ES2867375T3

ES2867375T3 - Polipéptido aislado de las proteínas de la toxina A y la toxina B de C. difficile y sus usos

Info

Publication number: ES2867375T3
Application number: ES16204515T
Authority: ES
Inventors: Larry Ellingsworth; David Flyer; Jing-Hui Tian; Steven Fuhrmann; Stefanie Kluepfel-Stahl; Gregory Glenn; Kerstin Westritschnig
Original assignee: Valneva Austria GmbH; Valneva USA Inc
Current assignee: Valneva Austria GmbH; Valneva USA Inc
Priority date: 2010-09-03
Filing date: 2011-09-05
Publication date: 2021-10-20
Anticipated expiration: 2031-09-05
Also published as: ES2631032T5; DK2753352T4; US20170239340A1; US20230173052A1; KR20140057315A; MX350126B; RS55707B1; SMT201700124T1; DK2753352T3; JP6121421B2; EP3167899B1; PL2753352T5; US20250360191A1; SI2753352T2; US11478540B2; EP3167899A1; HRP20170193T1; KR101907434B1; AU2011298306A1; HUE033342T2

Abstract

Un polipéptido aislado que tiene al menos 85 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO: 4, en donde el polipéptido comprende 23 unidades de repetición derivadas del dominio C-terminal de la toxina B de Clostridium difficile.

Description

DESCRIPCIÓN

Polipéptido aislado de las proteínas de la toxina A y la toxina B de C. diffiále y sus usos

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un polipéptido aislado que contiene los dominios de unión al receptor de la toxina A y la toxina B de Clostridium difficile y su uso como vacuna. Este polipéptido aislado proporciona inmunidad anti toxina a ambas toxinas.

Antecedentes de la invención

Clostridium difficile es la principal causa de diarrea asociada a antibióticos nosocomiales y se ha convertido en un problema de salud importante en hospitales, hogares de ancianos y otras instalaciones de atención. Se ha estimado que el costo para los hospitales es de 2 mil millones de dólares en Europa y de 3,2 mil millones de dólares en los Estados Unidos.

El agente causal es una bacteria anaeróbica Gram positiva, formadora de esporas, que se encuentra comúnmente en el medio ambiente pero también está presente en el tracto intestinal del 2-3 % de la población adulta sana. La enfermedad asociada a C. difficile (CDAD) se induce por la alteración de la flora colónica normal, habitualmente como resultado de la administración de antibióticos. Después del reto a esporas de C. difficile en el medio ambiente, el organismo puede colonizar la mucosa intestinal donde la producción de toxinas que causan enfermedades puede resultar en CDAD. La enfermedad puede variar desde diarrea leve sin complicaciones hasta colitis pseudomembranosa grave y megacolon tóxico.

La CDAD se ha vuelto cada vez más problemática en los entornos de atención médica. Un estudio reciente informó que el 31 % de los pacientes hospitalarios que reciben antibióticos se colonizan con C. difficile y el 56 % de los pacientes que se colonizan desarrollan CDAD. En general, C. difficile es responsable del 10-25 % de todas las diarreas asociadas a los antibióticos, del 50-75 % de las colitis relacionadas con los antibióticos y del 90-100 % de las colitis pseudomembranosas relacionadas con los antibióticos. El tratamiento de la CDAD implica la interrupción del antibiótico causal seguido de un tratamiento con metronidazol o vancomicina. La recaída después de la interrupción del tratamiento con antibióticos ocurre en aproximadamente el 20 % de los pacientes, a menudo como resultado de la recolonización por C. difficile.

En 2003, un brote de C. difficile en Quebec, Canadá, indicó la aparición de una cepa más virulenta de C. difficile conocida como fenotipo norteamericano 1/027 (NAP1). NAP1 se ha asociado con una mayor virulencia, malos resultados y mayores tasas de morbilidad y mortalidad en comparación con cepas anteriores. La aparición de esta cepa se suma a los problemas que ya se han encontrado al tratar de contener la incidencia de CDAD.

La fidaxomicina (Dificid ©) para la prevención de la enfermedad recurrente es la primera de una nueva clase de fármacos antibióticos macrocíclicos de espectro estrecho (Revill, P.; Serradell, N.; Bolos, J. (2006). "Tiacumicin B: macrolide antibiotic treatment of C. difficile-associated diarrhea". Drugs of the Future 31 (6): 494-497). Es un producto de fermentación obtenido a partir del actinomiceto Dactylosporangium aurantiacum subespecie hamdenesis. La fidaxomicina no es sistémica, lo que significa que se absorbe mínimamente en el torrente sanguíneo, es bactericida y ha demostrado la erradicación selectiva de Clostridium difficile patógeno con una alteración mínima de las múltiples especies de bacterias que componen la flora intestinal normal y saludable. El mantenimiento de condiciones fisiológicas normales en el colon puede reducir la probabilidad de recurrencia de la infección por Clostridium difficile (Johnson, Stuart (2009-06). "Recurrent Clostridium difficile infection: a review of risk factors, treatments, and outcomes". Journal of Infection 58 (6): 403-410). Aunque se cree que la introducción de esta nueva clase de fármaco antibiótico mejorará el tratamiento de la CDAD, todavía existe la necesidad médica de un fármaco preventivo, en particular para los pacientes de alto riesgo, como los ancianos y los pacientes inmunodeprimidos.

La CDAD es el resultado de las acciones de dos exotoxinas producidas por C. difficile, la toxina A y la toxina B (también denominadas CTA y CTB, respectivamente). Ambas toxinas son proteínas secretadas de alto peso molecular (~ 300 kDa) que poseen múltiples dominios funcionales (Voth DE y Ballard JD, Clinical Microbiology Reviews 18: 247-263 (2005)). El dominio N-terminal de ambas toxinas contiene actividad ADP-glucosiltransferasa que modifica las GTPasas de tipo Rho. Esta modificación provoca una pérdida de polimerización de actina y cambios citoesqueléticos que resultan en la ruptura de las uniones estrechas del epitelio colónico. Esto conduce a una exudación excesiva de líquido al colon y a la diarrea resultante. El dominio central contiene un dominio hidrófobo y se prevé que esté involucrado en el transporte de membrana. El dominio C-terminal de ambas toxinas contiene múltiples regiones homólogas llamadas unidades de repetición (RU) que están implicadas en la unión de la toxina a las células diana (Ho y otros, PNAS 102: 18373-18378 (2005)). Las unidades de repetición se clasifican en cortas (21-30 aminoácidos) o largas (-50 aminoácidos). Las unidades de repetición se combinan para formar agrupaciones, cada uno habitualmente contiene una unidad de repetición larga y de 3 a 5 cortas. La toxina A de longitud completa posee 39 unidades de repetición (ARU) organizadas en 8 agrupaciones (Dove y otros. Infect. Immun. 58: 480-488 (1990), mientras que la toxina B de longitud completa contiene 24 unidades de repetición (BRU) organizadas en 5 agrupaciones (Barroso y otros, Nucleic Acids Res. 18: 4004 (1990); Eichel-Streiber y otros, Gene 96: 107-113 (1992)).

Varios estudios, tanto de modelos animales como clínicos, han indicado un papel del anticuerpo anti-toxina en la protección contra la enfermedad asociada a C. difficile. Los hámsteres inmunizados con la toxina A y la toxina B inactivadas con formalina generaron altos niveles de anticuerpo anti-toxina y se protegieron de un reto letal de C. difficile (Giannasca PJ y Warny M, Vaccine 22: 848-856 (2004)). Además, la transferencia pasiva del anticuerpo anti toxina de ratón protegió a los hámsteres de una manera dependiente de la dosis. Kyne L y otros (The Lancet 357: 189-193 (2001)) informó que el desarrollo de una respuesta de anticuerpos anti-toxina A durante un episodio inicial de CDAD se correlacionó con la protección contra la recurrencia de la enfermedad.

Los determinantes reconocidos por los anticuerpos protectores anti-toxina se han localizado en el dominio C-terminal que contiene las unidades de repetición que funcionan como dominio de unión al receptor. Inicialmente, Lyerly y otros (Current Microbiology 21: 29-32 (1990)) revelaron que el dominio C-terminal de la toxina A que contiene 33 unidades de repetición es capaz de inducir la producción de anticuerpos anti-toxina neutralizantes y puede proteger de la infección por C. difficile. En este estudio, se inyectó a los hámsteres por vía subcutánea el polipéptido recombinante purificado varias veces antes del reto con la bacteria, sin embargo, solo se logró una protección parcial. Otro estudio (Ryan y otros, Infect. Immun. 65: 2941-49 (1997)) mostró que el polipéptido aislado que contiene 720 residuos de aminoácidos del extremo C-terminal de CTA y la señal de secreción de la hemolisina A de E. coli (expresada en Vibrio cholerae) indujo inmunidad protectora sistémica y mucosa contra una pequeña dosis de CTA en el modelo de CDAD de conejo.

También se informó que la respuesta de anticuerpos contra el dominio C-terminal de las toxinas A y B era necesaria para lograr una protección completa (Kink y Williams, Infect. Immun. 66: 2018-25 (1998), patente de Estados Unidos núm. 5,736,139 (1998)). Este estudio reveló que el dominio C-terminal de cada toxina era más eficaz para generar anticuerpos neutralizantes de toxinas. Demostró la eficacia de los anticuerpos aviares suministrados por vía oral (antitoxina) producidos contra el dominio C-terminal de CTA y CTB en el modelo letal de hámster. Los resultados también indican que la antitoxina puede ser eficaz en el tratamiento y manejo de CDAD en humanos. En otro estudio, se informó que los anticuerpos monoclonales humanos anti-toxina A y B confieren protección contra la mortalidad inducida por C. difficile en hámsteres (Babcock y otros, Infect. Immun. 74: 6339-6347 (2006)). La protección solo se observó mediante anticuerpos dirigidos contra el dominio de unión al receptor de cualquiera de las toxinas y se observó una protección mejorada después del tratamiento con anticuerpos tanto anti-toxina A como B.

Por otra parte, Ward y otros (Infect. Immun. 67: 5124-32 (1999)) consideraron 14 unidades de repetición de la toxina A de C. difficile (14 CTA) para el estudio de la actividad adyuvante. Las unidades de repetición se clonaron y expresaron con la etiqueta de polihistidina N-terminal (14 CTA-HIS) o se fusionaron al dominio de unión no tóxico de la toxina del tétanos (14 CTA-TETC). Ambas proteínas de fusión administradas por vía intranasal generaron anticuerpos séricos anti-toxina A pero no hubo respuesta en la superficie de la mucosa en ratones. Se observaron respuestas anti-toxina A sistémicas y mucosas mejoradas después de la coadministración con E. coli, toxina termolábil (LT) o su forma mutada LTR72. Sobre la base de los datos, Ward y otros sugirieron el uso de una fusión no tóxica de 14 CTA-TETC como adyuvante mucoso en una vacuna humana dirigida contra los patógenos clostridiales.

Estudios bioquímicos recientes sobre los dominios de las unidades de repetición de las toxinas de C. difficile han examinado los requisitos de secuencia mínima para formar una estructura terciaria estable (Demarest SJ y otros, J. Mol. Bio. 346: 1197-1206 (2005)). Se encontró un péptido de 11 unidades de repetición derivado de la toxina A con una estructura terciaria correcta, pero no 6 y 7 unidades de repetición de las toxinas A y B. Se encontró que el segmento de 11 unidades de repetición correctamente plegado mantenía la propiedad de unión al receptor. Un segundo estudio examinó las propiedades funcionales de los fragmentos de la toxina A que contienen 6, 11 o 15 unidades de repetición (Dingle T, Glycobiology 18: 698-706 (2008)). Sólo las unidades de repetición 11 y 15 fueron capaces de inhibir competitivamente la capacidad neutralizante de toxina del anticuerpo anti-toxina A. Si bien se encontró que los 3 fragmentos tenían actividad hemaglutinante, los fragmentos más largos mostraron una actividad hemaglutinante más alta que los más cortos. Los datos indican que se conservan la estructura del dominio de unión al receptor de toxina y la inmunogenicidad en los fragmentos de dominio que contienen más de 11-14 repeticiones.

Thomas y otros (WO97/02836, Patente de Estados Unidos núm. 5,919,463 (1999)) también describió la toxina A de C. difficile, la toxina B y ciertos fragmentos de estas (por ejemplo, el dominio C-terminal que contiene algunas o todas las unidades de repetición) como adyuvantes de mucosas. Demostraron que la administración intranasal de CTA o CTB mejoró significativamente la respuesta inmunitaria de la mucosa a un antígeno heterólogo como la ureasa de Helicobacter pylori, ovoalbúmina o hemocianina de lapa californiana (KLH) en múltiples compartimentos de ratón y se asoció con la protección contra el reto con Helicobacter. Además, se evaluó la actividad adyuvante de una proteína de fusión de la toxina A: 794 residuos de aminoácidos C-terminales de CTA que comprenden ARU (unidades de repetición de toxina A) se fusionaron con glutatión-S-transferasa (GST) y se expresó el polipéptido GST-ARU resultante en E. coli. Este estudio demostró una mejora significativa de la respuesta inmunitaria por GSTARU a antígenos coadministrados en secreciones de suero y mucosas.

Todos estos estudios sugieren el uso potencial de una proteína recombinante, no tóxica que comprende la toxina A de C. difficile o la toxina B, o fragmentos de estas, o sus combinaciones para producir una vacuna activa contra CDAD. Actualmente, no se encuentra disponible comercialmente ninguna vacuna contra C. difficile, aunque se ha evaluado una vacuna candidata que consiste en toxinas A y B completas desintoxicadas con formalina en estudios de fase I y IIa en humanos. Se informa que la inmunización parenteral con esta vacuna induce respuestas de anticuerpos anti-IgG anti-toxina y anticuerpos neutralizantes de toxina (Kotloff KL y otros, Infect. Immun. 69: 988 -995 (2001); Aboudola S y otros, Infect. Immun. 71: 1608-1610 (2003)).

La bibliografía indica además que la construcción de una proteína de fusión recombinante que contenga dominios de unión al receptor de las toxinas A y B de C. difficile, en su totalidad o en fragmentos de esta, sería un enfoque eficaz y comercialmente viable para el desarrollo de vacunas. Un enfoque de este tipo se ha intentado como una proteína de fusión de dos partes de un fragmento de 700 pares de bases de la toxina A y un fragmento de 1300 pares de bases de la toxina B por Varfolomeeva y otros (Mol. Genetics, Microb. and Virol. 3: 6-10 (2003)). Este enfoque también se ha descrito por Belyi y Varfolomeeva (FEMS Letters 225: 325-9 (2003)) lo que demuestra la construcción de la proteína de fusión recombinante que consiste en tres partes: dos dominios C-terminales compuestos por unidades de repetición de la toxina A y la toxina B de C. difficile seguida del fragmento de enterotoxina Cpe de Clostridium perfringens. La proteína de fusión se expresó en E. coli pero el producto se acumuló en cuerpos de inclusión y no fue estable. Además, el rendimiento de producto puro logrado en este estudio (50 |jg por 100 ml de cultivo) fue considerablemente bajo.

Wilkins y otros (WO 00/61762, Patente de Estados Unidos núm. 6,733,760 (2004)) también describió el uso de unidades de repetición de toxina A y B de C. difficile recombinantes (ARU recombinante y BRU recombinante) y sus conjugados de polisacáridos para la preparación de una vacuna contra CDAD. La proteína ARU recombinante resultante comprendía 867 residuos de aminoácidos mientras que la proteína BRU recombinante contiene 622 aminoácidos de longitud. A diferencia de los estudios mencionados anteriormente, este trabajo demostró un alto nivel de expresión de proteínas solubles ARU y BRU recombinantes en E. coli. Los ratones vacunados con ARU recombinante y con ARU recombinante conjugado con polisacárido montaron un nivel alto de anticuerpos antitoxina A neutralizantes y estaban altamente protegidos contra el reto letal con la toxina A de C. difficile. Además, Wilkins y otros sugirieron el uso de una proteína de fusión recombinante que consiste en ARU y BRU para la preparación de una vacuna.

Existe interés en desarrollar una vacuna contra la CDAD. Una proteína de fusión recombinante que consiste en ARU y BRU puede ser potencialmente útil como vacuna.

Telfer y otros (WO 2010/017383) propuso el uso de microorganismos atenuados, como Salmonella; mediante la expresión en su superficie de un polipéptido inmunogénico que comprende unidades de repetición C-terminales de la toxina A de C. difficile y/o unidades de repetición C-terminales de la toxina B para la vacunación contra CDAD por administración oral a un sujeto humano. El polipéptido de recombinación incluía al menos 20 repeticiones de toxina A y/o 15 repeticiones de toxina B, y además incluía una señal de secreción, por ejemplo, etiqueta ClyA de S. typhimurium.

Resumen

La presente invención proporciona un polipéptido aislado, ácido nucleico, composición farmacéutica y método como se define en las reivindicaciones adjuntas. En la presente se describen nuevas herramientas y métodos para el diseño, producción y uso de la toxina A y la toxina B de C. difficile. La presente invención proporciona un polipéptido aislado C-TAB que comprende la SEQ ID NO: 2 (C-TAB.G5) o un derivado de esta, la SEQ ID NO: 4 (C-TAB.G5.1). El C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 comprende 19 unidades de repetición del dominio C-terminal de la toxina A fusionadas con 23 unidades de repetición del dominio C-terminal de la toxina B. La presente invención también incluye composiciones y formulaciones que comprenden el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. Las composiciones o formulaciones pueden contener el polipéptido aislado, un antígeno adicional, un adyuvante y/o un excipiente. Alternativamente, las composiciones o formulaciones pueden consistir esencialmente en el polipéptido aislado sin un adyuvante u otros ingredientes activos (pero que comprenden opcionalmente un excipiente tal como un portador, tampón y/o estabilizador). Además, las composiciones o formulaciones de la invención pueden administrarse concomitantemente con otros fármacos tales como un antibiótico en particular, por ejemplo, en sujetos con CDAD recurrente o en sujetos que requieran un uso frecuente y/o prolongado de antibióticos.

La presente invención también proporciona una vacuna que comprende el polipéptido aislado de la presente invención. La vacuna puede comprender además un adyuvante, tal como aluminio, un adyuvante derivado de una exotoxina ribosilante de ADP u otros. La vacuna puede administrarse en un régimen de una dosis, régimen de dos dosis (administrado, por ejemplo, dentro de 3 a 20 días, por ejemplo, después de 10 a 15 días de la primera dosis), régimen de tres dosis (administrado, por ejemplo, después de aproximadamente 7 días y aproximadamente 21 días de la primera dosis), o un régimen de más de tres dosis, preferentemente un régimen de dos o tres dosis, en donde la dosis comprende una cantidad de 20 mg a 200 mg del polipéptido de la invención.

En la presente descripción se describe un método para evitar, tratar o aliviar uno o más síntomas de una enfermedad, tal como CDAD, mediante la administración del polipéptido aislado de la invención a un sujeto que lo necesite. El polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 puede administrarse al sujeto por vía intramuscular o por otras vías de suministro.

En la presente descripción se describe un método para evitar una enfermedad, como CDAD, mediante la administración del polipéptido aislado de la invención o una composición que comprende dicho polipéptido a un sujeto con riesgo de CDAD, tal como, por ejemplo, un sujeto con el siguiente perfil: i) un sujeto con un sistema inmunitario más débil como, por ejemplo, un sujeto anciano (por ejemplo, un sujeto mayor de 65 años) o un sujeto menor de 2 años; ii) un sujeto inmunodeprimido como, por ejemplo, un sujeto con SIDA; iii) un sujeto que toma o planea tomar fármacos inmunosupresores; iv) un sujeto con hospitalización planificada o un sujeto que se encuentra en el hospital; v) un sujeto que se encuentra o se espera que vaya a una unidad de cuidados intensivos (UCI); vi) un sujeto que está siendo sometido o planea someterse a una cirugía gastrointestinal; vii) un sujeto que está o planea ir a un centro de atención a largo plazo, como un hogar de ancianos; viii) un sujeto con comorbilidades que requieren el uso frecuente y/o prolongado de antibióticos; ix) un sujeto que es un sujeto con dos o más de los perfiles mencionados anteriormente, como por ejemplo, un sujeto anciano que planea someterse a una cirugía gastrointestinal; x) un sujeto con enfermedad inflamatoria intestinal; y/o xi) un sujeto con CDAD recurrente como, por ejemplo, un sujeto que ha experimentado uno o más episodios de CDAD.

En una modalidad, la invención proporciona métodos para producir el polipéptido aislado C-TAB. G5 o C-TAB.G5.1. El polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 puede producirse a partir de un ácido nucleico que codifica el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 mediante el uso de un sistema de expresión bacteriano, como un sistema de expresión en E. coli.

En una modalidad, la presente invención proporciona el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB. G5.1 en donde las 19 unidades de repetición de la toxina A están conectadas a las 23 unidades de repetición de la toxina B mediante un enlazador que consiste en al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 residuos de aminoácidos. A modo de ejemplo, el enlazador de la presente invención puede comprender la secuencia RSMH (Arg-Ser-Met-His) (aminoácidos 439-442 de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4).

En otra modalidad, la invención proporciona una variante del polipéptido aislado que comprende al menos una mutación (por ejemplo, inserción, sustitución o deleción), por ejemplo en ARU y/o BRU. La secuencia de la variante puede tener 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 2.

Esta invención también proporciona métodos para producir el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 o variantes de estos mediante ingeniería de ADN recombinante, fermentación bacteriana y purificación de proteínas. En una modalidad, la presente invención proporciona métodos para construir el ácido nucleico que codifica el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. En otra modalidad, la invención proporciona métodos para producir el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 mediante el uso de un sistema de expresión bacteriano, tal como un sistema de expresión en E. coli.

En la presente se describen métodos para evitar y tratar la CDAD en sujetos que lo necesiten, como los seres humanos. En este método, el C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 se administra a un sujeto solo o coadministrado con uno o más adyuvantes tales como aluminio u otros. Los sujetos pueden ser individuos sanos que están en riesgo de exposición a C. difficile, sujetos humanos que han sido tratados y recuperados de la infección por C. difficile y que están en riesgo de reinfección por C. difficile, o sujetos humanos que están actualmente infectados con C. difficile y cuyo estado puede mejorarse mediante la inducción de anticuerpos neutralizantes de la toxina de C. difficile.

La presente invención proporciona una composición inmunogénica que comprende C-TAB. G5 o C-TAB. G5.1. La composición inmunogénica puede incluir además un adyuvante para mejorar una respuesta inmunitaria específica de antígeno y/o un portador farmacéuticamente aceptable y/u otros componentes en una formulación adecuada para su aplicación a un sujeto que lo necesite. La composición inmunogénica puede suministrarse mediante suministro intramuscular (IM), suministro intradérmico (ID), suministro subcutáneo (SC), suministro intraperitoneal (IP), suministro oral, suministro nasal, suministro bucal o suministro rectal.

En otra modalidad de la invención, la composición inmunogénica provoca anticuerpos que se unen a toxinas nativas de C. difficile y neutralizan su actividad citotóxica, lo que proporciona protección activa, a largo plazo y/o tratamiento contra la enfermedad asociada a C. difficile (CDAD).

Por consiguiente, la invención proporciona composiciones inmunogénicas útiles para la prevención o el tratamiento de la enfermedad asociada a C. difficile en sujetos que lo necesiten.

En otra modalidad, la invención proporciona ácidos nucleicos y fragmentos o variantes de estos que codifican C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. La invención también proporciona vectores de expresión que comprenden el ácido nucleico que codifica C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1.

En la presente se describen anticuerpos y fragmentos de estos, tales como anticuerpos neutralizantes, humanizados, monoclonales, quiméricos y policlonales, específicos para C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. Los anticuerpos o fragmentos de estos pueden reconocer la toxina A y/o la toxina B.

Otra modalidad proporciona una vacuna que comprende un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4.

En la presente se describen kits de diagnóstico que comprenden los ácidos nucleicos, polipéptidos y/o anticuerpos de la invención.

Otras modalidades y ventajas de la invención se establecen en parte en la descripción que sigue, y en parte, pueden resultar obvias a partir de esta descripción, o pueden aprenderse de la práctica de la invención.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1A muestra el ácido nucleico que codifica el polipéptido aislado C-TAB.G5 (SEQ ID NO: 1). La Figura 1B muestra la secuencia de aminoácidos del polipéptido aislado C-TAB.G5 (SEQ ID NO: 2). El enlazador de aminoácidos entre el dominio de la toxina A y el dominio de la toxina B está subrayado.

