ES2303514T3

ES2303514T3 - Moduladores e inhibidores de la angiogenesis y la permeabilidad vascular.

Info

Publication number: ES2303514T3
Application number: ES00990365T
Authority: ES
Inventors: David A. Cheresh; Brian Eliceiri; Robert Paul
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1999-12-22
Filing date: 2000-12-22
Publication date: 2008-08-16
Anticipated expiration: 2020-12-22
Also published as: HUP0203957A2; SK287575B6; EP1250155A1; KR100813818B1; DK1250155T3; HU229628B1; CN1434727A; RU2002119399A; DK1905457T3; RU2271216C2; ATE392215T1; CA2395136A1; PL356815A1; NO20023036D0; WO2001045751A1; BR0016547A; EP1905457B1; JP2003518077A; KR20020063259A; DE60038631T2

Abstract

Composición farmacéutica que comprende unido nucleico que puede expresar la proteína tirosina quinasa Src y un ácido nucleico que puede expresar la proteína tirosina quinasa Y es, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Description

Moduladores e inhibidores de la angiogénesis y la permeabilidad vascular.

Referencia cruzada a las solicitudes relacionadas

La presente invención reivindica prioridad a la patente US nº 09/470.881 presentada el 22 de diciembre de 1999, y nº 09/538.248 presentada el 29 de marzo de 2000, reivindicando ambas prioridad a la solicitud de patente internacional nº PCT/US99/11780, que designa a los Estados Unidos de América y fue presentada el 28 de mayo de 1999, que reivindica prioridad a la solicitud

\hbox{provisional US para la patente nº de serie nº
60/087.220  registrada el 29 de mayo de 1998.}

Declaración de los derechos gubernamentales

Parte del trabajo dado a conocer se ha respaldado en parte con subvenciones del NIH en nombre de los Estados Unidos de América. Por consiguiente, el gobierno de los Estados Unidos de América puede tener determinados derechos sobre la presente invención.

Campo técnico

La presente invención se refiere en general al ámbito de la medicina y se refiere específicamente a composiciones destinadas a modular e inhibir la permeabilidad vascular (VP).

Antecedentes

La angiogénesis es un proceso de vascularización de los tejidos que implica el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos en un tejido y al que se hace asimismo referencia como neovascularización. El proceso está mediado por la infiltración de células endoteliales y células de músculo liso. Se cree que el proceso procede en una de tres formas: los vasos pueden brotar de un vaso preexistente, el nuevo desarrollo de vasos puede originarse a partir de células precursoras (vasculogénesis), o se pueden ensanchar en diámetro pequeños vasos ya existentes. [Blood et al. Bioch. Biophys. Acta. 1032:89-118 (1990)]. Para que tenga lugar la angiogénesis, las células endoteliales deben primero degradar y cruzar la membrana basal de los vasos de modo semejante al utilizado por las células tumorales durante la invasión y la generación de metástasis. La angiogénesis generalmente no se produce en los adultos o en los tejidos maduros, aunque si tiene lugar durante la cicatrización y el ciclo de crecimiento del corpus luteum. Ver por ejemplo Moses et al., [Science, 248:1408-1410 (1990)].

Mientras que la angiogénesis es un proceso importante en el crecimiento neonatal, también es importante en la cicatrización y es un factor en la patogénesis de gran número de patologías clínicas que comprenden la inflamación tisular, artritis, crecimiento tumoral, retinopatía diabética, degeneración macular por neovascularización de la retina, y trastornos semejantes. Estas manifestaciones clínicas asociadas a la angiogénesis se refieren como enfermedades angiogénicas. [Folkman et al.,Science, 235:442-447 (1987)].

Se ha propuesto que la inhibición de la angiogénesis podría ser una terapia de utilidad con el fin de restringir el crecimiento tumoral. Se ha propuesto la inhibición de la angiogénesis mediante (1) la inhibición de la liberación de "moléculas angiogénicas" tales como el bFGF (factor de crecimiento fibroblástico básico), (2) la neutralización de las moléculas angiogénicas, tal como mediante la utilización de anticuerpos anti\betabFGF, (3) la utilización de inhibidores del receptor de la vitronectina \alpha_{v}\beta_{3} y (4) la inhibición de la respuesta de las células endoteliales a los estímulos angiogénicos. Esta última estrategia ha recibido atención, Folkman et al., [Cancer Biology, 3:89-96 (1992)], han descrito múltiples inhibidores de la respuesta de las células endoteliales, que comprenden inhibidor de la colágena, inhibidores del reemplazo de la membrana basal, esteroides angiostáticos, inhibidores de la angiogénesis derivados de hongos, factor 4 de las plaquetas, trombospondina, fármacos artríticos tales como la D-penicilinamina y el tiomalato de oro, análogos de la vitamina D_{3}, interferón \alpha y similares, que se pueden utilizar con el fin de inhibir la angiogénesis. Para más inhibidores de la angiogénesis propuestos, [ver Blood et al., Biochem. Biophys. Acta., 1032:89-118 (1990), Moses et al., Science, 248:1408-1410 (1990), Ingber et al., Lab. Invest., 59:44-51 (1988), y las patentes US nº 5.092.885, nº 5.112.946, nº 5.192.744, nº 5.202.352, nº 5.753.230 y nº 5.766.591]. Sin embargo, ninguno de los inhibidores de la angiogénesis descritos en las referencias anteriores implica las proteínas Src.

Se ha informado anteriormente de que la angiogénesis depende de la interacción entre las integrinas vasculares y las proteínas de la matriz extracelular. Brooks et al., [Science, 264:569-571(1994)]. Además, se ha informado de que la muerte celular programada (apoptosis) de las células vasculares angiogénicas se inicia mediante la interacción, que se inhibiría mediante ciertos antagonistas de la integrina vascular \alpha_{v}\beta_{3}. [Brooks et al, Cell, 79:1157-1164 (1994)]. Más recientemente, se ha informado de que la unión de la metaloproteinasa-2 de matriz (MMP-2) al receptor de la vitronectina (\alpha_{v}\beta_{5}) se puede inhibir mediante la utilización de antagonistas de la \alpha_{v}\beta_{5} inhibiendo así la función enzimática de la proteinasa. [Brooks et al., Cell, 85:683-693 (1996)]. Las integrinas \alpha_{v} se han identificado como componentes importantes de la supervivencia de las células endoteliales en los vasos sanguíneos angiogénicos. Los antagonistas de las integrinas específicos de la integrina \alpha_{v} bloquean las sendas angiogénicas inducidas por factores de crecimiento discretos. Por ejemplo, la angiogénesis inducida por el factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) se bloquea mediante los antagonistas de la integrina \alpha_{v}\beta_{5}, mientras que la angiogénesis inducida por el factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF) se bloquea mediante los antagonistas de la integrina \alpha_{v}\beta_{3}.

El sistema vascular cerebral está caracterizado porque presenta una barrera hetamoencefálica muy restrictiva que prohibe la extravasación de pequeñas moléculas en los tejidos cerebrales circundantes. La naturaleza de la barrera hematoencefálica de los mamíferos ha recibido atención específica en los estudios farmacológicos, ya que debido a la elevada restrictividad de la barrera hetamoencefálica, evita rutinariamente el paso de muchos fármacos del sistema vascular al tejido cerebral. La presente invención implica el inesperado descubrimiento de que la VP, tal como se mide mediante el escape vascular de sangre, se puede modular mediante Src o Yes. Además, la VP ha sido asociada a la angiogénesis y otras patologías. El incremento en la permeabilidad vascular inducida por la inflamación está asociado con edema e hinchazón.

La necesidad de actividad de tirosina quinasa Src para la angiogénesis inducida por VEGF, pero no por bFGF, demostró la existencia de una diferencia significativa en la regulación y en las señales de activación entre estas sendas, tanto en los modelos de embrión de poyo como de ratón [Eliceiri et al., Molecular Cell, 4:915-924 (1999)].

Los cambios en la permeabilidad vascular debidos a las señales angiogénicas de las células tumorales han proporcionado un modelo para examinar las sendas de señalización relacionadas con el cáncer, sin embargo, la permeabilidad vascular debida al daño, la enfermedad u otros traumas de los vasos sanguíneos es la causa principal de pérdida vascular y edema asociada con el daño tisular. Por ejemplo, la enfermedad cerebrovascular asociada con el accidente cerebrovascular (CVA) u otro daño vascular en el cerebro o tejido espinal son las causas más comunes de trastorno neurológico y una de las principales fuentes de discapacidad. Típicamente, el daño del tejido cerebral o espinal en la región de un CVA implica la pérdida vascular y/o el edema. Típicamente, el CVA puede comprender daño causado por isquemia cerebral, interrupción del flujo sanguíneo normal al cerebro; la insuficiencia cerebral debida a perturbaciones transitorias en el flujo; infarto, debido a embolismo o trombosis de las arterias craneales internas o externas; hemorragia y malformaciones arteriovenosas. La embolia isquémica y la hemorragia cerebral pueden ocurrir súbitamente y el impacto del incidente

\hbox{refleja generalmente la zona  dañada del cerebro. [ver el
Manual Merk, 16ª ed. Capítulo. 123, (1992)].}

Además del CVA, las infecciones o enfermedades del sistema nervioso central (SNC) también pueden afectar los vasos sanguíneos del cerebro y la columna espinal y pueden implicar inflamación y edema, tal como por ejemplo la meningitis bacteriana, encefalitis vírica y la formación de abscesos cerebrales. [ver el Merk Manual, 16ª ed., Capítulo 125, (1992)]. Los trastornos sistémicos también pueden debilitar los vasos sanguíneos y conducir a la pérdida vascular y edema, tal como la diabetes, trastornos de riñón, aterosclerosis y semejantes. Por consiguiente, la pérdida vascular y el edema son patologías críticas, diferentes e independientes del cáncer, que necesitan intervención terapéutica específica efectiva en asociación con una multiplicidad de heridas, traumas o enfermedades.

Se ha descubierto que la inhibición selectiva de la actividad de la familia Src de tirosina quinasas reduce el daño o trauma asociado al incremento de VP en los tejidos y produce una disminución de la patología relacionada con la pérdida y/o edema de los vasos sanguíneos.

Sumario de la invención

Un aspecto de la presente invención comprende una composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico que puede expresar la proteína tirosina quinasa Src y un ácido nucleico que puede expresar la proteína tirosina quinasa Yes, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Los ácidos nucleicos expresables que codifican las proteínas Src o Yes pueden comprender segmentos de ácido nucleico que describen la totalidad o parte de las proteínas Yes o Src. Cuando son transferidas dentro de las células diana, las células diana transcriben y traducen la secuencia de ácido nucleico para expresar la proteína deseada.

Cuando la modulación es una potenciación o un incremento de la permeabilidad vascular de los vasos sanguíneos en el tejido diana, el ácido nucleico que codifica Src codificará formas activas de Src y el ácido nucleico que codifica Yes codificará formas activas de las protéinas quinasas Yes. Una vez transferidas dentro de la célula huésped diana, los ácidos nucleicos serán expresados por la célula huésped. Un ácido nucleico preferido que codifica Src codifica proteína Src A activa. Otro ácido nucleico preferido que codifica Src codifica un Src mutante activo en el que el residuo de aminoácido en la posición 527 de la proteína Src expresada es un residuo de un aminoácido cualquiera excepto tirosina, serina o treonina. Un ácido nucleico preferido que codifica Yes codificará el tipo silvestre de la proteína, o una proteína modificada que elimina o inhibe el lugar de fosforilación inactivador de la proteína Yes, de modo semejante a la mutación en la posición 527 de la Src descrita.

Cuando la modulación deseada es una inhibición o disminución de la permeabilidad vascular de los vasos sanguíneos en el tejido diana, un ácido nucleico preferido que codifica Src inactiva codifica la proteína Src 251. Otro ácido nucleico preferido que codifica Src inactiva codifica Src K295M inactiva. Un ácido nucleico preferido que codifica Yes inactiva codifica una proteína que tiene una actividad quinasa reducida.

Se prevé que las composiciones de la presente invención pueden comprender una mezcla de ácidos nucleicos, en la que dicho ácido nucleico puede comprender un gen expresable de Src o Yes. Además, se prevé que un solo ácido nucleico puede comprender un ácido nucleico que codifica tanto una proteína Src como un ácido nucleico que codifica una proteína Yes. Para una modulación refinada de la angiogénesis y VP en los tejidos diana, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden comprender una mezcla de ácidos nucleicos que pueden expresar proteína de tirosina quinasa Src o proteína de tirosina quinasa Yes, activas o inactivas.

Mediante la utilización de promotores de expresión diferencial u otros elementos reguladores de este tipo, se puede coadministrar un primer gen de tirosina quinasa de baja expresión con un segundo gen de tirosina quinasa de elevada expresión, según describe la presente invención. En esta forma de realización se puede lograr un incremento de la angiogénesis a la vez que se mantiene, minimiza o reduce VP, mediante la utilización de un primer gen activo de Src de baja expresión, en combinación con un segundo gen Yes inactivo de elevada expresión. Esta coadministración se puede lograr mediante la utilización de vectores de expresión separados o de una sola construcción de vector combinado. Se modo semejante, se puede lograr una disminución de la angiogénesis a la vez que se mantiene, potencia o incrementa la VP, mediante la utilización de un primer gen de Src inactivo de baja expresión, en combinación con un segundo gen Yes activo de elevada expresión. Se pueden lograr todavía más grados de modulación mediante las múltiples permutaciones de alta/baja y Src/Yes, en combinación con la selección de la actividad de los elementos promotores y promotores inducibles.

Se prevé que los genes Src y Yes individuales pueden estar regulados bajo el control de la misma o diferentes secuencias de ácidos nucleicos tales como, pero sin resultar limitativo, elementos amplificadores, represores y promotores. Cuando las dos o más proteínas son expresables a partir de un único vector, se prevé que la regulación y el control de la transcripción de los genes de proteínas independientes pueden estar bajo el control de los mismos elementos reguladores. También se prevé que la regulación y el control de la transcripción se pueden efectuar mediante dos o más elementos reguladores funcionando independientemente. Los elementos reguladores son conocidos en la materia y pueden ser secuencias de ácidos nucleicos activas constitutivamente o inducibles, amplificadoras, promotoras, supresoras o semejantes.

Se prevé que las composiciones de ácidos nucleicos de la presente invención pueden comprender vectores de transferencia génica víricos y/o no víricos que comprenden un segmento de ácido nucleico que codifica una proteína Src y/o Yes. En la materia se conocen vectores retrovíricos y no víricos de transferencia génica y expresión, descritos brevemente a continuación.

Una secuencia de ácidos nucleicos preferida codifica la proteína Src-A. Otra proteína Src activa preferida es una en la que el residuo de aminoácido en la posición 527 de la proteína Src es un residuo de aminoácido cualquiera excepto tirosina, serina o treonina.

Se prevé que una mezcla de ácidos nucleicos que codifican las proteínas Src y Yes puede combinar formas de proteínas activas e inactivas, dependiendo del nivel de modulación deseado y del efecto coordinado sobre la angiogénesis y VP que se desea, según lo descrito en la presente invención.

Cuando la proteína Src o Yes es inactiva o se inhibe, la modulación es la inhibición de VP. Cuando la proteína Src o Yes es activa o se activa, la modulación es la potenciación de VP.

Cuando el efecto modulador terapéutico efectivo de VP deseado es un incremento o potenciación de VP, se contempla que se pueden administrar ácidos nucleicos que codifican formas activas de la proteína Src y/o Yes.

El tejido que se debe tratar puede ser un tejido cualquiera en el que se desea la modulación de VP. El tratamiento terapéutico se logra poniendo en contacto el tejido diana con una cantidad efectiva de la composición moduladora, y se permite tiempo de contacto suficiente para que los componentes de ácido nucleico de la composición farmacéutica penetren en el tejido diana. Con el fin de inhibir VP, es de utilidad tratar el tejido enfermo en el que tiene lugar el efecto negativo de la pérdida vascular. Los tejidos ejemplares comprenden tejido inflamado, tejidos asociados a infarto, infarto de miocardio u otros bloqueos del flujo normal, tejidos que sufren restenosis y tejidos semejantes.

Con el fin de potenciar, es de utilidad tratar a los pacientes con extremidades isquémicas con pobre circulación en las extremidades debida a diabetes u otros trastornos, o con el fin de potenciar la administración de fármacos en el cerebro a través de la barrera hetamoencefálica. También se pueden tratar los pacientes con heridas crónicas que no cicatrizan y por consiguiente se podrían beneficiar de un incremento en la proliferación de las células vasculares y la neovascularización modulada por VP.

Otro aspecto de la presente invención comprende la utilización de un ácido nucleico que puede expresar una proteína tirosina quinasa Yes inactiva, o una mezcla de proteína tirosina quinasa Src inactiva y Yes, con el fin de preparar una composición farmacéutica destinada al tratamiento de un trastorno patológico seleccionado de entre el grupo constituido por daño inducido por isquemia, crecimiento tumoral, infarto de miocardio, aterosclerosis, edema cerebral, enfermedad o trauma cerebral, artritis reumatoide, retinopatía diabética, enfermedades inflamatorias, restenosis, hemorragia cerebral, trauma cerebral y espinal, daño cerebral y espinal inducido por hipoxia, trastornos inflamatorios del SNC, infecciones víricas y bacterianas del SNC, trastornos autoinmunes, enfermedades con incremento crónico de la permeabilidad de la barrera hetamoencefálica y síndrome de dificultad respiratoria del adulto (SDRA); mediante la inhibición de la permeabilidad vascular en el tejido diana.

La presente invención también comprende la utilización de un ácido nucleico que puede expresar una proteína tirosina quinasa Yes activa, o una mezcla de proteínas tirosina quinasa Src y Yes con el fin de preparar una composición farmacéutica destinada al tratamiento de un trastorno patológico seleccionado de entre el grupo constituido por isquemia de las extremidades y heridas crónicas mediante la potenciación de la permeabilidad vascular en un tejido diana.

Todavía otro aspecto de la presente invención son los artículos de fabricación que comprenden material de embalaje y composición farmacéutica comprendida en dicho material de embalaje, en el que dicha composición farmacéutica es que puede modular la permeabilidad vascular en un tejido que sufre una enfermedad, en la que dicho material de embalaje comprende una etiqueta que indica que dicha composición farmacéutica se puede utilizar con el fin de tratar enfermedades mediante la modulación de la permeabilidad vascular y en la que dicha composición farmacéutica comprende un cantidad terapéuticamente efectiva de un ácido nucleico que puede expresar la proteína tirosina quinasa Yes, en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Esta forma de realización comprende ácidos nucleicos que codifican una proteína Yes activa o inactiva. Tanto los vectores de transferencia/expresión retrovíricos como los no víricos pueden comprender un segmento de ácido nucleico que codifica una proteína Yes, tanto en forma activa como en forma inactiva o las dos. Cuando dichas formas activas e inactivas de un gen de proteína quinasa se encuentran presentes, se contempla que los genes estén bajo la regulación de diferentes promotores inducibles con el fin de permitir la expresión alternativa de uno otro, según se desee.

De manera similar, otro aspecto de la presente invención son artículos manufacturados en los que la composición farmacéutica comprende un ácido nucleico que puede expresar proteína tirosina quinasa Src y Yes, en una vehículo farmacéutico aceptable. Un componente de ácido nucleico preferido de la composición farmacéutica del presente artículo de fabricación codifica una proteína Src activa, en la que la modulación deseada es la potenciación o activación de VP. También se prevé ácido nucleico que codifican proteína Yes activa. Una forma preferida de Src activa es la proteína Src-A. Otro ácido nucleico preferido que codifica Src activo es uno en el que el residuo de aminoácido en la posición 527 de la proteína Src es un residuo de cualquier aminoácido excepto tirosina, serina o treonina. También se prevé que se pueda construir un solo ácido nucleico que exprese tanto Yes como Src, cualquiera de los dos independientemente regulado, o bajo el control transcripcional del mismo promotor, amplificador, supresor, represor u otra secuencia reguladora de ácido nucleico adecuada.

El daño tisular relacionado a la pérdida vascular y/o el edema asociado a los cambios negativos en la permeabilidad vascular se puede reducir mediante un inhibidor de la familia Src de tirosina quinasas. El daño tisular debido a la pérdida vascular o al edema se puede reducir de este modo.

Cualquier patología que implique un incremento nocivo en la permeabilidad vascular inducido por una herida y el daño tisular debido a la pérdida vascular o al edema se puede tratar según la presente invención. Dichos eventos patológicos pueden incluir trauma de los vasos sanguíneos tal como una ligación física, bloqueo, separación, oclusión, trauma y semejantes.

Otros eventos patológicos sistémicos tales como aterosclerosis, retinopatía diabética, enfermedad inflamatoria debida a infección por agentes microbianos, artritis y semejantes se tratan también adecuadamente según la presente invención.

La presente invención es de utilidad con el fin de tratar la enfermedad cerebrovascular o el trauma mediante la disminución del daño tisular debido al incremento de la pérdida vascular y/o el edema asociado a este. En particular, la presente invención es de utilidad para reducir el daño tisular asociado a la inducción de la permeabilidad vascular inducida por el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y mediada por Src. Sin embargo, la presente invención no queda limitada al incremento en la permeabilidad vascular inducido por VEGF, y también es apropiada con el fin modular el incremento en la permeabilidad vascular mediado por la familia Src de tirosina quinasas en respuesta a otras señales reguladoras.

En particular, mediante la inhibición de la tirosina quinasa Src, (también referida genéricamente en la presente memoria como Src), y la tirosina quinasa Yes, próximamente relacionada, (también referida genéricamente en la presente memoria como Yes), se puede modular el tejido tratado específicamente con el fin de inhibir en el mismo el incremento en la permeabilidad vascular asociado al daño o la enfermedad.

Un ácido nucleico que codifica una proteína inhibidora de una tirosina quinasa de la familia Src tal como una proteína Src inactiva o Yes inactiva es adecuado para la modulación de la permeabilidad vascular en un tejido. Dichos ácidos nucleicos inhibidores de la actividad tirosina quinasa de la familia Src pueden comprender uno o más vectores retrovíricos de expresión, vectores no víricos de expresión o semejantes. Tales ácidos nucleicos inhibidores pueden comprender las señales adecuadas, tales como promotores o amplificadores para uno o más segmentos de ácido nucleico expresables, en cualquier ácido nucleico dado.

