DE69835367T2

DE69835367T2 - Gentherapie für gaucher-krankheit

Info

Publication number: DE69835367T2
Application number: DE69835367T
Authority: DE
Inventors: S. Nelson West Upton YEW; J. Robin Sterling ZIEGLER; H. Seng Wellesley CHENG
Original assignee: Genzyme Corp
Current assignee: Genzyme Corp
Priority date: 1997-10-29
Filing date: 1998-10-29
Publication date: 2007-08-02
Anticipated expiration: 2018-10-30
Also published as: JP2002522509A; US6066626A; ES2268799T3; WO2000009153A1; EP1027069B1; AU1284799A; AU734290B2; ATE333893T1; EP2147681A1; IL135578A; EP1027069A1; DE69835367D1; US20100041151A1; CA2305768A1; JP2010031023A; US20030087868A1; IL135578A0; IL177228A0

Description

Die vorliegende Erfindung ist eine Teilfortführungsanmeldung der am 29. Oktober 1997 eingereichten US-Patentanmeldung Nr. 60/063,527, deren Offenbarung hier durch Bezugnahme aufgenommen ist.
Hintergrund der Erfindung
Lysosomale Speicherkrankheiten sind eine Gruppe von über 40 Störungen, die das Ergebnis von Defekten in Genen sind, die für Enzyme codieren, welche Glycolipid- oder Polysaccharid-Abfallprodukte innerhalb der Lysosome von Zellen abbauen. Die enzymatischen Produkte, wie z. B. Zucker und Lipide, werden dann zu neuen Produkten aufbereitet. Jede dieser Störungen rührt von einem vererbten autosomalen oder X-verknüpften, rezessiven Merkmal her, das die Enzymmengen im Lysosom beeinflusst. Im allgemeinen gibt es keine biologische oder funktionale Aktivität der betroffenen Enzyme in den Zellen und Geweben betroffener Individuen. Tabelle I stellt eine Liste repräsentativer Speicherkrankheiten und der mit den Erkrankungen verbundenen enzymatischen Defekte bereit. Bei solchen Krankheiten erzeugt die mangelnde Enzymfunktion eine fortschreitende systemische Ablagerung von Lipid- oder Kohlenhydrat-Substrat innerhalb von Zellen im Körper, die letztlich zu einem Verlust der Organfunktion und zum Tod führt. Auf die genetische Etiologie, klinischen Manifestationen, Molekularbiologie und Möglichkeit der lysosomalen Speicherkrankheiten gehen Scriver et al., Hrsg., in The Metabolic und Molecular Basis of Inherited Disease, 7. Auflage, Band II, McGraw Hill, (1995) näher ein. Tabelle I: Lysosomale Speicherkrankheiten und damit verbundene enzymatische Defekte

*MPS = Mucopolysaccharidose

Als Vertreter der Klasse lysosomaler Speicherkrankheiten ist die Fabry-Krankheit eine rezessive, X-verknüpfte, erbliche rezessive Störung, die durch ein Fehlen des lysosomalen Enzyms α-Galactosidase A bedingt ist. Das Fehlen dieser lysosomalen Hydrolase führt zu einer fortschreitenden Ablagerung von Glycosphingolipidglobotriasylceramid (GL3) oder Galactosyl-(α1->4)-galactosyl- (β1->4)-glucosyl-(β1->1')-ceramid in den meisten Geweben des Körpers. Die doppelbrechenden Ablagerungen von GL3 sind vorwiegend im vaskulären Endothel vorzufinden. Die fortschreitende endotheliale Akkumulation von GL3 führt zu Ischämie und Infarkt in Organen, wie Niere, Herz oder Gehirn, und verursacht quälenden Schmerz, Nierenversagen, Herzerkrankungen und zerebrovaskulären Erkrankungen. Das durchschnittliche Sterbealter eines Betroffenen an Komplikationen der vaskulären Erkrankung in Nieren, Herz und/oder Gehirn beträgt 41 Jahre. Derzeit sind keine wirksamen Behandlungen für diese Krankheit verfügbar (siehe z. B. Desnick et al. in Scriver et al., Hrsg.: The Molecular Basis of Inherited Disease, 7. Aufl., Kapitel 89, S. 2741-2784, McGraw Hill (1995)).
Humane α-Galactosidase A (α-D-Galactosidgalactohydrolase; α-gal A; EC 3.2:1.22) ist eine lysosomale Exoglycosidase, die von einem Gen auf Xq22 codiert wird. Eine humane Leber-cDNA, die für α-Galactosidase A codiert, wurde aus einer λgt11-Expressionsbibliothek (Calhoun et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82:7364-7368 (1985)) isoliert. Die isolierte cDNA codierte für die reife Aminosäuresequenz von α-Galactosidase A, enthielt aber nicht die komplette Signalpeptidsequenz der Vorläuferform (Bishop et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 83:4859-4863 (1986). Dieser partielle cDNA-Klon wurde dann dazu verwendet, einen E. coli-Expressionsvektor mit der α-Galactosidase A-Codierungssequenz unter Kontrolle des trp-Promotors zu konstruieren (Hantzopoulos et al., Gene 57:159-169 (1987)). Später wurde ein Genom-Klon isoliert, der den Promotor und das erste Exon des Proteins, einschließlich des vollen Signalpeptids, trug (Quinn et al., Gene 58:177-188 (1987)). Ferner wurden aus humanen Fibroblasten isolierte cDNA-Klone voller Länge erhalten und dazu verwendet, eine vorübergehende Expression von α-Galactosidase A in COS-Zellen zu erhalten (Tsuji et al., Eur. J. Biochem. 165:275-280 (1987)). Vor kurzem wurde eine transgene Fabry-Knockout-Maus, die ein Fehlen dieser Enzymaktivität zeigte, geschaffen (Ohshima et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 94:2540-2544 (1997). Knockout-Mäuse zeigen ein vollständiges Fehlen von α-Galactosidase A-Aktivität). Eine Lipidanalyse der Leber und Nieren der Knockout-Mäuse zeigte eine deutliche zeitabhängige Akkumulation von GL3, was die Ähnlichkeit des pathophysiologischen Prozesses in den Mutantenmäusen und in Patienten mit der Fabry-Krankheit zeigt. Id. Somit ergeben die Fabry-Knockout-Mäuse ein hervorragendes Modell für die Krankheit beim Menschen.
De Duve legte als Erster nahe, dass ein Ersatz des fehlenden lysosomalen Enzyms mit einem exogenen, biologisch aktiven Enzym ein praktikabler Ansatz zur Behandlung lysosomaler Speicherkrankheiten sein könnte (De Duve, Fed. Proc. 23:1045 (1964)). Seither legten verschiedene Studien nahe, dass die Enzymaustauschtherapie zur Behandlung verschiedener lysosomaler Speicherkrankheiten von Nutzen sein könnte. Der größte Erfolg zeigte sich bei Individuen mit der Typ I-Gaucher-Krankheit, die mit einem exogenen Enzym (β-Glucocerebrosidase) behandelt wurden, das aus Placenta (Ceredase^®) oder in jüngerer Zeit rekombinant (Cerezyme^®) hergestellt wurde. Es wurde davon ausgegangen, dass der Enzymaustausch auch zur Behandlung der Fabry-Krankheit sowie anderer lysosomaler Speicherkrankheiten von Nutzen sein könne, siehe beispielsweise Dawson et al., Ped. Res. 7(8):684-690 (1973) (in vitro) und Mapes et al., Science 169:987 (1970) (in vivo). Klinische Versuche zur Enzymaustauschtherapie wurden für Fabry-Patienten berichtet, bei denen Infusionen von normalem Plasma (Mapes et al., Science 169:987-989 (1970)); gereinigter α-Galactosidase A aus Placenta (Brady et al., N. Eng. J. Med. 279:1163 (1973)); oder gereinigter α-Galactosidase A aus Milz oder Plasma (Desnick et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 76:5326-5330 (1979)) verwendet wurden, und zeigten die biochemische Wirksamkeit eines direkten Enzymaustausches bei der Fabry-Krankheit. Diese Studien zeigten das Potential zur Eliminierung oder signifikanten Verringerung der pathologischen Glycolipid-Speicherung durch wiederholten Enzymaustausch. Beispielsweise führte bei einer Studie (Desnick et al., siehe oben) eine intravenöse Injektion von gereinigtem Enzym zu einer vorübergehenden Verringerung der Mengen des im Plasma gespeicherten Lipidsubstrates, Globotriasylceramid.
