ES2300439T3 - Reconocimiento subcelular de proteinas terapeuticas. - Google Patents
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Abstract
Una medicamento diana que comprende una enzima lisosómica y un péptido que se une a un dominio extracelular de un receptor humano de manosa-6-fosfato independiente de cationes de una manera independiente de manosa-6-fosfato-, en el que el péptido: (a) tiene una identidad de secuencia de aminoácidos suficiente respecto a IGF-II humano tal que el péptido se une al receptor humano de manosa-6-fosfato independiente de cationes; o (b) comprende IGF-II o un dominio variable de anticuerpo que reconoce el receptor; o (c) comprende la secuencia de aminoácidos de IGF-I o de una muteina de IGF-I en la que: (i) los aminoácidos 55 y 56 son cambiados; o (ii) los aminoácidos 1-4 son suprimidos o cambiados; o (iii) los aminoácidos 55 y 56 son cambiados y los aminoácidos 1-4 son suprimidos o cambiados.
Description
Reconocimiento subcelular de proteínas
terapéuticas.
Esta invención proporciona un medio para
suministrar específicamente proteínas a un compartimento subcelular
diana de una célula de mamífero. La capacidad para reconocer
proteínas en un compartimento subcelular es de gran utilidad en el
tratamiento de enfermedades metabólicas tales como enfermedades
relacionadas con el almacenamiento lisosómico, una clase de más de
40 trastornos heredados en los cuales enzimas lisosómicas
particulares están ausentes o son deficientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Las carencias de enzimas en compartimentos
celulares tales como el aparato de golgi, el retículo endoplásmico
y el lisosoma causan una amplia variedad de enfermedades humanas.
Por ejemplo, la lisil hidroxilasa, una enzima que se encuentra
normalmente en el lumen del retículo endoplásmico, es requerida para
el procesamiento apropiado del colágeno; la ausencia de la enzima
causa el síndrome de Ehlers-Danlos tipo VI, un
trastorno serio del tejido conjuntivo. GnT II, normalmente
encontrado en el aparato de golgi, es requerido para la
glicosilación normal de proteínas; la ausencia de GnT II conduce a
defectos en el desarrollo cerebral. Más de cuarenta enfermedades
relacionadas con el almacenamiento lisosómico (LSD) están causadas,
directamente o indirectamente, por la ausencia de una o varias
proteínas en el lisosoma.
Las enzimas lisosómicas en mamíferos se
sintetizan en el citosol y atraviesan el RE donde son glicosiladas
con carbohidratos superiores del tipo de manosa
N-unidos. En el aparato de golgi, el carbohidrato
superior de manosa se modifica en proteínas lisosómicas por la
adición de manosa-6-fosfato (M6P)
que reconoce estas proteínas en el lisosoma. Las proteínas
modificadas con M6P son suministradas al lisosoma vía la interacción
con cualquiera de dos receptores de M6P. La forma más favorable de
modificación es cuando dos M6P son añadidas a un carbohidrato
superior de manosa.
La terapia de reemplazo enzimático para
enfermedades relacionadas con el almacenamiento lisosómico (LSD)
está siendo activamente seguida. La terapia, excepto en la
enfermedad de Gaucher, generalmente requiere que sean incorporadas
proteínas LSD y suministradas a los lisosomas de una variedad de
tipos de células de una manera dependiente de M6P. Un enfoque
posible implica la purificación de una proteína LSD y la
modificación de ésta para incorporar un resto carbohidrato con M6P.
Este material modificado puede ser incorporado por las células de
una manera más eficiente que las proteínas LSD no modificadas debido
a la interacción con receptores de M6P en la superficie celular. Sin
embargo, debido al gasto de tiempo y el costo requerido para
preparar, purificar y modificar proteínas para su uso en el
reconocimiento subcelular, hay todavía una necesidad de nuevos
métodos más simples, más eficientes y más rentables para reconocer a
agentes terapéuticos en un compartimento celular.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención facilita el tratamiento de
enfermedades metabólicas proporcionando medicamentos de proteínas
diana que localizan a un compartimento subcelular de una célula
donde el medicamento es necesario. La invención simplifica la
preparación de medicamentos de proteínas diana reduciendo los
requerimientos para el procesamiento de
post-translación o post-síntesis de
la proteína. Por ejemplo, un medicamento diana de la presente
invención puede ser sintetizado como una proteína de fusión
incluyendo un dominio terapéutico y un dominio de reconocimiento de
la proteína de fusión en un compartimento subcelular correcto.
("Proteína de fusión", según se usa en este documento, se
refiere a un polipéptido simple que tiene al menos dos dominios que
no están normalmente presentes en el mismo polipéptido. Así, las
proteínas que ocurren naturalmente no son "proteínas de fusión"
según se usa en este documento). La síntesis como una proteína de
fusión permite el reconocimiento del dominio terapéutico en un
compartimento subcelular deseado sin las complicaciones asociadas
con la reticulación química de dominios terapéuticos separados y de
reconocimiento, por ejemplo.
La invención también permite el reconocimiento
de un medicamento en un lisosoma de una manera independiente de M6P.
En consecuencia, el medicamento diana no tiene que ser sintetizado
en una célula de mamífero, sino que puede ser sintetizado
químicamente o en una bacteria, levadura, protozoo, u otro organismo
independientemente del modelo de glicosilación, facilitándose la
producción del medicamento diana con un alto rendimiento y
relativamente a un precio bajo. El medicamento diana puede ser
sintetizado como una proteína de fusión, simplificándose además la
producción, o puede ser generado asociando agentes terapéuticos
sintetizados por separado y restos de recono-
cimiento.
cimiento.
La presente invención permite el reconocimiento
lisosómico de medicamentos sin necesidad de la adición de M6P al
carbohidrato superior de manosa. Está basada en parte en la
observación de que uno de los 2 receptores de M6P también se unen a
otros ligandos con alta afinidad. Por ejemplo, también se conoce el
receptor de manosa-6-fosfato
independiente de cationes como el receptor del factor de crecimiento
tipo insulina 2 (IGF-II) porque se une a
IGF-II con alta afinidad. Este polipéptido de peso
molecular bajo interactua con tres receptores, el receptor de
insulina, el receptor de IGF-I y el receptor de
M6P/IGF-II. Se cree que ejerce su efecto biológico
principalmente a través de interacciones con los dos primeros
receptores mientras que la interacción con el receptor de M6P
independiente de cation, según se piensa, da como resultado
predominantemente que IGF-II que sea transportado al
lisosoma donde es degradado.
En consecuencia, la invención se refiere a un
medicamento diana como se especifica en las reivindicaciones.
En una realización, el péptido es un dominio de
reconocimiento lisosómico no glicosilado que se une al dominio
extracelular del receptor de M6P independiente de cationes
humano.
El péptido puede ser un dominio de
reconocimiento lisosómico que se une al dominio extracelular del
receptor de M6P independiente de cationes humano, pero que no se
una a una muteina del receptor en el cual el aminoácido 1572 es
cambiado de isoleucina a treonina, o se una a la muteina con al
menos una afinidad diez veces menor (es decir, con al menos una
constante de disociación diez veces mayor). En otra realización, el
péptido es un dominio de reconocimiento lisosómico capaz de unirse
a un dominio del receptor que consiste esencialmente en las
repeticiones 10-15 del receptor de M6P independiente
de cationes humano. Preferiblemente, el dominio de reconocimiento
lisosómico puede unirse a un dominio del receptor que consiste
esencialmente en las repeticiones 10-13 del
receptor humano de manosa-6-fosfato
independiente de cationes. Más preferiblemente, el dominio del
reconocimiento lisosómico puede unirse a un dominio de receptor que
consista esencialmente en las repeticiones 11-12,
repetición 11 o los aminoácidos 1508-1566 del
receptor humano independiente de cationes de M6P. En cada una de
estas realizaciones, el dominio de reconocimiento lisosómico
preferiblemente se une al receptor o al dominio del receptor con
una constante de disociación submicromolar a o aproximadamente a pH
7,4. En una realización preferida, el dominio de reconocimiento
lisosómico se une a una constante de disociación de aproximadamente
10^{-7} M. En otra realización preferida, la constante de
disociación es menos que aproximadamente 10^{-7} M.
En otra realización, el péptido es
suficientemente duplicativo de IGF-II humano tal que
el resto de unión se une al receptor de M6P independiente de
cationes humano. El péptido puede ser suficientemente duplicativo
de IGF-II por la inclusión de una secuencia de
aminoácidos suficientemente homóloga a al menos una parte de
IGF-II, o por la inclusión de una estructura
molecular suficientemente representativa de al menos una parte de
IGF-II, tal que el resto de unión se una al receptor
de M6P independiente de cationes. En una realización, el péptido
comprende un polipéptido que incluye un polipéptido que tiene
hélices alfa antiparalelas separadas por no más de cinco
aminoácidos. En otra realización, el péptido comprende la secuencia
de aminoácidos de IGF-I o de una muteina de
IGF-I en la que los aminoácidos
55-56 son cambiados y/o los aminoácidos
1-4 son suprimidos o cambiados. En una realización
más, el resto de unión incluye un polipéptido con una secuencia de
aminoácidos al menos 60% idéntica al IGF-II humano;
los aminoácidos en las posiciones correspondiente a las posiciones
54 y 55 de IGF-II humano están preferiblemente no
cargados o están negativamente cargados a o aproximadamente a pH
7,4.
También se describen en este documento ácidos
nucleicos que codifican proteínas terapéuticas y células (por
ejemplo, células de mamífero, células de insecto, células de
levadura, protozoos o bacterias) que comprenden estos ácidos
nucleicos. También se describen métodos para producir las proteínas
proporcionando estas células con condiciones (por ejemplo, en el
contexto de un cultivo in vitro o manteniendo las células en
un cuerpo de mamífero) permitiendo la expresión de las proteínas.
Las proteínas pueden ser cultivadas a partir de entonces (por
ejemplo, de ser producidas in vitro) o pueden ser usadas que
intervenga una etapa de cultivo (por ejemplo, de ser producido in
vivo en un paciente). Así, se describen en este documento
métodos para tratar a un paciente administrando una proteína
terapéutica (por ejemplo, por inyección, síntesis in situ o
de otras maneras), administrando un ácido nucleico que codifica la
proteína (permitiéndose así la síntesis de proteínas in
vivo), o administrando una célula que comprenda un ácido
nucleico que codifica la proteína.
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 1 es un mapa del marco de lectura
abierto de IGF-II humano. El IGF-II
maduro carece del péptido señal y regiones divididas por COOH.
La figura 2 es un IGF-II
optimizado del codon de Leishmania representado en el sitio
XbaI de pIR1-SAT.
La figura 3 es una representación de una
realización preferida de la invención, que incorpora una secuencia
del péptido señal, la secuencia de
\beta-glucuronidasa madura humana, un puente de
tres aminoácidos y una secuencia de IGF-II.
La figura 4 representa la actividad de
\beta-glucuronidasa (GUS) en células GM4668 de
fibroblastos de piel de mucopolisacaridosis VII humana expuestas a
GUS, una proteína de fusión de
GUS-IGF-II
(RLIG-GUS), RLIG-GUS con mutaciones
\Delta1-7 y Y27L en la parte de
IGF-II (RLIG^{2}-GUS), o un
control negativo (DMEM).
La figura 5 representa la actividad de GUS en
células GM4668 expuestas a GUS (+\beta-GUS),
GUS-RLIG (+RLIG), GUS-RLIG en
presencia de un exceso de IGF-II
(+RLIG+IGF-II), o un control negativo (GM4668).
La figura 6 es una alineación de
IGF-I humano e IGF-II, que muestra a
los dominios A, B, C y D.
La figura 7 representa a GUS en células GM4668
expuestas a GUS, GUS-RLIG, GUS-RLIG,
GUS-RLIG con una deleción de los siete restos
terminales de amino (GUS-RLIG
\Delta1-7), GUS-RLIG en presencia
de un exceso de IGF-II, GUS-RLIG
\Delta1-7 en presencia de un exceso de
IGF-II, o un control negativo (Mock).
\vskip1.000000\baselineskip
Según se usa en este documento,
"reconocimiento lisosómico independiente de la glicosilación" y
"RLIG" se refieren a un reconocimiento lisosómico que es
independiente de
manosa-6-fosfato.
Según se usa en este documento, "constructo de
RLIG" se refiere a un constructo que incluye una parte de
reconocimiento lisosómico independiente de
manosa-6-fosfato y una parte
terapéutica eficaz en un lisosoma de mamí-
fero.
fero.
Según se usa en este documento, "GUS" se
refiere a \beta-glucuronidasa, una parte
terapéutica ejemplar.
Según se usa en este documento,
"GUS-RLIG" se refiere a un constructo de RLIG
con GUS acoplado a una parte de reconocimiento de
IGF-II.
Todas las referencias a las posiciones de
aminoácidos en IGF-II se refieren a las posiciones
en IGF-II maduro humano. Así, por ejemplo, las
posiciones 1, 2 y 3 son ocupadas por alanina, tirosina y arginina,
respectivamen-
te.
te.