Un artículo de fabricación según la presente invención puede comprender como parte de la composición farmacéutica un inhibidor de la tirosina quinasa de la familia Src que es un inhibidor químico. En particular, un inhibidor químico preferido de la tirosina quinasa de la familia Src se selecciona de entre el grupo constituido por PP1, PP2, PD173955, AGL1872, PD162531, Radicicol R2146 y Geldanamicina, o compuestos con una actividad inhibidora similar de Src. Un inhibidor muy preferido es PP1.

La composición farmacéutica del artículo de fabricación puede oscilar dependiendo del efecto modulador o inhibidor deseado y el embalaje y etiquetado cambiará también en consecuencia.

Breve descripción de los dibujos

En los dibujos que comprenden una parte de la presente publicación:

La Fig. 1 es una secuencia de ADNc de c-Src de pollo que consiste en la secuencia codificante completa sin los intrones tal como describen Takeya et al., Cell, 32:881-890 (1983). La secuencia se encuentra disponible a través del Número de Ascensión J0084 del GenBank. La secuencia comprende 1759 nucleótidos con la parte que codifica la proteína comenzando y terminando en las posiciones 112 y 1713, respectivamente (SEC ID nº:2).

La Fig. 2 es la secuencia de residuos de aminoácidos del c-Src de pollo codificada por la secuencia mostrada en la Fig. 1 (SEC ID nº:3).

La Fig. 3 es una secuencia de ADNc de c-Src humano que fue inicialmente descrita por Braeuninger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:10411-10415 (1991). La secuencia se encuentra disponible mediante el Número de Ascensión X59932 X71157 del GenBank. La secuencia comprende 2178 nucleótidos con la parte que codifica proteína comenzando y terminando en las posiciones de nucleótidos 134 y 1486, respectivamente (SEC ID nº:4).

La Fig. 4 es la secuencia de residuos de aminoácido codificada por el c-Src humano con la secuencia codificante mostrada en la Fig. 3 (SEC ID nº:5).

La Fig. 5 ilustra la activación de Src endógeno por bFGF o VEGF tal como se describe en el Ejemplo 4. La parte superior de la figura muestra el resultado de un ensayo in vitro de quinasa con el incremento en la activación del c-Src endógeno por bFGF y VEGF. La parte inferior de la figura es la transferencia del ensayo de quinasa detectado con un anticuerpo antiSrc como control de carga para el contenido equivalente de Src y IgG.

La Fig. 6 ilustra el efecto de la expresión del gen c-Src A mediada por retrovirus del sobre la angiogénesis en CAM de pollo tal como se describe en el Ejemplo 4. Se expusieron CAM de pollo de nueve días a retrovirus RCAS-Src A (c-Src mutado activo) o control RCAS-GFP (proteína verde fluorescente; una proteína fluorescente trazadora) o a tampón durante 72 horas. El nivel de angiogénesis se cuantificó como se indica en la Fig. 6A con microfotografías representativas (4X) en la Fig. 6B correspondientes a cada uno de los tratamientos, tomadas con un microscopio estereoscópico.

La Fig. 7 ilustra la expresión retrovírica de c-Src A en la activación de la fosforilación de la quinasa MAP vascular. La Fig. 7A muestra extractos de tejido de CAM de pollos de 10 días que han sido expuestos a VEGF o PMA durante 30 minutos o infectados con retrovirus c-Src A durante 48 horas. NT se refiere a "sin tratamiento". Se inmunoprecipitó Src de cantidades equivalentes de extracto de proteína total y se sometió a un ensayo de quinasa con complejo inmune in vitro utilizando una proteína de fusión FAK-GST como sustrato, sometido a electroforesis y transferido a nitrocelulosa. Se midieron también alícuotas del anterior homogeneizado total de tejido para determinar fosforilación de ERK endógena mediante inmunotransferencia, mediante un anticuerpo antifosfo-ERK. La Figura 7B muestra CAM de 10 días de vida que han sido infectadas con RCAS simulado o RCAS que comprendía Src A. Después de dos días, se disecaron las CAM, se criopreservaron en OCT y se seccionaron a 4 \mum. Las secciones se inmunotiñeron con un anticuerpo antiERK fosforilado (New England Biolabs), se lavaron y se detectaron con un anticuerpo secundario de cabra anticonejo conjugado a FITC. Las imágenes de fluorescencia se capturaron con una cámara de CCD enfriado (Princeton Inst.).

La Fig. 8 ilustra el requerimiento selectivo de actividad Src durante la angiogénesis inducida por VEGF, pero no inducida por bFGF. Se expusieron CAM de pollos de 9 días a retrovirus RCAS-Src 251 o RCAS-GFP control o a tampón durante 20 horas y a continuación se incubaron durante 72 horas adicionales en presencia o ausencia de bFGF o VEGF. El nivel de angiogénesis se cuantificó (Fig. 8A) tal como se describió anteriormente, y se tomaron microfotografías (6x) con un estéreomicroscopio tal como se muestra en la Fig. 8B. la Fig. 8C muestra una transferencia explorada mediante un anticuerpo antiSrc con el fin de confirmar la expresión de Src 251 en las células transfectadas en comparación con tratamientos simulados.

La Fig. 9 ilustra los resultados de la administración de retrovirus de RCAS-Src 251 a tumores humanos. La Fig. 9A es una microfotografía que muestra un fragmento de tumor de meduloblastoma humano infectado con RCAS-GFP (RCAS-Proteína Verde Fluorescente) que expresa GFP exclusivamente en los vasos sanguíneos del tumor (flechas) según se detecta mediante secciones ópticas con un microscopio confocal láser de barrido Bio Rad (barra = 500 \mum). La Fig. 9B describe los datos de tumores tratados mediante aplicación tópica de retrovirus, que se dejaron crecer durante entre 3 ó 6 días después de los cuales se extrajeron y se determinaron los pesos en húmedo. Los datos se expresan como el cambio medio en peso tumoral (desde el peso inicial del tumor de 50 mg) +/- SEM de 2 réplicas. La Fig. 9C describe en microfotografías representativas tumores de meduloblastoma extraídos quirúrgicamente de embriones (barra = 350 \mum). Los paneles inferiores son vistas amplificadas de cada tumor mostrando en detalle la vascularidad de cada tumor (barra = 350 \mum). Las flechas indican la destrucción de vasos sanguíneos en tumores tratados con RCAS-Src 251.

La Fig. 10 es un diagrama ilustrativo de un mapa de restricción de la construcción de vector RCASBP (RCAS) (SEC ID nº:1).

La Fig. 11 describe la secuencia codificada de residuos de aminoácidos de la proteína c-Yes humana mediante una representación de los aminoácidos con una sola letra (SEC ID nº:8).

La Fig. 12 describe la secuencia de ácido nucleico del un ADNc que codifica la proteína c-Yes humana. La secuencia es accesible mediante el número de accesión M15990 del GenBank. La secuencia comprende 4517 nucleótidos con la parte que codifica la proteína comenzando y terminando en las posiciones de nucleótidos 208 y 1839 respectivamente, y que se traduce en la secuencia de aminoácidos descrita en la Fig. 11 (SEC ID nº:7).

La Fig. 13 describe los resultados de la administración retrovírica de Src 251 y CSK en un modelo de angiogénesis subcutánea murina. La Fig. 13A ilustra los resultados de inmunotransferencia con el fin de detectar expresión de flk. La Fig. 13B ilustra los resultados de inmunotransferencia de un ensayo de flk bajo condiciones de estimulación mediante VEGF y bFGF. La Fig. 13c es una gráfica del número de vasos sanguíneos CD34 positivos (promedio de campos al azar por triplicado a 20x) mediante tratamiento de estimulación con VEGF y bFGF en presencia de GFP, Src 251 o retrovirus CSK.

La Fig. 14 ilustra los resultados de un ensayo Miles modificado para VP de VEGF en la piel de ratones deficiente en Src, fyn y Yes. La Fig. 14A comprende fotografías de orejas tratadas. La Fig. 14B comprende gráficas de resultados experimentales de estimulación de múltiples ratones deficientes. La Fig. 14C representa gráficamente la cantidad de colorante azul de Evan extraído mediante el tratamiento.

La Fig. 15 es una gráfica que describe el tamaño relativo de infarto en ratones tratados de tipo Src +/-, Src -/-, silvestre (wt) y PP1. El tratamiento con PP1 consistió en 1,5 mg/kg peso corporal.

La Fig. 16 describe rastreos secuenciales de MRI de cerebros de ratón control y tratado con PP1 mostrando menos infarto cerebral en los animales tratados con PP1 (derecha) que en los animales control (izquierda).

Descripción detallada de la invención A. Definiciones

Residuo de aminoácido: un aminoácido generado mediante digestión química (hidrólisis) de un polipéptido en su enlace peptídico. Los residuos de aminoácido descritos en la presente memoria son preferentemente las formas isoméricas "L". Sin embargo, se pueden sustituir residuos en forma de isómeros "D" por residuos de aminoácido-L, siempre y cuando el polipéptido retenga la propiedad funcional deseada. NH_{2} se refiere al grupo amino libre presente en el extremo amino de un polipéptido. COOH se refiere al grupo carboxilo libre presente en el extremo carboxilo de un polipéptido. De acuerdo con la nomenclatura estándar de polipéptidos (descrita en J. Biol Chem. 243:3552-59 (1969) y adoptada en 37 CFR \NAK1,822 (b) (2)).

Se debe subrayar que todas las secuencias de residuos de aminoácido se representan en la presente memoria mediante fórmulas cuya orientación de izquierda a derecha corresponde con la dirección convencional de amino terminal a carboxiterminal. Además, se debe subrayar que un guión al principio o final de una secuencia de residuos de aminoácido indica un enlace peptídico a otra secuencia de uno o más residuos de aminoácido.

Polipéptido: se refiere a una serie lineal de residuos de aminoácido conectados unos a otros mediante enlaces peptídicos entre el grupo \alpha-amino y el grupo carboxi de residuos de aminoácidos contiguos.

Péptido: tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una serie lineal de no más de aproximadamente 50 residuos de aminoácido conectados uno a otro como en un polipéptido.

Péptido cíclico: se refiere a un compuesto con estructura de anillo heteroatómico que comprende múltiples enlaces amídicos como en un polipéptido típico. El péptido cíclico puede ser homodético "cabeza a cola", péptido ciclado en el que el extremo N-amino de un péptido lineal ha formado un enlace amida con el carboxilato c-terminal del péptido lineal, o puede comprender una estructura de anillo en la que el polímero es heterodético y comprende enlaces amida y/o otros enlaces para cerrar el amillo, tales como puentes disulfuro, tioésteres, tioamidas, guanidino y enlaces semejantes.

Proteína: se refiere a una serie lineal de más de 50 residuos de aminoácido unidos uno a otro como en un polipéptido.

Proteína de fusión: Se refiere a un polipéptido que comprende por lo menos dos dominios de polipéptido operacionalmente unidos mediante un enlace peptídico típico ("fusionados"), en el que los dos dominios corresponden a péptidos que no se encuentran naturalmente fusionados.

Péptido sintético: se refiere a una cadena de residuos de aminoácido químicamente producida unidos mediante enlaces peptídicos que se encuentra libre de proteínas naturales y fragmentos de las mismas.

B. Consideraciones generales

La presente invención se refiere en general a: (1) el descubrimiento de que la VP inducido por VEGF está específicamente mediado por las proteínas tirosina quinasas Src y Yes y que se puede modular la VP proporcionando proteínas Src y Yes tanto activas como inactivas con el fin de potenciar o inhibir la angiogénesis, respectivamente; (2) el descubrimiento adicional de que la pérdida vascular y/o el edema asociado con el trauma, el incremento en la permeabilidad vascular relacionado a la enfermedad o la herida se puede modular específicamente y reducir mediante la inhibición de la actividad tirosina quinasa de la familia Src; (3) el descubrimiento de que la administración in vivo de un inhibidor de la tirosina quinasa de la familia Src disminuye el daño tisular debido al incremento en la permeabilidad vascular resultante de las enfermedades o las heridas, no asociado al cáncer o la angiogénesis.

Este descubrimiento es importante debido a la función que tiene la permeabilidad vascular en una multiplicidad de procesos de enfermedad y en asociación con la angiogénesis, la formación de nuevos vasos sanguíneos. Cuando un tejido asociado a un trastorno necesita angiogénesis para el crecimiento del tejido, es deseable inhibir la angiogénesis y de este modo inhibir el crecimiento del tejido enfermo. La angiogénesis se puede inhibir más eficazmente mediante la inhibición simultánea de la VP. Cuando el tejido dañado necesita angiogénesis para su crecimiento y cicatrización, es deseable potenciar o promover la VP y así, la angiogénesis, y de este modo promocionar la cicatrización del tejido y su crecimiento.

Cuando el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos es la causa de, o contribuye a, la patología asociada a un tejido enfermo, la inhibición de la VP y de este modo la angiogénesis, reducirá los efectos negativos de la enfermedad. Mediante la inhibición de la VP asociada a la angiogénesis, se puede intervenir en la enfermedad, disminuir los síntomas y en algunos casos curar la enfermedad.

En ciertos casos, es deseable un incremento de la VP con el fin de incrementar la eficacia de la administración de fármacos por vía de administración sistémica. La barrera hematoencefálica es un término utilizado para describir la ajustada regulación de la VP, y por tanto el mínimo acceso de incluso moléculas pequeñas al cerebro desde la circulación. La capacidad de modular selectivamente y específicamente la permeabilidad de la barrera hematoencefálica mediante la modulación de la VP de los vasos sanguíneos implicados permitirá la administración de fármacos que de otro modo no podrán pasar a través de la circulación al tejido cerebral.

De modo semejante, muchas patologías inducidas por la embolia y el heridas está instigado por el rápido incremento de la VP, y en consecuencia, la capacidad de modular la VP específicamente permitirá tratamientos nuevos y efectivos destinados a reducir los afectos negativos del infarto.

La terapia descrita en la presente memoria es efectiva en parte porque es altamente efectiva para la VP y no para otros procesos biológicos.

La presente invención se refiere, en parte, al descubrimiento de que la angiogénesis está mediada por la proteína tirosina quinasa Src, y que la angiogénesis se puede modular mediante la administración de proteínas Src activas o inactivas destinadas a potenciar o inhibir la angiogénesis, respectivamente.

Este descubrimiento es importante debido a la función que la angiogénesis, la formación de nuevos vasos sanguíneos, tiene en una multiplicidad de procesos de enfermedad. Cuando el tejido asociado a una enfermedad necesita angiogénesis para el crecimiento del tejido, es deseable inhibir la angiogénesis y de este modo inhibir el crecimiento del tejido enfermo. Cuando el tejido dañado necesita angiogénesis para el crecimiento del tejido y la curación, es deseable potenciar o promover la angiogénesis y de este modo promover la curación del tejido y el crecimiento.

Cuando el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos es la causa de, o contribuye a, la patología asociada a un tejido enfermo, la inhibición de la angiogénesis reducirá los efectos dañinos del tejido. Mediante la inhibición de la angiogénesis, se puede intervenir en la enfermedad, reducir los síntomas y en algunos casos curar la enfermedad.

Los ejemplos de tejidos asociados a enfermedades y neovascularización que se beneficiarían de la modulación inhibitoria de la angiogénesis comprenden la artritis reumatoide, retinopatía diabética, enfermedades inflamatorias, restenosis y semejantes. Cuando es necesario el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos es necesario para apoyar el crecimiento de los tejidos nocivos, la inhibición de la angiogénesis reducirá el aporte sanguíneo a tejido y de este modo contribuirá a reducir la masa de tejido que depende del aporte sanguíneo. Los ejemplos comprenden el crecimiento de los tumores en los que la neovascularización es una necesidad continua para que el tumor crezca más allá de pocos milímetros de grosor y para el establecimiento de tumores sólidos y metástasis.

Cuando el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos se cree que contribuye a curar un tejido, la potenciación de la angiogénesis asistirá en la curación. Los ejemplos comprenden el tratamiento de los pacientes con extremidades isquémicas en las que hay una circulación deficiente en la extremidad debida a diabetes u otros trastornos. También se contemplan pacientes con heridas crónicas que no se curan y por consiguiente podrían beneficiarse de un incremento en la proliferación de las células vasculares y en la neovascularización.

La terapia descrita en la presente memoria es efectiva en parte debido a que es muy selectiva para la angiogénesis y no para otros procesos biológicos.

Tal como se describió anteriormente, la angiogénesis comprende una multiplicidad de procesos que implican neovascularización del un tejido, lo que comprende brote, vasculogénesis, o agrandamiento de los vasos, estando todos estos procesos angiogénicos afectados por la proteína Src. Con excepción de la curación de las heridas traumáticas, la formación de corpus luteum y la embriogénesis, se cree que la mayoría de los procesos angiogénicos están asociados con procesos de enfermedad y por consiguiente la terapia descrita en la presente memoria es selectiva para la enfermedad y no tiene efectos secundarios negativos.

La presente invención se refiere también, en parte, al descubrimiento de que la pérdida vascular y/o el edema asociado al trauma, el incremento de la permeabilidad vascular relacionado con la enfermedad o la herida, se puede modular específicamente y reducir mediante la inhibición de la actividad tirosina quinasa de la familia Src. En particular, la presente invención se refiere al descubrimiento de que la administración in vivo de un inhibidor de la tirosina quinasa de la familia Src disminuye el daño tisular debido a enfermedad- o al incremento en la permeabilidad vascular relacionado con las heridas, que no está asociado con el cáncer o la angiogénesis.

Mientras que la administración de un inhibidor de la tirosina quinasa de la familia Src modula el incremento de la VP inducido por VEGF, la inhibición específica de la actividad quinasa de la familia Src disminuye el daño al tejido circundante debido a la pérdida vascular y/o el edema, sin embargo, se activa la señal de quinasa de la familia Src.

La permeabilidad vascular está implicada en una multiplicidad de procesos de enfermedad independientemente de cualquier asociación directa con la angiogénesis. Por ejemplo, muchas patologías y daños inducidos por la apoplejía son consecuencia del rápido incremento en la VP debido al trauma de los vasos sanguíneos y por consiguiente la capacidad de modular específicamente la VP permitirá tratamientos nuevos y efectivos destinados a reducir los efectos negativos de la apoplejía.

Los ejemplos de tejidos asociados con enfermedad o daño inducido por pérdida vascular y/o edema que se beneficiarían de una modulación inhibitoria específica utilizando un inhibidor de la quinasa de la familia Src comprenden la artritis reumatoide, retinopatía diabética, enfermedad inflamatoria, restenosis y semejantes.

El trauma a la cabeza o espina dorsal y otros accidentes cerebrovasculares causados típicamente por eventos isquémicos o hemorrágicos, son una de las causas principales de trastornos neurológicos y daños relacionados. El edema cerebral o la pérdida vascular resultante de tales heridas, son patologías que amenazan la vida y producen daño sistémico y diseminado en el cerebro y la espina dorsal (sistema nervioso central; SNC) y la capacidad de modular específicamente los efectos perjudiciales en los tejidos debidos a la pérdida vascular y el edema en tales casos es de gran utilidad.

Las infecciones del SNC, meningitis, cerebritos, encefalitis, pueden producir patologías negativas que comprenden edema cerebral. El tratamiento de la infección subyacente se puede suplir con una terapia específica destinada a reducir la pérdida vascular o el edema.

Se ha publicado que la neutralización sistémica de la proteína VEGF utilizando una proteína de fusión receptor de VEGF-IgG reduce el tamaño del infarto después de una isquemia cerebral, este efecto se atribuyó a la reducción de la permeabilidad vascular mediada por VEGF. N. van Bruggen et al., J. Clin. Inves. 104:1613-1620 (1999). Sin embargo, el VEGF no es el mediador crítico del incremento en la permeabilidad vascular que se ha descubierto que es Src.

Otras enfermedades o trastornos en los que está implicado el incremento en la permeabilidad vascular mediado por Src y son por consiguiente dianas adecuadas para el tratamiento mediante las composiciones de la presente invención pueden comprender: hemorragia cerebral, trauma cerebral y espinal, daño cerebral y espinal inducido por hipoxia, trastornos inflamatorios del SNC; infecciones víricas o bacterianas (por ejemplo, meningitis, encefalopatía VIH), trastornos autoinmunes (por ejemplo, esclerosis múltiple); enfermedades con un incremento crónico de la permeabilidad de la barrera hematoencefálica (por ejemplo, Morbos Alzheimer); como agente protector en los tratamientos quirúrgicos en los que se necesita una interrupción temporal de la perfusión u oxigenación del tejido; síndrome de dificultad respiratoria del adulto (SDRA); artritis reumatoide y retinopatía diabética.

C. Proteínas tirosina quinasa de la familia Src

Una proteína tirosina quinasa de utilización en la presente invención puede oscilar según la utilización que se pretende. Los términos "proteína Src" o "Src" se refieren colectivamente a las múltiples formas de la proteína tirosina quinasa Src descritas en la presente memoria, tanto en formas activas como en formas inactivas. Los términos "proteína Yes" o "Yes" se refieren colectivamente a las múltiples formas de la proteína tirosina quinasa Yes descritas en la presente memoria, tanto en formas activas como en formas inactivas. Además, en el contexto de la descripción, se hace también referencia a genes o secuencias genéticas de ácidos nucleicos que codifican Src o Yes. El término "familia Src" se refiere al grupo de tirosina quinasas que están relacionadas en función y secuencia de aminoácidos a
Src.

Una "proteína Src activa" se refiere a una cualquiera de entre una multiplicidad de formas de proteína Src que potencia la angiogénesis o la VP. Una "proteína Yes activa" se refiere a una cualquiera de entre una multiplicidad de formas de proteína Yes que potencia VP. Los ensayos destinados a medir la potenciación de la angiogénesis o la VP se describen en la presente memoria, y no se consideran limitantes. Una proteína se considera activa si el nivel de angiogénesis o VP es por lo menos superior al 10% superior, preferentemente 25% o superior, y más preferentemente 50% o superior a un nivel control en el que no se añade proteína al sistema de ensayo.

El ensayo preferido para medir la potenciación de la angiogénesis es el ensayo CAM que utiliza vectores víricos RCAS tal como se describe en los Ejemplos en los que el índice de angiogénesis se calcula contando puntos de bifurcación.

Un ensayo preferido para la medición de la potenciación de VP es el ensayo de Miles utilizando colorante azul de Evan en ratones tal como se describe en los Ejemplos, en los que se mide VP mediante la cantidad de colorante azul de Evan que se escapa de los vasos sanguíneos.

Una proteína Src o Yes activa preferida muestra también actividad de tirosina quinasa. Las proteínas Src o Yes extremadamente activas se describen en los ejemplos e incluyen Src-A y Yes-1.