Bisher wurde die biochemische und klinische Wirksamkeit des Enzymaustausches bei der Fabry-Krankheit sowie bei anderen lysosomalen Speicherkrankheiten jedoch wegen des Mangels an ausreichendem humanem Enzym für adäquate Dosen und für eine Langzeitauswertung nicht demonstriert.
Folglich besteht auf diesem Gebiet ein Bedarf an Verfahren zur Bereitstellung ausreichender Mengen biologisch aktiver, lysosomaler Enzyme, wie humaner α-Galactosidase A in defizienten Zellen. Zusätzlich besteht ein Bedarf an neuen Vektorzusammensetzungen, die einen effizienten Transfer von Genen, die lysosomale Enzyme, wie α-Galactosidase A, codieren, in defiziente Zellen und gleichzeitig eine direkte Expression des transferierten Gens ermöglichen. Kürzlich wurde mit rekombinanten Ansätzen versucht, diesen Bedürfnissen zu begegnen, siehe z. B. US-Pat., Nr. 5,658,567, erteilt am 19. August 1997, mit dem Titel: „Recombinant alpha-galactosidase A therapy for Fabry disease"; US-Pat. Nr. 5,580,757, erteilt am 3. Dezember 1996, mit dem Titel: „Cloning and Expression of Biologically Active alpha-galactosidase A as a Fusion Protein"; Bishop, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA. 83:4859-4863, (1986); Medin, J. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA. 93:7917-7922, (1996); Novo, F. J., Gene Therapy. 4:488-492, (1997); Ohshima, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA. 94:2540-2544, (1997), und Sugimoto Y. et al., Human Gene Therapy. 6:905-915, (1995). Zusätzlich wurde in der zugelassenen US-Patentanmeldung Serial No. 08/466,597, die am 6. Juni 1995 eingereicht wurde, gezeigt, dass retrovirale Expressionsvektoren, die ein für humane β-Glucocerebrosidase codierendes Gen enthalten, autologe, hämatopoietische Stammzellen infizieren, die, wenn sie in einen Gaucher-Patienten zurücktransplantiert wurden, dem Patienten eine anhaltende Produktion von biologisch aktivem Enzym bereitstellten.
Bisher hat sich jedoch keine Vektorzusammensetzung als fähig erwiesen, die Expression des humanen α-Galactosidase A-Gens oder der meisten anderen Gene, die für lysosomale Enzyme codieren, in Zellen, denen dieses fehlt, zu transduzieren und aufrecht zu erhalten. Die vorliegende Erfindung erfüllt diese Anforderungen und bietet auch damit zusammenhängende Vorteile.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt daher rekombinante virale und nicht-virale Vektoren bereit, die ein Transgen umfassen, das ein biologisch aktives humanes lysosomales Enzym codiert, und zum Infizieren und/oder Transfizieren und zum Aufrechterhalten der Expression des biologisch aktiven humanen lysosomalen Enzym-Transgens in Säugetierzellen, denen dieses fehlt, in der Lage sind. Insbesondere sieht die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Vektors vor, der ausgewählt ist aus der Gruppe Adenoviren, Adeno-assoziierte Viren (AAV), Vacciniaviren, Herpesviren, Bakteriophagen, Cosmide, Pilzvektoren, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer lysosomalen Speicherkrankheit, wobei die lysosomale Speicherkrankheit die Gaucher-Krankheit ist, wobei der Vektor ein Transgen umfasst und exprimiert, welches für eine biologisch aktive humane β-Glucosidase codiert, der Vektor in vivo von den Zielzellen aufgenommen wird, das Transgen darin exprimiert wird und das biologisch aktive Enzym in vivo produziert wird.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Bereitstellung eines biologisch aktiven, humanen lysosomalen Enzyms an Zellen, denen dieses fehlt, bereit, wobei das Verfahren umfasst: das Einbringen eines Vektors, der ein für das biologisch aktive, humane lysosomale Enzym codierendes Transgen umfasst und exprimiert, in die Zellen, wobei der Vektor von den Zellen aufgenommen wird, das Transgen exprimiert wird und das biologisch aktive Enzym produziert wird. Die Zellen können mit dem Vektor infiziert und/oder transfiziert werden, abhängig davon, ob der Vektor ein viraler Vektor und/oder ein virales Plasmid oder dergleichen ist.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform sieht die vorliegende Erfindung die anhaltende Produktion biologisch aktiver humaner α-Galactosidase A in Zellen von Fabry-Individuen vor, denen dieses Enzym fehlt.
Unter noch einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung auch ein Verfahren zur Bereitstellung eines biologisch aktiven, humanen lysosomalen Enzyms an andere entfernte Zellen, denen dieses fehlt, bereit, wobei die transfizierten und/oder infizierten Zellen, die den Vektor beherbergen, das biologisch aktive Enzym ausscheiden, das dann von den anderen defizienten Zellen aufgenommen wird. Insbesondere handelt es sich bei dem Enzym um humane β-Glucosidase und bei den Zellen um die eines Gaucher-Individuums.
Gemäß noch einem weiteren Aspekt wird das biologisch aktive Enzym, β-Glucosidase, in den Kreislauf eines Individuums (z. B. eines Gaucher-Individuums) abgeschieden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch einen rekombinanten, E1-deletierten adenoviralen Vektor und einen rekombinanten Plasmid-Expressionsvektor bereit, die beide ein für β-Glucosidase codierendes Transgen umfassen und exprimieren.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Bereitstellung biologisch aktiver, humaner β-Glucosidase an die Zellen eines Individuums mit der Gaucher-Krankheit bereit, bei dem in die Zellen eines Gaucher-Individuums eine Menge eines Vektors gemäß der vorliegenden Erfindung eingebracht wird, die zum Infizieren und zum Aufrechterhalten der Expression des biologisch aktiven, humanen β-Glucosidase-Transgens in Zellen, denen dieses fehlt, wirksam ist.
Ferner stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bereitstellung biologisch aktiver, humaner β-Glucosidase an die Zellen eines Individuums mit der Gaucher-Krankheit bereit, bei dem in die Zelle eines Gaucher-Individuums eine Menge des Vektors der Erfindung eingebracht wird, die zum Transfizieren und Aufrechterhalten der Expression biologisch aktiver, humaner β-Glucosidase in Zellen, denen sie fehlt, wirksam ist.
Andere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden detaillierten Beschreibung sowie aus den Ansprüchen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt den Plasmidexpressionsvektor pCFA-hAGA.
2 zeigt den Adenovirusexpressionsvektor Ad2/CEHα-gal.
3 zeigt die Aufnahme von α-Galactosidase A, die von Ad2/CEHα-gal produziert wird, in Fabry-Zellen. 3A zeigt die Aufnahme von α-Galactosidase A, die in Ad2/CEHα-gal-infizierten Fibroblasten (GMO2775) exprimiert wird. 3B zeigt die Aufnahme von α-Galactosidase A, die in Ad2/CEHα-gal-infizierten Skelettmuskelzellen (SkMC) exprimiert wird.
4 zeigt die Gewebeverteilung von α-Galactosidase A in normalen Mäusen gegenüber Fabry-Knockout-Mäusen.
5 zeigt die Gewebeverteilung von α-Galactosidase A nach intranasaler, intravenöser und intramuskulärer Verabreichung von Plasmid.
6 zeigt die Gewebeverteilung von α-Galactosidase A nach Verabreichung des Ad2/CEHα-gal/CEHα-gal-Vektors an Fabry-Knockout-Mäuse. 6A zeigt die Verteilung nach viraler Injektion in die Schwanzvene weiblicher Fabry-Knockout-Mäuse.
6B zeigt die Verteilung nach viraler Injektion in die rechte Quadrizeps-Muskelgruppe weiblicher Fabry-Mäuse.
7 zeigt einen zeitlichen Verlauf der α-Galactosidase A-Expression nach intravenöser Injektion von Ad2/CEHα-gal in C57BL/6n-Mäuse. 7A zeigt zeitabhängig die Expression von α-Galactosidase A. 7B zeigt die Persistenz von α-Galactosidase A, bezogen auf Tag 3.
8 zeigt α-Galactosidase A-Mengen in Ganzblut nach intravenöser Injektion von Ad2/CEHα-gal in C57BL/6n- und BALB/c(nu/nu)-Mäuse. 8A zeigt zeitabhängig die Expression von α-Galactosidase A. 8B zeigt die Persistenz von α-Galactosidase A, bezogen auf Tag 3.
9 zeigt α-Galactosidase A-Mengen in Geweben von Fabry-Mäusen nach intravenöser Injektion einer niedrigen Dosis (1,65 x 10¹⁰ Partikel) von Ad2/CEHα-gal. 9A zeigt zeitabhängig die Expression von α-Galactosidase A. 9B zeigt die Persistenz von α-Galactosidase A, bezogen auf Tag 3.
