ES2304376T3

ES2304376T3 - Composicion farmaceutica para la inmunomodulacion y preparacion de vacunas que comprenden un antigeno y, como adyuvantes, un oligodesoxinucleotido inmunogenico y un polpeptido policationico.

Info

Publication number: ES2304376T3
Application number: ES01903625T
Authority: ES
Inventors: Karen Lingnau; Frank Mattner; Walter Schmidt; Max Birnstiel; Michael Buschle
Original assignee: Intercell Austria AG
Current assignee: Valneva Austria GmbH
Priority date: 2000-01-28
Filing date: 2001-01-05
Publication date: 2008-10-16
Anticipated expiration: 2021-01-05
Also published as: UY26555A1; EP1251871B1; US20020197269A1; WO2001054720A1; CA2396884A1; AR026940A1; JP2003520824A; AU3166501A; PE20011217A1; ATA1292000A; DE60133717T2; AT409085B; AU784403B2; EP1251871A1; DE60133717D1; ATE392904T1

Abstract

Composición farmacéutica que comprende: - un antígeno, - un oligodesoxinucleótido inmunogénico que contiene motivos de CpG (ODN-Cpg), y - un péptido policatiónico que contiene más del 20% de aminoácidos básicos.

Description

Composición farmacéutica para la inmunomodulación y preparación de vacunas que comprenden un antígeno y, como adyuvantes, un oligodesoxinucleótido inmunogénico y un polipéptido policatiónico.

La invención se refiere a una composición farmacéutica, por ejemplo para usar para inmunomodulación, especialmente como vacunas.

Las vacunas pueden salvar más vidas (y recursos) que cualquier otra intervención médica (Nossal, 1998), Debido a los programas de vacunación mundiales, la incidencia de muchas enfermedades mortales ha disminuido drásticamente. Aunque esto es válido para un completo panel de enfermedades, por ejemplo tuberculosis, difteria, pertussis, sarampión y tétanos, no existen vacunas eficaces para numerosas enfermedades infecciosas, incluidas la mayoría de las infecciones virales, como el SIDA. Tampoco hay vacunas eficaces para otras enfermedades, infecciosas o no infecciosas, que se llevan millones de vidas de millones de pacientes al año, entre las que se incluyen la malaria o el cáncer. Además, la rápida aparición de bacterias y microorganismos resistentes a antibióticos requiere tratamientos alternativos, siendo las vacunas una elección lógica. Por último, la gran necesidad de vacunas también queda ilustrada por el hecho de que las enfermedades infecciosas, más que los trastornos cardiovasculares o el cáncer o las lesiones, siguen siendo la causa más importante de muerte y discapacidad en el mundo (Bloom y Widdus, 1998).

Desde un punto de vista inmunológico, un problema fundamental en el campo de las vacunas hoy en día es que las vacunas tradicionales (y/o los compuestos inmunomoduladores contenidos en estas preparaciones) están diseñadas para inducir niveles elevados de anticuerpos (Harlow y Lane, 1988). No obstante, los anticuerpos solos no son eficaces en la prevención de un gran número de enfermedades, incluidas la mayoría de las enfermedades causadas por virus, bacterias intracelulares, ciertos parásitos y el cáncer. Ejemplos de tales enfermedades son, entre otras, el virus del VIH mencionado antes o la especie Plasmodio en el caso de la malaria. En numerosos sistemas experimentales, se ha mostrado que la rama celular del sistema inmunológico, incluidas las células T, más que la rama humoral es importante para estas indicaciones. Por tanto, se necesitan nuevas tecnologías innovadoras para superar las limitaciones de las vacunas convencionales. El punto de atención deben ser las tecnologías que inducen con fiabilidad el sistema inmunológico celular, incluidas las células T específicas de antígeno, que reconocen moléculas expresadas en células infectadas por patógenos. Idealmente, se diseñan vacunas que induzcan células T que distingan las células enfermas y/o infectadas de las células normales y, simultáneamente, anticuerpos secretados por células B que reconocen patógenos en compartimentos extracelulares.

Diversas vacunas establecidas consisten en organismos vivos atenuados, en las que existe el riesgo de inversión a la cepa salvaje virulenta. En particular, esto puede ser un escenario potencialmente mortal en los huéspedes inmunocomprometidos. Como alternativa, las vacunas se administran como combinación de antígenos derivados de patógenos junto con compuestos que inducen o potencian las respuestas inmunitarias contra estos antígenos (estos compuestos se denominan normalmente adyuvantes), ya que estas vacunas con subunidades por sí solas normalmente no son eficaces.

Aunque no hay duda de que las vacunas anteriores son valiosos tratamientos médicos, existe la desventaja de que, debido a su complejidad, se pueden provocar diversos efectos secundarios, por ejemplo a antígenos contenidos en la vacuna que muestran reactividad cruzada con moléculas expresadas por células de individuos vacunados. Además, es difícil cumplir los requisitos existentes de las autoridades reguladoras, por ejemplo la Organización Mundial de la Salud (OMS), la Food and Drug Administration (FDA) y sus homólogos europeos, para la especificación exacta de la composición de la vacuna y los mecanismos de inducción de inmunidad.

Algunas vacunas ampliamente utilizadas se clasifican en la tabla 1.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1

1

De (Lijeqvist y Stahl, 1999) con modificaciones.

Las células presentadoras de antígenos pertenecen al sistema inmunológico innato, que ha evolucionado como primera línea de defensa del huésped que limita las infecciones justo después de la exposición a los microorganismos (Hoffmann y col., 1999). Las células del sistema inmunológico innato reconocen patrones de estructuras relativamente inespecíficas expresadas en sus dianas, en lugar de estructuras específicas más sofisticadas que son reconocidas por el sistema inmunológico adaptativo (Hoffmann y col., 1999). Ejemplos de células del sistema inmunológico innato son los macrófagos y las células dendríticas, así como los granulocitos (p. ej., neutrófilos), las células asesinas naturales y otras. Por el contrario, las células del sistema inmunológico adaptativo reconocen estructuras antigénicas específicas, incluidos péptidos en el caso de las células T, y péptidos y estructuras tridimensionales en el caso de las células B. El sistema inmunológico adaptativo es mucho más específico y sofisticado que el sistema inmunológico innato y mejora tras la exposición repetida a un patógeno/antígeno dado. Filogenéticamente, el sistema inmunológico innato es mucho más antiguo y se puede encontrar ya en organismos muy primitivos. No obstante, el sistema inmunológico innato es crucial durante la fase inicial de la exposición antigénica, ya que, además de contener patógenos, las células del sistema inmunológico innato, es decir las CPA, ceban a las células del sistema inmunológico adaptativo y, por tanto, desencadenan respuestas inmunológicas específicas que conducen a la eliminación de los intrusos. En resumen, las células del sistema inmunológico innato, y en particular las CPA, desempeñan un papel crucial durante la fase de inducción de las respuestas inmunitarias mediante a) la contención de infecciones por medio de un sistema primitivo de reconocimiento de patrones y b) el cebado de las células del sistema inmunológico adaptativo, que conduce a respuestas inmunológicas específicas y de memoria que tienen como resultado la eliminación de los patógenos intrusotes o de otras dianas (Roitt y col., 1998). Estos mecanismos pueden también ser importantes para eliminar o contener células tumorales.

