ES2299776T3

ES2299776T3 - Membrana de barrera.

Info

Publication number: ES2299776T3
Application number: ES04014072T
Authority: ES
Inventors: Aaldert Rens Molenberg
Original assignee: Straumann Holding AG
Current assignee: Straumann Holding AG
Priority date: 2004-06-16
Filing date: 2004-06-16
Publication date: 2008-06-01
Anticipated expiration: 2024-06-16
Also published as: AU2005253694B2; JP2008502388A; KR20070027592A; EP1609491B1; KR100899725B1; WO2005123156A1; KR100988391B1; DE602004011660T2; AU2008203066A1; ATE385423T1; AU2008203066B2; DE602004011660D1; US7741427B2; CA2563034C; JP4834892B2; US20080039577A1; AU2008203062A1; CA2563034A1; US8044172B2; US20100105800A1

Abstract

Membrana oclusiva de células, que se puede obtener mediante reacción de por lo menos dos precursores en presencia de agua, en la que: un primer precursor A que comprende un núcleo que soporta n cadenas, presentando cada una un grupo insaturado conjugado o un enlace insaturado conjugado unido a cualquiera de los últimos 20 átomos de la cadena, y un segundo precursor B que comprende un núcleo que soporta m cadenas, presentando cada una un grupo tiol unido a cualquiera de los últimos 20 átomos de la cadena, en el que: m es mayor o igual a 2, n es mayor o igual a 2, m+n es mayor o igual a 5, formando la reacción una red tridimensional con puntos de reticulación, caracterizada porque cada núcleo de los precursores forma un punto de reticulación si m y n son mayores que 2, y si m es igual a 2, el correspondiente punto de reticulación corresponde al núcleo del primer precursor A contiguo, y si n es igual a 2, el punto de reticulación corresponde al núcleo del segundo precursor B contiguo, y los puntos de reticulación contiguos se encuentran conectados por una cadena que presenta menos de 600 átomos.

Description

Membrana de barrera.

La presente invención se refiere a una membrana oclusiva de células que se puede obtener mediante la reacción de por lo menos dos precursores en presencia de agua y a un procedimiento para preparar la membrana.

Son conocidos per se implantes que se utilizan para la inserción en hueso, por ejemplo tornillos de titanio que deben introducirse en la mandíbula para la unión de dientes artificiales. La función de este tipo de implante puede resultar perjudicada por un volumen óseo insuficiente o por la presencia de defectos óseos en el sitio del implante. Una medida aplicada con frecuencia para estimular la formación de hueso en el sitio de implantación es la regeneración ósea guiada (GBR). En este procedimiento, el sitio donde se desea la formación de hueso se separa del tejido blando circundante con una membrana de barrera que inhibe la entrada en el sitio de células de tejido blando no osteogénicas, permitiendo de esta manera que células de la médula ósea rellenen dicho sitio con hueso. Además, puede utilizarse material de relleno de hueso osteoconductor para soportar la membrana.

Se utilizan varios tipos de membranas oclusivas de células en el campo de la regeneración ósea guiada o de la regeneración de tejidos en general. Las membranas oclusivas de células disponibles comercialmente pueden clasificarse según su origen en material de membrana xenogénico derivado de individuos de diferentes especies y material de membrana de fabricación sintética.

El material xenogénico siempre comporta el riesgo de infección. La mayoría de materiales de membrana se comercializan en forma de lámina y requieren que el cirujano las corte hasta el tamaño deseado, lo que exige tiempo. Además, este procedimiento resulta dificultoso debido a que resulta necesario encontrar la forma correcta. Un ejemplo de material xenogénico es el colágeno, que es biodegradable e hidrofílico.

Un ejemplo de material sintético es el PTFE (Teflón). La membrana de PTFE es hidrofóbica y por lo tanto no se une bien al tejido biológico y con frecuencia debe unirse utilizando clavos o tornillos. Además, el material no es biodegradable y de esta manera debe extraerse tras el proceso de cicatrización en un segundo procedimiento invasivo.

Son conocidos de la técnica los materiales biodegradables. En el documento WO 01/92584, se da a conocer un material de matriz que se forma mediante reacción de adición nucleofílica a grupos insaturados conjugados. Se une covalentemente un componente farmacéuticamente activo al biomaterial, que posteriormente se libera en el cuerpo. El material biodegradable se degrada bajo condiciones fisiológicas dentro del mes.

El documento WO nº 00/44808 también da a conocer un biomaterial polimérico formado mediante reacciones de adición nucleofílica a grupos insaturados conjugados. Los hidrogeles obtenidos pueden utilizarse, por ejemplo, como colas o sellantes y como andamiajes para la ingeniería de tejidos y aplicaciones de cicatrización de heridas. Además, dichos hidrogeles se degradan con rapidez bajo condiciones fisiológicas.

La patente US nº 5.874.500 da a conocer una composición polimérica reticulada que comprende un primer polímero sintético que contiene dos o más grupos amino unidos covalentemente a un segundo polímero sintético que contiene múltiples grupos electrofílicos y un componente biológicamente activo. Dicha composición puede utilizarse para llevar a cabo la adhesión entre una primera superficie y una segunda superficie, para llevar a cabo el aumento de tejidos, para prevenir la formación de adhesiones quirúrgicas y para recubrir una superficie de un implante sintético.

Tal como se utiliza en la presente memoria, los términos "polimerización" y "reticulación" se utilizan para indicar la unión de diferentes precursores entre sí, resultando en un incremento sustancial del peso molecular. El término "reticulación" además indica ramificación, típicamente proporcionando una red de polímero.

