ES2275556T3

ES2275556T3 - Utilizacion de inhibidores de la tirosina quinasa para el tratamiento del cancer de mama.

Info

Publication number: ES2275556T3
Application number: ES00973002T
Authority: ES
Inventors: Nigel James Bundred
Original assignee: University of Manchester
Current assignee: University of Manchester
Priority date: 1999-11-02
Filing date: 2000-11-01
Publication date: 2007-06-16
Anticipated expiration: 2020-11-01
Also published as: NO20022065D0; ATE339957T1; IL149176A0; ZA200203431B; EP1272188B1; DK1272188T3; NO323206B1; CN1197577C; MXPA02004272A; NZ518696A; WO2001032155A3; GB9925958D0; JP2003513035A; US7553815B1; KR20020064306A; NO20022065L; AU779190B2; EP1272188A2; DE60030889D1; PT1272188E

Abstract

Uso de un inhibidor de la tirosina quinasa de EGFR en la fabricación de un medicamento para usar en la quimioprevención de la aparición de cáncer de mama en un humano libre de cáncer de mama invasivo mediante la simultánea reducción de la proliferación e incremento de la apoptosis de las células epiteliales en un estado normal o en un estado intermedio, entre epitelio normal y epitelio invasivo maligno, mediante (a) reducción de la transformación de las células desde un estado normal a uno maligno en un humano libre de cáncer de mama invasivo; (b) reducción de la transformación de las células desde un estado intermedio, entre epitelio normal y epitelio invasivo maligno, a un estado maligno en un humano libre de cáncer de mama invasivo; o (c) causando reversión sustancial del tejido epitelial hacia un estado normal desde un estado intermedio, entre epitelio normal y epitelio invasivo maligno; donde el inhibidor de la tirosina quinasa de EGFR es ZD1839.

Description

Utilización de inhibidores de la tirosina quinasa para el tratamiento del cáncer de mama.

La presente invención está relacionada con el uso terapéutico de compuestos que poseen actividad inhibitoria contra la enzima tirosina quinasa del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). En particular, la invención está relacionada con el uso de tales compuestos para inhibir la transformación de células normales en células cancerosas, es decir, que los compuestos son agentes quimiopreventivos del cáncer.

Estos últimos años se ha descubierto que una célula puede convertirse en cancerosa en virtud de la transformación de una porción de su ADN en un oncogen, es decir, un gen que, activado, conduce a la formación de células de tumor maligno (Bradshaw, Mutagenesis, 1986, 1, 91). Varios de estos oncogenes dan lugar a la producción de proteínas que son receptores para factores del crecimiento. El complejo del receptor del factor del crecimiento conduce posteriormente a un aumento en la proliferación celular. Se sabe, por ejemplo, que varios oncogenes codifican las enzimas tirosina quinasa y que ciertos receptores de factor de crecimiento también son enzimas tirosina quinasa (Yarden et al., Ann. Rev. Biochem., 1988, 57, 443; Larsen et al. Ann. Reports in Med. Chem. 1989, Chpt. 13).

Las tirosina quinasas de receptor son importantes en la transmisión de señales bioquímicas que inician la replicación de la célula. Son enzimas grandes que atraviesan la membrana celular y poseen un dominio de unión extracelular para los factores de crecimiento tales como el factor de crecimiento epidérmico (EGF) y una porción intracelular que funciona como una quinasa para fosforilar aminoácidos de tirosina de proteínas y por lo tanto influencian en la proliferación celular. Se conocen varias clases de tirosina quinasas de receptor (Wilks, Advances in Cancer Research, 1993, 60, 43-73) en base a las familias de factores de crecimiento que se unen a diferentes tirosina quinasas de receptor. La clasificación incluye las tirosina quinasas de receptor de Clase I que comprenden la familia EGF de tirosina quinasas de receptor tales como los receptores EGF, TGF\alpha, NEU, erbB, Xmrk, HER y let23, las tirosina quinasas de receptor de Clase II que comprenden la familia de la insulina de tirosina quinasas de receptor tales como los receptores de la insulina, IGFI y el receptor relacionado con la insulina (IRR) y las tirosina quinasas de receptor de Clase III que comprenden la familia de tirosina quinasas de receptor del factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF) tales como los receptores PDGF\alphaa, PDGF\betab y el factor 1 estimulador de colonias
(CSF1).

Se sabe que las quinasas de Clase I tales como la familia EGF de tirosina quinasas de receptor están frecuentemente presentes en cánceres epiteliales humanos comunes tales como los cánceres de mama (Sainsbury et al., Brit. J. Cancer, 1988, 58, 458; Guerin et al., Oncogene Res., 1988, 3, 21 y Klijn et al., Breast Cancer Res. Treat., 1994, 29, 73), cáncer de pulmón no microcítico (NSCLCs) incluyendo adenocarcinomas (Cerny et al., Brit. J. Cancer, 1986, 54, 265; Reubi et al., Int. J. Cancer, 1990, 45, 269; y Rusch et al., Cancer Research, 1993, 53, 2379) y cáncer de células escamosas del pulmón (Hendler et al., Cancer Cells, 1989, 7, 347), cáncer de vejiga (Neal et al., Lancet, 1985, 366), cáncer oesofageal (Mukaida et al., Cancer, 1991, 68, 142), cáncer gastrointestinal como cáncer de colon, rectal o de estómago (Bolen et al., Oncogene Res., 1987, 1, 149), cáncer de la próstata (Visakorpi et al., Histochem. J., 1992, 24, 481), leucemia (Konaka et al., Cell, 1984, 37, 1035) y cáncer de ovario, bronquial o pancreático (EP-A-0400586). Cuanto más se analicen los tejidos tumorales humanos para la familia de EGF de tirosina quinasas de receptor se espera que se establezca su prevalencia extendida en otros cánceres tales como el cáncer de tiroides y uterino. Se ha demostrado más recientemente (W J Gullick, Brit. Med. Bull., 1991, 47, 87) que receptores de EGF que poseen actividad tirosina kinasa se sobreexpresan en muchos cánceres humanos tales como tumores de cerebro, de células escamosas de pulmón, de vejiga, gástrico, de mama, de la cabeza y del cuello, oesofageal, ginecológico y de la tiroides.

Se ha reconocido por consiguiente que un inhibidor de tirosina quinasa de receptor podría tener valor como inhibidor selectivo del crecimiento de las células de cáncer epitelial (Yaish et al., Science, 1988, 242, 933).

Se sabe de EP-A-0566226 y de las Solicitudes de Patente Internacional WO-A-96/33980 y WO-A-97/30034 que ciertos derivados de quinazolina que poseen un sustituyente anilino en la posición 4- poseen actividad inhibitoria de tirosina quinasa de EGFR y son inhibidores de la proliferación del tejido canceroso.

También se sabe de las Solicitudes de Patente Internacionales WO-A-96/30347 y WO-A-97/38983 que ciertos derivados de quinazolina estructuralmente relacionados que poseen un sustituyente anilino en la posición 4- también poseen actividad inhibitoria de tirosina quinasa de EGFR.

Posteriormente se ha demostrado que muchos otros derivados de 4-anilinoquinazolina y compuestos estructuralmente relacionados de estos poseen actividad inhibitoria de la tirosina quinasa de EGFR.

