DE60030889T2

DE60030889T2 - Verwendung von egfr tyrosine kinase hemmern zur behandlung von brustkrebs

Info

Publication number: DE60030889T2
Application number: DE60030889T
Authority: DE
Inventors: Nigel James Bundred
Original assignee: University of Manchester
Current assignee: University of Manchester
Priority date: 1999-11-02
Filing date: 2000-11-01
Publication date: 2007-04-05
Anticipated expiration: 2020-11-02
Also published as: CY1106285T1; NO323206B1; NZ518696A; BR0015194A; KR100785359B1; DK1272188T3; IL149176A0; EP1272188B1; KR20020064306A; MXPA02004272A; NO20022065L; EP1272188A2; AU1155901A; PT1272188E; CN1387437A; ZA200203431B; US7553815B1; WO2001032155A2; CA2389411C; AU779190B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die therapeutische Verwendung von Verbindungen, die hemmende Aktivität gegen das Epidermiswachstumsrezeptor-(EGFR-)Tyrosinkinaseenzym besitzen. Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung solcher Verbindungen zur Hemmung der Transformation normaler Zellen in Krebszellen, d.h. die Verbindungen sind chemopräventive Mittel.
In den vergangenen Jahren ist festgestellt worden, dass eine Zelle durch die Transformation eines Teils ihrer DNA in ein Onkogen, d.h. ein Gen, welches bei Aktivierung zur Bildung von malignen Tumorzellen führt, kanzerös werden kann (Bradshaw, Mutagenesis 1, 91 (1986)). Verschiedene solche Onkogene haben die Produktion von Proteinen zur Folge, die Rezeptoren für Wachstumsfaktoren sind. Der Wachstumsfaktorrezeptorkomplex führt in der Folge zu einem Anstieg der Zellproliferation. Es ist bekannt, dass z.B. verschiedene Onkogene für Tyrosinkinasenzyme kodieren, und dass bestimmte Wachstumsfaktorrezeptoren auch Tyrosinkinasenzyme sind (Yarden et al., Ann. Rev. Biochem. 57, 443, (1988); Larsen et al., Ann. Reports in Med. Chem. Kap. 13 (1989)).
Rezeptortyrosinkinasen sind wichtig für die Übertragung biochemischer Signale, welche die Zellreplikation initiieren. Sie sind große Enzyme, welche die Zellmembran umspannen und eine extrazelluläre Bindungsdomäne für Wachstumsfaktoren, wie z.B. den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), und einen intrazellulären Abschnitt besitzen, der als Kinase wirkt, um Tyrosinaminosäuren in Proteinen zu phosphorylieren und daher die Zellproliferation zu beeinflussen. Es sind verschiedene Klassen von Rezeptortyrosinkinasen bekannt (Wilks, Advances in Cancer Resarch 60, 43–73 (1993)), die auf Familien von Wachstumsfaktoren basieren, welche an verschiedene Rezeptortyrosinkinasen binden. Die Klassifizierung umfasst Rezeptortyrosinkinasen der Klasse I, umfassend die EGF-Familie von Rezeptortyrosinkinasen, wie z.B. EGF-, TGFα-, NEU-, erbB-, Xmrk-, HER- und let23-Rezeptoren, Klasse-II-Rezeptor-Tyrosinkinasen, umfassend die Insulinfamilie der Rezeptor-Tyrosinkinasen, wie z.B. Insulin, IGFI und mit Insulin verwandte Rezeptoren (IRR), und Klasse-III-Rezeptortyrosinkinasen, umfassend die Familie des aus Blutplättchen gewonnenen Wachs tumsfaktors (PDGF) von Rezeptortyrosinkinasen, wie z.B. PDGFαa-, PDGFβb- und koloniestimulierenden Faktor-1-(CSF1-)Rezeptoren.