10 zeigt α-Galactosidase A-Mengen in Geweben von Fabry-Mäusen nach intravenöser Injektion einer hohen Dosis (1,65 × 10¹¹ Partikel) von Ad2/CEHα-gal. 10A zeigt zeitabhängig die Expression von α-Galactosidase A. 10B zeigt die Persistenz von α-Galactosidase A, bezogen auf Tag, 3.
11 zeigt zeitabhängig die GL3-Mengen in Fabry-Maus-Gewebe nach intravenöser Injektion hoher und niedriger Dosen von Ad2/CEHα-gal.
12 zeigt den Effekt von DSG auf die α-Galactosidase A-Mengen in Mäusen nach wiederholter Verabreichung eines Adenovirus-Vektors.
13 zeigt den Effekt von DSG auf die Anti-Adenovirus-Antikörpermengen in Mäusen nach wiederholter Verabreichung eines Adenovirus-Vektors.
14 zeigt den Effekt eines gegen CD154 gerichteten MR1-Antikörpers auf die α-Galactosidase A-Mengen in Mäusegeweben nach wiederholter Verabreichung eines Adenovirus-Vektors.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt rekombinante virale und nicht-virale Vektoren mit einem für ein biologisch aktives, humanes lysosomales Enzym codierenden Transgen bereit, die zum Infizieren und/oder Transfizieren und Aufrechterhalten der Expression des biologisch aktiven, humanen lysosomalen Enzym-Transgens in Säugetierzellen, denen dieses fehlt, befähigt sind. Insbesondere sieht die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Vektors vor, der ausgewählt ist aus der Gruppe Adenoviren, Adeno-assoziierte Viren (AAV), Vacciniaviren, Herpesviren, Bakteriophagen, Cosmide, Pilzvektoren, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer lysosomalen Speicherkrankheit, wobei die lysosomale Speicherkrankheit die Gaucher-Krankheit ist, wobei der Vektor ein Transgen umfasst und exprimiert, welches für eine biologisch aktive humane β-Glucosidase codiert, der Vektor in vivo von den Zielzellen aufgenommen wird, das Transgen darin exprimiert wird und das biologisch aktive Enzym in vivo produziert wird.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zum Bereitstellen eines biologisch aktiven, humanen lysosomalen Enzyms an Zellen, denen dieses fehlt, bereit, wobei das Verfahren umfaßt: das Einführen eines Vektors, der ein Transgen umfaßt und exprimiert, welches für das biologisch aktive, humane lysosomale Enzym codiert, in die Zellen, wobei der Vektor von den Zellen aufgenommen, das Transgen exprimiert und das biologische aktive Enzym produziert wird. Die Zellen können mit dem Vektor infiziert und/oder transfiziert werden, je nachdem, ob der Vektor ein viraler Vektor und/oder ein Plasmid oder dergleichen ist.
Gemäß noch einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Abgabe eines biologisch aktiven, humanen lysosomalen Enzyms an andere, entfernt liegende Zellen, denen dieses Enzym fehlt, bereit, wobei die transfizierten und/oder infizierten Zellen, die den Vektor beherbergen, das biologisch aktive Enzym ausscheiden, das dann von den anderen defizienten Zellen aufgenommen wird.
Zu Vektoren, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, gehören Viren, wie Adenoviren, Adeno-assoziierte Viren (AAV), Vacciniaviren, Herpesviren, Bakteriophagen, Cosmide, Plasmide, Pilzvektoren und andere Rekombinationsträger, die typischerweise im Stand der Technik verwendet werden, deren Expression in verschiedenen eukaryontischen und prokaryontischen. Wirten beschrieben wurde und die zur Gentherapie sowie zur einfachen Proteinexpression verwendet werden können.
Polynukleotide/Transgene werden mittels dem Fachmann hinlänglich bekannter Verfahren in Vektorgenome eingesetzt. Transgene sind hier als Nukleinsäuremoleküle oder Strukturgene definiert, die für ein bestimmtes Protein codieren – bei der vorliegenden Erfindung sind dies ein humanes lysosomales Enzym und für diese Enzyme codierende Nukleinsäuren. Repräsentative lysosomale Enzyme gemäß der vorliegenden Erfindung sind in der obigen Tabelle I angegeben. Bezugnahmen auf die Isolierung und Charakterisierung der lysosomalen Enzyme in Tabelle I finden sich in Scriver et al., The Metabolic Basis of Inherited Disease, 7. Aufl., Bd. II, S. 2427-2879, McGraw Hill (1995).
Beispielsweise können zum Einsetzen des Transgens in den Vektor das Transgen und die Vektornukleinsäure unter geeigneten Bedingungen mit einem Restriktions-Enzym in Kontakt gebracht werden, um an jedem Molekül komplementäre Enden zu erzeugen, die sich miteinander paaren und durch eine Ligase miteinander verbunden werden können. Alternativ können synthetische Nukleinsäure-Linker an die Enden des restringierten Polynukleotids ligiert werden. Diese synthetischen Linker enthalten Nukleinsäuresequenzen, die einer bestimmten Restriktionsstelle in der Vektornukleinsäure entsprechen. Zusätzlich kann ein Oligonukleotid, das ein Terminationscodon und eine entsprechende Restriktionsstelle enthält, zum Einsetzen in einen Vektor ligiert werden, der z. B. alle oder einige der folgenden enthält: ein selektierbares Markergen, wie z. B. das Neomycin-Gen zur Selektierung stabiler oder transienter Transfektanten in Säugetierzellen; Enhancer-/Promotor-Sequenzen aus dem Immediate Early-Gen von humanem CMV für hohe Transkriptionslevel; Transkriptionsterminierungs- und RNA-Verarbeitungssignale aus SV40 für mRNA-Stabilität; SV40-Polyom-Replikationsursprünge und ColE1 zur geeigneten episomalen Replikation; vielseitige multiple Klonierungsstellen, sowie T7- und SP6 RNA-Promotoren zur in vitro-Transkription von Sense- und Antisense-RNA. Andere Möglichkeiten sind dem Fachmann hinlänglich bekannt und verfügbar.
So wie er hier verwendet wird, bezieht sich der Begriff „Expression" auf den Prozess, durch den Polynukleotide/Transgene zu RNA transkribiert und dann in Peptide, Polypeptide oder Proteine translatiert werden. Wenn das Polynukleotid von genomischer DNA abgeleitet ist, kann die Expression das Splicing der mRNA umfassen, falls ein entsprechender eukaryontischer Wirt ausgewählt ist. Regulierende Emente, die zur Expression benötigt werden, umfassen Promotorsequenzen zum Binden von RNA-Polymerase und Transkriptionsinitiationssequenzen für die Ribosombindung. Beispielsweise umfasst ein bakterieller Expressionsvektor einen Promotor, wie den lac-Promotor, und zur Transkriptionsinitiation die Shine-Dalgarno-Sequenz sowie das Start-Codon AUG (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2d Ed. (Cold Spring Harbor, NY, 1989) oder Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Greene, Assoc., Wiley Interscience, NY, NY, 1995). Gleichermaßen umfasst ein eukaryontischer Expressionsvektor, sei es ein Virus oder ein Plasmid, einen heterologen oder homologen Promotor für RNA-Polymerase II, ein stromabwärtiges Polyadenylierungssignal, das Startcodon AUG und ein Terminationscodon zum Abtrennen des Ribosoms. Diese Vektoren sind kommerziell erhältlich oder können aus den Sequenzen zusammengesetzt werden, die in dem Fachmann hinlänglich bekannten Verfahren beschrieben sind, beispielsweise den oben beschriebenen Verfahren zum Konstruieren von Vektoren im allgemeinen. Expressionsvektoren sind nützlich zum Produzieren von Zellen, die das Protein exprimieren, das durch das Polynukleotid/Transgen codiert wird.
Präparate des Transgens, das für ein humanes lysosomales Enzym, z. B. α-Galactosidase A, codiert, können in einem geeigneten Vektor zur Abgabe in die Zellen eines Individuums, z. B. eines Fabry-Individuums, mit dem Fachmann bekannten Verfahren aufgenommen werden, siehe z. B. Finkel und Epstein, FASEB J. 9:843-851 (1995); Feldman und Steg, Cardiovascular Res. 32:194-207 (1996).
Blanke Nukleinsäure-blanke Plasmid-DNA kann beispielsweise durch direkte Injektion in das Gewebe in Muskelzellen eingebracht werden (Wolff et al., Science 247:1465 (1989)).