Compuestos particulares de los que se ha establecido que poseen actividad inhibitoria tirosina quinasa potente incluyen: N-(3-cloro-4-fluorofenil)-7-metoxi-6-(3-morfolinopropoxi)quinazolina-4-amina (identificado a partir de ahora con el número de código ZD1839); N-(3-etinilfenil)-6,-7-bis(2-metoxietoxi)quinazolina-4-amina (identificado a partir de ahora con el número de código CP358774); y 6-acrilamido-N-(3-cloro-4-fluorofenil)-7-(3-morfolinopropoxi)quinazolina-4-amina (identificado a partir de ahora con el número de código PD0183805) descritos, por ejemplo, en J. Med. Chem., 1999, 42, 1803-1815.

\newpage

Todo lo antes dicho se relaciona con el tratamiento de las células completamente cancerosas. Así, se creía que tales inhibidores de la tirosina quinasa de EGFR funcionan para inhibir la señalización aguas abajo para EGFR en células de cáncer ER- y de tal modo inhiben la proliferación de tales células.

En cuanto a las células normales, se sabe que EGF puede tener un efecto mitogénico en una variedad de células epiteliales no-transformadas crecidas en cultivo (Carpenter et al., Annual Reviews in Biochemistry, 1979, 48, 193) incluyendo las células de las glándulas mamarias del ratón, pero que EGF puede también tener un efecto inhibitorio del crecimiento en ciertas líneas celulares y en tejido mamario en ratón que prolifera de manera natural (Coleman et al., Developmental Biology, 1990, 137, 425).

Ahora hemos encontrado que el inhibidor ZD1839 de la tirosina quinasa de EGFR tiene efecto no sólo en el crecimiento de las células cancerosas epiteliales transformadas sino también en el crecimiento constitutivo de células epiteliales normales. En, por ejemplo, tejido epitelial mamario humano normal de mujer, el estrógeno estimula el crecimiento normal e induce la expresión del receptor de la progesterona. Esto permite, que los efectos hormonales de un segundo esteroide sexual se medien en el epitelio de mama. El crecimiento constitutivo de, por ejemplo, las células epiteliales mamarias comprende la producción base no dependiente de estrógeno de células que disminuye con la edad de la mujer y después de la menopausia.

Así usando un modelo del xenoinjerto que supone la implantación y el crecimiento de tejido mamario normal humano y cáncer de mama in situ en ratones atímicos BALB/c nu/nu (Holland et al., J. National Cancer Institute, (1997), 89, 1059 y Gandhi et al, Cancer Research, (2000), 60, 4284-4288), hemos encontrado ahora que el inhibidor ZD1839 de la tirosina quinasa de EGFR tiene efectos en la proliferación constitutiva y la estimulada por estrógeno de tejido mamario benigno premenopáusico y pre-maligno [Carcinoma Ductal In Situ (DCIS)]. El efecto inhibitorio en el crecimiento constitutivo y en el estimulado por estrógeno proporciona un método para la inhibición de la transformación de células normales en células cancerosas i.e. la base para el tratamiento quimiopreventivo de las mujeres, particularmente de aquéllas con alto riesgo de desarrollar cáncer de mama maligno.

El inhibidor de la tirosina quinasa de EGFR puede por lo tanto utilizarse para reducir, preferiblemente inhibir, la transformación de células epiteliales, particularmente células epiteliales mamarias, desde un estado normal a uno maligno.

Dado que se sabe que EGF puede tener un efecto inhibidor del crecimiento en ciertas líneas celulares y de tejido mamario proliferante natural en ratones, probablemente vía su receptor de crecimiento, es sorprendente que un compuesto que bloquea de hecho tal recepción de crecimiento (un inhibidor de EFGR) debe también reducir la proliferación.

Así, aunque antioestrogénos convencionales como el Tamoxifeno, que funcionan eficazmente bloqueando el efecto del estrógeno sobre el receptor del estrógeno y rebajan la producción de EGF/TGF\alpha por la célula, y contrariamente al mecanismo previamente mencionado del funcionamiento de los inhibidores de EGFR sobre las células ER- de cáncer (asociadas también con el bloqueo de EGFR), se cree que el inhibidor de EGFR ZD1839, cuando se administra al epitelio mamario benigno in vivo o a cáncer mamario no invasivo in vivo (tanto ER+ o ER-), funciona bloqueando directamente el papel de proliferación celular de la tirosina quinasa. Así, bloqueando directamente la tirosina quinasa de EGFR, la naturaleza de la sensibilidad de hormonal de las células llega a ser irrelevante; i.e., el fármaco funciona por un mecanismo no-hormonal.

Más detalladamente, en referencia en primer lugar al crecimiento de la célula, en el pecho, la mayoría de las células de crecimiento son EGFR+ y ER-. En ausencia de un inhibidor de EGFR, el estrógeno estimula (solamente) las células ER+, que secretan producción de EGF, que a su vez actúa sobre las células ER- de manera paracrina para inducir la proliferación. Los inhibidores de TK de EGFR de la invención se unen a EGFR directamente en las células ER- para inhibir tal proliferación.

Por otra parte, la muerte de la célula (apoptosis) se previene por las señales de supervivencia de la matriz del tejido y de factores del crecimiento. El factor de crecimiento parecido a la insulina (en inglés, "insulin like growth factor", IGFI) señaliza a través del Receptor de IGFI para prevenir la muerte celular en el pecho.

Un trabajo reciente de Roudabush et al (J. Biol. Chem, (2000), 275, 22583-22589) ha demostrado que la estimulación de IGFR inducida por IGFRs dirige la secreción de un miembro de la familia de EGF fuera de la célula que actúa luego sobre la propia célula, y sobre las células vecinas, EGFR. El bloqueo del EGFR en la mama por inhibidores de TK de EGFR en la invención conduce por lo tanto a la muerte celular (apoptosis) in vitro e in vivo en epitelio
mamario.

Sorprendentemente, el TKI de EGFR puede actuar directamente, no sólo sobre el EGFR expresado en células ER- sino independientemente sobre células ER+.

R B Clarke et al, en Cancer Research (1997 57 4987-4991), han demostrado que células de mama epiteliales ER+/EGFR- normales no proliferan mientras que las células ER-/EGFR+ vecinas lo hacen, indicando que la proliferación ocurre por dos mecanismos, llamados estimulación por estrógeno de

(1): ER+ células y

(2): EGF y ligandos relacionados secretados por células ER+ para estimular paracrinamente las células EGFR+/ ER- vecinas.

Inhibiendo TK con TKI de EGFR, se evita que las células ER-/EGFR+ vecinas proliferen.

Además, nuestros datos demuestran que el TKI de EGFR también evita la expresión del receptor de progesterona inducido por estrógeno en células ER+ y reduce la producción de células ER+.

De esta manera, el estrógeno induce el receptor de la hormona esteroide y la síntesis de proteína en células normales ER+ para permitir la proliferación y el crecimiento y respuesta hormonal de una célula y para secretar factores estimuladores del crecimiento (e.g. EGF) que actúan sobre células epiteliales de mama ER- vecinas.

Sin embargo, debido a que el inhibidor de TK de EGFR evita la inducción del receptor de la progesterona por estrógeno en células ER+, reduce la sensibilidad hormonal y la estimulación del epitelio mamario y previene la transformación de tejido normal a canceroso.