El término "autoselectivo" se refiere a que un primer precursor A de la reacción reacciona mucho más rápido con un segundo precursor B que con otros compuestos presentes en la mezcla en el sitio de la reacción, y que el segundo precursor B reacciona mucho más rápido con el primer precursor A que con otros compuestos presentes en la mezcla en el sitio de la reacción. La mezcla puede contener otros materiales biológicos, por ejemplo fármacos, péptidos, proteínas, ADN, células, agregados celulares y tejidos.

La expresión "enlace insaturado conjugado" se refiere a la alternancia de enlaces múltiples carbono-carbono, carbono-heteroátomo o heteroátomo-heteroátomo y enlaces sencillos. Estos enlaces pueden someterse a reacciones de adición.

La expresión "grupo insaturado conjugado" se refiere a una molécula o a una región de una molécula que contiene una alternancia de múltiples enlaces carbono-carbono, carbono-heteroátomo o heteroátomo-heteroátomo y enlaces sencillos, que presenta un enlace múltiple que puede someterse a reacciones de adición. Entre los ejemplos de grupos insaturados conjugados se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, acrilatos, acrilamidas, quininas y vinilpiridinios, por ejemplo 2-vinilpiridinio o 4-vinilpiridinio.

El problema de la presente invención es proporcionar una membrana biodegradable que evita que el tejido blando circundante interactúe con la región que debe protegerse, que no presente riesgo de infección.

El problema se resuelve con una membrana de barrera según la reivindicación 1. Se proporcionan formas de realización preferidas adicionales en las reivindicaciones 2 a 17.

La membrana según la presente invención puede obtenerse mediante reacción de dos o más precursores. Debido a la combinación de las características de los precursores, es decir el número de cadenas de los precursores, así como el hecho de que los puntos de reticulación contiguos se encuentran conectados por una cadena que presenta menos de 600 átomos, la membrana resultante es oclusiva de células. La membrana según la presente invención evita que el tejido blando circundante interactúe con la región que debe protegerse. Lo anterior permite que se produzca una rápida regeneración ósea en el defecto óseo.

Debido al hecho de que la membrana es de origen no animal, el riesgo de inflamación y la transmisión de patógenos animales se encuentran reducidos. Además, la membrana es biodegradable, evitando una segunda cirugía. Sin embargo, es suficientemente estable para garantizar el mantenimiento de la función de barrera durante el tiempo completo de cicatrización para una regeneración ósea efectiva en defectos de lecho de implante, que implica que existe un resultado predecible del tratamiento, lo que resulta importante para el cirujano. La membrana se degrada dentro de aproximadamente los 6 meses. Los productos de degradación se excretan con facilidad y no son tóxicos.

La membrana según la presente invención puede aplicarse in situ, que implica que resulta posible una aplicación rápida, necesaria para el cirujano y el paciente. Debido al modo de aplicación, la membrana adoptará la forma de la superficie subyacente, garantizando de esta manera un encaje y fijación óptimas. No resulta necesaria la fijación de este tipo de membrana. Lo anterior implica que resulta fácil de manipular, debido a que se evitan los ajustes extraorales. Debido a que el ajuste es perfecto, existe un riesgo significativamente inferior de migración de granulocitos no deseada.

El primer precursor A comprende un núcleo que porta n cadenas con un grupo insaturado conjugado o un enlace insaturado conjugado unido a cualquiera de los últimos 20 átomos de la cadena. En una forma de realización preferida, dicho grupo insaturado conjugado o enlace insaturado conjugado es terminal. El núcleo puede ser un átomo individual, tal como un átomo de carbono o de nitrógeno o moléculas pequeñas, tales como una unidad de óxido de etileno, un azúcar, un alcohol multifuncional, tal como pentaeritritol, glicerina u oligoglicerina, tal como hexaglicerol. Las cadenas son polímeros lineales o cadenas de alquilo lineales o ramificadas que opcionalmente comprenden heteroátomos, grupos amida o grupos éster. Además de las cadenas, el núcleo puede sustituirse adicionalmente con residuos alquilo lineales o ramificados o con polímeros que no presentan grupos o enlaces insaturados conjugados. En una forma de realización preferida, el primer precursor A presenta 2 a 10 cadenas, más preferentemente 4 a 8 cadenas. Los enlaces insaturados conjugados preferentemente son acrilatos, acrilamidas, quininas, 2-vinilpiridinio o 4-vinilpiridinio y ésteres de itaconato de fórmula Ia o Ib:

1

en las que R_{1} y R_{2} son independientemente hidrógeno, metilo, etilo, propilo o butilo, y R_{3} es una cadena de hidrocarburo C_{1} a C_{10} lineal o ramificado, preferentemente metilo, etilo, propilo o butilo.

El segundo precursor B comprende un núcleo que soporta m cadenas, presentando cada una un grupo tiol unido a cualquiera de los últimos 20 átomos al final de la cadena. Por ejemplo, puede incorporarse un residuo cisteína en la cadena. Preferentemente el grupo tiol es terminal. El núcleo puede ser un átomo individual, tal como un átomo de carbono o de nitrógeno, o moléculas pequeñas, tales como una unidad de óxido de etileno, un azúcar, un alcohol multifuncional, tal como pentaeritritol, glicerina u oligoglicerina, tal como hexaglicerol. Las cadenas son polímeros lineales o cadenas de alquilo lineales o ramificadas que opcionalmente comprenden heteroátomos, grupos ésteres o grupos amida. En una forma de realización preferida, el segundo precursor B presenta 2 a 10 cadenas, más preferentemente 4 a 8 cadenas.