Es ist bekannt, dass die Klasse-I-Kinasen wie z.B. die EGF-Familie der Rezeptortyrosinkinasen häufig in gewöhnlichem menschlichen Epithelkrebs gegenwärtig sind, wie z.B. Brustkrebs (Sainsbury et al., Brit. J. Cancer 58, 458 (1988); Guerin et al., Oncogene Res. 3, 21 (1988), und Klijn et al., Breast Cancer Res. Treat. 29, 73 (1994)), nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLCs), einschließlich Adenokarzinome (Cerny et al., Brit. J. Cancer 54, 265 (1986), Reubi et al., Int. J. Cancer 45, 269 (1990), und Rusch et al., Cancer Research 53, 2379 (1993)), und Plattenepithelkarzinom der Lunge (Hendler et al., Cancer Cells 7, 347 (1990)), Blasenkrebs (Neal et al., Lancet 366 (1985)), Speiseröhrenkrebs (Mukaida et al., Cancer 68, 142 (1991)), Gastrointestinalkrebs, wie z.B. Dickdarm-, Rektum- oder Magenkrebs (Bolen et al., Oncogene Res. 1, 149 (1987)), Prostatakrebs (Visakorpi et al., Histochem. J. 24, 481 (1992)), Leukämie (Konaka et al., Cell 37, 1035 (1984)) und Gebärmutter-, Bronchial- oder Bauchspeicheldrüsenkrebs (EP-A-0400586). Da weiteres menschliches Tumorgewebe auf die EGF-Familie der Rezeptortyrosinkinasen getestet wird, wird davon ausgegangen, dass ihre weitverbreitete Prävalenz bei weiteren Krebsarten, wie z.B. Schilddrüsen- und Gebärmutterkrebs, festgestellt werden kann. Es ist kürzlich gezeigt worden (W. J. Gullick, Brit. Med. Bull. 47, 87 (1991)), dass EGF-Rezeptoren, welche Tyrosinkinaseaktivität besitzen, bei vielen menschlichen Krebsarten, wie z.B. Gehirntumor, Plattenepithelkarzinom der Lunge, Blasen-, Magen-, Brust, Kopf- und Halstumor, Speiseröhrentumor, gynäkologischem Tumor und Schilddrüsentumor, überexprimiert werden.
Dementsprechend ist anerkannt worden, dass ein Inhibitor der Rezeptortyrosinkinasen als selektiver Inhibitor des Wachstums von Epithelkrebszellen von Wert ist (Yaish et al., Science 242, 933 (1988)).
Es ist aus EP-A-0566226 und den internationalen Patentanmeldungen WO-A-96/33980 und WO-A-97/30034 bekannt, dass bestimmte Chinalozin-Derivate, die ei nen Anilin-Substituenten an Position 4 besitzen, EGFR-Tyrosinkinaseinhibitionsaktivität besitzen und Inhibitoren der Proliferation von Krebsgewebe sind.
Es ist außerdem aus den internationalen Patentanmeldungen WO-A-96/30347 und WO-A-97/38983 bekannt, dass bestimmte strukturell verwandte Chinazolin-Derivate, die über einen Anilin-Substituenten an Position 4 verfügen, auch EGFR-Tyrosinkinaseinhibitionsaktivität besitzen.
Folglich hat sich gezeigt, dass viele andere 4-Anilinchinazolin-Derivate und strukturell verwandte Verbindungen davon EGFR-Tyrosinkinaseinhibitionsaktivität besitzen.
Spezielle Verbindungen, von denen berichtet worden ist, dass sie potente EGFR-Tyrosinkinaseinhibitionsaktivität aufweisen, umfassen: N-(3-Chlor-4-fluorphenyl)-7-methoxy-6-(3-morpholinpropoxy)chinazolin-4-amin (hierin nachstehend durch die Codenummer ZD1839 identifiziert); N-(3-Ethinylphenyl)-6,7-bis(2-methoxyethoxy)chinazolin-4-amin (hierin nachstehend durch die Codenummer CP358774 identifiziert) und 6-Acrylamid-N-(3-chlor-4-fluorphenyl)-7-(3-morpholinpropoxy)chinazolin-4-amin (hierin nachstehend durch die Codenummer PD0183805 identifiziert), die z.B. in J. Med. Chem. 42, 1803–1815 (1999), offenbart worden sind.
Obiges betrifft die Behandlung von ganzen Krebszellen. Es wird daher davon ausgegangen, dass diese EGFR-Tyrosinkinaseinhibitoren die Inhibition der Stromab-Signalgebung für den EGFR in ER^–-Krebszellen bewirken und so die Proliferation dieser Zellen hemmen.
Es ist bekannt, dass bei normalen Zellen der EGF einen mitogenen Effekt in einer Reihe von nicht-transformierten Epithelzellen haben kann, die in Kultur gezüchtet werden (Carpenter et al., Annual Reviews in Biochemistry 48, 193 (1979)), einschließlich Zellen aus Mausbrustdrüsen, aber auch, dass der EGF in bestimmten Zelllinien und in natürlich proliferierendem Brustgewebe von Mäusen eine wachstumshemmende Wirkung haben kann (Coleman et al., Developmental Biology 137, 425 (1990)).
Die Erfinder haben nun herausgefunden, dass der EGFR-Tyrosinkinaseinhibitor ZD1839 nicht nur auf das Wachstum transformierter Epithelkrebszellen Auswirkungen hat, sondern auch auf das konstitutive Wachstum normaler Epithelzellen. Zum Beispiel stimuliert Östrogen in normalem menschlichem Brustepithelgewebe von Frauen normales Wachstum und bewirkt die Expression des Progesteronrezeptors. Dies ermöglicht die Vermittlung von hormonellen Wirkungen eines zweiten Sexsteroids im Brustepithel. Das konstitutive Wachstum von z.B. Brustepithelzellen umfasst den nicht von Östrogen abhängigen Basisumsatz von Zellen, der mit dem Alter der Frau und nach der Menopause abnimmt.