Como se ha mencionado antes, las células del sistema inmunológico innato reconocen patrones expresados en sus dianas respectivas. Ejemplos son lipopolisacáridos (LPS) en el caso de las bacterias gramnegativas, glucolípidos micobacterianos, ácidos lipoteicoicos de las bacterias grampositivas, mananos de levaduras y ARN de doble cadena de los virus (Hoffmann y col., 1999). Además, pueden reconocer patrones tales como alteraciones en las glucosilaciones de proteínas en las células tumorales.

Hallazgos recientes describen los ADN de los protozoos o eucariotas inferiores como otro patrón reconocido por el sistema inmunológico innato (aunque posiblemente también por el adaptativo) de mamíferos (y probablemente de la mayoría, si no todos, los vertebrados) (Krieg, 1996; Lipford y col., 1998).

El sistema inmunológico reconoce ADN de los organismos inferiores, incluidas las bacterias, probablemente debido a las diferencias estructurales y en el uso de secuencias existentes entre el ADN del patógeno y del huésped. En particular, las dianas son fragmentos cortos de ADN, derivados de no vertebrados o en forma de cortos oligodesoxinucleótidos (ODN) que contienen dinucleótidos no metilados de citosina-guanina (CpG) en un cierto contexto de bases (Krieg y col., 1995). Los motivos CpG se encuentran con la frecuencia prevista en el ADN bacteriano, pero son mucho menos frecuentes en el ADN de vertebrados (Lipford y col., 1998; Pisetsky, 1999). Además, los motivos de CpG en no vertebrados (p. ej., en bacterias) no están metilados, mientras que las secuencias CpG de vertebrados sí lo están. Estas diferencias entre el ADN de bacterias y el ADN de vertebrados permiten que los vertebrados reconozcan el ADN de los no vertebrados.

El ADN natural que contiene CpG, ODN, así como ODN sustituidos con tiofosfato (intercambio de residuos de tiofosfato por fosfato) que contienen motivos CpG (CpG-ODN) no solo son potentes activadores de la proliferación de células inmunitarias y de respuestas inmunológicas humorales (Krieg y col., 1995), sino también estimulan fuertes respuestas inmunológicas celulares (revisado en (Lipford y col., 1998)). Los ADN/ODN que contienen motivos de CpG no metilados pueden activar directamente las células monocíticas (células dendríticas, macrófagos) y las células B. Es probable que las células asesinas naturales (NK) no se activen directamente, pero sí respondan a la IL-12 (interleucina 12) derivada de monocitos con un marcado incremento de su producción de IFN-\gamma (Chace y col., 1997). En consecuencia, la inducción de monocitos y células NK por el ADN con CpG estimula la inducción de las respuestas de tipo Th1 y el desarrollo de células T citotóxicas.

Las células dendríticas, que representan importantes células presentadoras de antígenos durante las respuestas inmunológicas primarias, maduran in vitro bajo la influencia de ODN-CpG (Hartmann y col., 1999; Sparwasser y col., 1998) y producen cantidades grandes de IL-12, TNF-\alpha, IL-6 y, en menor medida IL-10 (Klinman y col., 1996; Sparwasser y col., 1998) cuando se exponen a estos compuestos. Por tanto, un efecto característico del ADN bacteriano y ODN-CpG es la inducción de respuestas humorales y celulares de tipo Th1 a los antígenos proteicos, que se caracteriza por su patrón de citocinas específico (Mosmann y col., 1986). Los ODN que contienen motivos de CpG se han utilizado como adyuvante de vacunas en ratones para potenciar, por ejemplo, la respuesta de anticuerpos a una vacuna del tétanos (Krieg y col., 1998) o estimular una fuerte respuesta de citocinas de tipo Th1 específica del antígeno en un modelo experimental de infección vírica (Oxenius y col., 1999). El ADN con CpG también se describe como un fuerte adyuvante de las respuestas de anticuerpos y de los linfocitos T citotóxicos (LTC) contra los antígenos del virus de la hepatitis B (Davis y col., 1998). La inducción de fuertes respuestas de tipo Th1 de citocinas y de LTC indica que los ODN-CpG también pueden ser útiles para las vacunas contra el cáncer usando antígenos tumorales. Los primeros datos publicados muestran que los ratones inmunizados con el idiotipo de un linfoma B en combinación con un ODN-CpG como adyuvante mostraron una supervivencia prolongada (Weiner y col., 1997).

Aunque los ODN-CpG o el ADN no metilado que contiene motivos de CpG son, potencialmente, adyuvantes muy potentes, esta tecnología tiene un lado más siniestro (Pisetsky, 1997). Por ejemplo, se ha comunicado que con dosis elevadas de ADN bacteriano que contiene motivos no metilados de CpG se puede inducir shock séptico (Sparwasser y col., 1997) en ciertas circunstancias. Es probable que esto se deba a cantidades excesivas de citocinas, en particular de TNF-\alpha y de IL-6, aunque también de otras, secretadas por células tras la exposición a ODN-CpG o a ADN bacteriano (Spaewasser y col., 1997). El ADN y los ODN bacterianos también pueden ser la causa de procesos inflamatorios que son una complicación frecuente en las infecciones pulmonares (Schwartz y col., 1997). Además, se sospecha que en los primeros estudios con terapia génica, en los que se administró en el pulmón de pacientes con fibrosis quística ADN plasmídico formulado o no formulado que contiene motivos no metilados de CpG, fallaron por los fuertes procesos inflamatorios, de los que se demostró que se debían a los motivos de CpG (Paillard, 1999; Yew y col., 1999). Las secuencias de CpG contenidas en el ADN plasmídico también parecen ser responsables de las muertes de animales tras inyecciones intravenosas de ADN plasmídico formulado con liposomas (Paillard, 1999). Por último, los animales expuestos a concentraciones elevadas de ODN con CpG desarrollan síntomas de artritis, probablemente debido a procesos inflamatorios causados por los ODN (Deng y col., 1999).

