ES2284201T3 - Composiciones de lipidos cationicos direccionadas a las celulas angiogenicas endoteliales. - Google Patents
Composiciones de lipidos cationicos direccionadas a las celulas angiogenicas endoteliales. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2284201T3 ES2284201T3 ES98910354T ES98910354T ES2284201T3 ES 2284201 T3 ES2284201 T3 ES 2284201T3 ES 98910354 T ES98910354 T ES 98910354T ES 98910354 T ES98910354 T ES 98910354T ES 2284201 T3 ES2284201 T3 ES 2284201T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- endothelial
- cells
- angiogenic
- liposomes
- liposome
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
- A61K49/0013—Luminescence
- A61K49/0017—Fluorescence in vivo
- A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
- A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
- A61K49/0032—Methine dyes, e.g. cyanine dyes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
- A61K47/543—Lipids, e.g. triglycerides; Polyamines, e.g. spermine or spermidine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
- A61K49/0013—Luminescence
- A61K49/0017—Fluorescence in vivo
- A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
- A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
- A61K49/0041—Xanthene dyes, used in vivo, e.g. administered to a mice, e.g. rhodamines, rose Bengal
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
- A61K49/0013—Luminescence
- A61K49/0017—Fluorescence in vivo
- A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
- A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
- A61K49/0041—Xanthene dyes, used in vivo, e.g. administered to a mice, e.g. rhodamines, rose Bengal
- A61K49/0043—Fluorescein, used in vivo
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
- A61K49/0063—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres
- A61K49/0069—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres the agent being in a particular physical galenical form
- A61K49/0076—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres the agent being in a particular physical galenical form dispersion, suspension, e.g. particles in a liquid, colloid, emulsion
- A61K49/0084—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres the agent being in a particular physical galenical form dispersion, suspension, e.g. particles in a liquid, colloid, emulsion liposome, i.e. bilayered vesicular structure
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
- A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
- A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers comprising non-phosphatidyl surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids or non-phosphatidyl liposomes coated or grafted with polymers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Un liposoma catiónico, que comprende: al menos 5% molar de al menos un lípido catiónico y opcionalmente lípidos neutros y un compuesto tóxico que destruye una célula angiogénica endotelial de un tumor, caracterizado por tener un potencial zeta mayor que 0 mV cuando está presente al pH fisiológico.
Description
Composiciones de lípidos catiónicos
direccionadas a las células angiogénicas endoteliales.
La presente invención puede aplicarse al
tratamiento de una diversidad de enfermedades y anormalidades
diferentes. En general, el cáncer se trata actualmente de modo
directo por medios físicos tales como extirpación quirúrgica del
tejido canceroso. Adicionalmente, puede tratarse el mismo por medios
químicos tales como la quimioterapia. Estos tratamientos, y otros
tratamientos afines están dirigidos, en general, a tratar
directamente el tejido canceroso. Con objeto de proporcionar una
comprensión del modo en que la presente invención se desvía de las
modalidades de tratamiento convencionales, se proporciona una
descripción breve y general de las tecnologías de tratamiento
actuales en estas áreas.
El término "cáncer" abarca un espectro de
enfermedades que varían en tratamiento, pronóstico, y curabilidad.
El enfoque para el diagnóstico y tratamiento depende del sitio de
origen del tumor, el grado de propagación, los sitios de
implicación, el estado fisiológico del paciente, así como del
pronóstico. Una vez diagnosticado, el tumor se "escalona"
usualmente, un proceso que implica utilizar las técnicas de cirugía,
examen físico, histopatología, formación de imagen, y evaluación en
laboratorio para definir el alcance de la enfermedad y dividir la
población de pacientes de cáncer en grupos por orden de probabilidad
de curación decreciente. Tales sistemas se utilizan tanto para
planificar el tratamiento como para determinar los pronósticos para
el paciente (Stockdale, F., 1996, "Principles of Cancer Patient
Management", en Scientific American Medicine, vol. 3, Dale,
D.C., and Federman, D.D. (compiladores), Scientific American Press,
Nueva York). El tipo o el escalón del cáncer pueden determinar cuál
de los tres tipos de tratamiento generales se utilizará: cirugía,
terapia de radiación, y quimioterapia. Puede elegirse también un
plan de tratamiento agresivo de modalidad combinada. A este fin,
puede utilizarse cirugía para extirpar el tumor primario, y las
células restantes se tratan con terapia de radiación o
quimioterapia (Rosenberg, S.A., 1985,
"Combined-modality therapy of cancer: what is and
when does it work?" New Engl. J. Med. 312:
1512-14).
La cirugía desempeña el papel central en el
diagnóstico y tratamiento del cáncer. En general, se requiere un
planteamiento quirúrgico para la biopsia, y la cirugía puede ser el
tratamiento definitivo para la mayor parte de los pacientes con
cáncer. La cirugía se utiliza también para reducir la masa del
tumor, para resecar las metástasis, para resolver las urgencias
médicas, para paliar y para rehabilitar. Aunque la técnica
quirúrgica primaria para el tratamiento del cáncer ha implicado el
desarrollo de un campo operativo en el que se practica la resección
de los tumores bajo visualización directa, las técnicas actuales
permiten la realización de algunas resecciones por medios
endoscópicos. Un problema fundamental en el tratamiento del cáncer
es la consideración del riesgo operativo (Stockdale, F.
supra).
La terapia de radiación juega un papel
importante en el tratamiento del cáncer tanto primario como
paliativo. Tanto la teleterapia (terapia de radiación con
megavoltaje) como la braquiterapia (radiación intersticial e
intracavitaria) son de uso común. La radiación electromagnética en
forma de rayos X se utiliza muy comúnmente en teleterapia para
tratar tumores malignos comunes, aun cuando se utilizan también los
rayos gamma, una forma de radiación electromagnética similar a los
rayos X pero emitida por isótopos radiactivos de radio, cobalto y
otros elementos. La terapia de radiación transfiere energía a los
tejidos como paquetes de energía discretos, llamados fotones, que
deterioran tanto los tejidos malignos como los normales por producir
ionización dentro de las células. La diana para los iones es muy
comúnmente el DNA; la terapia de radiación aprovecha el hecho de
que el deterioro por la radiación no es uniforme entre los tejidos
malignos y no malignos - las células que se dividen rápidamente son
más sensibles al deterioro del DNA que las células en reposo (Pass
H.I., 1993, "Photodynamic therapy in oncology: mechanisms and
clinical use", J. Natl. Cancer Instit. 85:
443-56). La terapia de radiación está asociada con
ventajas específicas así como con toxicidades importantes. La
radiación se prefiere en ciertas áreas anatómicas (v.g., el
mediastino), donde la radiación puede ser el único método local de
tratamiento factible, y la radiación puede ser también la única
modalidad local factible si la implicación del tumor es extensa. La
radiación puede utilizarse también cuando el paciente encuentra
inaceptable la cirugía, o cuando el estado médico del paciente hace
prohibitivo un procedimiento quirúrgico. El tratamiento por
radiación implica deterioro de los tejidos, que puede conducir a
efectos de radiación precoces y tardíos. Los efectos precoces
(toxicidad aguda de la terapia de radiación) incluyen eritema de la
piel, descamación, esofagitis, náusea, alopecia, y mielosupresión,
mientras que los efectos tardíos incluyen necrosis y fibrosis
tisular, y determinan usualmente la toxicidad límite de la terapia
de radiación (Stockdale, F. supra).
Prácticamente la totalidad de los agentes
quimioterapéuticos utilizados actualmente interfieren con la
síntesis del DNA, con la provisión de precursores para la síntesis
de DNA y RNA, o con la mitosis, y por consiguiente están
direccionados a las células proliferantes (Stockdale, F. "Cancer
growth and chemotherapy", supra). La investigación de
tumores animales y las pruebas clínicas humanas han demostrado que
las combinaciones de fármacos producen tasas más elevadas de
respuesta objetiva y una supervivencia más larga que los agentes
individuales (Frei, E. III, 1972, "Combination cancer therapy:
presidential address", Cancer Res. 32:
2593-2607). La terapia de combinación de fármacos
utiliza los diferentes mecanismos de acción y potenciales
citotóxicos de fármacos múltiples, con inclusión de agentes
alquilantes, antimetabolitos, y antibióticos (Devita, V.T., et
al., 1975, "Combination versus single agent chemotherapy; a
review of the basis for selection of drug treatment of cancer",
Cancer 35:98-110). La condición fisiológica
del paciente, las características del crecimiento del tumor, la
heterogeneidad de la población de células tumorales, y el estatus de
resistencia a fármacos múltiples del tumor influyen en la eficacia
de la quimioterapia. Generalmente, la quimioterapia no está
direccionada (aunque estas técnicas se encuentran en desarrollo,
v.g. Pastan, I. et al., 1986, "Immunotoxins",
Cell 47: 641-648), y pueden
producirse como resultado efectos secundarios tales como depresión
de la médula ósea, gastroenteritis, náusea, alopecia, deterioro del
hígado o el pulmón, o esterilidad.
Los regímenes del tratamiento arriba descritos
han alcanzado grados de éxito variables. Dado que la tasa de éxito
está muy lejos de ser perfecta, en muchos casos continúa la
investigación para desarrollar tratamientos mejores. Un área
prometedora de la investigación se refiere a la afección del sistema
inmunitario. Por el uso de ingeniería genética y/o estimulación
química es posible modificar y/o estimular respuestas inmunitarias
a fin de que el propio sistema inmune del cuerpo trate la enfermedad
v.g., anticuerpos que destruyan las células cancerosas. Este tipo
de tratamiento se desvía de los arriba descritos en el sentido que
utiliza un proceso biológico para combatir una enfermedad. Sin
embargo, el tratamiento es todavía un tratamiento directo, lo que
significa que los anticuerpos creados ataquen directamente las
células del cáncer.
La presente invención puede utilizarse para
tratamientos que implican una desviación radical de los tratamientos
normales en el sentido de que la presente invención no implica
afectar directamente a las células cancerosas, lesionadas o
inflamadas.
Otros han reconocido que, al menos en teoría, es
posible tratar el cáncer o la inflamación asociada con la
angiogénesis por inhibición de la angiogénesis. Un ejemplo típico
del pensamiento actual en relación con esta materia se expone en la
Publicación PCT WO 95/25543, publicada el 18 de septiembre de 1995.
Esta solicitud de patente publicada describe la inhibición de la
angiogénesis por administración de un anticuerpo que se fija a un
antígeno que se cree está presente en la superficie de las células
angiogénicas endoteliales. Específicamente, la solicitud describe
administrar un anticuerpo que se fija a \alpha_{V}\beta_{3},
que es un receptor de membrana que se cree media las interacciones
célula-célula y célula-matriz
extracelular a las que se hace referencia generalmente como sucesos
de adhesión celular. Por el bloqueo de este receptor, el tratamiento
confía en inhibir la angiogénesis y tratar con ello el cáncer y la
inflamación.
Se describe un liposoma catiónico, que comprende
al menos 5% molar de al menos un lípido catiónico y opcionalmente
lípidos neutros y un compuesto tóxico que destruye una célula
angiogénica endotelial de un tumor, caracterizado por tener un
potencial zeta mayor que 0 mV cuando está presente al pH fisiológico
y el uso del liposoma de la invención para suministrar
selectivamente el compuesto tóxico a las células angiogénicas
endoteliales de un tumor. El uso implica inyectar, preferiblemente
en el sistema circulatorio y más preferiblemente por vía
intraarterial, liposomas catiónicos que comprenden lípidos
catiónicos y un compuesto tóxico que destruye una célula
angiogénica endotelial de un tumor. Después de la administración,
los liposomas catiónicos se asocian selectivamente con células
angiogénicas endoteliales, lo que significa que los mismos se
asocian con las células angiogénicas endoteliales en una proporción
cinco veces mayor o más (preferiblemente diez veces mayor o más)
que aquélla con la que se asocian a las células endoteliales
correspondientes en reposo, que no experimentan angiogénesis.
Cuando los liposomas se asocian con las células angiogénicas
endoteliales, los mismos son absorbidos por la célula endotelial y
producen su efecto deseado. La sustancia puede destruir la célula
endotelial. La invención incluye una composición que afecta
selectivamente a las células angiogénicas endoteliales, que
comprenden lípidos catiónicos y una sustancia tóxica en donde la
composición tiene, en la sangre, mayor afinidad para las células
angiogénicas endoteliales en comparación con las células
endoteliales normales correspondientes, en donde la composición se
asocia selectivamente con las células angiogénicas endoteliales de
un vaso sanguíneo angiogénico durante cierto tiempo y de una manera
tal que la composición entra en las células angiogénicas
endoteliales. Esta composición está formulada preferiblemente para
administración por inyección en el sistema circulatorio de un
mamífero. La composición tiene preferiblemente en la sangre una
afinidad cinco veces mayor o más, y más preferiblemente diez veces
mayor o más para las células angiogénicas endoteliales en
comparación con las células endoteliales normales correspondientes.
La composición comprende preferiblemente 5% molar o más de lípidos
catiónicos.
Otro objeto adicional de la invención consiste
en utilizar un liposoma catiónico para destruir un tumor indeseable
por suministro de un compuesto tóxico a las células angiogénicas
endoteliales del tumor, compuesto que destruye las células
angiogénicas endoteliales y, después de ello, destruye las células
tumorales.
Una característica de la invención es que los
liposomas catiónicos de la invención se asocian selectivamente con
las células angiogénicas endoteliales con una preferencia mucho
mayor (cinco veces mayor o más, y preferiblemente diez veces mayor
o más) que aquélla con la que se asocian los mismos con las células
endoteliales correspondientes no implicadas en angiogénesis.
Una ventaja de la invención es que los liposomas
catiónicos de la invención pueden utilizarse para suministrar con
precisión pequeñas cantidades de compuestos tóxicos a las células
endoteliales, células que se ven afectadas de una manera (v.g.,
desactivadas) tal que el vaso sanguíneo se destruye o se hace
inoperante por ejemplo por un coágulo de sangre y el suministro de
nutrientes a los tejidos circundantes (tales como las células
tumorales) se suprime, destruyendo con ello el tejido (v.g.,
destruyendo un tumor sólido).
Otra ventaja de la invención es que los
liposomas catiónicos de la invención pueden utilizarse para inhibir
la angiogénesis asociada con tumores malignos o benignos asociados a
su vez con la angiogénesis en curso.
Una característica importante de la invención es
que varias clases de enfermedades y/o anormalidades se tratan sin
tratar directamente el tejido implicado en la anormalidad, v.g. por
inhibición de la angiogénesis se suprime el suministro de sangre a
un tumor y el tumor se destruye sin tratar directamente las células
tumorales de ningún modo.
Estos y otros objetos, ventajas y
características de la presente invención resultarán evidentes para
los expertos en la técnica después de la lectura de la descripción
proporcionada en esta memoria, en conexión con las figuras
adjuntas.
Las Figuras 1-10 se presentan en
este caso en una versión en color y una versión en blanco y negro.
Esto ha sido hecho debido a que la invención se comprende mejor
mediante fotografías en color, fotografías que pueden no ser
aceptables en la práctica actual de las solicitudes PCT. Las
fotografías en color para las Figuras 1-10 se
encuentran en la solicitud de patente U.S. número de serie
08/820.337, presentada el 12 de marzo de 1997. Adicionalmente,
fotografías en color que muestran claramente la mayor afinidad de
los complejos marcados de la invención para las células
angiogénicas endoteliales en comparación con las células
endoteliales normales correspondientes se muestran en Thurston,
et al., "Cationic Liposomes Target Angiogenic Endotelial
Cell in Tumors and Inflammation in Mice", J. Clin.
Invest., 1 de abril de 1998.