La Figura 2A muestra el ácido nucleico que codifica el C-TAB. Polipéptido aislado G5.1 (SEQ ID NO: 3). La Figura 2B muestra la secuencia de aminoácidos del polipéptido aislado C-TAB.G5.1 (SEQ ID NO: 4). El enlazador de aminoácidos entre el dominio de la toxina A y el dominio de la toxina B está subrayado.

La Figura 3 muestra la mejora de la producción de anticuerpos en ratones vacunados con C-TAB.G5 mediante el aumento de dosis de C-TAB.G5 y el suministro conjunto con el adyuvante de aluminio. Los ratones recibieron dos vacunaciones mediante inyección IM. Los títulos de IgG para anticuerpos anti-C-TAB, anti-toxina A y anti-toxina B se evaluaron mediante ELISA dos semanas después de la primera y segunda inyección.

La Figura 4 muestra una representación gráfica de la inducción de IgG anti-C-TAB, anti-toxina A y anti-toxina B en ratones que recibieron dosis crecientes de C-TAB.G5 con y sin aluminio mediante dos inyecciones IM.

La Figura 5 muestra los títulos de anticuerpos en un intervalo de dosis logarítmico en ratones inmunizados con C-TAB.G5 en presencia o ausencia de aluminio. Los títulos de IgG se evaluaron mediante ELISA dos semanas después de la segunda inmunización. Los datos demuestran que el aluminio aumenta significativamente la producción de anticuerpos en ratones vacunados.

La Figura 6 muestra el efecto protector en ratones vacunados con C-TAB.G5 (con y sin aluminio) y expuestos después a una dosis letal de la toxina A o la toxina B. Los ratones que recibieron dos vacunaciones (IM) en un intervalo de dos semanas se retaron (IP) tres semanas después. Se evaluaron los anticuerpos neutralizantes de la toxina A y la toxina B (TNA) dos semanas después de la segunda inyección, y se determinó el por ciento de animales que sobrevivieron al reto letal. El aumento de las dosis de C-TAB.G5 confirió una mayor producción de TNA, así como una mayor protección frente al reto letal. La presencia de aluminio aumentó adicionalmente la producción de TNA, así como también confirió una mayor supervivencia a dosis más bajas.

La Figura 7 muestra una comparación de la respuesta de anticuerpos y la eficacia de protección de C-TAB.G5 en ratones jóvenes (6-7 semanas) y viejos (18 meses) vacunados. Los ratones que recibieron dos vacunaciones (IM) en un intervalo de dos semanas se retaron (IP) tres semanas después. Se evaluaron los títulos de IgG de ELISA para anticuerpos anti-C-TAB, anti-toxina A y anti-toxina B, la producción de TNA así como también la supervivencia global. Los ratones jóvenes demostraron una mayor respuesta de anticuerpos incluso sin aluminio, y ambos grupos mostraron una supervivencia mejorada cuando se vacunaron en presencia de aluminio.

La Figura 8 muestra una comparación de la cinética del desarrollo de anticuerpos IgG anti-C-TAB en ratones jóvenes y viejos vacunados. Los ratones jóvenes demostraron mayores tasas y una producción más temprana de IgG, y ambos grupos demostraron mejores respuestas cuando se vacunaron en presencia de aluminio.

La Figura 9 muestra una comparación en la producción de anticuerpos anti-C-TAB, anti-toxina A y anti-toxina B en ratones inmunizados con C-TAB.G5.1 o la mezcla de toxoide A y B (1:1). Los ratones recibieron dos vacunaciones mediante inyección IM. Los títulos de IgG para anticuerpos anti-C-TAB, anti-toxina A y anti-toxina B se evaluaron mediante ELISA dos semanas después de la segunda inyección. La inmunización con toxoide induce anticuerpos contra la porción N-terminal de la molécula de toxina mientras que la inmunización con C-TAB induce anticuerpos contra la porción C-terminal de la molécula de toxina.

La Figura 10 muestra una comparación en la producción de TNA y la protección frente al reto con la toxina A o B en ratones inmunizados con C-TAB.G5.1 o con la mezcla de los toxoides A y B. Los ratones que recibieron dos vacunas (IM) en un intervalo de dos semanas se retaron (IP) tres semanas después con una dosis letal de la toxina A o la toxina B.

La Figura 11 muestra la producción de IgG anti-C-TAB (A), anti-toxina A (B) y anti-toxina B (C) en hámsteres inmunizados con C-TAB.G5.1 con y sin aluminio. Los hámsteres recibieron tres vacunaciones mediante inyección IM el día 0 y el día 14. Los títulos de IgG para anticuerpos anti-C-TAB, anti-toxina A y anti-toxina B se evaluaron mediante ELISA los días 14, 28 y 35.

La Figura 12 muestra una representación gráfica del desarrollo de anticuerpos de IgG anti-C-TAB en hámsteres inmunizados con C-TAB. G5.1 con o sin aluminio.

La Figura 13 muestra una comparación en TNA y protección en hámsteres inmunizados con C-TAB.G5.1 con o sin aluminio. Dos semanas después de la tercera vacunación, los hámsteres recibieron una dosis letal de la toxina A o la toxina B mediante inyección IP.

La Figura 14 muestra la supervivencia de hámsteres vacunados con C-TAB.G5.1 tras la administración intragástrica de una dosis letal de esporas de C. diffidle. Los datos de supervivencia se graficaron como curvas de ajuste de supervivencia de Kaplan-Meier y el análisis estadístico se realizó mediante un análisis de intervalos logarítmicos. En todas las dosis de esporas (102, 103 y 104), se observó una supervivencia del 100 % de los hámsteres en el grupo vacunado y la supervivencia mejoró significativamente en comparación con el grupo placebo.

La Figura 15 muestra la producción de anticuerpos anti-C-TAB, anti-toxina A y anti-toxina B en monos cinomolgos inmunizados con C-TAB.G5.1 en presencia o ausencia de aluminio. Dos grupos de monos (tres por grupo, 4-6 años) recibieron 200 |jg de C-TAB.G5.1 con o sin 250 |jg de aluminio. Se tomaron muestras de sangre los días de estudio 0, 14, 28 y 42. Se usó el método ELISA para evaluar los títulos de IgG anti-C-TAB, anti-toxina A y anti-toxina B. La Figura 16 muestra una comparación de la inmunogenicidad de C-TAB.G5 y C-TAB.G5.1 suministrados en un intervalo de dosis de 1 jg-30 jg en PBS o tampón de histidina. Los ratones recibieron dos vacunaciones (IM) en un intervalo de dos semanas. Los títulos de IgG para anticuerpos anti-C-TAB, anti-toxina A y anti-toxina B se evaluaron mediante ELISA dos semanas después de la segunda inyección. Los tres títulos de anticuerpos no fueron significativamente diferentes (análisis de prueba T) entre C-TAB.G5 suministrado en PBS o tampón de histidina y C-TAB.G5.1 suministrado en tampón de histidina.

La Figura 17 muestra una comparación de la inmunogenicidad de C-TAB.G5, C-TABNCTB y C-TADCTB en ratones. Los ratones recibieron dos vacunaciones de cada proteína recombinante en un intervalo de dos semanas mediante inyección IM. Todas las inmunizaciones se realizaron en ausencia de adyuvante de aluminio. Los títulos de IgG para anticuerpos anti-C-TAB, anti-toxina A y anti-toxina B se evaluaron mediante ELISA dos semanas después de la segunda inyección. Las tres proteínas de fusión demuestran una alta inmunogenicidad.

La Figura 18 muestra la protección contra el reto con la toxina B nativa en ratones. Los ratones se inmunizaron como se indica en la Figura 17 y tres semanas después se retaron mediante inyección IP con una dosis letal de la toxina B nativa.

La Figura 19 muestra una comparación en TNA y protección en hámsteres vacunados con C-TAB.G5.1 o C-TADCTB en ausencia o presencia de aluminio. Dos semanas después de la tercera vacunación, los hámsteres recibieron una dosis letal de la toxina A o la toxina B mediante inyección IP.

La Figura 20 muestra la producción de TNA y la protección frente al reto con la toxina A o la toxina B en ratones inmunizados con C-TAB.G5.1 en diferentes regímenes. Comparación en la producción y protección de TNA entre grupos de ratones vacunados mediante inyección IM tres veces los días 0, 3 y 14, o los días 0, 7 y 21, o los días 0, 14 y 28. Tres semanas después de la última inyección, los ratones se retaron con una dosis letal de la toxina A o la toxina B (el panel A está en forma de tabla y el panel B está en forma de gráfico).

La Figura 21 muestra la protección (supervivencia) frente al reto con la toxina A de C. difficile (55 ng/ratón) en ratones inmunizados con una sola inyección de 10 jg de C-TAB.G5.1 y 12,5 jg de aluminio (en 100 jl). Dicho reto se realizó 21 días, 35 días o 49 días después de la inmunización.

Descripción detallada

Descripción general

La presente invención proporciona una composición inmunogénica para inducir respuestas inmunitarias protectoras y/o terapéuticas frente a las toxinas A y B de C. difficile que comprende el uso de un polipéptido aislado C-TAB.G5 (SEQ iD NO: 2) o un derivado de este, C-TAB.G5.1 (SEQ ID NO: 4) que comprende 19 unidades de repetición (RU) de la toxina A y 23 unidades de repetición (RU) de la toxina B o fragmentos peptídicos, o variantes de estos.

La presente invención también proporciona métodos para producir el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 y el método para preparar la composición (por ejemplo, una vacuna) útil para la prevención y/o el tratamiento de la CDAD en mamíferos. La siguiente descripción proporciona más detalles y ejemplos para la construcción, expresión y purificación de los polipéptidos aislados recombinantes, su uso como antígenos para inducir una respuesta inmunitaria específica, así como también para evaluar la protección en sujetos. Los sujetos pueden ser animales o humanos.

Los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 para su uso en los métodos y composiciones de la presente invención pueden prepararse mediante el uso de cualquiera de varios métodos estándar. Por ejemplo, el CTAB.G5 o CTAB. G5.1 pueden producirse mediante el uso de técnicas estándar de ADN recombinante, en donde una célula huésped adecuada se transforma con un vector de expresión apropiado que contiene una parte de un fragmento de ácido nucleico que codifica una toxina (véase, por ejemplo, Dove y otros, Infect. Immun. 58: 480-8 (1990), y Barroso y otros, Nucleic Acids Research 18: 4004 (1990). Puede usarse cualquiera de una amplia variedad de sistemas de expresión para producir los polipéptidos recombinantes. C-TAB.G5 o C-TAB. G5.1 pueden producirse en un huésped procariota (por ejemplo, una bacteria, como E. coli o Bacillus) o en un huésped eucariota (por ejemplo, células de levadura, células de mamífero (por ejemplo, células COS1, NIH3T3 o JEG3) o células de insecto (por ejemplo, células de Spodoptera frugiperda (SF9)). Estas células están disponibles, por ejemplo, en American Type Culture Collection (ATCC). El método de transformación y transfección y la elección del vector de expresión dependerán del sistema huésped seleccionado. Los métodos de transformación y transfección se describen, por ejemplo, por Ausubel y otros, ISBN: 047132938X C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1, en particular fragmentos cortos, también pueden producirse mediante síntesis química, por ejemplo, mediante los métodos descritos en Solid Phase Peptide Synthesis, 1984, 2a ed., Stewart y Young, Eds., Pierce Chemical Co., Rockford, Ill., o mediante métodos estándar de traducción in vitro.

Además de las secuencias C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1, la presente invención proporciona variantes de estas que son funcionalmente activas e inmunogénicas. Las variantes pueden tener el mismo nivel de inmunogenicidad que C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. La variante puede tener sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4. Los genes que codifican C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 o sus variantes pueden prepararse mediante el uso de métodos estándar (véase más abajo; véase también, por ejemplo, Ausubel y otros, supra).

Además de las secuencias C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1, en la presente se describen derivados adicionales de C-TAB. G5 que comprenden repeticiones adicionales. A modo de ejemplo, una proteína de fusión, C-TABNCTB (SEQ ID NO: 18, codificada por la SEQ ID NO: 17), comprende, como C-TAB.G5, 19 unidades de repetición de CTA (aminoácidos 2272-2710), 23 unidades de repetición de CTB (aminoácidos 1850-2366) y otras 10 repeticiones adicionales de CTB (aminoácidos 1834-2057) fusionadas al extremo C terminal de CTB. Una variante adicional, la proteína de fusión C-TADCTB (SEQ ID NO: 20, codificada por la SEQ ID NO: 19) comprende C-TAB.G5 (19 repeticiones de CTA y 23 repeticiones de CTB) más 24 unidades de repetición adicionales de CTB (aminoácidos 1834-2366) fusionados al extremo C-terminal de C-TAB.G5. Una variante también puede comprender copias adicionales de C-TAB.G5 o partes de este. Por ejemplo, C-TADCTB comprende una porción doble de las unidades de repetición de CTB presentes en C-TAB. G5.

La presente invención proporciona métodos para la expresión de alto nivel de C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 en un sistema bacteriano como E. coli que comprende introducir un ácido nucleico que codifica C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 en una célula huésped bacteriana y expresar C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1.

Además, el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 de la presente invención puede acoplarse covalentemente o reticularse con adyuvantes (véase, por ejemplo, Cryz y otros, Vaccine 13: 67-71 (1994); Liang y otros, J. Immunology 141: 1495-501 (1988) y Czerkinsky y otros, Infect. Immun. 57: 1072 -77 (1989)).

La presente invención proporciona una vacuna que comprende el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 que puede proteger y proporcionar terapia contra la CDAD. La vacuna de la presente invención comprende un nuevo antígeno que puede suministrarse por vía intramuscular (IM), intradérmica (ID), subcutánea (SC), oral, nasal, bucal o rectal. La vacuna puede proporcionar protección inmunitaria o inducir anticuerpos para la inmunización pasiva. El polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 de la presente invención proporciona una vacuna para inmunizar contra la CDAD. El polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 de la presente invención o sus variantes, es un candidato vacunal combinado dirigido a ampliar la cobertura protectora contra enfermedades asociadas a C. difficile, tales como la CDAD, a un nivel no conocido o publicado hasta ahora. Este concepto de una vacuna única que ofrece protección o una disminución de la gravedad de las enfermedades asociadas a C. difficile representa un avance único en la gestión de la salud pública a nivel mundial y, especialmente, en la reducción de la gravedad de las epidemias (por ejemplo, hogares de ancianos, cruceros).

Como se usa en la presente descripción, "proteína de la toxina A" o "proteína de la toxina B" se refiere a proteínas tóxicas de C. dificile que son principalmente responsables de la CDAD. La toxina A y la toxina B comprenden múltiples unidades de repetición responsables de la inmunogenicidad en los dominios de unión C-terminales.

Como se usa en la presente descripción, "tipo salvaje" o "nativo" se refiere a una proteína de longitud completa compuesta por un ácido nucleico o una secuencia de aminoácidos que se encontraría endógenamente en una célula huésped.

Como se usa la presente descripción, los términos "enfermedad asociada a Clostridium diffiále ", "enfermedad relacionada con Clostridium diffiále", "enfermedad asociada a Clostridium diffiále", " enfermedad mediada por toxina de Clostridium difficile", "infección por Clostridium difficile" y "CDAD" se refieren a enfermedades causadas, directa o indirectamente, por la infección con Clostridium difficile.

"Antígeno" se refiere a una sustancia que induce una respuesta inmunitaria específica cuando se presenta a las células inmunitarias de un organismo. Por ejemplo, un antígeno puede ser un ácido nucleico, una proteína, un polipéptido, un péptido, una glicoproteína, un carbohidrato, un lípido, un glicolípido, una lipoproteína, una proteína de fusión, un fosfolípido o un conjugado de una combinación de estos. Un antígeno puede comprender un epítopo inmunogénico único o una multiplicidad de epítopos inmunogénicos reconocidos por un receptor de células B (es decir, un anticuerpo en la membrana de la célula B) o un receptor de células T. El antígeno puede proporcionarse como una partícula semejante a virus (VLP) o un microbio o microorganismo completo tal como, por ejemplo, una bacteria o virión. El antígeno puede ser un virus vivo inactivado o atenuado. El antígeno puede obtenerse de un extracto o lisado, ya sea de células completas o de membrana sola; o el antígeno puede sintetizarse químicamente o producirse de manera recombinante. Un antígeno puede administrarse solo o con un adyuvante. Una sola molécula de antígeno puede tener propiedades de antígeno y de adyuvante.

Por "adyuvante" se entiende cualquier sustancia que se use para potenciar específica o no específicamente una respuesta inmunitaria específica de antígeno, quizás mediante la activación de células presentadoras de antígeno. Los ejemplos de adyuvantes incluyen una emulsión de aceite (por ejemplo, adyuvante de Freund completo o incompleto), adyuvante Seppic incompleto de Montanide como ISA, adyuvantes de emulsión de aceite en agua como el sistema de adyuvante Ribi, formulación de adyuvante Syntax que contiene dipéptido de muramilo, adyuvante de sal de aluminio (ALUM), polímero policatiónico, especialmente péptido policatiónico, especialmente poliarginina o un péptido que contiene al menos dos motivos LysLeuLys, especialmente KLKLLLLLKLK, oligodesoxinucleótido inmunoestimulador (ODN) que contiene dinucleótidos de citosina-guanina (CpG) no metilados en un contexto de base definida (por ejemplo, como se describe en el documento WO 96/02555) u ODN basados en inosina y citidina (por ejemplo, como se describe en el documento WO 01/93903), o ácido desoxinucleico que contiene residuos de desoxiinosina y/o desoxiuridina (como se describe en los documentos WO 01/93905 y W^o02/095027), especialmente Oligo(dIdC)13 (como se describe en WO 01/93903 y WO 01/93905), compuesto neuroactivo, especialmente hormona de crecimiento humana (descrita en el documento WO 01/24822), o combinaciones de estos, una quimiocina (por ejemplo, defensinas 1 o 2, RANTES, MIP1-a, MIP-2, interleucina-8 o una citocina (por ejemplo, interleucina-1p, -2, -6, -10 o -12; interferón-y; factor de necrosis tumoral-a; o factor estimulante de colonias de granulocitos-monocitos) (revisado en Nohria y Rubin, 1994), una variante de dipéptido de muramilo (por ejemplo, murabutida, treonil-MDP o tripéptido de muramilo), variantes sintéticas de MDP, una proteína de choque térmico o una variante, una variante de Leishmania major LelF (Skeiky y otros, 1995, J. Exp. Med. 181: 1527-1537), variantes no tóxicas de exotoxinas ribosilantes de ADP bacterianas (bARE), que incluyen variantes en el sitio de escisión de tripsina (Dickenson y Clements, (1995) Infection and Immunity 63 (5): 1617-1623) y/o que afectan a la ADP-ribosilación (Douce y otros, 1997) o las bARE químicamente desintoxicadas (toxoides), QS21, Quill A, N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutamil-L-alanina-2-[1,2-dipalmitoil-s-glicero-3-(hidroxifosforiloxi)]etilamida (MTP-PE) y composiciones que contienen un aceite metabolizable y un agente emulsionante. Un adyuvante puede administrarse con un antígeno o puede administrarse por sí mismo, ya sea por la misma vía que la del antígeno o por una vía diferente a la del antígeno. Una sola molécula de adyuvante puede tener propiedades tanto de adyuvante como de antígeno.

Por "cantidad eficaz" se entiende una cantidad de un agente terapéutico suficiente para inducir o mejorar una respuesta inmunitaria específica de un antígeno, para un antígeno, o para tratar o diagnosticar una afección, para un fármaco. Dicha inducción de una respuesta inmunitaria puede proporcionar un tratamiento tal como, por ejemplo, inmunoprotección, desensibilización, inmunosupresión, modulación de una enfermedad autoinmunitaria, potenciación de la inmunovigilancia del cáncer o vacunación terapéutica contra una enfermedad infecciosa establecida. El tratamiento incluye curación, mejora o prevención.

Por "ácido nucleico" se entiende una única base de ácido desoxirribonucleico o un ácido ribonucleico o una secuencia de este unida por enlaces fosfodiéster.

Por "agente terapéutico" se entiende cualquier molécula que pueda usarse para tratar una enfermedad, aliviar los síntomas de una enfermedad, evitar una enfermedad o diagnosticar una enfermedad. Por ejemplo, un agente terapéutico puede ser un antígeno o un fármaco.

Por "sujeto" se entiende un animal. El sujeto puede ser cualquier animal, que incluye cualquier vertebrado. El sujeto puede ser un ganado doméstico, un animal de laboratorio (que incluye, pero no se limita a, roedores como una rata, hámster, gerbo o ratón) o un animal de compañía. En una modalidad, el animal puede ser un mamífero. Los ejemplos de mamíferos incluyen humanos, primates, marsupiales, caninos, monos, roedores, felinos, simios, ballenas, delfines, vacas, cerdos y caballos. El sujeto puede necesitar el tratamiento de una enfermedad o puede necesitar un tratamiento profiláctico.

Como se usa en la presente descripción, el término "anticuerpo" significa una molécula de inmunoglobulina o un fragmento de una molécula de inmunoglobulina que tiene la capacidad de unirse específicamente a un antígeno particular. Los anticuerpos son bien conocidos por los expertos en la ciencia de la inmunología. Como se usa en la presente descripción, el término "anticuerpo" significa no solo moléculas de anticuerpo de longitud completa, sino también fragmentos de moléculas de anticuerpo que conservan la capacidad de unión al antígeno. Dichos fragmentos también se conocen bien en la técnica y se emplean regularmente tanto in vitro como in vivo. En particular, como se usa en la presente descripción, el término "anticuerpo" significa no solo moléculas de inmunoglobulina de longitud completa, sino también fragmentos activos de unión a antígeno tales como los bien conocidos fragmentos activos F(ab')2, Fab, Fv y Fd.

Como se usa en la presente descripción, el término "variantes" puede incluir proteínas y/o polipéptidos y/o péptidos que son diferentes de un polipéptido de tipo salvaje, en donde uno o más residuos se han sustituido de forma conservadora con un residuo funcionalmente similar, y adicionalmente que muestra propiedades funcionales idénticas sustancialmente al polipéptido de tipo salvaje. Los ejemplos de sustituciones conservadoras incluyen la sustitución de un residuo no polar (hidrófobo) por otro (por ejemplo, isoleucina, valina, leucina o metionina) por otro, la sustitución de un residuo polar (hidrófilo) por otro (por ejemplo, entre arginina y lisina, entre glutamina y asparagina, entre glicina y serina), la sustitución de un residuo básico por otro (por ejemplo, lisina, arginina o histidina), o la sustitución de un residuo ácido por otro (por ejemplo, ácido aspártico o ácido glutámico). Una variante puede incluir cualquier polipéptido que tenga una estructura terciaria sustancialmente idéntica a un polipéptido de la invención que también presente las propiedades funcionales de los polipéptidos como se describe en la presente. Una variante puede ser un mutante de un polipéptido de tipo salvaje.

Como se usa en la presente descripción, "tratamiento" puede incluir cualquier tipo de intervención usada en un intento de alterar el curso natural del individuo o la célula. El tratamiento puede incluir, pero no se limita a, la administración de, por ejemplo, una composición farmacéutica, sola o en combinación con otras modalidades de tratamiento generalmente conocidas en la técnica. El "tratamiento" puede realizarse de forma profiláctica o después del inicio de un evento patológico.

Como se usa en la presente descripción, "portador farmacéuticamente aceptable" puede incluir cualquier material que, cuando se combina con un ingrediente activo, permite que el ingrediente conserve su actividad biológica y no sea reactivo con el sistema inmunitario del sujeto. Los portadores y/o excipientes farmacéuticamente aceptables pueden incluir tampones, estabilizadores, diluyentes, conservantes y solubilizantes. En general, la naturaleza de los portadores o excipientes dependerá del modo particular de administración que se emplee. Por ejemplo, las formulaciones parenterales comprenden habitualmente fluidos inyectables que incluyen fluidos farmacéutica y fisiológicamente aceptables tales como agua, solución salina fisiológica, soluciones salinas equilibradas, dextrosa acuosa, glicerol o similares como vehículo. Para composiciones sólidas (por ejemplo, en forma de polvo, píldora, comprimido o cápsula), los portadores sólidos no tóxicos convencionales pueden incluir, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón o estearato de magnesio. Además de los portadores biológicamente neutros, las composiciones farmacéuticas que se van a administrar pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas, tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes y agentes tamponantes del pH y similares, por ejemplo, acetato de sodio o monolaurato de sorbitán.