Una proteína "proteína Src inactiva" se refiere a una de entre una multiplicidad de formas de la proteína Src que inhibe la angiogénesis o VP. Una "proteína Yes inactiva" se refiere a una de entre una multiplicidad de formas de la proteína Yes que inhibe VP. Los ensayos para medir la inhibición del incremento de la VP se describen en la presente memoria, y no se deben considerar como limitativos. Una proteína Src se considera inactiva si el nivel de angiogénesis es por lo menos 10% inferior, preferentemente 25% inferior y más preferentemente 50% inferior que un nivel control en el que no se ha añadido Src exógeno al sistema de ensayo.

Una proteína Src o Yes se considera inactiva si el nivel de VP es por lo menos el mismo que, o 10% inferior, preferentemente 25% inferior y más preferentemente 50% inferior que un nivel control en el que no se ha añadido Src o Yes exógeno al sistema de ensayo.

Un ensayo preferido destinado a medir la inhibición de la angiogénesis es el ensayo CAM que utiliza vectores víricos RCAS tal como se describe en los Ejemplos en los que el índice de angiogénesis se calculó contando puntos de bifurcación.

Un ensayo preferido para medir la inhibición de VP es el ensayo de Miles utilizando colorante azul de Evan en ratones tal como se describe en los Ejemplos, en el que se mide VP por la cantidad de colorante azul de Evan que se escapa de los vasos sanguíneos.

Una proteína Src o Yes inactiva preferida muestra también una actividad tirosina quinasa reducida. Las proteínas Src inactivas ejemplares se describen en los Ejemplos e incluyen Src-251 y Src K295M.

Un proteína Src de utilidad en la presente invención se puede producir mediante una multiplicidad de procedimientos que comprenden el aislamiento de una fuente natural que comprende tejido, producción mediante expresión de ADN recombinante y purificación y semejantes. Proteína Src y/o Yes se puede proporcionar también "in situ" mediante la introducción de un sistema de terapia génica en el tejido de interés que a continuación expresa la proteína en el tejido.

Un gen que codifica una proteína Src o Yes se puede preparar mediante una multiplicidad de procedimientos conocidos en la materia y la invención no se debe considerar como limitativa en este aspecto.

Por ejemplo, es bien conocido que la historia natural de Src comprende una multiplicidad de homólogos de especies mamíferas, aves, víricas y semejantes y el gen se puede clonar fácilmente utilizando procedimientos de clonación de ADNc, a partir de cualquier tejido que exprese la proteína. Una Src preferida para utilización en la presente invención es una proteína celular, tal como los homólogos mamíferos o de aves referidos como c-Src.

La c-Src humana es particularmente preferida. Una Yes preferida para utilización en la presente invención es una proteína celular humana, c-Yes. La c-Yes-1 humana que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la Fig. 11 es particularmente preferida. La proteína Yes-1 de la Fig. 11 está codificada en el segmento de secuencia de ácido nucleico mostrado en la Fig. 12 y se identifica como el segmento del dominio codificante.

D. Moléculas de ADN recombinante y sistemas de expresión para la expresión de las proteínas Src o Yes

La presente invención describe una multiplicidad de secuencias de nucleótidos de utilización particular en la presente invención. Estas secuencias comprenden secuencias que codifican una proteína Src de utilidad en la presente invención y múltiples segmentos de ADN, moléculas de ADN (ADNr) recombinante y vectores construidos para la expresión de proteína Src. Estas secuencias también comprenden secuencias que codifican una proteína Yes de utilidad en la presente invención y múltiples segmentos de ADN, moléculas de ADN recombinante (ADNr) y vectores construidos para la expresión de proteína Yes.

Las moléculas de ADN (segmentos) de utilidad en la presente invención pueden por consiguiente comprender secuencias que codifican genes estructurales completos, fragmentos de genes estructurales o combinaciones de genes y unidades de transcripción tal como se describe a continuación en la presente memoria.

Un segmento de ADN preferido es una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína Src o Yes o las dos tal como se definen en la presente memoria o fragmentos biológicamente activos de las mismas.

La secuencia de residuos de aminoácido y la secuencia de nucleótidos de las Src y Yes preferidas se describe en los Ejemplos.

Un segmento de ADN preferido codifica una secuencia de residuos de aminoácido sustancialmente igual a, y preferentemente comprendiendo esencialmente una secuencia de residuos de aminoácido o parte de la misma correspondiente a una proteína Src o Yes descrita en la presente memoria. Los segmentos representativos y preferidos de ADN se describen adicionalmente en los Ejemplos.

La secuencia de residuos de aminoácidos de una proteína o polipéptido está directamente relacionada, a través del código genético, a la secuencia de ácido desoxirribonucleico (ADN) del gen estructural que codifica la proteína. Así, un gen estructural o un segmento de ADN se puede definir en términos de la secuencia de residuos de aminoácido, es decir, proteína o polipéptido, que codifica.

Una característica importante y bien conocida del código genético es su redundancia. Es decir, par la mayoría de los aminoácidos utilizados en la síntesis de proteínas, más de un triplete de nucleótidos codificante (codon) puede codificar o designar un residuo de aminoácido en particular. Por consiguiente, una multiplicidad de diferentes secuencias de nucleótidos puede codificar una secuencia de residuos de aminoácido particular. Tales secuencias de nucleótidos se consideran funcionalmente equivalentes ya que pueden resultar en la producción de la misma secuencia de residuos de aminoácido en todos los organismos. Ocasionalmente, se puede incorporar en una secuencia determinada de nucleótidos una variante metilada de purina o pirimidina. Sin embargo, dicha metilación no afecta la codificación en modo alguno.

Un ácido nucleico es un polinucleótido cualquiera o fragmento de ácido nucleico, ya sea un polirribonucleótido o polidesoxiribonucleótido, es decir, ARN o ADN, o análogo de los mismos. En una forma de realización preferida, una molécula de ácido nucleico se encuentra en forma de un segmento doble de ADN, es decir un segmento de ADN, aunque para ciertas metodologías de biología molecular es preferido el ADN o ARN de cadena simple.

Los segmentos de ADN se producen mediante múltiples procedimientos que comprenden procedimientos de química sintética y estrategias recombinantes, preferentemente mediante clonación o reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los segmentos de ADN que codifican partes de una proteína Src se pueden sintetizar fácilmente mediante procedimientos químicos, por ejemplo, el procedimiento de fosfodiéster de Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc., 103:3185-3191 (1981) o mediante procedimientos de síntesis automatizados. Además, los segmentos de ADN mayores se pueden preparar fácilmente mediante procedimientos bien conocidos, tales como la síntesis de un grupo de oligonucleótidos que definen el segmento de ADN, seguido de la hibridación y ligación de los oligonucleótidos con el fin de construir el segmento completo. Los procedimientos alternativos comprenden el aislamiento del segmento preferido de ADN mediante PCR utilizando un par de oligonucleótidos cebadores sobre una genoteca de ADNc que se considera contiene miembros que codifican la proteína Src.

Desde luego, mediante síntesis química se puede realizar cualquier modificación simplemente sustituyendo las bases adecuadas por las que codifican la secuencia nativa de residuos de aminoácido. Este procedimiento es bien conocido y se puede aplicar con facilidad a la producción de las múltiples diferentes proteínas Src "modificadas" descritas en la presente memoria.

Además, los segmentos de ADN que comprenden esencialmente genes estructurales que codifican una proteína Src o Yes se pueden modificar a continuación, por mutagénesis dirigida o al azar, con el fin de introducir cualquier sustitución deseada.

1. Clonando un gen Src o Yes

Un gen Src o Yes se puede clonar a partir de una fuente adecuada de ADN genómico o ARN mensajero (ARNm) mediante una multiplicidad de procedimientos bioquímicos. La clonación de estos genes se puede realizar según los procedimientos generales descritos en los Ejemplos y conocidos en la materia.

Las fuentes de ácidos nucleicos para la clonación de un gen Src o Yes adecuado para la utilización en la presente invención pueden comprender ADN genómico o ARN mensajero (ARNm) en forma de una librería de ADNc, a partir de un tejido que se cree expresa dichas proteínas. Un tejido preferido es el tejido de pulmón humano, aunque se puede utilizar cualquier otro tejido adecuado.

Un procedimiento preferido de clonación implica la preparación de una librería de ADNc utilizando procedimientos estándar y el aislamiento de la secuencia de nucleótidos que codifica Src o Yes mediante amplificación por PCR utilizando cebadores de oligonucleótidos apareados basados en la secuencias de nucleótidos descritas en la presente invención. Por el contrario, los clones de ADNc deseados se pueden identificar y aislar de la librería de ADNc o genómica mediante procedimientos convencionales de hibridación de ácidos nucleicos utilizando una sonda de hibridación a base de las secuencias de ácidos nucleicos descritas en la presente memoria. Otros procedimientos de aislamiento y clonación de los ácidos nucleicos que codifican Src o Yes son fácilmente aparentes a los expertos en la materia.

2. Transferencia génica y/o vectores de expresión

La presente invención contempla una molécula de ADN recombinante (ADNr) que comprende un segmento de ADN que codifica una proteína Src o Yes, o las dos, tal como se describe en la presente memoria. Un ADNr expresable se puede producir mediante la unión funcional (en el registro, expresable) de un vector a un segmento de ADN que codifican Src o Yes de la presente invención. Por consiguiente, una molécula de ADN recombinante es una molécula de ADN híbrida que comprende por lo menos dos ácidos nucleicos con secuencias de nucleótidos no encontradas juntas normalmente en la naturaleza.

La selección del vector al que se une funcionalmente el segmento de ADN de utilidad en la presente invención depende directamente, como es bien conocido en la materia, de las propiedades funcionales deseadas, por ejemplo, expresión de proteína y las células huésped que se deberán transformar. Consideraciones típicas en la técnica de la construcción de moléculas de ADN recombinante. Un vector contemplado en la presente invención puede por lo menos dirigir la replicación y preferentemente también la expresión, de un gen estructural comprendido en los segmentos de ADN del vector, al que se encuentra funcionalmente unido.

Cuando un vector de expresión comprende tanto una secuencia de ácido nucleico de Src como de Yes expresables, los dos genes se pueden regular mediante los mismos elementos reguladores corriente arriba del primer gen, o cada uno se puede regular individualmente por elementos reguladores diferentes.

Tanto los vectores de expresión procariótica como eucariótica son familiares para los expertos en la materia de la construcción de vectores y han sido descritos por Ausebel et al., en Current Protocols In Molecular Biology, Wiley and Sons, New York (1993) y por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989). Estas referencias también describen muchos de los procedimientos de ADN recombinante a los que se hace referencia en la presente memoria.

En una forma de realización de la presente invención, se contempla un vector de la presente invención que comprende un replicón procariótico, es decir, una secuencia de ADN con la capacidad de dirigir replicación autónoma y el mantenimiento extracromosómico de la molécula de ADN recombinante en una célula huésped procariótica, tal como una célula huésped bacteriana, transformada con éste. Tales replicones son bien conocidos en la materia. Además, estas formas de realización que comprenden replicones procarióticos comprenden también un gen cuya expresión proporciona resistencia a fármacos al huésped bacteriano transformado con éstos. Los genes bacterianos típicos de resistencia a fármacos comprenden los que confieren resistencia a la ampicilina o tetraciclina.

Los vectores que comprenden un replicón procariótico también pueden comprender un promotor procariótico que puede dirigir la expresión (transcripción y translación) de un gen estructural en una célula huésped bacteriana, tal como E. coli. trasformada con éstos. Un promotor es una elemento de control de la expresión formado por una secuencia de ADN que permite la unión de ARN polimerasa y que tenga lugar la transcripción. Las secuencias de promotores compatibles con los huéspedes bacterianos se administran típicamente en vectores de plásmido que comprenden lugares de restricción convenientes para la inserción de un segmento de ADN de utilidad en la presente invención. Típicos de tales vectores de plásmido son pUC8, pUC9, pBR322 y pBR329 disponibles de Biorad Laboratories (Richmond, CA), pRSET disponible de Invitrogen (San Diego, CA) y pPL y pKK223 disponibles de Pharmacia (Piscataway,
N.J.).

Los vectores de expresión compatibles con las células eucarióticas, preferentemente los compatibles con las células de vertebrados, se pueden utilizar también con el fin de formar moléculas de ADN recombinante de utilidad en la presente invención. Los vectores de expresión eucariótica son bien conocidos en la materia y se encuentran disponibles de una multiplicidad de fuentes comerciales. Típicamente, tales vectores se proporcionan con lugares de restricción convenientes para la inserción del segmento de ADN deseado. Entre tales vectores son típicos pSVL y pKSV-10 (Pharmacia), pBPV-1/pML2d (International Biotechnologies, Inc.), pTDT1 (ATCC, #31255), pRc/CMV (Invitrogen, Inc.), el vector preferido descrito en los Ejemplos y los vectores de expresión eucariótica similares.

Un sistema de expresión génica preferido en el contexto de la presente invención comprende un componente para la administración de genes, es decir, la capacidad de administrar genes al tejido de interés. Los vectores adecuados son vectores "infecciosos" tales como los virus de ADN recombinante, vectores adenovíricos o vectores retrovíricos que están diseñados con el fin de expresar la proteína deseada y tiene características que permiten la infección de tejidos diana preseleccionados. La aplicación de virus del sarcoma aviar competente en replicación (RCAS) descrito en la presente memoria es particularmente preferida.

Se pueden diseñar sistemas celulares de mamífero que utilizan virus recombinantes o elementos víricos con el fin de dirigir la expresión. Por ejemplo, cuando se utilizan vectores de expresión adenovíricos, la secuencia codificante de un polipéptido se puede ligar a un complejo de control de la transcripción/traslación adenovírico, por ejemplo, el promotor tardío y la secuencia directora tripartita. Este gen quimérico se puede insertar a continuación en el genoma del adenovirus mediante recombinación in vitro o in vivo. La inserción en una región no esencial del genoma del virus (por ejemplo, la región E1 o E3) resultará en un virus recombinante viable que puede expresar el polipéptido en el huésped infectado (por ejemplo, ver Logan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81:3655-3659 (1984)). Por el contrario, el promotor de 7,5K del virus vaccinia, (por ejemplo, ver Mackett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:7415-7419 (1982); Mackett et al., J. Virol., 49:857-864 (1984); Panicali et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:4927-4931 (1982)). De particular interés son los vectores a base de virus de papiloma bovino que tiene la capacidad de replicarse como un elemento extracromosómico (Sarver et al., Mol. Cell. Biol., 1:486 (1981)). Poco después de la entrada de este ADN en las células diana, el plásmido se replica produciendo hasta entre 100 y 200 copias por célula. La transcripción del ADNc insertado no necesita la integración del plásmido en el cromosoma del huésped, produciendo así un nivel elevado de expresión. Mediante la inclusión de un marcador seleccionable, tal como el gen neo, en el plásmido se pueden utilizar estos vectores para expresar establemente. Por el contrario, se puede modificar el genoma retrovírico con el fin de utilizarlo como un vector que puede introducir y dirigir la expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido en las células huésped (Cone et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81:6349-6353 (1984)]. También se puede alcanzar un elevado nivel de expresión utilizando promotores inducibles, que comprenden, sin quedar limitado a ellos, el promotor de la metalotionina IIA y el promotor de choque térmico.

Recientemente, se ha estudiado la supervivencia a largo plazo en estudios de terapia génica en animales desnudos portadores de cáncer de ovario humano comparando el promotor de citomegalovirus (CMV) con el del sarcoma de Rous (RSV) controlando la timidina quinasa (TK). La eficacia en matar células de la terapia génica mediada por adenovirus con el gen TK del virus herpes simples dirigido por el promotor CMV se descubrió que resultó entre 2 y 10 veces más eficaz que la terapia controlada por RSV (Tong et al., Hybridoma, 18(1):93-97 (1999)). También se ha descrito el diseño de promotores quiméricos para las aplicaciones de terapia génica, que necesitan niveles de expresión bajos seguido de una expresión inducible a nivel elevado (Suzuki et al., Human Gene Therapy, 7:1883-1893)).

Para la producción a largo plazo y nivel elevado de proteínas recombinantes, se prefiere la expresión estable. En lugar de utilizar vectores de expresión que comprenden orígenes de replicación víricos, las células huésped se pueden transformar con un ADNc controlado mediante los elementos de control de la expresión adecuados (por ejemplo, secuencias promotoras y amplificadoras, terminadores de la transcripción, lugares de poliadenilación, etc.) y un marcador seleccionable. Tal como se mencionó anteriormente, el marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células integren el plásmido establemente en sus cromosomas y crezca formando colonias que a su vez se pueden clonar y expandir en líneas celulares.

Por ejemplo, después de la introducción de un ADN foráneo, se puede permitir que las células modificadas crezcan durante entre 1 y 2 días en un medio enriquecido y a continuación cambiarlas a un medio selectivo. Se puede utilizar una multiplicidad de sistemas de selección, que comprenden, aunque no son limitantes, los genes de la timidina quinasa del virus herpes simples (Wigler et al., Cell, 11:223 (1977)), hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa [Szybalska et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 48:2026 (1962)] y adenina fosforibosiltransferasa [Lowy et al., Cell, 22:817 (1980)], que se pueden utilizar en células tk^{-}, hgprt^{-} o aprt^{-} respectivamente. También se pueden utilizar genes que confieren resistencia a antimetabolitos como la base de la selección; por ejemplo los genes dhfr, que confieren resistencia al metotrexato [Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 77:3567 (1980); O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78:1527 (1981); gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico [Mulligan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78:2072 (1981); neo, que confiere resistencia al aminoglicósido G-418 (Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol., 150:1 (1981) e higro, que confiere resistencia a la higromicina (Santerre et al., Gene, 30:147 (1984)]. Recientemente, se han descrito genes seleccionables adicionales, es decir trpB, que permite a las células utilizar indol en lugar de triptófano; hisD, que permite a las células utilizar histinol en lugar de histidina [Hartman et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:804 (1988)]; y ODC (ornitin decarboxilasa) que confiere resistencia al inhibidor de la ornitin decarboxilasa, 2-(difluorometil)-DL-ornitina, DFMO [McConlogue L., en Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed., (1987)].

Los principales vectores contemplados en la terapia génica humana son derivados de origen retrovírico. [Wilson, Clin. Exp. Immunol., 107(Sup.1):31-32 (1997); Bank et al., Bioessays, 18(12):999-1007 (1996); Robbins et al., Pharmacol. Ther., 80(1):35-47 (1998)]. El potencial terapéutico de la transferencia génica y la terapia antisentido ha estimulado el desarrollo de muchos sistemas de vectores destinados a tratar múltiples tejidos [sistema vascular, Stephan et al., Fundam. Clin. Pharmacol., 11(2):97-110 (1997), Feldman et al., Cardiovasc. Res., 35(3):391-404 (1997); Feldman et al., Cardiovas. Res., 35(3) :391-404 (1997); Vassalli et al., Cardiovasc. Res., 35(3):459-69 (1997); Baek et al., Circ. Res., 82(3):295-305 (1998); kidney, Lien et al., Kidney Inte. Suppl., 61:S85-8 (1997); liver, Ferry et al., Hum. Gene Ther., 9(14):1975-81 (1998); muscle, Marshall et al., Curr. Opn. Genet. Dev., 8(3):360-5 (1998)]. Además de estos tejidos, una diana crítica en la terapia génica humana es el cáncer, como tumor propiamente, o tejido asociado [Runnebaum, Anticancer Res., 17(4B):2887-90 (1997); Spear et al., J. Neurovirol., 4(2):133-47 (1998)].

Los ejemplos específicos de sistemas de vectores para terapia génica vírica fácilmente adaptables para su utilización en la presente invención se describen a continuación. La administración de genes mediante retrovirus ha sido revisada recientemente por Federspiel y Hughes [Methods in Cell Biol., 52:179-214 (1998)] que describe en particular la familia retrovírica del virus de leucosis aviar (ALV) [Federspiel et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 93:4931 (1996); Federspiel et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:11241 (1994)]. Svoboda [Gene, 206:153-163 (1998)] describe vectores retrovíricos, que comprenden ALV y el virus de la leucemia murina (MLV).

Los sistemas de expresión con retrovirus/adenovirus modificados se pueden adaptar fácilmente para la práctica de la presente invención. Por ejemplo, los sistemas de virus de la leucemia murina (MLV) han sido revisados por Karavanas et al., Crit. Rev. In Oncology/Hematology, 28:7-30 (1998). Los sistemas de expresión de adenovirus han sido revisados por Von Seggern y Nemerow en Gene Expression Systems (ed. Fernandez & Hoeffler, Academic Press, San Diego, CA, 1999, Cap.5, pp 112-157.

Se ha demostrado que los sistemas de expresión de proteínas tienen una utilización efectiva tanto in vivo como in vitro. Por ejemplo, se ha descrito la eficiente transferencia génica a los carcinomas de célula escamosa humanos mediante el vector de amplicon de virus del herpes simples (HSV) tipo 1, [Carew et al., Am. J. Surg., 176:404-408 (1998)]. El virus del herpes simplex ha sido utilizado en la transferencia génica al sistema nervioso [Goins, et al., J. Neurovirol., 3 (sup.1):S80-8 (1997)]. Se han ensayado vectores suicidas dirigidos utilizando HSV-TK en tumores sólidos [Smiley et al., Hum. Gene Ther., 8(8):965-77 (1997)]. El vector de virus herpes simples tipo 1 ha sido utilizado en la terapia génica del cáncer en células de carcinoma de colon [Yoon et al., Ann. Surg., 228(3):366-74 (1998)]. Se han desarrollado vectores híbridos con el fin de extender la duración del tiempo de transfección, comprendiendo HSV/AAV (virus adeno asociado) para el tratamiento de los hepatocitos [Fraefel et al., Mol. Med., 3(12):813-825 (1997)].

El virus vaccinia ha sido desarrollado para la terapia génica humana debido a que tiene un genoma grande [Peplinski et al., Surg. Oncol. Clin. N. Am., 7(3):575-88 (1998)]. Se ha descrito un virus de vaccinia sin timidina quinasa que expresa purinnucleósido pirofosforilasa para ser utilizado como un vector de terapia génica dirigido a tumores [Puhlman et al., Human. Gene Therapv., 10:649-657 (1999)].