La Figura 1 es una micrografía de fluorescencia
que muestra la absorción de los complejos fluorescentes rojos
DDAB:colesterol-DNA marcados con
CM-DiI en vasos sanguíneos angiogénicos de un
folículo en un ovario de ratón normal (barra de escala: 60
\mum);
la Figura 2 es una micrografía de fluorescencia
que muestra la absorción de los complejos fluorescentes rojos
DDAB:colesterol-DNA marcados con
CM-DiI en vasos sanguíneos angiogénicos en una
sección de un tumor pancreático en un ratón
RIP1-Tag5 - los vasos están teñidos de verde con una
lectina fluorescente (barra de escala: 40 \mum);
la Figura 3 es una micrografía de fluorescencia
con bajo aumento que muestra la escasa o nula absorción de los
complejos DOTAP:colesterol-DNA marcados con Rojo
Texas (amarillo-anaranjado) en los vasos sanguíneos
de un islote pancreático de ratón normal (barra de escala: 150
\mum);
la Figura 4 es una micrografía de fluorescencia
con bajo aumento que muestra la absorción de los complejos
DOTAP:colesterol-DNA marcados con Rojo Texas
(amarillo-anaranjado) en los vasos sanguíneos de un
tumor pancreático en un ratón RIP1-Tag2 (barra de
escala: 150 \mum);
la Figura 5 es una micrografía confocal que
muestra la escasa o nula absorción de los liposomas DOTAP:colesterol
marcados con Rojo Texas (rojo-anaranjado) en un
islote pancreático normal; los vasos se tiñeron (verde) con lectina
fluorescente (barra de escala: 50 \mum);
la Figura 6 muestra una micrografía confocal de
la absorción de liposomas DOTAP:colesterol marcados con Rojo Texas
(rojo-anaranjado) en un tumor pancreático en un
ratón RIP1-Tag2. Los vasos se tiñeron por perfusión
de lectina fluorescente de Lycopersicum esculentum (verde)
después de inyectar los liposomas por vía intravenosa (barra de
escala: 50 \mum);
la Figura 7 muestra una micrografía confocal de
la absorción de liposomas DOTAP:colesterol marcados con Rojo Texas
(rojo-anaranjado) en un tumor pancreático en un
ratón RIP1-Tag2. Los vasos se tiñeron por perfusión
con lectina fluorescente de Lycopersicum esculentum (verde)
después de inyectar los liposomas por vía intravenosa (barra de
escala: 50 \mum);
la Figura 8 muestra una micrografía confocal de
la absorción de liposomas DOTAP:colesterol marcados con Rojo Texas
(rojo-anaranjado) en un tumor pancreático en un
ratón RIP1-Tag2. Los vasos se tiñeron por perfusión
con lectina fluorescente de Lycopersicum esculentum (verde)
después de inyectar los liposomas por vía intravenosa. Los sitios
posibles de crecimiento de vasos tienen una absorción intensa (barra
de escala: 50 \mum);
la Figura 9 muestra una micrografía confocal que
muestra la escasa absorción de liposomas DOTAP:colesterol marcados
con Rojo Texas (rojo-anaranjado) en vasos sanguíneos
normales en la tráquea de un ratón exento de patógenos; los vasos
se tiñeron de verde con una lectina fluorescente (barra de escala:
50 \mum);
la Figura 10 muestra una micrografía confocal de
la absorción de los liposomas DOTAP:colesterol marcados con Rojo
Texas (rojo-anaranjado) en vasos sanguíneos
angiogénicos en la tráquea de un ratón con infección de
Mycoplasma pulmonis (barra de escala: 50 \mum);
la Figura 11 es un gráfico que muestra el grado
de absorción de los liposomas DOTAP:colesterol marcados con Rojo
Texas por los vasos sanguíneos de tráqueas de ratón exento de
patógenos (normal) e infectado con Mycoplasma pulmonis
evaluada por medida de la intensidad de fluorescencia de los
liposomas 4 horas después de la inyección intravenosa. Las medidas
se realizaron con un microscopio confocal Zeiss LSM 410. Los ratones
infectados se inocularon por vía intranasal con organismos de M.
pulmonis y se examinaron 4 semanas después. El asterisco
designa una diferencia estadísticamente significativa (P < 0,05,
valor medio \pm SE, n = 4 ratones por grupo);
la Figura 12 es una micrografía electrónica de
transmisión que muestra liposomas DOTAP:colesterol asociados con
una célula endotelial en la tráquea de un ratón infectado con M.
pulmonis (barra de escala: 50 \mum); y
la Figura 13 es una micrografía electrónica de
transmisión que muestra liposomas DOTAP:colesterol absorbidos por
una célula endotelial en la traquea de un ratón infectado con M.
pulmonis (barra de escala: 80 \mum).
Antes de describir el método presente de afectar
selectivamente a las células angiogénicas endoteliales y los
liposomas utilizados en el método, debe entenderse que esta
invención no está limitada a los liposomas o métodos particulares
descritos, dado que los mismos pueden, por supuesto, variar. Debe
entenderse que la terminología utilizada en esta memoria tiene
solamente por objeto describir realizaciones particulares.
Debe tenerse en cuenta que, tal como se utiliza
en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las
formas singulares "un/una", "y" y "el/la" incluyen
referentes plurales a no ser que los contextos indiquen claramente
otra cosa. Así, por ejemplo, la referencia a "un liposoma"
incluye mezclas y grandes números de tales liposomas, la referencia
a "un agente" incluye grandes números de agentes y mezclas de
los mismos, y la referencia a "el método" incluye uno o más
métodos o pasos del tipo descrito en esta memoria.
Las publicaciones expuestas en esta memoria se
proporcionan únicamente por su descripción antes de la fecha de
presentación de la presente solicitud. Nada de lo contenido en esta
memoria debe interpretarse como una admisión de que la presente
invención no tenga derecho a retrotraerse a dicha publicación en
virtud de invención previa.
A no ser que sed defina de otro modo, todos los
términos técnicos y científicos empleados en esta memoria tienen el
mismo significado que es entendido comúnmente por una persona con
experiencia ordinaria en la técnica a la que pertenece esta
invención.
Los términos "tratamiento", "terapia",
"tratar" y análogos se utilizan en esta memoria para significar
generalmente la obtención de un efecto farmacológico y/o
fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos
de prevenir completa o parcialmente una enfermedad o síntoma de la
misma y/o puede ser terapéutico en términos de una estabilización o
curación parcial o completa de una enfermedad y/o efecto adverso
atribuible a la enfermedad. "Tratamiento", tal como se utiliza
en esta memoria abarca cualquier tratamiento de una enfermedad en un
mamífero, particularmente un humano, e incluye:
(a) prevenir que la enfermedad o síntoma se
presente en un individuo que puede ser propenso a la enfermedad o
síntoma pero no se le ha diagnosticado todavía dicho
padecimiento;
(b) inhibir el síntoma de la enfermedad, es
decir, detener su desarrollo; o
(c) aliviar el síntoma de la enfermedad, es
decir, causar la regresión de la enfermedad o síntoma.
El término "angiogénesis" hace referencia a
un proceso de vascularización tisular que implica el desarrollo de
nuevos vasos. La angiogénesis ocurre por uno de tres mecanismos: (1)
neovascularización, donde las células endoteliales migran fuera de
los vasos pre-existentes comenzando la formación de
nuevos vasos; (2) vasculogénesis, donde los vasos se producen a
partir de células precursoras de novo; o (3) expansión
vascular, donde pequeños vasos existentes aumentan en diámetro para
formar vasos mayores (Blood, C.H. y Zetter, B.R., 1990, Biochem.
Biophys. Acta, 1032: 89-118).
La angiogénesis es un proceso importante en los
procesos normales de crecimiento neonatal y en el sistema
reproductor femenino durante el ciclo de desarrollo del cuerpo lúteo
(véase Moses, M.A., et al., 1990, Science 248:
1408-10). En condiciones normales, todos los proceso
que implican la nueva formación o la remodelización de vasos
sanguíneos existentes o nuevos es un proceso
auto-limitante, y la expansión de los tipos
específicos de células está controlada y concertada.
La angiogénesis está involucrada también en la
curación de las heridas y en la patogénesis de un gran número de
enfermedades clínicas que incluyen inflamación tisular, artritis,
asma, crecimiento de tumores, retinopatía diabética, y otras
afecciones. Se hace referencia a las manifestaciones clínicas
asociadas con angiogénesis como enfermedades angiogénicas (Folkman,
J. y Klagsburn, M., 1987, Science, 235:
442-7).
Muchos experimentos han sugerido que los tejidos
pueden producir factores angiogénicos que promueven la angiogénesis
en condiciones de suministro deficiente de sangre durante
condiciones tanto normales como patológicas. Estos factores y
compuestos difieren en especificidad celular y en los mecanismos por
los cuales inducen el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos. Estos
factores funcionan por una diversidad de mecanismos. Por ejemplo,
aquéllos pueden inducir la migración y proliferación de células
endoteliales o estimular la producción de colagenasa (véase
Klagsburn, M., y D'Amore, P.A., 1991, "Regulators of
angiogenesis", Ann. Rev. Physiol. 53:
217-39). Existen numerosos bioensayos que permiten
la determinación directa de actividades angiogénicas (Wilting, J.,
et al., 1991, "A modified chorioallantoic membrane (CAM)
assay for qualitative and quantitative study of growth factors.
Studies on the effects of carriers, PBS, angiogenin, and bFGF",
Anat. Embriol. (Berl) 183:
259-71).
Se ha propuesto que los inhibidores angiogénicos
pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades. Por ejemplo,
la interferencia con la angiogénesis puede restringir el crecimiento
de los tumores. Han sido propuestos varios medios para inhibir la
angiogénesis, que incluyen (1) inhibición de la liberación de
factores angiogénicos, (2) neutralización de factores angiogénicos
utilizando medios tales como anticuerpos monoclonales, y (3)
inhibición de las respuestas de las células endoteliales (Folkman,
J., et al., 1992, Seminars in Cancer Biology 3:
89-96), mediante el uso de factores
anti-angiogénicos, moléculas que se sabe inhiben la
angiogénesis. Varios inhibidores de las células endoteliales de
este tipo han sido descritos, tales como el inhibidor de colagenasa,
inhibidores de la reposición de las membranas basales, esteroides
angiostáticos, inhibidores derivados de hongos, el factor 4 de las
plaquetas, trombospondina, fármacos contra la artritis tales como
penicilamina, y alfa-interferón, entre otros (véase
Folkman, J., et al., 1992, Seminars in Cancer Biology
3: 89-96; para ejemplos, véanse: Stepien,,
H., et al., 1996, "Inhibitory effects of fumagillin and its
analogue TNP-470 on the function, morphology, and
angiogenesis of an oestrogen-induced prolactinoma in
Fischer 344 rats", J. Endocrinol.
150:99-106; Maione, T.E., et al.,
1990, "Inhibition of angiogenesis by recombinant human platelet
factor-4 and related peptides", Science
247: 77-9).
El término "células endoteliales" significa
aquellas células que constituyen el endotelio, la monocapa de
células escamosas simples que reviste la superficie interna del
sistema circulatorio. Estas células retienen capacidad de división
celular, aunque proliferan muy lentamente en condiciones normales,
sufriendo división celular quizás una sola vez al año. La
proliferación de las células endoteliales puede demostrarse
utilizando [^{3}H]-timidina para marcar células
en la fase S. En los vasos normales, la proporción de células
endoteliales que llegan a marcarse es especialmente alta en puntos
de ramificación de las arterias, donde la turbulencia y el desgaste
parecen estimular la renovación. (Goss, R.J., 1978, The
Physiology of Growth, Academic Press, Nueva York, pp.
120-137). Las células endoteliales normales están en
reposo, es decir no se dividen y como tales pueden distinguirse de
las células angiogénicas endoteliales como se expone más
adelante.
Las células endoteliales tienen también
capacidad de migrar, un proceso importante en la angiogénesis. Las
células endoteliales forman nuevos capilares in vivo cuando
hay necesidad de los mismos, por ejemplo durante la reparación de
heridas o cuando se percibe necesidad de aquéllos como ocurre en la
formación de tumores. La formación de nuevos vasos se conoce como
angiogénesis, e implica moléculas (factores angiogénicos) que
pueden ser mitógenas o quimioatractivas para las células
endoteliales (Klagsburn, supra). Durante la angiogénesis,
las células endoteliales pueden migrar fuera de un capilar existente
para comenzar la formación de un nuevo vaso, es decir, las células
de un vaso migran de una manera que permite la extensión de dicho
vaso (Speidel, C.C., Am. J. Anat. 52: 1-79).
Estudios in vitro han documentado tanto la proliferación como
la migración de células endoteliales; las células endoteliales
puestas en cultivo pueden proliferar y desarrollar espontáneamente
tubos capilares (Folkman, J., Haudenschild, C., 1980, Nature
288: 551-56).
Las expresiones "células angiogénicas
endoteliales" y "células endoteliales que sufren
angiogénesis" y análogas se utilizan intercambiablemente en esta
memoria para significar células endoteliales (como se ha definido
arriba) que sufren angiogénesis (como se ha definido arriba). Así,
las células angiogénicas endoteliales son células endoteliales que
están proliferando a una velocidad muy superior a la condición
normal de sufrir división celular aproximadamente una vez al año.
La velocidad de diferenciación respecto a la proliferación normal
de las tasas endoteliales puede ser 2x, 5x o 10x o más que la de
proliferación normal y puede variar notablemente dependiendo de
factores tales como la edad y el estado del paciente, el tipo de
tumor implicado, el tipo de herida, etc. Con tal que la diferencia
en el grado de proliferación entre las células endoteliales normales
y las células angiogénicas endoteliales pueda medirse y se
considere biológicamente importante, entonces los dos tipos de
células pueden ser diferenciados por la presente invención, es
decir, las células angiogénicas endoteliales pueden ser
diferenciadas de las células endoteliales normales en reposo
correspondientes en términos de fijación preferente de liposomas
catiónicos.
Las expresiones "células endoteliales
correspondientes", "células endoteliales normales o en
reposo" y análogas se utilizan con objeto de hacer referencia a
células endoteliales normales en reposo contenidas en el mismo tipo
de tejido (en condiciones normales) cuando algunas de las células
endoteliales están sufriendo angiogénesis y algunas de las células
endoteliales se encuentran en reposo. En el contexto de la presente
invención, las células angiogénicas endoteliales están
direccionadas preferentemente y están direccionadas con una
preferencia que es 5 veces, o preferiblemente 10 veces mayor que el
direccionamiento de las células endoteliales correspondientes en
reposo.
El término "lípido" se utiliza en su
sentido convencional como un término genérico que abarca grasas,
lípidos, los constituyentes del protoplasma solubles en
alcohol-éter, que son insolubles en agua. Los lípidos comprenden
las grasas, aceites grasos, aceites esenciales, ceras, esteroides,
esteroles, fosfolípidos, glicolípidos, sulfolípidos, aminolípidos,
cromolípidos (lipocromos), y ácidos grasos. El término abarca
lípidos tanto existentes naturalmente como producidos por síntesis.
Lípidos preferidos en conexión con la presente invención son:
fosfolípidos, con inclusión de fosfatidilcolinas y
fosfatidiletanolaminas, y esfingomielinas. En los casos en que se
trata de ácidos grasos, los mismos podrían tener una longitud de
12-24 carbonos, conteniendo hasta 6 insaturaciones
(enlaces dobles), y estar enlazados a la cadena principal por
enlaces acilo o éter. Donde existe más de un ácido graso enlazado a
la cadena principal, los ácidos grasos podrían ser diferentes
(asimétricos), o podría estar presente una sola cadena de ácido
graso, v.g. en las lisolecitinas. Son también posibles formulaciones
mixtas, particularmente cuando los lípidos no catiónicos se derivan
de fuentes naturales, tales como lecitinas (fosfatidilcolinas)
purificadas a partir de yema de huevo, corazón, cerebro o hígado de
bovino, o soja. Los esteroides y esteroles, particularmente el
colesterol, y esteroles sustituidos en la posición 3b.