En conjunto, estos informes subrayan los inconvenientes de los ODN, que se pueden sortera si la cantidad de ODN que se va a usar en una vacuna se puede reducir de un modo significativo.

Se ha demostrado que los polímeros policatiónicos, por ejemplo los polímeros de aminoácidos policatiónicos poli-L-arginina y poli-L-lisina, permiten una carga muy eficiente de las células presentadoras de antígenos (CPA) con antígenos in vitro e in vivo (Buschle y col., Gene Ther Mol Biol 1, (1998), 309-321; Buschle y col., Proc Natl Acad Sci USA 94, (1997), 3256-3261; Schmidt y col., Proc Natl Acad Sci USA 94, (1997), 3262-3267). Se piensa que este es el acontecimiento clave para desencadenar cascadas inmunológicas que, en último término, conducen a la inducción de células efectoras inmunológicas específicas de antígeno que son capaces de destrozar o neutralizar las dianas. Anteriormente se ha demostrado que una serie de compuestos policatiónicos ejercen efectos sobre las células inmunológicas (Buschle y col. Gene Ther Mol Biol 1, (1998), 309-321; Buschle y col., Proc Natl Acad Sci USA 94, (1997), 3256-3261).

La co-inyección de una mezcla de poli-L-arginina o poli-L-lisina junto con un antígeno adecuado como una vacuna protegen a los animales del crecimiento de tumores en varios modelos animales (Buschle y col. Gene Ther Mol Biol 1, (1998), 309-321; Schmidt y col. Proc Natl Acad Sci USA 94, (1997), 3262-3267). Por tanto, una vacuna compuesta por compuestos policatiónicos y antígeno(s) se acepta en la técnica como una forma muy eficaz de tratamiento.

McCluskie y Davies (Critical Reviews in Immunology 19 (1999), 303-329) describen el uso de ODN no metilados con CpG inmunoestimuladores para la inducción de inmunidad mucosa. McCluskie y col. (Vaccine 18 (2000), 231-237) describen la administración a ratones del antígeno de superficie de la hepatitis B purificado con ODN con CpG con toxina cholene. La secuencia de aminoácidos de la toxina cholene se describe en Dallas y col. (Nature 288 (1980), 499-501).

Es objeto de la presente invención proporcionar una composición farmacéutica que permita una administración eficaz a una célula diana, especialmente al sistema inmunológico celular, aunque también a otros tipos de células con el fin de inducir potentes respuestas inmunológicas. Otro objeto de la invención es proporcionar medios para disminuir, o incluso eliminar, las repuestas inmunológicas no deseadas.

Este objetivo se resuelve con una composición farmacéutica que comprende

-: un antígeno o un agente inmunosupresor

-: un ODN inmunogénico, que contiene motivos de CpG, y

-: un péptido policatiónico que contiene más del 20% de aminoácidos básicos.

Sorprendentemente se ha descubierto que la combinación de los ODN inmunogénicos, que también pueden incluir el factor quimiotáctico o inductor de la diferenciación como sustancia inmunoestimulante y el péptido policatiónico con un antígeno de acuerdo con la presente invención, conduce a un efecto inmunomodulador sinérgico para una preparación antigénica dada. La combinación de antígeno, ODN inmunogénicos y péptido policatiónico permitió la generación de vacunas superiores en comparación con las vacunas compuestas por ODN inmunogénicos y antígeno o antígeno y péptido policatiónico. De hecho, esto también se observó con cantidades subóptimas de los ODN inmunogénicos. Aunque en la técnica se sabe que tales ODN inmunogénicos, así como los péptido policatiónicos (así como muchas otras sustancias para las que se ha comunicado un efecto adyuvante) que son potentes factores en las preparaciones antigénicas, la combinación de estas sustancias muestra un efecto que es, con mucho, mejor que sólo la combinación de efectos únicos aislados de los compuestos. En contraste con otras combinaciones de diferentes clases de adyuvantes, en las que sólo se observan, como mínimo, efectos aditivos (si se observa alguno), la selección de los péptidos policatiónicos y ODN inmunogénicos en una aplicación combinada junto con un antígeno, ha mostrado un incremento imprevisible de la eficacia en la respuesta inmunológica a un antígeno seleccionado. De un modo sinérgico, los ODN inmunogénicos y los polímeros policatiónicos permiten una respuesta inmunológica celular muy eficaz, así como un efecto inmunomodulador que permite una perspectiva de vacunación superior.

La administración de ODN con motivos de CpG también tuvo como resultado la inducción de reacciones secundarias adversas, especialmente en la liberación sistémica de citocinas pro-inflamatorias, como TNF-\alpha e IL-6. Fue muy sorprendente el hecho de que estos efectos secundarios se pueden prevenir proporcionando un polímero policatiónico junto con el ODN y el antígeno. Especialmente, los polímeros policatiónicos que comprenden enlaces peptídicos muestran una prevención casi completa de TNF-\alpha e IL-6.