El compuesto primer precursor A presenta n cadenas, en el que n es mayor o igual a 2, y el compuesto segundo precursor B presenta m cadenas, en el que m es superior o igual a 2. El primer y/o el segundo precursor B puede comprender cadenas adicionales que no se encuentran funcionalizadas. La suma de las cadenas del primer y segundo precursor Bs, es decir m+n, es mayor o igual a 5. Para obtener una red tridimensional densa preferentemente la suma m+n es igual o mayor a 8.

Cada núcleo de los precursores forma un punto de reticulación si m y n son ambos mayores de 2. Si m es igual a 2, es decir, si el segundo precursor B es lineal, el punto de reticulación correspondiente corresponde al núcleo del primer precursor A contiguo. Si n es igual a 2, es decir, si el primer precursor A es lineal, el punto de reticulación corresponde al núcleo del segundo precursor B contiguo. Los puntos de reticulación contiguos se encuentran conectados por una cadena con menos de 600 átomos. Dichos 600 átomos únicamente son átomos que se encuentran en el esqueleto de la cadena, es decir sin contar los sustituyentes ni los átomos de H.

Preferentemente, el número de átomos entre los dos puntos de reticulación contiguos es inferior a aproximadamente 330 átomos, más preferentemente es de entre 30 y 120 átomos. Por lo tanto, las mallas de la red tridimensional resultante presentan dimensiones varios órdenes de magnitud inferiores a las de una célula (la dimensión de una célula es de entre 1 y 100 \mum), resultando en una membrana oclusiva de células.

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2

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Debido a que el número de cadenas del primer y segundo precursor B (n+m) es de por lo menos 5 y las distancias entre el núcleo del primer precursor A y el núcleo del segundo precursor B son reducidas, el contenido de agua de la red es pequeño, resultando en una estabilidad in vivo más prolongada. Sin embargo, la presencia de agua garantiza el transporte de moléculas pequeñas, es decir, resulta posible alejar el material de desecho de las células y la entrada de nutrientes en las mismas.

La reacción del primer y segundo precursor B preferentemente se basa en la adición de tipo Michael catalizada por base entre el grupo insaturado conjugado o el enlace insaturado conjugado del primer precursor A y el grupo tiol del segundo precursor B:

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3

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El enlace resultante se hidroliza en contacto con el agua. La velocidad de la reacción de hidrólisis depende de la temperatura y del valor del pH, que es de 7,4 en la mayoría de tejidos. Tras la hidrólisis de varios enlaces, la red reticulada se degrada o se descompone debido a la hidrólisis de los enlaces inestables.

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4

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En una forma de realización preferida, las cadenas del primer precursor A y/o las cadenas del segundo precursor B son polímeros lineales. Dichos polímeros preferentemente se seleccionan de entre el grupo constituido por polietilenglicol, poli(óxido de etileno), poli(alcohol vinílico), poli(alcohol etilén-covinílico), poli(ácido acrílico), poli(etilén-covinil-pirrolidona), poli(etiloxazolina), poli(vinilpirrolidona), poli(etilén-covinilpirrolidona), poli(ácido maleico), poli(ácido etileno-comaleico), poli(acrilamida) o copolímeros en bloque poli(óxido de etileno)-copoli(óxido de propileno). Dichos polímeros también pueden ser copolímeros, copolímeros en bloque, copolímeros injertados o copolímeros aleatorios. Los bloques, que se polimerizan en los extremos de los polímeros hidrofílicos, pueden estar compuestos de, por ejemplo, ácido láctico, ácido glicólico, \varepsilon-caprolactona, oligómeros ácido láctico-co-glicólico, carbonato de trimetileno, anhídridos y aminoácidos.

En una forma de realización preferida, las cadenas de las moléculas precursoras son moléculas de polietilenglicol (PEG). El PEG es altamente soluble en agua, disponible a elevada pureza y con muchas estructuras diferentes. Además, no es tóxica y ha sido autorizada por la FDA para la administración oral y tópica, y para inyecciones en el ser humano.

En una forma de realización más preferida, el primer precursor A es un acrilato de PEG con 8 cadenas y un peso molecular aproximado de 2 k (kg/mol=kDa). El peso molecular puede variar en aproximadamente \pm20% y de esta manera los valores de v son únicamente valores aproximados.

5

El segundo precursor B es un PEG-tiol con cuatro cadenas y un peso molecular aproximado de 2 k (kg/mol=kDa).

6

En una forma de realización adicional de la presente invención, puede añadirse un agente modificador de la viscosidad a los precursores con el fin de evitar el escape del líquido antes de que gelifique. Son posibles agentes modificadores de la viscosidad, por ejemplo, CMC o xantano.

En una forma de realización preferida adicional, puede añadirse un estabilizador para evitar la autopolimerización del primer precursor A. Un posible estabilizador es azul de metileno, que garantiza una buena estabilización.

Con el fin de obtener la membrana según la presente invención, los precursores se mezclan entre sí en presencia de agua, preferentemente agua tamponada a pH fisiológico o aproximadamente fisiológico. No resulta necesario que los monómeros sean completamente solubles en agua. En general, la reticulación se completa dentro de un periodo de tiempo relativamente corto (es decir, 10 segundos a 15 minutos). Por lo tanto, el sitio quirúrgico puede cerrarse relativamente poco después de completar el procedimiento quirúrgico.

La mezcla para formar la membrana según la presente invención puede llevarse a cabo mediante varios medios. En una forma de realización preferida, el primer precursor A se mezcla con un primer tampón y el segundo precursor B se mezcla con un segundo tampón. En la aplicación, las dos mezclas se mezclan adicionalmente por medio de un mezclador estático unido a dos jeringas y la mezcla resultante se aplica in situ.