Nukleinsäure-Lipidkomplexe-Lipidträger können mit nackten Nukleinsäuren (z. B. Plasmid-DNA) assoziiert werden, um das Hindurchtreten durch Zellmembranen zu erleichtern. Zu diesem Zweck können kationische, anionische oder neutrale Lipide verwendet werden. Kationische Lipide sind jedoch bevorzugt, da gezeigt wurde, dass sie besser mit DNA assoziieren, die im allgemeinen eine negative Ladung aufweist. Ebenso wurde gezeigt, dass kationische Lipide die intrazelluläre Abgabe von Plasmid-DNA vermitteln (Felgner und Ringold, Nature 337:387 (1989)). Wie gezeigt wurde, führt die intravenöse Injektion kationischer Lipid-Plasmid-Komplexe in Mäuse zur Expression der DNA in der Lunge (Brigham et al., Am. J. Med. Sci. 298:278 (1989)), siehe auch Osaka et al., J. Pharm. Sci. 85(6):612-618 (1996); San et al., Human Gene Therapy 4:781-788 (1993); Senior et al., Biochemica et Biophysica Acta 1070:173-179 (1991); Kabanov und Kabanov, Bioconjugate Chem. 6:7-20 (1995); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Behr, J-P., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Behr et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 86:6982-6986 (1989), und Wyman et al., Biochem. 36:3008-3017 (1997).
Kationische Lipide sind dem Durchschnittsfachmann bekannt. Zu repräsentativen kationischen Lipiden gehören diejenigen, welche z. B. in US-Pat. Nr. 5,283,185 und beispielsweise in US-Patent Nr. 5,767,099 beschrieben sind. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das kationische Lipid N⁴-Spermincholesterylcarbamat (GL-67), das in US-Patent Nr. 5,767,099 beschrieben ist. Zusätzliche bevorzugte Lipide umfassen N⁴-Spermidincholesterylcarbamat (GL-53) und 1-(N⁴-Spermin)-2,3-dilaurylglycerincarbamat (GL-89).
Adenovirus-Adenovirus-basierte Vektoren zur Abgabe von Transgenen sind dem Fachmann hinlänglich bekannt und kommerziell erhältlich oder können mittels üblicher molekularbiologischer Verfahren konstruiert werden. Rekombinante adenovirale Vektoren, die exogene Transfer-Gene enthalten, sind meist von Adenovirus Typ 2 (Ad2) und Adenovirus Typ 5 (Ad5) abgeleitet. Sie können auch von anderen nicht-onkogenen Serotypen abgeleitet sein, siehe z. B. Horowitz, „Adenoviridae and their Replication" in VIROLOGY, 2. Aufl., Fields et al. (Hrsg.), Raven Press Ltd., New York, 1990.
Die adenoviralen Vektoren der vorliegenden Erfindung sind nicht replikationsfähig, weisen eine minimale virale Genexpression auf und sind in der Lage, ein Transgen in Zielzellen zu exprimieren. Adenovirale Vektoren werden im allgemeinen durch Deletion der Gene der E1-Region replikationsunfähig gemacht. Die replikationsunfähigen Vektoren können in der 293-Zelllinie (ATCC CRL 1573), einer humanen, embryonalen Nierenzelllinie exprimiert werden, die E1-Funktionen exprimiert. Die deletierte E1-Region kann durch das interessierende Transgen, von einem adenoviralen oder nicht-adenoviralen Promotor gesteuert, ersetzt werden. Das Transgen kann auch in anderen Regionen des Adenovirusgenoms angeordnet werden, siehe Graham et al., "Adenovirus-based Expression Vectors and Recombinant Vaccines" in VACCINES: NEW APPROACHES to IMMUNOLOGICAL PROBLEMS, S. 363-390, Ellis, Hrsg., Butterworth-Heinemann, Boston, (1992), für eine Besprechung der Produktion replikationsunfähiger, adenoviraler Vektoren.
Dem Fachmann ist auch bekannt, dass andere nicht-essenzielle Regionen des Adenovirus innerhalb des viralen Genoms deletiert oder umgestellt werden können, um einen adenoviralen Vektor bereitzustellen, der zur Abgabe eines Transgens gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet ist. Beispielsweise beschreibt das US-Patent Nr. 5,670,488, dass manche oder alle der E1- und E3-Regionen deletiert werden können, und nicht-essenzielle, offene Leserahmen (ORFs) von E4, die nicht für die Viruspropagation in vitro benötigt werden, ebenfalls deletiert werden können. Andere repräsentative adenovirale Vektoren sind z. B. von Rich et al., Human Gene Therapy 4:461 (1993); Brody et al., Ann. NY Acad. Sci. 716:90 (1994); Wilson, N. Eng. J Med 334:1185 (1996); Crystal, Science 270:404 (1995); O'Neal et al., Hum. Mol. Genet. 3:1497 (1994), und Graham et al., wie oben, beschrieben. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der adenovirale Vektor ein E1-deletierter, Ad2-basierter Vektor, wie er z. B. in US-Patent Nr. 5,670,488 beschrieben ist. Andere adenovirale Vektoren, die verwendet werden können, umfassen diejenigen, die entwickelt wurden, um die Erzeugung replikationskompetenter Adenoviren in vivo zu verhindern (US-Patent Nr. 5,707,618). Zudem kommen Pseudoadenovirus-Vektoren (PAV), die bezüglich früher und später Gene deletiert sind und wie sie das US-Patent Nr. 5,670,488 beschreibt, hier ebenfalls zur Verwendung in Frage.
Gemäß obiger Definition ist ein Transgen, so wie es hier verwendet wird, eine Nukleinsäure oder ein Strukturgen, das für ein humanes lysosomales Enzym codiert. Ferner ist das Transgen gegenüber dem Adenovirus fremd oder nicht-nativ. In Frage kommt jede Nukleinsäure, die für ein humanes lysosomales Enzym codiert und in den adenoviralen Vektor transkribiert werden kann. Bei einer Ausführungsform, die nicht Teil der beanspruchten Erfindung ist, codiert das Transgen ein biologisch aktives oder funktionales α-Galactosidase A-Protein. Ein biologisch aktives oder funktionales Protein oder Peptid ist ein Protein oder Peptid, das den Zellmechanismus einer Zelle, in der es exprimiert wird, oder die Funktion eines Gewebes oder Organismus beeinflusst. Im Fall von α-Galactosidase A spaltet das Enzym das Lipidsubstrat Globotriasylceramid (Galactosyl-Galactosyl-Glucosyl-Ceramid) oder GL3 ab.
In den adenoviralen Vektoren der vorliegenden Erfindung ist das Transgen mit Expressionssteuerungssequenzen, z. B. einem Promotor, der die Expression des Transgens steuert, operabel verknüpft. So wie er hier verwendet wird, bezieht sich der Begriff „operabel verknüpft" auf die funktionale Beziehung eines Polynukleotids/Transgens zu Regulator- und Effektorsequenzen von Nukleotiden, wie Promotoren, Enhancern, Transkriptions- und Translationsstoppstellen und anderen Signalsequenzen. Beispielsweise bezieht sich eine operable Verknüpfung einer Nukleinsäure mit einem Promotor auf die physikalische und funktionale Beziehung zwischen dem Polynukleotid und dem Promotor, so dass die Transkription von DNA vom Promotor durch eine RNA-Polymerase initiiert wird, die den Promotor spezifisch erkennt und spezifisch an diesen bindet, wobei der Promotor die Transkription von RNA aus dem Polynukleotid steuert.
Promotorregionen umfassen spezifische Sequenzen, die zur RNA-Polymerase-Erkennung, -Bindung und -Transkriptionsinitiation ausreichen. Zusätzlich umfassen Promotorregionen Sequenzen, welche die Erkennungs-, Bindungs- und Transkriptionsinitiations-Aktivität von RNA-Polymerase modulieren. Diese Sequenzen können cis-agierend sein oder auf trans-agierende Faktoren ansprechen. Je nach Art der Regulierung können Promotoren konstitutiv oder reguliert sein. Beispiele für Promotoren sind SP6, T4, T7, der SV40-Early- Promotor, der Cytomegalovirus (CMV)-Promotor, der steroid-induzierbare Maus-Mammartumor-Virus (MMTV)-Promotor, der Moloney-Mausleukämie-Virus (MMLV)-Promotor, der Phosphoglyceratkinase (PGK)-Promotor und dergleichen. Alternativ dazu kann der Promotor ein endogener Adenovirus-Promotor, z. B. der E1a-Promotor oder der Ad2 Major Late-Promotor (MLP), sein. Gleichermaßen kann der Durchschnittsfachmann adenovirale Vektoren konstruieren, indem er endogene oder heterologe Poly A-Additionssignale verwendet. Insbesondere ist die Verwendung eines CMV-Promotors/-Transgens zusammen mit einer Adenovirus E4-Region, vorzugsweise ORF3, bevorzugt, bei der sich zeigte, wie dies in der am 14. April 1998 angemeldeten und hier durch Bezugnahme aufgenommenen PCT/US98/07841 beschrieben ist, dass sie eine erhöhte Persistenz der Transgenexpression ergab. Zudem kommen auch E1-deletierte, teilweise E3-deletierte Vektoren in Frage, die in der Lage sind, eine anhaltende Expression eines Transgens bereit zu stellen, wie dies in der am 14. April 1998 angemeldeten PCT/US98/07840 beschrieben ist.
