en la
posición 1, una cisteína en la posición 149, una arginina en la
posición 213 y una serina en la posición 238.
8. El biosensor de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha proteína de unión a
glucosa/galactosa mutada comprende además al menos una marca de
histidina.
9. El biosensor de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho grupo indicador es un
marcador luminiscente.
10. El biosensor de la reivindicación 9, en el
que dicho marcador luminiscente posee una longitud de onda de
excitación de más de 600 nanómetros.
11. El biosensor de la reivindicación 9, en el
que dicho marcador luminiscente posee una longitud de onda de
emisión de más de 600 nanómetros.
12. El biosensor de la reivindicación 9, en el
que dicho marcador luminiscente está acoplado covalentemente a
dicha al menos una proteína de unión a glucosa/galactosa.
13. El biosensor de la reivindicación 12, en el
que dicho marcador luminiscente está acoplado covalentemente a dicha
proteína de unión a glucosa/galactosa mediante reacción con un
miembro seleccionado del grupo compuesto por fluoresceína,
cumarinas, rodaminas, 5-TMRIA
(tetrametilrodamina-5-yodoacetamida),
Quantum Red^{TM}, Texas Red^{TM}, Cy3,
N-((-2-yodoacetoxi)etil)-N-metil)amino-7-nitrobenzoxadiazol
(IANBD),
6-acriloil-2-dimetilaminonaftaleno
(acrilodán), pireno, amarillo lucifer, Cy5, Dapoxyl (2-
bromoacetamidoetil)sulfonamida,
(N-(4,4-difluoro-1,3,5,7-tetrametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-2-il)yodoacetamida
(Bodipy 507/545 IA),
N-(4,4-difluoro-5,7-difenil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-propionil)-N'-yodoacetiletilendiamina
(BODIPY 530/550 IA), ácido
5-((((2-yodoacetil)amino)etil)amino)naftaleno-1-sulfónico
(1,5-IAEDANS) y
carboxi-X-rodamina,
5/6-yodoacetamida (XRIA 5,6).
14. El biosensor de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho grupo indicador emite dicha
señal en respuesta a la exposición a una fuente de energía.
15. Un procedimiento para la detección de
glucosa in vitro, que comprende:
a) proporcionar al menos una proteína de unión a
glucosa/galactosa mutada y al menos un grupo indicador unido a la
misma tal y como define el biosensor de glucosa de una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 14;
b) exponer dicha proteína de unión a
glucosa/galactosa mutada a concentraciones de glucosa
variables;
c) detectar un cambio de señal detectable y
reversible de dicho grupo indicador en el que dicho cambio de señal
detectable y reversible corresponde a dichas concentraciones de
glucosa variables.
16. El procedimiento de la reivindicación 15, en
el que dicha detección es continua, programada, episódica o
combinaciones de estas.
17. El procedimiento de la reivindicación 15, en
el que dicha proteína de unión a glucosa/galactosa mutada se
selecciona de proteínas de unión periplásmicas bacterianas.
18. El procedimiento de la reivindicación 15,
que además comprende la etapa de exponer dicho grupo indicador a
una fuente de energía capaz de excitar dicho grupo indicador para
que emita dicha señal.
19. Uso de una proteína de unión a
glucosa/galactosa mutada y al menos un grupo indicador fijado a la
misma como se define en una cualquiera de las reivindicaciones
1-14 para preparar un agente diagnóstico para la
detección de glucosa in vivo.
20. Una composición que comprende una proteína
de unión a glucosa/galactosa mutada que posee al menos una
sustitución de un aminoácido que es una cisteína en la posición
149, en la que el número del aminoácido se refiere a la proteína de
unión a glucosa/galactosa de E. coli que tiene 309 residuos
de aminoácidos.
21. La composición de la reivindicación 20, en
la que la proteína de unión a glucosa/galactosa mutada presenta
sustituciones adicionales de aminoácidos seleccionados de una
cisteína en la posición 1, una serina en la posición 1, una
cisteína en la posición 11, una cisteína en la posición 14, una
cisteína en la posición 19, una cisteína en la posición 43, una
cisteína en la posición 74, una cisteína en la posición 107, una
cisteína en la posición 110, una cisteína en la posición 112, una
cisteína en la posición 113, una cisteína en la posición 137, una
cisteína en la posición 213, una cisteína en la posición 216, una
cisteína en la posición 238, una cisteína en la posición 287, una
cisteina en la posición 292, una cisteína en la posición 236 y una
cisteína en la posición 296.