La presente invención facilita el tratamiento de
enfermedades metabólicas proporcionando medicamentos diana que,
cuando se proporcionan externamente a una célula, entran en la
célula y localizan a un compartimento subcelular donde es activo el
medicamento diana.
\vskip1.000000\baselineskip
La enzima lisosómica y el péptido están
necesariamente asociados, directamente o indirectamente. En una
realización, la enzima lisosómica y el péptido están asociados no
covalentemente. La asociación es preferiblemente estable a o
aproximadamente a pH 7,4. Por ejemplo, el resto de reconocimiento
puede ser biotinilado y unirse a la avidina asociada con la enzima
lisosómica. De forma alternativa, el péptido y la enzima lisosómica
pueden cada uno estar asociados (por ejemplo, como proteínas de
fusión) con diferentes subunidades de una proteína multimérica. En
otra realización, el péptido y la enzima lisosómica están
reticulados entre sí (por ejemplo, utilizando un agente de
reticulación químico).
En una realización preferida, la enzima
lisosómica es fusionada al péptido como una proteína de fusión. El
péptido puede estar en el extremo amino-terminal de
la proteína de fusión, el extremo carboxi-terminal,
o puede ser insertado dentro de la secuencia de la enzima lisosómica
en una posición donde la presencia del péptido no interfiera
excesivamente con la actividad terapéutica de la enzima
lisosómica.
Cuando la enzima lisosómica es una proteína
heteromérica, una o varias de las subunidades pueden estar asociadas
con un péptido. La hexosaminidasa A, por ejemplo, una proteína
lisosómica que afecta a la enfermedad de Tay-Sachs,
incluye una subunidad alfa y una subunidad beta. La subunidad alfa,
la subunidad beta, o ambas pueden estar asociadas con un resto de
reconocimiento conforme a la presente invención. Si, por ejemplo, la
subunidad alfa está asociada con un resto de reconocimiento y es
coexpresada con la subunidad beta, se forma un complejo activo y se
reconoce de manera apropiada (por ejemplo, al lisosoma).
Para reconocer un medicamento en el lisosoma, la
enzima lisosómica puede unirse al péptido a través de una
interacción que es interrumpida disminuyendo el pH a o
aproximadamente a 7,4 a o aproximadamente a 5,5. El resto de
reconocimiento se une a un receptor en el exterior de una célula; el
receptor seleccionado es uno que sufre la endocitosis y pasa a
través del endosoma tardío, que tiene un pH de aproximadamente 5,5.
Así, en el endosoma tardío, la enzima lisosómica se disocia del
resto de reconocimiento y procede al lisosoma, donde el agente
terapéutico actúa. Por ejemplo, un resto de reconocimiento puede ser
modificado químicamente para incorporar a un agente quelante (por
ejemplo, EDTA, EGTA o ácido trinitrilotriacético) que se une
fuertemente a un ión metálico tal como el níquel. El resto de
reconocimiento (por ejemplo, GUS) puede ser expresado como una
proteína de fusión con un marcador de seis-histidina
(por ejemplo, en el extremo amino-terminal, en el
extremo carboxi-terminal, o en un bucle flexible
accesible a la superficie). A o aproximadamente a pH 7,4, el
marcador de seis-histidina es sustancialmente
desprotonado y se une a iones metálicos tales como el níquel con
alta afinidad. A o aproximadamente a pH 5,5, el marcador de
seis-histidina está sustancialmente protonado,
conduciendo a la liberación del níquel y, por consiguiente, a la
liberación del agente terapéutico del resto de reconocimiento.
\newpage
Los métodos y las composiciones de la invención
son útiles para producir y suministrar enzimas lisosómicas a un
lisosoma, y la invención es particularmente útil para suministrar
enzimas lisosómicas para tratar enfermedades metabólicas, tales como
enfermedades relacionadas con el almacenamiento lisosómico
(LSD).
Los genes de LSD preferidos son mostrados en la
Tabla 1. En una realización preferida, un producto génico de LSD
tipo silvestre es suministrado a un paciente que sufre de un defecto
en el mismo gen de LSD. En realizaciones alternativas, es usada una
secuencia funcional o variante de especie del gen de LSD. En otras
realizaciones, un gen que codifica para una enzima diferente que
puede rescatar un gen de LSD defectuoso es usado de acuerdo con los
métodos de la invención.
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Una enzima lisosómica particularmente preferida
es la glucocerebrosidasa, fabricada actualmente por Genzyme como una
terapia de reemplazo enzimático eficaz para la enfermedad de
Gaucher. Actualmente, la enzima se prepara con restos de manosa
expuestos, que reconoce la proteína específicamente en células del
linaje de macrófago. Aunque la patología primaria en los pacientes
de Gaucher tipo 1 es debida a macrófagos que acumulan
glucocerebrosidos, pueda ser una ventaja terapéutica el suministro
de glucocerebrosidasa a otros tipos de células. El reconocimiento de
glucocerebrosidasa en lisosomas usando la presente invención
reconocerían al agente en múltiples tipos de células y puede tener
una ventaja terapéutica comparado con otros preparativos.
La presente invención permite reconocer una
enzima lisosómica en un lisosoma usando una proteína, o un análogo
de proteína, que se une específicamente a un receptor celular para
aquella proteína. El exterior de la superficie celular es
topológicamente equivalente a un compartimento lisosómico. Así, la
endocitosis de una molécula a través de la interacción con
un(os) receptor(es) apropiado(s) permite el
transporte de la molécula a un lisosoma sin cruzar ninguna membrana.
Si una deficiencia genética causa un déficit de una actividad
enzimática particular en cualquiera de estos compartimentos
lisosómicos, el suministro de una proteína terapéutica puede ser
lograda por el marcado con un ligando para el(los)
receptor(es) apropiado(s).
La invención permite el reconocimiento de una
enzima lisosómica en un lisosoma. El reconocimiento puede ocurrir,
por ejemplo, por la unión de un receptor de membrana celular que más
tarde pasa a través de un lisosoma. De forma alternativa, el
reconocimiento puede ocurrir por la unión de un receptor del plasma
que más tarde pasa por un endosoma tardío; la enzima lisosómica
entonces puede viajar desde el endosoma tardío a un lisosoma. Un
mecanismo de reconocimiento lisosómico preferido implica la unión al
receptor de M6P independiente de cationes.
El receptor de M6P independiente de cationes es
una glicoproteína transmembrana de cadena simple de 275 kDa
expresada por todas partes en tejidos de mamífero. Es uno de dos
receptores de mamífero que se unen a M6P: el segundo se denomina
receptor de M6P dependiente de cationes. El receptor de M6P
dependiente de cationes requiere cationes divalentes para la unión
de M6P; el receptor de M6P independiente de cationes no lo requiere.
Estos receptores juegan un papel importante en el tráfico de enzimas
lisosómicas a través del reconocimiento del resto M6P en el
carbohidrato superior de manosa en enzimas lisosómicas. El dominio
extracelular del receptor de M6P independiente de cationes contiene
15 dominios homólogos ("repeticiones") que une un grupo diverso
de ligandos en posiciones discretas sobre el receptor.
El receptor de M6P independiente de cationes
contiene dos sitios de unión para M6P: uno localizado en las
repeticiones 1-3 y el otro localizado en las
repeticiones 7-9. El receptor une ligandos de M6P
monovalentes con una constante de disociación en el intervalo \muM
uniendo ligandos de M6P divalentes con una constante de disociación
en el intervalo nM, probablemente debido a la oligomerización del
receptor. La incorporación de IGF-II por el receptor
es aumentada por la unión concomitante de ligandos de M6P
multivalentes tales como enzimas lisosómicas al
receptor.
receptor.
El receptor de M6P independiente de cationes
también contiene sitios de unión para al menos tres ligandos
distintos que pueden ser usados como de restos de reconocimiento. El
receptor de M6P independiente de cationes se une a
IGF-II con una constante de disociación de
aproximadamente 14 nM a o aproximadamente a pH 7,4, principalmente a
través de interacciones con la repetición 11. Compatible con su
función en el reconocimiento de IGF-II al lisosoma,
la constante de disociación aumenta aproximadamente 100 veces a o
aproximadamente a pH 5,5 promoviendo la disociación de
IGF-II en endosomas tardíos ácidos. El receptor es
capaz de unir formas de IGF-II
O-glicosiladas de alto peso molecular.
Un ligando útil adicional para el receptor de
M6P independiente de cationes es el ácido retinoico. El ácido
retinoico se une al receptor con una constante de disociación de 2,5
nM. El fotomarcaje de afinidad del receptor de M6P independiente de
cationes con ácido retinoico no interfiere con la unión de
IGF-II o M6P al receptor, indicando que el ácido
retinoico se une a un sitio distinto en el receptor. La unión del
ácido retinoico al receptor cambia la distribución intracelular del
receptor con una mayor acumulación del receptor en las vesículas
citoplásmicas y también potencia la respuesta de
\beta-glucuronidasa modificada con M6P. El ácido
retinoico tiene un resto fotoactivable que puede ser usado para
unirlo a un agente terapéutico sin interferir con su capacidad para
unirse al receptor de M6P independiente de cationes.
El receptor de M6P independiente de cationes
también se une al receptor de plasminógeno de tipo uroquinasa (uPAR)
con una constante de disociación de 9 \muM. El uPAR es un receptor
de GPI-anclado sobre la superficie de la mayor parte
de tipos de células donde funciona como una molécula de adhesión y
en la activación proteolítica de plasminógenos y
TGF-\beta. La unión de uPAR al receptor de
CI-M6P lo reconoce en el lisosoma, modulándose así
su actividad. Así, la fusión del dominio extracelular de uPAR, o su
parte competente que se une al receptor de M6P independiente de
cationes, a una enzima lisosómica permite el reconocimiento de la
enzima en un lisosoma.
Ventajosamente, la invención imita el mecanismo
biológico normal de respuesta de proteínas LSD, de una manera
independiente de
manosa-6-fosfato.
Por ejemplo, fusionando el ADN que codifica el
polipéptido IGF-II maduro al extremo 3' de casetes
del gen de LSD, son creadas proteínas de fusión que pueden ser
incorporadas por una variedad de tipos de células y transportadas al
lisosoma. Este método tiene numerosas ventajas respecto a métodos
que implican la glicosilación incluyendo la simplicidad y la
rentabilidad, porque una vez que la proteína está aislada, no se
necesitan hacer más modificaciones.
El IGF-II es preferiblemente
reconocido específicamente con el receptor de M6P. Particularmente
útiles son las mutaciones en el polipéptido de
IGF-II que causan una proteína que se une al
receptor de M6P con alta afinidad mientras que no se unan los otros
dos receptores con una afinidad apreciable. El
IGF-II también puede ser modificado para reducir al
mínimo la unión a las proteínas de unión a IGF en suero (Baxter
(2000) Am. J. Physiol Endocrinol Metab. 278 (6):
967-76) para evitar el secuestro de los constructos
de IGF-II/RLIG. Un número de estudios han localizado
restos en IGF-1 y IGF-II necesarios
para unir las proteínas de unión de IGF. Los constructos con
mutaciones en estos restos pueden ser seleccionados para la
retención de unión de alta afinidad al receptor de
M6P/IGF-II y para la afinidad reducida para las
proteínas de unión de IGF. Por ejemplo, sustituyendo PHE 26 de
IGF-II con SER, según se ha publicado, se reduce la
afinidad de IGF-II para IGFBP-1 y -6
sin afectar a la unión al receptor de M6P/IGF-II
(Bach et al. (1993) J. Biol. Chem. 268 (13):
9246-54). Otras sustituciones, tales como SER por
PHE 19 y LYS por GLU9, también pueden ser ventajosas. Las mutaciones
análogas, separadamente o en combinación, en una región de
IGF-I que es altamente conservadora con
IGF-II causan grandes disminuciones en la unión de
IGF-BP (Magee et al. (1999)
Biochemistry 38 (48):15863-70).
Un enfoque alternativo es identificar las
regiones mínimas de IGF-II que pueden unirse con
alta afinidad al receptor de M6P/IGF-II. Los restos
que han sido implicados en la unión de IGF-II al
receptor de M6P/IGF-II sobre todo se agrupan en una
cara de IGF-II (Terasawa et al. (1994)
EMBO J. 13 (23): 5590-7). Aunque la
estructura terciaria de IGF-II normalmente sea
mantenida por tres puentes disulfuro intramoleculares, incorporando
un péptido la secuencia de aminoácidos en la superficie de unión del
receptor de M6P/IGF-II de IGF-II
puede ser diseñada para plegar correctamente y tener actividad de
unión. Tal péptido de unión mínimo es una parte de reconocimiento
altamente preferida. Los péptidos diseñados basados en la región
alrededor de los aminoácidos 48-55 pueden ser
analizados para la unión al receptor de M6P/IGF-II.
De forma alternativa, una biblioteca arbitraria de péptidos puede
ser rastreada por su capacidad de unir el receptor de
M6P/IGF-II vía un ensayo en levadura de dos
híbridos, o vía un ensayo tipo de expresión en fago.