Daher haben die Erfinder unter Anwendung eines Xenotransplantatmodells, umfassend die Implantation und das Wachstum von normalem menschlichem Brustgewebe und In-situ-Brustkrebs in athymischen BALB/c-nu/nu-Mäusen (Holland et al., J. National Cancer Institute 89, 1059 (1997), und Gandhi et al., Cancer Research 60, 4284–4288 (2000)), herausgefunden, dass der EGFR-Tyrosinkinaseinhibitor ZD1839 Wirkungen auf die konstitutive und östrogenstimulierte Proliferation von gutartigem und prämalignem Brustepithel vor der Menopause [Ductal Carcinoma in Situ (DCIS)] zeigt. Die hemmende Wirkung auf das konstitutive und östrogenstimulierte Wachstum stellt ein Verfahren zur Inhibition der Transformation von normalen Zellen in Krebszellen bereit, d.h. die Grundlage für die chemopräventive Behandlung von Frauen, besonders von Frauen, die ein hohes Risiko für die Entwicklung eines malignen Brustkrebses aufweisen.
Der EGFR-Tyrosinkinaseinhibitor kann daher dazu verwendet werden, die Transformation von Epithelzellen, insbesondere von Brustepithelzellen, vom Normalstadium in ein malignes Stadium zu reduzieren und bevorzugt zu hemmen.
Angesichts der Tatsache, dass der EGF dafür bekannt ist, wachstumshemmende Wirkung auf bestimmte Zelllinien und natürlich proliferierendes Brustgewebe von Mäusen zu zeigen, vermutlich über seinen Wachstumsrezeptor, ist es überraschend, dass eine Verbindung, die eine solche Wachstumsrezeption (einen EFGR-Inhibitor) tatsächlich blockiert, auch die Proliferation reduzieren soll.
Daher wird davon ausgegangen, dass der EGFR-Inhibitor ZD1839, anders als herkömmliche Antiöstrogene, wie z.B. Tamoxifen, welche die Wirkung von Östrogen gegenüber dem Östrogenrezeptor wirksam blockieren und die EGF/TGFα-Produktion durch die Zelle verringern und im Gegensatz zum zuvor erwähnten Mechanismus des Wirkens von EGFR-Inhibitoren gegenüber ER^–-Krebszellen (wieder mit EGFR-Blockade verbunden), bei Verabreichung an ein gutartiges In-vivo-Brustepithel oder nichtinvasiven In-vivo-Brustkrebs (ob ER+ oder ER^–) wirkt, indem die zellproliferierende Rolle der Tyrosinkinase direkt blockiert wird. Daher wird durch direktes Blockieren der EGFR-Tyrosinkinase die Natur der Hormonempfindlichkeit der Zellen irrelevant, d.h. das Arzneimittel wirkt über einen nicht-hormonellen Mechanismus.
Genauer gesagt sind bei einem ersten Bezug auf das Zellwachstum in der Brust die meisten Wachstumszellen EGFR+ und ER^–. In Abwesenheit eines EGFR-Inhibitors stimuliert Östrogen (nur) ER+-Zellen, welche die EGF-Produktion sekretieren, welche wiederum auf die ER^–-Zellen auf parakrine Weise wirkt, um Proliferation zu induzieren. Die EGFR-TK-Inhibitoren der Erfindung binden an EGFR direkt auf ER^–-Zellen, um eine solche Proliferation zu hemmen.
Andererseits wird der Zelltod (Apoptose) durch Überlebenszeichen sowohl der Gewebsmatrize als auch der Wachstumsfaktoren vermieden. Der insulinähnliche Wachstumsfaktor (IGFI) sendet zur Vermeidung von Zelltod in der Brust Signale durch den IFGI-Rezeptor.
Die jüngste Arbeit von Roudabush et al., J. Biol. Chem. 275, 22583–22589 (2000), hat gezeigt, dass die IGFR-Stimulation, die durch IGFRs induziert wird, zur Sekretion eines EGF-Familienmitglieds außerhalb der Zelle führt, das dann auf den EGFR der Zelle selbst und der benachbarten Zellen einwirkt. Die in der vorliegenden Erfindung durch EGFR-TK-Inhibitoren bedingte Blockade von EGFR in der Brust ermöglicht daher In-vitro- und In-vivo-Zelltod (Apoptose) in dem Brustepithel.
Überraschenderweise kann der EGFR-TKI direkt wirken, nicht nur auf den EGFR, der auf den ER^–-Zellen exprimiert wird, sondern unabhängig auf ER+-Zellen.