Como se usa en la presente descripción, "fusión" puede referirse a ácidos nucleicos y polipéptidos que comprenden secuencias que no se encuentran asociadas naturalmente entre sí en el orden o contexto en el que se colocan de acuerdo con la presente invención. Un ácido nucleico o polipéptido de fusión no comprende necesariamente la secuencia natural del ácido nucleico o polipéptido en su totalidad. Las proteínas de fusión tienen dos o más segmentos unidos mediante enlaces peptídicos normales. Los ácidos nucleicos de fusión tienen dos o más segmentos unidos mediante enlaces fosfodiéster normales.

Polipéptidos aislados

La presente invención proporciona los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 como se establece en la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 4, respectivamente, que comprenden 19 unidades de repetición de la toxina A de C. difficile y 23 unidades de repetición de la toxina B de C. difficile. Un homólogo de C-TAB. G5, como C-TAB.G5.1, puede diferir de C-TAB.G5 en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos. El polipéptido C-TAB.G5.1 es una proteína de fusión que contiene el mismo dominio C-terminal de la toxina B que C-TAB.G5, pero el dominio C-terminal de la toxina A derivada de la cepa C. difficile VPI-10463 que es un homólogo del polipéptido C-TAB.G5 correspondiente derivado de la cepa C. difficile 630 y se diferencia por dos aminoácidos en las posiciones 155-156. A la secuencia codificante de C-TAB.G5.1, como se expone en la SEQ ID NO: 3, se le optimizó un codón para una expresión mejorada dentro de una célula huésped de E. coli. Los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 de la presente invención pueden ser eficaces para neutralizar los efectos tóxicos de la toxina A y la toxina B. de C. difficile.

La toxina A y la toxina B están codificadas por los genes trdA (SEQ ID NO: 5) y trdB (SEQ ID NO: 7), de la cepa 630 de C. difficile, respectivamente. Estructuralmente, las toxinas de C. difficile comprenden un dominio de ADP-glucosil transferasa, un dominio de cisteína proteasa, una región hidrófoba y una región de unión al receptor. El dominio C-terminal contiene unidades de repetición (RU) alta (también conocidas como oligopéptidos de repetición combinados (CROPS)). Las RU pueden ser oligopéptidos largos o cortos y pueden comprender de 20 a 50 aminoácidos con un motivo YYF consenso que se repite. Las RU se reúnen en agrupaciones. Como ejemplo, la toxina A, cepa 630 (SEQ ID NO: 6) codificada por el gen trdA de tipo salvaje (SEQ ID NO: 5) contiene 39 RU. Las 39 RU se reúnen en 8 agrupaciones. La toxina B, cepa 630 (SEQ ID NO: 8) codificada por el gen trdB de tipo salvaje (SEQ ID NO: 7) contiene 24 RU que se reúnen en 5 agrupaciones. Las Tablas 1 y 2 a continuación muestran las posiciones de aminoácidos de cada una de las RU en la toxina A y la toxina B de C. difficile codificada por el gen trdA y el gen trdB.

Tabla 1: Unidades de repetición de la toxina A (ARU)

(Continuación)

Tabla 2: Unidades de repetición de la toxina B (BRU)

En consecuencia, los polipéptidos aislados C-TAB.G5 y C-TAB.G5.1 comprenden 19 RU del dominio C-terminal de la toxina A de C. diffidle y 23 RU del dominio C-terminal de la toxina B de C. difficile, respectivamente. El C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 comprende los aminoácidos 2272-2710 de la toxina A de la SEQ ID NO: 6 fusionados con los aminoácidos 1850-2366 de la toxina B de la SEQ ID NO: 8. El polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 4, respectivamente. Las RU respectivas en el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 también pueden ser a partir de variantes de la toxina A o la toxina B de C. difficile. Estas RU en el polipéptido aislado C-TAB también pueden ser una combinación de la toxina A o la toxina B de C. difficile de origen natural o variantes.

Las RU en los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 comprenden RU largas y RU cortas, y las RU largas y RU cortas se disponen en una agrupación. Los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB. G5.1 de la presente invención comprenden 4 agrupaciones de 3 a 5 RU cortas seguidas de una RU larga de la toxina A de C. difficile y 5 agrupaciones de 3 a 5 RU cortas seguidas de una RU larga de toxina B de C. difficile.

Las RU cortas y largas contienen motivos conservados. La unidad de repetición corta puede comprender 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, o 26 aminoácidos. Cada unidad de repetición corta puede comprender motivos de tirosina conservados, tales como YYF, FYF, YFF, FYI o HYF. Una unidad de repetición corta puede comprender además un residuo de aspartato/histidina antes del motivo de tirosina si la siguiente unidad de repetición es una unidad de repetición larga. La unidad de repetición larga puede comprender 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, o 35 aminoácidos. Cada unidad de repetición larga puede comprender un motivo de repetición de tirosina tal como FEYF, FKYF o YKYF.

En la presente invención, las porciones de toxina A y toxina B de los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 pueden fusionarse directamente entre sí. Las porciones de toxina A y toxina B pueden estar separadas por una región enlazadora. Una región enlazadora puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 to 15, 20 to 30, 40, 45, o 50 aminoácidos. Los expertos en la técnica reconocerán que la región enlazadora puede adaptarse para alterar la posición de las porciones de la toxina A y la toxina B de modo que en su forma expresada y plegada cada unidad de repetición de toxina en los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 se coloca para exponer de manera óptima los epítopos potenciales y conservar su inmunogenicidad. Las RU y las agrupaciones en los polipéptidos aislados C-TAB también pueden separarse mediante enlazadores. En una modalidad, el enlazador comprende el péptido RSMH (439-442 de la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4).

Los polipéptidos aislados C-TAB de la presente invención pueden tener al menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia o similitud de secuencia con la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4. Como se conoce en la técnica, la "similitud" entre dos polipéptidos o polinucleótidos se determina tras comparar la secuencia de aminoácidos o nucleótidos y sus nucleótidos o aminoácidos sustituidos conservados de un polinucleótido o polipéptido con la secuencia de un segundo polinucleótido o polipéptido. También se conoce en la técnica "identidad", que significa el grado de relación de secuencia entre dos polipéptidos o dos secuencias de polinucleótidos según se determina mediante la identidad de la coincidencia entre dos cadenas de tales secuencias. Tanto la identidad como la similitud pueden calcularse fácilmente (Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A. M., y Griffin, H. G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991). Si bien existen varios métodos para medir la identidad y la similitud entre dos secuencias de polinucleótidos o polipéptidos, los términos "identidad" y "similitud" son bien conocidos por los expertos en la técnica (Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991; y Carillo, H. y Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Los métodos comúnmente empleados para determinar la identidad o la similitud entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a los descritos en Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, y Carillo, H. y Lipman, D., SIAM J. Applied Math. 48: 1073 (1988).

Los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 de la presente invención son inmunogénicos. Por ejemplo, los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 de la presente invención pueden tener al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % de la actividad inmunitaria de la correspondiente toxina bacteriana A, y los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 pueden tener al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % de la actividad inmunitaria de la correspondiente toxina bacteriana B. Los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 de la presente invención pueden usarse como vacunas para tratar, evitar o aliviar los síntomas de la CDAD.

Los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 de la presente invención también incluyen variantes del polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 que tiene la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4, respectivamente. Las variantes pueden tener inserciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos que tienen un efecto mínimo o nulo sobre la actividad, función o forma del polipéptido aislado. Los ejemplos de tales sustituciones incluyen la sustitución de un residuo no polar por otro, la sustitución de un residuo polar por otro, la sustitución de un residuo básico por otro o la sustitución de un residuo ácido por otro. Las variantes polipeptídicas aisladas de C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 pueden incluir además inserciones, sustituciones y/o deleciones de aminoácidos en una comparación con la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de la toxina A o la toxina B nativas que producen un efecto mínimo sobre la actividad, función y/o estructura del polipéptido. Los expertos en la técnica reconocerán que también pueden usarse aminoácidos no naturales. Los aminoácidos no naturales incluyen, por ejemplo, beta-alanina (beta-Ala) u otros omega-aminoácidos, como ácido 3-amino propiónico, 2,3-diamino propiónico (2,3-diaP), 4-amino butírico y así sucesivamente, alfa-aminisobutírico (Aib), sarcosina (Sat), ornitina (Orn), citrulina (Cit), t-butilalanina (t-BuA), t-butilglicina (t-BuG), N-metilisoleucina (N-MeIle), fenilglicina (Phg) y ciclohexilalanina (Cha), norleucina (Nle), ácido cisteico (Cya), 2-naftilalanina (2-Nal); ácido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico (Tic); beta-2-tienilalanina (Thi); y sulfóxido de metionina (MSO).

Las secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 de la presente invención pueden someterse a optimización de codones para mejorar la expresión en diferentes células huésped. La optimización de codones se refiere a modificar la secuencia de nucleótidos con el fin de mejorar la expresión de proteínas en una célula huésped de interés tras reemplazar uno o más codones de la secuencia nativa con codones que se usan con más frecuencia en los genes de esa célula huésped o en los genes del huésped del que se derivó la célula. Varias especies exhiben un sesgo particular para ciertos codones de un aminoácido particular. La presente invención proporciona una secuencia de nucleótidos sometida a optimización de codones que codifica el polipéptido aislado C-TAB.G5.1 para una expresión mejorada en E. coli.

Los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 de la presente invención pueden prepararse mediante cualquier técnica conocida. Por ejemplo, los polipéptidos aislados pueden expresarse mediante ingeniería genética. A modo de ejemplo, la traducción de ADN recombinante. Los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 también pueden prepararse sintéticamente. A modo de ejemplo, los polipéptidos aislados C-TAB. G5 o C-TAB. G5.1 pueden sintetizarse mediante el uso de la técnica de síntesis en fase sólida descrita inicialmente por Merrifield (J. Am Chem. Soc. 85: 2149-2154). Pueden encontrarse otras técnicas de síntesis de polipéptidos, por ejemplo, Kent y otros (1985) en Synthetic Peptides in Biology and Medicine, eds. Alitalo y otros, Elsevier Science Publishers, 295-358.

Los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 de la presente invención pueden aislarse u obtenerse en forma sustancialmente pura. Sustancialmente pura significa que las proteínas y/o polipéptidos y/o péptidos están esencialmente libres de otras sustancias con las que pueden encontrarse en la naturaleza o en sistemas in vivo en un grado práctico y apropiado para su uso previsto. En particular, los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 son suficientemente puros y están suficientemente libres de otros constituyentes biológicos de sus células huésped para ser útiles, por ejemplo, en la generación de anticuerpos, secuenciación o producción de preparados farmacéuticos. Mediante técnicas bien conocidas en la técnica, pueden producirse polipéptidos sustancialmente puros a la luz de las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos descritas en la presente descripción. Debido a que un polipéptido aislado sustancialmente purificado de la invención puede mezclarse con un portador farmacéuticamente aceptable en una preparación farmacéutica, el polipéptido aislado puede comprender solo un cierto porcentaje en peso de la preparación. No obstante, el polipéptido aislado es sustancialmente puro porque se ha separado sustancialmente de las sustancias con las que puede estar asociado en los sistemas vivos.

La presente invención proporciona además polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 que comprenden polipéptidos adicionales. Los polipéptidos adicionales pueden ser fragmentos de un polipéptido más grande. En una modalidad, hay uno, dos, tres, cuatro o más polipéptidos adicionales fusionados a los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. En algunas modalidades, los polipéptidos adicionales se fusionan hacia el extremo amino de los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB. G5.1. En otras modalidades, los polipéptidos adicionales se fusionan hacia el extremo carboxilo de los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. En otras modalidades, los polipéptidos adicionales flanquean los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB. G5.1. En aún otras modalidades, los polipéptidos adicionales se dispersan entre la porción de toxina A y la porción de toxina B de los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1.

En algunas modalidades, los polipéptidos adicionales ayudan a dirigir la secreción o localización subcelular de los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. Dichos polipéptidos se denominan "secuencia señal". Se describe una señal secretora, por ejemplo, la patente de Estados Unidos 6,291,212 y la patente de Estados Unidos 5,547,871. La secuencia señal secretora codifica péptidos secretores. Un péptido secretor es una secuencia de aminoácidos que actúa para dirigir la secreción de C-TAB. G5 o C-TAB. g5.1 desde una célula. Los péptidos secretores se caracterizan generalmente por un núcleo de aminoácidos hidrófobos y se encuentran típicamente (pero no exclusivamente) en los extremos amino de las proteínas recién sintetizadas. El péptido secretor puede escindirse a partir del polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 durante la secreción. Los péptidos secretores pueden contener sitios de procesamiento que permitan la escisión del péptido señal a partir de la proteína madura a medida que pasa por la vía secretora. Los sitios de procesamiento pueden codificarse dentro del péptido señal o pueden añadirse al péptido señal mediante, por ejemplo, mutagénesis in vitro. Las secuencias señal secretoras pueden ser necesarias para una serie compleja de etapas de procesamiento postraduccional para permitir la secreción de C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. La secuencia señal puede seguir inmediatamente al codón de iniciación y codifica un péptido señal en el extremo amino-terminal de C-TAB. G5 o C-TAB. G5.1. La secuencia señal puede preceder al codón de terminación y codifica un péptido señal en el extremo carboxi-terminal de C-TAB.G5 o CTAB.G5.1. En la mayoría de los casos, la secuencia señal se escinde por una proteasa específica, llamada peptidasa señal. Los ejemplos de secuencias señal secretoras incluyen, pero no se limitan a, ompA, pelB y ST pre pro.

En algunas modalidades, los polipéptidos adicionales ayudan a la estabilización, estructura y/o purificación de los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. En algunas modalidades, los polipéptidos adicionales pueden comprender un epítopo. En otras modalidades, los polipéptidos adicionales pueden comprender una etiqueta de afinidad. A modo de ejemplo, la fusión de un polipéptido que comprende un epítopo y/o una etiqueta de afinidad con el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 puede ayudar a la purificación y/o identificación del polipéptido. A modo de ejemplo, el segmento polipeptídico puede ser una etiqueta His, una etiqueta myc, una etiqueta de péptido S, una etiqueta MBP (proteína de unión a maltosa), una etiqueta GST (glutatión S-transferasa), una etiqueta ^fL^aG, una etiqueta de tiorredoxina, una etiqueta de GFP (proteína verde fluorescente), una BCCP (proteína portadora de biotina carboxilo), una etiqueta de calmodulina, una etiqueta de Strep, una etiqueta de epítopo de HSV, una etiqueta de epítopo V5 y una etiqueta de CBP. Los expertos en la técnica conocen el uso de tales epítopos y etiquetas de afinidad.

En otras modalidades, los polipéptidos adicionales pueden proporcionar un polipéptido aislado C-TAB. G5 o C-TAB.G5.1 que comprende sitios para la escisión del polipéptido. Como ejemplo, un polipéptido puede escindirse mediante hidrólisis del enlace peptídico. En algunas modalidades, la escisión la realiza una enzima. En algunas modalidades, la escisión se produce en la célula. En otras modalidades, la escisión se produce mediante manipulación artificial y/o introducción artificial de una enzima de escisión. A modo de ejemplo, las enzimas de escisión pueden incluir pepsina, tripsina, quimotripsina, trombina y/o factor Xa. La escisión permite aislar fácilmente los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 a partir de los polipéptidos. La escisión puede permitir además la separación de la porción de toxina A de la porción de toxina B. La escisión también puede permitir el aislamiento del polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 fusionado a polipéptidos de otros polipéptidos, tal como mediante la escisión de un epítopo usado para purificar la proteína expresada.

Los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 pueden poseer además modificaciones estructurales adicionales no compartidas con el mismo péptido sintetizado orgánicamente, tales como adenilación, carboxilación, glicosilación, hidroxilación, metilación, fosforilación o miristilación. Estas modificaciones estructurales añadidas pueden seleccionarse adicionalmente o preferirse mediante la elección apropiada del sistema de expresión recombinante. Por otro lado, los polipéptidos de fusión pueden tener su secuencia extendida por los principios y la práctica de la síntesis orgánica.

La presente invención también proporciona ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos aislados CTAB.G5 o C TAB.G5.1 que comprenden una porción polipeptídica obtenida de la toxina A de C. difficile y una porción polipeptídica obtenida de la toxina B de C. difficile. Los ácidos nucleicos pueden incluir formas mono o bicatenarias de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos o polímeros de estos. La presente invención proporciona ácidos ribonucleicos que codifican los polipéptidos aislados C TAB.G5 o C TAB.G5.1. La presente invención también proporciona ácidos nucleicos que se hibridan en condiciones rigurosas con un ácido nucleico que codifica el polipéptido aislado C TAB.G5 o C-TAB.G5.1 y el complemento de este. Las condiciones rigurosas se refieren al grado de homología entre una sonda y un ácido nucleico unido a un filtro; cuanto mayor sea la rigurosidad, mayor será el por ciento de homología entre la sonda y el ácido nucleico unido al filtro. La temperatura para un lavado riguroso puede determinarse sobre la base de la Tm del ácido nucleico (basada en el contenido de G/C). Las condiciones estrictas pueden verse afectadas adicionalmente por la concentración de sal en un tampón, como el citrato de sodio estándar (SSC). La presente invención proporciona ácidos nucleicos que tienen aproximadamente 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % de similitud de secuencia o identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1.

El polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 puede comprender adicionalmente una región enlazadora, por ejemplo, un enlazador menor de aproximadamente 50, 40, 30, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 residuos de aminoácidos. El enlazador puede unirse covalentemente a y entre la porción polipeptídica derivada de la toxina A o porción de esta y la porción polipeptídica derivada de la toxina B.

La presente invención proporciona ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos aislados CTAB. G5 o C-TAB. G5.1 que están degenerados en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 3, respectivamente. La degeneración del código genético permite variaciones de la secuencia de nucleótidos de una proteína de la toxina A, una proteína de la toxina B y/o un polipéptido aislado de interés, mientras se produce un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos idéntica a la del polipéptido codificado por la secuencia de ADN nativa. El procedimiento, conocido como "optimización de codones" (descrito en la patente de Estados Unidos 5,547,871 proporciona un medio para diseñar tal secuencia de ADN alterada. El diseño de genes de codones optimizados debe tener en cuenta una variedad de factores, que incluye la frecuencia de uso de codones en un organismo, las frecuencias vecinas más cercanas, la estabilidad del ARN, el potencial de formación de estructuras secundarias, la vía de síntesis y las futuras manipulaciones previstas del ADN de ese gen. En particular, pueden usarse métodos disponibles para alterar los codones que codifican un polipéptido aislado dado con los más fácilmente reconocidos por la levadura cuando se usan sistemas de expresión de levadura, o por células de insecto cuando se usa el sistema de expresión de células de insecto. La degeneración del código genético también permite que la misma secuencia de aminoácidos sea codificada y traducida de muchas formas diferentes. Por ejemplo, la leucina, la serina y la arginina están codificadas cada una por seis codones diferentes, mientras que la valina, prolina, treonina, alanina y glicina están codificadas cada una por cuatro codones diferentes. Sin embargo, la frecuencia de uso de tales codones sinónimos varía de un genoma a otro entre eucariotas y procariotas. Por ejemplo, los patrones de elección de codones sinónimos entre los mamíferos son muy similares, mientras que los organismos evolutivamente distantes como la levadura (como S. cerevisiae), las bacterias (como E. coli) y los insectos (como D. melanogaster) revelan un patrón de frecuencias de uso de codones genómicos claramente diferente (Grantham, R., y otros, Nucl. Acid Res., 8, 49-62 (1980); Grantham, R y otros, Nucl. Acid Res., 9, 43-74 (1981); Maroyama, T. y otros, Nucl. Acid Res., 14, 151-197 (1986); Aota, S. y otros, Nucl. Acid Res., 16, 315-402 (1988); Wada, K. y otros, Nucl. Acid Res., 19 Supp., 1981-1985 (1991); Kurland, C. G., FEBS Lett., 285, 165-169 (1991)). Estas diferencias en los patrones de elección de codones parecen contribuir a los niveles de expresión general de genes individuales tras modular las tasas de elongación de péptidos. (Kurland, C. G., FEBS Lett., 285, 165-169 (1991); Pedersen, S., EMBO J., 3, 2895-2898 (1984); Sorensen, M. A., J. Mol. Biol., 207, 365-377 (1989); Randall, L. L. y otros, Eur. J. Biochem., 107, 375-379 (1980); Curran, J. F. y Yarus. M., J. Mol. Biol., 209, 65-77 (1989); Varenne, S. y otros, J. Mol. Biol., 180, 549-576 (1984), Varenne, S. y otros, J. Mol. Biol., 180, 549-576 (1984); Garel, J.-P., J. Theor. Biol., 43, 211-225 (1974); Ikemura, T., J. Mol. Biol., 146, 1-21 (1981); Ikemura, T., J. Mol. Biol., 151, 389-409 (1981)).

Las frecuencias de uso de codones preferidas para un gen sintético deberían reflejar los usos de codones de genes nucleares derivados a partir del genoma exacto (o tan estrechamente relacionado como sea posible) de la célula/organismo que se pretende usar para la expresión de proteínas recombinantes.

Los métodos preferidos para determinar la identidad se diseñan para brindar la mayor coincidencia entre las dos secuencias evaluadas. Los métodos para determinar la identidad y la similitud se codifican en programas informáticos. Los métodos de programas informáticos preferidos para determinar la identidad y la similitud entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, el paquete de programas GCG (Devereux, y otros, Nucl. Acid Res. 12 (1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul y otros, J. Mol. Biol. 215: 403 (1990)). El grado de similitud o identidad mencionado anteriormente se determina como el grado de identidad entre las dos secuencias, lo que a menudo indica una derivación de la primera secuencia a partir de la segunda. El grado de identidad entre dos ácidos nucleicos puede determinarse por medio de programas informáticos conocidos en la técnica tales como GAP proporcionado en el paquete de programas GCG (Needleman y Wunsch J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970)). Con el fin de determinar el grado de identidad entre dos ácidos nucleicos para la presente invención, se usa GAP con los siguientes ajustes: penalización de creación de GAP de 5,0 y penalización de extensión de GAP de 0,3.

La presente invención también proporciona un vector que comprende un ácido nucleico que codifica el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. Un vector puede ser cualquiera de varios ácidos nucleicos en los que puede insertarse una secuencia deseada mediante restricción y ligación para el transporte entre diferentes entornos genéticos o para la expresión en una célula huésped. Los vectores se componen típicamente de ADN, aunque también se encuentran disponibles vectores de ARN. Los vectores incluyen, pero no se limitan a, plásmidos y fagémidos. Un vector de clonación es uno que es capaz de replicarse en una célula huésped, y que se caracteriza además por uno o más sitios de restricción de endonucleasas en los que el vector puede cortarse de una manera determinable y en los que se puede ligar una secuencia de ADN deseada de manera que el nuevo vector recombinante conserva su capacidad de replicarse en la célula huésped. En el caso de los plásmidos, la replicación de la secuencia deseada puede ocurrir muchas veces a medida que el plásmido aumenta en número de copias dentro de la bacteria huésped o solo una vez por huésped antes de que el huésped se reproduzca por mitosis. En el caso de los fagos, la replicación puede ocurrir activamente durante una fase lítica o pasivamente durante una fase lisogénica.

Los vectores pueden contener además una secuencia promotora. Un promotor puede incluir un ácido nucleico no traducido ubicado habitualmente corriente arriba de la región codificante que contiene el sitio para iniciar la transcripción del ácido nucleico. La región promotora también puede incluir otros elementos que actúan como reguladores de la expresión génica. En modalidades adicionales de la invención, el vector de expresión contiene una región adicional para ayudar en la selección de células que tienen incorporado el vector de expresión. La secuencia promotora a menudo está unida (inclusive) en su extremo 3' por el sitio de inicio de la transcripción y se extiende corriente arriba (dirección 5') para incluir el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables por encima del fondo. Dentro de la secuencia promotora se encontrará un sitio de inicio de la transcripción, así como también dominios de unión a proteínas responsables de la unión de la ARN polimerasa. Los promotores eucariotas contendrán a menudo, pero no siempre, cajas "TATA" y cajas "CAT".

Los vectores pueden contener además una o más secuencias marcadoras adecuadas para su uso en la identificación y selección de células que se han transformado o transfectado con el vector. Los marcadores incluyen, por ejemplo, genes que codifican proteínas que aumentan o disminuyen la resistencia o la sensibilidad a antibióticos u otros compuestos, genes que codifican enzimas cuyas actividades son detectables mediante ensayos estándar conocidos en la técnica (por ejemplo, p-galactosidasa o fosfatasa alcalina), y genes que afectan visiblemente al fenotipo de células, huéspedes, colonias o placas transformadas o transfectadas. Los vectores preferidos son aquellos capaces de replicación y expresión autónomas de los productos génicos estructurales presentes en los segmentos de ADN a los que están unidos operativamente.