Un reto en la terapia para enfermedades
relacionadas con el almacenamiento lisosómico es que muchas de estas
enfermedades tienen una implicación neurológica significativa. Las
enzimas terapéuticas administradas en la circulación sanguínea
generalmente no cruzan la barrera sangre-cerebro y
por lo tanto no pueden reducir los síntomas neurológicos asociados
con las enfermedades. El IGF-II, sin embargo, como
se ha mencionado, promueve el transporte a través de la barrera
sangre-cerebro vía transcitosis (Bickel et
al. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 46
(1-3): 247-79). Por lo tanto, los
constructos de RLIG diseñados de manera apropiada deberían ser
capaces de cruzar la barrera sangre-cerebro,
proporcionando por primera vez un medio para tratar síntomas
neurológicos asociados con enfermedades relacionadas con el
almacenamiento lisosómico. Los constructos puede ser analizados
usando ratones deficientes de GUS como se describe en el Ejemplo 7,
infra. Además los detalles en cuanto al diseño, la
construcción y las pruebas de medicamentos diana que pueden alcanzar
el tejido neuronal desde la sangre son descritos en la publicación
de EE.UU. Nº. 2003-0072761 A1, presentada el 30 de
abril de 2002.
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Las estructuras por RMN de
IGF-II han sido resueltas por dos grupos (Terasawa
et al. (1994) EMBO J. 13 (23):
5590-7; Torres et al. (1995) J. Mol.
Biol. 248 (2): 385-401) (véase, por
ejemplo, el banco de datos de proteína 1IGL record). Las
características generales de la estructura de IGF-II
son similares a las de IGF-I e insulina. Los
dominios A y B de IGF-II corresponden a las cadenas
de A y B de insulina. Las características estructurales secundarias
incluyen una hélice alfa a partir de los restos
11-21 de la región B unida por una vuelta inversa en
los restos 22-25 a una cadena beta corta en los
restos 26-28. Los restos 25-27
parecen formar una pequeña hoja beta antiparalela; los restos
59-61 y los restos 2628 también pueden participar
en la formación de hoja beta intermolecular. En el dominio A de
IGF-II, las hélices alfa que atraviesan los restos
42-49 y 53-59 están dispuestas en
una configuración antiparalela perpendicular a la hélice del dominio
B. Los grupos hidrófobos formados por dos de los tres puentes
disulfuro y los restos hidrófobos conservados estabilizan estas
características de estructura secundarias. Los extremos N y C
permanecen mal definidos porque es la región entre los restos
31-40.
IGF-II se une a los receptores
de IGF-II/M6P y IGF-I con
relativamente alta afinidad y se une con una afinidad inferior al
receptor de insulina. IGF-II también interactua con
un número si IGFBP está en suero.
La sustitución de los restos
48-50 de IGF-II (Phe Arg Ser) con
los restos correspondientes de insulina, (Thr Ser Ile), o la
sustitución de los restos 54-55 (Ala Leu) con los
restos correspondientes de IGF-I (Arg Arg) causa una
menor unión al receptor de IGF-II/M6P, pero la
retención de la unión a los receptores de IGF-I e
insulina (Sakano et al. (1991) J. Biol. Chem.
266 (31): 20626-35).
IGF-I y IGF-II
comparten secuencias idénticas y estructuras en la región de los
restos 48-50 aunque tengan una diferencia de 1000
veces en la afinidad para el receptor de IGF-II. La
estructura por RMN revela una diferencia estructural entre
IGF-I y IGF-II en la región de los
restos 53-58 de IGF-II (restos
54-59 de IGF-I): la hélice alfa está
mejor definida en IGF-II que en
IGF-I y, a pesar de IGF-I, no hay
ninguna curva en la estructura alrededor de los restos 53 y 54
(Torres et al. (1995) J. Mol. Biol. 248 (2):
385-401). Esta diferencia estructural se
correlaciona con la sustitución de Ala 54 y Leu 55 en
IGF-II con Arg 55 y Arg 56 en IGF-1.
Es posible que la unión al receptor de IGF-II esté
directamente interrumpida por la presencia de restos cargados en
esta región o que los cambios de la estructura engendrada por los
restos cargados proporcionen los cambios de unión para el receptor
de IGF-II. En cualquier caso, la sustitución de
restos no cargados para los dos restos de Arg en
IGF-I causó afinidades más altas para el receptor de
IGF-II (Cacciari et al. (1987)
Pediatrician 14 (3): 146-53). Así la
presencia de restos positivamente cargados en estas posiciones tiene
correlación con la pérdida de unión al receptor de
IGF-II.
El IGF-II se une a la repetición
11 del receptor de M6P independiente de cationes. En realidad, un
minireceptor en el cual sólo la repetición 11 es fusionada a los
dominios transmembrana y citoplásmicos del receptor de M6P
independiente de cationes es capaz de unirse a
IGF-II (con una afinidad aproximadamente de un
décimo de la afinidad del receptor de cadena completa) y mediar la
internalización de IGF-II y su suministro a los
lisosomas (Grimmeet et al. (2000) J. Biol. Chem.
275 (43): 33697-33703). Se conoce la
estructura del dominio 11 del receptor de M6P (entradas de la base
de datos de proteínas 1GPO y 1GP3; Brown et al. (2002)
EMBO J. 21 (5): 1054-1062). El
supuesto sitio de unión de IGF-II es una bolsa
hidrófoba que se piensa que interactua con aminoácidos hidrófobos de
IGF-II; los aminoácidos candidatos de
IGF-II incluyen leucina 8, fenilalanina 48, alanina
54 y leucina 55. Aunque la repetición 11 sea suficiente para la
unión de IGF-II, los constructos que incluyen partes
más grandes del receptor de M6P independiente de cationes (por
ejemplo, las repeticiones 10-13 ó
1-15) generalmente se unen a IGF-II
con mayor afinidad y con una mayor dependencia del pH (véase, por
ejemplo, Linnell et al. (2001) J. Biol. Chem.
276 (26):23986-23991).
La sustitución de los restos de
IGF-II Tyr 27 con Leu, Leu 43 con Val o Ser 26 con
Phe disminuye la afinidad de IGF-II para el receptor
de IGF-I 94, 56 y 4 veces respectivamente (Torres
et al. (1995) J. Mol. Biol. 248
(2):385-401). La deleción de los restos
1-7 de IGF-II humano causó una
disminución de 30 veces la afinidad para el receptor humano de
IGF-I y un aumento de 12 veces concomitante de la
afinidad para el receptor de IGF-II en ratas
(Hashimoto et al. (1995) J. Biol. Chem. 270
(30):18013-8). La estructura por RMN de
IGF-II muestra que Thr 7 está localizado cerca de
los restos 48 Phe y 50 Ser así como cerca del puente de disulfuro 9
Cys-47 Cys. Se piensa que la interacción de Thr 7
con estos restos puede estabilizar el hexapéptido del extremo
N-terminal flexible requerido para la unión del
receptor de IGF-I (Terasawa et al. (1994)
EMBO J. 13 (23) 5590-7). Al mismo
tiempo esta interacción puede modular la unión al receptor de
IGF-II. El truncamiento del extremo
C-terminal de IGF-II (restos
62-67) también parece bajar 5 veces la afinidad de
IGF-II para el receptor de IGF-I
(Roth et al. (1991) Biochem. Biophys. Res. Commun.
181 (2): 907-14).
Las superficies de unión para los receptores de
IGF-I y M6P independiente de cationes están sobre
las caras separadas de IGF-II. Basado en los datos
estructurales y mutacionales, los dominios de unión de M6P
independiente de cationes funcionales pueden ser construidos siendo
sustancialmente más pequeños que el IGF-II humano.
Por ejemplo, los aminoácidos del extremo
amino-terminal 1-7 y/o los restos
del extremo carboxi-terminal 62-67
pueden ser suprimidos o sustituidos. Además, los aminoácidos
29-40 pueden ser eliminados o sustituidos
probablemente sin cambiar el plegado del resto del polipéptido o la
unión al receptor de M6P independiente de cationes. Así, puede ser
construido un resto de reconocimiento incluyendo los aminoácidos
8-28 y 41-61. Estos tramos de
aminoácidos podrían ser unidos quizás directamente o ser separados
por un enlazador. De forma alternativa, los aminoácidos
8-28 y 41-61 pueden ser
proporcionados en cadenas polipéptidas separadas. Los dominios
comparables de insulina, que es homóloga a IGF-II y
que tiene una estructura terciaria estrechamente relacionada con la
estructura de IGF-II, tienen la información
estructural suficiente para permitir un nuevo plegado apropiado en
la estructura terciaria apropiada, incluso cuando estén presentes en
cadenas polipéptidas separadas (Wang et al. (1991) Trends.
Biochem. Sci. 279-281). Así, por ejemplo, los
aminoácidos 8-28, o su variante de sustitución
conservadora, podrían ser fusionados a una enzima lisosómica; la
proteína de fusión resultante podría ser mezclada con los
aminoácidos 41-61, o su variante de sustitución
conservadora, y ser administrada a un paciente.
Los constructos de IGF-II y
relacionados pueden ser modificados para disminuir su afinidad con
IGFBP, aumentando así la biodisponibilidad de las proteínas
marcadas.
La sustitución del resto de
IGF-II fenilalanina 26 con serina reduce la unión a
los IGFBP 1-5 unas 5-75 veces (Bach
et al. (1993) J. Biol. Chem. 268 (13):
9246-54). El reemplazo de los restos
48-50 de IGF-II con
treonina-serina-isoleucina reduce la
unión más de 100 veces en la mayor parte de los IGFBP (Bach et
al. (1993) J. Biol. Chem. 268 (13): 9246 54);
estos restos son, sin embargo, también importantes para unirse al
receptor de manosa-6-fosfato
independiente de cationes. La sustitución Y27L que interrumpe la
unión al receptor de IGF-I interfiere con la
formación del complejo ternario con IGFBP3 y la subunidad lábil
ácida (Hashimoto et al. (1997) J. Biol. Chem.
272 (44): 27936-42); este complejo ternario
cuenta para la mayor parte del IGF-II en la
circulación (Yu et al. (1999) J. Clin. Lab Anal.
13 (4): 166-72). La deleción de los seis
primeros restos de IGF-II también interfiere con la
unión de IGFBP (Luthi et al. (1992) Eur. J. Biochem.
205 (2):4 483-90).
Los estudios sobre la interacción de
IGF-I con los IGFBP revelaron además que la
sustitución de serina por fenilalanina 16 no afectó a la estructura
secundaria, pero disminuyó la unión de IGFBP entre 40 y 300 veces
(Magee et al. (1999) Biochemistry 38 (48):
15863-70). El cambio del glutamato 9 con lisina
también causó una disminución significativa de la unión de IGFBP.
Además, el doble mutante lisina 9/serina 16 exhibió la afinidad más
baja para los IGFBP. Aunque estas mutaciones no hayan sido
analizadas antes en IGF-II, la conservación de la
secuencia entre esta región de IGF-I y
IGF-II sugiere que un efecto similar sería observado
cuando fueron hechas mutaciones análogas en IGF-II
(glutamato 12 lisina/fenilalanina 19 serina).
La secuencia de aminoácidos de
IGF-II humano, o su parte que afecta a la unión al
receptor de M6P independiente de cationes, puede ser usada como una
secuencia de referencia para determinar si una secuencia candidato
posee la semejanza de aminoácidos suficiente para tener una
expectativa razonable de éxito en los métodos de la presente
invención. Preferiblemente, las secuencias de la variante son al
menos un 70% similar o 60% idéntica, más preferiblemente al menos un
75% similar o 65% idéntica, y lo más preferiblemente 80% similar o
70% idéntica respecto al IGF-II humano.
Para determinar si una región peptídica
candidato tiene el porcentaje de semejanza preciso o la identidad
respecto al IGF-II humano, la secuencia de
aminoácidos candidato y de IGF-II humano son
alineadas primero usando el algoritmo de programación dinámica
descrito en Smith y Waterman (1981) J. Mol. Biol. 147:
195-197, en combinación con la matriz de sustitución
BLOSUM62 descrita en la Figura 2 de Henikoff y Henikoff (1992)
PNAS 89: 10915-10919. Para la presente
invención, un valor apropiado para la penalización de inserción de
huecos es -12, y un valor apropiado para la penalización por
extensión de huecos es -4. Los programas informáticos que realizan
alineamientos usando el algoritmo de Smith-Waterman
y la matriz BLOSUM62, tal como la serie del programa GCG (Grupo
Molecular de Oxford, Oxford, Inglaterra), están disponibles en el
comercio y son ampliamente usados por los expertos en la
técnica.