El término "lípido catiónico" se utiliza en
esta memoria para abarcar cualquier lípido de la invención (como se
ha definido arriba) que es catiónico. El lípido se determinará como
catiónico cuando el lípido tiene una carga positiva (al pH
fisiológico) tal como puede medirse por instrumentación utilizada en
el momento de la medida. En los casos en que existen ácidos grasos
presentes en el lípido catiónico, los mismos pueden tener una
longitud de 12-24 carbonos, conteniendo hasta 6
insaturaciones (enlaces dobles), y estar unidos a la cadena
principal por enlaces acilo o éter; podría existir también una sola
cadena de ácido graso enlazada a la cadena principal. Donde existe
más de un ácido graso enlazado a la cadena principal, los ácidos
grasos podrían ser diferentes (asimétricos). Son también posibles
formulaciones mixtas.
El término "liposoma" abarca cualquier
compartimiento cerrado por una bicapa lipídica. Se hace también
referencia a los liposomas como vesículas lipídicas. Para formar un
liposoma, las moléculas lipídicas comprenden porciones alargadas no
polares (hidrófobas) y porciones polares (hidrófilas). Las porciones
hidrófobas e hidrófilas de la molécula se posicionan
preferiblemente en dos extremos de una estructura molecular
alargada. Cuando dichos lípidos se dispersan en agua, forman
espontáneamente membranas bicapa a las que se hace referencia como
laminillas. Las laminillas están compuestas de dos hojas de monocapa
de moléculas lipídicas con sus superficies no polares (hidrófobas)
enfrentadas una a otra y sus superficies polares (hidrófilas)
enfrentadas al medio acuoso. Las membranas formadas por los lípidos
encierran una porción de la fase acuosa de una manera similar a la
de una membrana celular que encierra los contenidos de una célula.
Así, la bicapa de un liposoma tiene semejanzas a una membrana
celular sin los componentes proteínicos presentes en una membrana
celular. Tal como se utiliza en conexión con la presente invención,
el término liposoma incluye liposomas multilaminares, que tienen
generalmente un diámetro comprendido en el intervalo de 1 a 10
micrómetros y comprenden cualquier número entre 2 y centenares de
bicapas lipídicas concéntricas que alternan con capas de una fase
acuosa, e incluye también vesículas unilaminares que están
constituidas por una sola capa lipídica y tienen generalmente un
diámetro de 20 a 100 nanómetros, vesículas que pueden producirse
sometiendo los liposomas multilaminares a ultrasonidos.
Los liposomas preferidos podrían ser vesículas
unilaminares pequeñas (SUVs) que tienen una sola bicapa lipídica, y
un diámetro en el intervalo de 25-200 nm.
Los liposomas catiónicos pueden definirse
funcionalmente por tener un potencial zeta mayor que 0 mV.
El término "liposoma catiónico", tal como
se utiliza en esta memoria, tiene por objeto abarcar cualquier
liposoma como se define arriba que es catiónico. El liposoma se
determina como catiónico cuando está presente al pH fisiológico.
Debe indicarse que el liposoma propiamente dicho es la entidad que
se determina como catiónica, lo que significa que el liposoma que
tiene una carga positiva medible a su pH fisiológico puede, en un
entorno in vivo, llegar a unirse a otras sustancias. Dichas
otras sustancias pueden estar cargadas negativamente y dar con ello
como resultado la formación de una estructura que no tiene una carga
positiva. La carga y/o estructura de un liposoma de la invención
presente en un entorno in vivo no ha sido determinada con
precisión. Sin embargo, de acuerdo con la invención, un liposoma
catiónico de la invención se producirá utilizando al menos algunos
lípidos que son en sí mismos catiónicos. El liposoma no precisa
estar constituido completamente por lípidos catiónicos, pero debe
comprender una cantidad suficiente de un lípido catiónico tal que
cuando se forma el liposoma y se pone en el interior de un entorno
in vivo al pH fisiológico, el liposoma tiene inicialmente
una carga positiva.
El término "se asocia con" hace referencia
a la acción de los liposomas catiónicos de la invención que se
mantienen en proximidad suficientemente estrecha a células
angiogénicas endoteliales durante periodos de tiempo
suficientemente largos tales que el liposoma y/o su contenido entran
en la célula endotelial. Los liposomas de la invención pueden
asociarse con células angiogénicas endoteliales en una diversidad de
circunstancias pero, muy preferiblemente, se asocian con la célula
angiogénica endotelial cuando se encuentran en condiciones in
vivo. Así, el liposoma puede estar modificado por la unión,
fijación o asociación de otras moléculas o materiales presentes en
el torrente sanguíneo antes de la asociación con la célula
angiogénica endotelial. Una diversidad de fuerzas pueden ser
responsables de la asociación de los liposomas con células
angiogénicas endoteliales tales como las interacciones
inespecíficas que ocurren entre dos moléculas cualesquiera no
relacionadas, es decir, otras macromoléculas tales como
seroalbúmina humana y transferrina humana. Estas fuerzas
intermoleculares pueden clasificarse en cuatro áreas generales que
son (1) electrostáticas; (2) enlaces de hidrógeno; (3) hidrófobas;
y (4) de Van der Waals. Las fuerzas electrostáticas se deben a la
atracción entre grupos iónicos con cargas opuestas tales como entre
grupos cargados opuestamente en un liposoma catiónico y grupos
presentes en la superficie o en el interior de la célula
angiogénica endotelial. La fuerza de atracción (F) es inversamente
proporcional al cuadrado de la distancia (d) entre las cargas. Las
fuerzas de enlaces de hidrógeno son proporcionadas por la formación
de puentes de hidrógeno reversibles entre grupos hidrófilos. Los
liposomas de la invención pueden incluir grupos hidrófilos tales
como -COOH y pueden estar presentes grupos similares en la
superficie de las células endoteliales al igual que pueden estarlo
los grupos -OH, -NH_{2}. Estas fuerzas dependen en gran parte
del posicionamiento estrecho de dos moléculas portadoras de estos
grupos. Las fuerzas hidrófobas operan del mismo modo que las
gotitas de aceite en agua se fusionan para formar una sola gota de
mayor tamaño. De acuerdo con ello, los grupos hidrófobos no polares
tal como están presentes en los liposomas de la invención tienden a
asociarse en un entorno acuoso y pueden tender a asociarse con
grupos hidrófobos presentes en la superficie de las células
endoteliales. Por último, las fuerzas de Van der Waals se crean
entre moléculas que dependen de interacciones entre las nubes
electrónicas externas.
La expresión "se asocia selectivamente" y
"se direcciona selectivamente" y análogas se utilizan en esta
memoria para describir una propiedad de los liposomas catiónicos de
la invención que causa que los liposomas catiónicos se asocien con
células angiogénicas endoteliales en un grado mayor que aquél con el
que los liposomas catiónicos se asocian con las células
endoteliales normales correspondientes no implicadas en
angiogénesis. De acuerdo con la invención, asociación selectiva o
preferencial significa que el liposoma se asociará en un grado cinco
veces mayor o más con las células endoteliales que sufren
angiogénesis en comparación con las células endoteliales normales
correspondientes que no sufren angiogénesis. Más preferiblemente, la
asociación preferible o selectiva indica una selectividad diez
veces mayor o más entre las células angiogénicas endoteliales y las
células endoteliales normales correspondientes.
El término "cáncer" hace referencia a una
enfermedad de proliferación celular inadecuada. Esta perturbación
es muy evidente clínicamente cuando el volumen de tejido tumoral
pone en riesgo la función de órganos vitales. Los conceptos que
describen el crecimiento tisular normal son aplicables al tejido
maligno dado que los tejidos normales y malignos pueden compartir
características de crecimiento similares, tanto a nivel de la célula
individual como al nivel del tejido. El cáncer es tanto una
enfermedad de regulación desordenada del crecimiento tisular como
de regulación desordenada del crecimiento celular. El tiempo de
duplicación hace referencia al tiempo requerido para que un tejido
o tumor se duplique en tamaño o número de células. El tiempo de
duplicación de un tumor clínicamente evidente es usualmente
considerablemente mayor que el tiempo del ciclo celular de las
células de las que está compuesto el tumor. Sin embargo, al
contrario que un tumor, el hígado, el corazón o los pulmones
normales en un adulto no tienen un tiempo de duplicación dado que
los órganos se encuentran en estado estacionario, de tal manera que
las velocidades de producción celular y muerte celular son iguales
(Stockdale, F., 1996, "Cancer growth and chemotherapy", en:
Scientific American Medicine, vol. 3, Scientific American
Press, Nueva York, pp. 12-18). Las características
de crecimiento de los tumores son tales que la producción de
células nuevas excede a la muerte celular; un suceso neoplástico
tiende a producir un aumento en la proporción de células madre que
sufren auto-renovación y una disminución
correspondiente en la proporción que progresa hasta la maduración
(McCulloch, E.A., et al., 1982, "The contribution of blast
cell properties to outcome variation in acute myelobastic leukemia
(AML)", Blood 59: 601-608). Para
cada población tumoral, existe un tiempo de duplicación y puede
establecerse una curva específica de crecimiento (Stockdale, F.,
supra). El patrón de crecimiento de los tumores puede
describirse por una curva de Gompertz (Steel, GG, 1977, Growth
kinetics of tumors, Oxford University Press, Inc., Nueva York,
p. 40), que indica que durante el desarrollo de un tumor la
velocidad de crecimiento es inicialmente muy rápida y decrece luego
progresivamente a medida que aumenta el tamaño.
Las figuras adjuntas proporcionan una
representación visual clara de la manera altamente selectiva en la
que los liposomas catiónicos de la invención están direccionados a
las células angiogénicas endoteliales. Una realización básica de la
invención implica un método de afectar selectivamente a las células
angiogénicas endoteliales por administración (preferiblemente por
inyección intravascular, más preferiblemente inyección
intraarterial) de una formulación que comprende un vehículo
farmacéuticamente aceptable y liposomas catiónicos que contienen un
compuesto tóxico. Los liposomas catiónicos dentro de la formulación
inyectada se dejan entrar luego en las células angiogénicas
endoteliales (por endocitosis) que revisten las paredes de los vasos
sanguíneos angiogénicos. Los liposomas catiónicos se asocian con
las células angiogénicas endoteliales durante un periodo de tiempo
suficiente y de una manera tal que los liposomas propiamente dichos
y/o los contenidos de los liposomas entran en la célula angiogénica
endotelial. Después de ello, el compuesto que entra en la célula
puede inhibir o promover la angiogénesis o proporcionar meramente
un marcador que permite la detección del sitio de angiogénesis. La
selectividad del direccionamiento de las células angiogénicas
endoteliales puede comprenderse mejor haciendo referencia a las
figuras adjuntas.
La Figura 1 muestra una porción de un ovario de
ratón que tiene un gran folículo redondo (en amarillo) posicionado
en el mismo. Dado que la angiogénesis está ocurriendo dentro de un
ovario de ratón normal, los liposomas catiónicos que contienen un
marcador detectable se asocian con las células angiogénicas
endoteliales de los vasos sanguíneos del folículo en crecimiento
(rojo-anaranjado). No obstante, en la Figura 1 no es
posible determinar claramente si el marcador está asociado
únicamente con las células angiogénicas endoteliales o si el mismo
está asociado con la totalidad del tejido dentro del ovario y el
folículo.
La Figura 2 es una micrografía de fluorescencia
que muestra una sección de un tumor pancreático de un ratón que fue
inyectado por vía intravenosa con liposomas catiónicos
(rojo-anaranjado) de la invención que contenían un
marcador detectable. La angiogénesis ocurre fácilmente dentro de los
tumores. Así, esta fotografía proporciona cierta indicación de que
los liposomas catiónicos (rojo-anaranjado) de la
invención se asocian específicamente con las células angiogénicas
endoteliales (verde). Sin embargo, estos resultados no demuestran
espectacularmente la especificidad de la invención.
Una comparación de las Figuras 3 y 4 demuestra
la capacidad de la invención para localizar un sitio de
angiogénesis. la Figura 3 es una fotografía que muestra vasos
sanguíneos dentro del tejido pancreático normal de un ratón. Existe
mucha menos marcación de las células endoteliales normales que la
correspondiente a las células angiogénicas endoteliales. Esto se
demuestra claramente por comparación de la Figura 3 con la Figura 4
que es una fotografía de un tumor pancreático en un ratón. la
Figura 4 muestra claramente un alto grado de acumulación del
marcador (amarillo-anaranjado) contenido dentro de
los liposomas catiónicos en el área de un tumor. La diferencia
espectacular entre las Figuras 3 y 4 indica la utilidad de la
presente invención para marcar claramente y con precisión el sitio
de un tumor. Sin embargo, dado que una proporción tan grande del
marcador está asociada con los vasos sanguíneos angiogénicos en la
Figura 4, no puede ser posible apreciar en toda su extensión la
especificidad de los liposomas catiónicos para direccionarse
preferentemente a las células angiogénicas endoteliales.
la Figura 5 es una fotografía de vasos
sanguíneos (verde) en un islote pancreático de ratón normal. La
pequeña cantidad de coloración rojo-anaranjada
indica la asociación limitada de los liposomas catiónicos con las
células endoteliales normales que revisten los vasos sanguíneos del
tejido pancreático.
La especificidad de los liposomas catiónicos que
contienen un marcador detectable se muestra más claramente por
comparación de la Figura 5 con la Figura 6. la Figura 6 muestra
claramente un grado mucho mayor de acumulación del marcador en las
células endoteliales de los vasos sanguíneos angiogénicos del tumor
en el interior del páncreas de un ratón.
La capacidad exacta de los liposomas catiónicos
para direccionarse a las células angiogénicas endoteliales se
muestra espectacularmente en las Figuras 7 y 8. la Figura 7 muestra
claramente que el marcador fluorescente se asocia sólo con los
vasos sanguíneos, es decir, el marcador no se escapa o migra al
tejido circundante. La especificidad se muestra del modo más
espectacular en la Figura 8, que está enfocada claramente en los
liposomas catiónicos marcados detectados en el interior de células
angiogénicas endoteliales, demostrando que el marcador es
específico para dichas células y no se escapa o migra al tejido
circundante.
Las Figuras 9 y 10 demuestran el mismo efecto
arriba descrito pero con un modelo de angiogénesis diferente. Las
Figuras 1 a 8 estaban dirigidas todas a tejido normal o canceroso.
Las Figuras 9 y 10, respectivamente, muestran tejido normal e
inflamado de la traquea de un ratón. Más específicamente, la Figura
9 muestra los vasos sanguíneos normales de una tráquea, es decir,
una tráquea de ratón exenta de patógenos. la Figura 10 muestra los
vasos sanguíneos de una tráquea en el caso de existencia de
angiogénesis inducida por infección. Es evidente la mayor
concentración del marcador detectable en la Figura 10, indicando que
los liposomas catiónicos de la invención se asocian selectivamente
con las células angiogénicas endoteliales - asociándose
específicamente con las células endoteliales de la tráquea que ha
sido inducida a angiogénesis por una infección.
La Figura 11 es un gráfico que representa la
diferencia en la especificidad de los liposomas catiónicos entre su
capacidad para asociarse con las células angiogénicas endoteliales y
las células endoteliales normales correspondientes que no sufren
angiogénesis. Como se muestra en la Figura 11, los liposomas
catiónicos de la invención (por este experimento) han demostrado
una afinidad aproximadamente 10 veces mayor para las células
angiogénicas endoteliales en comparación con las células
endoteliales correspondientes que no sufren angiogénesis.
Por último, las Figuras 12 y 13 muestran de qué
modo los liposomas catiónicos de la invención entran en las células
angiogénicas endoteliales. En la Figura 12, los liposomas catiónicos
han establecido contacto con la superficie de la célula angiogénica
endotelial. En la Figura 13, los liposomas catiónicos han entrado en
la célula angiogénica endotelial por endocitosis y están presentes
en el interior de la célula.
Una vez que se ha expuesto verbalmente y se ha
demostrado por medio de figuras la especificidad de los liposomas
catiónicos de la invención, los expertos en la técnica podrán
producir una diversidad de liposomas catiónicos diferentes que
contienen una diversidad de compuestos tóxicos diferentes a fin de
hacer uso de la invención. Sin embargo, para completar la misma, se
da a continuación una descripción de liposomas catiónicos y sus
métodos de fabricación, seguida por una descripción de sustancias
que inhiben o promueven la angiogénesis.