R. B. Clarke et al. haben in Cancer Research 57, 4987–4991 (1997), gezeigt, dass normale „ER+/EGFR–"-Epithelbrustzellen nicht proliferieren, während benachbarte „ER–/EGFR+"-Zellen dies tun, wodurch festgestellt wurde, dass die Proliferation aufgrund zweier Mechanismen eintritt, nämlich Östrogenstimulation von

(1) ER+-Zellen und
(2) EGF und verwandten Liganden, die von „ER+"-Zellen parakrin sekretiert werden, um benachbarte „EGFR+/ER–"-Zellen zu stimulieren.

Durch die Inhibition von TK mit EGFR-TKI werden benachbarte „ER–/EGFR+"-Zellen davon abgehalten, zu proliferieren.
Zusätzlich zeigen die Daten der Erfinder, dass der EGFR-TKI auch die Expression des östrogeninduzierten Progesteronrezeptors in „ER+"-Zellen induziert und den „ER+"-Zellturnover reduziert.
Daher bedingt Östrogen bei normalen ER+-Zellen die Synthese des Steroidhormonrezeptors und Proteins, um Proliferation und Wachstum und die Hormonreaktion einer Zelle zu ermöglichen und wachstumsstimulierende Faktoren (z.B. EGF) zu sekretieren, die auf benachbarte ER^–-Brustepithelzellen einwirken.
Jedoch reduziert der EGFR-TK-Inhibitor die Hormonempfindlichkeit und Stimulation des Brustepithels und vermeidet die Transformation von normalem Gewebe in Krebsgewebe, da er die Induktion von Progesteronrezeptor durch Östrogen in „ER+"-Zellen vermeidet.
Der Progesteronrezeptormarkierungsindex (PRLI), der in normalem Brustgewebe, das nicht den Prämenopausespiegeln von Östrogen ausgesetzt ist, auf etwa 5% sinkt, steigt bei Exposition gegenüber Östrogen auf 15% (I. J. Laidlaw et al., Endocrinology 136, 164–171 (1994)). Die Verwendung von ZD1839 zum Antagonisieren der Östrogenstimulation hebt diesen Anstieg auf, der zu einem PRLI von 10% führt.
Zusätzlich dazu kann ein EGFR-Tyrosinkinaseinhibitor auf Epithelgewebe verwendet werden, insbesondere Brustepithelgewebe, das sich zu einem nichtinvasiven Intermediärstadium entwickelt hat, das zwischen normalem Epithel, insbesondere normalem Brustepithel, und malignem invasivem Epithel, insbesondere malignem invasivem Brustepithel liegt, entweder um der Proliferation solcher Zellen vorzubeugen oder zu bedingen, dass das Epithelgewebe in diesen Zellen sich im Wesentlichen in ein Normalstadium zurückverändert.
Beispiele für solche Zellen im Intermediärstadium sind jene, die mit atypischer duktaler Hyperplasie, lobulärer Neoplasie und nicht-invasiven In-situ-Krebszellen, die im Gang und/oder Lumen einer Brust gegenwärtig sind, verbunden sind. Diese Zellen können bei Patienten gegenwärtig sein, die ein hohes Risiko für Brustkrebs aufweisen. Gemäß dem ersten, zweiten und dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung, die durch die Alternativen (a)–(c) nachstehend bezeichnet sind, wird die Verwendung eines EGFR-Tyrosinkinase-Inhibitors zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung in der Chemoprävention des Ausbruchs von Brustkrebs bei einem Menschen, der frei von invasivem Brustkrebs ist, insbesondere bei Frauen, durch die gleichzeitige Verringerung der Proliferation und Steigerung der Apoptose von Epithelzellen im Normalstadium oder in einem Intermediärstadium, das zwischen normalem Epithel und malignem invasivem Epithel liegt, bereitgestellt, wobei

(a) die Transformation der Epithelzellen, insbesondere Brustepithelzellen, von einem normalen zu einem malignen Stadium bei einem Menschen, der frei von invasivem Brustkrebs ist, verringert, bevorzugt gehemmt, wird;
(b) die Transformation der Epithelzellen, insbesondere Brustepithelzellen, von einem wie oben definierten Intermediärstadium zu einem malignen Stadium bei einem Menschen, der frei von invasivem Brustkrebs ist, verringert, bevorzugt gehemmt, wird oder
(c) eine maßgebliche Reversion des Epithelgewebes, insbesondere Brust-Epithelgewebes, vom oben definierten Intermediärstadium, das zwischen normalem Epithel, insbesondere normalem Brustepithel, und malignem invasivem Epithel, insbesondere malignem invasivem Brustepithel, liegt, zurück in das Normalstadium ausgelöst wird;

Die vorliegende Erfindung ist gemäß jedem der ersten und zweiten Aspekte (a) und (b) besonders auf Patienten anwendbar, die ein hohes Risiko für Brustkrebs aufweisen, so genannte Hochrisikopatienten. Es ist bekannt, dass Hochrisikopatienten Patienten sind, die im so genannten Gail-Risk-Modell, einem computergenerierten Programm zur Beurteilung des Risikos für Brustkrebs, eine Bewertung von zumindest 1,5 aufweisen (siehe M. H. Gail et al., J. Natl. Cancer Inst. 81, 1879–1886 (1989)). Faktoren, die das Risiko für Brustkrebs erhöhen, umfassen die Gegenwart von Intermediärzellen, die mit atypischer Hyperplasie in Zusammenhang stehen (einschließlich einer Krankengeschichte dieser als auch natürlich Brustkrebs bei einem direkten Verwandten), lobuläre Neoplasie, nicht-invasiver In-situ-Krebs oder die Gegenwart eines mutierenden BRCAI-Gens (siehe D. L. Page et al., BMJ 309, 61–64 (1994)).