Se ha descrito el virus adenoasociado 2 (AAV) para ser utilizado en la terapia génica humana, sin embargo AAV necesita un virus de apoyo (tal como un adenovirus o un virus de herpes) para que se replique y empaquete óptimamente en las células de mamífero [Snoeck et al., Exp. Nephrol., 5(6):514-20 (1997); Rabinowitz et al., Curr. Opn. Biotechnol., 9(5):470-5) (1998)] Sin embargo, se ha descrito el empaquetamiento in vitro de un AAV recombinante infeccioso, haciendo que este sistema sea mucho más prometedor [Ding et al., Gene Therapy, 4:1167-1172 (1997)]. Se ha demostrado que la transferencia de ADNc de receptor ecotrópico del retrovirus mediada por el AAV permite la transducción ecotrópica retroviral de células humanas primarias y establecidas [Qing et al., J. Virolgoy, 71(7):5663-5667 (1997)]. Se ha demostrado la terapia génica del cáncer utilizando un vector AAV que expresa p53 tipo silvestre humano [Qazilbash et al., Gene Therapy, 4:675-682 (1997)]. También se ha demostrado la transferencia génica en células vasculares utilizando vectores AAV [Maeda et al., Cardiovascular Res.,35:514-521 (1997)]. Se ha demostrado que AAV es un vector adecuado para la terapia génica dirigida al hígado [Xiao et al., J. Virol. 72(12):10222-6 (1998)]. La utilización de vectores AAV se ha demostrado en la terapia génica del tejido cerebral y del sistema nervioso central [Chamberlin et al., Brain Res.,793(1-2):167-75 (1998); During et al., Gene Therapy, 5(6):820-7(1998)]. También se han comparado los vectores AAV con los vectores de adenovirus (AdV) en la terapia génica del pulmón y la transferencia a las células epiteliales fe la fibrosis quística [Teramoto et al., J. Virol, 72(11):8904-12 (1998)]

Sistemas de vectores quiméricos Adv/retrovíricos de terapia génica que incorporan las cualidades útiles de cada uno de los virus con el fin de crear un AdV no integrativo que resulta funcionalmente integrativo mediante la generación intermedia de una célula productora de retrovirus [Feng et al., Nat. Biotechnology 15(9):866-70 (1997); Bilbao et al., FASEB J., 11(8):624-34 (1997)]. Esta poderosa nueva generación de vectores de terapia génica se ha adaptado a la terapia génica dirigida al cáncer [Bilbao et al., Adv. Exp. Med. Biol., 451:365-74 (1998)]. Una sola inyección de AdV que expresa p53 inhibió el crecimiento de nódulos tumorales subcutáneos de células de cáncer de próstata [Asgari et al., Int. J. Cancer, 71(3):377-82 (1997)]. Se ha descrito la transferencia génica mediada por AdV del tipo silvestre de p53 en pacientes con carcinoma de pulmón de célula pequeña avanzado [Schuler et al., Human Gene Therapy, 9:2075-2082 (1998)]. El mismo cáncer ha sido el sujeto de terapia sustitutiva del gen p53 mediada por vectores AdV [Roth et al., Semin. Oncol., 25(3 Suppl. 8):33-7 (1998)]. También se ha descrito que la transferencia génica de p53 mediada por AdV inhibe la diferenciación de las células endoteliales y la angiogénesis in vivo [Riccioni et al., Gene Ther., 5(6):747-54 (1998)]. También se ha descrito la expresión del antígeno de melanoma gp75 mediada por adenovirus como inmunoterapia contra el melanoma metastático [Hirschowitz et al., Gene Therapy, 5:975-983 (1998)]. Los AdV facilitan la infección de las células humanas con retrovirus ecotrópicos e incrementa la eficacia de la infección con retrovirus [Scott-Taylor et al., Gene Ther., 5(5):621-9) (1998)]. Los vectores AdV se han utilizado en la transferencia de genes a las células musculares lisas vasculares [Li et al., Chin. Med. J. (Engl)., 110(12):950-4 (1997), a células de carcinoma de célula escamosa [Goebel et al., Otolarynol. Head Neck Surg., 119(4):331-6 (1998), células de cáncer de esófago [Senmaru et al., Int. J. Cancer, 78(3):366-71 (1998), células mesagiales [Nahman et al., J. Investig. Med. 46(5):204-9 (1998)], células gliales [Chen et al., Cancer Res., 58(16):3504-7 (1998)] y a las articulaciones de los animales [Ikeda et al., J. Rheumatol, 25(9):1666-73 (1998)]. Más recientemente, se ha demostrado transferencia génica pericardial mediada por AcV a base de catéter [March et al., Clin. Cardiol., 22(1 suppl.1):I23-9 (1999)]. La manipulación del sistema AdV con los elementos genéticos de control adecuados permite la expresión génica in vivo en diana regulable mediada por AdV [Burcin et al., PNAS (USA), 96(2):355-60 (1999)].

Se han desarrollado vectores de alfavirus para aplicaciones de terapia génica humana, con líneas celulares empaquetadoras adecuadas para la transformación con casetes de expresión adecuados para la utilización con vectores derivados de virus Sindbis y virus Semliki Forest [Polo et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 96:4598-4603 (1999)]. También se han desarrollado sistemas a base de replicones de ARN de flavivirus nocitopaticos [Varnavski et al., Virology 255(2):366-75 (1999)] Se han utilizado vectores de virus sinbis con el gen suicida HSIV-TK para dirigir específicamente a células tumorales [Iijima et al., Int. J. Cancer, 80(1):110-8 (1998)].

Los vectores retrovirales a base de virus espumoso humano (HFV) también son prometedores como vectores de terapia génica [Trobridge et al., Human Gene Therapy, 9:2517-2525 (1998)]. Se han diseñado vectores de virus espumoso para terapia génica suicida [Nestler et al., Gene Ther., 4(11):1270-7 (1997)]. También se han utilizado citomegalovirus murino recombinante y sistemas de promotores como vectores de elevado nivel de expresión [Manning et al., J. Virol. Meth., 73(1):31-9 (1998); Tong et al., Hybridoma, 18(1):93-7 (1998)].

Se ha posibilitado la administración de genes a células no replicantes mediante la generación de vectores a base de virus Sendai [Nakanishi et al., J. Controlled Release, 54(1):61-8 (1998)].

En otros esfuerzos para permitir la transformación de células somáticas no replicantes, se han explorado los vectores lentivíricos. Se ha descrito la terapia génica de la fibrosis quística utilizando vectores basados en virus de la inmunodeficiencia humanos (VIH) deficientes en la replicación [Goldman et al., Human Gene Therapy, 8:2261-2268 (1997)]. También se ha demostrado la expresión sostenida de genes administrados en el hígado y músculo mediante vectores lentivíricos [Kafri et al., Nat. Genet., 17(3):314-7 (1997)]. Sin embargo, la preocupación por la seguridad predomina y el desarrollo de vectores mejorados procede rápidamente [Kim et al., J. Virol., 72(2):994-1004 (1998)]. El examen del LTR de VIH y Tat produjo información importante sobre la organización del genoma para el desarrollo de vectores [Sadaie et al., J. Med. Virol., 54(2):118-28 (1998)]. Por consiguiente en la actualidad se conocen mejor los requerimientos genéticos para un vector efectivo a base de VIH [Gasmi et al., J. Virol., 73(3):1828-34 (1999)]. Se han descrito vectores autoinactivantes, o las líneas celulares empaquetadoras condicionales [por ejemplo Zuffery et al., J. Virol, 72(12):9873-80 (1998); Miyoshi et al., J. Virol., 72(10):8150-7 (1998); Dull et al, J. Virol., 72(11):8463-71 (1998) y Kaul et al., Virology, 249(1):167-74 (1998)]. Se ha demostrado la eficaz transducción de linfocitos humanos y células CD34+ por vectores VIH [Douglas et al., Hum. Gene Ther., 10(6):935-45 (1999); Miyoshi et al., Science 283(5402):682-6 (1999)]. Se ha descrito la transducción eficiente de células humanas no replicantes mediante vectores lentivíricos de la inmunodeficiencia felina (FIV), que minimizan las preocupaciones sobre la seguridad en la utilización de vectores a base de VIH [Poeschla et al., Nature Medicine, 4(3):354-357 (1998)]. Se ha demostrado la infección productiva de las células mononucleares de la sangre humana mediante los vectores FIV [Johnston et al., J. Virol., 73(3):2491-8 (1999)].

Mientras que los vectores son difíciles de manejar y su capacidad para insertar ADN es limitada, estas limitaciones y desventajas se han afrontado. Por ejemplo, además de las líneas celulares empaquetadoras de virus simplificadas, se han desarrollado vectores Minivíricos, derivados del virus del herpes humano, virus herpes símplex tipo 1 (HSV-1) y del virus Epstein-Barr (EBF) con el fin de simplificar la manipulación del material genético y generar vectores víricos [Wang et al., J. Virology, 70(12):8422-8430 (1996)]. Se han demostrado anteriormente plásmidos adaptadores destinados a simplificar la inserción de ADN foráneo en los vectores retrovirales independientes de ayudantes [J. Virology 61(10):3004-3012 (1987)].

Los vectores víricos no son los únicos medios para efectuar la terapia génica, ya que se han descrito múltiples vectores no víricos. Se ha demostrado que un vector dirigido no vírico de administración de genes a base de la utilización de un poliplex de Factor de Crecimiento Epidémico/ADN (EGF/DNA) produce administración de genes eficiente y específica [Cristiano, Anticancer Res., 18:3241-3246 (1998)]. Se ha demostrado terapia génica del sistema vascular y del SNC utilizando liposomas catiónicos [Yang et al., J. Neurotrauma, 14(5):281-97 (1997)]. También se ha logrado terapia génica transitoria de la pancreatitis utilizando liposomas catiónicos [Denham et al., Ann. Surg., 227(6):812-20 (1998)]. Se ha demostrado la efectividad de un complejo de vector/ADN a base de quitosano destinado a la administración de genes [Erbacher et al., Pharm. Res., 15(9):1332-9 (1998)]. Se ha descrito un vector no vírico para la administración de ADN a base de un sistema terplex [Kim et al., 53(1-3):175-82 (1998)]. Se han utilizado complejos de liposomas recubiertos de partículas víricas con el fin de efectuar transferencia génica [Hirai et al., Biochem. Biophis. Res. Commun., 241(1):112-8 (1997)].

Se ha demostrado la terapia génica mediante la inyección directa en el tumor de vectores T7 no víricos codificantes del gen de la timidina quinasa [Chen et al., Human Gene Therapy, 9:729-736 (1998)]. La preparación de ADN de plásmido es importante para la transferencia génica mediante inyección directa [Horn et al., Hum. Gen Ther., 6(5):656-73 (1995)]. Se han adaptado vectores plasmídicos modificados específicamente para la inyección directa [Hartikka et al., Hum. Gene Therapy, 7(10):1205-17 (1996)].

Así, en la materia es conocida una amplia multiplicidad de vectores de transferencia génica/terapia génica y construcciones. Estos vectores se adaptan fácilmente para la utilización en los procedimientos de la presente invención. Mediante la adecuada manipulación, utilizando procedimientos de ADN recombinante/biología molecular, con el fin de insertar Src o Yes, o los dos, funcionalmente unidos (tanto activos como inactivos) al vector de expresión/administración seleccionado, se pueden generar múltiples vectores equivalentes para la práctica de la presente invención.

E. Modulación de la permeabilidad vascular (VP)

La presente invención proporciona una composición destinada a la modulación de la permeabilidad vascular (VP) de los vasos sanguíneos en un tejido asociado con un proceso de enfermedad o trastorno y de este modo efectúa los eventos en el tejido que depende de VP. Generalmente, la composición se puede utilizar en un procedimiento que comprende administrar al tejido, asociado con una proceso de enfermedad o trastorno, una composición que comprende una cantidad moduladora de VP de un vector de ácido nucleico que expresa Yes activo o inactivo o los dos, Yes activo o inactivo y Src.

Tal como se describe en la presente memoria, uno cualquiera de entre una multiplicidad de tejidos u órganos que comprenden tejidos organizados, pueden ser un lugar de VP en estados de enfermedad que comprenden cerebro, piel, músculo, intestino, tejido conectivo, articulaciones, huesos y similares en los que se encuentran vasos sanguíneos.

El paciente tratado en la presente invención en sus múltiples formas de realización es deseablemente un paciente humano, aunque se entiende que los principios de la presente invención indican que la invención es efectiva en todos los mamíferos, que se pretende sean incluidos en el término "paciente". En este contexto, se entiende que mamífero comprende cualquier especie en la que sea deseable el tratamiento del tejido asociado con enfermedades que implican angiogénesis, particularmente especies mamíferas agrícolas y domésticas.

Así, el procedimiento comprende administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición fisiológicamente tolerable que comprende vector de ADN destinado a expresar una proteína Yes, o tanto proteína Yes como proteína Src.

Generalmente, la dosis oscilará con la edad, condición, género y extensión de la enfermedad en el paciente y puede ser determinada por un experto en la materia. La dosificación se puede ajustar también mediante el médico particular en caso de complicación.

Una cantidad terapéuticamente efectiva moduladora de VP es la cantidad de ácido nucleico que codifica una proteína Src o Yes, suficiente para producir una modulación medible de VP en el tejido que se está tratando, es decir, una cantidad modulante de VP. La modulación de VP se puede medir mediante ensayos tal como se describe en la presente memoria o mediante otros procedimientos conocidos por los expertos en la materia. La modulación de VP se puede medir mediante el ensayo de Miller, tal como se describe en la presente memoria o mediante otros métodos conocidos por los expertos en la materia.

El vector de ácido nucleico que expresa proteína Src o Yes, o las dos, se puede administrar parenteralmente mediante inyección o mediante una infusión gradual durante el tiempo. Aunque se puede accede al tejido que se debe tratar en el cuerpo mediante administración sistémica y por consiguiente frecuentemente se trata mediante la administración intravenosa de las composiciones terapéuticas, se contemplan otros tejidos y medios de administración cuando existe la posibilidad de que el tejido a que se dirige contenga la molécula a la que se dirige. Por consiguiente, las composiciones de la presente invención se pueden administrar intravenosamente, intraperitonealmente, intramuscularmente, subcutáneamente, intracavidad, transdermalmente y se pueden administra mediante medios peristálticos.

Las composiciones terapéuticas que comprenden un vector de ácido nucleico que expresa la proteína Src o Yes se puede administrar convencionalmente intravenosamente, mediante inyección de una dosis unitaria, por ejemplo. El término "dosis unitaria" cuando se utiliza en referencia a una composición terapéutica de la presente invención se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para el sujeto, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el diluyente necesario; es decir, vehículo o vehículos.

En una forma de realización preferida el reactivo se administra en una dosis única intravenosamente. La administración localizada se puede lograr mediante la inyección directa o aprovechando compartimentos anatómicos aislados, aislando la microcirculación de sistemas de órganos diana, reperfusión en un sistema circulante o la oclusión temporal basada en catéter de las regiones diana del sistema vascular asociado al tejido enfermo.

Las composiciones se administran de un modo compatible con las formulaciones de dosis y en una cantidad terapéuticamente efectiva. La cantidad que se debe administrar y el programa dependen del sujeto que se debe tratar, la capacidad del sistema del sujeto para utilizar el ingrediente activo y el grado de efecto terapéutico deseado. Las cantidades precisas de ingrediente activo que se necesita administrar dependen del criterio del médico y son características de cada individuo. Sin embargo, en la presente memoria se dan a conocer los ámbitos de dosis adecuados para las aplicaciones sistémicas y dependen de la vía de administración. Los regímenes adecuados de administración también son variables, pero están tipificados por una administración inicial seguida de dosis repetidas a intervalos de una ó más horas por inyección u otra forma de administración. Por el contrario, se contempla una infusión intravenosa continua suficiente para mantener concentraciones en la sangre dentro de los rangos especificados para las terapias in vivo.

Existe una multiplicidad de enfermedades en las que la inhibición de la angiogénesis se cree que es importante, a las que se hace referencia como enfermedades angiogénicas, que comprenden aunque sin resultar limitativo, los trastornos inflamatorios tales como la inflamación inmune y no inmune, el reumatismo articular crónico y la psoriasis, los trastornos asociados a la invasión oportuna o inoportuna de los vasos sanguíneos tales como la retinopatía diabética, el glaucoma neovascular, la restenosis, proliferación capilar en la placa aterosclerótica y osteoporosis y los trastornos asociados al cáncer, tales como los tumores sólidos, metástasis de los tumores sólidos, angiofibromas, fibroplasia retrolental, hemangiomas, sarcoma de Kaposi y cánceres semejantes que necesitan de la neovascularización para apoyar el crecimiento tumoral.

De manera similar, la permeabilidad vascular es un componente importante de la angiogénesis, por méritos propios asociada a patologías nocivas. Por ejemplo el daño debido a la permeabilidad vascular inducida por la apoplejía dispara el daño relacionado a la inflamación.

Así, los procedimientos que inhiben la permeabilidad vascular en los tejidos asociados a una enfermedad reducen los síntomas de la enfermedad y, dependiendo de la enfermedad, pueden contribuir a curar la enfermedad. En una forma de realización, la presente invención contempla la inhibición de la permeabilidad vascular, en sí, en un tejido asociado a una enfermedad. En una forma de realización, la presente invención contempla la inhibición de la permeabilidad vascular, en sí, en un tejido asociado al trastorno. La extensión de la permeabilidad vascular en el tejido y por consiguiente la extensión de la inhibición lograda se puede valorar mediante múltiplos procedimientos.

Así, en una forma de realización relacionada, un tejido que se debe tratar es un tejido inflamado y la permeabilidad que se debe inhibir es debida a la estimulación por VEGF. En esta clase el procedimiento contempla la inhibición de VP en un tejido artrítico, tal como en un paciente con reumatismo articular crónico, en tejidos inmunes o no inmunes inflamados, en tejido psoriático y semejantes.

En otra forma de realización relacionada, el tejido que se debe tratar es un tejido retiniano de un paciente con una enfermedad retiniana tal como retinopatía diabética, degeneración macular o glaucoma neovascular y la VP que se debe inhibir es la VP del tejido retiniano en el que hay neovascularización del tejido retiniano.

Los procedimientos son también particularmente efectivos contra la formación de metástasis porque (1) su formación necesita la vascularización del tumor primario de tal modo que las células cancerosas puedan dejar el tumor primario y (2) su establecimiento en lugares secundarios necesita neovascularización para apoyar el crecimiento de las metástasis.

En una forma de realización relacionada, la presente invención contempla la práctica junto con otras terapias tales como la quimioterapia convencional dirigida contra los tumores sólidos y con el fin de controlar el establecimiento de metástasis. La administración de inhibidor de VP se realiza típicamente durante o después de la quimioterapia, aunque resulta preferido inhibir VP después de un régimen de quimioterapia cuando el tejido tumoral está tratando de respondiendo al asalto tóxico mediante la inducción de VP con el fin de recuperar el aporte de sangre y nutrientes al tejido tumoral. Además, es posible administrar los procedimientos de inhibición de la permeabilidad vascular después de la cirugía en la que se han extraído los tumores sólidos como profilaxis contra las metástasis.

En la medida que la presente invención se aplica a la inhibición de la permeabilidad vascular implicada en la metástasis, la presente invención también se puede aplicar a la inhibición de la formación de metástasis y a la regresión de los tumores establecidos.

La restenosis es un proceso de migración y proliferación de las células de músculo liso (SMC) en el tejido en el lugar de angioplasia coronaria transluminal percutánea que dificulta el éxito de la angioplasia. La migración y proliferación de las SMC durante la restenosis se puede considerar un proceso de VP que se inhibe según la presente invención. Por consiguiente la presente invención también contempla la inhibición de la restenosis mediante la inhibición de la permeabilidad vascular en pacientes después de los procedimientos de angioplasia. Con el fin de inhibir la restenosis, la tirosina quinasa inactivada se administra típicamente después del procedimiento de angioplasia debido a que la pared los vasos coronarios corre el riesgo de restenosis, típicamente durante entre aproximadamente 2 y aproximadamente 28 días, y más típicamente durante aproximadamente los primeros 14 días siguientes al procedimiento.

La composición de la presente invención se puede utilizar en un procedimiento destinado a inhibir la permeabilidad vascular en un tejido asociado a una enfermedad, y por consiguiente también con el fin de practicar el tratamiento de las enfermedades relacionadas con la permeabilidad vascular, que comprende poner en contacto un tejido en el cual está teniendo lugar el incremento de la permeabilidad vascular o corre el riesgo de que ocurra, con una composición que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un vector que expresa una proteína Yes inactivada o una proteína Src y Yes inactivada.

Se contempla la manipulación de la permeabilidad de la barrera hematoencefálica con el fin de modular el acceso de los fármacos al tejido cerebral. El incremento de la permeabilidad vascular de la barrera hematoencefálica permitirá que los fármacos, que normalmente no cruzarían la barrera, penetren en el tejido cerebral.

La inhibición o potenciación de la angiogénesis claramente tienen lugar entre 5 y 7 días después de la puesta en contacto inicial con la composición terapéutica de los ejemplos. De manera similar, la modulación de la VP puede tener lugar en un marco temporal semejante. Los efectos pueden tener lugar en un período de tiempo corto después de la administración de la composición terapéutica. Los factores temporales limitantes comprenden la velocidad de absorción por el tejido, la adquisición temporal, la traslocación de la proteína o la traducción del ácido nucleico (dependiendo del agente terapéutico) y la dirección de la proteína. Así, los efectos moduladores de la VP pueden tener lugar en tan poco tiempo como una hora desde el momento de la administración. También se puede administrar una exposición adicional o más prolongada a proteína Src y/o Yes inactiva, utilizando las condiciones adecuadas. Así, se pueden diseñar una multiplicidad de marcos temporales deseados mediante la modificación de tales parámetros.

La presente invención también comprende la administración a un tejido asociado al proceso de enfermedad o al vaso sanguíneo dañado o al trastorno traumático, una composición que comprende un inhibidor de una tirosina quinasa de la familia Src.

Los ejemplos de los inhibidores de las tirosina quinasas de la familia Src comprenden, pero sin resultar limitados, PP1, PP2, PD173955, AGL1872, PD162531, Radicicol R2146, Geldanamicina y semejantes.