Un vector de expresión es uno en el que puede insertarse un ácido nucleico deseado mediante restricción y ligación, de manera que se une operativamente a secuencias reguladoras y puede expresarse como una transcripción de ARN. La expresión se refiere a la transcripción y/o traducción de un gen endógeno, transgén o región codificante en una célula.

Una secuencia codificante y las secuencias reguladoras se unen operativamente cuando están unidas covalentemente de tal manera que colocan la expresión o transcripción de la secuencia codificante bajo la influencia o el control de las secuencias reguladoras. Si se desea que las secuencias codificantes se traduzcan en una proteína funcional, se dice que dos secuencias de ADN están unidas operativamente si la inducción de un promotor en las secuencias reguladoras 5' da como resultado la transcripción de la secuencia codificante y si la naturaleza del enlace entre las dos secuencias de ADN no (1) da como resultado la introducción de una mutación de cambio de marco, (2) interfiere con la capacidad de la región promotora para dirigir la transcripción de las secuencias codificantes, o (3) interfiere con la capacidad del transcripto de ARN correspondiente para traducirse en una proteína. Por tanto, una región promotora estaría unida operativamente a una secuencia codificante si la región promotora fuera capaz de efectuar la transcripción de esa secuencia de ADN de manera que el transcripto resultante pudiera traducirse en la proteína o polipéptido deseado.

Los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 de la presente invención pueden producirse mediante la expresión del ácido nucleico codificante en células huésped. El ácido nucleico puede transformarse o transfectarse en células huésped. Por consiguiente, algunos aspectos de la presente invención incluyen la transformación y/o transfección del ácido nucleico que codifica los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. La transformación es la introducción de ácido nucleico exógeno o heterólogo al interior de una célula procariota. La transfección es la introducción de un ácido nucleico transfectante que puede o no integrarse (enlazarse covalentemente) en el ADN cromosómico que forma el genoma de la célula. En procariotas, por ejemplo, el ácido nucleico transformante puede mantenerse en un elemento episomal como un plásmido o un vector viral. Con respecto a las células eucariotas, una célula transfectada de forma estable es aquella en la que el ácido nucleico transfectante se ha integrado en un cromosoma de modo que las células hijas lo heredan a través de la replicación cromosómica. Esta estabilidad se demuestra por la capacidad de la célula eucariota para establecer líneas celulares o clones compuestos por una población de células hijas que contienen el ácido nucleico transfectado.

Pueden usarse cultivos de células eucariotas superiores para expresar las proteínas de la presente invención, ya sea a partir de células de vertebrados o invertebrados, que incluyen insectos, y se conocen los procedimientos de propagación de estos (véase, por ejemplo, Kruse y otros (1973) Tissue Culture, Academic Press).

También se proporcionan células huésped y vectores para replicar los ácidos nucleicos y para expresar los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 codificados. Puede usarse cualquier vector o célula huésped, ya sea procariota o eucariota. Se conocen en la técnica muchos vectores y células huésped para tales fines. Está dentro de los conocimientos de la técnica seleccionar un conjunto apropiado para la aplicación deseada.

Las secuencias de ADN que codifican la toxina A y la toxina B, o porciones de estas, pueden clonarse a partir de una variedad de bibliotecas genómicas o de ADNc derivadas de C. difficile y otros procariotas que expresan la toxina A y la toxina B conocidos en la técnica. Las técnicas para aislar tales secuencias de ADN mediante el uso de métodos basados en sondas son técnicas convencionales y son bien conocidas por los expertos en la técnica. Las sondas para aislar tales secuencias de ADN pueden basarse en secuencias de proteínas o ADN publicadas. Alternativamente, puede usarse el método de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) descrito por Mullis y otros (Patente de Estados Unidos núm. 4,683,195) y Mullis (Patente de Estados Unidos núm. 4,683,202). La elección de la biblioteca y la selección de sondas para el aislamiento de tales secuencias de ADN están dentro del nivel de los expertos en la técnica.

Las células huésped adecuadas pueden derivarse de procariotas o eucariotas. Los huéspedes procariotas adecuados incluyen: Pseudomonas como P. aeruginosa, Escherichia coli, Staphylococcus como S. aureus y S. epidermidis, Serratia marcescens, Bacillus como B. subtillis y B. megaterium, Clostridium sporogenes, Enterococcus faecalis, Micrococcus como M. luteus y M. roseus y Proteus vulgaris. Las células huésped adecuadas para expresar los polipéptidos de la presente invención en eucariotas superiores incluyen: levaduras tales como Saccharomyces (por ejemplo, S. cerevisiae); 293 (riñón embrionario humano) (ATCC CRL-1573); 293F (Invitrogen, Carlsbad CA); 293T y la variante 293T/17 (293tsA1609neo y la variante ATCC CRL-11268) (riñón embrionario humano transformado por el antígeno T de SV40); COS-7 (línea CVI de riñón de mono transformada por SV40) (ATCC CRL1651); BHK (células de riñón de cría de hámster) (ATCC CRL10); CHO (células de ovario de hámster chino); células de Sertoli de ratón; CVI (células de riñón de mono) (ATCC CCL70); VERO76 (células de riñón de mono verde africano) (ATCC CRL1587); HeLa (células de carcinoma de cuello uterino humano) (ATCC CCL2); MDCK (células renales caninas) (ATCC CCL34); BRL3A (células de hígado de rata búfalo) (ATCC CRL1442); W138 (células de pulmón humano) (ATCC CCL75); HepG2 (células hepáticas humanas) (HB8065); y MMT 060652 (tumor mamario de ratón) (ATCC CCL51).

En otras modalidades, la presente invención proporciona ácidos nucleicos que codifican un polipéptido aislado que comprende los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 y polipéptidos adicionales. Los vectores útiles para construir sistemas de expresión eucariotas para la producción de polipéptidos de fusión comprenden ácido nucleico que codifica el polipéptido aislado unido operativamente a una secuencia de activación transcripcional apropiada, tal como un promotor y/o un operador. Otras características típicas pueden incluir sitios de unión a ribosomas, codones de terminación, potenciadores, terminadores o elementos replicón apropiados. Estas características adicionales pueden insertarse en el vector en el sitio o sitios apropiados mediante técnicas de empalme convencionales tales como digestión y ligación con endonucleasas de restricción.

En algunas modalidades, pueden fusionarse ácidos nucleicos adicionales al ácido nucleico que codifica los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. El ácido nucleico fusionado puede codificar polipéptidos que pueden ayudar en la purificación y/o inmunogenicidad y/o estabilidad sin cambiar el marco de lectura de codones del polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. Los ácidos nucleicos fusionados pueden codificar una secuencia secretora, que puede o no escindirse a partir de los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. Los ácidos nucleicos fusionados pueden no alargar significativamente el polipéptido expresado. Los ácidos nucleicos fusionados pueden codificar menos de sesenta aminoácidos adicionales para los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. En algunas modalidades, los ácidos nucleicos fusionados siguen al ácido nucleico que codifica los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. En otras modalidades, los ácidos nucleicos fusionados preceden al ácido nucleico que codifica los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. En otras modalidades, los ácidos nucleicos fusionados flanquean el ácido nucleico que codifica los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1.

En algunas modalidades, los ácidos nucleicos fusionados pueden codificar un polipéptido para ayudar a la purificación de los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. En algunas modalidades, el ácido nucleico fusionado codificará un epítopo y/o una etiqueta de afinidad. Los ejemplos de polipéptidos que ayudan a la purificación incluyen, pero no se limitan a, una etiqueta His, una etiqueta myc, una etiqueta de péptido S, una etiqueta MBP, una etiqueta GST, una etiqueta FLAG, una etiqueta tiorredoxina, una etiqueta GFP, una BCCP, una etiqueta de calmodulina, una etiqueta de Strep, una etiqueta de epítopo de HSV, una etiqueta de epítopo V5 y una etiqueta de CBP. En otras modalidades, el ácido nucleico fusionado puede codificar un polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 que tiene un sitio dirigido, o propenso a, la escisión. En una modalidad, el ácido nucleico fusionado puede codificar polipéptidos que comprenden sitios de escisión enzimática. En modalidades adicionales, la escisión enzimática puede ayudar a aislar los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1, así como también otros segmentos polipeptídicos fusionados, a partir de aún otros polipéptidos. A modo de ejemplo, un ácido nucleico intermediario que codifica un sitio de escisión enzimática situado entre los ácidos nucleicos que codifican los polipéptido aislados C-TAB. G5 o C-TAB.G5.1 y un epítopo pueden permitir la separación posterior de los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 expresados y el epítopo. Dichos sitios también pueden estar presentes entre la porción de la toxina A y la porción de la toxina B.

La presente invención también proporciona sistemas de expresión diseñados para ayudar a expresar y proporcionar los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. El sistema de expresión puede comprender una célula huésped transformada o transfectada con un ácido nucleico que codifica el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. La célula huésped puede ser un procariota. El procariota puede ser E. coli. La célula huésped puede ser una célula eucariota.

El sistema de expresión puede comprender además agentes para ayudar en la selección de células huésped transformadas o transfectadas con éxito con un ácido nucleico que codifica los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. Por ejemplo, el ácido nucleico que codifica el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 puede expresar además un gen que ayude a la célula huésped en la resistencia a antibióticos, como genes que ofrezcan resistencia a kanamicina o gentamicina o ampicilina o penicilina. Tales genes resistentes permitirán la selección de células huésped que hayan incorporado adecuadamente el ácido nucleico que codifica el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB. G5.1, como conocen los expertos en la técnica.

Otro aspecto descrito en la presente se dirige a la generación de anticuerpos. Los ejemplos de anticuerpos descritos en la presente, incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos producidos tras inmunizar un sujeto con el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. Los anticuerpos generados mediante inmunización con el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 pueden unirse específicamente a la toxina A o la toxina B, o pueden reaccionar de forma cruzada con el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. Los anticuerpos producidos por el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 de la presente invención pueden caracterizarse mediante el uso de métodos bien conocidos en la técnica.

Los anticuerpos producidos mediante el uso del polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB. G5.1 de la presente invención puede abarcar anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc, etc.), anticuerpos quiméricos, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos de cadena pesada solamente, anticuerpos monocatenarios (ScFv) heteroconjugados, anticuerpos de dominio único, variantes de estos, polipéptidos aislados que comprenden una porción de anticuerpo, anticuerpos humanizados y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprenda un sitio de reconocimiento antigénico de la especificidad requerida, que incluye variantes de glicosilación de anticuerpos, variantes de secuencias de aminoácidos de anticuerpos y anticuerpos modificados covalentemente. Los anticuerpos preferidos son de origen murino, rata, humano, conejo, canino, porcino, dromedario, camello, llama, felino, primate o cualquier otro origen (que incluye anticuerpos humanizados, quiméricos y/o fragmentos).

En otras modalidades, los anticuerpos producidos mediante inmunización con el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB. G5.1 se humaniza luego mediante métodos conocidos en la técnica. Un anticuerpo humanizado es una molécula de inmunoglobulina que contiene una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En aún otras modalidades, los anticuerpos completamente humanos se obtienen mediante el uso de ratones disponibles comercialmente que han sido modificados por ingeniería genética para expresar proteínas de inmunoglobulina humana específicas. En otras modalidades, los anticuerpos son quiméricos. Un anticuerpo quimérico es un anticuerpo que combina características de dos anticuerpos diferentes. Se conocen en la técnica métodos para preparar anticuerpos quiméricos.

En otras modalidades, la secuencia de nucleótidos que codifica los anticuerpos se obtiene y se clona después en un vector para expresión o propagación. En otra modalidad, los anticuerpos se preparan de forma recombinante y se expresan mediante el uso de métodos conocidos en la técnica. A modo de ejemplo, el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 puede usarse como antígeno con el fin de aislar anticuerpos recombinantes mediante estas técnicas. Los anticuerpos pueden prepararse de forma recombinante mediante el uso de la secuencia del gen para expresar el anticuerpo de forma recombinante en las células huésped. Se conocen en la técnica métodos para preparar variantes de anticuerpos y anticuerpos recombinantes.

En otras modalidades, los anticuerpos se unen a un portador mediante métodos convencionales en la técnica, para su uso, por ejemplo, en el aislamiento o purificación de la toxina A o la toxina B nativa o la detección de la toxina A o la toxina B nativa o C. difficile en una muestra o espécimen biológico.

Composiciones y formulaciones

La presente invención también proporciona composiciones que comprenden los polipéptidos aislados C-TAB. G5 o C-TAB.G5.1. Las composiciones pueden ser composiciones farmacéuticas que comprenden el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 y un portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones usadas en los métodos descritos en la presente comprenden generalmente, a modo de ejemplo y no de limitación, una cantidad eficaz del polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 (por ejemplo, una cantidad suficiente para inducir una respuesta inmunitaria) de la invención o un anticuerpo contra los polipéptidos aislados C-TAB. G5 o C-TAB.G5.1 (por ejemplo, una cantidad de un anticuerpo neutralizante suficiente para mitigar la infección, aliviar un síntoma de infección y/o evitar la infección). La composición farmacéutica puede comprender además portadores, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables conocidos en la técnica (véase generalmente Remington, (2005) The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams y Wilkins).

El polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 de la invención puede usarse para métodos para inmunizar o tratar seres humanos y/o animales con la CDAD. Por tanto, los polipéptidos aislados C-TAB. G5 o C-TAB.G5.1 pueden usarse dentro de una composición farmacéutica. La composición farmacéutica de la presente invención puede incluir además portadores y/o excipientes farmacéuticamente aceptables. Los portadores y/o excipientes farmacéuticamente aceptables útiles en esta invención son convencionales y pueden incluir tampones, estabilizadores, diluyentes, conservantes y solubilizantes. Remington's Pharmaceutical Sciences, de E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15a edición (1975), describe composiciones y formulaciones adecuadas para el suministro farmacéutico de los polipéptidos descritos en la presente. En general, la naturaleza de los portadores o excipientes dependerá del modo particular de administración que se emplee. Por ejemplo, las formulaciones parenterales comprenden habitualmente fluidos inyectables que incluyen fluidos farmacéutica y fisiológicamente aceptables tales como agua, solución salina fisiológica, soluciones salinas equilibradas, dextrosa acuosa, glicerol o similares como vehículo. Para composiciones sólidas (por ejemplo, en forma de polvo, píldora, comprimido o cápsula), los portadores sólidos no tóxicos convencionales pueden incluir, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón o estearato de magnesio. Además de los portadores biológicamente neutros, las composiciones farmacéuticas que se van a administrar pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas, tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes y agentes tamponantes del pH y similares, por ejemplo, acetato de sodio o monolaurato de sorbitán.

En una modalidad, la composición farmacéutica puede comprender además una sustancia inmunoestimuladora, como un adyuvante. El adyuvante puede seleccionarse sobre la base del método de administración y puede incluir adyuvantes basados en aceite mineral tales como adyuvante completo e incompleto de Freund, adyuvante Seppic incompleto de Montanide como ISA, adyuvantes de emulsión de aceite en agua como el sistema adyuvante Ribi, formulación de adyuvante Syntax que contiene dipéptido de muramilo, hidróxido de aluminio o adyuvante de sal de aluminio (aluminio), polímero policatiónico, especialmente péptido policatiónico, especialmente poliarginina o un péptido que contiene al menos dos motivos LysLeuLys, especialmente KLKLLLLLKLK, oligodesoxinucleótido inmunoestimulador (ODN) que contiene dinucleótidos de citosina-guanina no metilados (CpG) en un contexto de base definido (por ejemplo, como se describe en el documento WO 96/02555) u ODN basados en inosina y citidina (por ejemplo, como se describe en el documento WO 01/93903), o ácido desoxinucleico que contiene residuos de desoxiinosina y/o desoxiuridina (como se describe en los documentos WO 01/93905 y WO 02/095027), especialmente Oligo (dIdC)13 (como se describe en los documentos WO 01/93903 y WO 01/93905), componente neuroactivo, especialmente hormona del crecimiento humana (descrita en WO 01/24822), o combinaciones de estas. Tales combinaciones son de acuerdo con las descritas, por ejemplo, en los documentos WO 01/93905, WO 02/32451, WO 01/54720, WO 01/93903, WO 02/13857, WO 02/095027 y WO 03/047602. Preferentemente, el adyuvante es un adyuvante de hidróxido de aluminio.

Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones que se administran. Los portadores, excipientes o estabilizadores pueden comprender además tampones. Los ejemplos de excipientes incluyen, pero no se limitan a, carbohidratos (como monosacárido y disacárido), azúcares (como sacarosa, manitol y sorbitol), fosfato, citrato, antioxidantes (como ácido ascórbico y metionina), conservantes (como fenol, butanol, benzanol; alquil parabenos, catecol, cloruro de octadecil dimetilbencil amonio, cloruro de hexametoniuni, resorcinol, ciclohexanol, 3-pentanol, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio y m-cresol), polipéptidos de bajo peso molecular, proteínas (tales como albúmina sérica o inmunoglobulinas), polímeros hidrófilos, aminoácidos, agentes quelantes (como EDTA), contraiones formadores de sales, complejos metálicos (como complejos Zn-proteína) y tensioactivos no iónicos (como TWEEN™ y polietilenglicol).

La composición farmacéutica de la presente invención puede comprender además agentes adicionales que sirvan para mejorar y/o complementar el efecto deseado. A modo de ejemplo, para mejorar la inmunogenicidad del polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 de la invención que se administra como una vacuna de subunidad, la composición farmacéutica puede comprender además un adyuvante.

Un ejemplo de composición farmacéutica puede ser una composición inmunogénica. La presente invención proporciona composiciones inmunogénicas que comprenden los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. La composición inmunogénica puede incluir además un portador u otros portadores y/o excipientes farmacéuticamente aceptables en una formulación adecuada para inyección en un mamífero. Una composición inmunogénica es cualquier composición de material que provoca una respuesta inmunitaria en un huésped mamífero cuando la composición inmunogénica se inyecta o se introduce de otro modo. La respuesta inmunitaria puede ser humoral, celular o ambas. Un efecto de refuerzo se refiere a un aumento de la respuesta inmunitaria a una composición inmunogénica tras la exposición posterior del huésped mamífero a la misma composición inmunogénica. Una respuesta humoral da como resultado la producción de anticuerpos por el huésped mamífero tras la exposición a la composición inmunogénica.

Las composiciones inmunogénicas de la presente invención provocan una respuesta inmunitaria en un huésped mamífero, que incluye los seres humanos y otros animales. La respuesta inmunitaria puede ser una respuesta dependiente de células o una respuesta dependiente de anticuerpos o ambas; y además, la respuesta puede proporcionar memoria inmunitaria o un efecto de refuerzo o ambos en el huésped mamífero. Estas composiciones inmunogénicas son útiles como vacunas y pueden proporcionar una respuesta protectora por parte del sujeto o huésped mamífero frente a la infección por cepas de C. diffiále.

En la presente se describen métodos para producir una composición inmunogénica mediante la construcción del ácido nucleico que codifica el polipéptido aislado C-TAB. G5 o C-TAB. G5.1 y expresar el componente polipeptídico aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 en un huésped microbiano; lo que recupera el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB. G5.1 a partir de un cultivo del huésped; conjugar el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 con un segundo componente proteico, y recuperar la proteína conjugada y el componente polisacárido. El ácido nucleico que codifica el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB. G5.1 puede mantenerse durante todo el crecimiento del huésped mediante una presión selectiva constante y estable. El mantenimiento del vector de expresión puede conferirse mediante la incorporación en el vector de expresión de una secuencia genética que codifica un genotipo selectivo, cuya expresión en la célula huésped microbiana da como resultado un fenotipo selectivo. Una secuencia de genotipo selectiva también puede incluir un gen que complementa una mutación letal condicional. Pueden incorporarse otras secuencias genéticas en el vector de expresión, como otros genes de resistencia a fármacos o genes que complementan mutaciones letales. Los huéspedes microbianos pueden incluir: bacterias Gram positivas; bacterias Gram negativas, como E. coli; levaduras hongos filamentosos; células de mamíferos; células de insectos; o células vegetales.

Los métodos descritos en la presente también proporcionan un nivel de expresión del polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 en el huésped a un nivel superior a aproximadamente 50 mg/litro de cultivo, un nivel superior a aproximadamente 100 mg/litro, un nivel superior a aproximadamente 500 mg/litro o un nivel superior a aproximadamente 1 g/litro. Esta invención también proporciona que la proteína puede recuperarse mediante varios métodos conocidos por los expertos en la técnica para el aislamiento y recuperación de proteínas, tales como precipitación con sulfato de amonio seguida de cromatografía de intercambio iónico.

En la presente se describen métodos para preparar la composición inmunogénica que proporciona que el componente proteico se conjugue con un segundo componente proteico mediante uno de varios medios conocidos por los expertos en la técnica, tal como una reacción de amidización.

La presente invención también proporciona formulaciones que comprenden el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 para tratar y evitar la CDAD. En una modalidad, la formulación puede incluir el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB. G5.1 de la presente invención, un adyuvante y un portador farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, la formulación incluye el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB. G5.1 de la presente invención, o consiste esencialmente en uno o más polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 de la presente invención. La formulación puede comprender el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 de la presente invención y un adyuvante. La formulación puede incluir además un antígeno o un fármaco adicional. Además, la formulación puede incluir uno o más fármacos y, además del polipéptido aislado y/o el adyuvante, puede incluir uno o más fármacos. La formulación que comprende el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 puede estar en forma líquida o seca. Una formulación seca puede almacenarse y transportarse fácilmente. Las formulaciones secas rompen la cadena de frío requerida desde el lugar de fabricación de la vacuna hasta el lugar donde se realiza la vacunación. Alternativamente, el ingrediente activo, seco, de la formulación per se puede ser una mejora tras proporcionar una forma sólida en partículas que es absorbida y procesada por las células presentadoras de antígeno. Estos posibles mecanismos se discuten no para limitar el alcance de la invención o sus equivalentes, sino para proporcionar información sobre el funcionamiento de la invención y para guiar el uso de esta formulación en inmunización y vacunación.

Las formulaciones secas del polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 pueden proporcionarse en diversas formas: por ejemplo, polvos finos o granulados, polvo liofilizado, películas uniformes, píldoras y comprimidos. Puede secarse al aire, secarse a temperatura elevada, liofilizarse, congelarse o secarse por pulverización, recubrirse o pulverizarse sobre un sustrato sólido y después secarse, espolvorearse sobre un sustrato sólido, congelarse rápidamente y después secarse lentamente al vacío, o combinaciones de estos. Si diferentes moléculas son ingredientes activos de la formulación, pueden mezclarse en solución y después secarse, o mezclarse solo en forma seca.

Las formulaciones que comprenden el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 en forma líquida o sólida, tal como una forma seca, pueden aplicarse con uno o más adyuvantes en el mismo sitio o en sitios separados o simultáneamente o en aplicaciones repetidas, frecuentes. La formulación puede incluir otros antígenos de manera que la administración de la formulación induzca una respuesta inmunitaria a múltiples antígenos. En tal caso, los otros antígenos pueden tener diferentes estructuras químicas para inducir una respuesta inmunitaria específica para diferentes antígenos. Al menos un antígeno y/o un adyuvante pueden mantenerse en forma seca antes de la administración. La posterior liberación de líquido a partir de un depósito o la entrada de líquido en un depósito que contiene el ingrediente seco de la formulación disolverá al menos parcialmente ese ingrediente.

También pueden incorporarse en la formulación sólidos (por ejemplo, partículas de dimensiones nanométricas o micrométricas). Las formas sólidas (por ejemplo, nanopartículas o micropartículas) pueden ayudar en la dispersión o solubilización de los ingredientes activos; proporcionar un punto de unión para el adyuvante, el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1, o ambos, a un sustrato que las células presentadoras de antígeno pueden opsonizar, o combinaciones de estos. La liberación prolongada de la formulación a partir de un sólido poroso formado como una hoja, varilla o perla actúa como depósito.

Al menos un ingrediente o componente de la formulación (es decir, el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB. G5.1, el adyuvante o el fármaco) puede proporcionarse en forma seca antes de la administración de la formulación. Esta formulación también puede usarse junto con técnicas convencionales de inmunización enteral, mucosa o parenteral. La formulación que comprende el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 puede fabricarse en condiciones asépticas aceptables para las agencias reguladoras apropiadas (por ejemplo, Food and Drug Administration, EMEA para productos biológicos y vacunas. Opcionalmente, pueden incluirse en la formulación componentes tales como desecantes, excipientes, estabilizadores, humectantes, conservantes o combinaciones de estos, incluso aunque sean inmunitariamente inactivos. Sin embargo, pueden tener otras propiedades o características deseables.