Los liposomas pueden formarse fácilmente
poniendo lípidos (como se han definido arriba) que incluirán lípidos
catiónicos (como se han definido arriba) en solución acuosa y
agitando la solución durante un periodo de tiempo de varios
segundos a varias horas. El procedimiento simple produce
espontáneamente liposomas o vesículas grandes, multilaminares, con
diámetros comprendidos en el intervalo de aproximadamente 1 a 10
micrómetros. Estos liposomas están constituidos por dos a varios
centenares de bicapas lipídicas concéntricas que pueden alternar con
capas de la fase acuosa dentro de la cual estaban presentes los
lípidos. Una sustancia tal como un compuesto que inhibe la
angiogénesis, promueve la angiogénesis o proporciona un marcador
detectable puede incluirse dentro de la fase acuosa. La sustancia
es preferiblemente soluble en agua o puede, al menos, dispersarse
fácilmente en agua.
El espesor de la capa acuosa y por consiguiente
la cantidad total de fase acuosa atrapada en el interior del
liposoma, depende del balance de las fuerzas electrostáticas de
repulsión entre los lípidos cargados y las fuerzas atractivas de
Van der Waals entre las bicapas como un todo. Así, la separación
acuosa (y por consiguiente el volumen de material acuoso atrapado)
aumenta con la proporción creciente de lípidos cargados en la
membrana y con las concentraciones decrecientes de electrólitos
(iones cargados) en la fase acuosa. Los liposomas o vehículos de
pequeño tamaño formados son unilaminares y tienen un tamaño
comprendido en el intervalo de aproximadamente 20 a 100 nanómetros,
y pueden producirse sometiendo las vesículas
multi-laminares a ultrasonidos. Pueden obtenerse
liposomas unilaminares mayores que tienen un tamaño comprendido en
el intervalo de aproximadamente 0,1 a 1 \mum de diámetro, cuando
el lípido se solubiliza en un disolvente orgánico o un detergente y
el agente solubilizado se separa por evaporación o diálisis,
respectivamente. La fusión de liposomas unilaminares más pequeños
por métodos que requieren lípidos particulares o condiciones
severas de deshidratación-hidratación puede
proporcionar vasos unilaminares tan grandes o mayores que las
células.
Con objeto de formar los liposomas catiónicos de
la invención, es necesario que los liposomas se produzcan
utilizando al menos algún lípido catiónico. Sin embargo, los
liposomas catiónicos de la invención no precisan estar constituidos
enteramente por lípidos catiónicos. Por ejemplo, la utilización de
lípidos neutros en una cantidad de aproximadamente 45% y lípidos
catiónicos en una cantidad de aproximadamente 55%, proporcionará
lípidos catiónicos que son útiles en conexión con la invención y
están direccionados preferentemente a las células angiogénicas
endoteliales.
La composición de los liposomas catiónicos con
una sustancia que afecta a la angiogénesis y/o un marcador incluye
la preparación de liposomas en la cual los liposomas se preparan de
acuerdo con tecnología estándar por la cual, por ejemplo, se
mezclan soluciones de cloruro de
1-{2-(9(Z)-octadecenoiloxi)etil}-2-(8(Z)-heptadecenil)3-(2-hidroxietil)imidazolinio
(DOTAP), colesterol, y Rojo Texas DHPE, se evaporan a sequedad y la
película lipídica se rehidrata subsiguientemente en dextrosa al 5%
para producir vesículas multi-laminares. Estas
vesículas se extruyen a través de filtros de membrana de
policarbonato para proporcionar vesículas unilaminares. Los
liposomas y la sustancia a incorporar, por ejemplo DNA plasmídico,
se mezclan juntos en relaciones específicas en una solución de
dextrosa al 5% u otro excipiente fisiológicamente aceptable.
Lípidos catiónicos útiles incluyen: DDAB, bromuro de
dimetildioctadecil-amonio [disponible de Avanti
Polar Lipids y Sigma Chemical Company],
1,2-diacil-3-trimetilamonio-propanos
(con inclusión, pero sin carácter limitante, de dioleoil (DOTAP),
dimiristoil, dipalmitoil, diestearoil) [todos los cuales están
disponibles de Avanti Polar Lipids],
1,2-diacil-3-dimetilamonio-propanos
(con inclusión, pero sin carácter limitante, de dioleoil,
dimiristoil, dipalmitoil, diestearoil) [todos los cuales están
disponibles de Avanti Polar Lipids] DOTMA, cloruro de
N-[1-[2,3-bis(oleoiloxi)]propil]-N,N,N-trimetilamonio,
DOGS, dioctadecilamidoglicilespermina [disponible de Promega
Corporation] DC-colesterol,
3\beta-[N-(N',N'-dimetil-aminoetano)carbamoil]colesterol
DOSPA,
2,3-dioleoiloxi-N-(2(esperminacarboxamido)-etil)-N,N-dimetil-1-propanami-niotrifluoroacetato,
1,2-diacil-sn-glicero-3-etilfosfo-colinas(con
inclusión, pero sin carácter limitante, de dioleoil (DOEPC),
dilauroil, dimiristoil, dipalmitoil, diestearoil,
palmitoil-oleoil) [todas las cuales están
disponibles de Avanti Polar Lipids],
\beta-alanil-colesterol, CTAB,
bromuro de cetil-trimetil-amonio,
diC14-amidina,
N-t-butil-N'-tetradecil-3-tetradecilaminopropionamidina,
14Dea2, cloruro de
O,O'-ditetradecanolil-N-(trimetil-aminoacetil)-dietanolamina,
yoduro de
(N,N,N',N'-tetra-metil-N,N'-bis(2-hidroxietil)-2,3-dioleoiloxi-1,4-butano-diamonio
[disponible de Promega Corporation], derivados de cloruro de
1-[2-aciloxi)etil]2-alquil-(alquenil)-3-(2-hidroxietil)imidazolinio
tales como cloruro de
1-[2-(9(Z)-octadecenoiloxi)etil]-2-(8(Z)-heptadecenil-3-(2-hidroxietil)imidazolinio
(DOTIM), cloruro de
1-[2-(hexadecanoiloxi)etil]-2-pentadecil-3-(2-hidroxietil)imi-dazolinio
(DPTIM), cloruro de
1-[2-tetradecanoiloxi)-etil]-2-tridecil-3-(2-hidroxietil)imidazolinio
(DMTIM) - estos tres lípidos se describen en Solodin et al.,
Biochem 43, 13537-13544, 1995. Éste es de Tim
Heath's Lab en Wisconsin; Megabios han adquirido las patentes para
algunas de sus invenciones de lípidos.
Derivados de compuestos de
2,3-dialquiloxipropil-amonio
cuaternario, que contienen un resto hidroxialquilo en la amina
cuaternaria, tales como:
bromuro de
l,2-dioleoil-3-dimetil-hidroxietil-amonio
(DORI);
bromuro de
l,2-dioleiloxipropil-3-dimetil-hidroxietil-amonio
(DORIE);
bromuro de
l,2-dioleiloxipropil-3-dimetil-hidroxipropil-amonio
(DORIE-HP);
bromuro de
l,2-dioleiloxipropil-3-dimetil-hidroxibutil-amonio
(DORIE-HB);
bromuro de
l,2-dioleiloxipropil-3-dimetil-hidroxipentil-amonio
(DORIE-HPe);
bromuro de
l,2-dimiristiloxipropil-3-dimetil-hidroxil-etil-amonio
(DMRIE);
bromuro de
l,2-dipalmitiloxipropil-3-dimetil-hidroxietil-amonio
(DPRIE);
bromuro de
l,2-disteriloxipropil-3-dimetil-hidroxietil-amonio
(DSRIE) - estos lípidos fueron desarrollados por Vical, Felgner
et al., J. Biol. Chem. 269, 2550-2561,
1994.
Los liposomas catiónicos se preparan a partir de
los lípidos catiónicos propiamente dichos, o en mezcla con otros
lípidos, particularmente lípidos neutros tales como:
1,2-diacil-sn-glicero-fosfoetanolaminas
(con inclusión, pero sin carácter limitante, de dioleoil (DOPE));
una gran familia de derivados está disponible de Avanti Polar
Lipids);
1,2-diacil-sn-glicero-3-fosfocolinas
(una gran familia de derivados está disponible de Avanti Polar
Lipids);
N.B. Podrían incluirse ácidos grasos
asimétricos, tanto sintéticos como naturales, y formulaciones
mixtas, para los diacil-derivados anteriores.
Liposomas del tipo arriba descrito y de otros
tipos que pueden ser ideados por los expertos en la técnica pueden
utilizarse en la presente invención con los liposomas que contienen
una sustancia que promueve o inhibe la angiogénesis y/o incluye un
marcador detectable. Un ejemplo de liposomas de la invención son
liposomas catiónicos que contienen una sustancia soluble en lípidos
o soluble en agua que inhibe la angiogénesis. Sin embargo, los
compuestos solubles en lípidos pueden encontrarse en la bicapa
lipídica. Lo que sigue proporciona una descripción de inhibidores
de la angiogénesis. Sin embargo, debe indicarse que otros serán
ideados por los expertos en la técnica y/o serán desarrollados con
posterioridad a la presente invención, y que tales inhibidores de
la angiogénesis podrían ser utilizados fácilmente en conexión con la
presente invención.
La cantidad de inhibidor o promotor de la
angiogénesis administrada a un paciente (que puede ser cualquier
animal con un sistema circulatorio que contenga células endoteliales
que sufren angiogénesis) variará dependiendo de una extensa gama de
factores. Por ejemplo, sería necesario proporcionar dosis
sustancialmente mayores a los humanos que a animales más pequeños.
La cantidad de inhibidor o promotor de la angiogénesis dependerá
del tamaño, la edad, el sexo, el peso y la condición del paciente
así como de la potencia de la sustancia que se administre. Una vez
indicado que existe una variabilidad considerable en términos de
dosificación, se cree que los expertos en la técnica pueden,
utilizando la presente exposición, determinar fácilmente la
dosificación apropiada administrando primeramente cantidades
extremadamente pequeñas y aumentando progresivamente la dosis hasta
que se obtienen los resultados deseados. Aunque la cantidad de dosis
variará notablemente sobre la base de factores como los arriba
descritos, en general, la presente invención hace que sea posible
administrar cantidades sustancialmente cantidades sustancialmente
menores de cualquier sustancia en comparación con los sistemas de
suministro que están direccionados al tejido circundante, v.g.,
direccionados a las células tumorales propiamente dichas.
La presente invención fue facilitada por el uso
de modelos de angiogénesis en roedores. Enfermedades inflamatorias
crónicas tales como asma y bronquitis inducen la remodelización
tisular y vascular en la mucosa de las vías respiratorias. Para
comprender mejor la patogénesis de la inflamación crónica de las
vías respiratorias, se utilizó un modelo en el cual ocurren
inflamación crónica y remodelización tisular en las tráqueas de
ratas y ratones. La angiogénesis se desarrolla en la mucosa de las
vías respiratorias como resultado de la infección de Mycoplasma
pulmonis. En este modelo, los organismos Mycoplasma
pulmonis causan una infección persistente en el epitelio
traqueal y bronquial. La mucosa de las vías respiratorias de las
ratas infectadas con M. pulmonis presenta varias
anormalidades diferenciadas: 1) engrosamiento del epitelio y la
lámina propia; 2) cambios en la composición celular del epitelio;
3) angiogénesis; 4) sensibilidad incrementada de los vasos
angiogénicos para la sustancia P mediadora de inflamación en
términos de fuga de plasma; 5) fuga inducida por la sustancia P de
los capilares así como de las vénulas; y 6) número incrementado de
receptores para la sustancia P (receptores NK1) sobre las células
endoteliales capilares. En este modelo, la angiogénesis es activada
por la inflamación crónica, y los vasos sanguíneos son más
sensibles a los mediadores de inflamación.
Estudios que utilizaban perfusión de lectinas
para teñir la superficie luminal de las células endoteliales
revelaron la magnitud de la angiogénesis en las ratas después de la
infección por M. pulmonis. En la mucosa traqueal de las
ratas infectadas están presentes numerosos vasos semejantes a
capilares, y estos vasos sufren fuga después de la inyección
intravenosa de la sustancia P mediadora de inflamación.
En los ratones, M. pulmonis causa una
inflamación pulmonar aguda que alcanza su máximo 6-9
días después de la inoculación, seguido por infección persistente
de las vías respiratorias. La respuesta de los ratones a la
infección por M. pulmonis es muy dependiente de la variedad;
por ejemplo, las variedades C3H exhiben mayor mortalidad y mayor
reducción de la citoquina factor-\alpha de
necrosis tumoral que las variedades C57 BL. Algunos aspectos de la
remodelización mucosal tales como hiperplasia epitelial, han sido
descritos en las vías respiratorias de ratones infectados por M.
pulmonis. En los ratones C57BL/6 infectados con inoculación
nasal de M. pulmonis, el número de vasos traqueales aumenta
espectacularmente, al parecer por crecimiento de nuevos capilares.
En esta variedad, la vasculatura de la mucosa traqueal ya no es
planar, y se desarrollan pequeños vasos perpendiculares al plano de
la mucosa. Se encuentran numerosas ramificaciones vasculares
evidentes en regiones de vascularidad incrementada. Así, la
infección de los ratones C57BL/6 por M. pulmonis produce
inflamación crónica de las vías respiratorias con proliferación
endotelial, remodelización vascular, y angiogénesis. En contraste,
en los ratones C3H/HeNCr infectados por inoculación nasal de M.
pulmonis, el número de células endoteliales vasculares en la
mucosa traqueal aumenta, pero el número de vasos no lo hace. La
vascularidad incrementada no es debida a un aumento en la longitud
o el número de vasos sino a un aumento en el diámetro de los vasos,
y este aumento del diámetro en el tamaño de los vasos es debido a
una duplicación del número de células endoteliales. El tamaño de
las células endoteliales individuales en las tráqueas infectadas no
aumenta significativamente. Los niveles de anticuerpos circulantes
para M. pulmonis son similares en las dos variedades de
ratones. Así pues, la infección de los ratones C3H/HeNCr por M.
pulmonis produce una infección crónica de las vías
respiratorias con remodelización vascular y proliferación
endotelial, pero no un aumento significativo en el número de vasos,
mientras que en los ratones C57BL/6 produce proliferación celular y
nuevos vasos.
En un segundo modelo, la angiogénesis se produce
en tumores que son resultado de la expresión transgénica del
oncogén viral SV40. El modelo de ratón transgénico
"RIP-Tag" proporciona la oportunidad de
estudiar los cambios fenotípicos en las células angiogénicas
endoteliales en una progresión bien caracterizada desde tejido
normal a tumores. En el modelo de ratón transgénico
"RIP-Tag", el oncogén del virus
SV-40, antígeno T grande (Tag), es activado por una
región del promotor de insulina de la rata (RIP). Cuando se inserta
en el genoma murino, este constructo induce la expresión de Tag
específicamente en las células \beta de los islotes pancreáticos,
que están localizadas en aproximadamente 400 islotes dispersados por
todo el páncreas. La totalidad de los islotes del páncreas en estos
ratones expresan Tag; sin embargo, los islotes se desarrollan
normalmente hasta una edad aproximada de 6 semanas. A partir de
este momento, aproximadamente el 50% de los islotes se vuelven
hiperplásticos. Sin embargo, de estos islotes hiperplásticos, una
pequeña fracción (<5%) se desarrolla en tumores al cabo de
aproximadamente 10 semanas. Este cuello de botella en la
tumorigénesis parece resolverse cuando un islote adquiere la
capacidad de inducir angiogénesis: por ello, esta fase de la
tumorigénesis ha sido denominada el "cambio angiogénico". Un
cambio angiogénico similar parece existir también en otros modelos
de tumorigénesis murina así como en varios tumores humanos. Así
pues, el modelo RIP-Tag proporciona un entramado
bien caracterizado para examinar la progresión de la angiogénesis en
los tumores.