Los antígenos a usar en las composiciones presentes no son cruciales. Una vacuna puede contener una variedad completa de antígenos diferentes. Ejemplos de antígenos son organismos completos muertos, tales como virus o bacterias, hongos, protozoos o, incluso, células cancerosas inactivados. Los antígenos también pueden constar de subfracciones de estos organismos/tejidos, de proteínas o, en su forma más simple, de péptidos. Los antígenos también pueden ser reconocidos por el sistema inmunológico en forma de proteínas o péptidos glucosilados y pueden también ser o contener polisacáridos o lípidos. Se pueden usar péptidos cortos, ya que, por ejemplo, las células T citotóxicas (LTC) reconocen antígenos en forma de péptidos cortos, normalmente de una longitud de 8-11 aminoácidos, junto con el acomplejo mayor de histocompatibilidad (MHC) (Rammensee y col., Immunogenetics 41, (1995), 178-228). Las células B reconocen péptidos más largos, comenzando en alrededor de 15 aminoácidos (Harlow y col., Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)). En contraste con los epítopos de las células T, la estructura tridimensional de los antígenos de las células B también puede ser importante para el reconocimiento por parte de los anticuerpos. Con el fin de obtener respuestas inmunológicas sostenidas específicas de antígeno, los adyuvantes pueden ayudar a desencadenar cascadas inmunológicas que implican a todas las células del sistema inmunológico necesario. Principalmente, los adyuvantes actúan sobre las denominadas células presentadoras de antígeno (CPA), aunque no están restringidos en su modo de acción. Normalmente, estas células se encuentran primero con el(los) antígeno(s), seguido por la presentación del antígeno procesado o sin modificar a las células efectoras inmunológicas. También pueden estar implicados tipos de células intermedias. En una respuesta inmunológica productiva sólo están activadas las células efectoras con la adecuada especificidad. El adyuvante también puede conservar antígenos localmente y coinyectar otros factores. Además, el adyuvante puede actuar como factor quimiotáctico para otras células inmunológicas o pueden actuar localmente y/o sistémicamente como agente estimulante para el sistema inmunológico.

Preferentemente, como tales antígenos (incluidos antígenos derivados o antígenos glucosilados o lipidados o polisacáridos o lípidos) se usan las proteínas o péptidos derivados de un patógeno vírico o bacteriano o de hongos o parásitos. Otra fuente preferida de antígenos son los antígenos tumorales. Los patógenos preferidos se seleccionan del virus de inmunodeficiencia humana (VIH), los virus de la hepatitis A y B, el virus de la hepatitis C (VHC), el virus del sarcoma de Rous (VSR), el virus de Epstein Barr (VEB), el virus de la gripe, el rotavirus, Staphylococcus aureus, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Mycobacterium tuberculosis, Streptococcus pneumoniae, Bacillus anthracis, Vibrio cholerae, Plasmodium sp. (Pl. falciparum, Pl. vivax, etc.), Aspergillus sp. o Candida albicans. Los antígenos también pueden ser moléculas expresadas por las células cancerosas (antígenos tumorales). El proceso de derivación puede incluir la purificación de una proteína específica del patógeno/células cancerosas, la inactivación del patógeno así como la derivación proteolítica o química o la estabilización de tal proteína. Del mismo modo, también los antígenos tumorales (vacunas para el cáncer) o los antígenos autoinmunitarios se pueden usar en la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención. Con tales composiciones se puede fabricar una vacuna tumoral o un tratamiento para enfermedades autoinmunitarias.

En el caso de antígenos peptídicos, en la presente invención se incluye el uso mimítopos/agonistas/superagonistas/
antagonistas peptídicos o péptidos modificados en ciertas posiciones sin que afecte a las propiedades inmunológicas o mimítopos/agonistas/superagonistas/antagonistas no peptídicos (revisado en Sparbier y Walden, 1999). Los antígenos peptídicos pueden también contener elongaciones en el extremo carboxi o en el extremo amino del antígeno peptídico, lo que facilita la interacción con el(los) compuesto(s) policatiónico(s) o el(los) compuesto(s) inmunoestimuladores. Para el tratamiento de las enfermedades autoinmunitarias se pueden aplicar antagonistas peptídicos.

Los antígenos también pueden derivarse para incluir moléculas que potencian la presentación antigénica y que tengan como diana los antígenos a las células presentadoras de antígeno.

En una forma de realización de la invención, la composición farmacéutica sirve para conferir tolerancia a las proteínas o fragmentos proteicos y péptidos que están implicados en las enfermedades autoinmunitarias. Los antígenos usados en esta forma de realización sirven para tolerar el sistema inmunológico o regular por disminución las respuestas inmunitarias contra epítopos implicados en los procesos autoinmunitarios.

El ODN inmunogénico de acuerdo con la presente invención puede ser de origen procariota y eucariota. En el caso del origen eucariota, el ADN deberá derivar de, según el árbol filogenético, especies menos desarrolladas (p. ej., insectos, aunque también otras especies). En una forma de realización preferida de la invención, el ODN inmunogénico es una molécula de ADN producida sintéticamente o mezclas de tales moléculas. También se incluyen derivados o modificaciones de los ODN, tales como análogos sustituidos con tiofosfato (residuos de tiofosfato sustitutos de fosfato) como, por ejemplo, los descritos en las patentes de EE.UU. US 5.723.335 y US 5.663.153, y otros derivados y modificaciones, que, preferentemente, estabilizan la composición inmunoestimuladora(s) pero no cambian sus propiedades inmunológicas (p. ej., Sparbier y Walden, 1999). Un motivo de secuencia preferido es un motivo de ADN de seis bases que contiene un dinucleótido de CpG (no metilado) flanqueado por dos purinas en 5' y dos pirimidinas en 3' (5'-Pur-Pur-C-G-Pyr-Pyr-3') (Pisetsky, 1999). Los motivos de CpG contenidos en los ODN de acuerdo con la presente invención son más frecuentes en el ADN microbiano que en el de vertebrados superiores y muestran diferencias en el patrón de mutilación. (Bird, A.P., Nature 1986, 321: 209; Pisetsky, D.S., Immunol Res 1999, 19 (1): 35-46). (Lipford y col., 1998). Sorprendentemente, las secuencias que estimulan las CPA de ratón no son muy eficaces en células humanas (Hartmann y col., 1999; Krieg, 1999). ODN preferidos de acuerdo con la presente invención se describen en, p. ej., los documentos EP 0 468.520 A2, WO 96/02555, WO 98/16247, WO 98/18810, WO 98/37919, WO 98/40100, WO 98/52581, WO 98/52962, WO 99/51259 y WO 99/56755. Aparte de estimular el sistema inmunológico, ciertos ODN neutralizan algunas respuestas inmunológicas (Krieg, 1999; Lipford y col., 1998). Estas secuencias también se incluyen en la presente invención, por ejemplo para aplicaciones para el tratamiento de enfermedades
autoinmunitarias.

ODN/ADN se pueden producir químicamente o de modo recombinante, o pueden derivar de fuentes naturales. Las fuentes naturales preferidas son los insectos. Por supuesto, también se pueden usar mezclas de diferentes ODN de acuerdo con la presente invención.