Los procesos para fabricar una formulación farmacéutica se conocen bien. Los componentes de la formulación pueden combinarse con un portador o vehículo farmacéuticamente aceptable, así como también con cualquier combinación de aditivos opcionales (por ejemplo, diluyentes, aglutinantes, excipientes, estabilizadores, desecantes, conservantes, colorantes). El uso de portadores sólidos y la adición de excipientes para ayudar en la solubilización de componentes secos o estabilizadores de actividad inmunogénica o adyuvante, son modalidades preferidas. Véase, en general, Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6a Ed. (edición electrónica, 2003); Remington's Pharmaceutical Sciences, 22a (Gennaro, 2005, Mack Publishing); Pharmaceutical Dosage Forms, 2a ed. (varios editores, 1989-1998, Marcel Dekker); y Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (Ansel y otros, 2005, Williams & Wilkins).

Las buenas prácticas de fabricación se conocen bien en la industria farmacéutica y están reguladas por agencias gubernamentales (por ejemplo, Food and Drug Administration, EMEA). Pueden prepararse formulaciones líquidas estériles tras disolver un componente pretendido de la formulación en una cantidad suficiente de un disolvente apropiado, seguido de esterilización por filtración para eliminar los microbios contaminantes. Generalmente, las dispersiones se preparan mediante la incorporación de los diversos componentes esterilizados de la formulación en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico. Para la producción de formas sólidas que deben ser estériles, puede usarse secado al vacío o secado por congelación.

En general, las formas de dosificación sólidas (por ejemplo, polvos, gránulos, píldoras, comprimidos) pueden prepararse a partir de al menos un ingrediente activo o componente de la formulación.

Se conocen procedimientos de formación de comprimidos adecuados. La formulación también puede producirse mediante la encapsulación de formas sólidas de al menos un ingrediente activo, o tras mantenerlos separados de los líquidos en compartimentos o cámaras. El tamaño de cada dosis y el intervalo de dosificación al sujeto pueden usarse para determinar un tamaño y forma adecuados del comprimido, cápsula, compartimento o cámara.

Las formulaciones contendrán una cantidad eficaz de los ingredientes activos (por ejemplo, el fármaco, el antígeno y el adyuvante) junto con el portador o cantidades adecuadas de vehículo para proporcionar composiciones farmacéuticamente aceptables adecuadas para la administración a un ser humano o un animal.

Las cantidades relativas de ingredientes activos, tales como las cantidades del polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1, dentro de una dosis y el programa de dosificación pueden ajustarse apropiadamente para una administración eficaz a un sujeto (por ejemplo, un animal o un ser humano). Este ajuste también puede depender de la enfermedad o afección particular del sujeto y de si se pretende tratamiento o profilaxis. Para simplificar la administración de la formulación al sujeto, cada dosis unitaria contiene los ingredientes activos en cantidades predeterminadas para una única ronda de inmunización.

Existen numerosas causas de inestabilidad o degradación de polipéptidos, que incluyen la hidrólisis y la desnaturalización. En el caso de la desnaturalización, la conformación o estructura tridimensional de la proteína se altera y la proteína se despliega a partir de su estructura globular habitual. En lugar de replegarse a su conformación natural, la interacción hidrófoba puede provocar el agrupamiento de moléculas (es decir, la agregación) o el replegamiento a una conformación no natural. Cualquiera de estos resultados puede implicar una disminución o pérdida de la actividad inmunogénica o adyuvante. Pueden añadirse estabilizadores para disminuir o evitar tales problemas.

La formulación, o cualquier intermedio en su producción, puede tratarse previamente con agentes protectores (es decir, crioprotectores y estabilizadores secos) y después someterse a velocidades de enfriamiento y temperaturas finales que minimicen la formación de cristales de hielo. Mediante la selección adecuada de agentes crioprotectores y el uso de parámetros de secado preseleccionados, casi cualquier formulación podría crioprepararse para un uso final deseado adecuado.

Debe entenderse en la siguiente discusión que los aditivos opcionales como excipientes, estabilizadores, desecantes y conservantes se describen por su función. Por tanto, un producto químico particular puede actuar como una combinación de receptor, estabilizador, desecante y/o conservante. Dicho producto químico sería inmunitariamente inactivo porque no induce directamente una respuesta inmunitaria, sino que aumenta la respuesta tras mejorar la actividad inmunitaria del antígeno o el adyuvante: por ejemplo, tras reducir la modificación del antígeno o el adyuvante, o la desnaturalización durante el secado y ciclos de disolución.

Los estabilizadores incluyen ciclodextrina y variantes de esta (véase la Patente de Estados Unidos núm. 5,730,969). También pueden añadirse conservantes adecuados como sacarosa, manitol, sorbitol, trehalosa, dextrano y glicerina para estabilizar la formulación final (Howell y Miller, 1983). Puede añadirse a la formulación un estabilizador seleccionado a partir de tensioactivos no iónicos, D-glucosa, D-galactosa, D-xilosa, ácido D-glucurónico, sales de ácido D-glucurónico, trehalosa, dextranos, hidroxietil almidones y mezclas de estos. La adición de una sal de metal alcalino o cloruro de magnesio puede estabilizar el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1, lo que incluye opcionalmente albúmina de suero y liofilización para mejorar aún más la estabilidad. El polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 también puede estabilizarse tras ponerlo en contacto con un sacárido seleccionado a partir del grupo que consiste en dextrano, ácido condroitín sulfúrico, almidón, glucógeno, insulina, dextrina y sal de ácido algínico. Otros azúcares que pueden añadirse incluyen monosacáridos, disacáridos, alcoholes de azúcar y mezclas de estos (por ejemplo, glucosa, manosa, galactosa, fructosa, sacarosa, maltosa, lactosa, manitol, xilitol). Los polioles pueden estabilizar un polipéptido y son miscibles en agua o solubles en agua. Los polioles adecuados pueden ser polihidroxialcoholes, monosacáridos y disacáridos, que incluyen manitol, glicerol, etilenglicol, propilenglicol, trimetilglicol, vinilpirrolidona, glucosa, fructosa, arabinosa, manosa, maltosa, sacarosa y polímeros de estos. Varios excipientes pueden también estabilizar polipéptidos, que incluyen albúmina sérica, aminoácidos, heparina, ácidos grasos y fosfolípidos, tensioactivos, metales, polioles, agentes reductores, agentes quelantes de metales, polivinilpirrolidona, gelatina hidrolizada y sulfato de amonio.

Como ejemplo, la formulación del polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 puede estabilizarse en microesferas de sacarosa, trehalosa, poli(ácido láctico) (PLA) y poli (lactida-co-glicólido) (PLGA) mediante la elección adecuada de excipiente o estabilizador (Sánchez y otros, 1999). La sacarosa o la trehalosa puede usarse ventajosamente como aditivo porque es un sacárido no reductor y, por lo tanto, no causa reacciones de aminocarbonilo con sustancias que portan grupos amino tales como proteínas. La sacarosa o la trehalosa pueden combinarse con otros estabilizadores como los sacáridos.

Además, la formulación que comprende el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 puede incluir agentes terapéuticos, tales como, por ejemplo, anestésicos, analgésicos, antiinflamatorios, esteroides, antibióticos, antiartríticos, anorexígenos, antihistamínicos y antineoplásicos. Los ejemplos de tales agentes terapéuticos incluyen lidocaína y fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE). En otra modalidad, los agentes terapéuticos son antígenos y adyuvantes. En aún otra modalidad, la formulación que comprende un antígeno y/o un adyuvante puede aplicarse por separado pero junto con otros agentes terapéuticos, tales como, por ejemplo, anestésicos, analgésicos, antiinflamatorios, esteroides, antibióticos, antiartríticos, anoréxicos, antihistamínicos y antineoplásicos. En una modalidad preferida, los antibióticos son fidaxomicina, metronidazol o vancomicina.

La formulación que comprende el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 puede suministrarse a través de diversas vías de administración tales como, por ejemplo, por vía intramuscular.

Pueden añadirse polímeros a la formulación y pueden actuar como excipiente, estabilizador y/o conservante de un ingrediente activo, así como también reducir la concentración del ingrediente activo que satura una solución usada para disolver la forma seca del ingrediente activo. Tal reducción se produce porque el polímero reduce el volumen efectivo de la solución tras llenar el espacio "vacío". Por tanto, pueden conservarse cantidades de antígeno/adyuvante sin reducir la cantidad de solución saturada. Una consideración termodinámica importante es que un ingrediente activo en la solución saturada será "conducido" a regiones de menor concentración. En solución, los polímeros también pueden estabilizar y/o preservar la actividad antígeno/adyuvante de los ingredientes solubilizados de la formulación. Dichos polímeros incluyen polímeros y copolímeros de etileno o propilenglicol, vinilpirrolidona y O-ciclodextrina.

Se proporciona una dosis única o unitaria de la formulación que comprende el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 adecuado para la administración. La cantidad del adyuvante y/o el polipéptido aislado C-TAB. G5 o C-TAB.G5.1 en la dosis unitaria puede estar en cualquier lugar en un intervalo amplio de aproximadamente 0,001 |jg a aproximadamente 10 mg. Este intervalo puede ser de aproximadamente 0,1 jg a aproximadamente 1 mg; un intervalo más estrecho es de aproximadamente 5 jg a aproximadamente 500 jg. Otros intervalos adecuados están entre aproximadamente 20 jg y aproximadamente 200 jg, como por ejemplo, aproximadamente 20 jg, aproximadamente 75 jg o aproximadamente 200 jg. Una dosis preferida para un polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 es de aproximadamente 20 jg o 200 jg o menos. La relación entre el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 y el adyuvante puede ser de aproximadamente 1:1 o aproximadamente 1:1,25, pero también pueden usarse relaciones más altas (por ejemplo, aproximadamente 1:10 o menos), o también pueden usarse relaciones más bajas de polipéptido aislado de C-TAB a adyuvante (por ejemplo, aproximadamente 10:1 o más).

El polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 puede usarse como un antígeno y puede presentarse a células inmunitarias, y se induce una respuesta inmunitaria específica de antígeno. Esto puede ocurrir antes, durante o después de la infección por un patógeno, como C. diffícile. Sólo puede ser necesario el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1, pero ningún adyuvante adicional, si la inmunogenicidad de la formulación es suficiente para no requerir actividad adyuvante. La formulación puede incluir un antígeno adicional de manera que la aplicación de la formulación induzca una respuesta inmunitaria contra múltiples antígenos (es decir, multivalentes). Los linfocitos específicos de antígeno pueden participar en la respuesta inmunitaria y, en el caso de la participación de linfocitos B, los anticuerpos específicos de antígeno pueden ser parte de la respuesta inmunitaria. Las formulaciones descritas anteriormente pueden incluir desecantes, excipientes, humectantes, estabilizadores y conservantes conocidos en la técnica.

La formulación que comprende el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 de la presente invención puede usarse para tratar a un sujeto (por ejemplo, un ser humano o un animal que necesita tratamiento tales como prevención de enfermedades, protección contra efectos de infección, reducir o aliviar los síntomas de una enfermedad, como la CDAD, o combinaciones de estos). Por ejemplo, la formulación que comprende el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 de la presente invención puede usarse para tratar a un sujeto con riesgo de CDAD, como por ejemplo un sujeto con el siguiente perfil: i) un sujeto con un sistema inmunitario más débil como, por ejemplo, un sujeto anciano (por ejemplo, un sujeto mayor de 65 años) o un sujeto menor de 2 años; ii) un sujeto inmunodeprimido como, por ejemplo, un sujeto con SIDA; iii) un sujeto que toma o planea tomar fármacos inmunosupresores; iv) un sujeto con hospitalización planificada o un sujeto que se encuentra en el hospital; v) un sujeto que se encuentra o se espera que vaya a una unidad de cuidados intensivos (UCI); vi) un sujeto que está siendo sometido o planea someterse a una cirugía gastrointestinal; vii) un sujeto que está o planea ir a un centro de atención a largo plazo, como un hogar de ancianos; viii) un sujeto con comorbilidades que requieren el uso frecuente y/o prolongado de antibióticos; ix) un sujeto que es un sujeto con dos o más de los perfiles mencionados anteriormente, como por ejemplo, un sujeto anciano que planea someterse a una cirugía gastrointestinal; x) un sujeto con enfermedad inflamatoria intestinal; y/o xi) un sujeto con CDAD recurrente como, por ejemplo, un sujeto que ha experimentado uno o más episodios de CDAD.

El tratamiento puede vacunar al sujeto contra la infección por el patógeno o contra sus efectos patógenos tales como los provocados por la secreción de toxinas. La formulación puede usarse terapéuticamente para tratar una enfermedad existente, de manera protectora para evitar la enfermedad, para reducir la gravedad y/o duración de la enfermedad, para mejorar los síntomas de la enfermedad o combinaciones de estos.

Las formulaciones que comprenden los polipéptidos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 pueden suministrarse mediante diversas vías de administración que incluyen, pero no se limitan a las vías oral, subcutánea, intradérmica, intravenosa, intraarterial, intramuscular, intracardiaca, intraespinal, intratorácica, intraperitoneal, intraventricular y/o sublingual.

La formulación también puede comprender uno o más adyuvantes o combinaciones de adyuvantes. Habitualmente, el adyuvante y la formulación se mezclan antes de la presentación del antígeno pero, alternativamente, pueden presentarse por separado en un intervalo de tiempo corto.

Los adyuvantes incluyen, por ejemplo, una emulsión de aceite (por ejemplo, adyuvante de Freund completo o incompleto), adyuvante Seppic incompleto de Montanide como ISA, adyuvantes de emulsión de aceite en agua como el sistema de adyuvante Ribi, formulación de adyuvante Syntax que contiene dipéptido de muramilo, hidróxido de aluminio o sal adyuvante (aluminio), polímero policatiónico, péptido especialmente policatiónico, especialmente poliarginina o un péptido que contiene al menos dos motivos LysLeuLys, especialmente KLKLLLLLKLK, oligodesoxinucleótidos inmunoestimulantes (ODN) que contienen dinucleótidos de citosina-guanina no metilados (CpG) en un contexto de base definido (por ejemplo, como se describe en el documento WO 96/02555) u ODN basados en inosina y citidina (por ejemplo, como se describe en el documento WO 01/93903), o ácido desoxinucleico que contiene residuos de desoxiinosina y/o desoxiuridina (como se describe en los documentos WO 01/93905 y WO 02/095027), especialmente Oligo (dIdC)13 (como se describe en los documentos WO 01/93903 y WO 01/93905), un compuesto neuroactivo, especialmente la hormona de crecimiento humana (descrita en el documento WO 01/24822), o combinaciones de estos, una quimiocina (por ejemplo, defensinas 1 o 2, RANTES, MlPl-ct, MIP-2, interleucina-8, o una citoquina (por ejemplo, interleucina-1p, -2, -6, -10 o -12; interferón-Y; factor de necrosis tumoral-a; o factor estimulante de colonias de granulocitos-monocitos) (revisado en Nohria y Rubin, 1994), una variante de dipéptido de muramilo (por ejemplo, murabutida, treonil-MDP o tripéptido de muramilo), variantes sintéticas de MDP, una proteína de choque térmico o una variante, una variante de Leishmania major LelF (Skeiky y otros, 1995), variantes no tóxicas de exotoxinas bacterianas de ribosilación de ADP (bAREs), que incluye variantes en el sitio de escisión de tripsina (Dickenson y Clements, 1995) y/o que afectan a la ribosilación de ADP (Douce y otros, 1997), o bAREs (toxoides) químicamente detoxificados, QS21, Quill A, N-acetilmuramil-L-alanil-D-isogltitamil-L-alamina-2-[1,2-dipalmitoil-s-glicero-3-(hidroxifosforiloxi)]etilamida (MTP-PE) y composiciones que contienen un aceite metabolizable y un agente emulsionante, en donde el aceite y el agente emulsionante están presentes en forma de una emulsión de aceite en agua que tiene gotitas de aceite sustancialmente todas las cuales son de menos de una micra de diámetro (véase, por ejemplo, EP 0399843). Además, ver Richards y otros (1995) para otros adyuvantes útiles en inmunización.

Puede elegirse un adyuvante para inducir preferentemente anticuerpos o efectores celulares, isotipos de anticuerpos específicos (por ejemplo, IgM, IgD, IgA1, IgA2, IgA secretora, IgE, IgG1, IgG2, IgG3 y/o IgG4) o subconjuntos específicos de células T (por ejemplo, CTL, Th1, Th2 y/o T^dth) (véase, por ejemplo, Munoz y otros, 1990; Glenn y otros, 1995).

Se conoce que los dinucleótidos o motivos CpG no metilados activan las células B y los macrófagos (Stacey y otros, 1996). Pueden usarse otras formas de ADN como adyuvantes. Los ADN bacterianos se encuentran entre una clase de estructuras que tienen patrones que permiten al sistema inmunitario reconocer sus orígenes patógenos para estimular la respuesta inmunitaria innata que conduce a respuestas inmunitarias adaptativas (Medzhitov y Janeway, 1997, Curr. Opin. Immunol. 9(1): 4-9). Estas estructuras se denominan patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) e incluyen lipopolisacáridos, ácidos teicoicos, motivos CpG no metilados, ARN bicatenario y maninas. Los PAMP inducen señales endógenas que pueden mediar la respuesta inflamatoria, actuar como coestimuladores de la función de las células T y controlar la función efectora. La capacidad de los PAMP para inducir estas respuestas juega un papel en su potencial como adyuvantes y sus objetivos son las APC, como los macrófagos y las células dendríticas. Los PAMP también podrían usarse junto con otros adyuvantes para inducir diferentes moléculas coestimuladoras y controlar diferentes funciones efectoras para guiar la respuesta inmunitaria, por ejemplo, de una respuesta Th2 a una Th1.

En la presente descripción se describe el uso del polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 como agente de vacunación. Las vacunas o composiciones inmunogénicas de la presente invención pueden emplear una cantidad eficaz del antígeno. Se incluirá una cantidad de antígeno que provocará que el sujeto produzca una respuesta inmunitaria específica y suficiente para impartir protección al sujeto de la exposición posterior a C. difficile. El antígeno puede ser el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. En una modalidad, el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 se administra solo o en combinación con un adyuvante.

En la presente se describe el uso del polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 como vacuna de subunidad. Una vacuna de subunidad se refiere al uso de un fragmento de un patógeno como agente inoculante. Los expertos en la técnica conocerán que las vacunas de subunidades ofrecen un medio para generar anticuerpos contra una parte o región particular de un patógeno.

El programa de dosificación de administración y la eficacia de la vacuna pueden determinarse mediante métodos conocidos en la técnica. La cantidad de vacuna y el régimen de inmunización pueden depender del antígeno particular y el adyuvante empleado, el modo y frecuencia de administración y el efecto deseado (por ejemplo, protección y/o tratamiento). En general, la vacuna de la invención puede administrarse en cantidades que varían entre 1 |jg y 100 mg, tales como, por ejemplo, entre 60 |jg y 600 |jg. Una dosis única de la vacuna que comprende el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB. G5.1 puede estar en un intervalo de aproximadamente 1 jg a aproximadamente 1 jg, preferentemente de aproximadamente 5 jg a aproximadamente 500 jg, más preferentemente de aproximadamente 20 jg a aproximadamente 200 jg. La relación entre el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 y el adyuvante como el aluminio puede ser de aproximadamente 1:1, como por ejemplo 1:1,25, pero también pueden usarse relaciones superiores (por ejemplo, aproximadamente 1:10 o menos), o también pueden usarse relaciones más bajas

(por ejemplo, aproximadamente 10:1 o más). En una modalidad, en la vacuna que comprende el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1, el hidróxido de aluminio adyuvante se usará en un intervalo de aproximadamente 50 jig/ml a aproximadamente 200 jg/ml, preferentemente en la cantidad de aproximadamente 125 jg/ml de la formulación final.

La vacuna que comprende el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB. G5.1 puede administrarse por vía oral, intravenosa, subcutánea, intraarterial, intramuscular, intracardiaca, intraespinal, intratorácica, intraperitoneal, intraventricular y/o sublingual.

El régimen de inmunización puede determinarse mediante métodos conocidos en la técnica. La administración de la vacuna puede repetirse según lo considere necesario un experto en la técnica. Por ejemplo, una dosis de sensibilización puede ir seguida de 1, 2, 3 o más dosis de refuerzo a intervalos semanales, quincenales o mensuales. En una modalidad de la presente invención, la dosis de sensibilización va seguida de una o dos administraciones de refuerzo a intervalos de aproximadamente 7 a aproximadamente 14 días, como por ejemplo, 7 días y 21 días después de la primera sensibilización. En una modalidad preferida, la cantidad terapéuticamente eficaz de la vacuna se administra dos o tres veces a intervalos de 14 días /- 1,2 o 3 días (quincenalmente) a un sujeto. En una modalidad de la presente invención, la cantidad terapéuticamente eficaz de la vacuna se administra una vez.

Aún otro aspecto se dirige a la población que puede tratarse de acuerdo con la presente invención. En una modalidad, la población incluye individuos sanos que están en riesgo de exposición a C. difficile, especialmente, los individuos con hospitalización inminente o residencia en un centro de cuidados, así como personales en hospitales, hogares de ancianos y otros centros de cuidados. En otra modalidad, la población incluye pacientes previamente infectados que recayeron después de la interrupción del tratamiento con antibióticos, o pacientes para quienes el tratamiento con antibióticos no es eficaz.

En una modalidad más de la invención, la población incluye individuos que tienen al menos 18 años de edad o más. En una modalidad preferida, el sujeto humano tiene entre 18 y 65 años. En otra modalidad preferida, el sujeto humano son personas mayores de 65 años. Este último grupo de edad es la población más vulnerable que padece infecciones por C. difficile. En alguna modalidad más, el sujeto humano es menor de 18 años.

Métodos de uso del polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1

En la presente se describen métodos para usar el polipéptido aislado. Por ejemplo, el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 puede usarse para evitar o tratar enfermedades asociadas con C. difficile. A modo de ejemplo, la introducción de los polipéptidos aislados de la presente invención en el sistema inmunitario de un sujeto puede inducir una respuesta inmunitaria que incluye al sujeto que produce anticuerpos dirigidos contra el polipéptido aislado. Tales anticuerpos son útiles para reconocer a C. difficile.

En la presente se describen métodos para suministrar polipéptidos aislados a un sujeto que comprenden administrar el polipéptido aislado a un sujeto. El polipéptido aislado puede administrarse como líquido o como sólido. El polipéptido aislado puede incluir además un portador farmacéuticamente aceptable.

En la presente se describen métodos para identificar y aislar dominios variables de un anticuerpo que reconocen y se unen a la toxina A y/o toxina B que comprenden el uso del polipéptido aislado C TAB.G5 o C TAB.G5.1 para producir una respuesta inmunitaria, tras purificar y después caracterizar los anticuerpos producidos en respuesta al polipéptido aislado C-TAB. G5 o CTAB.G5. 1. Los epítopos identificados pueden ser útiles para clonar anticuerpos adicionales o fragmentos de estos.

Un aspecto de la presente descripción se dirige en parte al tratamiento, la prevención y la detección de C. difficile. En algunas modalidades, un sujeto, como un animal, recibe tratamiento y/o prevención y/o detección de C. difficile. En otras modalidades, el animal es un ser humano. Por ejemplo, los polipéptidos de la presente invención pueden usarse para generar anticuerpos contra C. difficile in vivo. A modo de ejemplo adicional, los polipéptidos de la presente invención pueden usarse para determinar si un sujeto produce anticuerpos contra C. difficile. En algunas modalidades, el polipéptido se usa para aislar anticuerpos. A modo de ejemplo, los polipéptidos pueden unirse a una matriz de afinidad.

A modo de ejemplo adicional, el ácido nucleico de la presente invención puede usarse para transformar y/transfectar células para producir de manera recombinante los polipéptidos y/o anticuerpos de la presente invención. Los ácidos nucleicos de la presente invención también pueden usarse, por ejemplo, para determinar si un sujeto está infectado con C. difficile. A modo de ejemplo, esto puede lograrse mediante el uso de métodos de hibridación radiomarcada. A modo de ejemplo adicional, los anticuerpos descritos en la presente pueden usarse para reconocer una infección por C. difficile. A modo de ejemplo, los anticuerpos pueden reconocer la toxina A nativa y/o la toxina B como antígeno. Los anticuerpos de la presente invención también pueden usarse para combatir una infección por C. difficile. A modo de ejemplo, los anticuerpos humanizados o los fragmentos de anticuerpos o los anticuerpos monoclonales pueden emplear la propia respuesta inmunitaria de un sujeto a una infección por C. difficile. A modo de ejemplo adicional, los anticuerpos descritos en la presente pueden acoplarse a una citocina o una toxina o una enzima o un marcador para ayudar a tratar y detectar una infección.