PP1 (Biomol, licenciado por Pfizer), fue el inhibidor sintético de Src utilizado en estos estudios. PP1 es parte de la familia de inhibidores de Src pertenecientes a las pirazolopirimidinas. Otros inhibidores sintéticos comprenden PP2 (Calbiochem, licenciado a Pfizer) que tiene una estructura relacionada a PP1 y también es conocido que bloquea la actividad de la familia de las quinasas Src [Hanke et al., J. Biol. Chem. 271(2):695-701 (1996)]. Otros inhibidores específicos de las quinasas Src comprenden PD173955 [Moasser et al., Cancer Res. 59:6145-6152 (1999); Parke Davis)] del que se ha publicado la estructura. PD162531 [Owens et al., Mol. Biol. Cell, 11:51-64 (2000)] también es un inhibidor específico de la quinasa Src de Parke Davis pero la estructura no está disponible en la literatura. La Geldanamicina es también un inhibidor de la quinasa Src, disponible de Life Technologies. Radicicol, comercializado por diferentes empresas (por ejemplo, Calbiochem, RBI, Sigma) es una lactona macrolítica antibiótica antifúngica que también funciona como un inhibidor no específico de las proteínas tirosina quinasas y se ha demostrado que inhibe la actividad quinasa Src. Los inhibidores químicos preferidos son PP1 y PP2 o similares, el inhibidor químico más preferido es PP1.

Los inhibidores adicionales de la tirosina quinasa de la familia Src adecuados se pueden identificar y caracterizar utilizando los ensayos estándares conocidos en la materia. Por ejemplo se han realizado cribados de compuestos químicos para encontrar inhibidores potentes y selectivos de Src u otras tirosina quinasas y han resultado en la identificación de entidades químicas de utilidad para una inhibición potente de la familia Src de tirosina quinasas.

Por ejemplo, los catecoles han sido identificados como elementos que se unen a una multiplicidad de inhibidores de la tirosina quinasa derivados de productos naturales y se han encontrado en compuestos seleccionados mediante selección combinatoria dirigida a diana de inhibidores selectivos de c-Src [Maly, D.J., et al., "Combinatorial target-guided ligand assembly: identification of potent subtype-selective c-Src inhibitors" PNAS (USA), 97(6):2419-2424 (2000)]. El cribado a base de química combinatoria de compuestos candidatos inhibidores, utilizando entidades que es conocido que son importantes en la inhibición de Src como punto de partida, es un medio importante y potente para aislar y caracterizar otros inhibidores químicos de la familia de tirosina quinasas Src.

Sin embargo, incluso se puede utilizar una cuidadosa selección de elementos con potencial para unirse, basada en el potencial para imitar una gama amplia de funciones presentes en los polipéptidos y ácidos nucleicos con el fin de realizar cribados combinatorios de inhibidores activos. Por ejemplo, las librerías de O-metiloximas son particularmente adecuadas para esta tarea, ya que la librería es de fácil preparación mediante la condensación de O-metilhidroxilamina con cualquiera de entre un elevado número aldehídos comercialmente disponibles. La formación de O-alquiloxima es compatible con una elevada gama de funcionalidades también estables a pH fisiológico [Malay et al.,
supra].

Tal como se describe, los inhibidores de la familia de quinasas Src adecuados comprenden también una cantidad, inhibidora de VP, de una proteína Src o Yes inactiva, o mezclas de estas, o vectores de ácido nucleico que expresan Src o Yes inactiva, o las dos.

Otros inhibidores de la familia de quinasas Src adecuados comprenden CSK, o vectores de ácido nucleico que expresan cantidades inactivantes de CSK.

Tal como se describe en la presente memoria, uno cualquiera de entre una multiplicidad de tejidos, u órganos que comprenden tejidos organizados, puede ser un lugar de VP en condiciones de enfermedad, que comprende cerebro, piel, músculo, intestino, tejido conectivo, articulaciones, huesos y tejidos semejantes en los que se encuentran vasos sanguíneos.

El paciente que se pueden tratar según la presente invención es deseablemente un paciente humano, aunque se debe entender que los principios de la presente invención indican que el tratamiento es efectivo con respecto a todos los mamíferos. En este contexto, se entiende que un mamífero comprende cualquier especie de mamífero en la que el tratamiento de pérdida vascular o daño tisular asociado a edema resulte deseable, en particular especies de mamíferos agrícolas y domésticos.

Los intervalos de dosis para administración de inhibidores químicos de la familia de tirosina quinasas Src, tales como PP1 se pueden encontrar comprendidos entre aproximadamente 0,1 mg/kg de peso corporal y aproximadamente 10 mg/kg peso corporal o el límite de solubilidad del agente activo en el vehículo farmacéutico. Preferentemente, las dosis típicas pueden comprender entre aproximadamente 1 mg/kg peso corporal y aproximadamente 9 mg/kg peso corporal. Dosis inferiores, tales como entre 0,1 mg/kg peso corporal y aproximadamente 1 mg/kg peso corporal se pueden optimizar en múltiples administraciones con el fin de tratar trastornos crónicos. Las dosis típicas en el tratamiento de las afecciones agudas menos graves, de fácil acceso y en las que la vía de administración es más directa, pueden comprender entre aproximadamente 1 mg/kg peso corporal y aproximadamente 3 mg/kg peso corporal. Dependiendo de la gravedad del daño, su lugar o la ruta de administración, se puede utilizar una dosis más elevada comprendida entre aproximadamente 3 mg/kg peso corporal y 10 mg/kg peso corporal (o el límite de solubilidad del agente en el vehículo farmacéutico) cuando se encuentra una herida más grave, de acceso difícil, o en la que la administración solo puede tener lugar mediante una vía indirecta.

En el caso de una herida aguda o trauma, es mejor administrar el tratamiento lo antes posible después de producirse el incidente. Sin embargo, el tiempo para la administración efectiva de inhibidores de la familia de tirosina quinasas Src puede estar comprendido entre aproximadamente las 48 horas desde el comienzo del daño o trauma, en el caso de accidentes agudos. Se prefiere que la administración tenga lugar en las 24 horas desde el comienzo, siendo mejor en las 12 horas, y resulta más preferido que la administración tenga lugar en las 6 horas desde el comienzo. La administración después de 48 horas del comienzo de la herida puede ser adecuada para reducir el daño tisular adicional debido a una pérdida vascular o un edema posteriores, sin embargo, el efecto sobre el daño tisular inicial puede quedar muy reducido.

Cuando se realiza una administración profiláctica con el fin de evitar la pérdida vascular o edema asociados con los procedimientos quirúrgicos, o realizada en vista de un criterio diagnóstico de predisposición, la administración puede tener lugar antes de cualquier incremento real de la VP, o durante dicho evento causante del incremento de la VP. Con el fin de tratar los trastornos crónicos que conducen a un incremento de VP y la pérdida vascular asociada o edema, la administración de inhibidores activos de la familia Src de tirosina quinasas se puede realizar mediante un régimen de dosis continuo.

Una cantidad moduladora de VP terapéuticamente efectiva es una cantidad de ácido nucleico que codifica proteína Src o Yes inactiva suficiente para producir una modulación medible de VP en el tejido que se está tratando, es decir, una cantidad moduladora de VP. La modulación de VP se puede medir mediante ensayos tal como se describe en la presente memoria, o mediante otros procedimientos conocidos en la materia. La modulación de VP se puede medir mediante el ensayo de ensayo de Miller, tal como se describe en la presente memoria, o mediante otros procedimientos conocidos en la materia.

Generalmente, la dosis puede oscilar con la edad, estado, género y extensión de la enfermedad en el paciente y la puede determinar un experto en la materia. La dosis también la puede ajustar el médico particular en caso de complicación.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar parenteralmente mediante inyección o mediante una infusión gradual durante un tiempo. Aunque típicamente se puede acceder al tejido que se debe tratar en el cuerpo mediante la administración sistémica y por consiguiente frecuentemente se trata mediante la administración intravenosa de las composiciones terapéuticas, se contemplan otros tejidos y medios de administración cuando existe la posibilidad de que el tejido objetivo comprenda las moléculas diana. Así, las composiciones de la presente invención se pueden administrar intravenosamente, intraperitonealmente, intramuscularmente, subcutáneamente, intracavidad, transdermalmente y se pueden administrar mediante medios peristálticos.

La administración intravenosa se realiza mediante inyección de dosis unitarias, por ejemplo. El término "dosis unitaria" cuando se utiliza haciendo referencia a una composición terapéutica de la presente invención, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para el sujeto, comprendiendo cada unidad una cantidad predeterminada del material activo calculada con el fin de producir los efectos terapéuticos deseados en asociación con el diluyente necesario; es decir, portador o vehículo.

En una forma de realización preferida el agente activo se administra en una dosis unitaria intravenosa. La administración localizada se puede lograr mediante inyección directa o aprovechando compartimentos anatómicos aislados, aislando la microcirculación de sistemas de órganos diana, reperfusión en un sistema circulante o la oclusión temporal a base de catéter de regiones diana del sistema vascular asociado al tejido enfermo.

Las composiciones se deben administrar de un modo compatible con la formulación de la dosis y en una cantidad terapéuticamente efectiva. La cantidad y tiempo en que se debe administrar depende del sujeto que se debe tratar, la capacidad del sistema del sujeto para utilizar el ingrediente activo y el grado de efecto terapéutico deseado. Las cantidades precisas de ingrediente activo que se debe administrar dependen del juicio del médico y son características de cada individuo. Sin embargo, los intervalos de dosis de administración sistémica se dan a conocer en la presente memoria y dependen de la vía de administración. También se encuentran disponibles regímenes adecuados de administración, pero están tipificados por una administración inicial seguida de dosis repetidas a intervalos de una o más horas mediante inyecciones subsiguientes u otra forma de administración. Por el contrario, se contempla una infusión intravenosa continua suficiente para mantener la concentración en la sangre en los intervalos especificados para la terapia in vivo.

La reducción del daño tisular debido a la pérdida vascular o el edema asociado a una enfermedad, daño o trauma, disminuye los síntomas de la enfermedad y, dependiendo de la enfermedad, puede contribuir a su curación. La extensión de la permeabilidad vascular en un tejido y por consiguiente la extensión de la inhibición se puede valorar mediante múltiples procedimientos. En particular, se pueden reducir los daños resultantes de la apoplejía u otros accidentes cerebrovasculares del SNC relacionados que tienen lugar como consecuencia del incremento de la VP inducida por la herida, y la siguiente pérdida vascular y/o daño por edema al tejido asociado.

En una forma de realización relacionada, un tejido que se debe tratar es un tejido inflamado y la permeabilidad vascular que se debe inhibir es debida a la estimulación mediada por VEGF. Para este tipo de aflicción, la presente invención contempla la inhibición de VP en los tejidos artríticos, tales como en un paciente con reumatismo articular crónico, en tejido inflamado inmune o no inmune, en tejido psoriático y semejantes.

En otra forma de realización relacionada, un tejido que se debe tratar es el tejido retiniano de un paciente con una enfermedad retiniana tal como la retinopatía diabética, degeneración macular o glaucoma neovascular y la VP que se debe inhibir es la VP del tejido retiniano en el que se produce neovascularización de tejido retiniano.

La composición de la presente invención se puede utilizar en un procedimiento destinado a la inhibición de la permeabilidad vascular en un tejido asociado con una herida o enfermedad y por consiguiente también con el fin de practicar el tratamiento de las enfermedades relacionadas con la permeabilidad vascular, que comprende poner en contacto un tejido en el que está teniendo lugar el incremento en la permeabilidad vascular, o corre el riesgo de que ocurra, con una composición que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de la familia Src de tirosina quinasas.

La modulación de VP y la reducción del daño tisular debido a pérdida vascular y edema pueden tener lugar en poco tiempo después de la administración de la composición terapéutica. La mayoría de los efectos terapéuticos se pueden visualizar dentro de 3 días desde la administración, en el caso de daño agudo o trauma. Típicamente, los efectos de la administración crónica no resultarán tan fácilmente evidentes.

Los factores temporales limitantes comprenden la velocidad de absorción por el tejido, la adquisición por el tejido, la traslocación de la proteína o la traducción del ácido nucleico (dependiendo del terapéutico) y la dirección de la proteína. Así, los efectos moduladores del daño tisular pueden tener lugar en tan poco tiempo como una hora desde el momento de la administración del inhibidor. También se puede prolongar o exponer más a los inhibidores de la familia Src de tirosina quinasas, utilizando las condiciones adecuadas. Así, modificando tales parámetros se pueden diseñar múltiples marcos terapéuticos temporales.

F. Composiciones terapéuticas (consideraciones generales)

La presente invención contempla composiciones terapéuticas de utilidad en la práctica de los procedimientos terapéuticos descritos en la presente memoria. En una forma de realización preferida, la composición terapéutica no es inmunogénica cuando se administra a un mamífero o paciente humano con fines terapéuticos.

Tal como se utiliza en la presente memoria, los términos "farmacéuticamente aceptable", "fisiológicamente tolerable" y las variaciones gramaticales de los mismos, haciendo referencia a la composición, vehículos, diluyentes, y reactivos se utilizan de modo intercambiable y se refieren a que los materiales se pueden administrar a un mamífero sin producir efectos fisiológicos indeseables tales como nausea, mareos, molestia gástrica y semejantes.

La preparación de una composición farmacológica que comprende ingredientes activos disueltos o dispersos en ésta es bien conocida por los expertos en la materia y no necesita estar limitada con base en la formulación. Típicamente, tales composiciones se preparan como inyectables tanto como disoluciones líquidas como suspensiones, sin embargo, también se pueden preparar formas sólidas adecuadas para disolución, o suspensión, en líquido antes de su utilización. La preparación también se puede emulsionar o presentar como una composición de liposomas.

El ingrediente activo se puede mezclar con excipientes farmacéuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente activo y en cantidades adecuadas para la utilización en los procedimientos terapéuticos descritos en la presente memoria. Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, disolución salina, dextrosa, glicerina, etanol o semejantes y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, la composición puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes mojantes o emulgentes, agentes tamponantes del pH y semejantes que incrementan la efectividad del ingrediente activo.

La composición terapéutica de la presente invención puede comprender sales farmacéuticamente aceptables de los componentes en ella. Las sales farmacéuticamente aceptables comprenden las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres del polipéptido) que se forman con ácidos orgánicos tales como, por ejemplo, ácido clorhídrico o ácido fosfórico, o ácidos orgánicos tales como ácido acético, tartárico, mandélico y semejantes. Las sales formadas con los grupos carboxílicos libres también se pueden derivar de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, sodio, potasio, amonio, calcio o hidróxidos férricos y bases orgánicas tales como isopropilamina, tremetilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína y semejantes.

Los vehículos fisiológicamente tolerables son bien conocidos en la materia. Son ejemplares de los vehículos líquidos las disoluciones acuosas estériles que no comprenden materiales además de los ingredientes activos y agua, o comprenden un tampón tal como fosfato sódico con un valor de pH fisiológico, disolución salina fisiológica o tanto una como la otra, tales como disolución salina tamponada con fosfato. Adicionalmente, los vehículos acuosos pueden comprender más de una sal tamponante, así como sales tales como los cloruros de sodio y potasio, dextrosa, polietilenglicol y otros solutos.

Las composiciones líquidas también pueden comprender fases líquidas además de y con la exclusión de agua. Los ejemplos de tales fases líquidas adicionales son glicerina, aceites vegetales tales como aceite de algodón y emulsiones de aceite agua.

F (i). Composiciones terapéuticas moduladoras de la VP de la presente invención

Para los vectores de expresión de ADN, la cantidad administrada depende de las propiedades del vector de expresión, el tejido que se debe tratar y consideraciones semejantes.

F(ii). Composiciones terapéuticas inhibidoras de la familia Src de tirosina quinasas de la presente invención

Los inhibidores adecuados de la familia Src de tirosina quinasas inhibirá específicamente la actividad tirosina quinasa biológica de la familia Src de tirosina quinasas. Una tirosina quinasa de la familia Src muy adecuada tendrá especificidad primaria para inhibir la actividad de la proteína ^{pp60}Src y secundariamente inhibir las quinasas de la familia Src más próximamente relacionadas tales como Yes. Los ejemplos de inhibidores de las tirosina quinasas de la familia Src particularmente adecuados comprenden PP1, PP2, PD173955, AGL1872, PD162531, Radicicol R2146, Geldanamicina y semejantes. Los inhibidores químicos adicionales de la familia Src de tirosina quinasas adecuados se pueden identificar y caracterizar utilizando ensayos conocidos en la materia.

Se hace referencia a las mutaciones en Src que demuestran ser inhibidoras de VP en lugar de estimularla, se refieren como mutaciones Src inactivas. Se hace referencia a las proteínas con mutaciones que confieren esta actividad inhibidora como proteínas Src dominantes negativas ya que inhiben la VP, comprendiendo la que resultante de actividad endógena de Src y también la actividad Src amplificada resultante de la actividad estimulante con factor de crecimiento. Así, ciertas mutaciones de c-Src tipo silvestre de la presente invención pueden también funcionar como dominantes negativas con respecto a su capacidad para bloquear el crecimiento de los vasos sanguíneos y VP y por ejemplo, por consiguiente reducir la VP in vivo. Por consiguiente, otros inhibidores adecuados de la familia Src de tirosina quinasas pueden comprender formas inactivas de las proteínas Src y Yes que pueden antagonizar la actividad Src y Yes, produciendo la inhibición o disminución en la permeabilidad vascular de los vasos sanguíneos en el tejido diana. Una proteína Src inactiva preferida es la Src 251. Otra proteína Src inactiva preferida es la Src K295M. Una proteína Yes inactiva preferida tendrá una actividad quinasa reducida en comparación con la de tipo silvestre.

Otros inhibidores de la familia Src de tirosina quinasas pueden ser ácidos nucleicos antisentido, análogos de los ácidos nucleicos o ácidos nucleicos proteínas que inhiben la expresión de los genes Src o Yes en las células diana. Las moléculas antisentido pueden estar en una cantidades terapéuticamente efectivas que modulan la VP cuando dicho ácido nucleico antisentido, que puede hibridarse al ARNm que codifica una proteína Src o Yes, puede hibridarse a dicho ARNm y producir la inhibición de la expresión celular de proteína tirosina quinasa Src o Yes cuando se transfecta en una célula diana en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Tal como se describió, la proteína c-Src inhibidora preferida comprende Src 251 en la que solamente se expresan los primeros 251 aminoácidos. Esta construcción no dispone del dominio quinasa completo y se le hace por consiguiente referencia como proteína Src "quinasa muerta". Una segunda construcción es la mutación Src (K295M) en la que el residuo del aminoácido lisina 295 está mutado a metionina. Esta mutación puntual en el dominio quinasa evita que se una el ATP y bloquea también las funciones quinasa dependientes relacionadas con la señalización y proliferación de las células vasculares y tumorales.

Con respecto a las mutaciones puntuales, cualquier mutación que resulta en la actividad inhibidora deseada se contempla para la utilización en la presente invención. Las construcciones de proteínas de fusión que combinan la proteína Src deseadas (mutación o fragmento de la misma) con etiquetas de aminoácido expresadas, epítopos antigénicos, proteínas fluorescentes, u otras proteínas o péptidos se contemplan también, siempre que el efecto modulador de la proteína Src esté intacto.

De modo semejante, la adición de un inhibidor exógeno de la actividad de la proteína Src o la estimulación de la expresión de dicho inhibidor en el tejido diana, tal como CSK (quinasa Src C-terminal), es también un medio para inhibir la actividad Src. La fosforilación de la Src inactivadora de la tirosina, es un medio para regular negativamente la quinasa c-Src terminal, a la que se hace referencia como CSK [Nada et al., Nature, 351:69-72 (1991); Okada et al., J. Biol. Chem., 266(36):24249-24252 (1991)]. Cuando CSK fosforila el aa527 en una Src de tipo silvestre, la proteína Src se inactiva. Así, CSK es un inhibidor útil y potente de la actividad Src. La secuencia de la proteína CSK humana de 450 aminoácidos se identifica mediante el número de accesión P41240 y se puede encontrar en el la base de datos del proteína suiza. Una secuencia de ácido nucleico de mRNA que codifica CSK humana se identifica con el número de accesión NM 004383 en la base de datos GenBank.

Para los vectores de expresión, la cantidad administrada depende de las propiedades del vector de expresión, el tejido que se debe tratar y consideraciones semejantes. Así, la cantidad efectiva de un inhibidor de la familia Src de tirosina quinasas en una composición farmacéutica es la cantidad que produce una modulación terapéuticamente efectiva de la permeabilidad vascular regulada por Src. Una cantidad terapéutica de una composición farmacéutica cualquiera es una que, por sí misma, produce la disminución de la

\hbox{pérdida vascular o edema
relacionado  con el daño tisular.}

G (i) Consideraciones generales; artículo de fabricación

Tal como se utiliza en la presente invención, el término material de embalaje se refiere a un material tal como vidrio, plástico, papel, láminas y semejantes que pueden retener en medios fijos un agente farmacéutico. Así, por ejemplo, el material de embalaje pude ser viales de plástico o vidrio, sobres laminados y recipientes semejantes utilizados para contener una composición farmacéutica que comprende un agente farmacéutico.

En una forma de realización preferida, el material de embalaje comprende una etiqueta que es una expresión tangible que describe el contenido del artículo de fabricación y la utilización del agente farmacéutico contenido en el mismo.

G (ii) Composiciones terapéuticas moduladoras de VP; artículo de fabricación

El agente farmacéutico en el artículo de fabricación es cualquiera de las composiciones de la presente invención adecuadas para proporcionar una proteína Src o Yes, formulada en una forma farmacéuticamente aceptable tal como se describe en la presente memoria según las indicaciones descritas. Así, la composición puede comprender un ADN que puede expresar una proteína Yes, o un ADN que puede expresar tanto una proteína Yes como Src. El artículo de fabricación contiene una cantidad de agente farmacéutico suficiente para su utilización en el tratamiento de un trastorno indicado en la presente memoria, tanto en dosis únicas como múltiples.

La proteína Src o Yes puede ser activa o inactiva, dependiendo de la modulación deseada. Las formas preferidas de Src y Yes inactivas se describieron anteriormente.

El material de embalaje comprende una etiqueta que indica la utilización del agente farmacéutico comprendido en el mismo, por ejemplo, para el tratamiento de trastornos asistidos mediante la inhibición o potenciación de la permeabilidad vascular y estados semejantes descritos en la presente memoria. La etiqueta puede además incluir instrucciones de utilización e información relacionada como la requerida para su comercialización. El material de embalaje puede comprender recipiente(s) para el almacenamiento del agente farmacéutico.

G (iii) Composición de inhibidor de la familia Src de tirosina quinasas; Artículo de fabricación

La presente invención contempla también un artículo de fabricación que es un recipiente etiquetado destinado a proporcionar una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de la familia Src de tirosina quinasas. Un artículo de fabricación comprende material de embalaje y un agente farmacéutico comprendido en el material de embalaje. El artículo de fabricación también puede comprender dos o más cantidades terapéuticamente sub efectivas de una composición farmacéutica, que actúan juntas sinérgicamente para producir la disminución del daño tisular debido a la pérdida vascular o edema.