Andere virale Vektoren zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung umfassen Vektoren, die von Vacciniaviren, Herpesviren, AAV und Retroviren abgeleitet sind. Insbesondere sind Herpesviren, speziell Herpes simplex-Viren (HSV), wie sie im US-Patent Nr. 5,672,344 beschrieben sind, besonders nützlich zur Abgabe eines Transgens an eine neuronale Zelle, was für diejenigen lysosomalen Speicherkrankheiten von Bedeutung ist, bei denen sich der enzymatische Defekt in neuronalen Zellen manifestiert, wie z. B. die Hurler-, die Hunter- und die Tay-Sach-Krankheit.
AAV-Vektoren, wie sie in den US-Patenten Nr. 5,139,941, 5,252,479 und 5,753,500 sowie in der PCT-Veröffentlichung WO 97/09441 beschrieben sind, sind ebenfalls geeignet, da diese Vektoren sich in Wirtschromosen mit einem minimalen Bedarf an wiederholter Verabreichung eines Vektors integrieren.
Retroviren können bei der vorliegenden Erfindung ebenfalls zum Einsatz kommen, insbesondere zur Transgenabgabe an Zellen, die aus einem Individuum entnommen, ex vivo infiziert und dem Individuum zur Produktion eines biologisch aktiven Enzyms wieder verabreicht werden können.
Die viralen und nicht-viralen Vektoren der vorliegenden Erfindung sind zum Transferieren eines für ein lysosomales Enzym codierenden Transgens in eine Zielzelle geeignet. Die Zielzelle kann in vitro oder in vivo vorliegen. Die Verwendung erfindungsgemäßer Vektoren in vitro ermöglicht den Transfer eines Transgens in eine kultivierte Zelle und ist für die rekombinante Produktion des Transgenproduktes geeignet. Die Verwendung erfindungsgemäßer Vektoren zur Abgabe eines Transgens in eine Zelle in vivo ist dazu geeignet, ein biologisch aktives Enzym Zellen, denen dieses fehlt – bei der Gaucher-Krankheit beispielsweise einer Zelle, in der β-Glucosidase fehlt, unzureichend vorhanden oder nicht-funktional ist – bereit zu stellen.
Die erfindungsgemäßen Vektoren können durch Verknüpfung eines Targeting-Moleküls mit dem Vektor gegen spezifische Zellen gerichtet werden. Ein Targeting-Molekül ist ein Agens, das für einen interessierenden Zell- oder Gewebetyp spezifisch ist, wie z. B. ein Ligand, Antikörper, Zucker, Rezeptor oder anderes Bindungsmolekül. Die Fähigkeit zielgerichteter Vektoren macht die erfindungsgemäßen Vektoren besonders brauchbar für die Behandlung lysosomaler Speicherstörungen. Beispielsweise kann die Aufnahme eines Targeting-Moleküls, wie VEGF oder eines Antikörpers gegen einen VEGF-Rezeptor, ein Targeting vaskulärer Endothelzellen von Individuen mit der Gaucher-Krankheit ergeben.
Zusätzlich ergeben virale Vektoren, insbesondere adenovirale Vektoren, die mit einem kationischen Amphiphil, wie z. B. dem oben beschriebenen kationischen Lipid Poly-L-Lysin (PLL) und Diethylaminoethyldextran (DEAE-Dextran), komplexiert wurden, eine erhöhte Ineffizienz der viralen Infektion von Zielzellen (siehe z. B. die PCT/US97/21496, eingereicht am 20. November 1997).
Besonders bevorzugt sind mit DEAE-Dextran komplexierte adenovirale Vektoren. Zusätzlich können Adenoviren und andere virale Vektoren, da die wiederholte Verabreichung eines viralen Vektors zu einer Immunreaktion gegen den Vektor führen kann, die dessen Wirksamkeit zur Abgabe des Gens an betroffene Zellen, Adenoviren und andere virale Vektoren, einschränkt, polymermodifiziert, z. B. mit Polyethylenglykol (PEG) komplexiert werden, um die virale Immunogenität zu verringern und eine wiederholte Verabreichung des Vektors zuzulassen (siehe z. B. die PCT/US98/06609, eingereicht am 3. April 1998). Alternativ dazu kann der Vektor mit einem immunsuppressiven Agens verabreicht werden, um die Immunreaktion auf wiederholte Vektorverabreichung zu vermindern. Zusätzlich können Kombinationen der obigen Ansätze angewandt werden.
Der Transfer des Transgens in die Zielzellen mittels erfindungsgemäßer Vektoren kann durch Bestimmung der Menge des Transgenproduktes (biologisch aktives Enzym) in der Zielzelle bewertet werden. Die Menge des Transgenproduktes in der Zielzelle korreliert direkt mit der Wirksamkeit des Transfers des Transgens durch erfindungsgemäße Vektoren. Zur Bestimmung der Enzymmengen kann jedes dem Fachmann bekannte Verfahren, z. B. ELISA, Radioimmun-Assays, Assays unter Verwendung von fluoreszierenden und chemilumineszenten Enzymsubstraten, verwendet werden.
Die Expression des Transgens kann mittels verschiedener dem Fachmann bekannter Verfahren, einschließlich u. a. immunologischer Assays, histochemischer Assays und Aktivitäts-Assays, überwacht werden. Immunologische Prozeduren, die zur in vitro-Detektion des Transgenproduktes in einer Probe geeignet sind, umfassen Immunassays, die einen detektierbaren Antikörper einsetzen. Zu solchen Immunassays gehören z. B: ELISA, der mikrofluorimetrische Pandex-Assay, Agglutinationsassays, Durchflusscytometrie, Serumdiagnose-Assays und immunhistochemische Färbeverfahren, die dem Fachmann hinlänglich bekannt sind. Ein Antikörper kann durch verschiedene, dem Fachmann hinlänglich bekannte Mittel detektierbar gemacht werden. Beispielsweise kann ein detektierbarer Marker direkt oder indirekt an den Antikörper gebunden werden. Zu geeigneten Markern zählen z. B. Radionuklide, Enzyme, Fluorogene, Chromogene und chemilumineszente Markierungen.
Für in vivo-Abbildungsverfahren kann einem Probanden ein detektierbarer Antikörper verabreicht und die Bindung des Antikörpers an das Transgenprodukt mittels dem Fachmann hinlänglich bekannter Abbildungstechniken detektiert werden. Geeignete Abbildungsmittel sind bekannt und umfassen z. B. Gamma-emittierende Radionuklide, wie ¹¹¹In, 99mTC, ⁵¹Cr und dergleichen, sowie paramagnetische Metallionen, die im US-Patent Nr. 4,647,447 beschrieben sind. Die Radionuklide ermöglichen die Abbildung von Geweben mittels Gammaszintillationsphotometrie, Positronemissionstomographie, Einzelphotonenemssions-Computertomographie und Gamma-Kamera-Ganzkörperabbildung, während paramagnetische Metallionen eine Visualisierung mittels Magnetresonanzabbildung gestatten.
Die vorliegende Erfindung wird unter Verwendung von Vektoren beispielhaft veranschaulicht, die ein α-Galactosidase A-Transgen zur Abgabe von biologisch aktiver α-Galactosidase A an Zellen und Gewebe von Individuen mit der Fabry-Krankheit umfassen. Die Wirksamkeit dieses Ansatzes wurde mit einem Mäusemodellsystem, z. B. einer Fabry-Knockout-Maus, gezeigt. Dabei wird aktive, humane α-Galactosidase A den Zellen eines Individuums mit der Fabry-Krankheit bereitgestellt, indem in ein Fabry-Individuum eine Menge der erfindungsgemäßen Vektoren eingebracht wird, die eine Infektion und/oder Transfektion und ein Andauern der Expression des biologisch aktiven humanen α-gal A-Gens in Zellen bewirkt, denen dieses fehlt. Die erfindungsgemäßen Vektoren können an die Zielzellen in einer geeigneten Zusammensetzung, entweder alleine oder komplexiert, wie oben vorgesehen, umfassend den Vektor und einen geeigneten akzeptablen Träger, abgegeben werden. Plasmidvektoren sind vorzugsweise mit einem kationischen Lipid, wie GL67, komplexiert. Adenovirale Vektoren sind vorzugsweise mit DEAE-Dextran komplexiert. Der Vektor kann an die Zielzellen mittels dem Fachmann bekannter Verfahren, beispielsweise intravenös, intramuskulär, intranasal, subkutan, mittels Intubation, Lavage und dergleichen, abgegeben werden.