Aspectos adicionales de la presente descripción se relacionan con ensayos de diagnóstico. La presente descripción es útil con muchos ensayos conocidos en la técnica. Los expertos en la técnica reconocerán la amplia gama de usos basados en la investigación para los polipéptidos, ácidos nucleicos y anticuerpos descritos en la presente. Los polipéptidos, anticuerpos y ácidos nucleicos descritos en la presente pueden, por ejemplo, marcarse con, tales como, moléculas radiactivas, quimioluminiscentes, fluorescentes y/o colorantes. Los anticuerpos, ácidos nucleicos y polipéptidos descritos en la presente se prestan para usar ensayos, por ejemplo, ensayos de ADN (como transferencia Southern), ensayos de ARN (como transferencia Northern), ensayos de proteínas (como transferencia Western), ensayos de cromatografía (como gaseosa, líquida, HPLC, exclusión por tamaño), inmunoensayos (como ELISA) y ensayos estructurales (como cristalografía y espectroscopia de RMN). Los anticuerpos, polipéptidos y ácidos nucleicos descritos en la presente pueden usarse además como sondas. Los expertos en la técnica también conocen ensayos que amplifican las señales de una sonda.

Kits

En la presente se describen kits que comprenden a modo de ejemplo, y sin limitación, ácidos nucleicos que codifican el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-^tA^b.G5.1, el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 y/o anticuerpos contra el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1. Los kits pueden incluir uno o más recipientes e instrucciones de uso de acuerdo con cualquiera de los métodos descritos en la presente. El polipéptido y/o anticuerpos aislados C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 descritos en la presente pueden usarse en una variedad de ensayos que incluyen inmunoensayos para detectar C. difficile. En una modalidad, el polipéptido aislado C-TAB.G5 o C-TAB. G5.1 sirve para funcionar como un antígeno con el fin de detectar anticuerpos en muestras biológicas. Los recipientes pueden ser dosis unitarias, envases a granel (por ejemplo, envases multidosis) o dosis subunitarias. Los kits de esta descripción están en un envase adecuado. También se contemplan envases para su uso en combinación con un dispositivo específico, como un inhalador, un dispositivo de administración nasal o un dispositivo de infusión. Un kit puede tener un puerto de acceso estéril. El recipiente también puede tener un puerto de acceso estéril. Los kits pueden proporcionar opcionalmente componentes adicionales como tampones e información interpretativa.

Los kits pueden usarse para detectar la presencia de C. difficile o para detectar una enfermedad asociada con C. difficile, como la CDAD. Los kits pueden usarse para evitar o tratar enfermedades asociadas con C. difficile. Los kits de la presente invención también pueden usarse para aliviar los síntomas de una enfermedad asociada con C. difficile.

Sin descripción adicional, se cree que un experto en la técnica puede, mediante el uso de la descripción anterior y los siguientes ejemplos ilustrativos, realizar y usar la invención reivindicada. Por lo tanto, los siguientes ejemplos de trabajo señalan específicamente modalidades preferidas de la presente invención y no deben interpretarse como limitantes de ninguna manera el resto de la descripción.

Ejemplos

Ejemplo 1: Preparación de los polipéptidos aislados C-TAB.G5 y C-TAB.G5.1.

Este ejemplo describe la preparación de polipéptidos aislados que comprenden porciones de las toxinas A (CTA) y B (CTB) de C. difficile para la expresión en células de E. coli. El método descrito a continuación puede usarse para preparar varios polipéptidos aislados que comprenden CTA y CTB. Como ejemplo, se describe un polipéptido aislado que comprende una parte del dominio C-terminal de CTA y una porción del dominio C-terminal de CTB. Ejemplo 1.1: Clonación de las construcciones génicas C-TAB.G5 y C-TAB.G5.1.

La porción del gen CTA (número de acceso YP-001087137) que codifica los aminoácidos 2026 a 2710 del dominio C-terminal se amplificó mediante PCR a partir del ADN genómico de C. difficile cepa 630 (ATCC BAA-1382) mediante el uso de los siguientes cebadores:

directo: 5'- caccACTAGTatgaacttagtaactggatggc -3' (SEQ ID NO: 9) y

inverso: 5'- CTCGAGttagccatatatcccaggggc -3' (S^eQ ID NO: 10).

La amplificación con el cebador directo creó un sitio Spel y la amplificación con el cebador inverso creó un sitio Xhol. La porción del gen CTB (número de acceso: YP-00108735) que codifica los aminoácidos 1850 a 2366 del dominio C-terminal se amplificó mediante PCR mediante el uso de los siguientes cebadores:

directo: 5'- caccATGCATatgagtttagttaatagaaaacag-3' (SEQ ID NO: 11) e

inverso: 5'- ggcCTCGAGctattcactaatcactaattgagc -3' (SEQ ID NO: 12).

La amplificación con el cebador directo creó un sitio Nsil y la amplificación con el cebador inverso creó un sitio Xhol. Las reacciones de PCR se realizaron mediante el uso de PCR Super-Mix (Invitrogen). Las condiciones del ciclo fueron 95 °C durante 2 minutos, 95 °C durante 45 segundos, 55 °C durante 50 segundos, 68 °C durante 8 minutos (30 ciclos) y 72 °C durante 10 minutos. Los productos de la PCR se purificaron con el kit de extracción de genes Quick (Invitrogen) y se ligaron en el vector PCR 2.1 TOPO (Invitrogen). Las mezclas de ligación se usaron para transformar células de E. coli Mech-1 por choque térmico. Los transformantes se sembraron en placas de ImMedia Amp Blue (Invitrogen). Las colonias blancas se recogieron y cultivaron en tubos de 15 ml con 4 ml de medio LB que contenía 100 pg/ml de ampicilina. Los cultivos se incubaron durante la noche a 37 °C y los plásmidos se extrajeron con el kit Quick plasmid miniprep (Invitrogen).

El fragmento del gen CTA en el vector PCR 2.1 -TOPO/TA se digirió con Spel y Xhol, y el fragmento se clonó en un vector intermedio, también digerido con Spel y Xhol, mediante el uso de T4 ^dN^aLigase. A continuación, se insertó un enlazador que contenía tres sitios de restricción (BgLIl-Nsil-SacI) en el extremo 3 'del fragmento del gen CTA por PCR mediante el uso del siguiente conjunto de cebadores sintéticos:

directo: 5 '-AGATCTATGCATGAGCTCctcgagcccaaaacgaaaggctcagc -3' (SEQ ID NO: 13)

inverso: 5'- cggtccggggccatatatcccaggggcttttactcc -3' (SEQ ID NO: 14).

El fragmento del gen CTB en PCR 2.1-TOPO/TB se digirió con Nsil y Xhol, y el fragmento del gen CTB digerido se ligó al vector intermedio que contenía el gen CTA y el enlazador, que también se digirió con Nsil y Xhol. El gen CTB se insertó 3' en el enlazador lo que da la secuencia de construcción 5'-CTA-enlazador-CTB-3'. Esta construcción de fusión se denomina vector intermedio C-TAB.V1.

El gen C-TAB.G5 se amplificó mediante PCR a partir del vector intermedio C-TAB.V1 mediante el uso de los cebadores:

directo: 5'- caccCCATTGatggtaacaggagtatttaaagga (SEQ ID NO: 15)

inverso: 5' - CTCGAGctattcactaatcactaattgagctg (SEQ ID NO: 16).

Las reacciones de PCR se realizaron mediante el uso de PCR Super mix (Invitrogen). La condición del ciclo fue 95 °C durante 2 minutos, 95 °C durante 45 segundos, 55 °C durante 50 segundos, 68 °C durante 4 minutos (30 ciclos) y 72 °C durante 10 minutos. Los productos de la PCR se purificaron con el kit de extracción de genes Quick (Invitrogen) y se ligaron en el vector PCR2.1-TOPO (Invitrogen). Las mezclas de ligación se usaron para transformar células de E. coli Mech-1 por choque térmico. Los transformantes se sembraron en placas de ImMedia Amp Blue (Invitrogen). Las colonias blancas se recogieron y cultivaron en tubos de 15 ml con 4 ml de medio LB que contenía 100 pg/ml de ampicilina. Los cultivos se incubaron durante la noche a 37 °C y los plásmidos se extrajeron con el kit minipreparación de plásmidos Quick (Invitrogen). El gen de fusión C-TAB.G5 en el vector PCR 2.1-TOPOTA se digirió con la enzima de restricción Ncol y Xhol. Estos fragmentos de C-TAB se ligaron en el vector de expresión pET28 digerido con las mismas enzimas de restricción. Esta construcción resultante codifica el dominio C-terminal de la toxina A de los aminoácidos 2272 a 2710 fusionado al dominio C-terminal de la toxina B de los aminoácidos 1851 a 2366. La construcción pET28/C-TAB.G5 se transformó en E. coli BL21 (DE3) para la expresión. Se seleccionaron para el análisis cinco colonias que contenían el gen de fusión C-TAB.G5.

La secuencia codificante de C-TAB.G5.1 se obtuvo mediante optimización de codones para una expresión mejorada dentro de células huésped E. coli. El uso de codones se adaptó al sesgo de codones de genes de E. coli. Además, el contenido de GC se ajustó para prolongar la vida media del ARNm; se ha evitado una región con un contenido de GC muy alto (> 80 %) o muy bajo (<30 %). Por lo tanto, el gen optimizado permite tasas de expresión altas y estables en E. coli. El gen C-TAB.G5.1 de codón optimizado se sintetizó in situ y se subclonó en el vector de expresión pET-28b(+).

Secuenciación de ADN: las secuencias de ADN plasmídico se confirmaron mediante el uso de química de secuenciación del ciclo del terminador de colorante con colorantes de d-rodamina. Los datos de secuenciación se analizaron mediante el uso del programa Jellyfish.

Ejemplo 1.2: Expresión de las proteínas de fusión recombinantes C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 en E. coli.

La expresión de las construcciones génicas C-TAB.G5 y C-TAB.G5.1 puede realizarse mediante el uso de un procedimiento estándar para la expresión en E. coli.

Cribado de colonias para la expresión de la proteína de fusión C-TAB recombinante: Con el fin de cribado, las colonias se recogieron y cultivaron en tubos Falcon de 15 ml con 4 ml de medio LB con 50 pg/ml de kanamicina. Los tubos se cultivaron durante una noche a 37 °C con mezcla a 250 rpm. Después de la fase de crecimiento inicial, se transfirió 1 ml de cultivo de cada tubo a una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos y se indujo la expresión con isopropil-p-D-1-tiogalacto-puranosida (IPTG) 1 mM durante 3 h a 30 °C. Los sedimentos celulares se recogieron mediante centrifugación a 12 000 g durante 1 min en microcentrífuga. Se prepararon lisados de sedimentos celulares y la fracción soluble se analizó mediante SDS-PAGE y análisis de transferencia Western para determinar la expresión de la proteína de fusión C-TAB. Se seleccionaron clones positivos para una evaluación adicional.

Fermentación por lotes para la expresión de C-TAB.G5: los cultivos de semillas se cultivaron en cinco matraces de agitación de 500 ml, cada uno de los cuales contenía 150 ml de medio Super Broth complementado con 30 pg/ml de kanamicina. Los cultivos se hicieron crecer durante 12 h a 28 °C con agitación continua a 275 rpm hasta que la OD600 alcanzó 2 - 2,5. Los matraces de agitación se usaron para inocular un fermentador que contenía 10 l de Super Broth. El cultivo se desarrolló aproximadamente 4,5 h a 37 °C a OD600 = 3,5 - 4. Para la inducción de la expresión del producto, se añadió IPTG 0,1 mM y el crecimiento continuó durante 4 horas más a 25 °C. Después, las células se recogieron por centrifugación y la pasta celular se almacenó congelada a -70 °C. Una tasa de expresión específica de producto típica lograda mediante este proceso de fermentación fue de aproximadamente 200 mg/ml.

Fermentación por lotes alimentados para la preparación de C-TAB.G5.1: Se usó una alícuota de 500 pl de la reserva de glicerol de un banco de semillas (almacenado a -75 °C) para inocular 100 ml de medio de precultivo complementado con 30 pg/ml de kanamicina en un matraz de agitación de 1 l. El precultivo se incubó a 37 ° C con agitación constante a ~ 150 rpm durante aproximadamente 7 h hasta que alcanzó una OD600 = 1,0 - 2,0. Se usaron 25 ml de precultivo para inocular 7 l de medio de fermentación por lotes en un fermentador estándar de la industria de 15 l equipado con un sistema de control de proceso, capaz de realizar fermentaciones por lotes alimentados. Se llevó a cabo una fase de cultivo discontinuo de 7 l durante 12 h a 37 °C (OD600 = 12-15) hasta que se agotó la glucosa. La fase de alimentación de glucosa (producción de biomasa) se inició después mediante un modo de alimentación exponencial a una velocidad de crecimiento específica constante p = 0,25/h a 37 °C durante 6 h (OD600 = 40-50). Una hora antes de cambiar a una fase de alimentación constante e inducción con una concentración final de IPTG 1 mM (producción de producto), la temperatura se redujo a 30 °C para reducir el riesgo de formación de cuerpos de inclusión. La fase de expresión del producto continuó durante otras 5 h con alimentación constante a 30 °C (OD600 = ~ 100), lo que dio como resultado un tiempo total de proceso de fermentación de 23 h y un volumen de cultivo final de ~ 8,2 l. Se recogió una biomasa de células húmedas de aproximadamente 1,2 kg por centrifugación y se almacenó a < -70 °C. Una tasa de expresión específica de producto típica alcanzada por tal fermentación por lotes alimentados fue de hasta 1,3 g/l.

Ejemplo 1.3: Purificación de las proteínas de fusión C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 recombinantes.

Purificación de la muestra analítica C-TAB.G5: La pasta celular congelada se descongeló y se resuspendió en tampón de ácido cítrico/NaOH 10 mM a pH 5,6, y la suspensión celular se pasó dos veces a través de un homogeneizador (homogeneizador GEA Niro Soavi) a 550 bar. La suspensión se centrifugó dos veces: una a 13500 rpm durante 30 minutos y la segunda vez a 18000 rpm en una ultracentrífuga durante una hora. Los sobrenadantes se agruparon y el pH se ajustó a 5,6 con tampón de ácido cítrico 50 mM pH 3. Los lisados celulares clarificados se pasaron por una columna de flujo rápido SP con tampón de ácido cítrico/NaOH 10 mM a pH 5,6. Las proteínas se eluyeron con un gradiente de revestimiento de cloruro de sodio que aumentaba de 0 a 500 mM en NaPi 20 mM. Se agruparon las fracciones que contenían C-TAB.G5. La conductividad se ajustó hasta 5 mS/cm con H2O destilada. Se añadió Tris hasta una concentración final de 25 mM. Las fracciones agrupadas se pasaron por una columna de flujo rápido DEAE. La proteína se eluyó con un gradiente lineal de cloruro de sodio que se incrementó de 50 a 500 mM en Tris 25 mM. De nuevo, se agruparon las fracciones que contenían C-TAB.G5 y se añadió citrato de sodio 1,5 M, pH 7,5 hasta una concentración final de 0,4 M. El conjunto de C-TAB V1 se cargó en una columna de fenol Sepharose HP equilibrada con Tris 25 mM, Citrato de sodio 0,4 M a pH 7,5. La proteína de fusión C-TAB.G5 se eluyó con una concentración de sal reductora en un gradiente de revestimiento mediante el uso de Tris 5 mM, pH 7,5. Todas las columnas se controlaron mediante un sistema de cromatografía AKTA Prime. La proteína de fusión C-TAB purificada se cambió de tampón a PBS mediante el uso de una membrana de 50 K.

Purificación de la preparación a granel de C-TAB.G5.1: La biomasa se almacenó a -80 °C hasta su procesamiento.

Se diluyen 450 g de pasta celular congelada (equivalente a 2,90 l de fermentador) con 4 volúmenes de tampón de lisis (Hepes 20 mM, pH 7,5, ~ 0,6 mS/cm) (por ejemplo, 450 g de pasta 1800 ml de tampón) y se descongelan de esta manera para ~ 1 h ± 0,5 h bajo agitación mecánica. Opcionalmente, los grumos restantes pueden resuspenderse mediante el uso de un Ultraturrax (por ejemplo, 5 min a 8000 rpm). La lisis celular se realiza en un homogeneizador alto Niro Soavi Panda (640 ± 25 bar, 3 ciclos). El lisado se enfría a < 10 °C mediante el uso de un intercambiador de calor y se mantiene a esta temperatura hasta la centrifugación. El lisado celular crudo se somete a una etapa de centrifugación discontinua (Beckmann Avanti JLA 60.25) operada a 14 000 rpm (30 000 g) a 4 °C durante 30 min. Los sobrenadantes se recogen y agrupan. La parte semilíquida del sedimento también se descarta para disminuir el riesgo de obstruir la etapa de filtración. Después, los sobrenadantes agrupados se filtran a través de una cápsula de filtro de profundidad Supercap PDH4 de 100/5 pulgadas (Pall) (área de filtración efectiva de 250 cm2). El lisado restante en la carcasa del filtro se lava con tampón de lisis. Después de la clarificación, se añade al lisado una alícuota de solución madre de Tris 1 M, pH 7,5, hasta una concentración final de 25 mM. La composición de tampón del lisado final es Hepes 20 mM, Tris 25 mM, pH 7,5, conductividad ~ 6 mS/cm). El lisado puede estar todavía ligeramente turbio después de la filtración, pero esto no afecta la siguiente etapa de captura. La etapa de captura se realiza a temperatura ambiente con DEAE Sepharose FF (GE Healthcare) en una columna XK50/30 (GE Healthcare) de las siguientes dimensiones: diámetro 50 mm, altura del lecho empacado 20 cm, volumen del lecho empacado ~ 400 ml. La densidad de carga es de aproximadamente 0,8 a 1,2 g de biomasa/ml de gel. El proceso lo ejecuta un sistema Ákta Explorer (GE Healthcare) y se controla a 280 nm. El equilibrado se realiza a 100 cm/h con aproximadamente 5 CV de Tris 25 mM, Hepes 20 mM, NaCl 25 mM, pH 7,5, conductividad -5 mS/cm hasta que el pH, la conductividad y la absorbancia a 280 nm sean estables. El lisado se carga en la columna a 75 cm/h y se descarta el flujo a través. Cuando se carga todo el lisado filtrado, se reanuda el flujo con aproximadamente 5 CV de tampón de equilibrio hasta que se estabilice la absorbancia a 280 nm. Las impurezas se eliminan de la columna durante la etapa de lavado 2 con 5 CV de Tris 25 mM, NaCl 175 mM, pH 7,5, conductividad 19 mS/cm. La proteína C-TAB se eluye de la columna mediante elución por etapas con 3 CV de Tris 25 mM, NaCl 375 mM, pH 7,5, conductividad 36 mS/cm. La recolección de las fracciones que contienen C-TAB comienza cuando la absorbancia a 280 nm comienza a aumentar (habitualmente después de 1 CV) y dura aproximadamente de 0,5 a 1,0 CV. Las fracciones agrupadas que contienen C-TAB pueden almacenarse a 2-8 °C durante una noche. La etapa de purificación intermedia se realiza con SP-Sepharose FF (GE Healthcare) en una columna XK50/30 (GE Healthcare) a temperatura ambiente con las siguientes dimensiones: diámetro 50 mm, altura del lecho empacado 20 cm, volumen del lecho empacado ~ 400 ml. La densidad de carga máxima es de aproximadamente 4-5 mg de C-TAB/ml de gel. El proceso lo ejecuta un sistema Ákta Explorer (GE Healthcare) y se controla a 280 nm. Las etapas de equilibrio, lavado y elución en gradiente lineal se realizan a un régimen de flujo máximo de 200 cm/h (65 ml/min) a menos que una contrapresión superior (> 4 bar) lo impida. El equilibrio se realiza con aproximadamente 5-10 CV de tampón G a 200 cm/h hasta que el pH, la conductividad y la absorbancia a 280 nm sean estables. Antes de cargar, la agrupación de DEAE debe ajustarse para permitir la unión de C-TAB en resina SP-FF. La agrupación de DEAE se diluye 25 veces con tampón de equilibrio SP-FF (ácido cítrico 10 mM, 2 mM EDTA, pH 5.560.1, conductividad ~ 2 mS/cm) hasta una conductividad final de no más de 3,5 mS/cm, pH 5,5 ± 0,1. Si es necesario, se añade agua MilliQ adicional para lograr la conductividad deseada. Tenga en cuenta que la baja conductividad es muy crítica para permitir la unión de C-TAB a SP-FF. La muestra se carga en la columna a 150 cm/h y se descarta el flujo a través. Después de cargar la muestra, se reanuda el flujo con aproximadamente 5 CV de tampón de equilibrado a 200 cm/h hasta estabilizar la absorbancia a 280 nm. La elución se realiza mediante gradiente lineal a 100 cm/h desde tampón de equilibrio al 0 % hasta fosfato de sodio 20 mM al 30 %, NaCl 500 mM, pH 7,0 sobre 10 CV. Las fracciones se recogen y el agrupamiento se realiza mediante absorbancia UV a 280 nm. La agrupación comienza en el 15 % del pico máximo y termina en el 15 % del pico máximo. La agrupación se ajusta inmediatamente a citrato 400 mM (pH final 7, aproximadamente 49 mS/cm) mediante el uso de una solución madre de citrato 1,5 M, pH 8,0. La agrupación SPFF ajustada debe tener un pH de 7 y aproximadamente 49 mS/cm y se almacena a 2-8 °C durante la noche.

La etapa de cromatografía de pulido se realiza con fenil-Sepharose HP (GE Healthcare) en una columna XK50/30 (GE Healthcare) a temperatura ambiente con las siguientes dimensiones: diámetro 50 mm, altura del lecho empacado 15 cm, volumen del lecho empacado -300 mL. La densidad de carga es de aproximadamente 4-5 mg de C-TAB/ml de gel. El proceso lo ejecuta un sistema Ákta Explorer (GE Healthcare) y se controla a 280 nm. Las etapas de equilibrado, carga, lavado y elución se realizan a un régimen de flujo máximo de 100 cm/h (33 ml/min) a menos que lo impida una contrapresión superior (> 4 bar). En tal caso, debe reducirse el régimen de flujo. El equilibrado se realiza con aproximadamente 5-10 CV de Tris 25 mM, citrato de sodio 400 mM, pH 7,5, 46 mS/cm a 100 cm/h hasta que el pH, la conductividad y la absorbancia a 280 nm sean estables. La muestra se carga en la columna a 100 cm/h y se descarta el flujo a través. Después de cargar la muestra, se reanuda el flujo con aproximadamente 5 CV de tampón de equilibrado a 100 cm/h hasta estabilizar la absorbancia a 280 nm. La elución se realiza mediante gradiente lineal a 100 cm/h desde tampón de equilibrio al 100 %/Tris 5 mM 0 %, pH 7,5, 0,5 mS/cm a Tris 5 mM 100 %, pH 7,5, 0,5 mS/cm sobre 20 CV. Las fracciones se recogen y la agrupación se realiza mediante absorbancia UV a 280 nm. La agrupación comienza a aproximadamente 10-15 % del pico máximo y termina en aproximadamente 20 % del pico máximo. La agrupación ajustada se almacena a 2-8 °C durante una noche. La preparación de la solución de proteína de la sustancia farmacológica C-TAB final se logra mediante filtración de flujo tangencial de corte de 30 kDa (TFF, membrana Pellicon 2, Millipore) operada a temperatura ambiente. La solución de proteína se diafiltra contra tampón de formulación (histidina 20 mM, NaCl 75 mM, sacarosa 5 %, Tween®800,025 %, pH 6,5) hasta que el pH del permeado es igual a 6,5 ± 0,2).

La concentración final de proteína se ajusta a 2 mg/ml de acuerdo con la medición de UV a 280 nm mediante el uso de 1,566 como coeficiente de extinción específico a 280 nm para C-TAB (concentración de proteína 1 mg/ml, cubeta de 1 cm).

SDS-PAGE y análisis de transferencia Western: Los lisados de células completas y la proteína de fusión C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 purificada se resuspendieron en tampón de muestra Nu-Page que contenía betamercaptoetanol y se hirvieron durante 10 min. Se cargaron muestras (25 jl) en gel de Tris-acetato al 3 - 8 %. Después de la electroforesis (150 V durante 1 h), las proteínas se visualizaron tras teñir los geles con tinción azul simplemente o se usaron para análisis de transferencia Western.