El(los) péptido(s) policatiónico(s) a usar de acuerdo con la presente invención puede ser cualquier péptido policatiónico que muestre el efecto característico de acuerdo con el documento WO 97/30721. Los péptidos policatiónicos preferidos se seleccionan de polipéptidos básicos, policationes orgánicos, poliaminoácidos básicos o mezclas de los mismos. Estos poliaminoácidos deberían tener una longitud de cadena de al menos 4 residuos aminoacídicos (véase: Tufsin, tal y como se describe en Goldman y col. (1983)). Especialmente preferidas son las sustancias que contienen enlaces peptídicos, como polilisina, poliarginina y polipéptidos que contienen más del 50% de aminoácidos básicos en un intervalo de más de 8, especialmente más de 20, residuos aminoacídicos o mezclas de los mismos. Otros policationes preferidos y sus composiciones farmacéuticas se describen en el documento WO 97/30721 (p. ej., polietilenimina) y el documento WO 99/38528. Preferentemente, estos polipéptidos contienen entre 20 y 500 residuos aminoacídicos, especialmente entre 20 y 200 residuos.

Estos péptidos policatiónicos se pueden producir químicamente o de modo recombinante, o pueden derivar de fuentes naturales.

Los (poli)péptidos catiónicos también pueden ser péptidos microbianos antibacterianos policatiónicos con propiedades como se revisa en (Ganz y Lehrer, 1999; Hancock, 1999). Estos (poli)péptidos pueden ser de origen procariótico o animal o vegetal o puede producirse químicamente o de modo recombinante (Andreu y Rivas, 1998; Ganz y Lehrer, 1999; Simmaco y col., 1998). Los péptidos también pueden pertenecer a la clase de las defensinas (Ganz, 1999; Ganc y Lehrer, 1999). Se pueden encontrar secuencias de tales péptidos, por ejemplo, en Tossi y col., Biopolymers (Peptide Science) 55 (2000), 4-30.

Tales péptidos de defensa del huésped, o defensinas, también son una forma preferida del péptido policatiónico de acuerdo con la presente invención. En general, como péptido policatiónico se usa un compuesto que permita como activación de producto final (o regulación por disminución) del sistema inmunológico adaptativo, preferentemente mediado por CPA (incluidas las células dendríticas).

Especialmente preferidas para usar como sustancia policatiónica en la presente invención son los péptidos antimicrobianos derivados de catelicidina o derivados de los mismos (A 1416/2000), especialmente péptidos antimicrobianos derivados de catelicidina de mamíferos, preferentemente de seres humanos, bovinos o ratones.

Entre los péptidos policatiónicos derivados de fuentes naturales se incluyen VIH-REV o VIH-TAT (péptidos catiónicos derivados, péptidos antenapedia, quitosano u otros derivados de quitina) u otros péptidos derivados de estos péptidos o proteínas mediante producción bioquímica o recombinante. Otros compuestos policatiónicos preferidos son catelina o sustancias relacionadas o derivadas de la catelina. Por ejemplo, la catelina de ratón es un péptido que posee la secuencia aminoacídica NH_{2}-RLAGLL-RKGGEKLKKIGOKIKNFFOKLVPOPE-COOH. Las sustancias relacionadas o derivadas de catelina contienen toda o partes de la secuencia de la catelina, con al menos 15-20 residuos aminoacídicos. Las derivaciones pueden incluir la sustitución o modificación de los aminoácidos naturales por aminoácidos que no están entre los 20 aminoácidos esenciales. Además, en dichas moléculas de catelina se pueden introducir otros residuos catiónicos. Se prefieren que estas moléculas de catelina estén combinadas con el antígeno y el ODN inmunogénico de acuerdo con la presente invención. No obstante, sorprendentemente se ha descubierto que estas moléculas de catelina so también eficaces como adyuvante para un antígeno sin la adición de otros adyuvantes. Por tanto, es posible usar tales moléculas de catelina como adyuvantes eficaces en formulaciones de vacunas con o sin otras sustancias inmunoactivadoras.

Otra sustancia policatiónica preferida para usar de acuerdo con la presente invención es un péptido sintético que contiene al menos 2 motivos KT., K separados por un enlazador de 3 a 7 aminoácidos hidrófobos (A 1789/
2000).

Fue muy sorprendente el hecho de que con la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención, el efecto inmunoestimulante fue significativamente superior al que cabría esperar de la adición de los efectos de cada componente por separado o, incluso, de la adición de los efectos del policatión con el antígeno y el ODN inmunogénico con el antígeno. Además, se descubrió que el efecto del ODN inmunogénico solo no es muy elevado cuando se aplica un antígeno directamente con esta sustancia. Esto es cierto particularmente si los compuestos no se administran repetidamente. Es muy importante el hecho de que la combinación de los compuestos permite usar menos del ODN inmunogénico que puede ayudar a evitar los efectos secundarios (véase en lo que antecede). Sorprendentemente, la administración combinada de antígeno, ODN y péptido policatiónico también previene o reduce los efectos secundarios presentes cuando se administran ODN.

De acuerdo con otro aspecto, la presente invención también se refiere a vacunas que comprenden una composición de acuerdo con la presente invención.

Además, la presente invención también se expone para el uso de la composición de acuerdo con la presente invención para fabricar una vacuna.

Las cantidades relativas de los ingredientes de la presente composición son altamente dependientes de las necesidades de la composición individual, por ejemplo el péptido policatiónico a usar. En el caso de poli-L-arginina y poli-L-lisina, las cantidades preferidas del antígeno/ODN inmunogénico/policatión compuesto inmunosupresor residen en el intervalo de 1-10000 \mug de antígeno por vacunación, 1 pM-1 mM de ODN inmunogénico por dosis y de 0,1 a 1000 \mug de policatión por vacunación.

Se prefiere especialmente proporcionar ODN de CpG y péptidos policatiónicos (especialmente polipéptidos policatiónicos, tales como poli-arginina o poli-lisina) en una proporción de cargas de entre 100:1 y 0,1:1, preferentemente entre 50:1 y 0,5:1, especialmente entre 10:1 y 0,5:1.

Las presentes composiciones pueden aplicarse a un paciente, por ejemplo a un candidato a vacunación, en cantidades eficaces por ejemplo a intervalos semanales, bisemanales o mensuales- Los pacientes a tratar con las presentes composiciones también se pueden vacunar repetidamente o sólo una vez. Un uso preferido de la presente invención es la inmunización activa, especialmente de seres humanos o de animales sin protección contra el antígeno específico.