Daher ist die vorliegende Erfindung speziell zur Behandlung von Intermediärzellen anwendbar.
Ein solches Arzneimittel, das wie oben beschrieben hergestellt wird, kann in einem Verfahren zur Reduktion, bevorzugt Hemmung, der Transformation von Epithelzellen, insbesondere Brustepithelzellen, von einem normalen zu einem malignen Stadium bei einem Menschen eingesetzt werden, der frei von invasivem Brustkrebs ist, besonders bei Frauen, wobei das Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Menge des EGFR-Tyrosinkinaseinhibitors umfasst.
Ein Arzneimittel, das wie oben beschrieben hergestellt wird, kann auch in einem Verfahren zur Reduktion, bevorzugt Hemmung, der Transformation von Epithelzellen, insbesondere Brustepithelzellen, von einem Intermediärstadium in ein malignes Sta dium bei einem Menschen eingesetzt werden, der frei von Brustkrebs ist, besonders bei Frauen, wobei das Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Menge des EFGR-Tyrosinkinaseinhibitors umfasst.
Diese oben beschriebenen Verabreichungsverfahren sind besonders auf Hochrisikopatienten und zur Behandlung von Intermediärzellen anwendbar, wie zuvor definiert.
Ein solches Arzneimittel, das wie oben beschrieben hergestellt wird, kann in einem Verfahren verwendet werden, das die Verabreichung einer wirksamen Menge des EGFR-Tyrosinkinaseinhibitors an einen Menschen, besonders an Frauen, umfasst, der frei von invasivem Brustkrebs ist.
In der Anwendung kann der EGFR-Tyrosinkinaseinhibitor ZD1839 alleine oder in einer Zusammensetzung verabreicht werden, die einen pharmazeutisch annehmbaren Träger enthält. Er wird vorzugsweise in Tablettenform verabreicht.
Er wird im Allgemeinen so verabreicht, dass eine wirksame nicht-toxische Dosis gegeben wird. Die Größe der Dosis variiert gemäß dem gewählten Weg der Verabreichung an den Patienten. Im Allgemeinen können herkömmliche Dosen des EGFR-Tyrosinkinaseinhibitors verwendet werden. Insbesondere wird für den EGFR-Tyrosinkinaseinhibitor ZD1839 eine tägliche Dosis im Bereich von z.B. etwa 10 mg bis 5 g verabreicht, bevorzugt von etwa 10 mg bis 1000 mg, noch bevorzugter von etwa 10 mg bis 500 mg (d.h. etwa 0,2 mg/kg bis 100 mg/kg Körpergewicht, bevorzugt von etwa 0,2 mg/kg bis 20 mg/kg Körpergewicht, noch bevorzugter von etwa 0,2 mg/kg bis 10 mg/kg Körpergewicht), die wenn gewünscht in geteilten Dosen verabreicht wird.
Die zuvor definierte Inhibition der Zelltransformation kann als alleinige Therapie angewendet werden oder zusätzlich zum EGFR-Tyrosinkinaseinhibitor ZD1839 eine oder mehrere Substanzen und/oder Behandlungen umfassen.