La expresión específica de C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 se determinó mediante análisis de transferencia Western mediante el uso de anticuerpos específicos de toxina. Las proteínas se transfirieron a 23 V durante 60 min a una membrana de PVDF mediante el uso de tampón de transferencia 1x en metanol 10 %. Las membranas se bloquearon durante 1 h a temperatura ambiente con caseína 0,5 % en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Las membranas de transferencia se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente con un anticuerpo monoclonal contra la toxina B (GenWay; clon B426M) o un anticuerpo policlonal de cobayo contra la toxina A derivado internamente (List Biological Labs). Las membranas lavadas se incubaron con anti-IgG de cobaya o anti-IgG de ratón conjugados con peroxidasa de rábano picante. Las transferencias se lavaron y se añadieron sustratos de AEC. Las transferencias se incubaron tras mezclar suavemente durante 5 a 10 minutos. Las transferencias se enjuagaron con agua para detener el desarrollo del color.

Hemaglutinación de RBC: Se ha demostrado que el dominio de unión a células de la toxina A, pero no de la toxina B, es capaz de aglutinar glóbulos rojos de conejo (RBC). El proceso de aglutinación es el resultado de la unión de la toxina A a una secuencia de glucanos que se encuentra en los antígenos sanguíneos de los RBC de conejo. Las muestras (C-TAB.G5 y toxina A nativa) se diluyen a 100 jg/ml en PBS. En una placa de microtitulación con fondo en V, se preparan diluciones seriadas dobles por duplicado a través de la placa, se comienza con 100 jg/ml y se deja 50 j l de la dilución en cada pocillo. Se añaden cincuenta microlitros de una suspensión de RBC/PBS de conejo 0,75 % a cada pocillo de la placa de microtitulación y la placa se incuba durante 1 h a temperatura ambiente. La hemaglutinación se indica por la falta de formación de un sedimento de RBC en el fondo de la placa. El título de hemaglutinación de una muestra se representa por la concentración de proteína presente en el pocillo con la mayor dilución de muestra en la que no se observa sedimento de RBC.

Ejemplo 2: Titulación de la dosis de la proteína de fusión C-TAB.G5 recombinante en presencia y ausencia de aluminio en ratones.

Este estudio fue para determinar la viabilidad de una titulación de dosis in vivo de C-TAB.G5 con y sin adyuvante de aluminio como un ensayo de potencia de C-TAB. El aluminio usado fue Alydragel, (hidróxido de aluminio, Brenntag). Se usaron para la inmunización ratones hembra C57BL/6 (Charles River Labs.), de edades comprendidas entre 8 y 9 semanas. Todos los animales recibieron una primera inmunización mediante inyección intramuscular (IM) (50 jl) en el músculo del muslo derecho el día 0. La segunda inmunización se realizó mediante inyección IM en el músculo del muslo izquierdo el día 14. Un total de 72 ratones se dividieron en 12 grupos vacunados de la siguiente manera:

- Grupo 1: solo PBS

- Grupo 2: 100 (154) ng de C-TAB.G5

- Grupo 3: 300 (462) ng de C-TAB.G5

- Grupo 4: 1000 (1540) ng de C-TAB.G5

- Grupo 5: 3000 (4620) ng de C-TAB.G5

- Grupo 6: 10000 (15400) ng de C-TAB. G5

- Grupo 7: PBS con 50 jg de aluminio

- Grupo 8: 10,0 (15,4) ng de C-TAB.G5 con 50 jg de hidróxido de aluminio

- Grupo 9: 30,0 (46,2) ng de C-TAB.G5 con 50 jg de hidróxido de aluminio

- Grupo 10: 100 (154) ng de C-TAB.G5 con 50 jg de hidróxido de aluminio

- Grupo 11: 300 (462) ng de C-TAB.G5 con 50 jg de hidróxido de aluminio

- Grupo 12: 1000 (1540) ng de C-TAB.G5 con 50 jg de hidróxido de aluminio

En este estudio, la concentración de proteína se determinó en primer lugar de acuerdo con el protocolo estándar Quick Start™ Bradford Protein Assay (Bio-Rad). Finalmente, la concentración de proteína (mostrada entre paréntesis) se volvió a determinar mediante medición de UV a 280 nm de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 1.3. En todos los estudios de seguimiento, la concentración de proteínas se midió mediante el método UV.

Se recogieron muestras de sangre de todos los animales dos semanas después de la primera inmunización (día 14 del estudio) y dos semanas después de la segunda inmunización (día 28 del estudio). El suero se almacenó a -20 °C hasta su análisis.

ELISA de IgG en suero: Los anticuerpos séricos contra C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 (denominados C-TAB), la toxina A y la toxina B o los toxoides de estas se evaluaron en un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA). En resumen, soluciones madre de 1,0 pg/ml de la toxina A, la toxina B o el polipéptido aislado C-TAB. G5 se prepararon en PBS y se añadieron 100 pl a cada pocillo de placas de 96 pocillos. Después de la incubación durante la noche a 4 °C, las placas se lavaron y se bloquearon con tampón de bloqueo de caseína 0,5 %. Las placas se lavaron de nuevo y se añadieron a las placas diluciones seriadas dobles de los sueros de ensayo. Después de una segunda incubación durante una noche a 4 °C, las placas se lavaron y se incubaron con IgG anti-ratón conjugada con peroxidasa (H L). Después de 2 horas de incubación a temperatura ambiente, las placas se lavaron de nuevo, se añadió sustrato de peroxidasa (2,2'-azinobis(3-etilbenztiazolina-6-sulfonato) y se dejó que se desarrollara el color durante 2 h a temperatura ambiente. La reacción se detuvo tras añadir 50 pl de SDS 2 % a los pocillos. Las placas se leen con un lector de placas ELISA a una absorbancia de 405 nm. Los títulos de anticuerpos en suero se informan como la media geométrica de las Unidades de ELISA, que son las diluciones de suero que dan como resultado una lectura de OD a 405 nm de 1,0. Como control negativo, se usó una muestra agrupada de suero preinmunitario obtenido de animales sangrados previamente antes de la primera inmunización para evaluar una respuesta de anticuerpos.

Los animales que recibieron C-TAB.G5 demostraron un aumento dependiente de la dosis en los títulos de anticuerpos, con el adyuvante de aluminio que permite títulos de anticuerpos significativamente mejorados a una dosis menor de C-TAB.G5. La Figura 3 muestra los títulos de IgG anti-C-TAB, anti-toxina A y anti-toxina B. La Figura 4 muestra una comparación gráfica de títulos de anticuerpos en presencia o ausencia de aluminio.

Ejemplo 3: Inmunogenicidad y eficacia protectora de C-TAB.G5 en ratones.

Este estudio fue para evaluar la inmunogenicidad y la eficacia protectora de C-TAB.G5 en ratones vacunados que recibieron un reto letal de la toxina A o la toxina B de C. difficile. Se usaron para este estudio ratones hembra C57BL/6 (Charles River Labs.), de 6-7 semanas de edad. Todos los animales recibieron la primera vacunación mediante inyección intramuscular (IM) (50 pl) en el músculo del muslo derecho el día 0. La segunda vacunación se realizó mediante inyección IM en el músculo del muslo izquierdo el día 14. Se dividieron 116 ratones en grupos vacunados de la siguiente manera:

Grupo 1: solo PBS

Grupo 2: 3 pg de C-TAB.G5

Grupo 3: 10 pg de C-TAB.G5

Grupo 4: 30 pg de C-TAB.G5

Grupo 5: 3 pg de C-TAB.G5 50 pg de hidróxido de aluminio

Grupo 6: 10 pg de C-TAB.G5 50 pg de hidróxido de aluminio

Grupo 7: 30 pg de C-TAB.G5 50 pg de hidróxido de aluminio

Grupo 8: solo PBS

Grupo 9: 3 pg de C-TAB.G5

Grupo 10: 10 pg de C-TAB.G5

Grupo 11: 30 pg de C-TAB.G5

Grupo 12: 3 pg de C-TAB.G5 50 pg de hidróxido de aluminio

Grupo 13: 10 pg de C-TAB.G5 50 pg de hidróxido de aluminio

Grupo 14: 30 pg de C-TAB.G5 50 pg de hidróxido de aluminio

Se recogieron muestras de sangre de todos los animales dos semanas después de la segunda inmunización (día de estudio 28). El suero se almacenó a -20 °C hasta su análisis. A continuación, se determinaron los títulos de anticuerpos en suero contra C-TAB, la toxina A y la toxina B mediante ELISA y se informaron como Unidades ELISA (EU).

La Figura 5 muestra los títulos de anticuerpos en suero contra C-TAB, la toxina A y la toxina B en ratones evaluados dos semanas después de la segunda inmunización (día 28 del estudio). Este estudio demostró que la proteína de fusión C-TAB. G5 es altamente inmunogénica en ratones y puede inducir una respuesta fuerte de anticuerpos contra la toxina A y la toxina B incluso sin añadir un adyuvante. La inmunogenicidad de C-TAB.G5 puede aumentarse significativamente (más de un log) mediante el suministro conjunto con hidróxido de aluminio. Los animales que recibieron C-TAB.G5 con o sin aluminio demostraron una respuesta de anticuerpos 2 veces mayor en un intervalo de dosis de un logaritmo.

Además de evaluar los títulos de anticuerpos, se evaluó la capacidad de los anticuerpos generados por inmunización con C-TAB.G5 para neutralizar las toxinas A y B nativas en un ensayo de neutralización de toxinas (TNA) in vitro.

Ensayo de anticuerpos neutralizantes de toxinas (TNA). Para el análisis in vitro, se incubaron 125 pl de toxina A (5 ng/ml) o toxina B (1 ng/ml) con 125 pl de diluciones seriadas de antisueros obtenidos de ratones inmunizados. Después de una hora de incubación a 37 °C, se añadió la mezcla de toxina:suero a pocillos de microtitulación que contenían células Vero (células de riñón de mono) y las placas de microtitulación se incubaron durante 18 horas. La incubación de la toxina A o B con células Vero dio como resultado un cambio en la morfología celular y una pérdida de adherencia celular que se midió mediante tinción con rojo neutro de las células tratadas con toxina después de la eliminación de las células no adherentes. El título de neutralización de toxinas de un suero se informa como la dilución de suero que da una reducción del 50 % en la actividad de la toxina.

Los resultados del ensayo de TNA se muestran en la Figura 6. Los datos indican que los anticuerpos generados después de la inmunización con C-TAB. G5 solo pueden neutralizar la actividad tóxica de la toxina A nativa pero no de la toxina B. Cuando el C-TAB. G5 se suministró conjuntamente con aluminio, los títulos de TNA se aumentaron con un aumento de aproximadamente 6 veces en el TNA de antitoxina A y solo títulos 2 veces más bajos en el TNA de antitoxina B. Estos datos indican que el polipéptido aislado C-TAB.G5 no solo conserva los epítopos de reconocimiento antigénico de los anticuerpos presentes en las toxinas nativas, sino que comprende epítopos antigénicos críticos necesarios para la generación de anticuerpos neutralizantes de toxinas funcionales. Por tanto, C-TAB.G5 es eficaz para neutralizar los efectos tóxicos de la toxina A y la toxina B de C. difficile y, por lo tanto, es útil en la vacunación.

Además de evaluar la respuesta de anticuerpos, se determinó la capacidad de la inmunización con C-TAB.G5 para proteger a los ratones de un reto letal de toxinas nativas. Tres semanas después de la segunda vacunación (día de estudio 35), los animales de los grupos vacunados y no vacunados (N=8) recibieron una dosis letal de 25 ng de la toxina A o 50 ng de la toxina B intraperitonealmente (IP). La supervivencia de los ratones se controló durante los siguientes 9 días y los resultados se muestran en la Figura 6. Este experimento demostró que la inmunización de ratones con C-TAB.G5 en ausencia del adyuvante de aluminio era capaz de conferir un 100 % de protección contra un reto letal con la toxina A nativa y un 50 % de protección contra un reto con la toxina B. El suministro conjunto de C-TAB.G5 con Alum mejoró la inmunidad protectora a la toxina B hasta un 100 % de protección. Estos datos indican que la vacunación con C-TAB.G5 induce una respuesta inmunitaria suficiente para proteger a los ratones de los efectos tóxicos de las toxinas A y B en el modelo de reto letal.

Ejemplo 4: Evaluación de la inmunogenicidad y eficacia protectora de C-TAB.G5 en ratones jóvenes y envejecidos.

Este estudio fue para comparar la respuesta inmunitaria montada contra C-TAB.G5 en ratones jóvenes y envejecidos. Para este estudio se usaron ratones hembra C57BL/6 (Charles River Labs.), de 6-7 semanas y 18 meses, respectivamente. Todos los animales recibieron la primera vacunación mediante inyección intramuscular (IM) (50 ml) en el músculo del muslo derecho el día 0. La segunda vacunación se realizó mediante inyección IM en el músculo del muslo izquierdo el día 14. 192 ratones se dividieron en grupos vacunados de la siguiente manera:

Grupo 1: PBS a ratones jóvenes

Grupo 2: PBS a ratones envejecidos

Grupo 3: 10 |jg de C-TAB.G5 a ratones jóvenes

Grupo 4: 30 jg de C-TAB.G5 a ratones jóvenes

Grupo 5: 10 jg de C-TAB.G5 a ratones envejecidos

Grupo 6: 30 jg de C-TAB.G5 a ratones envejecidos

Grupo 7: 10 jg de C-TAB.G5 50 jg de hidróxido de aluminio a ratones jóvenes

Grupo 8: 30 jg de C-TAB.G5 50 jg de hidróxido de aluminio a ratones jóvenes

Grupo 9: 10 jg de C-TAB.G5 50 jg de hidróxido de aluminio a ratones envejecidos

Grupo 10: 30 jg de C-TAB.G5 50 jg de hidróxido de aluminio a ratones envejecidos

Grupo 11: PBS a ratones jóvenes

Grupo 12: PBS a ratones envejecidos

Grupo 13: a ratones jóvenes

Grupo 14: a ratones jóvenes

Grupo 15: a ratones envejecidos

Grupo 16: ratones envejecidos

Grupo 17: .G5 50 jg de hidróxido de aluminio a ratones jóvenes

Grupo 18: .G5 50 jg de hidróxido de aluminio a ratones jóvenes

Grupo 19: .G5 50 jg de hidróxido de aluminio a ratones envejecidos

Grupo 20:

.G5 50 jg de hidróxido de aluminio a ratones envejecidos

Tres semanas después de la segunda vacunación (día 35 del estudio), los animales de los grupos vacunados y no vacunados (N = 6) recibieron un reto letal mediante inyección intraperitoneal (IP) con 25 ng de la toxina A o 50 ng de la toxina B. La supervivencia de los ratones se controló durante los siguientes 9 días.

Se recogieron muestras de sangre de todos los animales dos semanas después de la primera inmunización (día 14 del estudio) y dos semanas después de la segunda inmunización (día 28 del estudio). El suero se almacenó a -20 °C hasta su análisis. A continuación, se determinaron los títulos de anticuerpos en suero contra C-TAB, la toxina A y la toxina B y se informaron como Unidades ELISA (EU). Se determinaron los anticuerpos neutralizantes de la toxina A y la toxina B (TNA) mediante el uso de células Vero tratadas con una cantidad citotóxica de la toxina A y la toxina B recombinante.

Los animales jóvenes que recibieron la vacuna C-TAB.G5 demostraron niveles significativamente más altos de todos los anticuerpos evaluados, en comparación con los animales envejecidos. Se obtuvieron títulos de anticuerpos especialmente altos en ratones jóvenes vacunados con C-TAB.G5 en presencia de hidróxido de aluminio (Figura 7). Se logró una mejora particularmente significativa en el título de TNA de la toxina B. Al mismo tiempo, no hubo una gran diferencia entre los ratones jóvenes y los envejecidos en la capacidad de resistir los retos de la toxina A y la toxina B. Sin embargo, ambos grupos demostraron una mejor tasa de protección cuando se vacunaron en presencia de aluminio. La Figura 7 muestra una comparación de la inmunogenicidad y la eficacia protectora de C-TAB.G5 en ratones jóvenes frente a ratones viejos. La Figura 8 muestra la cinética del desarrollo de anticuerpos anti-C-TAB en ratones jóvenes y viejos.

Ejemplo 5: Comparación de la inmunogenicidad y la eficacia protectora de C-TAB.G5.1 y el toxoide A y B.

Este estudio fue para comparar la inmunogenicidad y la eficacia protectora de C-TAB.G5.1 frente al toxoide A/B. El toxoide A/B usado fue la mezcla de partes iguales (1:1) del toxoide A (lote núm. 1009132) y el toxoide B (lote núm.

1009133). El toxoide se preparó mediante fijación con formalina y se proporcionó por TechLab. Para este estudio se usaron ratones hembra C57BL/6 (Charles River Labs.), de 6-7 semanas de edad. Todos los animales recibieron la primera vacunación mediante inyección intramuscular (IM) (50 jl) en el músculo del muslo derecho el día O. La segunda vacunación se realizó mediante inyección IM en el músculo del muslo izquierdo el día 14. Se dividieron 180 ratones en grupos vacunados de la siguiente manera:

- Grupo 1: solo PBS

- Grupo 2: 10 |jg de C-TAB. G5.1

- Grupo 3: 30 jg C-TAB.G5.1

- Grupo 4: 10 jg de C-TAB. G5.1 50 jg de hidróxido de aluminio

- Grupo 5: 10 jg de C-TAB. G5.1 50 jg de hidróxido de aluminio

- Grupo 6: 30 jg de toxoide A/B

- Grupo 7: 10 jg de toxoide A/B

- Grupo 8: 30 jg de toxoide A/B 50 jg de hidróxido de aluminio

- Grupo 9: 30 jg de toxoide A/B 50 jg de hidróxido de aluminio

- Grupo 10: PBS

- Grupo 11: 10 jg de C-TAB.G5.1

- Grupo 12: 30 jg de C-TAB. G5.1

- Grupo 13: 10 jg de C-TAB. G5.1 50 jg de hidróxido de aluminio

- Grupo 14: 30 jg de C-TAB. G5.1 50 jg de hidróxido de aluminio

- Grupo 15:10 jg de toxoide A/B

- Grupo 16: 30 jg de toxoide A/B

- Grupo 17: 10 jg de toxoide A/B 50 jg de hidróxido de aluminio

- Grupo 18: 30 jg de toxoide A/B 50 jg de hidróxido de aluminio

Tres semanas después de la segunda vacunación (día de estudio 35), los animales de los grupos vacunados y no vacunados (N = 6) recibieron un reto letal mediante inyección intraperitoneal (IP) con 28 ng de la toxina A o 50 ng de la toxina B. La supervivencia de los ratones se controló durante los siguientes 9 días.

Se recogieron muestras de sangre de todos los animales dos semanas después de la primera inmunización (día 14 del estudio) y dos semanas después de la segunda inmunización (día 28 del estudio). El suero se almacenó a -20 °C hasta su análisis. A continuación, se determinaron los títulos de anticuerpos en suero contra C-TAB, la toxina A y la toxina B mediante ELISA y se informaron como Unidades ELISA (EU). Se determinaron los anticuerpos neutralizantes de la toxina A y la toxina B (TNA) mediante el uso de células Vero tratadas con una cantidad citotóxica de la toxina A y la toxina B recombinante.

Este estudio demuestra la inmunogenicidad y la eficacia protectora de C-TAB.G5.1 y el toxoide A/B en ratones después de dos vacunaciones. Los animales que recibieron C-TAB.G5.1 mostraron títulos de anticuerpos anti-C-TAB más bajos pero significativos, en comparación con los animales que recibieron toxoide A/B. Además, el suministro conjunto de aluminio aumentó en gran medida todas las respuestas de anticuerpos evaluadas. Como resultado, es similar el nivel de anticuerpos anti-C-TAB y anti-toxina A alcanzado en animales inmunizados con C-TAB.G5.1 o con toxoide A/B en presencia de aluminio. El único título de anticuerpos más bajo se observó para el anticuerpo anti-toxina B cuando los ratones se inmunizaron con C-TAB.G5.1, en comparación con los ratones inmunizados con toxoide A/B. Es de destacar que, a diferencia de los anticuerpos generados contra C-TAB.G5.1 que reconocen epítopos en la porción C-terminal de las moléculas de toxina, los anticuerpos inducidos con inmunización con toxoide eran específicos de la porción N-terminal de las moléculas de toxina, que se leyó en el ELISA de antitoxina. Por tanto, los anticuerpos anti-toxina A y anti-toxina B generados en ratones inmunizados con C-TAB.G5.1 y toxoide A/B eran anticuerpos de diferente especificidad y, por tanto, no pueden compararse directamente. Sin embargo, los datos indican que la respuesta de anticuerpos a la inmunización con C-TAB.G5.1 es significativamente alta, como en el caso de la inmunización con toxoides. Además, el estudio de reto con la toxina demostró que la capacidad de la inmunización con C-TAB.G5.1 para proteger a los ratones frente a un reto letal es comparable a la eficacia de protección del toxoide A y B. La figura 9 muestra una comparación de la inmunogenicidad de C-TAB.G5.1 y toxoide A/B. La Figura 10 muestra los datos de neutralización y protección de toxinas para ratones inmunizados con C-TAB.G5.1 en comparación con los inmunizados con toxoide A/B.

Ejemplo 5.1: Comparación de títulos de anticuerpos y eficacia protectora de C-TAB.G5.1 en diferentes regímenes de inmunización.

Este estudio fue para comparar la inmunogenicidad y la eficacia protectora de C-TAB.G5.1 en ratones que recibieron tres dosis de la vacuna en diferentes regímenes de inmunización. Para este estudio se usaron ratones hembra C57BL/6 (Charles River Labs.), de 6-7 semanas de edad. Se dividieron 135 ratones en 14 grupos. Todos los animales de los grupos núms. 2-13 recibieron tres vacunaciones mediante inyección intramuscular (IM) (50 jl) en el músculo del muslo derecho o el músculo del muslo izquierdo en los días indicados a continuación. Los ratones de los grupos 1 y 8 no recibieron vacunación; sirvieron como control negativo. La inmunización se realizó de la siguiente manera:

Se recogieron muestras de sangre de todos los animales los días de estudio 0, 3, 7, 14, 21, 28, 35 y 42. El suero se almacenó a -20 °C hasta su análisis. Los títulos de anticuerpos en suero contra C-TAB, la toxina A y la toxina B se determinaron mediante ELISA y se informaron como Unidades ELISA (EU). Los anticuerpos neutralizantes de la toxina A y la toxina B (TNA) se determinaron el día 42 del estudio mediante el uso de células Vero tratadas con una cantidad citotóxica de la toxina A y la toxina B recombinante.

Tres semanas después de la última vacunación (día de estudio 49), los animales de los grupos vacunados y no vacunados (N = 8) recibieron un reto letal mediante inyección intraperitoneal (IP) con 28 ng de la toxina A o 50 ng de la toxina B. La supervivencia de los ratones se controló durante los siguientes 9 días.

Este estudio demuestra que todos los títulos de anticuerpos medidos dos semanas después de la tercera vacunación o el día 35 y 42 del estudio son comparables en todos los regímenes de inmunización, aunque el régimen de inmunización de 0/14/28 muestra las mejores respuestas de anticuerpos. Si se comparan los títulos de anticuerpos medidos dos semanas después de la segunda vacunación, entonces el régimen de inmunización de 0/14/28 es mejor que el régimen de inmunización de 0/7/21, y mucho mejor que el régimen de inmunización de 0/3/14. Este estudio confirmó que los títulos de anticuerpos anti-toxina A/B aumentan significativamente cuando el antígeno se inyecta conjuntamente con hidróxido de aluminio (datos no mostrados). El estudio también muestra que incluso dos dosis de la vacuna con aluminio administradas en un intervalo de dos semanas pueden provocar un nivel alto de anticuerpos, comparable al nivel obtenido después de tres dosis de vacunación.

El nivel de anticuerpos neutralizantes de la toxina A/B es mucho más alto en el régimen de inmunización de 0/7/21 y 0/14/28 que en el régimen de inmunización de 0/3/14.

La protección completa contra el reto con la toxina A no requiere aluminio en el régimen de inmunización de 0/7/21 y 0/14/28, pero no en el 0/3/14. El régimen de inmunización de 0/14/28/ con aluminio indujo un nivel más alto de protección (87,5 %) contra el reto con la toxina B, mientras que el régimen de inmunización de 0/7/21 proporciona un 37,5 % de protección y 0/3/14 muestra 28,6 % de protección. Los resultados de este estudio se muestran en la Figura 20.