Der Begriff „für α-Galactosidase A codierendes Transgen" umfaßt eine Nukleinsäure (DNA) oder ein Strukturgen, die/das für α-Galactosidase A codiert und, wenn sie/es in defizienten Zellen eines Fabry-Individuums exprimiert wird, deren α-Galactosidase A-Defizienz lindert.
So wie er hier verwendet wird, bezieht sich der Begriff „wirksame Menge" auf eine Menge, welche die Defizienz durch die Produktion biologisch aktiver α-Galactosidase A in den Zellen eines Fabry-Individuums lindert. Die Produktion biologisch aktiver α-Galactosidase A in Fabry-Individuen kann anhand der Linderung der mit der Fabry-Krankheit verbundenen Symptome bewertet werden. Die genaue wirksame Menge des beim Verfahren der vorliegenden Erfindung zu verwendenden Vektors läßt sich vom Durchschnittsfachmann beispielsweise unter Berücksichtigung individueller Unterschiede hinsichtlich Alter, Gewicht, Grad der Erkrankung und Zustand des Individuums bestimmen.
Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung sowohl virale als auch nicht-virale Ansätze zur Abgabe biologisch aktiver β-Glucosidase an Zellen von Individuen mit der Gaucher-Krankheit bereit. Ein rekombinanter adenoviraler Vektor (pAd2/CEHα-gal) und ein Plasmidexpressionsvektor (pCFA-hAGA), die humane α-Galactosidase A (α-gal) exprimieren, die Beispiele für die Erfindung und nicht Teil der beanspruchten Erfindung sind, wurden konstruiert. Eine humane Atemwegsepithel-Zelllinie, die mit diesen Vektoren entweder infiziert oder transfiziert war, exprimierte aktives Enzym in Mengen, die mehr als eine log-Einheit größer als endogene Mengen waren, wobei ein merklicher Anteil der Aktivität in das Medium ausgeschieden wurde. Es zeigte sich, dass die von infizierten Fibroblasten (GMO2775) oder infizierten primären, humanen Skelettmuskelzellen (SkMC) ausgeschiedene α-Galactosidase A von Fabry-Fibroblasten aufgenommen wird. Dies zeigt, dass das Enzym von Zellen ausgeschieden werden kann, die den Vektor in vivo aufgenommen haben, und dass das ausgeschiedene Enzym von nicht-transfizierten Zellen aufgenommen werden kann, wodurch der Gendefekt in einem großen Prozentsatz der Zellen im Körper korrigiert wird.
An Mäusen wurden Untersuchungen unter Verwendung von pCFA-hAGA durchgeführt, um die Wirksamkeit dreier potentieller Verabreichungswege – intranasale, intravenöse und intramuskuläre Verabreichung – zu vergleichen.
Eine intranasale Eintröpfelung von mit dem kationischen Lipid GL-67 komplexierter Plasmid-DNA in die Lunge führte zu einer geringen Expression (bis zu 1800 pg α-gal pro 100 mg Gewebe) in der Lunge. Eine intravenöse Verabreichung von mit dem Lipid GL-67 komplexierter DNA zeigte ebenfalls niedrige Expressionsniveaus in der Lunge (bis zu 700 pg pro 100 mg Gewebe). Eine intramuskuläre Injektion von Plasmid-DNA alleine in Abwesenheit von kationischem Lipid ergab niedrige Expressionsniveaus (bis zu 1200 pg pro 100 mg Gewebe) im Muskel nach Injektion. Unter Verwendung des Adenovirus-Vektors durchgeführte Versuche zeigen sehr hohe Aktivitätsniveaus in allen getesteten Geweben (bis zu 100 μg pro 100 mg Gewebe in der Leber, 10 μg pro 100 mg Gewebe in den meisten anderen Organen). Die Menge an Enzym, die in der Leber normaler Mäuse getestet wurde, betrug 400 ng pro 100 mg Gewebe. Die Gewebeproben der virusbehandelten Mäuse wurden mittels zweier unterschiedlicher Verfahren, einem Aktivitäts-Assay und einem ELISA-Assay, mit ähnlichen Ergebnissen getestet.
Zusätzlich wurde gezeigt, dass eine intravenöse Verabreichung viraler Vektoren an Fabry-Mäuse bei den behandelten Tieren in einer großen Vielzahl von Geweben zu einer Verringerung des akkumulierten GL3-Substrates führt. Es wurde gezeigt, dass normalerweise geringe Mengen lysosomaler Enzyme ausgeschieden werden und dass diese von entfernten Zellen über die Mannose-6-phosphat-Rezeptoren wieder eingefangen werden können. Tatsächlich zeigen die dargestellten Ergebnisse, dass α-Galactosidase A, die aus Überständen von Zellen, die mit viralen und nicht-viralen, für das Enzym codierenden Vektoren transfiziert waren, gesammelt wurde, von Fabry-Zellen aufgenommen werden konnte. Diese Ergebnisse legen ferner nahe, dass der Gentransfer von α-Galactosidase A zu einem entsprechenden Speicherorgan eine Umkehr des biochemischen Defektes und die Speicherung von GL3 in den betroffenen Geweben von Fabry-Patienten erleichtern kann.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht.
Die Beispiele sind nicht Teil der beanspruchten Erfindung.
Beispiel 1: Vektorkonstruktion
pCFA-hAGA
Dieser Plasmidexpressionsvektor nutzt den Cytomegalovirus-Immediate Early-Promotor zum Steuern der Expression der humanen α-Galactosidase A-cDNA. Ein Hybridintron wurde nach dem Promotor eingesetzt, um Spleiss-Stellen zum Verstärken der Expression bereit zu stellen. Das Polyadenylierungssignal wurde dem Rinderwachstumshormon-Gen entnommen. Das ColE1-Replikon von pUC wurde als Grundgerüst für die Replikation in E. coli verwendet. Das Kanamycin-Resistenzgen wurde dazu verwendet, eine Auswahl nach Plasmid-Aufrechterhaltung zu treffen. Die Konstruktion von pCFA-hAGA ist analog zur Konstruktion des ein CFTR-Transgen enthaltenden pCF1-Vektors, wie z. B. im US-Patent Nr. 5,783,565, beschrieben, dessen Offenbarung hier durch Bezugnahme aufgenommen ist. Im pCFA-hAGA-Vektor ist das CFTR-Transgen in pCF1 durch ein α-Galactosidase A-Transgen substituiert.
Ad2/CEHα-gal
Der E1-deletierte Adenovirusexpressionsvektor, der ein Virusgrundgerüst vom Ad2-Serotyp verwendet, wurde so konstruiert, wie dies im US-Patent Nr. 5,670,488, beschrieben ist, dessen Offenbarung hier durch Bezugnahme aufgenommen ist. Die E1-Region des Virusgenoms wurde deletiert, um Raum für eine Expressionskassette zu lassen. Das Deletieren der E1-Region macht das Virus zudem replikationsunfähig. Der Adenovirus E1a-Promotor wurde verwendet, um die Expression der humanen α-Galactosidase A-cDNA zu steuern. Das Hybridintron war nach dem Promotor enthalten. Das Polyadenylierungssignal wurde dem SV40-Virus entnommen. (2).
Beispiel 2: Aufnahme humaner α-Galactosidase A die von Ad2/CEHα-gal produziert wurde, in Fabry-Fibroblasten
Humane Primärzellen wurden mit Ad2/CEHα-gal in den folgenden MOIs infiziert (Fabry-Fibroblasten-Zelllinie GMO2775: 0, 2, 4, 6 und 8 μU α-gal/μg Protein; Skelettmuskel-Zelllinie SkMC: 0, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5 und 3 μU α-gal/μg Protein). Drei Tage nach der Infektion wurde konditioniertes Kulturmedium gesammelt und filtriert, um Viruspartikel zu entfernen. Filtriertes, konditioniertes Medium wurde nicht-infizierten Fabry-Fibroblasten (GMO2775) zugeführt. Nach fünfstündiger Inkubation wurde das Medium entfernt, und die Zellen wurden mit PBS gewaschen und in 0,5 ml Lysepuffer geerntet. Fibroblasten von normalen Spendern (GMO2770B) und von Fabry-Spendern, die keinem konditionierten Medium exponiert waren, wurden geerntet und als Kontrolle getestet. Zell-Lysate wurden mit dem fluoreszierenden Substrat 4-Methylumbelliferyl-α-D-galactopyranosid (4-mu-α-gal) getestet (3A und 3B). Die Assays zeigten, dass humane Primärzellen, die mit Ad2/CEHα-gal infiziert waren, biologisch aktive α-Galactosidase A ausschieden, die von Fabry-Fibroblasten aufgenommen wurde.