La mezcla también puede llevarse a cabo entre gotas finas de cada una de las dos soluciones de precursor en una pulverización de aire. Puede prepararse una solución a partir de ambos precursores, aunque a un pH, por ejemplo, en que la reacción no puede producirse o se produce sólo lentamente. Tras la colocación de la solución premezclada de precursores, puede ajustarse el pH, por ejemplo mediante la mezcla con un ácido o una base, o mediante una reacción química para crear un ácido o una base, o la difusión de un ácido o una base, resultando en una condición final en la solución final de precursores que resulta apropiada para que se produzca la reacción química. Otro enfoque puede ser preparar la solución final de precursores a una temperatura a la que no puede producirse la reacción o a la que sólo se produce muy lentamente, relacionada con la energía de activación de la reacción o con un tampón con propiedades sensibles a la temperatura o ambas. Al calentar o enfriar (resulta más útil calentar) hasta la temperatura final de aplicación (por ejemplo hasta la temperatura corporal tras la inyección), las condiciones en la solución final de precursores resultarían apropiadas para que se produzca la reacción química.

El primer y el segundo precursor B pueden comercializarse separadamente. En una forma de realización preferida se comercializan conjuntamente en forma de un kit que comprende el primer precursor A y el segundo precursor B, en el que dichos precursores se encuentran separados uno de otro. Lo anterior puede llevarse a cabo, por ejemplo, con dos jeringas, un recipiente con dos compartimentos o dos recipientes diferentes. Dicho kit puede comprender además una solución acuosa tamponada. También resulta posible que la solución tamponada se encuentre separada del primer precursor A y del segundo precursor B.

Ejemplos

Ejemplo 1

PEG-tetratiol 2k A.) PEG-tetra-aliléter 2k

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Se disolvieron 20,3 g de PEG 2k de 4 brazos (PM=2.323 g/mol, 35,7 meq. de OH) en 200 ml de tetrahidrofurano seco bajo una atmósfera de Ar. La solución se secó mediante reflujo del solvente sobre tamices moleculares hasta que el contenido de agua había caído hasta 200 ppm. A continuación, se dejó enfriar hasta la temperatura ambiente y se añadieron 2,69 g de una suspensión de NaH al 60% en aceite mineral (67 mmoles) y se dejó reaccionar durante 15 minutos, después de lo cual se añadieron 8,75 g de bromuro de alilo (73,3 mmoles). La suspensión se sometió a reflujo y se agitó durante la noche. Tras enfriarla, se filtró a través de aproximadamente 1 cm de Celite 545, rindiendo una solución transparente de color amarillo pálido. Se eliminaron el solvente y el exceso de bromuro de alilo mediante evaporación rotatoria y el aceite remanente se disolvió nuevamente en 200 ml de agua. El lavado de la emulsión resultante con tres partes de 50 ml de éter dietílico proporcionó una solución transparente amarillo pálido en la que se disolvieron 20 g de NaCl. El producto se extrajo con tres partes de 50 ml de diclorometano y las capas orgánicas agrupadas se secaron con MgSO_{4} y se filtraron. La eliminación del solvente mediante evaporación rotatoria rindió 21,3 g (98%) de un aceite amarillo pálido. La RMN-^{1}H confirmó la estructura del producto.

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B.) PEG-tetra(tioacetato) 2k

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Se disolvieron 19,7 g de PEG-tetra-aliléter 2k (PM=2.483 g/mol, 31,7 meq de alilo) y 1,70 g (10,4 mmoles) de AIBN en 150 ml de tetrahidrofurano libre de estabilizador y la solución se desgasificó mediante cuatro ciclos de evacuación y purga con Ar. La solución se sometió a reflujo y durante un periodo de 20 horas, se añadieron tres partes de 10 ml de una solución desgasificada de 9,0 ml (135 mmoles) de ácido tioacético en 21 ml de tetrahidrofurano. Antes de la última adición se añadieron 0,53 g (3,3 mmoles) de AIBN. Tras agitar bajo reflujo durante cuatro horas más, el producto se aisló tal como se ha descrito en A.), rindiendo 22,2 g (100%) de un aceite amarillo pálido. La estructura del producto y la conversión completa de los grupos alilo se confirmaron mediante RMN-^{1}H, que mostró un grado de funcionalización de aproximadamente 95%.

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C.) PEG-tetratiol 2k

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Se disolvieron 10,9 g de PEG-tetra(tioacetato) 2k (PM=2.787 g/mol, 15,7 meq de tioacetato) en 100 ml de agua y se desgasificó mediante cuatro ciclos de evacuación y purga con Ar. A continuación, se añadieron 100 ml de una solución acuosa de NaOH 0,4 M desgasificada, y la solución resultante se desgasificó nuevamente. Tras agitar durante dos horas a temperatura ambiente, se añadieron 12,7 ml de una solución acuosa de KHSO_{4} 2,00 M, rindiendo una solución de pH 6,5. El producto se aisló tal como se ha descrito en A.), aunque se mantuvo bajo Ar durante el procedimiento, rindiendo 10,1 g (98%) de un aceite amarillo. No pudieron detectarse mediante espectroscopía de IR ningún grupo carbonilo (señal a 1.690 cm^{-1}) y la RMN-^{1}H confirmó la estructura del producto.