El índice de marcaje del receptor de la progesterona (PRLI), que cae en tejido mamario normal no expuesto a niveles premenopáusicos de estrógeno a aproximadamente un 5%, incrementa al exponerse a estrógeno a un 15% (I J Laidlaw et al, Endocrinology (1994), 136, 164-171). El uso de ZD1839 para antagonizar la estimulación de estrógeno abroga este incremento dando un PRLI de un 10%.

Además, un inhibidor de la tirosina quinasa de EGFR se puede utilizar sobre tejido epitelial, particularmente tejido epitelial mamario, que se ha desarrollado hacia una fase intermedia no invasiva entre el epitelio normal, particularmente epitelio normal de mama, y epitelio invasivo maligno, particularmente epitelio invasivo maligno de mama, tanto para prevenir la proliferación de tales células como para hacer que el tejido epitelial en tales células substancialmente revierta a un estado normal.

Ejemplos de tales células en fase intermedia son aquéllas asociadas con hiperplasia ductal atípica, neoplasia lobular y células de cáncer in-situ no invasivas presentes dentro del conducto y/o del lumen de un pecho. Tales células pueden estar presentes en pacientes con un riesgo elevado de cáncer de mama. De acuerdo con el primer, segundo y tercer aspectos de la presente invención representados por las alternativas (a)-(c) más abajo, aquí se proporciona el uso de un inhibidor de la tirosina quinasa de EGFR en la fabricación de un medicamento para usar en la quimioprevención de la aparición de cáncer de mama en un humano libre de cáncer de mama invasivo, especialmente una mujer, mediante la simultánea reducción de la proliferación e incremento de la apoptosis de las células epiteliales en un estado normal o en un estado intermedio, entre epitelio normal y epitelio invasivo maligno, mediante

(a): reducción, preferiblemente inhibición, de la transformación de células epiteliales, en particular células epiteliales mamarias, desde un estado normal a un estado maligno en un humano libre de cáncer de mama invasivo;

(b): reducción, preferiblemente inhibición, de la transformación de células epiteliales, en particular células epiteliales mamarias, desde un estado intermedio, como se ha definido arriba, a un estado maligno en un humano libre de cáncer de mama invasivo; o

(c): causando reversión sustancial del tejido epitelial, en particular tejido epitelial mamario, hacia un estado normal desde un estado intermedio, como se ha definido previamente, entre epitelio normal, en particular epitelio de mama normal, y epitelio invasivo maligno, en particular epitelio de mama invasivo maligno;

donde el inhibidor de la tirosina quinasa de EGFR es ZD1839.

La invención, de acuerdo con cada uno de los aspectos primero y segundo (a) y (b) de arriba, es particularmente aplicable para pacientes con alto riesgo de cáncer de mama, llamados pacientes "alto riesgo". Se sabe clasificar a los pacientes de alto riesgo al ser aquéllos con una puntuación de al menos 1.5 en el llamado Modelo de Gail de Riesgo, un programa para ordenador aceptable para la determinación del riesgo de cáncer de mama (ver M. H. Gail et al, J. Natl. Cancer Inst, (1989), 81, 1879-1886). Factores que incrementan el riesgo de desarrollar cáncer de mama incluyen la presencia de células intermedias asociadas con hiperplasia atípica (incluyendo una historia de esto como el hecho de cáncer de mama en un primer pariente), neoplasia lobular, cáncer in-situ no invasivo o la presencia de un gen BRCAI mutado (ver D. L. Page et al, BMJ, (1994), 309, 61-64).

Así, la invención es especialmente aplicable al tratamiento de células intermedias.

Tal medicamento, como se fabrica arriba, puede emplearse en un método para reducir, preferiblemente inhibir, la transformación de células epiteliales, en particular células epiteliales mamarias, desde un estado normal a uno maligno en un humano libre de cáncer de mama invasivo, especialmente una mujer, que comprende la administración de una cantidad efectiva del inhibidor de tirosina quinasa de EGFR.

Un medicamento, como se fabrica arriba, puede emplease en un método para reducir, preferiblemente inhibir, la transformación de células epiteliales, en particular células epiteliales mamarias, desde un estado intermedio a un estado maligno en un humano libre de cáncer de mama invasivo, especialmente una mujer, que comprende la administración de una cantidad efectiva del inhibidor de tirosina quinasa de EGFR.

Tales métodos de administración como se describen arriba son particularmente aplicables para pacientes con un alto riesgo y para el tratamiento de células intermedias, como se ha definido arriba.

Tal medicamento, como se fabrica arriba, puede emplearse en un método que comprende la administración a un humano libre de cáncer de mama invasivo, especialmente una mujer, de una cantidad efectiva del inhibidor de tirosina quinasa de EGFR.

En uso, el inhibidor de tirosina quinasa de EGFR ZD1839 puede administrarse solo o en una composición que contiene un excipiente farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, se administra en forma de comprimido.

Se administrará generalmente de manera que se dé una dosis efectiva no tóxica. El tamaño de la dosis variará naturalmente de acuerdo con la ruta escogida de administración al paciente. En general, pueden emplearse dosis convencionales de inhibidor de tirosina quinasa de EGFR. Más particularmente, para el inhibidor de tirosina quinasa de EGFR ZD1839, se administra una dosis diaria en el rango, por ejemplo, desde aproximadamente 10 mg a 5 g, preferiblemente desde aproximadamente 10 mg a 1000 mg, más preferiblemente desde aproximadamente 10 mg a 500 mg (i.e. aproximadamente 0.2 mg/kg a 100 mg/kg de peso corporal, preferiblemente desde aproximadamente 0.2 mg/kg a 20 mg/kg de peso corporal, más preferiblemente desde aproximadamente 0.2 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal), dada si se requiere en dosis repartida.

La inhibición de la transformación celular definida antes puede aplicarse como una terapia única o puede suponer, además del inhibidor de la tirosina quinasa de EGFR ZD1839, una o más otras sustancias y/o tratamientos.

Así, un cuarto aspecto de la invención proporciona un kit medicinal de un primer y un segundo componentes activos para uso en la quimioprevención de la aparición de cáncer de mama en un humano libre de cáncer de mama invasivo mediante la simultánea reducción de la proliferación e incremento de la apoptosis de las células epiteliales en un estado normal o en un estado intermedio, entre epitelio normal y epitelio invasivo maligno, mediante

(a): reducción de la transformación de células epiteliales desde un estado normal a uno maligno en un humano libre de cáncer de mama invasivo;

(b): reducción de la transformación de las células desde un estado intermedio, entre epitelio normal y epitelio invasivo maligno, a un estado maligno en un humano libre de cáncer de mama invasivo; o

(c): causando reversión sustancial del tejido epitelial hacia un estado normal desde un estado intermedio, entre epitelio normal y epitelio invasivo maligno;

donde el primer componente activo es un inhibidor de la tirosina quinasa de EGFR que es ZD1839 y el segundo componente activo es un antiestrógeno.