Una vez que el alineamiento entre la secuencia
candidato y de referencia es hecha, puede ser calculada una
puntuación de la semejanza en porcentaje. Los aminoácidos
individuales de cada secuencia son comparados secuencialmente de
acuerdo con su semejanza entre sí. Si el valor en la matriz BLOSUM62
correspondiente a los dos aminoácidos alineados puntúa cero o un
número negativo, la semejanza por parejas es cero; de otra forma la
semejanza por parejas puntúa 1,0. La puntuación de semejanza bruta
es la suma de las puntuaciones de semejanza por parejas de los
aminoácidos alineados. La puntuación sin procesar entonces se
normaliza dividiéndola por el número de aminoácidos en la más
pequeña de las secuencias de referencia o candidato. La puntuación
sin procesar normalizada es el porcentaje de semejanza. De forma
alternativa, para calcular un porcentaje de identidad, los
aminoácidos alineados de cada secuencia son comparados
secuencialmente de nuevo. Si los aminoácidos no son idénticos, la
puntuación de identidad por parejas puntúa cero; de otra manera la
puntuación de identidad por parejas puntúa 1,0. La puntuación de
identidad sin procesar es la suma de los aminoácidos idénticos
alineados. La puntuación sin procesar entonces es normalizada
dividiéndola por el número de aminoácidos en la más pequeña de las
secuencias de referencia o candidato. La puntuación sin procesar
normalizada es el porcentaje de identidad. Las inserciones y
deleciones no son tomadas en cuenta para los objetivos del cálculo
del porcentaje de semejanza e identidad. En consecuencia, las
penalizaciones de hueco no son usadas en este cálculo, aunque sean
usadas en el alineamiento inicial.
Las estructuras conocidas de los receptores de
IGF-II humano y M6P independiente de cationes
permiten el diseño de análogos de IGF-II y otras
proteínas de unión del receptor de M6P independiente de cationes
usando principios de diseño informáticos tales como los discutidos
en las patentes de EE.UU. N^{os}. 6.226.603 y 6.273.598. Por
ejemplo, las coordenadas atómicas conocidas de
IGF-II pueden ser proporcionadas a un ordenador
equipado con un programa de modelado por ordenador convencional,
tales como INSIGHTII, DISCOVER O DELPHI, disponible en el comercio
en Biosym, Tecnologías Inc., o QUANTAS o CHARMM, disponibles en el
comercio en Molecular Simulations, Inc. Estos y otros programas de
software permiten el análisis de estructuras moleculares y
simulaciones que predicen el efecto de cambios moleculares sobre la
estructura y sobre interacciones intermoleculares. Por ejemplo, el
software puede ser usado para identificar análogos modificados con
capacidad para formar enlaces de hidrógeno intermoleculares
adicionales o iónicos, mejorando la afinidad del análogo para el
receptor diana.
El software también permite el diseño de
péptidos y moléculas orgánicas con propiedades estructurales y
químicas que imitan las mismas propiedades mostradas en al menos
parte de la superficie de la cara de unión del receptor de M6P
independiente de cationes de IGF-II. Como una
contribución principal a la superficie de unión del receptor está
la disposición espacial de restos químicamente interactivos
presentes dentro de las cadenas laterales de los aminoácidos que
definen juntas la superficie de unión del receptor, una realización
preferida de la presente invención se refiere al diseño y a la
producción de una molécula orgánica sintética que tiene un marco
que lleva restos químicamente interactivos en una relación espacial
que imita la relación espacial de los restos químicos dispuestos en
las cadenas laterales del aminoácido que constituye la cara de unión
del receptor de M6P independiente de cationes de
IGF-II. Los restos químicos preferidos, incluyen,
pero no limitados, a los restos químicos definidos por las cadenas
laterales de aminoácidos de los aminoácidos que constituyen la cara
de unión del receptor de M6P independiente de cationes de
IGF-II. Se sobrentiende, por lo tanto, que la
superficie de unión del receptor del análogo de
IGF-II no tiene que comprender restos de
aminoácidos, pero sí los restos químicos dispuestos sobre ello.
Por ejemplo, en la identificación de grupos
químicos relevantes, el experto en la técnica que use un programa
informático convencional puede diseñar una pequeña molécula que
tenga los restos químicos interactivos con el receptor dispuestos
sobre un marco vehículo adecuado. Los programas informáticos útiles
son descritos, por ejemplo, en Dixon (1992) Tibtech
10:357-363; Tschinke et al. (1993)
J. Med. Chem 36: 3863-3870; y Eisen
et. al. (1994) Proteins: Structure, Function, and
Genetics 19: 199-221, cuyas descripciones
son incorporadas en este documento como referencia.
Un programa informático particular titulado
"CAVEAT" busca en una base de datos, por ejemplo, la base de
datos estructural de Cambridge, para estructuras que tengan
orientaciones espaciales deseadas de restos químicos (Bartlett et
al. (1989) en "Molecular Recognition: Chemical and Biological
Problems" (Roberts, S. M., editor) págs.
182-196). El programa CAVEAT ha sido usado para
diseñar análogos de tendamistat, un inhibidor de 74 restos de
\alpha-amilasa, basado en la orientación de las
cadenas laterales de aminoácido seleccionadas en la estructura
tridimensional del tendamistat (Bartlett et al. (1989)
supra).
De forma alternativa, en la identificación de
una serie de análogos que imitan la actividad de unión del receptor
de M6P independiente de cationes de IGF-II, el
experto en la técnica puede usar una variedad de programas
informáticos que ayudan al experto en la técnica a desarrollar
relaciones cuantitativas entre estructura y actividad (QSAR) y
además para ayudar al diseño de novo de análogos adicionales
de morfogenes. Otros programas informáticos útiles son los
descritos, por ejemplo, en Connolly-Martin (1991)
Methods in Enzymology 203:587-613;
Dixon (1992) supra; y Waszkowycz et al. (1994) J.
Med. Chem. 37:3994-4002.
Los restos de reconocimiento preferidos se unen
a sus receptores diana con una constante de disociación
submicromolar. Por lo general, las constantes de disociación bajas
(por ejemplo, menos de 10^{-7} M, menos de 10^{-8} M, o menos de
10^{-9} M) son cada vez más preferidas. La determinación de las
constantes de disociación preferiblemente se determina mediante
resonancia de plasmon de superficie como se describe en Linnell
et al. (2001) J. Biol. Chem. 276 (26):
23986-23991. Una forma soluble del dominio
extracelular del receptor diana (por ejemplo, las repeticiones
1-15 del receptor de M6P independiente de cationes)
es generada e inmovilizada en un chip por una interacción
biotina-avidina. El resto de reconocimiento es
pasado por el chip, y las constantes cinéticas y de equilibrio son
detectadas y calculadas midiendo los cambios de la masa asociada con
la superficie del chip.
Pueden ser expresadas proteínas de fusión
quiméricas en una variedad de sistemas de expresión, incluyendo
sistemas de traducción in vitro y células intactas. Ya que la
modificación de M6P no es un requisito previo para el
reconocimiento, una variedad de sistemas de expresión, incluyendo
sistemas de levadura, baculovirus y hasta procariotas tales como
E. coli que no glicosilan las proteínas, son adecuados para
la expresión de proteínas terapéuticas diana. De hecho, una proteína
no glicosilada generalmente tiene mejor biodisponibilidad, ya que
las proteínas glicosiladas son rápidamente limpiadas de la
circulación por la unión al receptor de manosa en el endotelio
sinusoidal hepático.
De forma alternativa, la producción de enzimas
lisosómicas quiméricas diana en el sistema de expresión celular de
mamífero produce proteínas con múltiples determinantes de unión para
el receptor de M6P independiente de cationes. Las sinergias entre
dos o más ligandos del receptor de M6P independiente de cationes
(por ejemplo, M6P y IGF-II, o M6P y ácido retinoico)
pueden ser explotadas: se ha demostrado que los ligandos
multivalentes realzan la unión al receptor por la reticulación del
receptor.
En general, pueden ser adaptados casetes génicos
que codifican la enzima lisosómica quimérica para el sistema de
expresión particular para incorporar las secuencias necesarias para
la expresión óptima incluyendo a promotores, sitios de unión
ribosómicos, intrones o alteraciones en la secuencia de codificación
para optimizar el uso del codon. Como la enzima es secretada
preferiblemente desde la célula productora, un ADN que codifique un
péptido señal compatible con el sistema de expresión puede ser
sustituido por el péptido señal endógeno. Por ejemplo, para la
expresión de \beta-glucuronidasa y
\alpha-galactosidasa marcada con
IGF-II en Leishmania, los casetes de ADN que
codifican péptidos señal de Leishmania (GP63 o SAP) son
insertados en el lugar del ADN que codifica el péptido señal
endógeno para alcanzar la expresión óptima. En sistemas de expresión
de mamífero, puede ser empleado el péptido señal endógeno, pero si
el marcador de IGF-II está fusionado en el extremo
5' de la secuencia de codificación, podría ser deseable usar el
péptido señal de IGF-ll.
Las células CHO son un huésped de mamífero
preferido para la producción de enzimas lisosómicas. El método
clásico para lograr la expresión de células CHO con alto rendimiento
es usar una línea celular CHO deficiente en dihidrofolato reductasa
(DHFR), por ejemplo la línea de CHO DUKX (O'Dell et al.
(1998) Int. J. Biochem. Cell Biol. 30 (7):
767-71). Esta cepa de células CHO requiere
hipoxantina y timidina para su crecimiento. La cotransfección del
gen que se sobreexpresa con un casete génico de DHFR, en plásmidos
separados o en un plásmido simple, permite la selección del gen de
DHFR y generalmente permite el aislamiento de clones que también
expresan la proteína recombinante de elección. Por ejemplo, el
plásmido pcDNA3 usa el promotor de la región reguladora de la región
temprana del citomegalovirus (CMV) para llevar a cabo la expresión
de un gen de interés y pSV2DHFR para promover la expresión de DHFR.
La exposición subsecuente de células que llevan los casetes génicos
recombinantes a concentraciones incrementalmente crecientes del
análogo de folato metotrexato conduce a la amplificación tanto del
número de copia génico del gen de DHFR como del gen
co-transfectado.
Un plásmido preferido para la expresión
eucariota en este sistema contiene el gen de interés colocado
corriente abajo de un promotor fuerte tal como CMV. Un intrón puede
ser colocado en el flanco 3' del casete génico. Se puede dirigir un
casete de DHFR por un segundo promotor desde el mismo plásmido o
desde un plásmido separado. Además, puede ser útil incorporar en el
plásmido un marcador seleccionable adicional tal como la neomicina
fosfotransferasa, que confiere resistencia a G418.
De forma alternativa, pueden ser producidas
enzimas recombinantes en la línea celular HEK 293 humana usando
sistemas de expresión basados en el sistema de replicación del virus
Epstein-Barr (EBV). Este consiste en el origen de
replicación de EBV oriP y la proteína de unión de ori de EBV,
EBNA-1. La unión de EBNA-1 a oriP
inicia la replicación y la amplificación subsecuente del plásmido
extracromosómico. Esta amplificación a su vez causa altos niveles de
expresión de los casetes génicos almacenados dentro del plásmido.
Los plásmidos que contienen oriP pueden ser transfectados en
células HEK 293 transformadas con EBNA-1 (disponible
en el comercio de Invitrogen) o, de forma alternativa, puede ser
empleado un plásmido tal como pCEP4 (disponible en el comercio de
Invitrogen) que conduce a la expresión de EBNA-1 y
que contiene oriP de EBV.
En E. coli, preferiblemente son
secretadas las enzimas lisosómicas en el espacio periplásmico. Esto
puede ser logrado sustituyendo para el ADN que codifica el péptido
señal endógeno de la enzima lisosómica un casete de ácido nucleico
que codifica un péptido señal bacteriano tal como la secuencia señal
de ompA. Se puede llevar a cabo la expresión por cualquiera de un
número de promotores inducibles fuertes tales como los promotores
lac, trp o tac. Un vector adecuado es pBAD/gIII
(disponible en el comercio de Invitrogen) que usa el péptido señal
de Gene III y el promotor araBAD.
Un parte de reconocimiento de
IGF-II útil tiene tres puentes disulfuro
intramoleculares. Pueden ser construidas proteínas de fusión RLIG
(por ejemplo GUS-RLIG) en E. coli para
dirigir la proteína al espacio periplásmico. IGF-II,
cuando se fusiona al extremo C-terminal de otra
proteína, puede ser secretado en una forma activa en el espacio
periplásmico de E. coli (Wadensten et al. (1991)
Biotechnol. Appl. Biochem. 13 (3):
412-21). Para facilitar el plegado óptimo del resto
de IGF-II, se añaden preferiblemente concentraciones
apropiadas de glutationa reducida y oxidada al entorno celular para
promover la formación del puente disulfuro. En el caso de que una
proteína de fusión con puentes disulfuro sea soluble
incompletamente, se trata cualquier material insoluble
preferiblemente con un agente caotrópico tal como urea para
solubilizar la proteína desnaturalizada y replegarla en un tampón
con las concentraciones apropiadas de glutationa reducida y oxidada,
u otros agentes oxidantes y reductores, para facilitar la formación
de puentes disulfuro apropiados (Smith et al. (1989) J.