Los ejemplos siguientes se exponen con objeto de
proporcionar a las personas con experiencia ordinaria en la técnica
una exposición y descripción completas del modo de fabricar
liposomas catiónicos y desarrollar la metodología para utilización
de tales liposomas. Se han realizado esfuerzos para asegurar la
exactitud con respecto a los números utilizados (v.g., cantidades,
temperatura, etc.) pero deben tenerse en cuenta algunos errores y
desviaciones experimentales. A no ser que se indique otra cosa, las
partes son partes en peso, el peso molecular es peso molecular
medio ponderal; la temperatura se expresa en grados Celsius; y la
presión es la atmosférica o está próxima a la misma. Debe indicarse
que cada uno de los ejemplos que siguen representa un número de
experimentos que se realizaron, resumiéndose los procedimientos y
resultados de los mismos. Será apreciado por los expertos en la
técnica que no todos los experimentos proporcionaron resultados
positivos. Sin embargo, se considera que lo que sigue refleja
exactamente los resultados obtenidos.
Los liposomas y/o el DNA plasmídico se marcaron
y se determinó la distribución celular de los complejos marcados en
diversos momentos después de inyección intravenosa. Los experimentos
se realizaron sobre ratones exentos de patógenos (peso corporal
20-25 g) de ambos sexos.
Se prepararon liposomas catiónicos pequeños de
vesículas unilaminares a partir del lípido catiónico DDAB o DOTAP y
el lípido neutro DOPE o colesterol, marcados con Rojo Texas o el
tinte rojo fluorescente de carbocianina DiI o
CM-DiI, y en algunos casos se complejaron con DNA
plasmídico que contenía un gen informador tal como luciferasa o
\beta-galactosidasa. Las células endoteliales se
marcaron utilizando la lectina fluorescente de plantas fluoresceína
de Lycopersicon esculentum. Los monocitos/macrófagos se
marcaron utilizando cuentas fluorescentes (Duke, 500 nm). Los
núcleos celulares se marcaron con DAPI, YO-PRO, o el
tinte Hoechst 33342.
Los liposomas fluorescentes o complejos
liposoma-DNA que contenían 10-60
\mug de DNA en hasta 300 \mul se inyectaron en ratones sin
anestesiar por la vía de la vena del rabo. En algunos experimentos,
se inyectaron cuentas fluorescentes de 500 nm después de los
complejos. Desde 5 minutos a 24 horas después, los animales se
anestesiaron con pentobarbital sódico y se perfundieron luego a
través del ventrículo izquierdo con fijador (paraformaldehído al 1%
en solución salina tamponada con fosfato) seguido por la lectina
fluorescente para marcar la superficie endotelial de la
vasculatura. Después de la perfusión, se extirparon los tejidos y se
prepararon bien como montajes enteros o cortados en secciones
utilizando un Vibrátomo o cortador de tejidos. Adicionalmente, se
procesaron algunos especímenes para microscopía electrónica. Los
tejidos se examinaron por microscopía de epifluorescencia o por
microscopía confocal. Adicionalmente, algunos especímenes se
examinaron por microscopía electrónica de transmisión.
Resultados: En los ratones examinados desde 5
minutos a 24 horas después de la inyección, eran muy abundantes
liposomas marcados con CM-DiI o con DiI o complejos
liposoma-DNA en los pulmones. Adicionalmente,
aquéllos eran muy numerosos en las células endoteliales de los
capilares alveolares. La fluorescencia en los capilares alveolares
se distribuía uniformemente en todos los lóbulos de ambos pulmones.
Adicionalmente, existía algo de fluorescencia de
CM-DiI o DiI en los monocitos/macrófagos
intravasculares.
A continuación del pulmón, el hígado y el bazo
tenían la cantidad máxima de liposomas o complejos marcados. En
estos órganos, la fluorescencia de CM-DiI o DiI
estaba co-localizada con las cuentas fluorescentes.
En el hígado, la fluorescencia de CM-DiI o DiI y
las cuentas se encontraban en las células de Kupffer. En el bazo,
aquéllas se encontraban en los macrófagos.
El ovario tenía también vasos sanguíneos
marcados intensamente con liposomas o complejos marcados con
CM-DiI o marcados con DiI. Específicamente, se
observó que las células endoteliales en los vasos sanguíneos
angiogénicos de folículos grandes y los cuerpos lúteos de los
ovarios del ratón absorbían ávidamente DDAB:colesterol (liposomas
o)-complejos de DNA marcados con
CM-DiI o DiI después de inyección intravenosa. Estas
observaciones se documentaron fotográficamente (Figura 1). Otros
vasos sanguíneos ováricos contenían relativamente pocos complejos
marcados. Estos resultados se utilizaron para deducir que las
células angiogénicas endoteliales absorben preferentemente
liposomas y complejos liposoma-DNA, es decir, que
los liposomas catiónicos utilizados en los experimentos eran mucho
más propensos a asociarse con las células endoteliales que sufrían
angiogénesis en comparación con las células endoteliales
correspondientes que no sufrían angiogénesis.
Los liposomas o complejos marcados eran también
muy abundantes en las células endoteliales de las vénulas
endoteliales altas (HEV) de los ganglios linfáticos y los parches de
Peyer del intestino delgado, en tanto que eran escasos en las
células endoteliales de los capilares de estos órganos linfoides.
Los liposomas o complejos marcados eran también numerosos en las
células endoteliales capilares de la hipófisis anterior, el
miocardio, el diafragma, la corteza suprarrenal y el tejido
adiposo.
Eran abundantes los liposomas o complejos
marcados en los monocitos/macrófagos unidos a las vénulas de la
vejiga urinaria, el útero, y el tubo de Falopio. Algunas vénulas
contenían grandes números de monocitos/macrófagos marcados.
Adicionalmente, estaban marcadas una pequeña proporción de las
células endoteliales de arteriolas, capilares, y vénulas en estos
órganos.
Un número relativamente pequeño de liposomas o
complejos marcados estaban asociados con las células endoteliales
capilares de la hipófisis posterior, la médula renal, los vellos
intestinales (íleon), el páncreas, y la médula suprarrenal.
Prácticamente no se encontró ningún liposoma o complejo marcado en
las células endoteliales del cerebro, la glándula tiroides, la
corteza renal, los islotes pancreáticos, la tráquea o los bronquios,
con la excepción de un monocito/macrófago ocasional.
Conclusiones: La formulación de liposomas
DDAB:colesterol o complejos liposoma-DNA marcados
con CM-DiI o DiI utilizada en estos estudios se
direccionaba a tres tipos de células principales: células
endoteliales, macrófagos, y monocitos. La absorción de liposomas o
complejos era específica de órganos y vasos. En la mayoría de los
casos aquéllos eran absorbidos por las células endoteliales
capilares del pulmón y los macrófagos del hígado y el bazo. Las
células endoteliales capilares del ovario, la hipófisis anterior, el
corazón, el diafragma, la corteza suprarrenal, y el tejido adiposo
estaban también direccionados. Los vasos sanguíneos que absorbían
liposomas o complejos en el ovario eran sitios de angiogénesis.
Adicionalmente, se direccionaban HEV de los ganglios linfáticos y
los parches intestinales de Peyer. El direccionamiento de las
células endoteliales o macrófagos de otros órganos era menos
frecuente y más variable. Los vasos sanguíneos del cerebro,
tiroides, corteza renal, tráquea y bronquios no estaban
direccionados.
Adicionalmente, los experimentos documentaban
que los liposomas o complejos no se fugaban de la vasculatura en la
mayoría de los órganos. Aunque aquéllos se encontraban en las
células extravasculares del bazo, que tienen vasos sanguíneos con
un endotelio discontinuo, los mismos no se extravasaban a otros
órganos.
Finalmente, la absorción ávida de liposomas
catiónicos y complejos liposoma-DNA por los vasos
sanguíneos de los folículos ováricos grandes y los cuerpos lúteos
indica que las células endoteliales de los vasos sanguíneos
angiogénicos eran sitios de absorción preferencial.
Los resultados de los experimentos del Ejemplo 1
indicaban que los vasos sanguíneos angiogénicos en los folículos
ováricos y los cuerpos lúteos absorbían ávidamente los liposomas
catiónicos y los complejos liposoma-DNA. De acuerdo
con ello, se realizó un experimento para determinar si las células
endoteliales de los vasos sanguíneos angiogénicos de los tumores
absorben con avidez los liposomas catiónicos o complejos
liposoma-DNA.
Se utilizó el modelo de tumor
RIP-Tag5 transgénico, como se describe en la
Experimental Mouse Models Section, Hanahan, D. Heritable formation
of pancreatic beta-cell tumors in transgenic mice
expressing recombinant insulin/simian virus 40 oncogenes.
Nature 315:115-22,1985; Hanahan, D., and J.
Folkman. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch
during tumorigenesis. Cell 86: 353-64, 1996.
En este modelo, designado RIP-Tag, el oncogén del
virus SV-40, antígeno T grande (Tag), está activado
por una región del promotor de insulina de la rata (RIP). Cuando se
inserta en el genoma murino, este constructo induce la expresión del
antígeno T específicamente en las células \beta de los islotes
pancreáticos.
Un atributo importante de este modelo es que
diversas etapas del desarrollo del tumor, y por consiguiente
diversas etapas de la angiogénesis, están presentes simultáneamente
en cada ratón RIP-Tag5. Aunque la totalidad de los
300-400 islotes expresan el antígeno T, los islotes
se desarrollan inicialmente con normalidad. Sin embargo, al cabo de
6 semanas , aproximadamente la mitad son hiperplásticos, y de éstos,
una pequeña proporción desarrollan tumores al cabo de 10 semanas.
La tumorigénesis parece coincidir con la aparición de angiogénesis.
Esta conversión ha sido designada el "cambio angiogénico",
Folkman, J., K. Watson, D. Ingber, y D. Hanahan, Induction of
angiogenesis during the transition from hyper-plasia
to neoplasia. Nature 339: 58-61, 1989;
Hanahan, D., and J. Folkman, Patterns and emerging mechanisms of the
angiogenic switch during tumorigenesis. Cell 86:
353-64, 1996. Un cambio angiogénico similar parece
existir en otros modelos de tumorigénesis murina así como en varios
tumores humanos, Hanahan, D., and J. Folkman, Patterns and emerging
mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis.
Cell 86: 353-64,1996.
Se utilizaron métodos y materiales de acuerdo
con el Ejemplo 1. Específicamente, se inyectaron liposomas
DDAB:
colesterol marcados con CM-DiI o DiI por vía intravenosa en un ratón RIP-Tag5 portador de un tumor, y se inyectaron por vía intravenosa complejos DDAB:colesterol-DNA marcados con CM-DiI o DiI por vía intravenosa en otro ratón RIP-Tag5. La distribución de los liposomas o complejos en los vasos sanguíneos angiogénicos de los tumores de las células de los islotes pancreáticos se examinó 24 horas después de la inyección, y se comparó con la existente en los vasos de los islotes pancreáticos de ratones normales.
colesterol marcados con CM-DiI o DiI por vía intravenosa en un ratón RIP-Tag5 portador de un tumor, y se inyectaron por vía intravenosa complejos DDAB:colesterol-DNA marcados con CM-DiI o DiI por vía intravenosa en otro ratón RIP-Tag5. La distribución de los liposomas o complejos en los vasos sanguíneos angiogénicos de los tumores de las células de los islotes pancreáticos se examinó 24 horas después de la inyección, y se comparó con la existente en los vasos de los islotes pancreáticos de ratones normales.
Resultados: se realizaron dos nuevas
observaciones: (1) los liposomas o complejos eran absorbidos por las
células endoteliales de los vasos sanguíneos angiogénicos sin
fugarse a través del endotelio, y (2) la absorción endosómica de
los liposomas o complejos era mayor en las células endoteliales de
los vasos sanguíneos angiogénicos que en las células endoteliales
de los vasos normales de los islotes pancreáticos (la Figura 2
pertenece a un espécimen tisular).
Conclusiones: Este experimento proporcionó
resultados consistentes con la absorción preferencial de los
liposomas DDAB:colesterol o complejos liposoma-DNA
por los vasos tumorales angiogénicos. Antes de repetir el
experimento (1) se incrementó la intensidad de fluorescencia de los
complejos liposoma-DNA, (2) los métodos de
localización de los sitios de absorción de liposomas catiónicos y
complejos liposoma-DNA en los tumores de los ratones
RIP-Tag se mejoraron; y (3) se obtuvo una mayor
familiaridad con la estructura y función de los vasos sanguíneos
angiogénicos en los tumores de las células de los islotes
pancreáticos en los ratones RIP-Tag5.
(Ejemplo de
referencia)
Propósito: La intensidad de fluorescencia de los
complejos liposoma-DNA se había incrementado
utilizando Rojo Texas-DHPE en lugar de DiI; el
método de preparación del páncreas de los ratones
RIP-Tag2 para localización de los sitios de
absorción de los complejos fluorescentes liposoma
catiónico-DNA se mejoró; y la estructura y función
de los vasos sanguíneos angiogénicos en los tumores de las células
de los islotes pancreáticos en los ratones RIP-Tag2
habían sido estudiadas. Con estas mejoras, se llevaron a cabo
experimentos del tipo descrito en el Ejemplo 2 para determinar de
qué modo eran absorbidos los liposomas catiónicos y los complejos
lípido-DNA.
Métodos: Se prepararon liposomas catiónicos de
vesículas unilaminares pequeñas DOTAP:colesterol, marcados con Rojo
Texas-DHPE. Se prepararon complejos
liposoma-DNA para una relación lípido total:DNA de
24:1
(nmoles/\mug) en glucosa al 5%, utilizando 60 \mug de DNA plasmídico en 300 \mul. Los complejos (300 \mul) se inyectaron en las venas del rabo de ratones C57BL/6 transgénicos RIP1-Tag2 sin anestesiar y ratones C57BL/6 normales sin anestesiar.
(nmoles/\mug) en glucosa al 5%, utilizando 60 \mug de DNA plasmídico en 300 \mul. Los complejos (300 \mul) se inyectaron en las venas del rabo de ratones C57BL/6 transgénicos RIP1-Tag2 sin anestesiar y ratones C57BL/6 normales sin anestesiar.
Cuatro horas después de la inyección de los
complejos, se anestesiaron los ratones por inyección intraperitoneal
de Nembutal, 50 mg/kg. La vasculatura se fijó por perfusión de
paraformaldehído al 1% a través de la aorta ascendente, y la
superficie luminal de la vasculatura se coloreó por perfusión de
lectina fluorescente verde, Thurston, G., P. Baluk, A. Hirata, y
D.M. McDonald, Permeability-unrelated changes
revealed at endothelial cell borders in inflamed venules by lectin
binding. Am J Physiol 271: H2547-2562, 1996.
Montajes de tejidos enteros o secciones de Vibrátomo se montaron en
Vectashield, y los vasos se examinaron utilizando un microscopio de
fluorescencia Zeiss Axiophot o un microscopio confocal Zeiss LSM 410
equipado con un láser de kriptón-argón y tubos
fotomultiplicadores optimizados. Las imágenes se registraron en
película Kodak Ektachrome (ASA 400) o como archivos digitales de
imagen confocal.
Resultados: el experimento demostró claramente
una ávida absorción de los complejos
DOTAP:colesterol-DNA marcados con Rojo Texas por
las células angiogénicas endoteliales en los tumores pancreáticos de
los ratones RIP1-Tag2. La absorción por los vasos
tumorales excedía con mucho de la absorción de estos complejos por
las células endoteliales correspondientes de los islotes
pancreáticos normales (compárense las Figuras 3 y 4).
Los tumores se diferenciaban fácilmente de los
tejidos adyacentes debido a la marcación intensa de sus vasos
sanguíneos con los complejos fluorescentes rojos de liposomas. La
geometría de la vasculatura de los tumores era variable, variando
desde el patrón típico de los islotes normales a un retículo
anastomosante, denso y tortuoso de vasos sinusoidales claramente
mayores y compactados más densamente que en los islotes normales.