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Ejemplo 2

PEG-ditiol lineal 3.4k A.)\alpha,\omega-bis alil-PEG

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Se disolvieron 34,0 g de \alpha,\omega-bishidroxi-PEG (PM=3.391 g/mol, 20,1 meq de OH) en 250 ml de tetrahidrofurano seco bajo una atmósfera de Ar. La solución se secó mediante reflujo del solvente sobre tamices moleculares hasta que el contenido de agua había caído a menos de 100 ppm. A continuación, se dejó enfriar hasta aproximadamente 50ºC y se añadieron 1,68 g de una suspensión de NaH al 60% en aceite mineral (42 mmoles) y se dejó reaccionar durante 15 minutos, después de lo cual se añadieron 4,0 ml de bromuro de alilo (47 mmoles). La suspensión se sometió a reflujo y se agitó durante la noche. Tras enfriarla, se filtró a través de aproximadamente 1 cm de Celite 545, rindiendo una solución transparente de color amarillo pálido. Se eliminaron el solvente y el exceso de bromuro de alilo mediante evaporación rotatoria y el sólido resultante se disolvió nuevamente en 200 ml de agua. El lavado de la emulsión resultante con dos partes de 50 ml de éter dietílico rindió una solución transparente de color amarillo pálido en la que se disolvieron 20 g de NaCl. El producto se extrajo con tres partes de 50 ml de cloroformo y las capas de cloroformo agrupadas se secaron con MgSO_{4}, se filtraron y se concentraron mediante evaporación rotatoria hasta aproximadamente 80 ml. La precipitación en 1,2 l de éter dietílico frío y la posterior filtración y secado a 60ºC en un horno de vacío rindió 33,3 g (96%) de polvos blancos. La estructura del producto se confirmó mediante RMN-^{1}H, que mostró un grado de funcionalización de aproximadamente 97%.

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B.)\alpha,\omega-bis(3-tioacetilpropil)-PEG

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Se disolvieron 31,7 g de \alpha,\omega-bisalil-PEG (PM=3.471 g/mol, 18,3 meq de alilo) y se disolvieron 1,02 g (10,4 mmoles) de AIBN en 200 ml de tetrahidrofurano libre de estabilizador y la solución se desgasificó mediante cuatro ciclos de evacuación y purga con Ar. La solución se sometió a reflujo y durante un periodo de 21 horas se añadieron tres partes de 10 ml de una solución desgasificada de 5,2 ml (73 mmoles) de ácido tioacético en 25 ml de tetrahidrofurano. Antes de la última adición, se añadieron 0,26 g (1,6 mmoles) de AIBN. Tras agitar bajo reflujo durante cinco horas más, el producto se aisló tal como se ha descrito en A.), rindiendo 30,8 g (93%) de polvos blanquecinos. La estructura del producto y la conversión completa de los grupos alilo se confirmaron mediante RMN-^{1}H, que mostraron un grado de funcionalización de aproximadamente 97%.

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C.)\alpha,\omega-bis(3-mercaptopropil)-PEG 3,4k

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Se disolvieron 8,5 g de \alpha,\omega-bis(3-tioacetilpropil)-PEG (PM=3.623 g/mol, 4,7 meq de tioacetato) en 70 ml de una solución acuosa desgasificada de NaOH 0,20 M y se agitó durante dos horas a temperatura ambiente bajo Ar. A continuación, se añadió KHSO_{4} acuoso 2,00 M hasta que la solución alcanzó un pH de 6. El producto se aisló tal como se ha descrito en A.), aunque se mantuvo bajo Ar durante el procedimiento, rindiendo 6,4 g (76%) de polvos blancos. No pudieron detectarse grupos carbonilo mediante espectroscopía de IR (señal a 1.690 cm^{-1}) y la estructura del producto se confirmó mediante RMN-^{1}H.

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Ejemplo 3

PEG-tetraacrilato 2k

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Se disolvieron 12,7 g de PEG 2k de 4 brazos (PM=2.323 g/mol, 21,9 meq de OH) en 250 ml de tetrahidrofurano seco bajo una atmósfera de Ar. La solución se secó mediante reflujo del solvente sobre tamices moleculares hasta caer el contenido de agua a menos de 100 ppm, después de lo cual se dejó enfriar hasta la temperatura ambiente. Se añadieron 2,81 g de trietilamina (27,8 mmoles) y se añadió gota a gota una solución de 2,51 g de cloruro de acriloilo (27,7 mmoles) en 25 ml de diclorometano seco a una velocidad suficiente para que la temperatura de la mezcla de reacción se mantuviese por debajo de 30ºC. La suspensión resultante se filtró a través de aproximadamente 1,5 cm de Celite 545, rindiendo una solución transparente de color amarillo pálido a la que se añadieron 44 mg de MEHQ. El solvente se eliminó mediante evaporación rotatoria, el aceite remanente se disolvió nuevamente en 150 ml de agua y se añadió NaHCO_{3} hasta alcanzar un pH de 8. La solución acuosa se lavó tres veces con 50 ml de éter dietílico, se añadieron 15 g de NaCl y el producto se extrajo con cinco partes de 50 ml de diclorometano. Las capas orgánicas agrupadas se secaron con Na_{2}SO_{4} y se filtraron. La eliminación del solvente mediante evaporación rotatoria rindió 12,9 g (93%) de aceite amarillo. Se confirmó la estructura del producto mediante RMN-^{1}H, que mostró un grado de funcionalización de aproximadamente 95%.

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Ejemplo 4

PEG-octaacrilato 2k

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Partiendo de PEG 2k de 8 brazos (PM=1.985 g/mol) y siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 3, se obtuvo PEG-octaacrilato 2k con un grado de funcionalización de aproximadamente 94%.