La vía de aplicación de la presente composición no es crucial, por ejemplo la inyección subcutánea, intramuscular, intradérmica o transdérmica es adecuada, así como la captación oral. El experto en la técnica puede realizar con facilidad la adaptación de la presente composición a dicha vía de aplicación.

Asimismo, es posible aplicar la presente composición por separado, por ejemplo inyectando el ODN inmunogénico por separado de la composición antígeno/policatión. Por tanto, la presente invención también está dirigida a un kit que comprende una composición que contiene el antígeno y el péptido policatiónico como un componente y una composición que contiene la sustancia ODN inmunogénica como segundo componente.

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Los componentes pueden aplicarse en el mismo sitio o a la vez, no obstante, también es posible una aplicación en sitios diferentes o en momentos diferentes o durante un periodo de tiempo diferente. También es posible variar las aplicaciones sistémicas o locales de la composición o de los componentes, respectivamente.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un kit que comprende un componente que contiene un ODN inmunogénico, un componente que contiene un péptido policatiónico que contiene más del 20% de aminoácidos básicos y un componente que contiene un antígeno. Preferentemente, el antígeno se proporciona ya mezclado con el péptido policatiónico.

La invención se describe con más detalle mediante los ejemplos siguientes y las figuras expuestas, aunque no se restringe a estas formas de realización concretas.

Fig. 1A y 1B: INF-\gamma-ELISPOT de la respuesta inmunológica contra el péptido-OVA SIINFEKL;

Fig. 2: INF-\gamma-ELISPOT de la respuesta inmunológica contra el péptido P1A derivado de P815 de mastocitoma de ratón (Fig. 2A), el péptido CSP SYVPSAEQI (Fig. 2B), el péptido LLO GYKDGNEYI (Fig. 2C) y el péptido OVA ISQAVHAAHAEINE (Fig. 2D);

Fig. 3: INF-\gamma-ELISPOT de la respuesta inmunológica contra el péptido MC1R WGPFFLHL;

Fig. 4: INF-\gamma-ELISPOT de la respuesta inmunológica en diferentes sitios de inyección contra el péptido OVA SIINFEKL; y

Fig. 5: la aplicación combinada de ODN-CpG y poli-L-arginina (pR 60) previene la inducción de la producción sistémica de TNF-\alpha e IL-6.

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Ejemplos

En todos los experimentos se usaron ODN sustituidos con tiofosfato (con residuos de tiofosfato sustituyendo los fosfatos, en lo sucesivo denominado "oligodesoxinucleótidos sustituidos con tiofosfato"), ya que tales ODN muestran mayor resistencia a la nucleasa (Ballas y col., 1996; Krieg y col., 1995; Parronchi y col., 1999).

Los ganglios linfáticos se pasaron a través de un depurador celular de 70 \mum y se lavaron dos veces con medio DMEM (GIBCO BRL) que contiene 5% de suero bovino fetal (FCS, SIGMA chemicals). Las células se ajustaron a 10^{7} células/ml en DMEM/5% FCS. Se realizaron ensayos IFN-\gamma-ELISPOT por duplicado tal y como se ha descrito (Miyahira y col., 1995). Este procedimiento es un procedimiento ampliamente utilizado, que permite la cuantificación de células T específicas de antígeno. Los linfocitos se estimularon ex vivo por duplicado con medio (basal), pR 60, ODN-CpG y concanavalina A (Con A). Se contaron las manchas que representan las células T únicas productoras de IFN-\gamma Y se restó el número de manchas basales en todas las muestras. Se detectaron muchas manchas tras la estimulación con Con A (datos no mostrados), lo que indica un buen estado de los linfocitos usados.

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Ejemplo 1

La aplicación combinada de ODN-CpG y poli-L-arginina (pR 60) potencia considerablemente la inducción de células T específicas de ovoalbúmina-péptido de un modo dependiente de la concentración (pR 60).

Ratones: C57BI/6 (Harlan/Olac)

Péptido: OVA_{257-264}-Péptido (SIINFEKL), un epítopo restringido (H-2Kb) por MHC de clase I de ovoalbúmina de pollo (Rotzschke y col., 1991), se sintetizó usando síntesis estándar de F-moc de fase sólida, se purificó mediante HPLC y se analizó mediante espectroscopia de masas para determinar la pureza. Dosis: 300 \mug/ratón.

Poli-L-arginina 60 (pR 60): Poli-L-arginina con un grado medio de polimerización de 60 residuos de arginina; SIGMA chemicals Dosis: 1000, 100 ó 10 \mug/ratón

ODN-CpG 1668: ODN sustituidos con tiofosfato que contienen un motivo de CpG: TCC A\underline{TG \ ACG} \underline{TT}C CTG ATG CT, sintetizado por NAPS GMBH, Göttingen. Dosis: 5 noml/ratón

ODN sin CpG 1911: oligonucleótidos modificados con fosfotioatos que no contienen motivo CpG: TCC AGG ACT TTC CTC AGG TT, sintetizados por NAPS GMBH, Göttingen. Dosis: 5 noml/ratón

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Grupos experimentales (5 ratones por grupo)

1.: OVA_{257-264}-Péptido + ODN-CpG

2.: OVA_{257-264}-Péptido + ODN-CpG + pR60 1000 \mug

3.: OVA_{257-264}-Péptido + ODN-CpG + pR60 100 \mug

4.: OVA_{257-264}-Péptido + ODN-CpG + pR60 10 \mug

5.: OVA_{257-264}-Péptido + ODN-CpG

6.: OVA_{257-264}-Péptido + ODN sin CpG + pR60 1000 \mug

7.: OVA_{257-264}-Péptido + ODN sin CpG + pR60 100 \mug

8.: OVA_{257-264}-Péptido + ODN sin CpG + pR60 10 \mug

9.: OVA_{257-264}-Péptido + pR60 1000 \mug

10.: OVA_{257-264}-Péptido + pR60 100 \mug

11.: OVA_{257-264}-Péptido + pR60 10 \mug

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El día 0 se inyectó en la pata trasera de los ratones un volumen total de 100 \mul (50 \mul por pata) que contenía los compuestos mencionados antes. Se sacrificó a los animales 4 días después de la inyección y se recogieron los ganglios linfáticos poplíteos. Los ganglios linfáticos se pasaron a través de un colador celular de 70 \mum y se lavaron dos veces con medio DMEM (GIBCO BRL) que contiene 5% de suero bovino fetal (FCS, SIGMA chemicals). Las células se ajustaron a 10^{7} células/ml en DMEM/5% FCS.