Tal tratamiento conjunto puede conseguirse por medio de la administración simultánea, secuencial, separada o intermitente de los componentes individuales del tratamiento. Por ejemplo, en mujeres con riesgo por encima del promedio de desarrollar cáncer de mama, cuando se utiliza el inhibidor de la tirosina quinasa de EGFR para inhibir la transformación del tejido mamario en cáncer de mama, puede ser práctica normal utilizar una combinación de diferentes formas de tratamiento. El otro componente de tal tratamiento conjunto puede incluir un antiestrógeno tal como tamoxifeno, fulvestrant (ICI 182,780:faslodex) o raloxifeno. Luego puede ser beneficioso emplear terapia secuencial con, por ejemplo, un primer periodo de tratamiento de aproximadamente 1 a 6 meses durante el cual se administra una dosis convencional de un inhibidor de tirosina quinasa tal como ZD1839 seguido por un segundo periodo de tratamiento de aproximadamente 1 a 6 meses durante el cual se administra una dosis convencional de un antiestrógeno tal como tamoxifeno, fulvestrant o raloxifeno. Así se permite que haya un periodo donde se permite que crezca constitutivamente tejido mamario con el fin de minimizar la extensión de la atrofia tisular.

Alternativamente la terapia combinada puede incluir la administración continua de un antiestrógeno tal como tamoxifeno, fulvestrant o raloxifeno y la administración intermitente del inhibidor de la tirosina quinasa de EGFR ZD1839. La terapia intermitente del inhibidor de la tirosina quinasa de EGFR puede suponer, por ejemplo, un ciclo de dos meses de tratamiento que comprenda una primera porción que implique la dosificación del inhibidor de la tirosina quinasa de EGFR ZD1839 por un periodo de aproximadamente un mes seguido de una segunda porción que implique un periodo libre de fármaco de tirosina quinasa de EGFR de alrededor de un mes. A partir de entonces se pueden dar ciclos de dos meses más de tal tratamiento.

Ahora se describirán realizaciones de la invención en más detalle con referencia a los siguientes Ejemplos y las figuras que acompañan en los que:

\newpage

La Fig. 1 ilustra, por el Ejemplo 2, la proliferación (Ki67 LI) y apoptosis (AI) en epitelio ER-/EGFR+ y ER+/EGFR-DCIS; y

La Fig. 2 ilustra, por el ejemplo 3, la dosis respuesta de ZD1839 en mama (a) DCIS y (b) normal.

Ejemplo 1

Se determinó el efecto de los inhibidores de la tirosina quinasa de EGFR de la presente invención utilizando un modelo de xenoinjerto que supone la implantación y crecimiento de tejido de mama normal humano y de cáncer de mama in situ en ratones nu/nu BALB/c atímicos hembra (Holland et al., J. National Cancer Institute, 1997, 89, 1059 y Gandhi et al, Cancer Research, (2000), 60, 4284-4268). Se implantaron como xenoinjertos, tejido de mama normal y tejido de carcinoma ductal in situ (DCIS) de mujeres sometidas a cirugía terapéutica, en ratones hembra. Después de 14 días, se inició una dosis diaria de ZD1839 de 10 a 200 mg/kg durante un periodo de 14 días. Se extirpó el tejido de xenoinjerto a los días 0, 14, 21 y 28. Se implantaron subcutáneamente pellets de 17\beta-estradiol (2 mg) en un segundo grupo de experimentos (utilizando xenoinjertos de mama normal) en el día 14 tanto en los ratones control como en los de tratamiento y se utilizó inmunotinción Ki67 convencional para valorar la proliferación epitelial (Ki67 es un anticuerpo monoclonal para un marcador en una célula).

Se obtuvieron los siguientes resultados:

1

2

3

Ejemplo 2 Resumen del procedimiento

Se implantó tejido de mama de 16 mujeres sometidas a cirugía por DCIS en 16-20 ratones inmunosuprimidos por experimento (8 xenoinjertos/ratón). El tratamiento empezó 2 semanas post implante y consistió en un cebado diario con ZD1839 a 10-200 mg/kg durante 14-28 días; estaban presentes controles apropiados. Los xenoinjertos se quitaron en los días 14, 21, 28 y 42 y a continuación se valoraron para proliferación (LI) por inmunotinción Ki67, y apoptosis (AI) por morfología.

Materiales y Métodos Pacientes

Los participantes en este estudio eran mujeres atendidas en el Nightingale Breast Screening Assessment Centre o en el Symptomatic Breast Clinic en el University Hospital of South Manchester, U. K. durante el periodo de noviembre de 1998 a enero de 2000. Se incluían las mujeres en el estudio si tenían mamogramas que mostrasen microcalcificación generalizada indicativa de DCIS y confirmación tanto citopatológica como histopatológica del diagnóstico (n=16). Todas las muestras de tejido se obtuvieron por escisión terapéutica de DCIS. La aprobación para extirpar tejido de muestras patológicas en este estudio se concedió por el South Manchester Medical Research Ethics Committee.

Animales

Se obtuvieron ratones "nude" atímicos (BALB/c nu/nu) de 8-10 semanas de edad, hembra, adultos, intactos, de la colonia de criadero del Paterson Institute for Cancer Research. Fueron alojados bajo condiciones convencionales con un ciclo de luz y oscuridad de 12 horas (no luz desde las 7 PM hasta las 7 AM) en jaulas de alto filtro. Se les subministró ad libitum con alimento irradiado y agua filtrada y lecho irradiado durante la cría. Se utilizaron alimentos, agua y lecho normales durante los experimentos. Todo el cuidado de los animales y los procedimientos quirúrgicos se llevaron a cabo de acuerdo con las regulaciones Home Office Regulations y los procedimientos de UK Scientific Procedures (1986) Act. Se utilizó para todos los experimentos anestesia por inhalación de halotano (2-4% halotano en oxígeno; Halovet Vapouriser, International Market Supplies, Congleton, U. K.).

Tratamiento de las Muestras de Tejido

Para la preparación de las muestras de tejido para injertar a los ratones, se tomaron piezas de 1-2 cm^{3} de tejido mamario, que contenía microcalcificaciones, en el momento de la cirugía de las muestras principales. El tejido fresco se despojó del exceso de grasa y se dividió inmediatamente bajo condiciones estériles en tres o cuatro porciones más pequeñas y se colocaron en Medio Dulbecco's Modified Eagle (DMEM), con 4.5 g/L de glucosa y sin piruvato sódico (Gibco Life Technology, Paisley, Scotland, UK) a temperatura ambiente hasta la implantación en los ratones. En el laboratorio, se colocó el tejido en DMEM fresco en una placa de Petri estéril, y se diseccionó el tejido cuidadosamente en muestras de 2-mm x 2-mm x 1 mm con una hoja de escalpelo. Dependiendo del volumen de tejido disponible, se seleccionaron al azar entre 5 y 20 trozos de la placa de Petri y no se implantaron en los ratones pero en cambio, fueron usados para histología. La mitad de estos injertos no implantados (día 0) fueron fijados inmediatamente en formalina tamponada (4% formaldehído) durante 24 horas, y la otra mitad en fijador Camoy's durante 1 hora, y después todos ellos fueron guardados en 70% de alcohol. Después de al menos 24 horas, se colocaron individualmente las muestras de tejido fijado en cassettes de tejido (Tissue Tek III; Bayer Diagnostics Ltd., Basingstoke, UK.) y se guardaron en 70% de alcohol hasta la fijación con parafina. Estas muestras representantes de las extirpaciones DCIS de cada paciente, se etiquetaron como las muestras "Día 0", y se reservaron para examen histológico, inmunotinción, y recuento de células apoptóticas. Los xenoinjertos restantes se implantaron en ratones "nude".