Beispiel 3: Gewebeverteilung von α-Galactosidase A in normalen Mäusen gegenüber Fabry-Knockout-Mäusen
Normale Mäuse (C57BL/6n) und Fabry-Knockout-Mäuse (bereitgestellt von Dr. Robert Desnick, Mount Sinai School of Medicine, New York, NY) wurden mit dem 4-mu-α-gal-Aktivitätsassy auf α-Galactosidase A-Mengen getestet. Zum Zeitpunkt der Sakrifizierung wurde eine Ganzkörperperfusion durchgeführt, und die Organe wurden geerntet und bei –80°C aufbewahrt. Die Gewebe wurden in Assaypuffer homogenisiert und durchliefen mehrere Frier- und Tau-Zyklen. Die Fabry-Mäuse zeigten im Vergleich zu normalen Mäusen in allen getesteten Organen deutlich verringerte α-Galactosidase A-Aktivitätsniveaus (4).
Beispiel 4: Gewebeverteilung von α-Galactosidase A nach intranasaler, intravenöser und intramuskulärer Verabreichung von pCFA-hAGA
pCFA-hAGA, komplexiert mit dem kationischen Lipid GL-67(N⁴-Spermincholesterylcarbamat), das z. B. im US-Patent Nr. 5,783,565, beschrieben ist, welches durch Bezugnahme hier aufgenommen ist, wurde C57BL/6n-Mäusen verabreicht. Die α-gal-Mengen in Gewebehomogenaten wurden mittels eines für humane α-Galactosidase spezifischen, Enzym-verknüpften Immunosorbens-Assay (ELISA) getestet. Intranasale Eintröpfelungen wurden mit 100 μl GL-67:DOPE (1:2):pCFA-hAGA-Komplex bei einem Lipid:DNA-Verhältnis von 0,6 mM:3,6 mM durchgeführt, siehe z. B. Internationale Veröffentlichung Nr. WO 96/18372 (Kationische Amphiphile und Plasmide zur intrazellulären Abgabe therapeutischer Moleküle, z. B. GL-67); Fasbender, A. J. et al., Am. J. Physiol. 269(1) Teil 1: L45-51 (1995); Zabner, J. et al., J. Biol. Chem. 270 (32):18997-19007 (1995). Die Tiere wurden 2 Tage nach Eintröpfelung sakrifiziert. Intravenöse Injektionen wurden mit 100 μl GL-67:DOPE:DMPE-PEG (1:2:0,005):pCFA-hAGA-Komplex bei einem Lipid:DNA-Verhältnis von 4 mM:4 mM in die Schwanzvene durchgeführt. Diese Tiere wurden 2 Tage nach Verabreichung sakrifiziert.
Intramuskuläre Injektionen von 100 μg blankem pCFA-hAGA in 50 μl wurden der rechten Quadrizeps-Muskelgruppe verabreicht. Diese Tiere wurden 5 Tage nach Verabreichung sakrifiziert. Enzym war in den Geweben detektierbar, die in erster Linie mit den gewählten Lipid/DNA-Formulierungen und Verabreichungswegen transfiziert wurden (5).
Beispiel 5: Gewebeverteilung von α-Galactosidase A in Fabry-Knockout-Mäusen nach Verabreichung von Ad2/CEHα-gal
Weiblichen Fabry-Knockout-Mäusen wurden Viren in einer Dosis von 5 × 10⁹ IU in 260 μl in die Schwanzvene injiziert. Die Mäuse wurden nach 3 Tagen sakrifiziert. Mittels ELISA wurden die α-Galactosidase A-Aktivitätsniveaus in verschiedenen Organen detektiert. Intravenöse Virus-Injektionen führten in allen getesteten Organen zu hohen α-Galactosidase A-Mengen (10- bis 100-fach). Aufgrund der breiten Verteilung der Enzym-Aktivität ist dies eine vielversprechende Therapie für die Fabry-Krankheit (6A).
Weiblicher Fabry-Knockout-Mäusen wurden Viren in einer Dosis von 9,5 × 10⁸ IU in 50 μl in die rechte Quadrizeps-Muskelgruppe injiziert. Diese Mäuse wurden nach 5 Tagen sakrifiziert. Mittels ELISA wurden die α-Galactosidase A- Mengen in verschiedenen Organen detektiert. Intramuskuläre Virus-Injektionen führten zu signifikanten Enzymmengen an der Injektionsstelle sowie moderaten Enzymmengen in Leber und Milz, was darauf hinweist, dass infizierte Zellen an der Injektionsstelle Enzym abschieden, das von Zellen in anderen Geweben aufgenommen wurde (6B).
Beispiel 6: Zeitlicher Verlauf der α-Galactosidase A-Expression nach intravenöser Injektion von Ad2/CEHα-gal in C57BL/6n-Mäuse
Das vorliegende Experiment zeigte, dass signifikante Mengen an aktivem Enzym noch einige Zeit nach Verabreichung des Vektors andauerten. C57BL/6n-Mäusen wurden Viren in die Schwanzvene injiziert. Die verabreichte Dosis betrug 5 × 10⁹ IU in einem Volumen von 260 μl. Die Organe wurden nach 3, 14 und 28 Tagen geerntet. Mittels ELISA wurden die α-Galactosidase A-Mengen in Gewebe-Homogenaten detektiert (7A und 7B). Bis zum 28. Tag waren die Enzymmengen gegenüber den Mengen des 3. Tages etwa um das 5 bis 10-Fache gefallen, wobei diese Mengen noch immer deutlich höher als die Wildtyp-Mengen waren.
Beispiel 7: α-Galactosidase A-Mengen in Ganzblut nach intravenöser Injektion von Ad2/CEHα-gal in C57BL/6n und BALB/c (nu/nu)-Mäuse
C57BL/6n- oder BALB/c (nu/nu)-Mäusen wurden Viren in die Schwanzvene injiziert. Die verabreichte Dosis betrug 5 × 10⁹ IU in einem Volumen von 260 μl. Blut wurde nach 3, 14 und 28 Tagen geerntet. Mittels ELISA wurden die α-Galactosidase A-Mengen in Ganzblut detektiert (8A und 8B). Das Vorliegen von α-Galactosidase A in Blut deutete auf eine Abscheidung von Enzym von Infektionsstellen in den Blutstrom hin. Die Enzymmengen waren nach 14 Tagen etwa um das 10-Fache gefallen. Das ähnliche Muster in nackten und normalen Mäusen legt nahe, dass diese Verringerung nicht durch eine Immunreaktion bedingt ist.
Beispiel 8: Kurzzeitiger zeitlicher Verlauf, der die Verringerung der GL3-Mengen in Fabry-Mäusen zeigt, denen Ad2/CEHα-gal intravenös verabreicht wurde
Weiblichen Fabry-Mäusen, die zwischen 3 und 8 Monate alt waren (n=12, für jede Gruppe), wurde eine hohe Dosis (1,65 × 10¹¹ Partikel) oder eine niedrige Dosis (1,65 × 10¹⁰) Ad2/CEHα-gal in 0,25 ml PBS/5% Saccharose über die Schwanzvene injiziert. Die Mäuse wurden 3, 7 oder 14 Tage nach der Injektion sakrifiziert (n=4 pro Zeitpunkt pro Dosis). Zwei naive weibliche Fabry-Mäuse (3 Monate und 8 Monate alt) wurden am 3. Tag als Referenz für die GL3-Mengen in unbehandelten Mäusen sakrifiziert. Zum Zeitpunkt der Sakrifizierung wurde eine Blutprobe entnommen, um die α-Galactosidase A-Aktivität zu bestimmen.
Nach der Sakrifizierung wurden die Tiere mit PBS perfundiert und verschiedene Organe entnommen. Die Organe wurden in zwei Teile geteilt, wobei mit dem einen die α-Galactosidase A-Aktivität über einen für humane α-Galactosidase A spezifischen ELISA getestet und der andere extrahiert und mit einem für GL3 spezifischen Assay vom Typ ELISA auf GL3 getestet wurde. Die Daten wurden wurden bezüglich des Gewichtes der Gewebeprobe normalisiert.