Biol. Chem. 264 (16): 9314-21). Por
ejemplo, se ha replegado IGF-I usando
guanidina-HCl 6 M y el agente reductor
tris(2-carboxietil)fosfina 0,1 M para
la desnaturación y reducción de IGF-II (Yang et
al. (1999) J. Biol. Chem. 274 (53):
37598-604). El replegado de proteínas fue logrado en
tampón Tris-HCl 0,1M (pH 8,7) conteniendo
glutationa oxidada 1 mM, glutationa reducida 10 mM, KCl 0,2M y EDTA
1 mM.
Un ácido nucleico que codifica una enzima
lisosómica puede ser proporcionado ventajosamente directamente a un
paciente que sufra de una enfermedad, o puede ser proporcionado a
una célula ex vivo, seguido por la adminstration de la célula
viva al paciente. Los métodos de terapia génica in vivo
conocidos en la técnica incluyen proporcionar ADN purificado (por
ejemplo, tal como en plásmido), proporcionar el ADN en un vector
viral o proporcionar el ADN en un liposoma u otra vesícula (véase,
por ejemplo, la patente de EE.UU. Nº. 5.827.703, que describe a
vehículos de lípidos para el uso en terapia génica y la patente de
EE.UU. Nº. 6.281.010, que proporciona vectores adenovirales útiles
en terapia génica).
Los métodos para tratar la enfermedad
implantando una célula que ha sido modificada para expresar una
proteína recombinante son también conocidos. Véase, por ejemplo, la
patente de EE.UU. Nº. 5.399.346, que describe métodos para
introducir un ácido nucleico en una célula humana primaria para su
introducción en un ser humano. Aunque el uso de células humanas para
terapia ex vivo sea preferido en algunas realizaciones,
pueden ser implantadas otras células tales como células bacterianas
en el sistema vascular de un paciente, liberando continuamente a un
agente terapéutico. Véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU.
N^{os}. 4.309.776 y 5.704.910.
El reconocimiento de una proteína directamente
en un compartimento subcelular tal como un lisosoma sin requerir una
etapa de purificación puede ser llevado a cabo usando los métodos de
la presente invención. Una proteína de fusión IGF-II
puede ser expresada en un organismo parásito atenuado o simbiótico
que sea administrado a un huésped. La proteína de fusión de
IGF-II expresada es secretada por el organismo,
incorporada por las células huésped y reconocida en sus
lisosomas.
Las proteínas RLIG pueden ser proporcionadas
in situ vía Leishmania viva secretando las proteínas
en los lisosomas del macrófago infectado. A partir de este orgánulo,
éste abandona la célula y es incorporado por las células adyacentes
no del linaje del macrófago. Así, el marcador de RLIG y el agente
terapéutico permanecen necesariamente intactos mientras que la
proteína reside en el lisosoma del macrófago. En consecuencia,
cuando las proteínas RLIG son expresadas in situ,
preferiblemente son modificadas para asegurarse de la compatibilidad
con el ambiente lisosómico. La \beta-glucuronidasa
humana ("GUS" humana), una parte terapéutica ejemplar,
normalmente sufre una división del péptido del extremo
C-terminal en el lisosoma o durante el transporte al
lisosoma (por ejemplo, entre los restos 633 y 634 en GUS). Así,
cuando un constructo de GUS-RLIG deba ser expresado
por Leishmania en un lisosoma macrófago, la GUS humana
preferiblemente se modifica para dar la proteína resistente a la
división, o los restos después del resto 633 preferiblemente son
simplemente omitidos a partir de una proteína de fusión RLIG.
Asimismo, IGF-II, una parte de reconocimiento
ejemplar, preferiblemente se modifica para aumentar su resistencia a
la proteolisis, o un péptido de unión mínimo (por ejemplo, como se
identifica por expresión en fago o dos híbridos en levadura) es
sustituido por el resto IGF-II tipo silvestre.
Los medicamentos diana descubiertos de acuerdo
con la presente invención pueden ser administrados a un huésped
mamífero por cualquier ruta. Así, cuando sea apropiado, la
administración puede ser oral o parenteral, incluyendo las rutas de
administración intravenosa e intraperitoneal. Además, la
administración puede ser por inyecciones periódicas de un bolo del
medicamento o puede ser hecha más continuamente por la
administración intravenosa o intraperitoneal de un depósito que sea
externo (por ejemplo, una bolsa i. v.). Los medicamentos de la
presente invención pueden ser de calidad farmacéutica. Es decir,
cumplen con las normas de pureza y control de calidad requeridas
para la administración a seres humanos. También están dentro del
significado intencionado, según se usa en este documento, las
aplicaciones veterinarias.
Las formulaciones, tanto para el veterinario
como para el uso médico humano, de los medicamentos de acuerdo con
la presente invención típicamente incluyen tales medicamentos en
asociación con su vehículo farmacéuticamente aceptable y
opcionalmente otro(s) ingrediente(s). El(los)
vehículo(s) puede(n) ser "aceptable(s)" en
el sentido de ser compatible(s) con los otros ingredientes de
las formulaciones y no deletéreos con su receptor. Los vehículos
farmacéuticamente aceptables, en cuanto a esto, son requeridos para
incluir alguno y todos los disolventes, medios de dispersión,
revestimientos, agentes antibacterianos y agentes antimicóticos,
agentes de retraso de absorción e isotónicos, y similares,
compatibles con la administración farmacéutica. Se conoce el uso de
tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas en
la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio convencional
o agente sea incompatible con el compuesto activo, es contemplado su
uso en las composiciones. También pueden ser incorporados en las
composiciones compuestos activos suplementarios (identificados de
acuerdo con la invención y/o conocidos en la técnica). Las
formulaciones pueden ser presentadas convenientemente en formas de
dosificación unitaria y pueden prepararse por cualquiera de los
métodos conocidos en la técnica de farmacia/microbiología. En
general, algunas formulaciones se preparan poniendo al medicamento
en asociación con un vehículo líquido o un vehículo sólido finamente
dividido o ambos, y luego, si fuera necesario, conformando el
producto en la formulación deseada.
Una composición farmacéutica de la invención se
formula para ser compatible con su ruta pretendida de
administración. Los ejemplos de rutas de administración incluyen la
administración oral o parenteral, por ejemplo, intravenosa,
intradérmica, por inhalación, transdérmica (tópica), transmucosa y
rectal. Las soluciones o suspensiones usadas para la aplicación
parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los componentes
siguientes: un diluyente estéril tal como agua para inyección,
solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina,
propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes
antibacterianos tales como alcohol bencílico o
metil-paraBen; antioxidantes tales como ácido
ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido
etilendiaminotetracético; tampones tales como acetatos, citratos o
fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro
de sodio o dextrosa. El pH puede ser ajustado con ácidos o bases,
tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio.
Las soluciones útiles para la administración
oral o parenteral pueden ser preparadas por cualquiera de los
métodos conocidos en la técnica farmacéutica, descritas, por
ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, (Gennaro, A.,ed.),
Mack Pub., 1990. Las formulaciones para la administración parenteral
también pueden incluir glicocolato para la administración bucal,
metoxisalicilato para la administración rectal, o ácido cútrico para
la administración vaginal. La preparación parenteral puede ser
incluida en ampollas, jeringuillas desechables o viales de múltiples
dosis hechos de vidrio o plástico. Los supositorios para la
administración rectal también pueden ser preparados mezclando el
fármaco con un excipiente no irritante tal como la mantequilla de
cacao, otros glicéridos, u otras composiciones que sean sólidas a
temperatura ambiente y líquida a la temperatura del cuerpo. Las
formulaciones también pueden incluir, por ejemplo,
polialquilenglicoles tales como el polietilenglicol, aceites de
origen vegetal, naftalenos hidrogenados y otros por el estilo. Las
formulaciones para la administración directa pueden incluir glicerol
y otras composiciones de alta viscosidad. Otros vehículos
parenterales potencialmente útiles para estos medicamentos incluyen
partículas de copolímero de etileno-acetato de
vinilo, bombas osmóticas, sistemas de infusión implantables y
liposomas. Las formulaciones para la administración por inhalación
pueden contener como excipientes, por ejemplo, la lactosa, o
soluciones acuosas que contengan, por ejemplo, éter de
polioxietilen-9-laurilo, glicocolato
y desoxicolato, o soluciones aceitosas para la administración en
forma de gotas nasales, o como un gel que se aplica por la nariz.
Los enemas de retención también pueden ser usados para la
administración rectal.
Las formulaciones de la presente invención
adecuadas para la administración oral pueden estar en forma de
unidades discretas tales como cápsulas, cápsulas de gelatina,
bolsitas, comprimidos, pastillas o píldoras, conteniendo cada una
una cantidad predeterminada del fármaco; en forma de un polvo o
gránulos; en forma de una solución o una suspensión en un líquido
acuoso o líquido no acuoso; o en forma de una emulsión
de-aceite-en-agua o
una emulsión
de-agua-en-aceite.
El medicamento también puede ser administrado en forma de un bolo,
electuario o pasta. Un comprimido puede ser hecho comprimiendo o
moldeando el fármaco opcionalmente con uno o varios ingredientes
accesorios. Los comprimidos prensados pueden ser preparados
comprimiendo, en una máquina adecuada, el fármaco en una forma no
aglomerada tal como un polvo o gránulos, opcionalmente mezclados por
un aglomerante, lubricante, diluyente inerte, agente tensioactivo o
agente dispersante. Los comprimidos moldeados pueden ser hechos
moldeando, en una máquina adecuada, una mezcla del fármaco
pulverizado y el vehículo adecuado humedecido con un líquido
diluyente inerte.
Las composiciones orales generalmente incluyen
un diluyente inerte o un vehículo comestible. Para el objetivo de la
administración terapéutica oral, el compuesto activo puede ser
incorporado con excipientes. Las composiciones orales preparadas
usando un vehículo fluido para su uso como un enjuague incluye el
compuesto en el vehículo fluido y se aplican oralmente y agitan y se
expectoran o se tragan. Pueden ser incluidos como parte de la
composición agentes de unión farmacéuticamente compatibles y/o
materiales adyuvantes. Los comprimidos, píldoras, cápsulas,
pastillas y similares pueden contener cualquiera de los ingredientes
siguientes, o compuestos de una naturaleza similar: un aglomerante
tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un
excipiente tal como almidón o lactosa; un agente de desintegración
tal como ácido algínico, Primogel, o almidón de grano; un lubricante
tal como estearato de magnesio o Sterotes; un agente deslizante tal
como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como
sacarosa o sacarina; o un agente aromatizante tal como hierbabuena,
salicilato de metilo o condimento de naranja.
Composiciones farmacéuticas adecuadas para su
uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (cuando sean
solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la
preparación inmediata de soluciones inyectables estériles o de
dispersión. Para la administración intravenosa, los vehículos
adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua
bacteriostática, Cremophor EL® (BASF, Parsippany, NJ) o solución
salina tamponada de fosfato (PBS). En todos los casos, la
composición puede ser estéril y puede ser fluida a un grado que sea
fácil que exista como inyectable. Puede ser estable en las
condiciones de fabricación y almacenaje y puede ser conservada
contra la acción de la contaminación de microorganismos tales como
bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o un medio
de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por
ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y
similares) y sus mezclas adecuadas. La fluidez apropiada puede ser
mantenida, por ejemplo, por el uso de un revestimiento tal como
lecitina, manteniendo el tamaño de partículas requerido en el caso
de la dispersión y por el uso de tensioactivos. La prevención de la
acción de microorganismos puede ser lograda por varios agentes
antibacterianos y agentes antimicóticos, por ejemplo, paraBen,
clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y otros similares.
En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por
ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol y
cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las
composiciones inyectables puede ser causada por la inclusión en la
composición de un agente que retrase la absorción, por ejemplo,
monoestearato de aluminio
y gelatina.
y gelatina.
Pueden prepararse soluciones inyectables
estériles incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida
en un disolvente apropiado con uno o una combinación de los
ingredientes enumerados anteriormente, cuando se requiera, seguido
de la esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones se
preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que
contiene un medio de dispersión básico y otros ingredientes
requeridos de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de
polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables
estériles, los métodos de preparación incluyen secado al vacío y
liofilización que proporciona un polvo del ingrediente activo más
cualquier ingrediente deseado adicional de su solución antes
filtrada en estéril.
Las formulaciones adecuadas para la
administración intra-articular pueden estar en forma
de una preparación acuosa estéril del medicamento que puede estar en
forma microcristalina, por ejemplo, en forma de una suspensión
microcristalina acuosa. Formulaciones liposómicas o sistemas
poliméricos biodegradables también pueden ser usados para presentar
el medicamento tanto para la administración intraarticular como para
la oftálmica.
Las formulaciones adecuadas para la
administración tópica, incluyendo el tratamiento oculares, incluyen
preparativos líquidos o semilíquidos tales como linimentos,
lociones, geles, aplicaciones, emulsiones
de-aceite-en-agua o
de-agua-en-aceite
tales como cremas, ungüentos o pastas; o soluciones o suspensiones
tales como gotas. Las formulaciones para la administración tópica en
la superficie de la piel pueden ser preparadas dispersando el
medicamento con un vehículo dermatológicamente aceptable tal como
una loción, crema, ungüento o jabón. En algunas realizaciones, son
útiles vehículos capaces de formar una película o capa sobre la piel
para localizar la eliminación de la inhibición y la aplicación.