Se realizaron ensayos IFN-\gamma-ELISPOT por duplicado tal y como se ha descrito (Miyahira y col., 1995). Este procedimiento es un procedimiento ampliamente utilizado, que permite la cuantificación de células T específicas de antígeno. Los linfocitos se estimularon ex vivo por duplicado con medio (basal), pR 60, ODN-CpG y concanavalina A (Con A). Se contaron las manchas que representan las células T únicas productoras de IFN-\gamma Y se restó el número de manchas basales en todas las muestras. Se detectaron muchas manchas tras la estimulación con Con A (datos no mostrados), lo que indica un buen estado de los linfocitos usados.

Para cada grupo experimental de ratones, el número de manchas/1x10^{6} células se ilustran en las Figura 1A y 1B.

Mientras que la inyección de OVA_{257-264}-péptido con poli-L-arginina o ODN-CpG solo condice a cifras bajas de células productoras de INF-\gamma específicas de péptido, la inyección de OVA_{257-264}-péptido con la combinación de poli-L-arginina y ODN-CpG potencia considerablemente la respuesta específica de péptido. Al usar ODN-CpG no inmunogénico en lugar de ODN sin CpG, la complicación de poli-L-arginina no tiene un efecto creciente sobre la respuesta inmunológica específica de péptido, que es bastante baja.

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Ejemplo 2

La aplicación combinada de ODN-CpG y poli-L-arginina potencia considerablemente la inducción de células T específicas de un péptido derivado de mastocitoma, un péptido derivado de circuí-esporozoíto, un péptido derivado de listeriolisina y un péptido derivado de ovoalbúmina restringido por MHC de clase II.

Ratones: DBA/2 (Harlan/Olac)

Péptidos: a. {}\hskip0.2cm Péptido P1A derivado de P815 de mastocitoma de ratón (LPYLGWLVF), res {}\hskip0.6cm tringido por MHC de clase I (H2-Ld)

b.: Péptido-CSP (SYVPSAEQI) derivado de la proteína circumesporozoíto de plasmodium yoelii (Rodrigues y col., 1992), restringido por MHC de clase I (H2-Kd).

c.: Péptido-LLO (GYKDGNEYI) derivado de listeriolisina O 91-99 de Listeria monocytogenes (Pamer y col., 1991), restringido por MHC de clase I (H2-Kd).

d.: OVA_{323-336}-Péptido (ISQAVHAAHAEINE) derivado de ovoalbúmina de pollo, restringido por MHC de clase II (I-Ad) (Shimonkevitz y col., 1984). Todos los péptidos se sintetizaron mediante síntesis convencional de F-moc de fase sólida, se purificaron mediante HPLC y se analizaron mediante espectroscopia de masas para determinar la pureza. Dosis: 300 \mug/ratón

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Poli-L-arginina 60 (pR60): Poli-L-Arginina con un grado medio de polimerización de 60 residuos de arginina; SIGMA chemicals Dosis: 1000, 100 \mug/ratón

ODN-CpG 1668: ODN sustituidos con tiofosfato que contienen un motivo de CpG: TCC A\underline{TG \ ACG} \underline{TT}C CTG ATG CT, sintetizado por NAPS GMBH, Göttingen. Dosis: 5 nmol/ratón

ODN sin CpG 1911: ODN sustituidos con tiofosfato que no contienen un motivo de CpG: TCC AGG ACT TTC CTC AGG TT, sintetizado por NAPS GMBH, Göttingen. Dosis: 5 nmol/ratón

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Grupos experimentales (5 ratones por grupo)

1.: Péptido-P1A + ODN-CpG + pR60 100 \mug

2.: Péptido-P1A + ODN sin CpG + pR60 100 \mug

3.: Péptido-P1A + ODN-CpG

4.: Péptido-P1A + pR60 100 \mug

5.: Péptido-CSP + ODN-CpG + pR60 100 \mug

6.: Péptido-CSP + ODN sin CpG + pR60 100 \mug

7.: Péptido-CSP + ODN-CpG

8.: Péptido-CSP + pR60 100 \mug

9.: Péptido-LLO + ODN-CpG + pR60 100 \mug

10.: Péptido-LLO + ODN sin CpG + pR60 100 \mug

11.: Péptido-LLO + ODN-CpG

12.: Péptido-LLO + pR60 100 \mug

13.: Péptido-OVA + ODN-CpG + pR 60100 \mug

14.: Péptido-OVA + ODN sin CpG + pR 60 100 \mug

15.: Péptido-OVA + ODN-CpG

16.: Péptido-OVA + pR 60 100 \mug

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El día 0 se inyectó en la pata trasera de los ratones un volumen total de 100 \mul, 50 \mul por pata, que contenía los compuestos mencionados antes. Se sacrificó a los animales 4 días después de la inyección y se recogieron los ganglios linfáticos poplíteos. Los ganglios linfáticos se prepararon como se ha descrito en el ejemplo 1 (Shimonkevitz y col., 1984) y se prepararon IFN-\gamma-ELISPOT. Para cada grupo experimental de ratones, el número de manchas/1x10^{6} células se ilustran en las Figura 2A-D.

Mientras que la inyección de los péptidos con poli-L-arginina o ODN-CpG solo conduce a cifras bajas, o ninguna, de células productoras de INF-\gamma específicas de péptido, la inyección de péptidos con la combinación de poli-L-arginina y ODN-CpG índice (p. ej., CSP) o potencia considerablemente la respuesta específica de péptido. Al usar ODN sin CpG no inmunogénico en lugar de ODN-CpG, la complicación de poli-L-arginina no tiene un efecto creciente sobre la respuesta inmunológica específica de péptido, que es bastante baja.

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Ejemplo 3

La aplicación combinada de ODN-CpG y poli-L-arginina (pR 60) potencia de forma sinérgica la respuesta inmunitaria contra MC1R (receptor de la hormona estimulante de melanocitos).