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Ejemplo 5

PEG-tetraacrilato 15k

15

Se disolvieron 12,08 g de PEG 15k de 4 brazos (PM=14.861 g/mol, 3,3 meq de OH) en 150 ml de tetrahidrofurano seco bajo una atmósfera de Ar. La solución se secó sometiendo a reflujo el solvente sobre tamices moleculares hasta que el contenido de agua había caído a menos de 100 ppm, después de lo cual se dejó enfriar hasta la temperatura ambiente. Se añadieron 0,78 g de trietilamina (7,7 mmoles) y se añadió gota a gota una solución de 0,69 g de cloruro de acriloilo (7,7 mmoles) en 20 ml de diclorometano seco a una velocidad suficiente para que la temperatura de la mezcla de reacción se mantuviese por debajo de 30ºC. La suspensión resultante se filtró a través de aproximadamente 1 cm de Celite 545, rindiendo una solución transparente de color amarillo pálido a la que se añadieron 44 mg de MEHQ. El solvente se eliminó mediante evaporación rotatoria, el sólido resultante se disolvió nuevamente en 150 ml de agua y se añadió NaHCO_{3} hasta alcanzar pH 8. La solución acuosa se lavó dos veces con 40 ml de éter dietílico, se añadieron 10 g de NaCl y el producto se extrajo con cuatro partes de 50 ml de diclorometano. Las capas orgánicas agrupadas se secaron con Na_{2}SO_{4} y se filtraron. A la solución de color amarillo pálido resultante se añadieron 30 mg de MEHQ y se concentró hasta aproximadamente 35 ml mediante evaporación rotatoria. La precipitación en 0,8 l de éter dietílico frío y la posterior filtración y secado a 60ºC en un horno de vacío rindió 11,5 g (94%) de polvos blancos. La estructura del producto se confirmó mediante RMN-^{1}H, que mostró un grado de funcionalización de aproximadamente
97%.

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Ejemplo 6

PEG-octaacrilato 10k

16

Partiendo de PEG 10k de 8 brazos (PM=9.468 g/mol) y siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 5, se obtuvo PEG-octaacrilato 10k con un grado de funcionalización de entre 95% y 100%.

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Ejemplo 7

PEG-octaacrilato 20k

17

Partiendo de PEG 20k de 8 brazos (PM=19.770 g/mol) y siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 5, se obtuvo PEG-octaacrilato 20k con un grado de funcionalización de entre 96% y 100%.

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Ejemplo 8

PEG-trisacrilato 15k

18

Partiendo de PEG 15k de 3 brazos (PM=14.763 g/mol) y siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 5, se obtuvo PEG-trisacrilato 15k con un grado de funcionalización de aproximadamente 97%.

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Ejemplo 9

Hidrocloruro de tris(2-[4-mercapto-butirilamino]etil)amina

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19

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Se disolvieron 4,7 g (32 mmoles) de tris(2-aminoetil)amina y 10,3 g (101 mmoles) de \gamma-tiobutirolactona en 100 ml de cloroformo seco bajo una atmósfera de Ar. La mezcla de reacción se agitó durante 24 horas bajo reflujo, se dejó enfriar hasta la temperatura ambiente y se precipitó mediante la adición lenta de 16 ml de HCl 2,0 M en éter dietílico. Tras sedimentar el precipitado, se decantó el sobrenadante líquido y el precipitado se disolvió nuevamente en diclorometano, se precipitó nuevamente en éter dietílico y se secó en un horno de vacío, rindiendo un material ceroso de color amarillo pálido. La estructura del producto se confirmó mediante RMN-^{1}H y RMN-^{13}C.

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Ejemplo 10

Hidrocloruro de tris(2-[2-{N-acetilamino}-4-mercapto-butirilamino]etil)amina

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Se disolvieron 2,51 g (17,1 mmoles) de tris(2-aminoetil)amina y 8,54 g (53,7 mmoles) de N-acetilhomo-cisteína tiolactona en 50 ml de cloroformo seco bajo una atmósfera de Ar. La mezcla de reacción se agitó durante 22 horas bajo reflujo, se dejó enfriar hasta la temperatura ambiente y se precipitó mediante adición lenta de 10 ml de HCl 2,0 M en éter dietílico. Tras sedimentar el precipitado, se decantó el sobrenadante líquido y el precipitado se disolvió nuevamente en etanol, se precipitó nuevamente en éter dietílico, y se secó en un horno de vacío, rindiendo 10,2 g (90%) de polvos blancos. Se confirmó la estructura del producto mediante RMN-^{1}H y RMN-^{13}C.

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Ejemplo 11

\alpha,\omega-bis(4-mercapto-butirilamino)-PEG 3,4k

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Se disolvieron 1,27 g (32 mmoles) de \alpha,\omega-bisamino-PEG (PM=3.457 g/mol, 0,72 meq de amina), 0,22 g (2,1 mmoles) de \gamma-tiobutirolactona y 20 mg de 4-(dimetilamino)-piridina en 10 ml de diclorometano seco bajo una atmósfera de Ar. La mezcla de reacción se calentó bajo reflujo y se agitó durante 32 horas, después de lo cual el producto se aisló mediante precipitación dos veces en éter dietílico frío y se secó en un horno de vacío, rindiendo 1,23 g (91%) de polvos blancos. La estructura del producto se confirmó mediante RMN-^{1}H.

Gelación

Ejemplo 12

Se disolvieron 7,0 mg (4,0 \mueq de tiol) del producto del Ejemplo 2 y 20,0 mg (4,0 \mueq de acrilato) del producto del Ejemplo 8 en cantidades iguales de un tampón acuoso de trietanolamina 0,30 M/HCl a pH 8,0. Se enfriaron ambas soluciones hasta 0ºC, se mezclaron rápidamente y se introdujeron entre las placas de un reómetro de placas paralelas. Las placas se mantuvieron a 37ºC y se midieron los módulos de conservación (G') y de pérdida (G'') como función del tiempo a una frecuencia de 10 Hz. El punto de gel, definido como el punto de intersección de G' y G'', se determinó para varias concentraciones de PEG (Tabla 1).