Ejemplo 6: Evaluación de la inmunogenicidad y eficacia protectora de la proteína de fusión C-TAB.G5.1 recombinante en hámsteres.

Este estudio fue para evaluar adicionalmente la inmunogenicidad de la proteína de fusión recombinante C-TAB.G5.1 administrada con o sin adyuvante en un modelo animal diferente.

Para este estudio se usaron hámsteres hembras (Harlan), de más de 7 semanas y con un peso de entre 80 y 90 g. Todos los animales recibieron la primera vacunación mediante inyección intramuscular (IM) en bolo (50 jl) en el músculo del muslo derecho el día 0. La segunda vacunación fue mediante inyección IM en el músculo del muslo izquierdo el día 14 y la tercera vacunación fue mediante inyección IM el día 28. Los hámsteres se dividieron en grupos (N = 6) y se vacunaron de la siguiente manera:

Grupo 1: solo tampón de formulación

Grupo 2: 10 jg de C-TAB.G5.1

Grupo 3: 10 jg de C-TAB.G5.1 100 jg de hidróxido de aluminio

Grupo 4: 30 jg de C-TAB.G5.1

Grupo 5: 30 jg de C-TAB.G5.1 100 jg de hidróxido de aluminio

Grupo 6: 100 jg de C-TAB.G5.1

Grupo 7: 100 jg de C-TAB.G5.1 100 jg de hidróxido de aluminio

Grupo 10: solo tampón de formulación

Grupo 11. 10 jg de C-TAB.G5.1

Grupo 12. 10 jg de C-TAB.G5.1 100 jg de hidróxido de aluminio

Grupo 13. 30 jg de C-TAB.G5.1

Grupo 14. 30 jg de C-TAB.G5.1 100 jg de hidróxido de aluminio

Grupo 15100 jg de C-TAB.G5.1

Grupo 16. 100 jg de C-TAB.G5.1 100 jg de hidróxido de aluminio

Dos semanas después de la tercera vacunación (día de estudio 42), los animales de los grupos vacunados y no vacunados (N = 6) recibieron un reto letal mediante inyección intraperitoneal (IP) con 75 ng de la toxina A o 125 ng de la toxina B. Se usaron 12 hámsteres adicionales para una titulación de la dosis del reto con la toxina A o la toxina B el día 44. Se controló la supervivencia de los hámsteres durante los siguientes 8 días.

Se recogieron muestras de sangre de todos los animales dos semanas después de la primera inmunización (día de estudio 14), después de la segunda inmunización (día de estudio 28) y la tercera inmunización (día de estudio 35). El suero se almacenó a -20 °C hasta su análisis. A continuación, se determinaron los títulos de anticuerpos en suero contra C-TAB, la toxina A y la toxina B mediante ELISA y se informaron como Unidades ELISA (EU). Se determinaron los anticuerpos neutralizantes de la toxina A y la toxina B (TNA) mediante el uso de células Vero tratadas con una cantidad citotóxica de la toxina A y la toxina B recombinante.

Este estudio demostró que los hámsteres, al igual que los ratones, pudieron responder positivamente a la vacunación con C-TAB.G5.1. Los animales que recibieron C-TAB.G5.1 demostraron un aumento dependiente de la dosis en todos los títulos de anticuerpos evaluados, mientras que el adyuvante de aluminio mejoró significativamente los títulos de anticuerpos en todas las dosis de C-TAB.G5. Los títulos de anticuerpos más altos se observaron dos semanas después de las segundas inyecciones (día 28 del estudio). La Figura 11 (A-C) muestra los títulos de anticuerpos para cada grupo de hámsteres inmunizados. La Figura 12 muestra la cinética del desarrollo de anticuerpos anti-C-TAB en hámsteres inmunizados con C-TAB. G5 en presencia o ausencia de hidróxido de aluminio.

Los resultados del ensayo de TNA se muestran en la Figura 13. Estos resultados son similares a los obtenidos en ratones e indican que el anticuerpo generado contra la proteína de fusión C-TAB.G5.1 en hámsteres es eficaz para neutralizar los efectos tóxicos de la toxina A y la toxina B de C. diffiále.

La Figura 13 también muestra los datos de protección para hámsteres inmunizados con C-TAB.G5.1 después de un reto con toxina letal. Se logró una alta protección incluso mediante la vacunación con C-TAB.G5.1 en ausencia del adyuvante. El nivel de protección se mejoró al 100 % tras añadir aluminio a la vacuna.

Ejemplo 7: La eficacia protectora de la proteína de fusión C-TAB.G5.1 contra un reto de esporas de C. difficile en hámsteres tratados con clindamicina.

Después del tratamiento con antibióticos, C. difficile puede colonizar el intestino y, si es toxigénico, puede causar una diarrea asociada a los antibióticos. La enfermedad asociada a C. difficile (CDAD) de los seres humanos se modela en hámsteres mediante el uso de clindamicina para hacer que los animales sean susceptibles a la colonización, la diarrea y la muerte, habitualmente unos pocos días después de la siembra con una cepa toxigénica. Para evaluar la eficacia de la vacuna C-TAB.G5.1, se retaron hámsteres vacunados y no vacunados con clindamicina y la cepa 630 de C. difficile. Se mezclaron 100 |jg de C-TAB.G5.1 con 125 |jg de adyuvante de hidróxido de aluminio. Las hembras hámsteres adultas que pesaban ~ 100 g recibieron 3 vacunaciones mediante inyección intramuscular (IM) los días 0, 14 y 28. El placebo fue PBS. Se dividieron 48 hámsteres en grupos de 8 vacunados de la siguiente manera:

Grupo 1: solo PBS reto de 102 esporas

Grupo 2: C-TAB.G5.1 reto de 102 esporas

Grupo 3: solo PBS reto de 103 esporas

Grupo 4: C-TAB.G5.1 reto de 102 esporas

Grupo 5: solo PBS reto de 104 esporas

Grupo 6: C-TAB.G5.1 reto de 104 esporas

El día 42, todos los animales de todos los grupos recibieron una dosis oral de 10 mg de fosfato de clindamicina/kg de peso corporal. El día 43, a todos los animales de todos los grupos se les administró una dosis por sonda oral con esporas lavadas de la cepa 630 de C. difficile. Se usaron tres niveles de reto a esporas (~ 102, 103 y 104). La observación, pero ningún tratamiento, continuó hasta el día 54. Al finalizar el estudio, todos los animales supervivientes estaban libres de la enfermedad durante > 5 días.

Se extrajeron muestras de sangre para obtener suero para estudios serológicos los días 0, 14, 28, 42 y el día 54 (final del estudio). Las heces se recogieron los días 1 y 42, directamente del ano de los hámsteres o, si es necesario, de entre el lecho.

Los resultados se muestran en la Figura 14 lo que demuestra las curvas de supervivencia después del reto con esporas en hámsteres. Los datos de supervivencia se graficaron como curvas de ajuste de supervivencia de Kaplan-Meier y el análisis estadístico se realizó mediante un análisis de intervalos logarítmicos. A todas las dosis de esporas, se observó 100 % de supervivencia de los hámsteres en el grupo vacunado y la supervivencia fue significativamente mayor en comparación con el grupo de placebo: p=0,0245 a 102 esporas, p=0,0006 en 103 esporas, p<0,0001 a 104 esporas.

Ejemplo 8: Eficacia de inmunogenicidad y protección de C-TAB.G5.1 en monos.

Este estudio fue para evaluar la inmunogenicidad y protección de C-TAB.G5.1 en monos cinomolgos. Para este estudio se usaron seis monos cinomolgos hembras, de entre 4 y 6 años y con un peso de entre 2 y 4 kg. Se dispusieron dos grupos de tres monos, el primer grupo (Grupo 1) recibió 200 jg de C-TAB.G5.1 y el segundo (Grupo 2) recibió 200 jg de C-TAB.G5.1 y 250 jg de aluminio. Como adyuvante de aluminio se usó Rehydragel (Reheis, lote núm. 534401, diluido en PBS a 2 mg/ml). Antes de la extracción de sangre o la inmunización, se afeitaron los animales (si era necesario).

Las inmunizaciones 1a (estudio del día 0) y 3a (estudio del día 28) se inyectaron en el brazo izquierdo (deltoides), la 2a inmunización (día de estudio 14) se inyectó en el brazo derecho (deltoides). El Grupo 1 recibió 200 jg de C-TAB.G5.1 solo en 0,5 ml de PBS 1x mediante inyección IM y el Grupo 2 recibió 200 jg de C-TAB.G5.1 con 250 jg de aluminio en 0,5 ml de PBS 1x mediante inyección IM.

En los puntos de tiempo establecidos (días de estudio 0, 14, 28 y 42), se obtuvieron 2-3 ml de sangre total por métodos estándar en tubos separadores de suero. Las muestras de suero se congelaron a aproximadamente -20 °C. A continuación, se usó el método ELISA para evaluar los títulos de IgG anti-C-TAB, anti-toxina A y anti-toxina B. Los títulos de anticuerpos se presentaron en Unidades ELISA (EU).

La Figura 15 muestra que el aumento de las dosis de C-TAB.G5.1 conduce a un aumento de la producción de anticuerpos que reconocen las tres proteínas, mientras que la presencia de aluminio mejora significativamente los niveles de anticuerpos. Los títulos de anticuerpos más altos se observaron con dos vacunaciones el día 42. Estos datos indican claramente la viabilidad de usar las proteínas de fusión recombinantes C-TAB.G5 o C-TAB.G5.1 para sujetos vacunados que lo necesiten.

Ejemplo 9: Comparación de la inmunogenicidad de C-TAB.G5 y C-TAB.G5.1.

Este estudio fue para comparar la inmunogenicidad de C-TAB.G5 y C-TAB.G5.1, así como el efecto de dos tampones diferentes en los que se suministró C-TAB. Para la inmunización se usaron ratones hembra C57BL/6 (Charles River Labs.), con edades comprendidas entre 8 y 9 semanas. Todos los animales recibieron la primera inmunización mediante inyección intramuscular (IM) (50 jl) en el músculo del muslo derecho el día 0. La segunda inmunización se realizó mediante inyección IM en el músculo del muslo izquierdo el día 14. Un total de 72 ratones se dividieron en 12 grupos vacunados de la siguiente manera:

Grupo 1: 1 jg de C-TAB.G5 en PBS

Grupo 2: 3 jg de C-TAB.G5 en PBS

Grupo 3: 10 |jg de C-TAB. G5 en PBS

Grupo 4: 30 jg de C-TAB. G5 en PBS

Grupo 5: 1 jg de C-TAB.G5 en tampón de histidina

Grupo 6: 3 jg de C-TAB.G5 en tampón de histidina

Grupo 7: 10 jg de C-TAB.G5 en tampón de histidina

Grupo 8: 30 jg de C-TAB.G5 en tampón de histidina

Grupo 9: 1 jg de C-TAB.G5.1 en tampón de histidina

Grupo 10: 3 jg de C-TAB. G5.1 en tampón de histidina

Grupo 11: 10 jg de C-TAB.G5.1 en tampón de histidina

Grupo 12: 30 jg de C-TAB.G5.1 en tampón de histidina

Se recogieron muestras de sangre de todos los animales dos semanas después de la segunda inmunización (día de estudio 28). El suero se almacenó a -20 °C hasta su análisis. Los títulos de anticuerpos en suero contra C-TAB, la toxina A y la toxina B se determinaron mediante ELISA y se informaron como Unidades ELISA.

La Figura 16 muestra que todos los títulos de anticuerpos (anti-C-TAB, anti-toxina A y anti-toxina B) no fueron significativamente diferentes (como reveló el análisis de la prueba T) en el intervalo de dosis de 1-30 jg para tres formulaciones de vacuna. Se logró una producción de anticuerpos ligeramente mayor con la formulación de C-TAB.G5 en tampón de histidina, en comparación con PBS. No se observaron diferencias significativas entre la inmunización con las formulaciones de histidina C-TAB.G5 y C-TAB.G5.1. Por tanto, este estudio demuestra la misma inmunogenicidad de las construcciones C-TAB.G5 y C-TAB.G5.1.

Ejemplo 10: Preparación y evaluación de las proteínas de fusión alternativas C-TABNCTB y C-TADCTB.

Este Ejemplo describe la preparación de otras dos proteínas de fusión que comprenden una porción del dominio C-terminal de CTA y dos porciones del dominio C-terminal de CTB derivadas de la cepa C. difficile VPI-10463. La proteína de fusión C-TABNCTB (SEQ ID NO: 18) comprende, como C-TAB.G5, 19 unidades de repetición de CTA (aminoácidos 2272-2710), 23 unidades de repetición de CTB (aminoácidos 1850-2366), más 10 repeticiones adicionales de CTB (aminoácidos 1834-2057) fusionadas al extremo C-terminal de CTB. La proteína de fusión C-TADCTB (SEQ ID nO: 20) comprende la secuencia C-TAB.G5 (19 repeticiones de CTA y 23 repeticiones de CTB) más 24 unidades de repetición adicionales de CTB (aminoácidos 1834-2366) fusionadas al extremo C-terminal de C-TAB.G5. Por tanto, C-TADCTB comprende una porción doble de unidades de repetición de CTB. La clonación de las construcciones génicas C-TABNCTB y C-TADCTB se realizó de una manera similar a la descrita en el Ejemplo 1. 1 Las proteínas de fusión recombinantes se expresaron en E. coli y se purificaron mediante el uso de un procedimiento estándar como se describe en el Ejemplo 1.2. Los polipéptidos aislados se evaluaron en estudios de inmunogenicidad y protección en animales.

Ejemplo 10.1: Comparación de la inmunogenicidad y eficacia protectora de C-TAB.G5, C-TABNCTB y C-TADCTB en ratones.

Este estudio fue para comparar la inmunogenicidad y la eficacia protectora de C-TAB.G5, C-TABNCTB y C-TADCTB en ratones vacunados con cinco dosis de antígeno en un intervalo de dos logaritmos. Para este estudio se usaron ratones hembra C57BL/6 (Charles River Labs.), de 6-7 semanas de edad. Todos los animales recibieron dos vacunaciones: la primera mediante inyección intramuscular (IM) (50 jl) en el músculo del muslo derecho el día 0. La segunda vacunación se realizó mediante inyección IM en el músculo del muslo izquierdo el día 14. Todas las inmunizaciones se realizaron en ausencia de aluminio. Se recogieron muestras de sangre dos semanas después de la segunda inmunización (día 28 del estudio). El suero se almacenó a -20 °C hasta su análisis. Los títulos de anticuerpos en suero contra C-TAB, la toxina A y la toxina B se determinaron mediante ELISA y se informaron como Unidades ELISA (EU) que se muestran en la Figura 17.

Este estudio demostró que las proteínas de fusión alternativas C-TADCTB y C-TABNCTB, así como C-TAB.G5, son altamente inmunogénicas y pueden inducir una respuesta fuerte de anticuerpos contra la toxina A y la toxina B incluso sin añadir un adyuvante.

Además de evaluar la respuesta de anticuerpos, se determinó la capacidad de la inmunización con C-TADCTB y C-TABNCTB para proteger a los ratones de un reto letal de la toxina B nativa. Tres semanas después de la segunda vacunación (día 35 del estudio), los animales de los grupos vacunados y no vacunados (N = 6) recibieron por vía intraperitoneal (IP) una dosis letal de 50 ng de la toxina B. Se controló la supervivencia de los ratones durante los 9 días siguientes y los resultados se muestran en la Figura 18. Este experimento demostró que la inmunización de ratones con 33 jg de C-TADCTB en ausencia de aluminio era capaz de conferir un 100 % de protección contra un reto letal con la toxina B nativa, mientras que la misma dosis de C-TAB.G5 y C-TABNCTB induce solo protección parcial. Estos datos indican que, de manera similar a C-TAB.G5, otras dos proteínas de fusión C-TADCTB y C-TABNCTB pueden ser protectoras contra el reto letal con la toxina nativa.

Ejemplo 10.2: Comparación de la inmunogenicidad y eficacia protectora de C-TAB.G5.1 y C-TADCTB en hámsteres. Este estudio fue para evaluar adicionalmente la inmunogenicidad de la proteína de fusión alternativa C-TADCTB administrada con o sin adyuvante de aluminio en un modelo animal diferente.

El estudio se diseñó como se describe en el Ejemplo 6: las hembras de hámster se vacunaron tres veces mediante inyección IM (día de estudio 0, 14 y 28) en presencia o ausencia de 100 |jg de hidróxido de aluminio. Dos semanas después de la tercera vacunación (día 42 del estudio), todos los animales recibieron un reto letal mediante inyección intraperitoneal (IP) con 75 ng de la toxina A o 125 ng de la toxina B. Se recogieron muestras de sangre los días 14, 28 y 35 del estudio y se determinaron los títulos de anticuerpos en suero a C-TAB, la toxina A y la toxina B mediante ELISA. Los anticuerpos neutralizantes de la toxina A y la toxina B (TNA) se midieron en sueros del día 35. La supervivencia de los hámsteres se controló y se informó como % de protección.

Este estudio demostró que la proteína de fusión C-TADCTB puede inducir una respuesta de anticuerpos anti-toxina en hámsteres, de manera similar a los ratones. El adyuvante de aluminio mejoró significativamente todos los títulos de anticuerpos evaluados. Los resultados del ensayo de TNA que se muestran en la Figura 19 indican que el anticuerpo generado contra C-TADCTB es eficaz para neutralizar los efectos tóxicos de la toxina A y la toxina B de C. difficile. La Figura 19 también demuestra la comparación de datos de protección para hámsteres inmunizados con C-TAB.G5.1 o con C-TADCTB. Se logró una alta protección mediante la vacunación con ambas proteínas de fusión recombinantes.

Ejemplo 11: Un estudio de fase 1 abierto que evalúa la seguridad, inmunogenicidad y respuesta a la dosis de una composición farmacéutica que comprende C-TAB.G5.1

La composición farmacéutica que comprende C-TAB.G5.1, una proteína de fusión recombinante que consiste en la toxina A y la toxina B de Clostridium difficile (C. difficile) truncada, que se administrará en tres dosis diferentes: 20 jg con Al(OH)3 (aluminio), 75 y 200 jg sin o con Al(OH)3, respectivamente, inyección intramuscular (IM), tres vacunaciones los días 0, 7 y 21.

OBJETIVOS DEL ESTUDIO

Primario:

■ Investigar la seguridad y tolerabilidad de una composición farmacéutica que comprende C-TAB.G5.1 hasta 6 meses después de la tercera vacunación.

Secundario:

■ Investigar la respuesta inmunitaria medida contra el antígeno de la vacuna C-TAB.G5.1 y las toxinas nativas A y B de C. difficile a tres dosis diferentes y dos formulaciones los días 0, 7, 14, 21, 28, 113, 201 después de la primera vacunación para obtener una primera indicación de la dosis y formulación óptimas.

■ Investigar la capacidad de los anticuerpos IgG inducidos por la vacuna C-TAB.G5.1 para neutralizar las toxinas A y B de C. difficile in vitro.

Diseño del estudio

Este es un estudio de fase 1 de escalamiento de dosis, abierto, parcialmente aleatorizado, que consistirá en una parte A en adultos sanos de entre > 18 y < 65 años y una parte B en ancianos sanos > 65 años, siendo este último grupo de edad la población más vulnerable a sufrir infecciones por C. difficile. La parte A se llevará a cabo con el calendario de vacunación los días 0, 7 y 21 en cinco grupos de tratamiento de 12 sujetos adultos sanos para estudiar la seguridad y la respuesta a la dosis de 20 jg de la vacuna C-TAB.G5.1 con adyuvante, y de 75 jg y 200 jg de la vacuna C-TAB.G5.1 con o sin adyuvante, respectivamente. La seguridad y la inmunogenicidad se analizarán después de que todos los sujetos adultos de la parte A hayan recibido la tercera vacunación, todos los datos de seguridad serán revisados por una Junta de Monitoreo de Seguridad de Datos (DSMB) antes de la inscripción de los sujetos de la parte B. Los grupos de tratamiento no seguros o inútiles (es decir, dosis que no inducen respuestas considerables de IgG) se identifican durante el análisis intermedio, estos grupos de tratamiento se eliminarán y no se trasladarán a la parte B.

La parte B del estudio buscará la confirmación de la dosis en la población anciana. En consecuencia, la parte B se llevará a cabo en 5 grupos de tratamiento de 20 sujetos sanos ancianos por grupo. Se aplicará el calendario de vacunación los días 0, 7 y 21. Este diseño de estudio permitirá comparar las respuestas a las dosis tanto en adultos como en ancianos. Este último grupo de edad será la principal población objetivo de una vacuna contra C. difficile, que representa la población más vulnerable para las dos indicaciones objetivo en la vía de desarrollo de una vacuna contra C. difficile, es decir, la prevención de la diarrea recurrente por C. difficile y la prevención de la infección primaria por C. difficile en un enfoque de vacunación preventiva basado en la edad o basado en el riesgo por la edad. Sin embargo, los sujetos de edad avanzada pueden responder menos a la vacunación que los adultos jóvenes; por lo tanto, se requiere la confirmación de la dosis en la población objetivo de edad avanzada desde una etapa de desarrollo temprana. Un análisis intermedio después de que todos los adultos de la parte A hayan sido vacunados permitirá eliminar dosis/formulaciones no seguras o que no induzcan respuestas considerables de IgG en adultos para mitigar el riesgo de exponer a los sujetos del grupo de ancianos a situaciones potencialmente inseguras o dosis inútiles (por ejemplo, dosis más baja) y/o formulaciones (por ejemplo, formulación sin adyuvante) de la vacuna.

La vacuna C-TAB.G5.1 es una solución acuosa de C-TAB.G5.1 en L-Histidina 20 mM, NaCl 75 mM, Sacarosa 5 %, Tween® 80 al 0,025 %; pH 6,5 producida por métodos estándar.

SECUENCIAS:

(Continuación)

(Continuación)

(Continuación)

(Continuación)

(Continuación)

(Continuación)

(Continuación)

(Continuación)

(Continuación)

(Continuación)

(Continuación)

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido aislado que tiene al menos 85 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO: 4, en donde el polipéptido comprende 23 unidades de repetición derivadas del dominio C-terminal de la toxina B de Clostridium diffiále.

2. El polipéptido de la reivindicación 1, en donde dicho polipéptido comprende 19 unidades de repetición derivadas del dominio C-terminal de la toxina A de Clostridium diffiále.

3. El polipéptido de la reivindicación 1, en donde dicho polipéptido tiene al menos 90 %, más preferentemente al menos 95 %, más preferentemente 99 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO: 4.

4. El polipéptido de la reivindicación 1, en donde dicho polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4.

5. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho polipéptido proporciona una supervivencia de un hámster vacunado con dicho polipéptido después de la administración intragástrica de una dosis letal de esporas de C. diffiále en dosis de esporas de 102, 103 y 104.

6. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el polipéptido provoca anticuerpos que se unen a toxinas de C. diffiále nativas y neutralizan su actividad citotóxica.

7. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para uso en medicina.

8. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para su uso en la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad asociada a C. diffiále (CDAD).

9. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para su uso en la prevención de la CDAD en un sujeto con riesgo de CDAD, en donde dicho sujeto es: i) un sujeto anciano o un sujeto menor de 2 años; ii) un sujeto con SIDA; iii) un sujeto que toma o planea tomar fármacos inmunosupresores; iv) un sujeto con hospitalización planificada o un sujeto que se encuentra en el hospital; v) un sujeto que se encuentra o se espera que vaya a una unidad de cuidados intensivos; vi) un sujeto que está siendo sometido o planea someterse a una cirugía gastrointestinal; vii) un sujeto que está o planea ir a un centro de atención a largo plazo, como un hogar de ancianos; viii) un sujeto con comorbilidades que requieren el uso frecuente y/o prolongado de antibióticos; o ix) un sujeto con CDAD recurrente.

10. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para su uso en la prevención y/o tratamiento de la CDAD en un sujeto mayor de 65 años.

11. Un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de los polipéptidos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

12. Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o un ácido nucleico de la reivindicación 11 y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.

13. La composición farmacéutica de la reivindicación 12, en donde dicha composición comprende además un adyuvante.

14. La composición farmacéutica de la reivindicación 13, en donde dicho adyuvante es una sal de aluminio.

15. Un método para producir el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o la composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en donde el método comprende introducir en una célula huésped un ácido nucleico que codifica el polipéptido, cultivar la célula huésped en condiciones que permitan la expresión del polipéptido y aislar el polipéptido.