El agente farmacéutico en el artículo de fabricación es una de las composiciones de la presente invención adecuada para proporcionar un inhibidor de la familia Src de tirosina quinasas, formulada en una forma farmacéuticamente aceptable tal como se describe en la presente memoria según las indicaciones publicadas. Así, la composición puede comprender un inhibidor químico tal como PP1, PP2, PD173955, AGL1872, PD162531, Radicicol R2146 y Geldanamicina, una proteína inhibidora tal como Src inactiva, Yes inactiva, proteína CSK activa, o una molécula de ácido nucleico que es que puede expresar dicha proteína o combinación de proteínas. El artículo de fabricación comprende una cantidad de agente farmacéutico suficiente para su utilización en el tratamiento de un trastorno indicado en la presente memoria, tanto en dosis únicas como en dosis múltiples.

El material de embalaje comprende una etiqueta que indica la utilización del agente farmacéutico comprendido en el mismo, por ejemplo, para el tratamiento de un trastorno asistido por la inhibición del incremento de la permeabilidad vascular y condiciones semejantes dadas a conocer en la presente memoria. La etiqueta puede además comprender instrucciones de utilización e información relacionada tal como se puede necesitar para la comercialización. El material de embalaje puede comprender recipiente(s) para el almacenamiento del agente farmacéutico.

Ejemplos

Los ejemplos siguientes hacen referencia a la presente invención y son ilustrativos y no limitativos de la invención. Además, las modificaciones de la presente invención, actuales o desarrolladas más adelante, que resultarán evidentes para los expertos en la materia, se deberán considerar dentro del alcance de la presente invención según las reivindicaciones adjuntas.

1. Preparación de construcciones para la expresión de c-Src o c-Yes

Con el fin de preparar las construcciones de expresión de utilidad en la modulación de VP y la angiogénesis, se manipuló cAND de c-Src y se insertó en un construcción/vector de expresión.

La secuencia de ADNc que codifica el tipo silvestre (es decir, endógeno) del c-Src de pollo se muestra en la Fig. 1 (SEC ID nº:2) la secuencia de residuos de aminoácidos codificada se muestra en la Fig. 2 (SEC ID nº:3). La secuencia de proteína codificada se traduce desde las posiciones de los nucleótidos 112 al 1713 del ADNc. La secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de ácido nucleico del ADNc de c-Src humano (SEC ID nº:4) y las secuencias de residuos de aminoácidos codificada (SEC ID nº:5) se muestran respectivamente en las Figs. 3 y 4. Para la secuencia de proteína humana, la secuencia codificante comienza en la posición de nucleótido 134 a 1486 del ADNc.

Se prepararon ADNc de tipo silvestre así como también múltiples c-Src mutados. Las construcciones mutadas de c-Src se prepararon mediante mutagénesis dirigida tal como describen Kaplan et al., [EMBO J., 13:4745-4756 (1994)]. Las construcciones de c-Src que codifican la proteína Src mutante de utilización en la presente invención se describen en Kaplan et al, id. Kaplan et al., describen múltiples construcciones de c-Src mutante y las proteínas codificadas de utilidad en la práctica de la presente invención. Por ejemplo, Kaplan et al., describen múltiples productos de alelos de c-Src de pollo en su Fig. 1, comprendiendo el Src A y Src 251.

La presente invención describe dos categorías de funcione c-Src con el fin de modular VP. Tal como se describió anteriormente, una categoría comprende moléculas de Src que incrementan la VP y por consiguiente se considera que son proteínas activas. En la presente invención se demuestra que el tipo silvestre de Src junto con múltiples mutaciones que inducen VP. Una mutación del c-Src de tipo silvestre que funciona en este contexto con respecto as su capacidad de inducir crecimiento de los vasos sanguíneos y VP es la mutación el mutante Src A que tiene una mutación puntual en la posición de residuo de aminoácido (aa) 527 que cambia tirosina 527 por fenilalanina. Este lugar es normalmente el lugar de regulación negativa por la quinasa c-Src, a la que se hace referencia como la quinasa CSK. Cuando CSK fosforila el aa527 en el tipo silvestre de Src, la proteína queda inactivada. Sin embargo, en el Src A mutado en la posición aa527, la tirosina reguladora está convertida en fenilalanina confiriendo así a la proteína actividad constitutiva (es decir, permanentemente) no sujeta no sujeta a inactivación mediante fosforilación.

En la presente memoria se describen otras mutaciones en Src que tienen el efecto modulador opuesto sobre VP, inhibiendo VP en lugar de estimulándolo. Dichas mutaciones se refieren como mutaciones inactivas de Src. Se hace referencia a las proteínas con mutaciones que confieren esta actividad inhibidora asimismo como proteínas Src dominantes negativas ya que inhiben VP, comprendiendo la resultante de la actividad endógena de Src así como también la actividad Src incrementada como resultado de la estimulación por factor de crecimiento. Así, ciertas mutaciones del c-Src tipo silvestre de utilidad en la presente invención pueden funcionar como dominantes negativas con respecto a su capacidad de bloquear el crecimiento de los vasos sanguíneos y la VP, por ejemplo, por consiguiente reducen la VP in vivo.

Tales proteína c-Src inhibidoras preferidas comprenden Src 251 en la que solamente se expresan los primeros 251 aminoácidos de Src. A esta construcción le falta el dominio quinasa por completo y se refiere por consiguiente como proteína Src de "quinasa muerta". Una segunda construcción es la mutación de Src (K295M) en la que el residuo de aminoácido lisina 295 está mutado a metionina. Esta mutación puntual en el dominio quinasa impide que se una el ATP y también bloquea las funciones de Src dependientes de la quinasa relacionadas a la señalización de las células vasculares y tumorales.

Con respecto a las mutaciones puntuales, cualquier mutación que produce la deseada actividad inhibidora o activadora se contempla para la utilización en la presente invención. También se contemplan las construcciones de proteínas de fusión que combinan la proteína Src deseada (mutante o fragmento del mismo) con las etiquetas de aminoácido deseadas, epítopos antigénicos, proteínas fluorescentes u otras proteínas o péptidos, siempre y cuando el efecto modulador de la proteína Src deseado esté intacto.

Por ejemplo, para la mutación activadora de Src en el residuo 527, siempre y cuando el residuo de aminoácido mutado resultante no sea tirosina, serina o treonina, la presente invención contempla que la presencia de un aminoácido alternativo en la posición deseada producirá una proteína Src con la deseada actividad moduladora promotora de VP activa.

La quinasa Yes de la familia Src a sido descrita anteriormente, pero no se conoce mucho sobre su función celular [Burck et al., The Oncogenes, Springer-Verlag, New York, pp. 133-155 (1988); Marth et al., Cell, 43:393 (1985); Semba et al., PNAS (USA), 83:5459 (1986); Shibuya et al., J. Virol, 42:143 (1982); Yoshida et al., Jpn. J. Cancer Res., 76:559 (1985)]. La proteína Yes activa preferida está codificada en el ácido nucleico descrito por Sukegawa et al., [Mol. Cell Biol., 7:41-47 (1987)]. Las modificaciones inactivantes de la proteína Yes humana y los ácidos nucleicos que codifican Yes se pueden lograr tal como se describió para Src.

TABLA 1

1

Una construcción de expresión preferida de utilización en la presente invención es la construcción RCASBP (A) (SEC ID nº:1). Este vector de expresión se basa en una serie de virus del sarcoma aviar competentes en la replicación con una polimerasa Bryan amplificada (BP) para mejor título y es específico para el tipo A de la glicoproteína del sobre expresada en las células aviares normales [Revisado en Methods in Cell Biology, 52:179-214 (1997); ver también, Hughes et al., J. Virol, 61:3004-3012 (1987); Fekete & Cepko, Mol. Cellular Biol., 13(4):2604-2613 (1993); Itoh et al., Development, 122:291-300 (1996) y Stott et al., BioTechniques, 24:660-666 (1998)]. La secuencia completa de RCASBP (A) (SEC ID nº:1) se proporciona en la lista de secuencias y en la Fig. 10 se describe un mapa de restricción de la construcción, al que se hace referencia en la presente memoria como RCAS.

La construcción Src 251 original fue subclonada por el Dr. Pam Schawrtzberg, en el NIH en el laboratorio del Dr. Harold Varmus. En resumen, la clonación del ADNc de la secuencia Src para la expresión de la misma se logró mediante la inserción de un conector que comprendiendo lugares de restricción Not I- BstB1-Not I en el lugar Not I único en el extremo 5' de Src 251. Src tiene un lugar Cla I único en el extremo 3'. La digestión de Src 251 con BstB1 y Cla I generó un fragmento BstB1-ClaI que se ligó en el lugar Cla I de RCASBP (A). Un extremo sobresaliente BstB1 permite la ligación del sobresaliente Cla I que no se recortará con Cla I.

Las construcciones Src adecuadas para la utilización en la práctica de la presente invención se obtienen fácilmente en el vector anterior mediante primero digiriendo el vector RCAS que comprende Src 251 con Not I y Cla I (en un fondo DAM+) con el fin de permitir la inserción de un ADNc de Src digerido de modo semejante. Por consiguiente esta construcción RCASBP (A) inicial que comprende Src 251 se utilizó además con el fin de subclonar todas las demás construcciones Src tal como se describieron anteriormente y en [Kaplan et al., The EMBO J., 13(20):4745-4756 (1994)] en RCASBP (A) mediante un fragmento Not I- Cla I generado mediante la construcción Src 251. Con el fin de producir la mutación c-Src deseada en el ADNc, se utilizaron procedimientos estándar de mutación dirigida conocidos por los expertos en la materia. Los cebadores diseñados para incorporar las mutaciones deseadas se diseñaron también con lugares de restricción con el fin de facilitar las siguientes operaciones de clonación. Se eliminan de la construcción de ácido nucleico fragmentos enteros de secuencias de ácido nucleico que codifican Src mediante procedimientos de amplificación por PCR sobre la base de las secuencias conocidas de ADNc de pollo, humanas y los homólogos semejantes de Src y a continuación se formaron las nuevas construcciones.

En una forma de realización de la presente invención, el cebador de PCR 3' utilizado con el fin de amplificar ácidos nucleicos Src codifica también una secuencia en marco. La utilización de este cebador añade una etiqueta de epítopo 9E10-myc al extremo carboxilo de la siguiente construcción de Src. Los aminoácidos siguientes se añadieron después del aminoácido 251 de Src con el fin de generar la construcción de vector que comprende la etiqueta de epítopo 9E10-myc: VDMEQKLIAEEDLN (SEC ID nº:6). Se realizaron dos PCR para cada una de las construcciones y se obtuvieron resultados semejantes. Todas las construcciones de mutantes construidas mediante PCR se secuenciaron también mediante PCR con el fin de confirmar la secuencia de ADN prevista de los clones. Los ADNc de Src tipo silvestre y mutado de utilización en los sistemas de expresión de utilización en la presente invención se encuentran también disponibles en Upstate Biotech Laboratories, Lake Placid, NY que vende Src aviar así como también humano y múltiples formas de quinasa mutante muerta y activada.

Los vectores de expresión alternativos para la expresión de proteínas Src o Yes de utilidad en la presente invención comprenden también vectores adenovíricos tales como los descritos en las patentes US nº 4.797.368; nº 5.173.414; nº 5.436.146; nº 5.589.377 y nº 5.670.488. Los procedimientos alternativos para la administración de proteínas moduladoras de Src o Yes comprenden la administración de ADNc de Src o Yes con un sistema de vector no vírico tal como se describe en la patente US nº 5.675.954 y la administración del ADNc propiamente como ADN desnudo tal como se describe en la patente US nº 5.589.466. La administración de las construcciones de utilización en la presente invención tampoco está limitada a la aplicación tópica de vector vírico tal como se describe en el sistema de ensayo CAM más adelante. Por ejemplo, las preparaciones de vector vírico también se inyectan intravenosamente para la administración sistémica en el lecho vascular. Estos vectores también son dirigibles a los lugares de vascularización incrementada mediante la inyección localizada en un tumor, por ejemplo.

Las proteínas expresadas in vitro se contemplan también para la administración de las mismas después de la expresión y purificación de la proteína Src seleccionada mediante procedimientos de utilidad para la administración de proteínas o polipéptidos. Uno de tales procedimientos comprende sistemas de administración por liposomas, tales como los descritos en las patentes US nº 4.356.167; nº 5.580.575; nº 5.542.935 y nº 5.643.599. Los expertos en la materia también conocen otros vectores y sistemas de administración de proteínas para ser utilizado en la expresión y/o administración de las proteínas Src o Yes de utilidad en la presente invención.

2. Caracterización de la preparación de la membrana corioalantoica de pollo (CAM) no tratada A. Preparación de CAM

Se puede inducir la angiogénesis en la membrana corioalantoica (CAM) después de que la angiogénesis embriónica normal a resultado en la formación de vasos sanguíneos maduros. Se ha demostrado que la angiogénesis se induce en repuesta a citoquinas específicas o fragmentos de tumor tal como describen Leibovich et al., [Nature, 329:630 (1987) y Ausprunk et al., Am. J. Pathol., 79:597 (1975)]. Las CAM se prepararon a partir de embriones de poyo para la subsiguiente inducción de la angiogénesis e inhibición de la misma. Embriones de pollo de diez días de McIntyre Poultry (Lakeside, CA) y se incubaron a 37ºC y 60% humedad. Se produjo una pequeña perforación a través de la cáscara en el extremo del huevo directamente sobre la cámara de aire mediante la utilización de un pequeño taladro (Dremel, Division of Emerson Electric Co, Racine WI). Se realizó una segunda perforación en el lado ancho del huevo en una zona libre de vasos sanguíneos del embrión que se determinó previamente por transparencia del huevo. Se aplicó presión negativa en la primera perforación, lo que resultó en la separación de la CAM (membrana corioalantoica) de la membrana de la cáscara y creó una falsa cámara de aire sobre la CAM. Se cortó una pequeña ventana de 1,0 centrímeto (cm) x 1,0 cm cuadrado a través de la cáscara sobre la CAM descolgada mediante la utilización de un pequeña rueda de cortar (Dremel). La pequeña ventana permitió acceso directo a la CAM
subyacente.

La preparación de CAM resultante a continuación se utilizó a los 6 días de embriogénesis, una etapa marcada por una neovascularización activa, sin tratamiento adicional a la CAM, reflejando el modelo utilizado para la evaluación de los efectos sobre la neovascularización embriónica o se utilizaron a los 10 días de embriogénesis cuando ha cesado la embriogénesis. Esta última preparación se utilizó en la presente invención con el fin de inducir angiogénesis renovada en respuesta al tratamiento con citoquinas o a ponerla en contacto con un tumor tal como se describe más adelante.

3. Ensayo de angiogénesis en CAM A. Angiogénesis inducida por factores de crecimiento

Se ha demostrado que las citoquinas o factores de crecimiento inducen angiogénesis. Se indujo angiogénesis colocando un disco de 5 mm x 5 mm de filtro Whatman (Whatman Filter Paper nº1) saturado de disolución de equilibrada de sal Hank (HBSS, Gibco, Grand Island, NY) o HBSS con 2 microgramos/ml (\mug/ml) de factor de crecimiento fibroblástico (bFGF) o factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) (Genzyme, Cambridge, MA) en la CAM de los embriones de pollo de 9 ó 10 días en una región desprovista de vasos sanguíneos y a continuación se sellaron las ventanas mediante cinta adhesiva. También son efectivas otras concentraciones de factores de crecimiento en la inducción del crecimiento de vasos sanguíneos. En los ensayos en los que la inhibición de la angiogénesis se evaluó mediante la inyección intravenosa de antagonistas, la angiogénesis se induce inicialmente con ente 1 y 2 \mug/ml de bFGF o VEGF en medio de crecimiento fibroblástico. La angiogénesis se monitorizó mediante fotomicroscopía después de 72 horas.

B. Angiogénesis embriónica

La preparación de CAM destinada a evaluar el efecto de los inhibidores de la angiogénesis sobre la formación natural de neovasculatura embriónica es la del embrión de pollo embriónico de 6 días tal como se describió anteriormente. En esta etapa del desarrollo los vasos sanguíneos están sufriendo crecimiento de nuevo y por consiguiente proporcionan un sistema de utilidad con el fin de evaluar la modulación de la angiogénesis por las proteínas Src de utilidad en la presente invención. El sistema CAM se prepara tal como se describió anteriormente, con la excepción de que el ensayo se realiza en el día embriónico 6 en lugar de en el día 9 ó 10.

4. Modulación de la angiogénesis tal como se mide en el ensayo CAM

Con el fin de evaluar los efectos de las proteínas Src sobre la angiogénesis, los siguientes ensayos se realizaron en preparaciones de CAM de pollos de 10 días de edad. Se transfectaron cinco \mug de construcciones RCAS preparadas tal como se describe en el Ejemplo 1, en la línea de fibroblastos de pollo inmortalizado DF-1 (regalos de Doug Foster, U. of Minn.). Esta línea celular así como también los fibroblastos primarios de embrión de pollo fue que puede producir virus, sin embargo, la línea celular DF-1 produjo títulos más elevados. Los sobrenadantes víricos se recogieron de las líneas celulares DF-1 confluentes productoras en medio CLM libre de suero [composición: base de medio F-10 suplida con DMSO, ácido fólico, ácido glutámico y disolución vitamínica MEM]. Se concentraron treinta y cinco ml de sobrenadante vírico mediante ultracentrifugación a 4ºC durante 2 horas a 22.000 rpm. Estos precipitados de virus concentrados se resuspendieron en 1/100 del volumen inicial en medio CLM libre de suero, se hicieron alícuotas y se almacenaron a -80ºC. El título se ensayó mediante la infección de diluciones seriadas de un vector vírico control que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína verde fluorescente (GFP), a la que se hace referencia como RCAS-GFP, mediante la infección de fibroblastos primarios de embrión de pollo que se incubaron durante ente 48 y 72 horas. Los títulos del stock vírico que se obtuvieron después de la concentración superaron rutinariamente 10^{8} I.U./ml. Para el ensayo CAM que utiliza los stocks víricos, se prepararon discos de filtro Whatman de 6 mm de diámetro mojados en acetato de cortisona, en cortisona a 3 mg/ml acetato de cortisona durante 30 minutos en 95% etanol. Los discos se secaron en una campana de flujo laminar y a continuación se mojaron en 20 \mul de stock vírico por disco durante 10 minutos. Estos discos se aplicaron al CAM de embrión de pollo de 9 a 10 días, se sellaron con cinta de celofano y se incubaron a 37ºC durante entre 18 y 24 horas. A continuación se añadió PBS simulado o factores de crecimiento a una concentración de 5 \mug/ml a la CAM en un volumen de 20 \mul del stock vírico adecuado, como un empujón de virus adicional al tejido CAM. Después de 72 horas, las CAM se cosecharon y examinaron para determinar los cambios en el índice de angiogénesis tal como se determina mediante un contaje doble ciego del número de puntos de bifurcación en la CAM subyacente al disco. Para los ensayos de quinasa, se cosechó el tejido debajo del disco en RIPA, se homogeneizó mediante un triturador monitorizado y se inmunoprecipitó Src de cantidades equivalentes de proteína total y se sometió a un ensayo de quinasa in vitro utilizando la proteína de fusión FAK-GST como sustrato. Para los ensayos de inmunofluorescencia, el tejido CAM debajo de los discos se congeló en OCT, un criopreservante, se seccionó a 4 \mum, se fijó en acetona durante 1 minuto, se incubó en 3% suero normal de cabra durante 1 hora, seguido de una incubación en anticuerpo primario de conejo antiERK fosforilada tal como se describió anteriormente [Eliceiri et al., J. Cell Biol., 140:1255-1263 (1998)], se lavó en PBS y se detectó mediante un anticuerpo secundario fluorescente.

A. Activación de Src endógeno mediante bFGF o VEGF

Con el fin de determinar los efectos de los factores de crecimiento sobre la actividad de Src en la modulación de la angiogénesis, se realizaron los siguientes ensayos. Se homogenizaron extractos de tejido de CAM de pollo de 10 días de edad que se habían expuesto a bFGF o VEGF (2 \mug/ml) durante dos horas. Se inmunoprecipitó Src endógena de cantidades equivalentes de proteína total y se sometió a un ensayo in vitro de quinasa complejo inmune utilizando una proteína de fusión FAK-GST como sustrato, se sometió a electroforesis y se transfirió a nitrocelulosa.

Los resultados del ensayo se muestran en la Fig. 5, en la que el incremento en actividad Src se evidencia mediante el incremento de la densidad en el gel con tratamiento de bFGF o VEGF en comparación con muestras (simuladas) que son indicativas del nivel basal de actividad Src en el ensayo CAM. Tanto bFGF como VEGF produjeron aproximadamente un incremento de 2 veces en la actividad endógena de Src presente en la CAM. El ensayo de transferencia anterior también se ensayó mediante un anticuerpo antiSrc como control de la carga de un contenido equivalente de Src e IgG.

B. Efecto de la expresión génica de Src A mediada por retrovirus en la angiogénesis en CAM de pollo

Se realizaron los siguientes ensayos con el fin de ensayar el efecto de proteínas mutantes Src sobre la angiogénesis en la preparación CAM. Para el ensayo, se expusieron CAM de poyo de 9 días de edad a retrovirus que expresan RCAS-Src A o RCAS-GFP o a tampón durante 72 horas siguiendo el protocolo descrito anteriormente.

Los resultados de este ensayo se muestran en la Fig. 6A en la que se cuantificó el nivel de angiogénesis tal como se describió anteriormente. Las microfotografías (4X) se tomaron utilizando un estereomicroscopio tal como se muestra en la Fig. 6B. La actividad Src endógena basal tiene un índice angiogénico de aproximadamente 50. Por el contrario, las CAM tratadas con RCAS-Src-A expresado por vector retrovírico con una mutación puntual en la posición de residuo de aminoácido 527 de tirosina a fenilalanina, resultó en un incremento (inducción) de la angiogénesis a un índice angiogénico de 90. El incremento de la angiogénesis mediado por Src-A también resulta evidente en las fotografías mostradas en la Fig. 6B.