22. La composición de la reivindicación 21, en
la que dicha proteína de unión a glucosa/galactosa mutada
presenta
(i) al menos dos sustituciones de aminoácidos
seleccionados de una cisteína en la posición 149 y una serina en la
posición 238, una cisteína en la posición 149 y una arginina en la
posición 213, una cisteína en la posición 149 y una cisteina en la
posición 213, una cisteína en la posición 149 y una treonina en la
posición 213, una cisteína en la posición 149 y una leucina en la
posición 213, una cisteína en la posición 149 y una tirosina en la
posición 213, una cisteina en la posición 149 y una asparagina en
la posición 223, una cisteína en la posición 149 y una cisteína en
la posición 238, una cisteína en la posición 149 y una serina en la
posición 256, y una cisteína en la posición 149 y una arginina en
la posición 256; o
(ii) al menos tres sustituciones de aminoácidos
que se seleccionan de una cisteína en la posición 149, una serina
en la posición 213 y una serina en la posición 238; una cisteína en
la posición 149, una arginina en la posición 213 y una serina en la
posición 238; una cisteína en la posición 149, una cisteína en la
posición 213 y una cisteína en la posición 238; una cisteína en la
posición 149, una serina en la posición 213 y una asparagina en la
posición 223; y una cisteína en la posición 149, una asparagina en
la posición 223 y una arginina en la posición 256; o
(iii) al menos cuatro sustituciones de
aminoácidos que se seleccionan de una serina en la posición 1, una
cisteína en la posición 149, una arginina en la posición 213 y una
serina en la posición 238; una serina en la posición 1, una
cisteína en la posición 149, una serina en la posición 213 y una
serina en la posición 238; y una cisteína en la posición 149, una
cisteína en la posición 182, una cisteína en la posición 213 y una
serina en la posición 238.
23. La composición de una cualquiera de las
reivindicaciones 20 a 22, en la que dicha proteína de unión a
glucosa/galactosa mutada comprende además al menos una marca de
histidina.
24. La composición de una cualquiera de las
reivindicaciones 20 a 22, en la que dicha proteína de unión a
glucosa/galactosa mutada comprende además al menos un grupo
indicador.
25. La composición de la reivindicación 24, en
la que dicho grupo indicador es un marcador luminiscente.
26. La composición de la reivindicación 25, en
la que dicho marcador luminiscente posee una longitud de onda de
excitación de más de 600 nanómetros.
27. La composición de la reivindicación 25, en
la que dicho marcador luminiscente posee una longitud de onda de
emisión de más de 600 nanómetros.
28. La composición de la reivindicación 25, en
la que dicho marcador luminiscente está acoplado covalentemente a
dicha al menos una proteína de unión a glucosa/galactosa mediante
reacción con dicha al menos una proteína de unión mutada y un
miembro seleccionado del grupo compuesto por fluoresceína,
cumarinas, rodaminas, 5-TMRIA
(tetrametilrodamina-5-yodoacetamida),
Quantum Red^{TM}, Texas Red^{TM}, Cy3,
N-((-2-yodoacetoxi)etil)-N-metil)amino-7-nitrobenzoxadiazol
(IANBD),
5-acriloil-2-dimetilaminonaftaleno
(acrilodán), pireno, amarillo lucifer, Cy5, Dapoxyl®
(2-bromoacetamidoetil)sulfonamida,
(N-(4,4-difluoro-1,3,5,7-tetrametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-2-il)yodoacetamida
(Bodipy597/545IA),
N-(4,4-difluoro-5,7-difenil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-propionil)-N-yodoacetiletilendiamina
(BODIPY® 530/550 IA) ácido
5-((((2-yodoacetil)amino)etil)amino)naftaleno-1-sulfónico
(1,5-IAEDANS) y
carboxi-X-rodamina,
5/6-yodoacetamida (XRIA 5,6).
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