Ratones: C57B1/6 (Harlan/Olac)

Péptido: MC1R-Péptido (WGPFFLHL, F. Mattner, no publicado) un epítopo restringido por MHC de clase I (H-2Kb) del receptor de la hormona estimulante de los melanocitos se sintetizó mediante síntesis convencional de F-moc de fase sólida, se purificó mediante HPLC y se analizó mediante espectroscopia de masas para determinar la pureza. Dosis: 300 \mug/ratón

Poli-L-arginina 60 (pR60): Poli-L-arginina con un grado medio de polimerización de 60 residuos de arginina; SIGMA chemicals Dosis: 1000, 100 ó 10 \mug/ratón

ODN-CpG 1668: ODN sustituidos con tiofosfato que contienen un motivo de CpG: TCC A\underline{TG \ ACG} \underline{TT}C CTG ATG CT, sintetizados por NAPS GMBH, Göttingen. Dosis: 5 nmol/ratón

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Grupos experimentales (3 ratones por grupo)

1.: MC1R + ODN-CpG + pR

2.: MC1R + ODN-CpG

3.: MC1R + pR

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El día 0 se inyectó en la pata trasera de los ratones un volumen total de 100 \mul (50 \mul por pata) que contenía los compuestos mencionados antes. Se sacrificó a los animales 4 días después de la inyección y se recogieron los ganglios linfáticos poplíteos. Los ganglios enfáticos y los ensayos de IFN-\gamma-ELISPOT se prepararon como se describe en el ejemplo 1. Para cada grupo experimental de ratones, el número de manchas/1x10^{6} células se ilustran en la Figura 3, se dan las desviaciones estándar de los triplicados estimulados ex vivo.

Mientras que la inyección del MC1R-péptido con poli-L-arginina o ODN-CpG solo conduce a cifras bajas de células productoras de IFN-\gamma específicas de péptido, la inyección de MC1R-péptido con la combinación de poli-L-arginina y ODN-CpG potencia considerablemente la respuesta específica de péptido.

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Ejemplo 4

La aplicación combinada de ODN-CpG y poli-L-arginina (pR 60) induce en puntos de inyección diferentes una fuerte respuesta inmunológica específica de antígeno contra Ovoalbúmina-péptido.

Ratones: C57B1/6 (Harlan/Olac)

Péptido: OVA_{257-264}-Péptido (SIINFEKL), un epítopo restringido por MHC de clase I (H-2Kb) de ovoalbúmina de pollo (Rotzschke y col., 1991), se sintetizó mediante síntesis estándar de F-moc de fase sólida, se purificó mediante HPLC y se analizó mediante espectroscopia de masas para determinar la pureza. Dosis: 300 \mug/ratón

Poli-L-arginina 60 (pR60): Poli-L-arginina con un grado medio de polimerización de 60 residuos de arginina; SIGMA chemicals Dosis: 1000 \mug/ratón

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Grupos experimentales (5 ratones por grupo) sitios de inyección:

1.: Pata

2.: sc/flanco

3.: en el pabellón auditivo

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El día 0 se inyectó en la pata trasera de los ratones un volumen total de 100 \mul (50 \mul por pata) que contenía los compuestos mencionados antes (Ovoalbúmina-péptido + ODN-CpG + pR60). Se sacrificó a los animales 4 días después de la inyección y se recogieron los ganglios linfáticos drenantes. Los ganglios enfáticos y los ensayos de IFN-\gamma-ELISPOT se prepararon por triplicado (se facilita la desviación estándar) como se describe en el ejemplo 1. Para cada grupo experimental de ratones, el número de manchas/1x10^{6} células se ilustran en la Figura 4.

La co-aplicación de OVA_{257-264}-péptido con poli-L-arginina y ODN-CpG induce en diferentes sitios de inyección una fuerte respuesta inmunológica específica de antígeno. La inyección en el pabellón auditivo es superior a las demás inyecciones subcutáneas (pata, flanco).

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TABLA 2

3

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Ejemplo 5

La aplicación combinada de ODN-CpG y poli-L-arginina (pR60) previene la inducción de TNF-\alpha y la producción de IL-6.

5

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Grupos experimentales (4 ratones por grupo)

1.: OVA_{257-264}-péptido

2.: pR60

3.: CpG 1668 + OVA_{257-264}-péptido

4.: CpG 1668 + pR 60 +OVA_{257-264}-péptido

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Se inyectó en la pata trasera de los ratones un volumen total de 100 \mul, 50 \mul por pata, que contenía los compuestos mencionados antes Una hora después de la inyección se extrajo sangre de la vena de la cola y se preparó suero. Se determinó la cantidad de citocinas proinflamatorias (TNF-\alpha e IL-6) en suero usando ELISA específicos de
citocinas.

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TNF-\alpha/IL-6 en sueros/1 h después de la inyección

7

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Claims

1. Composición farmacéutica que comprende:

-: un antígeno,

-: un oligodesoxinucleótido inmunogénico que contiene motivos de CpG (ODN-Cpg), y

2. Composición de acuerdo con la reivindicación 1, que se caracteriza porque el antígeno es una proteína derivada de un patógeno vírico, parasítico o bacteriano.

3. Composición de acuerdo con la reivindicación 1, que se caracteriza porque el antígeno es un antígeno tumoral.

4. Composición de acuerdo con la reivindicación 1, que se caracteriza porque el antígeno es un antígeno autoinmunitario.

5. Composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que se caracteriza porque el péptido policatiónico es un polipéptido básico, un policatión orgánico, un poliaminoácido básico o mezclas de los mismos.

6. Composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que se caracteriza porque el péptido policatiónico es polilisina, poliarginina, un polipéptido que contiene más del 50% de aminoácidos básicos en un intervalo de más de 8, especialmente de más de 20, residuos aminoacídicos o mezclas de los mismos.

7. Composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que se caracteriza porque el péptido policatiónico deriva de la proteína-REV o la proteína-TAT del VIH, quitosano u otros derivados de quitina.

8. Composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que se caracteriza porque el ODN-CpG se selecciona de moléculas de ADN producidas sintéticamente, ODN sustituidos con tiofosfato, ADN inmunogénico de insecto, moléculas de ADN recombinante, moléculas de ADN que contienen un dinucleótido de CpG flanqueado por dos purinas en 5' y dos pirimidinas en 3', o mezclas de los mismos.

9. Vacuna, que comprende una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

10. Uso de una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para la fabricación de una vacuna.

11. Kit que comprende

-: un componente que contiene un ODN-CpG inmunogénico, y

-: un componente que contiene un péptido policatiónico que contiene más del 20% de aminoácidos básicos, y

-: un componente que contiene un antígeno.