Implantación de Xenoinjertos en ratones "nude"

Como en el Ejemplo 1, cada muestra de paciente se dividió entre 10 y 32 ratones (dependiendo del volumen de tejido y del número de ratones disponibles; número medio, dieciséis). El trasplante de xenoinjertos a los ratones se completó dentro de 90 minutos de la extirpación del tejido de la paciente. Se realizaron dos pequeñas incisiones en la piel media de un lado a otro de la piel dorsal a través de las cuales se colocaron simétricamente ocho trozos de tejido (4 en cada lado). La recuperación de estos xenoinjertos en puntos de tiempo apropiados requirió reanestesiar los ratones y extirpar cada injerto utilizando disección aguda. Después, los injertos fueron procesados para histología como se describe antes para las muestras del Día 0. Para los experimentos de 100-200 mg/kg de ZD1839, se extirparon los injertos en los Días 14, 21 y 28; a las dosis más bajas (10-75 mg/kg), los injertos se recuperaban en los Días 14, 28 y 42. Dos xenoinjertos fueron eliminados en cada punto de tiempo intermedio y 4 xenoinjertos en cada punto de tiempo final de cada ratón.

Tratamiento

Los ratones fueron cebados durante 14-28 días con ZD1839 (10-200 mg/kg) o vehículo empezando el Día 14 después de la eliminación de los 2 primeros xenoinjertos. El ZD1839 (4-(3-cloro-4-fluorofenilamina)-7-metoxi-6-(3-(4-morfolinil)quinazolina), un EGFR-TKI selectivo activo oralmente, fue una donación de AstraZeneca Pharmaceuticals. El vehículo (control) era 0.5% de polisorbato.

Evaluación Histológica de los Xenoinjertos

Todas las muestras a Día 0 y cada xenoinjerto se fijaron en bloques de parafina. Un único patólogo de mama experimentado examinó para presencia de DCIS, las secciones de 3-\mum de cada uno de los bloques, teñidas en H&E; aquéllas que contenían DCIS se valoraron en apoptosis y en inmunogenicidad del antígeno Ki67 (como un marcador de proliferación epitelial) como se ha descrito previamente.

También se averiguó para todas las muestras a Día 0 que contenían DCIS el grado nuclear y la presencia o ausencia de comedo-necrosis. Además, las muestras a Día 0 se evaluaron inmunohistoquímicamente para el estado de ER, c-erB-2m, EGFR.

Valoración de la muerte celular apoptótica

Las secciones teñidas en H&E de las muestras de DCIS se examinaron utilizando microscopio óptico para indicios morfológicos de apoptosis. Los criterios utilizados para identificar células apoptóticas están bien reconocidos, e incluyen la condensación de la cromatina inicialmente en los márgenes del núcleo; condensación del citoplasma (cromofilia), separación de las células de los alrededores, indicado por la aparición de un halo blanco característico alrededor de la célula moribunda; e inicios citoplasmáticos para formar fragmentos de unión a membrana (cuerpos apoptóticos). Para adquirir el AI, se recontaron al menos 1000 células a x400 aumentos utilizando un microscopio Zeiss, y el número de células que mostraban morfología apoptótica se expresaron como porcentaje del número total contado.

Determinación inmunohistoquímica de ER y de Antígeno Nuclear Ki67

Se utilizó la metodología inmunohistoquímica de ER y Ki67. Éstas han sido previamente descritas (Gandhi et al, Br. J. Cancer. (1998), 78, 785-794).

Tanto la tinción de ER como la de Ki67 era predominantemente nuclear con mínima respuesta citoplasmática. La intensidad de la tinción era variable, pero no se valoró separadamente, y las células se juzgaron como positivas o negativas. El índice de marcaje (LI) de Ki67 se calculó a partir de contar un mínimo de 1000 células epiteliales y el número de núcleos teñidos positivamente se expresaba como un porcentaje del número total contado. El estado ER se determinó también contando a 1000 células, y las lesiones se consideraban ER+ si >5% de las células estaban positivamente teñidas para ER.

Determinación inmunohistoquímica de c-erB-2, EGFR y pErk1/Erk2

Se cortaron secciones de parafina (3 \mum de grosor) de tejido de cada muestra, se montaron en portaobjetos recubiertos de APES (3-aminopropiletoxisilano), desparafinadas e hidratadas antes de la tinción inmunohistoquímica para c-erB-2, EGFR y Erk1/Erk2 fosforilados (p). La recuperación del antígeno se consiguió mediante un método de microondas (650W) durante 30 minutos (min). La actividad peroxidasa endógena se bloqueó mediante incubación en peróxido de hidrógeno [1.5% (v/v) para EGFR y c-erB-2, 3% (v/v) para pErk1/Erk2] en tampón fosfato salino (PBS) durante 15 min. Para los antígenos c-erB-2 y EGFR, los portaobjetos se enjuagaron en TBS antes de usar un 10% de suero de conejo normal para bloquear la unión no específica y después se incubaron con el anticuerpo primario a una dilución de 1:20 para EGFR (antihumano monoclonal de ratón, NCL-EGFR; Novocastra labs, Newcastle upon Tyne, UK) y a una dilución de 1:40 para c-erbB-2 (monoclonal de ratón, MAB4022, Chemicon, Harrow, UK), durante 1 hora a temperatura ambiente. Se aplicó como anticuerpo secundario una inmunoglobulina antiratón de conejo biotinilada (E413, Dako, High Wycombe, UK) (dilución 1:350, incubado durante 30min), y seguido de esto, una incubación de 30 min a temperatura ambiente (RT) con el estándar de rábano picante (en inglés "horseradish") con tres capas de estreptavidina-avidina-biotina (K0377, Dako) para c-erbB-2 y EGFR.

Para la detección del antígeno pErk1/Erk2, se bloquearon las secciones con 20% de suero humano normal durante 15 min antes de la aplicación de los anticuerpos primarios antihumanos de conejo policlonales de pMEK, pErk1/Erk2, pElk1 a una dilución de 1:20 (9101L, New England Biolabs, UK). Se aplicó como anticuerpo secundario durante 1 hr el Biogenex Multil Link a una dilución de 1:100 (Euro/DPC, Llanberis, UK). Se empleó un procedimiento kit inmunohistoquímico de complejo avidina-biotina (Biogenex Concentrated Label, Euro/DPC).

Se aplicó durante 5 min el cromógeno diaminobencidina (Sigma, Poole, UK) y después hematoxilina como tinción de contraste durante 5 min.

Se utilizaron controles negativos (IgG de ratón genérica, X0931, Dako) y controles positivos (secciones de células A431 para EGFR, y de tejido DCIS que previamente había mostrado ser fuertemente positivo para c-erbB-2 y pErk1/Erk2).

La tinción para c-erbB-2 y EGFR era predominantemente membranosa pero había también respuesta citoplasmática y nuclear. Éstas se puntuaron como positivas (escala 1-4) o negativas en relación con los portaobjetos de control positivo y negativo. La tinción para pErkl/Erk2 era nuclear y citoplasmática y puntuada de acuerdo con la tinción de los componentes citoplasmáticos y nucleares antes descritas (Gee et al, Int. J. Cancer (1995), 64, 269-273).