Cuando sea deseada la adherencia a una superficie de tejido, la
composición puede incluir el medicamento dispersado en una
composición de fibrinógeno-trombina u otro
bioadhesivo. El medicamento entonces puede ser extendido,
pulverizado o aplicado de otra manera a la superficie del tejido
deseado. Para la administración tópica a superficies de tejido
interno, el agente puede ser dispersado en un adhesivo de tejido
líquido u otra sustancia conocida para realzar la adsorción a una
superficie de tejido. Por ejemplo, pueden ser usadas ventajosamente
hidroxipropilcelulosa o soluciones de fibrinógeno/trombina. De forma
alternativa, pueden ser usadas soluciones que revistan al tejido,
tales como formulaciones que contienen pectina.
Para tratamientos por inhalación, tal como para
el asma, puede ser usada la inhalación del polvo (formulaciones
autopropulsadas o pulverizaciones) dispensada con un recipiente de
pulverización, un nebulizador o un atomizador. Tales formulaciones
pueden estar en forma de un polvo pulverizado fino para la
administración pulmonar de un dispositivo de inhalación en polvo o
formulaciones autopropulsadas que dispensen el polvo. En el caso de
una solución autopropulsada y formulaciones de pulverización, el
efecto puede ser logrado tanto por la elección de una válvula que
tenga las características de pulverización deseadas (es decir,
siendo capaz de producir una pulverización que tenga el tamaño de
partículas deseado) o incorporando el ingrediente activo como un
polvo suspendido en el tamaño de partículas controlado. Para la
administración por inhalación, también pueden ser administrados los
medicamentos en forma de una pulverización de aerosol desde un
recipiente a presión o dispensador que contenga a un propulsor
adecuado, por ejemplo, un gas tal como dióxido de carbono o un
nebulizador. También pueden ser usadas gotas nasales.
La administración sistémica también puede ser
por un medio transmucoso o transdérmico. Para la administración
transmucosa o transdérmica, son usados en la formulación agentes
penetrantes apropiados para que la barrera sea permeable. Se
conocen tales agentes penetrantes generalmente en la técnica, e
incluyen, por ejemplo, para la administración transmucosa,
detergentes, sales de bilis y derivados del ácido filsídico. La
administración transmucosa puede ser logrado por el uso de
pulverizaciones nasales o supositorios. Para la administración
transdérmica, los medicamentos típicamente se formulan en ungüentos,
bálsamos, geles o cremas tales como las generalmente conocidas en la
técnica.
En una realización, los medicamentos se preparan
con vehículos que protegerán contra su eliminación rápida del
cuerpo, tal como una formulación de liberación controlada,
incluyendo implantes y sistemas de administración microencapsulada.
Pueden ser usados polímeros biodegradables y biocompatibles, tales
como el acetato de etilen-vinilo, polianhídridos,
ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico.
Los métodos para la preparación de tales formulaciones serán
evidentes para los expertos en la técnica. Los materiales también
pueden ser obtenidos comercialmente de Corporación Alza y Nova
Pharmaceuticals, Inc. También pueden ser usadas suspensiones
liposómicas como vehículos farmacéuticamente aceptables. Estas
pueden ser preparadas de acuerdo con métodos conocidos para los
expertos en la técnica, por ejemplo, como se describe en la patente
de EE.UU. Nº. 4.522.811. También pueden ser usados microsomas y
micropartículas.
Pueden ser formuladas composiciones orales o
parenterales en formas de de dosificación unitaria para su facilidad
de administración y uniformidad de dosificación. La formas de
dosificación unitaria se refieren a unidades físicamente discretas
ajustadas como dosificaciones unitarias para el sujeto que se trate;
conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto
activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en
asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación
para las formas de dosificación unitarias de la invención es
controlada y directamente dependiente de las características únicas
del compuesto activo y del efecto terapéutico particular que se
logre, y las limitaciones inherentes en la técnica de la composición
de un tal compuesto activo para el tratamiento de individuos.
Generalmente, los medicamentos identificados de
acuerdo con la invención pueden ser formulados para la
administración parenteral u oral a seres humanos u otros mamíferos,
por ejemplo, en cantidades terapéuticamente eficaces, por ejemplo,
cantidades que proporcionen concentraciones apropiadas del fármaco
al tejido diana durante un tiempo suficiente para inducir el efecto
deseado. Además, los medicamentos de la presente invención pueden
ser administrados solos o en combinación con otras moléculas
conocidas para tener un efecto beneficioso sobre la enfermedad
particular o la indicación de interés. Sólo de forma ilustrativa,
cofactores útiles incluyen cofactores que alivian los síntomas,
incluyendo agentes antisépticos, antibióticos, antivirales y
antimicóticos y analgésicos y anestésicos.
La concentración eficaz de los medicamentos
identificados de acuerdo con la invención que deben ser
administrados en una composición terapéutica variarán dependiendo
de un número de factores, incluyendo la dosificación final deseada
del fármaco que se administre y la ruta de administración. La
dosificación preferida para ser administrada también depende
probablemente de variables tales como el tipo y el grado de la
enfermedad o la indicación que sea tratada, el estado de salud
global del paciente particular, la eficacia biológica relativa del
medicamento suministrado, la formulación del medicamento, la
presencia y los tipos de excipientes en la formulación y la ruta de
administración. Los medicamentos de esta invención pueden ser
proporcionados a un individuo usando unidades de dosis típicas
deducidas de los estudios en mamíferos antes descritos usando a
primates no humanos y roedores. Como se describe anteriormente, una
unidad de dosificación se refiere a una forma unitaria, es decir,
una dosis sola que puede administrarse a un paciente, y que puede
ser manejada y embalada fácilmente, quedando como una dosis unitaria
físicamente y biológicamente estable que comprenda el medicamento
como tal o una mezcla de ello con diluyentes farmacéuticos sólidos o
líquidos o vehículos.
En ciertas realizaciones, los organismos son
modificados para producir los medicamentos identificados e acuerdo
con la invención. Estos organismos pueden liberar el medicamento en
su cultivo o pueden ser introducidos directamente a un paciente. En
otra serie de realizaciones, pueden ser utilizadas células para
servir como un vehículo de los medicamentos identificados de acuerdo
con la invención.
Los medicamentos de la invención también
incluyen los derivados de "profármaco". El término profármaco
se refiere a un derivado farmacológicamente inactivo (o
parcialmente inactivo) de una molécula parenteral que requiere una
biotransformación espontánea o enzimática, dentro del organismo para
liberar o activar el componente activo. Los profármacos son
variaciones o derivados de los medicamentos de la invención que
tienen grupos excindibles en condiciones metabólicas. Los
profármacos se vuelven los medicamentos de la invención que son
farmacéuticamente activos in vivo, cuando sufren solvolisis
en condiciones fisiológicas o sufren la degradación enzimática. El
profármaco de esta invención puede llamarse único, doble, triple,
etcétera, dependiendo del número de etapas de biotransformación
requeridas para liberar o activar el componente de fármaco activo
dentro del organismo e indica el número de funcionalidades
presentes en una forma precursora tipo. Las formas de profármaco a
menudo ofrecen ventajas de solubilidad, compatibilidad con el tejido
o liberación retrasada en el organismo mamífero (véase, Bundgard,
"Design of Prodrugs", págs.
7-9,21-24, Elsevier, Amsterdam 1985
y Silverman, "The Organic Chemistry of Drug Design and Drug
Action", págs. 352-401, Academic Press, San
Diego, Calif., 1992). Además, los derivados de profármaco de acuerdo
con esta invención pueden ser combinados con otras propiedades para
realzar la biodisponibilidad.
Se han sintetizado casetes de
IGF-II por ligadura de una serie de oligos
sobrelapantes y clonados en Pirl-SAT, un vector de
expresión estándar de Leishmania. Se han hecho 4 casetes de
IGF-II: uno que codifica el polipéptido maduro tipo
silvestre, uno con una deleción \Delta1-7, uno con
una mutación Y27L y uno con ambas mutaciones. Estas mutaciones,
según se ha publicado, reducen la unión de IGF-II a
otros receptores sin afectar a la unión del receptor de M6P.
La secuencia de codificación de
IGF-II humana es mostrada en la Figura 1. La
proteína es sintetizada como una
pre-pro-proteína con un péptido
señal de 24 aminoácidos en el extremo amino-terminal
y una región del extremo carboxi-terminal de 89
aminoácidos ambos de los cuales son eliminados después de la
translación, revisado en (O'Dell et al. (1998) Int. J.
Biochem Cell Biol. 30 (7): 767-71. La
proteína madura tiene 67 aminoácidos. Una versión optimizada del
codon de Leishmania de IGF-II maduro se
muestra en la Figura 2 (Langford et al. (1992) Exp.
Parasitol 74 (3): 360-1). Este casete fue
construido templando los oligonucleotidos sobrelapantes cuyas
secuencias se muestran en la Tabla 2. Casetes adicionales que
contienen una deleción de los aminoácidos 1-7 del
polipéptido maduro (\Delta1-7), la alteración del
resto 27 de tirosina a leucina (Y27L) o ambas mutaciones
(\Delta1-7, Y27L) fueron hechas para producir los
casetes de IGF-II con especificidad sólo para el
receptor deseado como se describe antes. Para hacer el casete de
IGF-II tipo silvestre, fueron hibridados y ligados
los oligos RLIG1-9. Para hacer el casete Y27L,
fueron hibridados y ligados los oligos 1, 12, 3, 4, 5, 16, 7, 8 y 9.
Después de la ligadura, los dos casetes fueron purificados en
columna. Los casetes Y27L y tipo silvestre fueron amplificados por
PCR utilizando los oligos RLIG 20 y 10 y la plantilla apropiada.
Para incorporar la deleción \Delta1-7, las dos
plantillas fueron amplificadas usando los oligos RLIG 11 y 10. Los 4
casetes de IGF-II resultantes (tipo silvestre, Y27L,
\Delta1-7 e Y27L\Delta1-7)
fueron purificados en columna, fueron digeridos con XbaI,
purificados por gel y ligados al corte de XbaI
PirI-SAT.
Los casetes génicos entonces fueron clonados
entre el sitio XmaI (no mostrado) corriente arriba de XbaI en el
vector y el sitio AscI de tal modo que se conservara el marco de
lectura. Un sitio de metilasa de DAM soblelapante en el sitio 3'
XbaI permitió el uso del sitio 5'XbaI en vez del sitio XmaI para la
clonación. El sitio AscI añade un puente de 3 restos de
aminoácidos.
El objetivo de incorporar las mutaciones
indicadas en el casete del IGF-II es para asegurar
que las proteínas de fusión son reconocidas en el receptor
apropiado. La IGF-II humana tiene un alto grado de
semejanza de secuencia y estructural con IGF-I
(véase, por ejemplo la Figura 6) y las cadenas A y B de insulina
(Terasawa et al. (1994) Embo J. 13 (23):
5590-7). Por consiguiente, no es sorprendente que
estas hormonas tengan especificidades de unión del receptor
sobrelapantes. La IGF-II se une al receptor de
insulina, el receptor de IGF-I y el receptor de
manosa 6-fosfato independiente
catión/IGF-II (CIM6P/IGF-II). El
receptor de CIM6P/IGF-II es un receptor de actividad
dual que actúa como un receptor para IGF-II y como
un receptor de manosa 6-fosfato implicado en la
clasificación de hidrolasas lisosómicas. Durante varios años, estas
dos actividades fueron atribuidas para separar proteínas hasta que
fue determinado que ambas actividades residían en una proteína sola
(Morgan et al. (1987) Nature 329 (6137):
301-7); (Tong et al. (1988) J. Biol.
Chem. 263 (6):2585-8).
Los efectos biológicos más profundos de
IGF-II, tal como su efecto mitogénico, son mediados
por el receptor de IGF-I más que por el receptor de
CIM6P/IGF-II, revisado en (Ludwig et al.
(1995) Trends in Cell Biology 5:
202-206) véase también (Korner et al. (1995)
J. Biol. Chem. 270 (1): 287-95). Se
piensa que el resultado principal de la unión de
IGF-II al receptor de CIM6P/IGF-II
es el transporte al lisosoma para su degradación subsecuente. Esto
representa un medio importante para controlar los niveles de
IGF-II y explica por qué los ratones que tienen
mutantes nulos del receptor de CIM6P/IGF-II exhiben
una mortalidad perinatal a no ser que IGF-II también
sea suprimido (Lau et al. (1994) Genes Dev. 8
(24): 2953-63); (Wang et al. (1994)
Nature 372 (6505): 464-7); (Ludwig
et al. (1996) Dev. Biol. 177
(2):517-35). En los métodos de la presente
invención, es deseable tener las proteínas de fusión
IGF-II unidas al receptor de
CIM6P/IGF-II. Las mutaciones Y27L y
\Delta1-7 reducen la unión de
IGF-II a los receptores de IGF-I e
insulina sin cambiar la afinidad del receptor de
CIM6P/IGF-II (Sakano et al. (1991) J.