Der zeitliche Verlauf der α-Galactosidase A-Aktivität in Gewebeproben nach niedrig dosierter und nach hochdosierter Verabreichung von Ad2/CEHα-gal ist in den 9A bzw. 10A gezeigt. Das Anhalten der α-Galactosidase A-Aktivität, bezogen auf Tag 3, ist für jede Dosis in den 9B bzw. 10B gezeigt. Diese Studie zeigte, daß die hohe Dosis des Vektors in allen getesteten Geweben gegenüber naiven Mäusen zu einem vielfachen Anstieg der α-Galactosidase A-Aktivität führte, der bis zu 14 Tage lang anhielt. Bei der niedrigeren Dosis gab es einen mäßigen Anstieg der α-Galactosidase A-Aktivität.
Mit dem Anstieg der α-Galactosidase A-Mengen in den getesten Geweben ging eine signifikante Abnahme der GL3-Mengen in allen Geweben bei den hohen Vektordosen einher (11). Es wird davon ausgegangen, dass die geringere Abnahme der GL3-Mengen auf die niedrige Dosis des Vektors hin ein auf dem Alter der getesteten Tiere beruhendes Artefakt ist. Für die Studien bei niedriger Dosis wurden jüngere Mäuse verwendet, die niedrigere Mengen an gespeichertem GL3 aufweisen als ältere Mäuse. Beispielsweise zeigten Studien an der Mount Sinai School of Medicine in New York, dass Fabry-Mäuse GL3 mit der Zeit in ihren Geweben akkumulieren. Nach 3 Monaten sind die GL3-Mengen deutlich über Normal, wobei sie in 5 Monate alten Mäusen auf etwa das Zweifache der 3-Monats-Menge steigen. Zwischen 5 bis 11 Monaten stabiliseren sich die GL3-Mengen, wobei die GL3-Menge nach 5 Monaten etwa 80% des Maximums beträgt. Alle Studien mit hoher Dosis wurden in 5 bis 7 Monate alten Mäusen durchgeführt, so daß die anfänglichen GL3-Mengen in dieser Gruppe nicht so stark variierten.
Beispiel 9: Wiederholte Verabreichung von Adenovirus an Mäuse nach Immunsuppression mittels Desoxyspergualin (DSG)
Da eine wiederholte Verabreichung des adenoviralen Vektors, der das α-Galactosidase A-Gen enthält, erforderlich sein kann, um α-Galactosidase A-Mengen in behandelten Individuen aufrecht zu erhalten, können verschieden Immunsuppressiva verwendet werden, um eine Immunreaktion auf den verabreichten Adenovirus-Vektor zu inhibieren. Solche Immunreaktionen können die Wirksamkeit des wiederverabreichten Virus inhibieren. Das vorliegende Experiment zeigt die Wirkung des immunsuppressiven Agens DSG auf die wiederholte Adenovirus-Verabreichung.
Zwei Gruppen von vier BALB/c-Mäusen wurden mit 1 × 10¹¹ Partikeln Ad2/CFTR-16 (einem E1-deletierten, teilweise E3-deletierten Vektor, der zur anhaltenden Transgenexpression befähigt ist, wie dies in der am 14. April 1998 eingereichten PCT/US98/07840 beschrieben ist, deren Offenbarung durch Bezugnahme hier aufgenommen wird) mittels Schwanzveneninjektion (hohe Dosis) behandelt. Zwei Gruppen von vier Mäusen erhielten 1 × 10¹⁰ Partikel des Virus (niedrige Dosis). Eine Gruppe, der jede Dosis gegeben wurde, erhielt an den Tagen -1 bis 5, bezogen auf die Virus-Verabreichung, 20 mg/kg DSG mittels IP-Injektion. Dieses Behandlungsregime wurde nach 28 Tagen wiederholt. Am 56. Tag erhielten die Mäuse die gleiche Virus-Dosis, wobei diesmal Ad2/CEHα-gal verwendet wurde. Zwei zusätzliche Gruppen von Mäusen erhielten am 56. Tag 1 × 10¹¹ oder 1 × 10¹⁰ Partikel Ad2/CEHα-gal ohne vorherige Behandlung. Diesen Tieren wurde an den Tagen -1, 27 und 55, bezogen auf die anfängliche Virus-Verabreichung, Blut entnommen. Drei Tage, nachdem sie das Ad2/CEHα-gal-Virus erhalten hatten, wurden die Tiere sakrifiziert und ihre Organe entnommen. Gewebehomogenate wurden mit einem für humane α-Galactosidase A spezifischen ELISA auf a-Galactosidase A-Expression analysiert. Gegen Adenovirus hergestellte Antikörper wurden aus Plasmaproben titriert. Bei beiden Dosierungen des Virus waren die α-Galactosidase A-Mengen in den Mäusen, denen DSG gegeben wurde, höher als in denen, die kein DSG erhielten (12), was darauf hinweist, dass DSG zum Erhalt einer Transgenexpression nach wiederholter Virus-Verabreichung beitrug. Gleichermaßen inhibierte DSG Anti-Adenovirus-Antikörpertiter in Mäusen (13).
Beispiel 10: Wirksamkeit wiederholter Adenovirus-Verabreichung an Mäuse nach Immunsuppression mit Anti-CD154 (CD40-Ligand)-Antikörper (MR1)
Der MR1-Antikörper, der von PharMingen (Katalog-Nr. 090205), erhältlich ist, reagiert mit gp39 (CD40-Ligand -CD154), einem akzessorischen Molekül, das auf aktivierten T-Lymphozyten exprimiert wird. Noelle et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6550 (1992); Roy et al., J. Immunol. 151:2497 (1993). gp39 ist zum Erzeugen einer Immunreaktion erforderlich; seine Inhibierung mit MR1 inhibiert Immunreaktionen. Tatsächlich wurde gezeigt, dass ein Antikörper gegen gp39 (CD40-Ligand; CD154) sowohl menschliche als auch zelluläre Immunreaktionen inhibiert, was die wiederholte Verabreichung von Adenovirus in die Atemwege von Mäusen erleichtert, siehe Scaraia et al., Gene Therapy 4:611 (1997); WO 98/08541, die hier durch Bezugnahme aufgenommen ist.
Das vorliegende Experiment sollte die Wirksamkeit von MR-1 zur Inhibierung einer Immunreaktion auf wiederholte Adenovirus-Verabreichung an Mäuse zeigen.
Zwei Gruppen von drei BALB/c-Mäusen wurden 1 × 10¹¹ Partikel Ad2/CFTR-16 mittels Schwanzvenen-Injektion verabreicht. Eine Gruppe der Mäuse erhielt 500 μg MR1-Anti-CD154-Antikörper mittels intraperitonealer Injektionen an den Tagen -1, 1, 4, 7 und 14, bezogen auf die Virus-Verabreichung. Achtundzwanzig Tage nach der ersten Virus-Verabreichng erhielten die Mäuse eine zweite Injektion von 1 × 10¹¹ Viruspartikeln, wobei diesmal Ad2/CEHα-gal/CEHα-gal verwendet wurde. Eine dritte Gruppe von drei Mäusen erhielt am 28. Tag nur die Ad2/CEHα-gal-Injektion. Drei Tage nach der zweiten Virus-Injektion wurden die Tiere sakrifiziert und ihre Organe geerntet. Gewebehomogenate wurden mittels ELISA auf α-Galactosidase A-Expression analysiert. Wie in 14 gezeigt, ergab dieses Experiment, dass es möglich ist, eine hochgradige α-Galactosidase A-Transgenexpression mit einer zweiten Verabreichung von Adenovirus nach kurzzeitiger Immunsuppression mit MR1-Antikörper zu erhalten.

Claims

Verwendung eines Vektors ausgewählt aus der Gruppe Adenoviren, Adeno-assoziierten Viren (AAV), Vacciniaviren, Herpesviren, Bakteriophagen, Cosmiden, Pilzvektoren zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer lysosomalen Speicherkrankeit, wobei die lysosomale Speicherkrankheit die Gaucher-Krankheit ist, wobei der Vektor ein Transgen umfasst und exprimiert, welches für eine biologisch aktive humane β-Glucosidase codiert, der Vektor in vivo von den Zielzellen aufgenommen wird, das Transgen darin exprimiert wird und das biologisch aktive Enzym in vivo produziert wird.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Adenovirus mit DEAE-Dextran komplexiert ist.
Verwendung nach Ansprüchen 1 bis 2, wobei die Zellen, beherbergend den Vektor, das Enzym sezernieren, welches von anderen Zellen, denen das Enzym mangelt, aufgenommen wird.