Daher stellt ein vierter Aspekt der vorliegenden Erfindung ein medizinisches Set aus einer ersten und einer zweiten Wirkstoffkomponente zum Einsatz in der Chemoprävention des Ausbruchs von Brustkrebs bei einem Menschen, der frei von invasivem Brustkrebs ist, durch gleichzeitige Verringerung der Proliferation und Steigerung der Apoptose von Epithelzellen im Normalstadium oder in einem Intermediärstadium bereit, das zwischen normalem Epithel und malignem invasivem Epithel liegt, wobei

(a) die Transformation der Epithelzellen von einem normalen zu einem malignen Stadium bei einem Menschen, der frei von invasivem Brustkrebs ist, verringert wird;
(b) die Transformation der Zellen von einem Intermediärstadium, das zwischen normalem Epithel und malignem invasivem Epithel liegt, zu einem malignen Stadium bei einem Menschen, der frei von invasivem Brustkrebs ist, verringert wird; oder
(c) eine maßgebliche Reversion des Epithelgewebes vom Intermediärstadium, das zwischen normalem Epithel und malignem invasivem Epithel liegt, zurück in das Normalstadium ausgelöst wird;

Eine solche kombinierte Behandlung kann durch gleichzeitige, sequenzielle, separate oder intermittierende Verabreichung der individuellen Komponenten der Behandlung erreicht werden. Zum Beispiel kann es bei Frauen, die ein überdurchschnittliches Risiko für Brustkrebs aufweisen, bei Verwendung des EFGR-Tyrosinkinaseinhibitors zur Inhibition der Transformation von Brustgewebe in Brustkrebs üblich sein, eine Kombination verschiedener Behandlungsformen zu verwenden. Die andere Komponente einer solchen kombinierten Behandlung kann ein Antiöstrogen, wie z.B. Tamoxifen, Fulvestrant (ICI 182, 780:Faslodex) oder Raloxifen umfassen. Es kann vorteilhaft sein, eine sequenzielle Therapie mit z.B. einem ersten Behandlungs zeitraum von etwa 1 bis 6 Monaten zu verwenden, in welchem eine herkömmliche Dosis eines EGFR-Tyrosinkinaseinhibitors, wie z.B. ZD1839, verabreicht wird, gefolgt von einem zweiten Behandlungszeitraum von etwa 1 bis 6 Monaten, in welchem eine herkömmliche Dosis eines Antiöstrogens, wie z.B. Tamoxifen, Fulvestrant oder Raloxifen, verabreicht wird. Dadurch wird ein Zeitraum ermöglicht, in welchem ein konstitutives Wachstum des Brustgewebes zugelassen wird, um das Ausmaß der Gewebsatrophie zu verringern.
Alternativ dazu kann die Kombinationstherapie die kontinuierliche Verabreichung eines Antiöstrogens, wie z.B. Tamoxifen, Fulvestrant oder Raloxifen, und die intermittierende Verabreichung des EGFR-Tyrosinkinaseinhibitors ZD1839 umfassen. Die intermittierende Therapie mit dem EGFR-Tyrosinkinaseinhibitor kann z.B. einen zweimonatigen Behandlungszyklus umfassen, bestehend aus einem ersten Behandlungsabschnitt, der die Dosierung des EGFR-Tyrosinkinaseinhibitors ZD1839 über einen Zeitraum von etwa einem Monat umfasst, gefolgt von einem zweiten Behandlungsabschnitt, der einen Zeitraum von etwa einem Monat frei von EGFR-Tyrosinkinasearzneimittel umfasst. Danach können weitere Zwei-Monats-Zyklen dieser Behandlung verabreicht werden.
Die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden nun unter Hinweis auf die folgenden Beispiele und Zeichnungen im Anhang detaillierter beschrieben, wobei
1 für Beispiel 2 die Proliferation (Ki67 LI) und Apoptose (AI) in „ER–/EGFR+"- und „ER+/EGFR–"-DCIS-Epithel veranschaulicht und
2 für Beispiel 3 die ZD1839-Dosis-Reaktion in (a) DCIS und (b) einer normalen Brust veranschaulicht.
Beispiel 1
Die Wirkung des EGFR-Tyrosinkinaseinhibitors der vorliegenden Erfindung wurde unter Einsatz eines Xenotransplantatmodells bestimmt, das die Implantation und das Wachstum des normalen menschlichen Brustgewebes und des In-situ-Brustkrebses in weibliche athymische BLAB/c-nu/nu-Mäusen umfasst (Holland et al., J. National Cancer Institute 89, 1059 (1997), und Gandhi et al., Cancer Research 60, 4284–4268 (2000)). Normales Brustgewebe und das Gewebe eines In-situ-Ductus-Karzinoms (DCIS) von Frauen, die sich therapeutischer Chirurgie unterzogen haben, wurde als Xenotransplantat in weibliche Mäuse implantiert. Nach 14 Tagen wurde die tägliche Dosierung von ZD1839 bei 10 bis 200 mg/kg für einen Zeitraum von 14 Tagen begonnen. Das Xenotransplantatgewebe wurde an den Tagen 0, 14, 21 und 28 entfernt. Pellets von 17β-Östradiol (2 mg) wurden in einer zweiten Versuchsreihe (unter Einsatz normaler Brust-Xenotransplantate) an Tag 14 sowohl den Kontroll- als auch den Behandlungsmäusen subkutan implantiert, und herkömmliche Ki67-Immunfärbung wurde verwendet, um die Epithelproliferation zu beurteilen (Ki67 ist ein monoklonaler Antikörper zu einem Marker in einer Zelle).
Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten:
Beispiel 2
Zusammenfassung des Verfahrens
Brustgewebe von 16 Frauen, die sich aufgrund von DCIS einer Operation unterzogen, wurde pro Versuch in 16–20 immunsupprimierte Mäuse (8 Xenotransplantate/Maus) implantiert. Die Behandlung begann 2 Wochen nach der Implantation und bestand aus täglicher künstlicher Sondenernährung mit ZD1839 bei 10–200 mg/kg über 14–28 Tage; es lagen geeignete Kontrollen vor. An den Tagen 14, 21, 28 und 42 wurden die Xenotransplantate entfernt und dann mittels Ki67-Immunfärbung auf Proliferation (LI) und mittels Morphologie auf Apoptose (AI) getestet.
Materialien und Verfahren
Patienten
Die Teilnehmer an der vorliegenden Studie waren Frauen, die im Zeitraum von November 1998 bis Jänner 2000 entweder das Nightingale Breast Screening Assessment Centre oder die Symptomatic Breast Clinic am University Hospital von South Manchester, U.K., aufsuchten. Frauen wurden in die Studie aufgenommen, wenn sie Mammographien hatten, die eine weitverbreitete Mikrokalzifikation aufwiesen, die auf DCIS schließen ließ, und eine zytopathologische oder histopathologische Bestätigung der Diagnose vorlag (n = 16). Alle Gewebsproben wurden bei der therapeutischen Entfernung von DCIS erhalten. Das South Manchester Medical Research Ethics Committee gab die Genehmigung zum Entfernen des Gewebes aus pathologischen Proben in dieser Studie.
Tiere
Intakte, erwachsene, weibliche, 8–10 Wochen alte athymische Nacktmäuse (BALB/c nu/nu) wurden von der Zuchtkolonie am Paterson Institute for Cancer Research erhalten. Sie wurden unter herkömmlichen Bedingungen bei einem 12-Stunden-Hell-Dunkel-Zyklus (die Lichter wurden von 19.00 Uhr bis 7.00 Uhr früh abgeschaltet) in Filter-Top-Käfigen untergebracht. Während der Zucht wurde den Mäusen ad libitum bestrahlte Nahrung und gefiltertes Wasser und ein bestrahltes Lagerstreu bereitgestellt. In diesem Versuch wurden normale(s) Nahrung, Wasser und Lagerstreu verwendet. Die gesamte Betreuung der Tiere und die chirurgischen Verfahren wurden gemäß den Bestimmungen des britischen Innenministeriums und dem Scientific Procedures Act des Vereinigten Königreichs (1986, Gesetz zur Regelung wissenschaftlicher Verfahren) durchgeführt. Für alle Verfahren wurde Anästhesie über die Inhalation von Halothan (2–4% Halothan an Sauerstoff, Halovet Vapouriser, International Market Supplies, Congleton, U.K.) eingesetzt.
Behandlung von Gewebsproben
Zur Herstellung von Gewebsproben zur Transplantation in Mäuse wurden zum Zeitpunkt der Operation aus der Hauptprobe 1–2 cm³ Stücke Brustgewebe entnommen, das Mikrokalzifizierungen enthielt. Das frische Gewebe wurde von übermäßigem Fett befreit und unmittelbar unter sterilen Bedingungen in drei oder vier kleinere Portionen geteilt und in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), das über 4,5 g/l Glukose und kein Natriumpyruvat (Gibco Life Technology, Paisley, Schottland, Vereinigtes Königreich) verfügte, bei Raumtemperatur bis zur Implantation in die Mäuse gegeben. Im Labor wurde das Gewebe in frisches DMEM in einer sterilen Petrischale gegeben und mit einer Skalpellklinge vorsichtig in 2 mm × 2 mm × 1 mm große Proben geschnitten. Abhängig vom Volumen des verfügbaren Gewebes wurden aus der Petrischale zufällig zwischen 5 und 20 Stücken ausgewählt und nicht in die Mäuse implantiert, aber histologisch verwendet. Die Hälfte dieser nichtimplantierten Transplantate (Tag 0) wurde sofort 24 Stunden lang in gepuffertem Formalin (4% Formaldehyd) und die andere Hälfte 1 Stunde lang in Carnoys Fixiermittel fixiert, und dann wurden alle Transplantate in 70% Alkohol gelagert. Nach einem Zeitraum von zumindest 24 Stunden wurden die fixierten Gewebsproben individuell in Gewebskassetten gelegt (Tissue Tek III; Bayer Diagnostics Ltd., Basingstoke, U.K.) und bis zur Paraffineinbettung in 70% Alkohol gelagert. Diese Proben, welche das aus jedem Patienten entfernte DCIS darstellen, wurden als „Tag 0"-Proben markiert und für eine histologische Überprüfung, Immunfärbung und apoptotische Zellzählungen reserviert. Die übrigen Xenotransplantate wurden in Nacktmäuse implantiert.