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TABLA 1

22

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Ejemplo 13

Se disolvieron 41,9 mg (64,0 \mueq de tiol) del producto del Ejemplo 1 y 40,3 mg (63,5 \mueq de acrilato) del producto del Ejemplo 3 en 237 mg de un tampón acuoso de trietanolamina 0,050 M/HCl a pH 7,6. Ambas soluciones se enfriaron hasta 0ºC, se mezclaron rápidamente y se introdujeron entre las placas de un reómetro de placas paralelas. Las placas se mantuvieron a 37ºC y se midieron los módulos de conservación (G') y de pérdida (G'') como función del tiempo a una frecuencia de 10 Hz.

Se determinó el punto de gel, definido como el punto de intersección de G' y G'' (Tabla 2).

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TABLA 2

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Degradación in vitro

Ejemplo 14

Se disolvieron 155,8 mg (238 \mueq. de tiol) del producto del Ejemplo 1 y 150,6 mg (237 \mueq de acrilato) del producto del Ejemplo 3 en 0,59 g de un tampón acuoso de trietanolamina 0,030 M/HCl a pH 7,4. Ambas soluciones se enfriaron hasta 0ºC, se mezclaron rápidamente y se formaron geles cilíndricos (70 \mul) en moldes de teflón (diámetro: 6 mm). Los geles se curaron durante 1 hora a 37ºC y se introdujeron en PBS 10 mM (pH 7,4) a 37ºC. Se realizó un seguimiento del incremento de volumen debido a la hidrólisis de los enlaces éster mediante pesado de los geles a intervalos regulares (figura 1: valores medios de 6 muestras; la línea muestra el ajuste de una curva logarítmica). El gel se había disuelto por completo tras aproximadamente 64 días.

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Ejemplo 15

Se gelificaron varias combinaciones diferentes de compuestos tiol y acrilato siguiendo el procedimiento descrito en el Ejemplo 14. Se indican en la Tabla 3 los tiempos tras los cuales se habían disuelto por completo los geles.

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TABLA 3

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Ejemplo 16

Oclusividad de células Procedimientos

Se cortaron esponjas altamente porosas secas de alcohol polivinílico (PVA) formando cilindros de 3 mm de diámetro y 5 mm de altura, y se esterilizaron mediante hinchado y autoclavaje posterior en agua desionizada. Las esponjas cilíndricas estériles resultantes seguidamente se liofilizaron para eliminar el exceso de agua y se almacenaron en estado estéril hasta que se requirieron nuevamente.

Se diluyó un kit de cola de fibrina estándar de manera que la concentración final del componente fibrinógeno fuese cuatro veces inferior y la concentración final del componente trombina fuese 125 veces inferior a las de un kit estándar. Se mezclaron volúmenes iguales de las soluciones de fibrinógeno y trombina, y se adsorbieron en la esponja de PVA, creando una red de fibrina entre los poros del PVA.

Las esponjas de fibrina-PVA formadas de esta manera se almacenaron en placas de Petri estériles hasta la implantación en el animal (+control) o se atraparon en un material de membrana.

Las membranas de gel de PEG se moldearon a temperatura ambiente bajo condiciones estériles en moldes cilíndricos de acero inoxidable (\diameter 7 mm, altura: 7 mm) utilizando kits de membrana que contenían cantidades equimolares de PEG-tiol 2k de 4 brazos y PEG-acrilato 2k de 8 brazos, así como un tampón de trietanolamina/HCl con CMC como modificador de la viscosidad. Antes de que se iniciase la gelación, se introdujo una esponja de fibrina en el centro de cada membrana de gel. Los moldes se cubrieron y los geles se dejó que se curasen durante aproximadamente 1 hora, y posteriormente se transfirieron a PBS 10 mM estéril y se almacenaron en un incubador a 37ºC durante la noche.

En un procedimiento quirúrgico estándar, catorce ratas hembra adultas recibieron cada una cuatro implantes distribuidos aleatoriamente en cuatro bolsillos subcutáneos dorsales. En tres de los bolsillos se introdujo un implante de membrana y en el cuarto saco, se introdujeron dos esponjas rellenas de fibrina a modo de control positivo. Las incisiones se cerraron con grapas. Los animales se sacrificaron tras varios puntos del tiempo post-operatoriamente y los implantes se fijaron en 4% PFA/PBS. Se realizaron series de deshidratación con EtOH al 70%, 90% y 100% bajo agitación lenta a temperatura ambiente. La duración de cada etapa de deshidratación fue de 24 horas durante las que se renovó una vez la solución. Tras la deshidratación, los explantes se infiltraron durante 36 horas con solución Histocryl recién catalizada, que se renovó dos veces durante la infiltración. A continuación, se incluyó cada muestra en una cápsula de gelatina (EMS, tamaño 13) con solución Histocryl recién catalizada. Los explantes incluidos se seccionaron en un micrótomo rotatorio (MICROM) con una cuchilla (en forma de "d", MICROM). Las secciones se tiñeron con hematoxilina de Meyer (Merck) y una solución acuosa de eosina (al 1%, Sigma), se montaron en Mowiol.

Se cuantificó el grado de invasión celular en esponjas de PVA rellenas de fibrina mediante recuento de núcleos celulares teñidos con DAPI en 36 a 45 secciones histológicas (de 4 \mum de grosor) de explantes de tejido mediante análisis automatizado de imágenes.