Todas las valoraciones histológicas se llevaron a cabo por investigadores a ciegas para el grupo de tratamiento. La reproducibilidad del recuento se valoró por el mismo investigador re-puntuando 10 portaobjetos teñidos con el anticuerpo Ki67 y 10 portaobjetos H&E para apoptosis durante varios meses después de la estimación inicial. Los dos grupos de resultados obtenidos de esta manera estaban bien correlacionados por análisis de regresión (r=0.95, P<0.001).

Proliferación epitelial en intestino de ratón normal

La extirpación, procesado de tejido intestinal para la valoración de Ki67, y la metodología de puntuación se han descrito previamente (Potten y Grant, Br. J. Cancer, (1998), 78, 993-1003).

Métodos estadísticos

El análisis estadístico se llevó a cabo utilizando el software SPSS (SPSS, Chicago, IL, USA) por el CRC Department of Computing and Biomathematics en el Paterson Institute for Cancer Research. Para cada caso que mostraba epitelio de mama normal o DCIS, se hizo una comparación entre muestras recuperadas de ratones tratados con ZD1839 y control en cada punto de tiempo de valoración. Las muestras de tejido obtenidas en cada tiempo de valoración en los dos grupos de estudio se consideraron estadísticamente independientes y se compararon utilizando el test de Mann Whitney U. Todos los tests significativos eran a dos bandas, utilizando el nivel de significado del 5% convencional. Los datos de las dosis separadas de ZD1839 se colapsaron después de que el análisis inicial demostró efecto a todas las dosis. Se utilizó el coeficiente de correlación de Pearson para examinar el grado de correlación entre variables métricas. El análisis estadístico de la proliferación en epitelio intestinal fue mediante comparación de medias en cada posición de la célula epitelial en las criptas.

Resultados

La edad media de las mujeres que fueron sometidas a cirugía era n=rango (estado menopáusico).

Implante de xenoinjerto y recuperación DCIS

De las 16 muestras de tejido mamario que contenían DCIS en el momento de la cirugía, 13 (81.3%) produjeron muestras a Día 0 que contenían DCIS, de las cuales 11 expresaban EGFR+ inmunohistoquímicamente con una puntuación media de 2 (rango 1-3), y 2 eran EGFR-. De estos 11 casos EGFR+, 7 eran ER-/c-erbB-2 positivos (todos grado nuclear elevado), y 3 ER+/c-erbB-2 positivos (1 grado alto, 2 grado intermedio) y 1 ER+/c-erbB-2 negativo (grado bajo). Las 13 muestras de tejido mamario condujeron a un total de 273 muestras de Día 0 de las cuales 44 (16.1%) contenían focos de DCIS. Se implantaron un total de 1904 xenoinjertos, de los cuales 1858 (97.5%) se recuperaron con éxito. De los 1858 xenoinjertos recuperados, 329 (17.7%) contenían DCIS. La media de recuperación de DCIS por experimento fue de 71% del esperado (rango 14-91.3%). DCIS se recuperó en los xenoinjertos de los Días 14, 21, 28 y 42 en todos los 13 experimentos.

Mama normal

Se encontró tejido mamario histológicamente normal en todas las 16 muestras de cirugía por DCIS. La mayoría (97.6%) de los xenoinjertos implantados se recuperaron, de los cuales un 22.4% contenían mama normal. La mama normal se recuperó desde todos los puntos de tiempo en el 100% de todos los experimentos.

Todos los 16 casos fueron ER+ y EGFR+ con una puntuación media de 1 (rango 1-2), y 2 fueron también c-erB-2 débilmente positivos.

Mama normal (Tabla 1)

La Tabla 1 muestra la proliferación de EGFR+ (LI) y la apoptosis (AI) en ZD1839 (10-200 mg/kg [datos colapsados]) versus tratados con vehículo (a) mama normal y (b) epitelio DCIS a diferentes puntos de tiempo. Los números entre paréntesis representan los rangos entrecuartos ("interquartile") **p<0. 01, ***p< 0.001 versus control. Los xenoinjertos de mama normal tuvieron una disminución en el LI medio desde los Días 0 a 14 (4.9 [IQR: 4.0-5.7] versus 3.8 [IQR: 2.7-5.1], p<0.05) que después se mantuvo sin cambios para los otros puntos de tiempo (Días 21, 28, y 42). LI medio disminuyó en el grupo tratado con ZD1839 comparado con los controles en el Día 21 (2.3 [IQR: 1.0-3.8] versus 4.1 [IQR: 2.8-5.2]), Día 28 (2.2 [IQR: 1.7-3.3] versus 4.1 [IQR: 2.4-5.4]), y Día 42 (1.7 [IQR: 1.1-2.6] versus 2.8 [IQR: 2.3-5.1]) (todos p<0.01).

Los resultados AI fueron similares a los resultados de los xenoinjertos tratados DCIS de antes. No se observó reducción del AI medio desde el Día 0 al 14 (0.20 [IQR: 0.17-0.29] versus 0.18 [IQR: 0.10-0.21], p=0.90). En el Día 21, hubo un incremento en el AI medio en los xenoinjertos tratados con ZD1839 comparado con los controles (0.36 [IQR: 0.23-0.53] versus 0.18 [IQR: 0.10 a 0.25, p<0.001). Después de 14 días de tratamiento (Día 28), el AI medio se equilibró con los niveles de los controles (ZD1839 0.19 [IQR: 0.10-0.28] versus Control 0.18 [IQR: 0.10-0.20], p=0.35).

TABLA 1 Efecto de ZD1839 en la proliferación y la apoptosis en epitelio de mama normal y DCIS

4

DCIS EGFR+ (Fig. 1)

La Figura 1 muestra los cambios en LI y AI inducidos por ZD1839 en DCIS ER-/EGFR+ (1a y 1c) y ER+/EGFR+ (1b y 1d) respectivamente. ZD1839 o vehículo se dieron desde el día 14 en adelante. Los valores para los días 0 y 14 son para los ratones no tratados. Se vio en el grupo ZD1839 un incremento en AI y una disminución en LI después de 7 y 14 días de tratamiento (*p<0.05, **p<0.01 versus control) en ambos DCIS ER-/EGFR+ y ER+/EGFR+. Los números entre paréntesis representan el número de observaciones vistas para un punto de tiempo particular y para aquel grupo. Los valores medios se muestran como líneas horizontales gruesas, los cuadros representan rangos entrecuartos.

LI y AI medio en las muestras del Día 0 fue mayor en los 7 casos de DCIS ER-/EGFR+ que en los 4 casos de DCIS ER+/EGFR- (14.0 [IQR: 13.0-15.3] versus 7.8 [IQR: 6.5-11.2], y 1.3 [IQR: 1.0-1.6] versus 0.79 [IQR: 0.6-1.0] respectivamente, ambos p<0.05).

LI medio en DCIS ER-/EGFR+ disminuyó en el grupo tratado con ZD1839 comparado con el grupo tratado con vehículo por el Día 21 (4.7 [IQR: 2.6-17.2] versus 11.6 [IQR: 10. 7-15.1], p=0.19), Día 28 (8.3 [IQR: 2.7-10.9] versus 13.5 [IQR: 12.0-16.3], p<0.01)), y Día 42 (11.4 [IQR: 10.8-11.8] versus 13.0 [IQR: 12.0-14.8], p<0.05) (Fig. 1a).