En el último caso, la vasculatura se asemejaba a la de los cuerpos
lúteos. La intensidad de marcación de los vasos tumorales estaba
aproximadamente relacionada con el tamaño del tumor. Los tumores
mayores tenían la marcación máxima.
Algunos vasos sanguíneos en tumores de tamaño
pequeño a mediano tenían protrusiones achaparradas, focales,
semejantes a aneurismas. Estos sitios eran particularmente claros,
debido a la presencia de puntos anormalmente numerosos marcados con
Rojo Texas, que se presumía eran endosomas. La marcación con Rojo
Texas de estos sitios era mayor que la de los vasos adyacentes.
Parecía que estas estructuras podían ser brotes capilares. Las
estructuras no se encontraban en tumores grandes que tenían una
vasculatura densa y compleja, en la que los vasos estaban marcados
densamente de manera uniforme.
No había evidencia alguna de extravasación de
los complejos marcados con Rojo Texas en los tumores. Asimismo, no
se observó complejo alguno marcado con Rojo Texas dentro de las
agrupaciones de eritrocitos extravasculares en los tumores. La
marcación intensa de la vasculatura tumoral se asemejaba a la de los
cuerpos lúteos ováricos durante la primera etapa de su
desarrollo.
Propósito: Se llevaron a cabo experimentos del
tipo descrito en el Ejemplo 3 para extender las observaciones a
otros modelos de angiogénesis. Estos experimentos enfocaban también
la cuestión de si tenía que estar presente DNA para que los
liposomas catiónicos se direccionaran a los vasos sanguíneos
angiogénicos. Se examinaron cuatro modelos animales de angiogénesis
con respecto a si había una absorción preferencial de liposomas
DOTAP:colesterol o complejos liposoma-DNA por los
vasos sanguíneos angiogénicos.
Modelos: Modelo de tumor
RIP1-Tag2. Se produjeron ratones transgénicos
C57BL/6 y se determinó su fenotipo en el momento del nacimiento por
análisis PCR. El modelo de ratón se ha descrito anteriormente.
Modelo de tumor HPV. Se produjeron ratones
transgénicos HPV (virus del papiloma humano) y se determinó su
fenotipo en el momento del nacimiento por análisis PCR. Se
utilizaron como controles hermanos de camada no transgénicos. En
este modelo, el oncogén del virus del papiloma humano está activado
por una región del promotor de keratina 14. Cuando se inserta en el
genoma murino, este constructo induce la expresión de HPV
específicamente en las células epidérmicas. Todos los ratones
transgénicos desarrollan displasia acompañada por angiogénesis en
la piel del tórax superior y las orejas, y una pequeña proporción
desarrollan tumores.
Modelo de infección de Mycoplasma
pulmonis en los ratones. Esta infección da como resultado
inflamación crónica de las vías respiratorias acompañada por
angiogénesis en la mucosa de las vías respiratorias. Después de la
anestesia (87 mg/kg de quetamina y 13 mg/kg de xilazina inyectadas
intraperitonealmente), ratones macho y hembra de ocho semanas
exentos de patógenos C3H/HeNCr o ratones C57BL/6 (ambos de Charles
River) se inocularon por vía intranasal con 3 x 10^{4} unidades
formadoras de colonia de Mycoplasma pulmonis (cepa
5782C-UAB CT7), en un volumen de 50 \mul. Como
controles se utilizaron ratones exentos de patógenos y se inocularon
con caldo estéril. Los ratones infectados y de control se
enjaularon por separado en condiciones de barrera. Se midieron los
niveles séricos de anticuerpo para M. pulmonis al final del
experimento (Microbiological Associates, Betesda, MD). Los ratones
se estudiaron 1 a 8 semanas después de la infección.
Modelo de infección de Mycoplasma
pulmonis en las ratas. Al igual que en los ratones, esta
infección causa enfermedad crónica de las vías respiratorias, una
de cuyas características es la angiogénesis en la mucosa de las
vías respiratorias. Después de la anestesia (40 mg/kg de quetamina y
8 mg/kg de xilazina inyectadas por vía intraperitoneal), se
inocularon ratas Wistar macho de 8 semanas exentas de patógenos (de
Charles River) por vía intranasal diariamente durante 3 días
consecutivos con Mycoplasma pulmonis de la cepa 5782C4 en un
volumen de 200 \mul. Como controles se utilizaron ratas exentas de
patógenos inoculadas con caldo. Las ratas infectadas y de control
se enjaularon por separado en condiciones de barrera. Se midieron
los niveles séricos de anticuerpo para M. pulmonis y otros
patógenos al final del experimento (Microbiological Associates,
Betesda, MD).
Métodos: Se prepararon liposomas catiónicos
DOTAP:colesterol, marcados con Rojo Texas-DHPE, como
se describe en el Ejemplo 3. Los liposomas se inyectaron en una
vena del rabo de los ratones a una dosis de 360 nmol de lípidos
totales en un volumen de 100 \mul en glucosa al 5%. Las ratas se
infectaron por la vía de la vena femoral. Se prepararon complejos
liposoma-DNA para una relación lípido total:DNA de
24:1 en glucosa al 5%, utilizando 60 \mug de DNA plasmídico en
200-300 \mul. Los liposomas o los complejos
(200-300 \mul) se inyectaron en una vena del rabo
de ratones (RIP-Tag2, HPV, o infectados con M.
Pulmonis, no anestesiados. Como controles se utilizaron ratones
no transgénicos, exentos de patógenos.
A los 20 minutos o 4 horas después de la
inyección, los ratones o ratas se anestesiaron por inyección
intraperitoneal de Nembutal, 50 mg/kg. La vasculatura se fijó por
perfusión de paraformaldehído al 1% a través de la aorta
ascendente, y la superficie luminar de la vasculatura se coloreó por
perfusión de lectina fluorescente verde, Thurston, G., P. Baluk, A.
Hirata, y D.M. McDonald. Se revelaron cambios relacionados con la
permeabilidad en los bordes de las células endoteliales en las
vénulas inflamadas por fijación de lectina. Am.J. Physiol 271:
H2547-2562, 1996. Montajes enteros de tejidos o
secciones de Vibrátomo se montaron en Vectashield, y los vasos se
examinaron con un microscopio de fluorescencia Zeiss o microscopio
confocal.
El grado de absorción de liposomas o complejos
fluorescentes se cuantificó por microscopía confocal. Resumidamente,
una serie de 12 imágenes confocales separadas por 2,5 \mum en el
eje focal (z) se recogió en la región rostral de la tráquea en los
canales de fluoresceína y Rojo Texas utilizando una lente 20x NA 0,6
(Zeiss) y ajustes normalizados del tamaño del estenope confocal, la
ganancia del tubo fotomultiplicador, y la potencia del láser. Se
generaron proyecciones de la serie de imágenes que mostraban los
vasos (fluoresceína-L. esculentum) y los liposomas (Rojo
Texas) por separado. Utilizando el soporte lógico confocal, se
definieron en las imágenes de los vasos regiones de un área
aproximada de 200 \mum^{2}, después de lo cual se midió la
fluorescencia media de las regiones correspondientes de la imagen
de los liposomas. Se determinó la intensidad de fondo por medida de
la fluorescencia en regiones seleccionadas adyacentes a los vasos.
Las medidas se realizaron sobre 25 vasos por tráquea y 4 tráqueas
por grupo (n = 4). La significación de las diferencias se evaluó por
el ensayo t de Student.
Los tejidos preparados para microscopía
electrónica de transmisión se procesaron como se ha descrito
previamente, McDonalds, D.M. Endotelial gaps and permeability of
venules of rat tracheas exposed to inflammatory stimuli, Am. J.
Physiol. 266: L61-L83, 1994. Resumidamente, la
perfusión del fijador primario (aldehído glutárico al 3% en tampón
de cacodilato 75 mM, pH 7,1, más 1% de sacarosa, 4% de PVP, 0,05% de
CaCl_{2}, y 0,075% de H_{2}O_{2}) durante 5 min a la
temperatura ambiente fue seguida por perfusión del fijador
secundario (aldehído glutárico al 3% en tampón de cacodilato 75 mM,
pH 7,1, que contenía 0,05% de CaCl_{2}, 1% de sacarosa, y 4% de
PVP) durante 5 min. Se dejó que los tejidos se fijaran in
situ durante 1 hora a la temperatura ambiente, después de lo
cual se retiraron y se dejaron durante una noche en fijador
secundario a 4ºC. Los tejidos se cortaron con una cuchilla de
afeitar o se dividieron en rodajas con un cortador de tejidos,
después de lo cual se sometieron a fijación en osmio (OsO4 al 2% en
tampón de cacodilato 100 mM, pH 7,4, durante 18 h a 4ºC), se
lavaron en H_{2}O (18 h a 4ºC), y se tiñeron en bloque con acetato
de uranilo (acuoso, 37ºC durante 48 horas). El tejido se deshidrató
luego con acetona, se infiltró, y se incrustó en resina epoxi. Se
cortaron secciones ultra-delgadas con un
ultramicrotomo, se montaron sobre rejillas de especímenes de una
sola ranura, y se examinaron con un microscopio electrónico Zeiss
EM-10.
Resultados: Los experimentos revelaron que los
liposomas DOTAP:colesterol marcados con Rojo Texas, en ausencia de
DNA, se direccionaban selectivamente a las células angiogénicas
endoteliales de los tumores en los ratones
RIP1-Tag2, análogamente a los descubrimientos
previos con los complejos DOTAP:colesterol-DNA
marcados con Rojo Texas y los complejos
DDAB:colesterol-DNA marcados con DiI. Este
experimento y experimentos subsiguientes sobre ratones transgénicos
RIP1-Tag2 confirmaron que la absorción de los
liposomas catiónicos por los vasos sanguíneos angiogénicos de los
islotes hiperplásticos y tumores excedía con mucho a la de los vasos
normales correspondientes (Figuras 5, 6, 7 y 8). En algunos vasos
de los islotes hiperplásticos y tumores pequeños, los liposomas
eran absorbidos por las células endoteliales sólo en regiones
focales (Figura 8), mientras que en los tumores mayores la
absorción era más generalizada (Figura 6). Se pensó que las regiones
focales de absorción eran sitios posibles de crecimiento de nuevos
vasos (Figura 8).
Dado que esta propiedad de los liposomas
catiónicos o complejos liposoma-DNA, tenía el uso
práctico potencial de suministrar selectivamente sustancias a las
células angiogénicas endoteliales, parecía deseable determinar si
esta propiedad de las células angiogénicas endoteliales en los
tumores era compartida por las células endoteliales en otros sitios
de angiogénesis patológica. Esta cuestión se abordó en experimentos
en los cuales se examinó la absorción de los liposomas
DOTAP:colesterol marcados con Rojo Texas por las células
angiogénicas endoteliales en la tráquea de ratones con infección de
Mycoplasma pulmonis, que causa inflamación crónica de las
vías respiratorias, una de cuyas características es la angiogénesis
(compárense las Figuras 9 y 10). Se encontró que las células
angiogénicas endoteliales en las regiones de inflamación crónica
eran sitios de absorción anormalmente alta de liposomas catiónicos
(Figura 10). Específicamente, los vasos en las tráqueas de los
ratones infectados con M. pulmonis tenían un grado de
absorción anormalmente alto. Las medidas por microscopía confocal de
los vasos sanguíneos angiogénicos demostraron que los ratones
infectados tenían una absorción 20 a 30 veces mayor que los
controles (Figura 11). Algunos vasos angiogénicos tenían una
absorción 100 veces mayor. Los estudios por microscopía confocal y
electrónica de las células angiogénicas endoteliales en ratones
infectados con M. pulmonis sugerían que los liposomas
catiónicos se asociaban primeramente con los endosomas (Figura 12)
y posteriormente se internalizaban en los mismos (Figuras 13).
Análogamente, los liposomas catiónicos eran
absorbidos ávidamente por los vasos sanguíneos angiogénicos en los
folículos ováricos y los cuerpos lúteos de los ratones, la piel
displástica de los ratones transgénicos HPV, y las tráqueas de
ratas con angiogénesis debida a infección de M. pulmonis.
Conclusiones: Estos experimentos confirmaron que
los liposomas catiónicos y los complejos
liposoma-DNA están direccionados preferentemente a
las células angiogénicas endoteliales de los tumores y los sitios de
inflamación crónica.
Los documentos siguientes se citan por letras y
números a todo lo largo del texto anterior.
A. U.S. Pat. No. 4,897,355
B. U.S. Pat. No. 4,394,448
C. U.S. Pat. No. 5,328,470
D. WO93/12240
E. WO/91/06309
F. Huang, et al, Cancer
Res. 52, 5135 (1992).
G. Rosenecker et al., PNAS
93, 7236 (1996).
H. Abdi, et al., In Vitro Cell
Dev. Biol. Anim. 31, 310 (1995).
I. Chonn et al., Curr. Opin.
Biotechnol. 6, 698 (1995).
J. Green, et al., Adv. Exp.
Med. Bio. 383, 83 (1995).
K. Hung, et al, Gene 159,
65 (1995).
L. Ledley, et al., Hum. Gene
Ther. 6, 1129 (1995).
M. Mori, et al., Cancer
Chemother. Pharmacol. 35, 447 (1995).
N. Volm, et al., et al,
Curr. Opin. Oncol. 7, 429 (1995).
O. Litzinger, et al., Biochim.
Biophys. Acta 1190, 99 (1994).
P. Northfelt, et al., Drugs
48, 569 (1994).
Q. Oku, et al., Crit. Rev.
Ther. Drug Carrier Sys. 11, 231 (1994).
R. Gabizon, et al., Ann Biol.
Clin (Paris) 51, 811 (1993).
S. Huang, et al, Am. J.
Pathol. 143, 10 (1994).
T. Mori, et al., Pharm.
Res. 10, 507 (1993).
U. Priebe, et al., Pharmacol.
Ther. 60, 215 (1993).
V. Straubinger, et al., J.
Natl. Cancer Inst. Monogr. 69 (1993).
W. Fidler, et al., World J.
Surg. 16, 270 (1992).
X. Rowlinson-Busza, et
al., Curr. Opin. Oncol. 4, 1142 (1992).
Y. Sugarman, et al., Crit. Rev.
Oncol. Hematol. 12, 231 (1992).
Z. Pak, et al., Biotherapy
3, 55 (1991).
AA. De Smidt, et al., Crit.
Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 7, 99 (1990).
BB. Papahadjopoulos, et al.,
Prog. Clin. Biol. Res. 343, 85 (1990).
CC. Shibata, et al., Neurol.
Med. Chir. (Tokyo) 30, 242 (1990).
DD. Hughes, et al., Cancer
Res. 49, 6214 (1989).
EE. Shibata, et al., Neurol.
Med. Chir. (Tokyo) 29, 696 (1989).
FF. Freeman, et al., Cancer
58, 573 (1986).
GG. Zolotareva, et al., Eksp.
Onkol. 8, 28 (1986).
HH. Caride, et al, Crit. Rev.
Ther. Drug Carrier Syst. 1, 121 (1985).
II. Yatvin, et al., Med.
Phys. 9, 149 (1982).
JJ. Liposomes, A Practical Approach, edited by
Nev, R.R.C., IRL Press, 1994.
KK. Liposomes, From Physics to Applications,
Lasic, D.D., Elsevier, 1993.
LL. Thurston, et al., "Cationic
Liposomes Target Angiogenic Endothelial Cells in Tumors and
Inflammation in Mice", J. Clin. Invest., April 1,
1998.
1. Arfors, K.-E., G. Rutili, and
E. SvensjÜ. Microvascular transport of macromolecules in
normal and inflammatory conditions. Acta Physiol. Scand.
Suppl. 463: 93-103, 1979.