Resultados

Tras 1 mes, los implantes protegidos con PEG se encontraban básicamente libres de células, mientras que en los implantes no protegidos, la fase fibrina de la esponja se encontraba completamente invadida por células densamente empaquetadas. Los análisis estadísticos demostraron diferencias altamente significativas (P=0,00004) entre las muestras y los controles positivos. En los puntos del tiempo siguientes, no se observaron esencialmente cambios en el número de células en los controles positivos. El valor medio (\pmSD) de las muestras de control era de (1,3\pm0,3)\cdot10^{6} células por mm^{3} (n=12).

La figura 2 muestra el número de células observado en cada esponja protegida por PEG como porcentaje del número medio en las muestras de control (círculos abiertos). Los porcentajes medios de cada punto del tiempo (\pmSD) se indican con cruces. Entre los meses 1 y 4, el número de células observado en las muestras se incrementó sólo ligeramente. Aunque se observó un claro incremento de la infiltración de células tras 6 meses, en la mayoría de las esponjas el número de células todavía era inferior a 1% del observado en el control positivo. Tras 7 meses, las membranas de PEG se habían desintegrado en su mayoría y el número de células se había incrementado a (2,8\pm4,7)% del observado en el control positivo. La fuerte variación entre muestras individuales en este punto del tiempo puede explicarse por ligeras variaciones en el tiempo hasta la degradación completa entre las membranas de PEG individuales. Bajo la definición de "oclusivo de células" como que permite la infiltración de menos del 1% de las células, puede concluirse que la membrana es oclusiva de las células durante aproximadamente 6 meses.

Claims

1. Membrana oclusiva de células, que se puede obtener mediante reacción de por lo menos dos precursores en presencia de agua, en la que:

un primer precursor A que comprende un núcleo que soporta n cadenas, presentando cada una un grupo insaturado conjugado o un enlace insaturado conjugado unido a cualquiera de los últimos 20 átomos de la cadena, y

un segundo precursor B que comprende un núcleo que soporta m cadenas, presentando cada una un grupo tiol unido a cualquiera de los últimos 20 átomos de la cadena, en el que:

m es mayor o igual a 2,

n es mayor o igual a 2,

m+n es mayor o igual a 5,

formando la reacción una red tridimensional con puntos de reticulación, caracterizada porque

cada núcleo de los precursores forma un punto de reticulación si m y n son mayores que 2, y

si m es igual a 2, el correspondiente punto de reticulación corresponde al núcleo del primer precursor A contiguo, y

si n es igual a 2, el punto de reticulación corresponde al núcleo del segundo precursor B contiguo, y

los puntos de reticulación contiguos se encuentran conectados por una cadena que presenta menos de 600 átomos.

2. Membrana según la reivindicación 1, caracterizada porque el grupo insaturado conjugado o un enlace insaturado conjugado es terminal.

3. Membrana según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el grupo tiol es terminal.

4. Membrana según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el primer precursor A presenta de 2 a 10 cadenas.

5. Membrana según la reivindicación 4, caracterizada porque el primer precursor A presenta de 2 a 8, preferentemente de 4 a 8 cadenas.

6. Membrana según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el segundo precursor B presenta de 2 a 10 cadenas.

7. Membrana según la reivindicación 6, caracterizada porque el segundo precursor B presenta de 2 a 8, preferentemente de 4 a 8, cadenas.

8. Membrana según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que puntos de reticulación contiguos se encuentran conectados por una cadena que presenta menos de 330 átomos.

9. Membrana según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que los puntos de reticulación contiguos se encuentran conectados por una cadena que presenta de 30 a 120 átomos.

10. Membrana según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que las cadenas del primer o el segundo precursor B son polímeros lineales.

11. Membrana según la reivindicación 10, caracterizada porque los polímeros del primer y/o segundo precursor B se seleccionan de entre el grupo constituido por polietilenglicol, poli(óxido de etileno), poli(alcohol vinílico), poli(etilén-co-alcohol vinílico), poli(ácido acrílico), poli(etilén-co-ácido acrílico), poli(etil-oxazolina), poli(vinilpirrolidona), poli(etilén-covinil-pirrolidona), poli(ácido maleico), poli(etilén-co-ácido maleico), poli(acrilamida) y copolímeros en bloque de poli(óxido de etileno)-copoli(óxido de propileno).

12. Membrana según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la cadena del primer y/o segundo precursor B es un residuo polietilenglicol.

13. Membrana según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el grupo insaturado conjugado o el enlace insaturado conjugado del primer precursor A es un acrilato, una acrilamida, una quinina, un 2-vinilpiridinio o 4-vinilpiridinio o un éster de itaconato.

14. Membrana según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el primer precursor A se selecciona de entre el grupo constituido por:

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15. Membrana según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el segundo precursor B se selecciona de entre el grupo constituido por:

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16. Procedimiento para preparar una membrana oclusiva de células según la reivindicación 1 mediante la mezcla del primer precursor A según se define en la reivindicación 1 y el segundo precursor B según se define en la reivindicación 1, en presencia de agua para formar la membrana oclusiva de células.

17. Procedimiento según la reivindicación 16, caracterizado porque el agua es una solución acuosa tamponada.

18. Kit para preparar una membrana oclusiva de células según la reivindicación 1, que comprende:

un segundo precursor B que comprende un núcleo que soporta m cadenas, presentando cada una un grupo tiol unido a cualquiera de los últimos 20 átomos de la cadena,

en el que:

m es mayor o igual a 2,

n es mayor o igual a 2, y

m+n es mayor o igual a 5, y

cada núcleo de los precursores forma un punto de reticulación si m y n son mayores de 2, y

los puntos de reticulación contiguos se encuentran conectados por una cadena con menos de 600 átomos,

y el primer precursor A y el segundo precursor B se encuentran separados entre sí,

caracterizado porque dicho kit comprende asimismo una solución acuosa tamponada y/o un modificador de viscosidad.

19.

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20.

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