C. Expresión retrovírica de Src A activa la fosforilación de la quinas MAP vascular

El efecto de Src A en comparación con los factores de crecimiento VEGF y PMA sobre la fosforilación quinasa MAP vascular se ensayaron también según los procesos de ensayo descritos anteriormente en la presente memoria. Los extractos de tejido de CAM de pollos de 10 días de edad expuestas a VEGF o PMA (otro mitógeno a una concentración comparable) durante 30 minutos, se compararon con los infectados con retrovirus que expresan Src-A durante 48 horas. A continuación se inmunoprecipitó Src de cantidades equivalentes de extracto de proteína total y se sometió a un ensayo in vitro de inmunocomplejo quinasa utilizando una proteína de fusión FAK-GST como sustrato, se sometió a una electroforesis y se transfirió a nitrocelulosa.

Los resultados de este ensayo se muestran en la Fig. 7A, en la que las CAM no tratadas (NT) muestran fosforilación endógena de la quinasa MAP vascular mediada por Src a nivel basal. Tanto el VEGF como el PMA produjeron un incremento de aproximadamente 2 veces sobre la línea basal. Por el contrario, Src A incrementó la actividad en entre aproximadamente 5 y 10 veces sobre la observada con muestras sin tratar.

También se midieron alícuotas de los anteriores homogeneizados de tejido total para determinar la fosforilación endógena de ERK mediante inmunotransferencia con un anticuerpo antifosfo-ERK tal como se muestra en la Fig. 7B. Para este ensayo, se infectaron CAM de 10 días de edad con RCAS simulados o con RCAS que expresaban Src A. después de dos días, se disecaron las CAM, se criopreservaron en OCT y se seccionaron a 4 \mum. Las secciones se inmunotiñeron con anticuerpo antiERK-fosforilada (New England Biolabs), se lavaron y se detectó con un anticuerpo secundario de cabra anticonejo conjugado a FITC. Las imágenes fluorescentes se capturaron en una cámara con un CCD enfriado (Princenton Inst.). Las fotomicrografías indicaron un incremento de la inmunofluorescencia en las preparaciones tratadas con Src-A en comparación con los controles simulados.

D. Requerimiento selectivo de la actividad Src durante la angiogénesis inducida por VEGF pero no por bFGF

Con el fin de ensayar el efecto de la actividad moduladora de Src sobre la angiogénesis inducida por factor de crecimiento, se realizaron los siguientes ensayos. Se expusieron CAM de pollos de nueve días a la preparación de vectores retrovíricos que expresa la mutación de Src dominante negativa a la que se hace referencia como Src 251 o Src K295M tal como se describió anteriormente. CAM tampón o retrovirus RCAS-Src 251 o RCAS-GFP de control o tampón se trataron durante 20 horas y se incubaron durante 72 horas

\hbox{adicionales en
presencia o ausencia  de bFGF o VEGF.}

El nivel de angiogénesis, cuantificado tal como se describió anteriormente, se muestra en la Fig. 8A. Las fotomicrografías representativas (6X), mostradas en la Fig. 8B, se tomaron mediante un estereomicroscopio. La Fig. 8C ilustra una transferencia explorada con un anticuerpo antiSrc con el fin de confirmar la expresión de Src 251 en las células transfectadas en comparación con el tratamiento simulado.

Los resultados de los ensayos descritos anteriormente indican que tanto las CAM tratadas con bFGF como con VEGF en presencia de controles RACS-GFP indujeron angiogénesis superior a la angiogénesis basal mediada por Src observada en las preparaciones de CAM simuladas o no tratadas. El mutante Src 251 negativo dominante expresado fue efectivo en la inhibición de la angiogénesis inducida por VEGF al nivel de la línea basal sin ser efectivo en la inhibición de la angiogénesis mediada por bFGF. Las fotomicrografías mostradas en la Fig. 8B confirman gráficamente los datos mostrados en la Fig. 8A. así, Src 251 expresado retroviralmente es un inhibidor efectivo de la angiogénesis, cuando l angiogénesis está inducida con VEGF.

En la presente invención se contemplan las aplicaciones de la proteína Src de utilidad en la presente invención con otros modelos de angiogénesis tal como se describe en los Ejemplos más adelante.

5. Regresión del crecimiento del tejido tumoral con moduladores Src tal como se mide mediante el ensayo en el modelo de ojo de conejo

El efecto de los moduladores Src sobre la angiogénesis inducida mediante factores de crecimiento se puede observar en microestructuras naturalmente transparentes tales como las que ejemplifica la córnea del ojo. Los nuevos vasos sanguíneos crecen a partir del borde de la córnea, que dispone de un aporte sanguíneo rico, hacia el centro de la córnea que normalmente no tiene aporte sanguíneo. Los estimuladores de la angiogénesis, tales como bFGF, cuando se aplican a la córnea inducen el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos a partir del borde de la córnea. Los antagonistas de la angiogénesis, aplicados a la córnea, inhiben el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos a partir del borde de la córnea. Así, la córnea produce angiogénesis mediante una invasión de las células endoteliales del borde de la córnea hacia el rudo tejido corneal lleno de colágeno que es fácilmente visible. El ensayo de modelo de ojo de conejo proporciona por consiguiente un modelo in vivo para la observación directa de la estimulación e inhibición de la angiogénesis después de la implantación de compuestos directamente en la córnea del ojo.

El ensayo modelo de ojo de conejo in vivo demuestra angiogénesis inducida por factores de crecimiento

Se induce angiogénesis en el ensayo modelo de ojo de conejo in vivo mediante los factores de crecimiento bFGF o VEGF y se describe en la sección siguiente.

Se preparan partículas del polímero Hydron conteniendo factor de crecimiento según describen D'Amato et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91:4082-4085 (1994). Las partículas contienen 650 ng de factores de crecimiento unidos independientemente a sucralfate (Carafet, Marion Merrell Dow Corporation) con el fin de estabilizar el factor de crecimiento y asegurar su liberación lenta en el tejido circundante. Además, las partículas de hydron se preparan conteniendo el retrovirus que expresa el Src deseado tal como se describió anteriormente. Las partículas se moldean en clavijas de teflón especialmente preparadas que disponen de un núcleo taladrado en su superficie. Se colocan aproximadamente 12 \mul del material de moldear en cada clavija y se deja polimerizar durante la noche en una campana estéril. Las partículas se esterilizan mediante irradiación ultravioleta. A continuación se ensayan los efectos de las proteínas Src tal como se describió anteriormente.

6. Regresión in vivo del crecimiento de tejido tumoral mediante moduladores Src tal como se mide mediante el ensayo quimérico ratón:humano

Se genera un modelo de quimera ratón:humano in vivo reemplazando una parte de la piel de un ratón SCID con piel de prepucio neonatal humano. El ensayo in vivo de quimera ratón:humano se prepara esencialmente tal como describen Yan, et al., [J. Clin. Invest., 91:986-996 (1993)]. En breve, se extrae quirúrgicamente un cuadrado de 2 cm^{2} de superficie de piel de un ratón SCID (6 a 8 semanas de edad) y se reemplaza con prepucio humano. El ratón se anestesia y se elimina el pelo de un área de 5 cm^{2} en cada lado de la región abdominal lateral mediante afeitado. Se preparan dos lechos circulares de injerto de 2 cm^{2} mediante la eliminación del grosor total de piel hasta la fascia. Se colocan injertos de prepucio humano de todo el grosor del mismo tamaño sobre las heridas del lecho y se suturan en el lugar. El injerto se recubre con un Band-Aid que se sutura a la piel. También se aplica cinta adhesiva de tejido micropore con el fin de cubrir la herida.

Se utiliza la línea de melanoma humano M21-L o la línea de carcinoma de mama humano MDA 23.1 (ATCC HTB 26; \alpha_{v}\beta_{3} negativa mediante inmunorreactividad de secciones de tejido a mAb LM609) con el fin de formar tumores sólidos humanos en el injerto de piel humana en el ratón SCID. Se inyecta una suspensión de 5 x 10^{6} células independientes M21-L o MDA 23.1 intradermalmente en el injerto de piel humana. A continuación se observan los ratones durante entre 2 a 4 semanas con el fin de permitir el crecimiento tumores humanos medibles.

Una vez se establece un tumor humano medible, se inyectan preparaciones de retrovirus de la presente invención o PBS en la vena de la cola del ratón. Después de un período de entre 2 y 3 semanas, el tumor se extrae y se analiza mediante pesado e histología. Se ensayan los efectos de la proteína Src expresada de utilidad en la presente invención, sobre los tumores.

7. Regresión in vitro del crecimiento del tejido tumoral mediante moduladores Src tal como se mide mediante ensayo CAM

El crecimiento tumoral depende de la angiogénesis [Folkman, J. Biol, Chem. 267:10931-10934 (1992); Weidner et al., N.E. J.Med. 324:1-8 (1991); Brooks et al., Cell 79:1157-1164 (1994)] de hecho, las publicaciones recientes sugieren que el crecimiento tumoral es sensible a los efectos antiantiogénicos de los antagonistas del receptor de VEGF [Kim et al., Nature, 362:8451-844 (1993)]. Por consiguiente, se examinó si la supresión de angiogénesis mediante la administración de Src-251-sin quinasa influenciaría el crecimiento de un meduloblastoma humano (DAOY), un tumor muy angiogénico que se conoce que produce VEGF y muy poco bFGF.

Los ensayos de crecimiento tumoral de meduloblastoma DAOY de entre 3 y 6 días se realizaron en CAM de pollo esencialmente tal como se describió anteriormente [Brooks et al., supra (1994)]. Se lavaron 5 x 10^{6} células DAOY cultivadas en RPMI 1640 con 10% suero bovino fetal y se sembraron en la CAM de un embrión de 10 días con el fin de producir fragmentos de tumor DAOY. Después de 7 días, se disecaron fragmentos de tumor de 50 mg y se resembraron en otro embrión de 10 días y se incubaron durante otros 3 a 6 días con aplicación tópica (25 \mul) de retrovirus control RCAS-GFP, RCAS-Src 251 o tratamiento simulado. Mediante la generación de imagen confocal de tejido completo de los tumores infectados como guía, fue posible determinar que, mediante esta estrategia tópica, se produjo una expresión significativa de las construcciones RCAS alrededor de y en los fragmentos de tumor. Se resecaron y pesaron los tumores de modo doble-ciego extrayendo solamente la masa tumoral definible [Brooks et al., supra 1994]. El peso húmedo del tumor después de entre 3 y 6 días se comparó con el peso inicial y se determinó el porcentaje de cambio en el peso tumoral para cada grupo.

Estos tumores crecieron fácilmente en la CAM y produjeron angiogénesis activa (Fig. 9) permitiendo dirigir selectivamente al sistema vascular tumoral derivada del ave mediante la utilización de un retrovirus RCAS específico de ave.

La Fig. 9, describe resultados que muestran que la administración retrovírica de RCAS-Src 251 a los tumores humanos creciendo en la CAM de poyo invierte el crecimiento tumoral. La Fig. 9A muestra meduloblastomas que habían sido crecidos en CAM de embrión de pollo tal como se describió anteriormente. Se aplicó tópicamente retrovirus que comprenden RCAS-GFP o RCAS-Src 251 a tumores preestablecidos superiores a 50 mg. Una micrografía de un fragmento de tumor de meduloblastoma infectado con RCAS-GFP que expresaba GFP revela la expresión exclusiva en los vasos sanguíneos del tumor (flecha) tal como se detectó mediante sección óptica con un microscopio confocal de barrido láser Bio Rad (barra = 500 \mum). La Fig. 9B muestra los resultados de tumores tratados tal como anteriormente a los que se permitió crecer durante entre 3 y 6 días después de los que se resecaron y se determinó el peso húmedo. Los datos se expresan como el cambio medio en peso tumoral (desde el peso inicial de 50 mg del tumor) +/- SEM de 2 réplicas. Los RCAS-Src 251 tuvieron un impacto significativo sobre el crecimiento tumoral después de 3 días (*, p < 0,002) y 6 días (**, p< 0,05). La Fig. 9C muestra estereomicrografías representativas de tumores de meduloblastoma extraídos quirúrgicamente de embriones y adquiridas mediante un estereomicroscopio Olympus (barr = 350 \mum). Panel inferior, una micrografía de gran amplificación de cada tumor mostrando el sistema vascular de cada tumor en detalle (barra = 350 \mum). Las flechas indican vasos sanguíneos destruidos en los tumores tratados con RCAS-Src-251.

Los resultados muestran que la administración de RCAS que comprenden Src 251 a los meduloblastomas preestablecidos resultó en la expresión vírica selectiva en los vasos sanguíneos asociados a los tumores (Fig. 9A) y ello finalmente condujo a la regresión de estos tumores en el período de seis días (Fig. 6B). Importantemente, los vasos sanguíneos asociados a los tumores en los animales tratados con virus que comprenden Src 251 estuvieron severamente destruidos y fueron menos en número en comparación con los vasos tumorales en los animales control (Fig. 9C). El hecho de que los tumores infectados con RCAS-GFP mostraron GFP localizada solamente en el sistema vascular del tumor sugiere que los efectos antitumorales observados con el Src 251 administrado retroviralmente fueron debidos a sus propiedades antiangiogénicas.

8. Necesidad de Src para la supervivencia celular durante la angiogénesis mediada por VGEF pero no por bFGF

La información reciente sugiere que los receptores de los factores de crecimiento [Choi y Ballermann, J. Biol. Chem., 270:21144-21150 (1995); Satake et al, Biochem. Biophys. Res. Comm., 244:642-646 (1998)] e integrinas [Meredith, et al., Mol. Biol. Cell, 4:953-961 (1993); Brooks et al., Science, 264:569-571 (1994a)] promocionan la supervivencia de las células endoteliales angiogénicas. El hecho de que tanto los factores de crecimiento como los receptores de adhesión también regulen la actividad Src sugirió el examen de la función de Src sobre la supervivencia de las células endoteliales durante la angiogénesis. Se infectaron CAM estimuladas con bFGF o VEGF con retrovirus comprendiendo Src 251 y se analizaron secciones de criostato de los tejidos para determinar la presencia de células apoptóticas.

En breve, secciones de criostato de CAM tratadas con RCAS-GFP o RCAS-Src 251 tratadas con bFGF o VEGF se analizaron para determinar células apoptóticas utilizando Apoptag Kit (Oncor, Gaithersburg, MD). Las secciones se inmunotiñeron también con un anticuerpo policlonal de conejo antivWf (Biogenix, San Ramon, CA) y se contratiñeron con 1 \mug/ml DAPI. Las imágenes de fluorescencia se capturaron con una cámara de CCD enfriado (Roper, Trenton, NJ), y las imágenes de fluorescencia se procesaron y aparejaron las exposiciones entre tratamientos experimentales tal como se describió anteriormente [Ellcelri, et al., 1998, supra].

Con el fin de medir el índice apoptótico de los tejidos CAM infectados con retrovirus, se utilizó annexina V conjugada a FITC (Clontech, Palo Alto, CA) para teñir las suspensiones celulares y las células lavadas se analizaron por citometría de flujo. Las suspensiones celulares de células de CAM se prepararon a partir de CAM infectadas con virus o simuladamente infectadas, mediante la digestión con 0,1% (peso/vol) colagenasa tipo IV (Worthington Biochemicals, Lakewood, NJ) en RPMI 1640 de tejido de CAM triturado, con agitación durante 1 hora a 37ºC tal como se describió anteriormente (Brooks et al., 1994b) y filtrado a través de una rejilla de nylon de 100 \muM [Becton Dickinson, Fountain Lakes, NJ). La fluorescencia se midió con un citómetro de flujo FACscan (Becton Dickinson) con el fin de contar 10.000 células.

Las mediciones de tinción con vWf mediante FAC se realizaron en preparaciones paralelas de células de tejido de CAM digerido con colagenasa, que se fijaron en 1,8% paraformaldehído, se fijaron en 70% etanol, se incubaron con en anticuerpo antivWf y se detectaron con un anticuerpo secundario conjugado a FITC.

La administración de Src 251 promovió una tinción TUNEL extensa entre los vasos sanguíneos positivos al antígeno relacionado al factor VIII [factor von Willebrand [vWf]] en las CAM estimuladas con VEGF pero no con bFGF. De hecho, en estas CAM se observó una apoptosis mínima entre los demás tipos celulares, lo que sugiere una necesidad específica de las células endoteliales por actividad quinasa Src para la supervivencia celular en los vasos sanguíneos activados por VEGF. En una segunda serie de experimentos, las CAM infectadas con retrovirus estimuladas con VEGF o con bFGF se sometieron a una digestión limitada con colagenasa con el fin de preparar una suspensión de células sueltas. Estas células derivadas de CAM demostraron comprender aproximadamente entre el 20 y el 50% de células endoteliales (positivas a vWf) y se analizaron para determinar apoptosis mediante detección por citometría de flujo de células positivas a annexina V, un marcador temprano de la apoptosis. Las células derivadas de las CAM infectadas con Src 251 y estimuladas con VEGF tuvieron una tinción con annexina V significativamente incrementada relativa a las células de CAM infectadas simuladamente con RCAS-GFP y tratadas con VEGF. Por el contrario, las células derivadas de CAM infectadas simuladamente o las infectadas con RCAS-Src 251 y estimuladas con bFGF mostraron poca o no tinción con annexina V. Además, no se detectó tinción con annexina V entre las células derivadas de CAM no estimuladas o estimuladas con bFGF. Estos datos demuestran que la actividad quinasa Src es necesaria selectivamente para la supervivencia de las células endoteliales durante la angiogénesis mediada por VEGF pero no por bFGF en la CAM.

9. Requerimiento selectivo de la actividad de quinasa Src en un modelo subcutáneo murino de angiogénesis

Con el fin de analizar más la función de Src en la angiogénesis se utilizó un modelo murino. En este caso, se indujo la angiogénesis mediante la inyección subcutánea de factor de matrigel sin factor de crecimiento suplementado con bFGF (100 ng/ml) o VEGF (400 ng/ml) en ratones atímicos wehl (nu/nu) adultos y se analizó después de 5 días [Passaniti et al., 1992]. La angiogénesis se cuantificó extrayendo y homogeneizando el tejido, aislando las proteínas e inmunotransfiriendo con anticuerpo contra receptor del VEGF (flk-1) (Fig. 13A) que es específico para la células endoteliales. Tal como se observó en el pollo, la expresión de ADNc de Src-251 desprovisto de quinasa bloqueó la angiogénesis inducida por VEGF en este modelo murino mientras que no tuvo efecto sobre la angiogénesis inducida por bFGF (Fig. 13B). Con el fin de establecer la función del Src endógeno en este modelo, se infectaron los tejidos con un retrovirus para la expresión de Cak que inhibe la actividad de Src endógeno mediante la fosforilación del lugar regulador C-terminal [Nada et al., Nature, 361:68-72 (1991)]. La expresión de Cak bloqueó la angiogénesis inducida por VEGF pero no la inducida por bFGF (Fig. 13), confirmando una función de la actividad Src endógena en la angiogénesis mediada por VEGF. La neovascularización de estos tejidos estimulados infectados por virus, se confirmó mediante inmunofluorescencia directa con anticuerpo antiDC34 conjugado a FITC (Fig. 13) o con anticuerpo antiflk-1 y se cuantificó por enumeración del número de vasos

\hbox{sanguíneos positivamente teñidos para CD34 en cada
criosección (Fig. 13C).}

En breve, se indujo angiogénesis mediante la inyección subcutánea de Matrigel desprovisto de factor de crecimiento que contenía disolución salina o VEGF (400 ng/ml) con 2 x 10^{6} células ecotrópicas empaquetadoras que expresaban retrovirus GFP, en el flanco de un ratón atímico wahl (nu/nu) y se analizó después de 5 días de incubación. La neovascularización se cuantificó mediante inmunotransferencia con anticuerpo antireceptor del VEGF (flk-1) que es específico para las células endoteliales. La Fig. 15A describe los resultados de la inmunotransferencia. Los efectos del retrovirus Src-251 desprovisto de quinasa, Csk o GFP sobre la angiogénesis inducida por VEGF (400 ng/ml) o bFGF (400 ng/ml) se analizó mediante inmunotransferencia del homogeneizado de tejido con un anticuerpo antiflk-1. Un ejemplo de estos resultados se describe en la Fig. 15B. El efecto de los retrovirus que expresan Src-251 y Csk sobre la neovascularización inducida por VEGF se cuantificó mediante la enumeración del número de vasos CD34 positivos en secciones transversales de tejido mediante inmunofluorescencia indirecta en campos triplicados al azar, a 20X. Las criosecciones de las biopsias se sometieron también a tinción por inmunofluorescencia con anticuerpo antiCD34 o con anticuerpo antiflk, se fotografiaron y se cuantificaron tal como se describió anteriormente para los ensayos de angiogénesis en CAM.

La fluorescencia de los montajes completos de fragmentos tumorales infectados con RCAS-FGP se logró mediante la disección de un fragmento de tumor y haciendo imágenes del fragmento sin fijar directamente en un portaobjetos utilizando un microscopio confocal láser (MRC 1024: Rio-Rad, Hercules, CA).

10. Efecto de la expresión intradermal de VEGF en oreja de ratón Src^{-/-} o Src^{+/-}

Continuando con los resultados obtenidos en los modelos de pollo y ratón, se utilizó una estrategia genética directa con el fin de examinar la angiogénesis inducida por VEGF en ratones Src^{-/-}. También se examinaron los efectos sobre la permeabilidad vascular, ya que se conoce que el VEGF tanto inicia el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos como promociona la permeabilidad vascular [Senger et al., Science, 218:983-985 (1983); Ferrera y Davis-Smyth, Endocr. Rev., 16:4-25 (1997)].

Se realizó en una oreja de ratones Src^{-/-} y Src^{+/-} la inyección intradermal de adenovirus que expresan un ADNc del VEGF humano, mientras que en la oreja opuesta de cada ratón se inyectó adenovirus que expresaba \beta-galactosidasa. El crecimiento de nuevos vasos sanguíneos dependiente de VEGF en las orejas Src^{+/-} se detectó por primera vez a las 48 horas y la neovascularización se analizó a los 5 días.

En breve, se generaron ratones pp60^{c-src}, pp60^{c-yes}, pp60^{c-fyn} deficientes (129/8v/Ev X C57B16/J) tal como se describió anteriormente [Soriano et al., Cell, 64:693-702 (1991)]. Se obtuvieron stocks adicionales de Jackson Labs. Las orejas de los ratones se inyectaron intradermalmente [Eriksson et al., Microvasc. Res., 19:374-378 (1980)] con 5 \mul de adenovirus que expresaba o VEGF o \beta-galactosidasa y se fotografiaron las orejas después de 5 días, con un estereoscopio.