Biol. Chem. 266 (31): 20626-35);
(Hashimoto et al. (1995) J. Biol. Chem. 270
(30):18013-8). Por lo tanto, de acuerdo con la
invención, estas formas mutantes de IGF-II deben
proporcionar un medio para reconocer proteínas de fusión
específicamente con el receptor de
CIM6P/IGF-II.
En un experimento, son preparados 4 casetes
diferentes de IGF-II con las secuencias apropiadas,
tipo silvestre, \Delta1-7, Y27L y
\Delta1-7/Y27L. Los casetes de
\beta-GUS son fusionados a casetes de
IGF-II y estos constructos son puestos dentro de
parásitos. Los casetes de \alpha-galactosidasa
también son fusionados a los casetes de IGF-II. Las
fusiones de GUS han sido analizadas y se ha mostrado que producen la
proteína enzimáticamente activa.
Un constructo preferido, mostrado en la Figura
3, incluye el péptido señal de la fosfatasa ácidasecretada de L.
mexicana, SAP 1, clonada en el sitio XbaI de un
Pirl-SAT modificado en el cual ha sido eliminado el
sitio Sail simple. Fusionada en marco está la secuencia de GUS
madura, unida a un marcador de IGF-II por un puente
de tres aminoácidos.
Fueron cultivadas L. mexicana que
expresaban y secretaban \beta-Gus a 26ºC en 100 ml
de medio estándar Promastigote (M199 con HEPES 40 mM, pH 7,5,
adenina 0,1 mM, 0,0005% de hemina, 0,0001% de biotina, suero bovino
fetal del 5%, fluido embrionario del 5%, 50 unidades/ml de
penicilina, 50 \mug/ml de estreptomicina y 50 \mug/ml de
nourseotricina). Después de alcanzar una densidad de aproximadamente
5 x 10^{6} promastigotes/ml, los promastigotes fueron recogidos
por centrifugación durante 10 minutos a 1000 x g a temperatura
ambiente; estos promastigotes fueron usados para inocular 1 litro de
medio de proteína bajo (M199 suplementado con adenina 0,1 mM,
0,0001% de biotina, 50 unidades/ml de penicilina y 50 \mug/ml de
estreptomicina) a temperatura ambiente. Los cultivos de 1 litro
fueron introducidos en matraces taponados de 2 litros con una barra
de agitación estéril de modo que los cultivos pudieran ser incubados
a 26ºC con una agitación suave. Fueron aireados los cultivos de 1
litro dos veces al día moviéndolos en una mampara de flujo laminar,
eliminando los tapones y agitando enérgicamente antes de sustituir
los tapones. Cuando los cultivos alcanzaron una densidad de
2-3 x10^{7} promastigotes/ml, los cultivos fueron
centrifugados como se describe anteriormente excepto el pelet de
promastigote que fue desechado y el medio fue decantado en matraces
estériles. La adición de 434 g de (NH_{4})_{2}SO_{4}
por litro precipitó la proteína GUS activa a partir del medio; el
medio desalado fue almacenado a 4ºC de la noche a la mañana. Las
proteínas precipitadas fueron recolectadas por centrifugación a
10.500 x g durante 30 minutos o por filtración a través de una
membrana Supor-800 de Gelman; las proteínas fueron
resuspendidas en Tris 10 mM, pH 8,1, CaCl_{2} mM y fueron
almacenadas a -80ºC hasta la diálisis. Los preparativos a granel de
varios litros de medio fueron descongelados, reunidos, colocados en
un tubo de diálisis (Spectra/Por-7, MWCO 25,000), y
fueron dializados de la noche a la mañana frente a dos volúmenes de
1 litro de DMEM con bicarbonato (medio Eagle modificado de
Dulbecco).
La línea de fibroblastos de la piel GM4668
(humano, NIGMS, depósito de células mutantes genético humanas) es
derivada a partir de un paciente con mucopolisacaridosis VII; las
células por lo tanto tienen poca o ninguna actividad de
\beta-GUS. Las células GM4668 son por lo tanto
particularmente útiles para analizar la respuesta de los constructos
de GUS-RLIG en células humanas. Fueron cultivadas
células GM4668 en placas de cultivo de tejido de 12 pocillos en
medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con suero de
becerro fetal del 15% (v/v) a 37ºC en 5% de CO_{2}. Fueron
cultivados fibroblastos de la noche a la mañana en presencia de
aproximadamente 150 unidades de los preparativos de
\beta-glucuronidasa humana expresada en
Leishmania (GUS), la proteína de fusión
GUS-IGF-II (GUS- RLIG), o la
proteína de fusión GUS-IGF-II
mutante (GUS\Delta-RLIG) preparados como se
describe en el Ejemplo 2. Los pocillos de control no contenían
ninguna enzima añadida (blanco medio DMEM). Después de la
incubación, el medio fue eliminado de los pocillos y analizado por
triplicado para detectar la actividad de GUS. Los pocillos fueron
lavados cinco veces con 1 ml de solución salina tamponada de fosfato
a 37ºC, luego fueron incubados durante 15 minutos a temperatura
ambiente en 0,2 ml de tampón de lisis (Tris 10 mM, pH 7,5, NaCl 100
mM, EDTA 5 mM, hidrocloruro de fluoruro de
4-(2-aminoetilbencenosulfonilo) 2 mM (AEBSF, Sigma)
y NP-40 del 1%). Los lisados celulares fueron
transferidos a tubos de microcentrífuga, luego se hicieron girar a
13.000 revoluciones por minuto durante 5 minutos para eliminar los
restos de células. Tres alícuotas de 10 \muL de lisado fueron
analizados para calcular la concentración de proteína (ensayo de
proteínas Micro BCA de Pierce, Pierce, IL).
Tres alícuotas de 38 \muL de lisado fueron
analizadas para detectar la actividad de GUS usando un ensayo
fluorométrico estándar adaptado de (Wolfe et al. (1996)
"Protocols for Gene Transfer in Neuroscience: Towards Gene Therapy
of Neurological Disorders" 263-274). Los ensayos
se hacen en cuvetas de fluorímetro disponibles. 150 \mul de la
mezcla de reacción son añadidos a cada cuveta. 1 ml de la mezcla de
reacción es una mezcla de sustrato de 860 \mug de H_{2}O, 100
\mul de NaAcetato 1 M, 40 \mul de 25X
\beta-GUS. La mezcla de sustrato de 25X
\beta-GUS es una suspensión de 250 mg de
4-metilumbeliferil-\beta-D
glucurónido en 4,55 ml de etanol almacenado a -20ºC en un desecador.
38 \mul de la muestra son añadidos a la mezcla de reacción y la
reacción se incuba a 37ºC. Las reacciones son terminadas por la
adición de 2 ml de solución de parada (10,6 g de Na_{2}CO_{3},
12,01 g de glicina, H_{2}O hasta 500 ml, pH 10,5). El resultado de
fluorescencia es después medido con el fluorímetro.
Los resultados del experimento de respuesta
indican que la cantidad de células asociadas a
GUS-RLIG es 10 veces mayor que la del GUS no
modificado (Figura 4). El constructo mutante doble es
aproximadamente 5 veces más eficaz que el GUS no modificado. Estos
resultados indican que la tecnología RLIG es un medio eficaz para
reconocer una enzima lisosómica por su respuesta. La respuesta
también puede ser verificada usando técnicas de inmunofluorescencia
estándar.
Para verificar que la respuesta mediada por RLIG
ocurre vía el sitio de unión de IGF-II sobre el
receptor de M6P independiente de cationes, fueron realizados
experimentos competitivos usando IGF-II
recombinante. El diseño experimental era idéntico al descritó
anteriormente, excepto que los fibroblastos GM4668 fueron incubados
con las proteínas indicadas en suero menos DMEM +2%BSA durante
aproximadamente 18 horas. Cada derivado de
\beta-GUS fue añadido en 150 U por pocillo. Fueron
añadidos 2,85 \mug de IGF-II a cada pocillo para
analizar la competitividad. Esto representa aproximadamente 100
veces de exceso molar respecto a RLIG-GUS, una
concentración suficiente para competir por unirse al receptor de
M6P/IGF-II.
Los resultados del experimento competitivo son
representados en la Figura 5. En ausencia de IGF-II,
fueron detectadas más de 24 unidades/mg de lisado de
RLIG-GUS. Bajo la adición de IGF-II,
la cantidad de células asociadas a RLIG-GUS cayó a
5,4 U. Este nivel es similar al nivel de GUS no modificado
incorporado por los fibroblastos. Así, la mayor parte de la
respuesta de la proteína RLIG puede competir por
IGF-II indicando que la respuesta ocurre en realidad
por una interacción ligando-receptor específica.
También pueden ser aislados productos de
expresión a partir del medio libre de suero. En general, la cepa de
expresión es cultivada en medio con suero, diluida en medio libre de
suero, y se le permite crecer durante varias generaciones,
preferiblemente 2-5 generaciones, antes de que el
producto de expresión sea aislado. Por ejemplo, la producción de
proteínas terapéuticas diana secretadas puede ser aislada a partir
de promastigotes de Leishmania mexicana que son cultivados
inicialmente en 50 ml de medio 1X M199 en un matraz de 75 cm^{2} a
27ºC. Cuando la densidad celular alcanza 1-3 x
10^{7}/ml, el cultivo es usado para inocular 1,2 L de medio M199.
Cuando la densidad de este cultivo alcanza aproximadamente 5 x
10^{6}/ml, las células son recolectadas por centrifugación,
resuspendidas en 180 ml de sobrenadante y usadas para inocular 12 L
de medio "Zima" en un matraz de centrífuga de 16 L. La densidad
celular inicial de este cultivo es típicamente aproximadamente 5 x
10^{5}/ml. Este cultivo es aumentado hasta una densidad celular de
aproximadamente 1,0-1,7 x10^{7} células/ml. Cuando
esta densidad celular es alcanzada, las células son separadas del
medio de cultivo por centrifugación y el sobrenadante es filtrado a
4ºC mediante un filtro de 0,2 \mu para eliminar los promastigotos
residuales. El medio filtrado fue concentrado de 12,0 L a 500 ml
utilizando un dispositivo de filtración de flujo tangencial
(cartucho Prep/Scale-TFF de MILLIPORE).
El medio de crecimiento preferido para este
método es el medio de crecimiento M199 y "Zima". Sin embargo,
también son útiles otros que contengan suero y sin suero. El medio
de crecimiento M199 es como sigue: (lote de 1L) = 200 ml de 5X M199
(con indicador de pH rojo de fenol) + 637 ml de H_{2}O, 50,0 ml de
FBS, 50,0 ml de EF, 20,0 ml de 50 microgramos/ml de SAT, 2,0 ml de
hemina del 0,25% en trietanolamina del 50%, 10 ml de adenina 10 mM
en Hepes 50 mM, pH 7,5, 40,0 ml de Hepes 1 M, pH 7,5, 1 ml de
biotina del 0,1% en etanol del 95%, 10,0 ml de
penicilina/estreptomicina. Todos los sueros usados son inactivados
por calor. El volumen final = 1 L es esterilizado con filtro. El
medio M199 modificado con "Zima" es como sigue: (lote de 20,0
L) = 217,8 g de polvo M199 (-)rojo de fenol + 7,0 g de bicarbonato
de sodio, 200,0 ml de adenina 10 mM en Hepes 50 mM, pH 7,5, 800,0 ml
de Hepes sin ácido, pH 7,5, 20,0 ml de biotina del 0,1% en etanol
del 95%, 200,0 ml de penicilina/estreptomicina, volumen final = 20,0
L es esterilizado con filtro.
Las proteínas terapéuticas diana son purificadas
preferiblemente por cromatografía con Concanavalina A (ConA). Por
ejemplo, cuando un cultivo alcanza una densidad de > 1,0 x
10^{7} promastigotes/ml, la L. mexicana es eliminada por
centrifugación, 10 minutos a 500 x g. El medio de cultivo
recolectado es pasado por un filtro de 0,2 \mum para eliminar
partículas antes de la carga directamente en una columna de
ConA-agarosa (agarosa en perlas 4% reticulado,
Sigma). La columna de ConA-agarosa es pretratada con
NaCl 1 M, Tris 20 mM, pH 7,4, 5 mM cada uno de CaCl_{2},
MgCl_{2} y MnCl_{2} y luego es equilibrada con 5 volúmenes de
tampón de columna (Tris 20 mM, pH 7,4, CaCl_{2} 1 mM y MnCl_{2}
1 mM). Un total de 179.800 unidades (nmol/h) de actividad de GUS
(en 2 L) en el medio de cultivo son cargadas en 22 ml de la columna
de agarosa de ConA. Ninguna actividad es detectable en el flujo a
través o en el lavado. La actividad de GUS es eluida con tampón de
columna conteniendo metilmanopiranósido 200 mM. Las fracciones
eluidas que contienen el pico de actividad son reunidas y
concentradas. Los experimentos de respuesta y competitivos fueron
realizados como se describe en los Ejemplos 3 y 4, pero los
organismos fueron cultivados en medio sin suero y purificados con
ConA; aproximadamente 350-600 unidades enzimáticas
fueron aplicadas a los fibroblastos. Se muestran los resultados en
la Figura 7.