2. Baluk, P., and D. M. McDonald.
The b2-adrenergic receptor agonist formoterol
reduces microvascular leakage by inhibiting endothelial gap
formation. Am. J. Physiol. 266: L461-L468,
1994.
3. Bowden, J. J., A. Garland, P.
Baluk, P. Lefevre, E. Grady, S. R.
Vigna, N. W. Bunnett, and D. M. McDonald.
Direct observation of substance P-induced
internalization of neurokinin 1 (NK1) receptors at sites of
inflammation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:
8964-8968, 1994.
4. Brigham K., B. Meyrick, B.
Christman, M. Magnuson, G. King, and L. C.
Berry. In vivo transfection of murine lungs with a
functioning prokaryotic gene using a liposome vehicle. Am. J.
Med. Sci. 298: 278-281, 1989.
5. Christenson, L. K., and R. L.
Stouffer. Proliferation of microvascular endothelial cells
in the primate corpus luteum during the menstrual cycle and
simulated early pregnancy. Endocrinology 137:
367-374, 1996.
6. Conary, J. T., R. E. Parker, B.
W. Christman, R. D. Faulks, G. A. King, B. O.
Meyrick, and K. L. Brigham. Protection of rabbit lungs
from endotoxin injury by in vivo hyperexpression of the
prostaglandin G/H synthase gene. J. Clin. Invest. 93:
1834-1840, 1994.
7. Folkman, J., K. Watson, D.
Ingber, and D. Hanahan. Induction of angiogenesis
during the transition from hyperplasia to neoplasia. Nature
339: 58-61, 1989.
8. Hanahan, D. Heritable formation of
pancreatic beta-cell tumors in transgenic mice
expressing recombinant insulin/simian virus 40 oncogenes.
Nature 315: 115-22, 1985.
9. Hanahan, D., and J. Folkman.
Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during
tumorigenesis. Cell 86: 353-64,
1996.
10. Lundberg, J. M., and A. Saria.
Capsaicin-induced desensitization of airway mucosa
to cigarette smoke, mechanical and chemical irritants.
Nature 302: 251-253, 1983.
11. Majno, G., and G. E. Palade.
Studies on inflammation. I. The effect of histamina and serotonin
on vascular permeability: an electron microscopic study. J.
Biophys. Biochem. Cytol. 11:571-604,
1961.
12. McDonald, D. M. Neurogenic
inflammation in the rat trachea. I. Changes in venules, leucocytes,
and epithelial cells. J. Neurocytology
17:583-603, 1988.
13. McDonald, D. M. The ultrastructure
and penneability of tracheobronchial blood vessels in health and
disease. Eur. J. Respir. Dis. 3 (Suppl
12):572s-585s, 1990.
14. McDonald, D. M. Endothelial gaps and
permeability of venules of rat tracheas exposed to inflammatory
stimuli. Am. J. Physiol. 266: L61-L83,
1994.
15. McDonald, D. M., and A.
Goldfein. The relation of lutein cell Golgi apparatus
morphology to ovarian progesterone secretion during the rat estrous
cycle. Anat. Rec. 151: 385, 1965.
16. McDonald, D. M., K. Seiki M.
Prizant, and A. Goldfein. Ovarian progesterone
secretion in relation to the lutein cell Golgi apparatus during rat
estrous cycle. Endocrinology 85: 236-243,
1969.
17. Nabel, E. G., D. Gordon, Z. Y.
Yang, L. Xu, H. San, G. E. Plautz, B. Y.
Wu, X. Gao, L. Huang, and G. J. Nabel.
Gene transfer in vivo with DNA-liposome
complexes: lack of autoimmunity and gonadal localization. Hum.
Gene Ther. 3: 649-56, 1992.
18. Philip, R., D. Liggitt, M.
Philip, P. Dazin, and R. J. Debs. In
vivo gene delivery: Efficient transfection of T lymphocytes in
adult mice. J. Biol. Chem. 268: 16087, 1993.
19. Thurston, G., P. Baluk, A.
Hirata, and D. M. McDonald.
Permeability-related changes revealed at
endothelial cell borders in inflamed venules by lectin binding.
Am J Physiol 271: 112547-2562,
1996.
20. Tsukada, K., T. Matsushima,
and N. Yamanaka. Neovascutarization of the corpus
luteum of rats during the estrus cycle. Pathol Int
46:408-416, 1996.
21. Umeno, E., J. A. Nadel, and D.
M. McDonald. Neurogenic inflammation of the rat trachea:
fate of neutrophils that adhere to venules. J. Appl. Physiol.
69: 2131-2136, 1990.
22. Zhu, N., D. Liggitt, Y.
Liu, and R. Debs. Systemic gene expression after
intravenous DNA delivery into adult mice. Science 261:
209-211, 1993.
23. Bowden, J. J., T. R. Schoeb,
J. R. Lindsey, and D. M. McDonald. Dexamethasone and
oxytetracycline reverse the potentiation of neurogenic inflammation
in airways of rats with Mycoplasma pulmonis infection. Am
J Respir Crit Care Med 150:1391-401,
1994.
24. McDonald, D. M. Infections intensify
neurogenic plasma extravasation in the airway mucosa. Am Rev
Respir Dis 146: S40-4, 1992.
25. McDonald, D. M. Upregulation of
tachykinin receptors in an animal model of chronic airway
inflammation. Pulmonary Pharmacology 8:
203-205, 1995.
26. McDonald, D. M., T. R. Schoeb,
and J. R. Lindsey. Mycoplasma pulmonis infections
cause long-lasting potentiation of neurogenic
inflammation in the respiratory tract of the rat. J Clin
Invest 87:787-99, 1991.
Claims (8)
1. Un liposoma catiónico, que comprende:
al menos 5% molar de al menos un lípido
catiónico y opcionalmente lípidos neutros y un compuesto tóxico que
destruye una célula angiogénica endotelial de un tumor,
caracterizado por tener un potencial zeta mayor que 0 mV
cuando está presente al pH fisiológico.
2. El liposoma de la reivindicación 1, en el
cual dicho lípido catiónico comprende una cadena principal y más de
un ácido graso de 12 a 24 carbonos de longitud y que contiene hasta
seis insaturaciones enlazadas a la cadena principal por enlaces
acilo o éter.
3. El liposoma de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 2 que tiene una selectividad al menos cinco
veces mayor entre las células endoteliales angiogénicas y las
células endoteliales normales correspondientes.
4. El uso de un liposoma catiónico que
comprende al menos 5% molar de al menos un lípido catiónico y
opcionalmente al menos un lípido neutro y una sustancia que afecta
a las células angiogénicas endoteliales seleccionada de un compuesto
tóxico que destruye una célula angiogénica endotelial de un tumor
que tiene un potencial zeta mayor que 0 mV cuando está presente al
pH fisiológico, para la fabricación de una composición farmacéutica
para tratamiento del cáncer.
5. El uso de la reivindicación 4, en el cual
dicho lípido catiónico comprende una cadena principal y más de un
ácido graso que tiene 12-24 carbonos de longitud y
que contiene hasta seis insaturaciones enlazadas a la cadena
principal por enlaces acilo o éter.
6. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 5, en el cual dicho liposoma se administra por
inyección intravascular.
7. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
4 a 6, en el cual dicho liposoma tiene una selectividad al menos
cinco veces mayor entre las células angiogénicas endoteliales y las
células endoteliales normales correspondientes.
8. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones 4 a 7, en el cual dicho paciente es un mamífero,
particularmente un humano.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US820337 | 1997-03-12 | ||
| US08/820,337 US5837283A (en) | 1997-03-12 | 1997-03-12 | Cationic lipid compositions targeting angiogenic endothelial cells |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2284201T3 true ES2284201T3 (es) | 2007-11-01 |
Family
ID=25230519
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES98910354T Expired - Lifetime ES2284201T3 (es) | 1997-03-12 | 1998-03-12 | Composiciones de lipidos cationicos direccionadas a las celulas angiogenicas endoteliales. |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (7) | US5837283A (es) |
| EP (2) | EP1014945B1 (es) |
| JP (2) | JP4463880B2 (es) |
| KR (1) | KR100530534B1 (es) |
| AT (1) | ATE362753T1 (es) |
| AU (1) | AU727946B2 (es) |
| BR (1) | BR9808018A (es) |
| CA (1) | CA2283327C (es) |
| DE (1) | DE69837807T2 (es) |
| ES (1) | ES2284201T3 (es) |
| IL (2) | IL131697A0 (es) |
| NO (1) | NO327487B1 (es) |
| WO (1) | WO1998040052A1 (es) |
Families Citing this family (84)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7112338B2 (en) * | 1997-03-12 | 2006-09-26 | The Regents Of The University Of California | Cationic liposome delivery of taxanes to angiogenic blood vessels |
| US5837283A (en) * | 1997-03-12 | 1998-11-17 | The Regents Of The University Of California | Cationic lipid compositions targeting angiogenic endothelial cells |
| US6930094B1 (en) * | 1997-05-09 | 2005-08-16 | Merckle Gmbh | Tissue factor for influencing blood vessel formation |
| US6054133A (en) * | 1997-07-10 | 2000-04-25 | The Regents Of The University Of California | Anti-microbial targeting for intracellular pathogens |
| US6130207A (en) * | 1997-11-05 | 2000-10-10 | South Alabama Medical Science Foundation | Cell-specific molecule and method for importing DNA into a nucleus |
| US6082364A (en) * | 1997-12-15 | 2000-07-04 | Musculoskeletal Development Enterprises, Llc | Pluripotential bone marrow cell line and methods of using the same |
| US7157098B1 (en) * | 1998-01-06 | 2007-01-02 | Roman Perez-Soler | Gene therapy of tumors using non-viral delivery system |
| US6225293B1 (en) * | 1998-09-02 | 2001-05-01 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compounds for tracking the biodistribution of macromolecule-carrier combinations |
| PT1129064E (pt) | 1998-11-12 | 2008-01-31 | Invitrogen Corp | Reagentes de transfecção |
| DE69928778T2 (de) * | 1999-06-08 | 2006-07-06 | Gentium S.P.A., Villa Guardia | Anwendung von Komplexen von kationischen Liposomen und Polydeoxyribonukleotiden wie Arzneimitteln |
| BR0012528A (pt) * | 1999-06-22 | 2002-04-09 | Res Dev Foundation | Cobertura aperfeiçoada para feridas para melhorar a cicatrização de feridas |
| US6611833B1 (en) * | 1999-06-23 | 2003-08-26 | Tissueinformatics, Inc. | Methods for profiling and classifying tissue using a database that includes indices representative of a tissue population |
| HK1046506B (en) * | 1999-09-09 | 2006-08-25 | The Regents Of The University Of California | Cationic liposome delivery of taxanes to angiogenic blood vessels |
| US6716824B1 (en) * | 1999-10-22 | 2004-04-06 | F. Charles Brunicardi | Treatment of pancreatic adenocarcinoma by cytotoxic gene therapy |
| WO2001032222A1 (en) * | 1999-11-03 | 2001-05-10 | Mbt Munich Biotechnology Gmbh | Selective toxin expression in angiogenic endothelial cells |
| US6329348B1 (en) | 1999-11-08 | 2001-12-11 | Cornell Research Foundation, Inc. | Method of inducing angiogenesis |
| US8029795B2 (en) * | 1999-12-30 | 2011-10-04 | Gwathmey, Inc. | Targeted iron chelator delivery system |
| US6372722B1 (en) * | 2000-01-19 | 2002-04-16 | Genteric, Inc. | Method for nucleic acid transfection of cells |
| PL366025A1 (en) * | 2000-05-03 | 2005-01-24 | Munich Biotech Ag | Cationic diagnostic, imaging and therapeutic agents associated with activated vascular sites |
| AU2001280754A1 (en) * | 2000-07-24 | 2002-02-05 | Research Development Foundation | Enhancement of photodynamic therapy by anti-angiogenic treatment |
| US20030082103A1 (en) * | 2000-10-11 | 2003-05-01 | Targesome, Inc. | Targeted therapeutic lipid constructs having cell surface targets |
| AU2002250081A1 (en) * | 2001-02-14 | 2002-08-28 | Uab Research Foundation | Combined transductional and transcriptional targeting system for improved gene delivery |
| US8722654B2 (en) | 2001-03-02 | 2014-05-13 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Lipoxin analogs as novel inhibitors of angiogenesis |
| EP1406698B1 (en) * | 2001-03-02 | 2008-10-29 | The Brigham and Women's Hospital | Lipoxin analogs as novel inhibitors of angiogenesis |
| US20020142304A1 (en) * | 2001-03-09 | 2002-10-03 | Anderson Daniel G. | Uses and methods of making microarrays of polymeric biomaterials |
| US20030186390A1 (en) * | 2001-03-22 | 2003-10-02 | De Jong Gary | Methods for delivering nucleic acid molecules into cells and assessment thereof |
| US7294511B2 (en) * | 2001-03-22 | 2007-11-13 | Chromos Molecular Systems, Inc. | Methods for delivering nucleic acid molecules into cells and assessment thereof |
| US6936469B2 (en) | 2001-03-22 | 2005-08-30 | Chromos Molecular Systems Inc. | Methods for delivering nucleic acid molecules into cells and assessment thereof |
| US20030096414A1 (en) * | 2001-03-27 | 2003-05-22 | Invitrogen Corporation | Culture medium for cell growth and transfection |
| US20030166593A1 (en) * | 2001-04-30 | 2003-09-04 | Kenneth Chien | Non-viral vesicle vector for cardiac specific gene delivery |
| EP1427449A1 (en) * | 2001-08-29 | 2004-06-16 | Kwang-Hoe Chung | Anti-cancer agents comprising disintegrin genes and the treating methods |
| AU2002362461A1 (en) * | 2001-10-01 | 2003-04-14 | Targesome, Inc. | Targeted therapeutic lipid constructs having cell surface targets |
| WO2003045314A2 (en) * | 2001-11-26 | 2003-06-05 | Exelixis Inc. | Mhyps as modifiers of branching morphogenesis and methods of use |
| US7488313B2 (en) * | 2001-11-29 | 2009-02-10 | Boston Scientific Scimed, Inc. | Mechanical apparatus and method for dilating and delivering a therapeutic agent to a site of treatment |
| US7519418B2 (en) * | 2002-04-30 | 2009-04-14 | Boston Scientific Scimed, Inc. | Mechanical apparatus and method for dilating and delivering a therapeutic agent to a site of treatment |
| WO2003093469A2 (en) * | 2002-05-01 | 2003-11-13 | Chromos Molecular Systems, Inc. | Methods for delivering nucleic acid molecules into cells and assessment thereof |
| WO2003106636A2 (en) * | 2002-06-14 | 2003-12-24 | Mirus Corporation | Novel methods for the delivery of polynucleotides to cells |
| US20030235565A1 (en) * | 2002-06-18 | 2003-12-25 | Cheung Ling Yuk | Feed additives for shrimp culture |
| EP2108362B1 (en) * | 2002-06-26 | 2013-05-29 | MediGene AG | A cationic liposomal preparation comprising a taxane |
| US20040034336A1 (en) * | 2002-08-08 | 2004-02-19 | Neal Scott | Charged liposomes/micelles with encapsulted medical compounds |
| US20080026077A1 (en) * | 2002-11-12 | 2008-01-31 | John Hilfinger | Methods and compositions of gene delivery agents for systemic and local therapy |
| US20050026859A1 (en) * | 2002-11-12 | 2005-02-03 | John Hilfinger | Methods and compositions of gene delivery agents for systemic and local therapy |
| US20040197319A1 (en) * | 2003-03-24 | 2004-10-07 | Paul Harch | Wound healing composition derived from low platelet concentration plasma |
| US7330851B2 (en) * | 2003-08-18 | 2008-02-12 | Eaglehawk, Limited | Data security through dissembly of data elements or connections between elements |