Se encontró que había niveles idénticos de expresión vírica en las orejas inyectadas con Src^{+/-} y Src^{-/-} tal como se determinó mediante tinción con X-gal de las orejas inyectadas con adenovirus \beta-galactosidasa. En las orejas Src^{-/-} inyectadas con VEGF, no se produjo una disminución significativa de la angiogénesis tal como se midió mediante el contaje de puntos de bifurcación (p < 0,05). Sin embargo, sorprendentemente, el fenotipo más evidente en estos animales fue el completo bloqueo de la pérdida vascular en comparación con las orejas Src^{+/-} inyectadas con VEGF. El examen de las orejas inyectadas con VEGF confirmó la extensión de la pérdida vascular en los ratones Src^{+/-}, que estuvo esencialmente ausente en los ratones Src^{-/-}. La pérdida vascular en estos animales sugirió que la actividad VP, que ha sido asociada con la angiogénesis in vivo [Dvorak et al., Am. J. Pathol., 148:11029-1039 (1995)], se podría interrumpir selectivamente en ratones pp60^{c-Src} deficientes.

11. VEGF fracasa en comprometer la barrera hematoencefálica en ratones deficientes en pp60^{c-Src}

El sistema vascular cerebral está caracterizado porque presenta una barrera hematoencefálica muy restrictiva que prohibe la extravasación de pequeñas moléculas en el tejido cerebral circundante. El crecimiento tumoral dentro del cerebro puede comprometer esta barrera debido en parte a la producción de factores de crecimiento angiogénicos tales como el VEGF. Por consiguiente, se examinó la naturaleza de la barrera hematoencefálica en ratones Src^{+/-} o Src^{-/-}. En este caso, se inyecto disolución salina o VEGF estereotácticamente en los hemisferios derecho e izquierdo del cerebro, respectivamente. Todos los ratones recibieron inyecciones sistémicas de colorante azul de Evan con el fin de monitorizar la actividad VP.

En breve, se inyectó disolución salina o VEGF (200 ng en 2 \mul) estereotácticamente en los lóbulos izquierdo o derecho a 92 mm a la izquierda/derecha de la línea media, 0,5 mm rostral de Bregma, y 3 mm en profundidad desde la dura, respectivamente. Los animales recibieron una disolución intravenosa de colorante azul de Evan a lo 30 min., después de la inyección, tal como se describió anteriormente. Después de 30 minutos adicionales, se perfundieron los animales y se extrajeron los cerebros. Se observó la fluorescencia del colorante azul de Evan utilizando un microscopio confocal láser en criosecciones no fijadas del cerebro.

La pérdida vascular de sangre se localizó en el hemisferio inyectado con VEGF en los ratones Src^{+/-}, pero hubo una ausencia total de pérdida vascular en los ratones Src^{-/-}. Este fue también el caso cuando se examinó la VP mediante la medición de la acumulación de colorante azul de Evan tal como se detecta mediante análisis de epifluorescencia de las secciones de criostato de estos cerebros. Así, el VEGF compromete la barrera hematoencefálica en un modo que depende del pp60^{c-Src} activo.

12. La VP mediada por VEGF, pero no la VP asociada a inflamación, depende de pp60^{c-Src}

Con el fin de analizar más y cuantificar el efecto de VEGF como factor VP en los ratones Src^{+/-} o Src^{-/-}, se utilizó el ensayo de Miles [Miles & Miles, 1952] para medir cuantitativamente la permeabilidad vascular en la piel de estos animales. Se inyectó VEGF intradermalmente en ratones Src^{+/-} o Src^{-/-} que habían recibido una administración intravenosa sistémica de colorante azul de Evan. En los 15 minutos posteriores a la inyección de VEGF, se produjo un incremento de 3 veces en la VP en los ratones Src^{+/-}. Sin embargo, en los ratones Src^{-/-} no se observó actividad VP detectable. La extracción del colorante de los parches de piel inyectada se cuantificó y comparó con controles de disolución salina y bFGF. Los controles de bFGF o disolución salina inyectados adyacentemente al VEGF no mostraron un incremento significativo en VP.

En resumen, el ensayo de Miles [Miles et al., 1962] se adaptó para ratones mediante la inyección de 10 \mul de VEGF (400 ng/ml), alilisocianato (aceite de mostaza, 20% peso/vol. en aceite mineral), o disolución salina, intradermalmente en ratones que habían sido inyectados previamente con 100 \mul de 0,5% colorante azul de Evan. Después de 15 min. Los parches de piel se disecaron, fotografiaron y extrajeron a 58ºC con formalina y se cuantificaron con un espectrofotómetro.

También se conoce que la pérdida vascular/permeabilidad tiene lugar durante la inflamación, lo que permite la acumulación de proteínas adhesivas del suero y células inflamatorias en los tejidos.

De hecho, los mediadores inflamatorios promocionan por sí directamente la pérdida vascular. Por consiguiente, se ensayó uno de tales mediadores inflamatorios, el alilisotiocianato, también conocido como aceite de mostaza [Inoue et al., 1997 supra], en ratones Src^{+/-} o Src^{-/-} para determinar su capacidad de producir VP. Contrariamente a lo observado con animales Src^{-/-} estimulados con VEGF, no se detectó disminución en VP producido por la inyección del mediador inflamatorio alilisotiocianato. Así, se puede concluir que Src tiene una función selectiva en la actividad VP inducida por VEGF y no influencia la VP asociada al proceso inflamatorio.

13. La actividad VP mediada por VEGF depende de src y Yes, pero no de Fyn

La especificidad de la necesidad de Src para la VP se exploró mediante el examen de la actividad VP inducida por VEGF asociada a SFK tales como Fyn o Yes, que, como Src, se conoce que se expresan en las células endoteliales [Bull et al., FEBS letters, 361:41-44 (1994); Kiefer et al., Curr. Biol, 4:100-109 (1994)]. Se confirmó que estos tres SFK se expresaban de modo equivalente en las aortas de los ratones tipo silvestre. Como en los ratones Src^{-/-}, los animales deficientes en Yes también fueron defectivos en la VP inducida por VEGF. Sin embargo, sorprendentemente, los ratones sin Fyn retuvieron una elevada VP en respuesta a VEGF que no fue significativamente diferente de la de los animales control. La disrupción de la VP inducida por FEGF en los ratones Src^{-/-} o Yes ^{-/-} demuestra que la actividad quinasa de las SFK específicas es esencial para el evento de señalización mediado por VEGF que conduce a la actividad VP pero no a la angiogénesis.

Las propiedades de permeabilidad vascular de VEGF en la piel de ratones Src^{+/-} (Fig. 14A, panel izquierdo) o Src^{-/-} (Fig. 14A, panel derecho) se determinaron mediante inyección intradermal de disolución salina o VEGF (400 ng) en ratones que habían sido inyectados intravenosamente con colorante azul de Evan. Después de 15 minutos, se fotografiaron los parches de piel (barra de escala, 1 mm). Las estrellas indican los lugares de inyección. Se disecaron las regiones que rodean los lugares de inyección de VEGF, bFGF o disolución salina y se cuantificó VP mediante la elusión del colorante azul de Evan en formamida a 58ºC durante 24 horas y se midió la absorbancia a 500 nm (Fig. 14B, gráfica derecha). La capacidad de un mediador de la inflamación (alilisotiocianato), que se conoce que induce VP en relacionada a la inflamación, se ensayó en ratones Src^{+/-} o Src^{-/-} (Fig. 14B, derecha).

La capacidad de VEGF para inducir VP se comparó en ratones Src^{-/-}, Fyn^{-/-} o Yes^{-/-} mediante el ensayo de Miles (Fig. 14C). Los datos para cada uno de los ensayos de Miles se expresó como la media \pm SD de animales por triplicado. Los defectos VP de Src^{-/-} y Yes^{-/-} en comparación con animales control fueron estadísticamente significativo (*p < 0,05, ensayo t pareado), mientras que ni los defectos VP de los ratones Fyn^{-/-} tratados con VEGF ni los de los ratones Src^{+/-} tratados con alilisotiocianato fueron estadísticamente significativos (**p < 0,05).

14. Los ratones tratados con inhibidor de la familia Src de tirosina quinasa y los ratones Src^{-/-} muestran un daño asociado al trauma o a la herida de los vasos sanguíneos inferior al de los ratones de tipo silvestre sin tratar

La administración específica de inhibidores de la familia Src de tirosina quinasas funciona como inhibidora de la pérdida vascular patológica y de la permeabilidad durante el daño vascular o los trastornos tales como la apoplejía. El endotelio vascular es un tipo celular dinámico que responde a muchas señales para regular procesos tales como el brote de nuevos vasos durante la angiogénesis de un tumor o la regulación de la permeabilidad de la pared vascular durante el edema inducido por la apoplejía y el daño tisular.

La reducción de la permeabilidad vascular en dos modelos de apoplejía en ratón, mediante la inhibición con fármacos de la senda de Src, es suficiente para inhibir el daño cerebral mediante la reducción de la perdida vascular inducida por la isquemia. Además, en ratones genéticamente deficientes en Src, con una reducida pérdida vascular/permeabilidad, el volumen de infarto también se reduce. La combinación de los datos de inhibidor de Src sintético, con la evidencia genética que soporta una reducida pérdida vascular durante la apoplejía y otros modelos relacionados demuestran la relevancia fisiológica de esta estrategia para reducir el daño cerebral después de la apoplejía. La inhibición de estas sendas mediante una gama de inhibidores disponibles de las quinasas de la familia Src de estas cascadas de señalización tiene el beneficio terapéutico de mitigar el daño cerebral derivado del daño tisular relacionado a la permeabilidad.

Se utilizaron dos procedimientos para inducir isquemia cerebral localizada. Los dos modelos animales de isquemia cerebral focalizada están bien establecidos y se usan ampliamente en la investigación de la apoplejía. Se han utilizado los dos modelos anteriormente con el fin de investigar la patofisiología de la isquemia cerebral así como para ensayar nuevos fármacos antiapopléticos.

a) se anestesiaron ratones con avertin y se mantuvo la temperatura corporal manteniendo a los animales sobre un manta térmica. Se realizó una incisión ente la oreja derecha y el ojo derecho. Se expuso el cráneo mediante retracción del músculo temporal y se taladró una pequeña perforación en la región obre la arteria cerebral media (MCA). Se eliminaron las meninges y se ocluyó la MCA derecha mediante coagulación utilizando un filamento caliente. Se permitió que se recuperasen los animales y se devolvieron a las jaulas. Después de 24 hora, se perfundieron los cerebros, se extrajeron y se cortaron en secciones de 1 mm. Las secciones se sumergieron en cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolium (TTC) al 2% y el área de cerebro infartado se identificó como tejido no teñido (blanco) rodeado de tejido viable (rojo). El volumen del infarto se definió como la suma de las áreas no teñidas de las secciones, multiplicada por el
grosor.

Se utilizaron ratones deficiente en Src (Src^{-/-}) para estudiar la función de Src en la isquemia cerebral. Los ratones src^{+/-} sirvieron como controles. Se descubrió que en los ratones Src^{-/-} el volumen de infarto estaba reducido de 26 \pm 10 mm^{3} a 16 \pm 4 mm^{3} en los controles a las 24 horas después del insulto. El efecto fue todavía más pronunciado cuando se inyectaron ratones C57B16 tipo silvestre con 1,5 mg/kg PP1 intraperitonealmente (i.p.) 30 minutos después de la oclusión del vaso. El tamaño del infarto se redujo de 31 \pm 12 mm^{3} en el grupo sin tratar a 8 \pm 2 mm^{3} en el grupo tratado con PP1.

b) En un segundo modelo de isquemia cerebral se ocluyó la MCA mediante el emplazamiento de un bolus en el origen de la MCA. Se colocó un solo coágulo homólogo intacto de 24 horas rico en fibrina en el origen de la MCA utilizando un catéter PE-50 modificado. Se demostró la inducción de isquemia cerebral mediante la reducción del flujo sanguíneo cerebral en el hemisferio ipsilateral en comparación con el del hemisferio contralateral. Después de 24 horas se extrajeron los cerebros, se prepararon secciones seriadas y se tiñeron con hematoxilina-eosina (HE). Los volúmenes infartados se determinaron sumando las áreas infartadas en las secciones HE seriadas multiplicadas por la distancia entre cada sección.

Las dosis de PP1 utilizadas en este estudio (1,5 mg/kg i.p.) se seleccionaron empíricamente. Es conocido que el VEGF se expresa primero a aproximadamente a las 3 horas de la isquemia cerebral en el cerebro con un máximo después de 12 a 24 horas. En este estudio PP1 se administró 30 minutos después del inicio del infarto con el fin de bloquear completamente el incremento en la permeabilidad vascular inducido por el VEGF. Según el proceso temporal típico de expresión de VEGF, una ventana terapéutica para la administración de los inhibidores Src sería de hasta 12 horas después de la apoplejía. En las enfermedades asociadas con un incremento sostenido de la permeabilidad vascular sería apropiada una administración crónica del fármaco inhibidor de Src.

La Fig. 15 es un gráfico que describe los resultados comparativos de los volúmenes (mm^{3}) promediados de infarto en cerebros de ratones después de la herida, en los que los ratones fueron Src (Src^{+/-}) heterogéneos, mutantes dominante negativos (Src^{-/-}), tipo silvestre (WT) o tipo silvestres tratado con 1,5 mg/kg PP1 (PP1).

La Fig. 16 describe muestras secuenciales de rastreos MRI de cerebros de ratón perfundidos después del tratamiento para inducir daño al SNC, en los que la progresión de los rastreos de los animales tratados con PP1 (derecha) muestra claramente un menor infarto que en la progresión de los rastreos de los animales control no tratados (izquierda).

La presente invención es particularmente adecuada para la intervención específica del daño tisular inducido por PV debido a que la inhibición dirigida de la acción de las tirosina quinasas de la familia Src enfoca la inhibición sobre VP sin un efecto a largo tiempo sobre otras respuestas inducidas por VEGF que pueden ser beneficiosas para la recuperación del daño. Por el contrario a la neutralización de la proteína VEGF, la inhibición de Src no interfiere con el efecto angiogénico acumulativo del VEGF que podría ser beneficioso en una etapa posterior de la enfermedad.

La utilización de pequeñas moléculas sintéticas inhibidoras resulta en general más segura y más manejable que la utilización de proteínas grandes. La utilización de proteínas recombinantes, tales como una proteína de fusión receptor de VEGF-inmunoglobulina murina es potencialmente dañina y no permite la administración repetida por miedo a provocar una reacción alérgica cuando se utiliza en seres humanos (es decir, anticuerpo humano antiratón; HAMA).

Finalmente, el VEGF no es el único activador del Src corriente abajo, existen otras citoquinas implicadas en la patofisiología de la isquemia cerebral que pueden influenciar la permeabilidad vascular, tale como IL-6 y TNF-\alpha. Así, la inhibición de VEGF podría no inhibir todo el daño subsiguiente relacionado a la activación de Src. De hecho, la reducción del tamaño del infarto por PP1 es más pronunciada que por antagonismo del VEGF lo que indica que otras sendas pueden activar las quinasas Src facilitando el incremento de la permeabilidad.

La memoria anterior se considera suficiente para permitir que un experto en la materia ponga en práctica la invención. El depósito de material no constituye una admisión de que la descripción escrita comprendida en la presente memoria resulte inadecuada para permitir la práctica de un aspecto cualquiera de la presente invención, comprendiendo el mejor modo de la misma, ni se debe considerar como limitativo del alcance de las reivindicaciones a la ilustración que representa. Desde luego, a partir de la descripción anterior resultarán evidentes múltiples modificaciones de la presente invención para los expertos en la materia que se encuentran dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

<110> THE SCRIPPS RESEARCH INSTITUTE

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<120> MODULADORES E INHIBIDORES DE LA ANGIOGÉNESIS Y LA PERMEABILIDAD VASCULAR

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<130> 18-129

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<140> 09/538.248

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<141> 2000-03-29

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<140> 09/470.881

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<141> 1999-12-22

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<160> 8

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 11627

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: RCASBP(A) basado en el virus del sarcoma aviar

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<220>

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<221> misc feature

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<222> (7649)..(11258)

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<223> secuencias pBR322

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<220>

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<221> LTR

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<222> (7166)..(7494)

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<223> corriente arriba

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<220>

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<221> LTR

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<222> (1)..(101)

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<223> corriente arriba (la numeración se inicia corriente arriba R)

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<220>

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<221> miscfeature

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<222> (11394)..(11623)

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<223> U3

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<220>

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<221> miscfeature

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<222> (1)..(21)

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<223> R

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<220>

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<221> miscfeature

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<222> (22)..(101)

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<223> U5

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<220>

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<221> miscfeature

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<222> (102)..(119)

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<220>

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<221> LTR

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<222> (7166)..(7494)

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<223> corriente abajo

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<220>

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<221> miscfeature

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<222> (7166)..(7393)

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<223> U3

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<220>

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<221> miscfeature

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<222> (7394)..(7414)

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<223> R

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<220>

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<221> miscfeature

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<222> (7415)..(7494)

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<223> U5

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<220>

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<221> miscfeature

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<222> (7154)..(7165)

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<223> PPT

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<220>

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<221> miscfeature

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<222> (388)..(391)

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<223> donador de unión (AGGT)

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<220>

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<221> miscfeature

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<222> (5074)..(5077)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> aceptor de unión env (AGGC)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> miscfeature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6982)..(6985)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> aceptor de unión Clal (AGGA)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> gen

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (372)..(902)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> gag p19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> gen

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (909)..(1094)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> gag p10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> gen

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1095)..(1814)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> gag p27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> gen

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1843)..(2108)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> gag p12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> gen

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2109)..(2480)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> gag pl5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> miscsignal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2481)..(2483)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> gag stop

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> gen

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2501)..(4216)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> pol RT

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> gen

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4217)..(5185)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> pol IN

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> miscsignal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5186)..(5188)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> pol stop

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> gen

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5244)..(6263)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> env gp85

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> gen

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6264)..(6878)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> env gp37

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> miscsignal

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6879)..(6881)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> env stop

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> miscfeature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7027)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> sitio Clal/el sitio Clal en gag es metilado en las cepas de Dam+ y no se corta

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

2

3

4

5

6

7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1759

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> pollo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> gen

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1759)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ADNc de c-SRC de pollo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (112)..(1710)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

8

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 533

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> pollo

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

10

11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2187

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> gen

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(2187)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ADNc de c-SRC humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (134)..(1483)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

12

13

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 450

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

15

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial:etiqueta de epítopo 9E10-myc

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0.8cm

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4517

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (208)..(1836)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> proteína traducida de ADNc de Yes-1 humana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

18

19

20

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

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<211> 543

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

22

23

24

Claims

1. Composición farmacéutica que comprende unido nucleico que puede expresar la proteína tirosina quinasa Src y un ácido nucleico que puede expresar la proteína tirosina quinasa Yes, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

2. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que el ácido nucleico que puede expresar la proteína tirosina quinasa Src y el ácido nucleico que puede expresar la proteína tirosina quinasa Yes son dos ácidos nucleicos diferentes.

3. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que un solo ácido nucleico comprende el ácido nucleico que puede expresar la proteína tirosina quinasa Src y el ácido nucleico que puede expresar la proteína tirosina quinasa Yes.

4. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicha proteína Src es Src-A, o presenta en el residuo de aminoácido 527 cualquier residuo de aminoácido excepto tirosina, serina o treonina, o en la que dicha proteína Src es inactiva.

5. Composición farmacéutica según la reivindicación 4, en la que dicha proteína Src nativa es Src K295M o Src 251.

6. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dicha proteína Yes es una proteína Yes inactiva.

7. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende un vector vírico de transferencia de genes, o un vector no vírico de transferencia de genes.

8. Utilización de un ácido nucleico que puede expresar una proteína tirosina quinasa Yes inactiva, o una mezcla de proteínas tirosina quinasas inactivas Src y Yes para la preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento de un estado patológico seleccionado de entre el grupo constituido por daños inducidos por apoplejía, crecimiento de tumores, infarto de miocardio, ateroesclerosis, edema cerebral, trauma o enfermedad cerebrovascular, artritis reumatoide, retinopatía diabética, enfermedades inflamatorias, restenosis, hemorragia cerebral, trauma cerebral y espinal, lesión espinal y cerebral inducido por hipoxia, trastornos inflamatorios del SNC, infecciones víricas o bacterianas del SNC, trastornos autoinmunes, enfermedades con un incremento crónico de la permeabilidad de la barrera hematoencefálica, y síndrome de dificultad respiratoria del adulto (SDRA); mediante la inhibición de la permeabilidad vascular en un tejido diana.

9. Utilización según la reivindicación 8, en la que dicha proteína Src inactiva es Src K295M, Src 251 o una mezcla de las mismas.

10. Utilización de un ácido nucleico que puede expresar una proteína tirosina quinasa activa Yes o una mezcla de proteínas tirosina quinasas activas Src y Yes para la preparación de una composición farmacéutica destinada al tratamiento de un estado patológico seleccionado de entre el grupo constituido por extremidades isquémicas y heridas crónicas mediante la potenciación de la permeabilidad vascular en un tejido diana.

11. Utilización según la reivindicación 10, en la que dicha proteína Src activa es Src-A, o presenta en el residuo de aminoácido 527 cualquier aminoácido excepto tirosina, serina o treonina.

12. Artículo de fabricación que comprende material de embalaje y una composición farmacéutica contenida en dicho material de embalaje, en el que dicha composición farmacéutica puede modular la permeabilidad vascular en un tejido que sufre una enfermedad, en el que dicho material de embalaje comprende una etiqueta que indica que dicha composición farmacéutica se puede utilizar para el tratamiento de enfermedades mediante la modulación de la permeabilidad vascular, y en el que dicha composición farmacéutica comprende un ácido nucleico que puede expresar la proteína tirosina quinasa Yes en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

13. Artículo de fabricación según la reivindicación 12, en el que la composición farmacéutica comprende además un ácido nucleico que puede expresar la proteína tirosina quinasa Src.

14. Artículo de fabricación según la reivindicación 13, en el que dicha proteína Src es una Src activa o inac-
tiva.

15. Artículo de fabricación según la reivindicación 14, en el que dicha proteína Src activa es Src-A o presenta en el residuo de aminoácido 527 cualquier residuo de aminoácido excepto tirosina, serina o treonina.

16. Artículo de fabricación según la reivindicación 14, en el que dicha proteína Src inactiva es Src K295M o Src 251.

17. Artículo de fabricación según la reivindicación 12 ó 13, en el que dicha proteína Yes es activa o inactiva.

18. Artículo de fabricación según la reivindicación 13, en el que dichas proteínas Src y Yes están codificadas por una mezcla de ácidos nucleicos que pueden expresar la proteína Src y que pueden expresar la proteína
Yes.