El experimento en el Ejemplo 4 es repetido
usando IGF-II normal o desnaturalizado como
competidor. Como en el Ejemplo 4, se reduce la cantidad de
GUS-RLIG asociado por célula cuando se
co-incuba con concentraciones normales de
IGF-II que son eficaces para la competición, pero, a
concentraciones comparables, IGF-II desnaturalizado
tiene poco o ningún efecto.
La unión de proteínas GUS-RLIG
al receptor de M6P/IGF-II sobre fibroblastos es
medida y la velocidad de respuesta es evaluada de modo similar a los
métodos publicados (York et al. (1999) J. Biol. Chem.
274 (2): 1164-71). Los fibroblastos de GM4668
cultivados en placas de cultivo de 12 pocillos como se describe
anteriormente son lavados en medio helado menos suero que contiene
1% de BSA. El ligando, (GUS, GUS-RLIG o
GUS-\DeltaRLIG, o proteínas de control) es añadido
a las células en medio frío menos suero más 1% de BSA. Bajo la
adición del ligando, las placas son incubadas en hielo durante 30
minutos. Después de 30 minutos, el ligando es eliminado y las
células son lavadas rápidamente 5 veces con medio frío en hielo. Los
pocillos para el punto de tiempo 0 reciben 1 ml de tampón de
separación frío en hielo (ácido acético 0,2 M, pH 3,5, NaCl 0,5 M).
La placa entonces es puesta a flote en un baño maría a 37ºC y son
añadidos 0,5 ml de medio precalentado para iniciar la respuesta. En
cada punto de parada, es añadido 1 ml de tampón de separación.
Cuando el experimento es terminado, las alícuotas del tampón de
separación son guardadas para el ensayo fluorométrico de la
actividad de \beta-glucuronidasa como se describe
en el Ejemplo 3. Las células entonces son lisadas como se describe
anteriormente y el lisado es analizado para determinar la actividad
de \beta-glucuronidasa.
Se espera que GUS-RLIG sea
rápidamente incorporado por los fibroblastos en materia de minutos
una vez que la temperatura es cambiada a 37ºC (York et al.
(1999) J. Biol. Chem. 274 (2):
1164-71) y que la actividad de la enzima persista en
las células durante muchas horas.
Son usados ratones GUS menos generados por
acoplamientos heterozigóticos de ratones
B6.C-H-2^{bml}/ByBIR-gus^{mps}/+
(Birkenmeier et al. (1989) J. Clin. Invest 83
(4): 1258-6) para evaluar la eficacia de
GUS-RLIG o derivados en terapia de reemplazo
enzimático. Dos formatos son usados. En un formato, se dan a
3-4 animales una inyección sola de 20.000 U de
enzima en 100 \mul de tampón de dilución de enzima (NaCl 150 mM,
Tris 10 mM, pH 7,5). Los ratones son sacrificados
72-96 horas más tarde para evaluar la eficacia de la
terapia. En un segundo formato, se dan a ratones inyecciones
semanales de 20.000 unidades aproximadamente 3-4
semanas y son sacrificados 1 semana después de la inyección final.
Son llevados a cabo análisis histoquímicos e histopatológicicos de
hígado, bazo y cerebro por métodos publicados (Birkenmeier et
al. (1991) Blood 78 (11):
3081-92); (Sands et al. (1994) J. Clin.
Invest 93 (6):2324-31); (Daly et
al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (5):
2296-300). En ausencia de terapia, las células (por
ejemplo, macrófagos y células Kupffer) de ratones GUS menos
desarrollaron grandes compartimentos de almacenaje intracelulares
que son el resultado de la acumulación de productos superfluos en
los lisosomas. Es previsto que en células en ratones tratados con
los constructos de GUS-RLIG, visiblemente se
reducirá el tamaño de estos compartimentos o los compartimentos se
encogerán hasta que no sean más visibles con un microscopio
óptico.
Asimismo, seres humanos con enfermedades
relacionadas con el almacenamiento lisosómico serán tratados usando
constructos que reconocen una parte terapéutica apropiada en sus
lisosomas. En algunos casos, el tratamiento tomará la forma de
inyecciones regulares (por ejemplo, semanales) de una proteína RLIG.
En otros casos, el tratamiento será logrado por la administración de
un ácido nucleico para permitir la expresión persistente in
vivo de una proteína RLIG, o por la administración de una célula
(por ejemplo, una célula humana o un organismo unicelular) que
exprese la proteína RLIG en el paciente. Por ejemplo, la proteína
RLIG puede ser expresada in situ usando un vector de
Leishmania como se describe en la patente de EE.UU. Nº.
6.020.144, publicada el 1 de febrero de 2000; solicitud de patente
provisional de EE.UU. Nº. 60/250.446; y registro de agente de la
solicitud provisional Nº. SYM-005PRA, "Protozoan
Expression Systems for Lysosomal Storage Disease Genes",
presentada el 11 de mayo de 2001.
El objetivo de estos experimentos es evaluar la
eficacia de \alpha-galactosidasa modificada con
RLIG (\alpha-GAL A) como una terapia de reemplazo
enzimático para la enfermedad de Fabry.
La enfermedad de Fabry es una enfermedad de
almacenamiento lisosómico que es el resultado de una actividad
insuficiente de \alpha-GAL A, la enzima
responsable de eliminar la galactosa terminal de
GL-3 y otros esfingolípidos neutros. La menor
actividad enzimática ocurre debido a una variedad de mutaciones
sentido y antisentido en el gen ligado a X. La acumulación de
GL-3 es más frecuente en los lisosomas de las
células endoteliales vasculares del corazón, hígado, riñones, piel y
cerebro, pero también ocurre en otras células y tejidos. La
acumulación de GL-3 en células endoteliales
vasculares en última instancia conduce a problemas cardíacos y
fallos hepáticos.
La terapia de reemplazo enzimático es un
tratamiento eficaz para la enfermedad de Fabry, y su éxito depende
de la capacidad de la enzima terapéutica a ser incorporada por los
lisosomas de las células en las cuales GL-3 se
acumula. El producto de Genzyme, Fabrazyme, es una
\alpha-GAL A recombinante producida en células CHO
DUKX B11 que han sido aprobadas para el tratamiento de pacientes con
Fabry en Europa debido a su eficacia demostrada.
La capacidad de la Fabrazyme para ser
incorporado por células y ser transportado al lisosoma es debida a
la presencia de manosa 6-fosfato (M6P) en su
carbohidrato N-unido. Fabrazyme es suministrado a
los lisosomas por la unión al receptor de
manosa-6-fosfato/IGF-II
(M6P/IGF-Iir), presente sobre la superficie celular
de la mayor parte de tipos de células, y la posterior endocitosis
mediada por el receptor. Fabrazyme, según se cree, tiene tres sitios
de glicosilación N-unidos en los restos ASN 108,161
y 184. Los carbohidratos predominantes en estas posiciones son
complejo bisialilaso biantenario fucosilaso,
manosa-7 oligomanosa monofosforilada, y
manosa-7 oligomanosa bifosforilada,
respectivamente.
La tecnología de reconocimiento lisosómico
independiente de la glicosilación (RLIG) de la presente invención
reconoce directamente proteínas terapéuticas en el lisosoma vía una
interacción diferente con M6P/IGF-Iir. Un ligando de
reconocimiento es un derivado de IGF-II maduro
humano, que también se une con alta afinidad al
M6P/IGF-Iir. En las aplicaciones actuales, el
marcador IGF-II es proporcionado como una fusión del
extremo C-terminal a la proteína terapéutica, aunque
otras configuraciones sean factibles incluyendo la reticulación. La
capacidad de enzimas RLIG-modificadas para responder
en células ha sido establecida usando
\beta-glucuronidasa
RLIG-modificada, que es incorporada de manera
eficiente por los fibroblastos en un procedimiento que es competido
con exceso de IGF-II. Las ventajas de la
modificación de RLIG son mayores unión al receptor de
M6P/IGF-II, mayor respuesta en lisosomas de células
diana, farmacocinética cambiada o mejorada y un mayor, diferente o
mejorado grado de distribución en tejidos. El mejor grado de
distribución en tejidos podría incluir la administración de
\alpha-GAL A RLIG-modificado a
través de la barrera sangre-cerebro ya que las
proteínas IGF cruzan de forma demostrable la barrera
sangre-cerebro.
Otra ventaja del sistema RLIG es la capacidad de
producir proteínas competentes en su repuesta en sistemas de
expresión no mamíferos donde no ocurren modificaciones con M6P. En
ciertas realizaciones, la proteína RLIG-modificada
será producida principalmente en células CHO. En ciertas otras, el
marcador RLIG será colocado en el extremo C-terminal
de \alpha-GAL A aunque la invención no esté así
limitada.
Claims (17)
-
\global\parskip0.900000\baselineskip
1. Una medicamento diana que comprende una enzima lisosómica y un péptido que se une a un dominio extracelular de un receptor humano de manosa-6-fosfato independiente de cationes de una manera independiente de manosa-6-fosfato-, en el que el péptido:- (a)
- tiene una identidad de secuencia de aminoácidos suficiente respecto a IGF-II humano tal que el péptido se une al receptor humano de manosa-6-fosfato independiente de cationes; o
- (b)
- comprende IGF-II o un dominio variable de anticuerpo que reconoce el receptor; o
- (c)
- comprende la secuencia de aminoácidos de IGF-I o de una muteina de IGF-I en la que: (i) los aminoácidos 55 y 56 son cambiados; o (ii) los aminoácidos 1-4 son suprimidos o cambiados; o (iii) los aminoácidos 55 y 56 son cambiados y los aminoácidos 1-4 son suprimidos o cambiados.
- 2. El medicamento diana de la reivindicación 1, en el que el péptido comprende una secuencia de aminoácidos al menos 60% idéntica respecto a IGF-II humano.
- 3. El medicamento diana de la reivindicación 2, en el que la secuencia de aminoácidos comprende, en las posiciones correspondiente a las posiciones 54 y 55 de IGF-II humano, aminoácidos cada uno de los cuales no están cargados o están negativamente cargados a pH 7,4.
- 4. El medicamento diana de la reivindicación 1, en el que el péptido comprende los aminoácidos 48-55 de IGF-II humano.
- 5. El medicamento diana de la reivindicación 1, en el que el péptido comprende al menos tres aminoácidos seleccionados a partir del grupo que consiste en los aminoácidos 8, 48, 49, 50, 54 y 55 de IGF-II humano.
- 6. El medicamento diana de la reivindicación 1, en el que el péptido comprende los aminoácidos 8-23 de IGF-II humano y los aminoácidos 41-61 de IGF-II humano.
- 7. El medicamento diana de la reivindicación 6, en el que los aminoácidos 8-28 y 41-81 están presentes en un polipéptido solo.
- 8. El medicamento diana de la reivindicación 1, en el que el péptido comprende los aminoácidos 41-61 de IGF-II humano y una muteina de los aminoácidos 8-28 de IGF-II humano, diferenciándose la muteina de la IGF-H humana en una posición seleccionada a partir del grupo que consiste en el aminoácido 9, aminoácido 19, aminoácido 26 y aminoácido 27.
- 9. El medicamento diana de la reivindicación 1, en el que el péptido comprende un polipéptido que tiene hélices alfa antiparalelas separadas por no más de cinco aminoácidos.
- 10. El medicamento diana de la reivindicación 1, en el que el péptido se une a un dominio extracelular del receptor humano de manosa-6-fosfato independiente de cationes e (i) no se une a una muteina en la cual el aminoácido 1572 del receptor humano de manosa-6-fosfato independiente de cationes es cambiado de isoleucina a treonina; o (ii) se une a la muteina con una constante de disociación al menos diez veces la constante de disociación para unir el dominio extracelular del receptor humano de manosa-6-fosfato independiente de cationes.
- 11. El medicamento diana de la reivindicación 1, en el que el péptido es capaz de unirse a un dominio del receptor que consiste esencialmente en las repeticiones 10-15 del receptor humano de manosa-6-fosfato independiente de cationes.
- 12. El medicamento diana de la reivindicación 11, en el que el péptido es capaz de unirse a un dominio del receptor que consiste esencialmente en las repeticiones 10-13 de dicho receptor.
- 13. El medicamento diana de la reivindicación 12, en el que el péptido se une a un dominio del receptor que consiste esencialmente en las repeticiones 11-12 de dicho receptor.
- 14. El medicamento diana de la reivindicación 13, en el que el péptido se une a un dominio del receptor que consiste esencialmente en la repetición 11 de dicho receptor.
- 15. El medicamento diana de la reivindicación 14, en el que el péptido se une a un dominio del receptor que consiste esencialmente en los aminoácidos 1508-1566 de dicho receptor.
- 16. El medicamento diana de cualquiera de las reivindicaciones precedentes para uso en terapia de reemplazo enzimático.
- 17. El uso del medicamento diana de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad de almacenamiento lisosómico.
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