No hubo cambio en AI medio en DCIS ER-/EGFR+ desde el Día 0 al 14 (1.3 [IQR: 1.0-1.6] versus 1.0 [IQR: 0.8-1.44], p=0.14). Después de 7 días de tratamiento (Día 21), hubo un incremento significativo en AI medio en el grupo tratado con ZD1839 comparado con el grupo tratado con vehículo (2.1 [IQR: 1.0-2.3] versus 0.7 [IQR: 0.5 a 1.1], p<0.01), aunque, después de 14 días de tratamiento (Día 28), AI medio volvió a los niveles de los controles (ZD1839 1.1 [IQR: 0.8-1.2] versus Control 1.2 [IQR 0.5-1.5], p=0.44) (Fig. 1b).

Se observaron cambios similares en LI y AI en DCIS ER+/EGFR+ (Fig. 1b y 1d) con una caída significativa en LI en el Día 14 (ZD1839 4.6 (IQR 3.9-5.2%) versus 11.2 Control (IQR 9.2-15.55) y un aumento en la apoptosis (ZD1839 1.5 (IQR 1.3-1.6) versus Control (IQR 0.6-0.9%).

Ki67 LI en EGFR+ (Fig. 2)

La Figura 2 muestra las tasas de proliferación epitelial (Ki67 LI) en EGFR+ (a) DCIS y (b) xenoinjertos de mama normal después de 2 semanas (Día 28) de cebado con diferentes dosis de ZD1839 (10-200 mg/kg) o de vehículo control. Los números entre paréntesis representan el número de observaciones vistas para un punto de tiempo particular y para un grupo. Los valores medios se muestran como líneas gruesas horizontales, los cuadros representan rangos entrecuartos.

Dosis crecientes de ZD1839 estaban asociadas con caídas crecientes de la proliferación epitelial tanto en DCIS ER-/EGFR+ como en ER+/EGFR+ pero no en mama normal (Fig. 2).

Correlación de la Proliferación con la Apoptosis

Hemos demostrado previamente una correlación positiva de LI con AI en DCIS. LI muestra una correlación positiva con AI en mama normal y DCIS (r=0.10, p=0.02, y r=0.25, p<0.01 respectivamente) no tratada con ZD1839 (i.e. Día 0, Día 14, y casos de vehículo control).

La comparación de la población celular utilizando la media del ratio Ll/AI (como ratio de producción celular) reveló que el tratamiento con ZD1839 inhibía significativamente la producción celular tanto en DCIS como en mama normal en el Día 28 (4.4 [2.7-6.9] versus 29.7 [13.1-40.2], y 8.5 [5.8-17.4] versus 33.8 [21.4-70.6] respectivamente, p<0.001.

Regulación negativa de pErk1/2 en DCIS tratados con EGFR TKI y mama normal

Para determinar si la ruta de señalización de la MAP quinasa queda afectada por la inhibición de la tirosina quinasa de EGFR, se llevó a cabo en Día 0 y Día 42 una detección inmunohistoquímica de (p) Erk1/Erk2 fosforilados en secciones de xenoinjertos de DCIS y de mama normal tratados con ZD1839 o vehículo. El "HScore" nuclear medio de mama normal y DCIS a Día 0 fue 30 (IQR: 12-45) y 22 (IQR: 12-34). En DCIS, el "HScore" nuclear estaba disminuido en el grupo tratado con ZD1839 comparado con los controles después de 28 días de tratamiento (8 [IQR: 5-18] versus 25 [IQR: 8-30], p<0.05). En mama normal hubo una diferencia similar (7 [IQR: 3-17.5] versus 18 [IQR: 8-32], p<0.01).

El "HScore" nuclear de pErK1/Erk2 correlacionaba con el Ki67 Ll en DCIS y en mama normal (ambos r=0.52, p=0.05).

Discusión

ER- DCIS sobreexpresa el oncogen c-erbB-2, y también está descrito que expresa EGFR en el 50% de los casos. Nosotros encontramos una expresión dual de ambos receptores en la misma población celular en 10 de 11 (90%) de ER- DCIS. ER- DCIS tiene una alta tasa proliferativa, que en muestras de pre-tratamiento correlacionaban con alta expresión del enzima de transducción de la señal de la MAP quinasa.

Así, nosotros pensamos en la hipótesis de que la formación de heterodímeros de EGFR/c-erbB-2 era responsable de la alta tasa de proliferación y de la expresión de MAP quinasa y probamos nuestra teoría mediante el uso de un péptido EGFR-TKI, ZD1839. En el tratamiento con ZD1839, se vio una caída prolongada en la proliferación epitelial y una disminución en la expresión de MAP quinasa combinado con un incremento en la apoptosis en un estadio temprano confirmando nuestra hipótesis. Se sabe que EGFR produce una señal mitogénica y correlaciona con proliferación y doblamiento tumoral en cáncer de mama invasivo, y la inhibición de esta ruta condujo a una caída en el índice de marcaje Ki67 en xenoinjertos de DCIS.

Se vio un incremento en la apoptosis tanto de DCIS como de epitelio de mama normal después de siete días de tratamiento. Aunque se cree que el Factor-1 de crecimiento tipo Insulina (en inglés, "Insulin Like Growth Factor-1", IGF-1) es importante en la supervivencia de la célula, trabajo reciente de Roudabush et al, J. Biol. Chem., (2000), 275, 22583-22589, ha indicado que la estimulación del receptor de IGF-1 conduce a la secreción de EGF que une heparina extracelularmente y promueve la transactivación en el receptor EGF. Así, el EGFR puede ser más importante para la supervivencia de la célula en mama normal que lo que se ha reconocido con anterioridad. Puesto que la proliferación epitelial correlaciona con la apoptosis en mama normal, se esperaría que una reducción en la proliferación correlacionase con una reducción en la apoptosis. Después del incremento inicial en la apoptosis después de 7 días en grupo tratado con ZD1839 la caída del índice de marcaje (proliferación) condujo a una caída en la apoptosis de 14 días. Sin embargo, el ratio LI/AI global en los grupos tratados con ZD1839 tanto en DCIS como en mama normal se redujo indicando una producción celular global menor con la inhibición de EGFR-TK. Además, la caída global en la producción celular indica el efecto quimiopreventivo potencial de un EGFR TKI en mama normal. Se ha descrito que DCIS de grado alto ER- es el más probable de sufrir una recaída después de escisión local amplia y en la recaída al menos el 50% se ha convertido en cáncer de mama de alto grado invasivo con metástasis distantes o nodales asociadas. La prevención de la recaída y la progresión hacia cáncer invasivo requiere de un agente que suprima la proliferación o incremente la apoptosis y el EGFR-TKI descrito cumple este criterio.

Una supresión de la proliferación epitelial de mama normal combinada con un incremento en la apoptosis indica el potencial de los inhibidores EGFR-TK como agentes quimiopreventivos en mujeres en riesgo elevado de cáncer de mama.

Se cree que la ruta de la MAP quinasa EGFR es importante en la proliferación celular, la supervivencia y la diferenciación. La correlación significativa positiva de pErk1/Erk2 con el índice de marcaje Ki67 en DCIS y mama normal sugiere que la señalización de la MAP quinasa es importante en mediar la proliferación celular en epitelio de mama. Una disminución en pErk1/Erk2 en el grupo tratado con ZD1839 correlacionó con una caída en la proliferación y es probable que las señales EGFR a través de esta señalización y cambios en la MAP quinasa predecirán la respuesta farmacológica.