| US20080063699A1 (en) * | 2003-10-15 | 2008-03-13 | Michael Teifel | Method of Administering Cationic Liposomes Comprising an Active Drug |
| CA2568306A1 (en) * | 2004-06-14 | 2005-12-22 | Zoser B. Salama | Anti-cancer composition comprising proline or its derivatives and an anti-tumour antibody |
| US20060134066A1 (en) * | 2004-12-22 | 2006-06-22 | Peyman Gholam A | Localization of vectors and other agents |
| AU2006243337B2 (en) | 2005-05-04 | 2011-09-29 | Syncore Biotechnology Co., Ltd | Method of administering a cationic liposomal preparation comprising paclitaxel |
| AU2006259415B2 (en) | 2005-06-15 | 2012-08-30 | Massachusetts Institute Of Technology | Amine-containing lipids and uses thereof |
| EP2397034A1 (en) | 2005-07-14 | 2011-12-21 | Lithera, Inc. | Sustained Release Enhanced Lipolytic Formulation for Regional Adipose Tissue Treatment |
| US20090175930A1 (en) * | 2006-01-11 | 2009-07-09 | Nobuhiro Yagi | Composition Suppressing The Expression of Target Gene in Eyeball and Medicament For Treating of Disease in Eyeball |
| US20090169610A1 (en) * | 2006-02-03 | 2009-07-02 | Noboru Yamazaki | Liposome Preparation |
| ES2609388T3 (es) | 2006-03-22 | 2017-04-20 | Syncore Biotechnology Co., Ltd | Tratamiento del cáncer de mama triple negativo a receptores |
| EP2170956B1 (en) | 2007-06-15 | 2014-10-22 | Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts | Treatment of tumors using specific anti-l1 antibody |
| EP2222697B1 (en) | 2007-11-01 | 2012-12-05 | Perseid Therapeutics LLC | Immunosuppressive polypeptides and nucleic acids |
| CA3006395C (en) | 2008-11-07 | 2022-05-31 | Massachusetts Institute Of Technology | Aminoalcohol lipidoids and uses thereof |
| HUE038039T2 (hu) | 2009-12-01 | 2018-09-28 | Translate Bio Inc | mRNS bejuttatása fehérjék és enzimek kiegészítésére humán genetikai betegségekben |
| US9193827B2 (en) | 2010-08-26 | 2015-11-24 | Massachusetts Institute Of Technology | Poly(beta-amino alcohols), their preparation, and uses thereof |
| PL2691443T3 (pl) | 2011-03-28 | 2021-08-30 | Massachusetts Institute Of Technology | Sprzężone lipomery i ich zastosowania |
| ME03491B (me) | 2011-06-08 | 2020-01-20 | Translate Bio Inc | Kompozicije lipidnih nanočestica i postupci za isporuku irnk |
| EP2638896A1 (en) | 2012-03-14 | 2013-09-18 | Bioneer A/S | Cationic liposomal drug delivery system for specific targeting of human cd14+ monocytes in whole blood |
| EP2859102A4 (en) | 2012-06-08 | 2016-05-11 | Shire Human Genetic Therapies | NUCLEASE RESISTANT POLYNUCLEOTIDES AND USES THEREOF |
| EP2882706A1 (en) | 2012-08-13 | 2015-06-17 | Massachusetts Institute of Technology | Amine-containing lipidoids and uses thereof |
| EP3467108B1 (en) | 2013-03-14 | 2024-05-22 | Translate Bio, Inc. | Methods for purification of messenger rna |
| EA037922B1 (ru) | 2013-03-14 | 2021-06-07 | Шир Хьюман Дженетик Терапис, Инк. | мРНК CFTR И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ МУКОВИСЦИДОЗА У МЛЕКОПИТАЮЩЕГО |
| WO2014179562A1 (en) | 2013-05-01 | 2014-11-06 | Massachusetts Institute Of Technology | 1,3,5-triazinane-2,4,6-trione derivatives and uses thereof |
| MX2016005238A (es) | 2013-10-22 | 2016-08-12 | Shire Human Genetic Therapies | Formulaciones de lipidos para la administracion de acido ribonucleico mensajero. |
| AU2014340092B2 (en) | 2013-10-22 | 2019-09-19 | Translate Bio, Inc. | mRNA therapy for Argininosuccinate Synthetase Deficiency |
| EP3060258A1 (en) | 2013-10-22 | 2016-08-31 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | Mrna therapy for phenylketonuria |
| EP3636742B1 (en) | 2014-04-25 | 2025-11-05 | Translate Bio, Inc. | Methods for purification of messenger rna |
| CA2949106C (en) | 2014-05-30 | 2023-10-24 | Shire Human Genetic Therapies, Inc. | Biodegradable lipids for delivery of nucleic acids |
| EA033966B1 (ru) | 2014-06-24 | 2019-12-13 | Транслейт Био, Инк. | Стереохимически обогащенные композиции для доставки нуклеиновых кислот |
| EP3164379A1 (en) | 2014-07-02 | 2017-05-10 | Massachusetts Institute of Technology | Polyamine-fatty acid derived lipidoids and uses thereof |
| WO2016011203A1 (en) | 2014-07-15 | 2016-01-21 | Life Technologies Corporation | Compositions with lipid aggregates and methods for efficient delivery of molecules to cells |
| JP6875275B2 (ja) | 2014-09-30 | 2021-05-19 | ドイチェス クレブスフォルシュングスツェントルム シュティフトゥング デス エッフェントリッヒェンレヒツ | Ｌ１ｃａｍ（ｃｄ１７）と結合する抗体などの結合分子 |
| WO2016081203A2 (en) | 2014-11-17 | 2016-05-26 | Cellectar Biosciences, Inc. | Phospholipid ether analogs as cancer-targeting drug vehicles |
| KR20230107408A (ko) | 2016-07-29 | 2023-07-14 | 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 | 항-cd19 항체에 대한 항-이디오타입 항체 |
| EP3585417B1 (en) | 2017-02-27 | 2023-02-22 | Translate Bio, Inc. | Method of making a codon-optimized cftr mrna |
| CA3063531A1 (en) | 2017-05-16 | 2018-11-22 | Translate Bio, Inc. | Treatment of cystic fibrosis by delivery of codon-optimized mrna encoding cftr |
| SI3773544T1 (sl) | 2018-04-10 | 2026-01-30 | Cellectar Biosciences, Inc. | Fosfolipid-flavaglin konjugati ter postopki njihove uporabe za ciljno zdravljenje raka |
| CN118421617A (zh) | 2018-08-24 | 2024-08-02 | 川斯勒佰尔公司 | 用于纯化信使rna的方法 |
| MX2021005969A (es) | 2018-11-21 | 2021-09-14 | Translate Bio Inc | Tratamiento de la fibrosis quística mediante el suministro de arnm que codifica cftr nebulizado. |
| US12496346B2 (en) | 2019-10-10 | 2025-12-16 | Cellectar Biosciences, Inc. | Phospholipid-flavagline conjugates and methods of using the same for targeted cancer therapy |
| WO2022029660A1 (en) | 2020-08-05 | 2022-02-10 | Juno Therapeutics, Inc. | Anti-idiotypic antibodies to ror1-targeted binding domains and related compositions and methods |
Family Cites Families (41)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4460577A (en) * | 1977-09-30 | 1984-07-17 | Farmitalia Carlo Erba S.P.A. | Pharmaceutical compositions consisting or consisting essentially of liposomes, and processes for making same |
| US4394448A (en) * | 1978-02-24 | 1983-07-19 | Szoka Jr Francis C | Method of inserting DNA into living cells |
| US4897355A (en) * | 1985-01-07 | 1990-01-30 | Syntex (U.S.A.) Inc. | N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor |
| US5092885A (en) * | 1987-02-12 | 1992-03-03 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Peptides with laminin activity |
| US5110730A (en) * | 1987-03-31 | 1992-05-05 | The Scripps Research Institute | Human tissue factor related DNA segments |
| US5264318A (en) * | 1987-06-15 | 1993-11-23 | Sanyo-Kokusaku Pulp Co., Ltd. | Positive type photosensitive composition developable with water comprising a photocrosslinking agent, a water-soluble resin and an aqueous synthetic resin |
| US5328470A (en) * | 1989-03-31 | 1994-07-12 | The Regents Of The University Of Michigan | Treatment of diseases by site-specific instillation of cells or site-specific transformation of cells and kits therefor |
| JPH0395118A (ja) | 1989-09-07 | 1991-04-19 | Green Cross Corp:The | プロスタグランジン含有脂肪小体製剤 |
| AU625013B2 (en) * | 1989-11-03 | 1992-06-25 | Vanderbilt University | Method of in vivo delivery of functioning foreign genes |
| US5192744A (en) * | 1990-01-12 | 1993-03-09 | Northwestern University | Method of inhibiting angiogenesis of tumors |
| US5264618A (en) | 1990-04-19 | 1993-11-23 | Vical, Inc. | Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules |
| DE69114782T2 (de) * | 1990-08-08 | 1996-04-18 | Takeda Chemical Industries Ltd | Intravaskulär embolisierendes Mittel mit Gehalt an einem die Angiogenesis hemmenden Stoff. |
| US6605712B1 (en) * | 1990-12-20 | 2003-08-12 | Arch Development Corporation | Gene transcription and ionizing radiation: methods and compositions |
| JPH07502510A (ja) * | 1991-12-17 | 1995-03-16 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | 嚢胞性繊維症膜貫通型コンダクタンス調節活性（ｃｆｔｒ）のための遺伝子治療 |
| US5858784A (en) * | 1991-12-17 | 1999-01-12 | The Regents Of The University Of California | Expression of cloned genes in the lung by aerosol- and liposome-based delivery |
| WO1993018751A1 (en) * | 1992-03-23 | 1993-09-30 | Georgetown University | Liposome encapsulated taxol and a method of using the same |
| JP3285355B2 (ja) * | 1992-06-04 | 2002-05-27 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | ｉｎｖｉｖｏ遺伝子治療のための方法及び組成物 |
| US5631237A (en) | 1992-12-22 | 1997-05-20 | Dzau; Victor J. | Method for producing in vivo delivery of therapeutic agents via liposomes |
| PT982301E (pt) | 1993-06-11 | 2004-02-27 | Upjohn Co | Utilizacao antineoplasica de delta-6,7-taxois e composicoes farmaceuticas que oscontem |
| EP0636363B1 (en) | 1993-07-27 | 2001-05-23 | Terumo Kabushiki Kaisha | Drug delivery system |
| JP3570561B2 (ja) * | 1993-07-27 | 2004-09-29 | テルモ株式会社 | 血管内皮損傷部位を認識する担体 |
| US5641755A (en) * | 1994-02-04 | 1997-06-24 | Arch Development Corp. | Regulation of x-ray mediated gene expression |
| US5753230A (en) * | 1994-03-18 | 1998-05-19 | The Scripps Research Institute | Methods and compositions useful for inhibition of angiogenesis |
| US5837682A (en) * | 1996-03-08 | 1998-11-17 | The Children's Medical Center Corporation | Angiostatin fragments and method of use |
| US5885795A (en) * | 1994-04-26 | 1999-03-23 | The Children's Medical Center Corporation | Methods of expressing angiostatic protein |
| US5580898A (en) * | 1994-05-24 | 1996-12-03 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Method of stabilizing microtubules |
| US5512294A (en) * | 1994-08-05 | 1996-04-30 | Li; King C. | Targeted polymerized liposome contrast agents |
| GB9506466D0 (en) * | 1994-08-26 | 1995-05-17 | Prolifix Ltd | Cell cycle regulated repressor and dna element |
| US6071890A (en) * | 1994-12-09 | 2000-06-06 | Genzyme Corporation | Organ-specific targeting of cationic amphiphile/DNA complexes for gene therapy |
| US5580899A (en) | 1995-01-09 | 1996-12-03 | The Liposome Company, Inc. | Hydrophobic taxane derivatives |
| US6126086A (en) * | 1995-01-10 | 2000-10-03 | Georgia Tech Research Corp. | Oscillating capillary nebulizer with electrospray |
| DE19605279A1 (de) * | 1996-02-13 | 1997-08-14 | Hoechst Ag | Zielzellspezifische Vektoren für die Einschleusung von Genen in Zellen, Arzneimittel enthaltend derartige Vektoren und deren Verwendung |
| DE19605274A1 (de) * | 1996-02-13 | 1997-08-14 | Hoechst Ag | Nukleinsäurekonstrukte für die zellzyklusregulierte Expression von Genen, derartige Konstrukte enthaltende Zellen sowie deren Verwendung zur Herstellung von Heilmitteln |
| JP2000509259A (ja) | 1996-04-17 | 2000-07-25 | ヘキスト・マリオン・ルセル・ドイチユラント・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング | 血管内皮増殖因子（ＶＥｇＦ／ＶＰＦ）発現のアンチセンス阻害剤 |
| US5935937A (en) | 1996-06-19 | 1999-08-10 | Fox Chase Cancer Center | Compositions and methods for inducing apoptosis |
| EP0819758B1 (en) * | 1996-07-16 | 2006-09-20 | Archibald James Mixson | Cationic vehicle: DNA complexes and their use in gene therapy |
| US6271206B1 (en) * | 1996-09-12 | 2001-08-07 | Valentis, Inc. | Sonic nebulized nucleic acid/cationic liposome complexes and methods for pulmonary gene delivery |
| US5837283A (en) * | 1997-03-12 | 1998-11-17 | The Regents Of The University Of California | Cationic lipid compositions targeting angiogenic endothelial cells |
| US7112338B2 (en) * | 1997-03-12 | 2006-09-26 | The Regents Of The University Of California | Cationic liposome delivery of taxanes to angiogenic blood vessels |
| US6426086B1 (en) * | 1998-02-03 | 2002-07-30 | The Regents Of The University Of California | pH-sensitive, serum-stable liposomes |
| AU5646300A (en) | 1999-02-10 | 2000-08-29 | Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The | Methods of stimulating angiogenesis |
-
1997
- 1997-03-12 US US08/820,337 patent/US5837283A/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-03-12 AT AT98910354T patent/ATE362753T1/de active
- 1998-03-12 WO PCT/US1998/004891 patent/WO1998040052A1/en not_active Ceased
- 1998-03-12 EP EP98910354A patent/EP1014945B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-12 DE DE69837807T patent/DE69837807T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-12 ES ES98910354T patent/ES2284201T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-12 BR BR9808018-0A patent/BR9808018A/pt not_active Application Discontinuation
- 1998-03-12 CA CA002283327A patent/CA2283327C/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-03-12 IL IL13169798A patent/IL131697A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-03-12 AU AU64613/98A patent/AU727946B2/en not_active Ceased
- 1998-03-12 KR KR10-1999-7008274A patent/KR100530534B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1998-03-12 EP EP07000360A patent/EP1767192A3/en not_active Withdrawn
- 1998-03-12 JP JP53981298A patent/JP4463880B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1998-07-31 US US09/127,177 patent/US6120799A/en not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-09-10 NO NO19994413A patent/NO327487B1/no not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-11-14 US US10/004,286 patent/US20020197306A1/en not_active Abandoned
-
2002
- 2002-05-29 US US10/160,714 patent/US6756055B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-11-22 US US10/302,374 patent/US7494666B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2003
- 2003-11-03 US US10/700,735 patent/US7094424B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2004
- 2004-04-02 US US10/817,053 patent/US7135192B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2005
- 2005-10-10 IL IL171355A patent/IL171355A/en not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-11-09 JP JP2006303924A patent/JP2007084565A/ja not_active Withdrawn
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2284201T3 (es) | Composiciones de lipidos cationicos direccionadas a las celulas angiogenicas endoteliales. | |
| ES2258471T3 (es) | Suministro de liposomas cationicos de taxanos a vasos sanguineos angiogenicos. | |
| US20070254022A1 (en) | Cationic liposome delivery of taxanes to angiogenic blood vessels | |
| US20220118116A1 (en) | Adhesive/adsorption switch on nanoparticles to increase tumor uptake and delay tumor clearance | |
| AU2005237143B2 (en) | Cationic liposome delivery of taxanes to angiogenic blood vessels | |
| MXPA99008343A (es) | Composiciones lipídicas catiónicas enfocando células endoteliales angiogénicas |