Ejemplo 3

Utilizando en método del Ejemplo 1, cuyos pasos de procedimiento están descritos con más detalle en el Ejemplo 2, se midió el efecto de ZD 1839 en la proliferación (Ki67 LI) en epitelio de mama normal estimulado por estrógeno. Los resultados se muestran en la Tabla 2.

En el epitelio de mama normal, en el día 0, fecha de implantación en el ratón, el valor Ki67 LI era 4.1 y se redujo a 2.6 en el día 14. Los ratones control se trataron después sólo con estrógeno, mientras que los ratones de ensayo se trataron tanto con estrógeno como con ZD1839. La cantidad de estrógeno administrada correspondía a un nivel premenopáusico; i.e. pellet de 17-\beta-estradiol (2 mg) (ver Holland et al, referenciado en el Ejemplo 1). Después de 21 días, el valor de Ki67 LI para los ratones control era tan alto como 6.5, mientras que para los ratones de ensayo el valor era considerablemente reducido a un valor de 1.4. Después de 28 días, el valor de Ki67 LI para los ratones control era de 5.4, mientras que para los ratones de ensayo, el valor continuó cayendo, hasta alcanzar un nivel de 1.1.

TABLA 2 El efecto de ZD 1839 en la proliferación (LI Ki67) en epitelio de mama normal estimulado por estrógeno

5

Ejemplo 4

De nuevo utilizando el método del Ejemplo 1, se midió el efecto de ZD1839 en la apoptosis (AI) en epitelio de mama normal estimulado con estrógeno. Los resultados se muestran en la Tabla 3.

En el epitelio de mama normal, en día 0, fecha de implantación en el ratón, el valor AI era 0.3 y se redujo a 0.2 en el día 14. Los ratones control se trataron después sólo con estrógeno, mientras que los ratones de ensayo se trataron tanto con estrógeno como con ZD1839. La cantidad de estrógeno administrada correspondía a un nivel premenopáusico. Después de 21 días, el valor AI para los ratones control era tan alto como 0.5, mientras que para los ratones de ensayo el valor era todavía más alto, un valor de 0.7. Después de 28 días, el valor AI para los ratones control era de 0.6, mientras que para los ratones de ensayo, el valor se mantuvo a un nivel de 0.7.

TABLA 3 El efecto de ZD1839 en la apoptosis (AI) en epitelio de mama normal estimulado por estrógeno

6

Ejemplo 5

Utilizando el mismo régimen de aplicación que en el Ejemplo 1, se midió el efecto de ZD1839 en la expresión del receptor de la progesterona (PR LI) en epitelio de mama normal estimulado con estrógeno (el receptor de progesterona incrementa la respuesta hormonal de la célula). Los resultados se muestran en la Tabla 4.

En el epitelio de mama normal, en día 0, fecha de implantación en el ratón, el valor PR LI era 11.8 y se redujo a 5.8 en el día 14. Los ratones control se trataron después sólo con estrógeno, mientras que los ratones de ensayo se trataron tanto con estrógeno como con ZD1839. La cantidad de estrógeno administrada correspondía a un nivel premenopáusico. Después de 21 días, el valor PR LI para los ratones control era tan alto como 17.2, mientras que para los ratones de ensayo el valor era sólo de 10.4. La inducción por estrógeno de la expresión de PR fue por lo tanto suprimida por ZD1839. Así, se inhiben los efectos hormonales (normalmente mediados mediante los receptores de progesterona) de los esteroides sexuales progesterona y andrógeno.

TABLA 4 El efecto de ZD1839 en la expresión de PR (LI PR) en epitelio de mama normal estimulado por estrógeno

7

De los resultados anteriores, se puede ver que como se expone antes, el efecto inhibitorio en el crecimiento constitutivo y el efecto promotor sobre la muerte de tejido celular de mama normal proporciona un método para la inhibición de la transformación de las células normales en células cancerosas i.e. la base para el tratamiento quimiopreventivo de mujeres, particularmente de aquéllas con un alto riesgo de desarrollar cáncer de mama maligno.

Estudios del epitelio de mama normal muestran que la terapia de sustitución hormonal (HRT) incrementa la expresión del receptor de progesterona (ver Hargreaves et al, Br. J Cancer, (Oct. 1998), 78(7), 945-949 y Hofscth et al, J. Clin. Endocrinol. Metab., (Dec 1999), 84(12), 4559-4565) y la HRT combinada (estrógeno y progesterona) incrementa la proliferación epitelial de mama significativamente más que lo que hace HRT con estrógeno solo (ver Hofstch, Supra). El uso de la HRT combinada a largo plazo tiene una tasa de inducción de cáncer de mama incrementada comparada con HRT con estrógeno solo (ver Persson et al, Cancer Causes Control, (Aug 1999), 10(4), 253-260; Colditz, J. Womens Health, (Apr 1999), 8(3), 347-357; y Magnusson et al, Int. J. Cancer, (5 May 1999), 81(3), 339-344). Inhibiendo la inducción del receptor de la progesterona, la progesterona no puede ejercer sus efectos y la frecuencia de desarrollo de cáncer de mama se reduce.

Además, el efecto inhibitorio sobre el tejido de mama normal estimulado por estrógeno indica que el inhibidor de la tirosina quinasa de EGFR trabajará solo incluso en presencia de altos niveles de estrógeno: i.e. para proporcionar quimioprevención en mujeres premenopáusicas.

Así, la inhibición de EGFR-TK utilizando ZD1839 ofrece una nueva aproximación para el tratamiento y la prevención del cáncer a pesar del estado ER y proporciona una nueva aproximación quimiopreventiva potencial, especialmente en familias con alto riesgo de cáncer de mama.

Claims

1. Uso de un inhibidor de la tirosina quinasa de EGFR en la fabricación de un medicamento para usar en la quimioprevención de la aparición de cáncer de mama en un humano libre de cáncer de mama invasivo mediante la simultánea reducción de la proliferación e incremento de la apoptosis de las células epiteliales en un estado normal o en un estado intermedio, entre epitelio normal y epitelio invasivo maligno, mediante

(a): reducción de la transformación de las células desde un estado normal a uno maligno en un humano libre de cáncer de mama invasivo;

donde el inhibidor de la tirosina quinasa de EGFR es ZD1839.

2. Uso según la reivindicación 1, donde el medicamento es una combinación del inhibidor de la tirosina quinasa de EGFR como un primer componente activo y un antiestrógeno como un segundo componente activo, donde los componentes se administran simultáneamente o por separado.

3. Uso según la reivindicación 2, donde el antiestrógeno se selecciona de tamoxifeno, fulvestrant y raloxifeno.

4. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el tejido epitelial es tejido epitelial mamario.

5. Un kit medicinal de un primer y un segundo componentes activos para uso combinado en la quimioprevención de la aparición de cáncer de mama en un humano libre de cáncer de mama invasivo mediante la simultánea reducción de la proliferación e incremento de la apoptosis de las células epiteliales en un estado normal o en un estado intermedio, entre epitelio normal y epitelio invasivo maligno, mediante

6. Un kit medicinal según la reivindicación 5, donde el antiestrógeno se selecciona de tamoxifeno, fulvestrant y raloxifeno.