Implantation von Xenotransplantaten in Nacktmäuse
Wie in Beispiel 1 wurden die Proben jedes einzelnen Patienten auf zwischen 10 und 32 Mäuse aufgeteilt (abhängig vom Gewebsvolumen und der Zahl der verfügbaren Mäuse, Median = sechzehn). Die Transplantation von Xenotransplantaten in Mäuse wurde innerhalb von 90 Minuten nach Entfernung des Gewebes aus dem Patienten vollendet. Es wurden an der Mittellinie der Haut am Rücken zwei kleine Hautschnitte gemacht, durch welche 8 Gewebsstücke symmetrisch platziert wurden (4 auf jeder Seite). Die Wiedergewinnung dieser Xenotransplantate zu den geeigneten Zeitpunkten erforderte eine erneute Anästhesierung der Mäuse und das Herausschneiden jedes Transplantats unter Einsatz scharfer Sezierung. Die Transplantate wurden dann wie oben für Tag-0-Proben beschrieben histologisch verarbeitet. Für die ZD1830-Versuche mit 100–200 mg/kg wurden die Transplantate an den Tagen 14, 21 und 28 entfernt, bei geringeren Dosen (10–75 mg/kg) wurden die Transplantate an den Tagen 14, 28 und 42 entnommen. Aus jeder Maus wurden an jedem Zwischenzeitpunkt zwei Xenotransplantate und an jedem Endpunkt 4 Xenotransplantate entfernt.
Behandlung
Die Mäuse wurden 14–28 Tage lang über eine Sonde entweder mit ZD1839 (10–200 mg/kg) oder einem Vehikel künstlich ernährt, beginnend an Tag 14 nach der Entfernung der ersten beiden Xenotransplantate. ZD1839 (4-(3-Chlor-4-fluorphenylamin)-7-methoxy-6-(3-(4-morpholinyl)chinazolin), ein oral aktiver selektiver EGFR-TKI, wurde uns dankenswerterweise von AstraZeneca Pharmaceuticals zur Verfügung gestellt. Das Vehikel (Kontrolle) war 0,5% Polysorbat.
Histologische Bewertung von Xenotransplantaten
Alle Tag-0-Proben und Transplantate wurden in Paraffinblöcke platziert. H&E-gefärbte, 3 μm große Teile jedes Blocks wurden von einem einzigen erfahrenen Brustpathologen auf die Gegenwart von DCIS untersucht; jene Teile, die DCIS enthielten, wurden wie zuvor beschrieben auf Apoptose und Ki67-Antigenimmunogenität (als Marker für die Epithelproliferation) getestet.
Auf allen Tag-0-Proben, die DCIS enthielten, wurde auch die nukleare Reinheit und die Gegenwart oder Abwesenheit von Komedo-Nekrose bestimmt. Zusätzlich wurden die Tag-0-Proben immunhistochemisch auf ihren ER-, c-erbB-2-, EGFR-Status getestet.
Beurteilung von apoptotischem Zelltod
Die H&E-gefärbten Teile der DCIS-Proben wurden unter Einsatz eines Lichtmikroskops auf morphologische Hinweise auf Apoptose getestet. Die zur Identifikation von apoptotischen Zellen verwendeten Kriterien sind weitgehend anerkannt und umfassen die anfänglich an den Rändern des Nukleus auftretende Kondensation von Chromatin, die Kondensation des Zytoplasmas (Chromophilie), die Ablösung von benachbarten Zellen, angezeigt durch das Erscheinen eines weißen Rings um die sterbende Zelle, und die zytoplasmatische Sprossung zur Bildung von membrangebundenen Fragmenten (apoptotischen Körpern). Zur Bestimmung der AI wurden unter Einsatz eines Zeiss-Mikroskops zumindest 1000 Zellen bei 400fachen Vergrößerung gezählt, und die Zahl jener Zellen, die apoptotische Morphologie zeigten, wurde als Prozentsatz der gezählten Gesamtzahl dargestellt.
Immunhistochemische Bestimmung von ER- und Ki67-Zellkernantigenen
Es wurden immunhistochemische ER- und KI67-Verfahren verwendet. Diese sind zuvor beschrieben worden (Gandhi et al., Br. J. Cancer 78, 785–794 (1998)). Sowohl die ER- als auch Ki67-Färbung waren überwiegend nuklear mit minimaler zytoplas matischer Aufnahme. Die Intensität der Färbung variierte, wurde jedoch nicht separat bestimmt, und die Zellen wurden als positiv oder negativ eingestuft. Der Ki67-Markierungsindex (LI) wurde über die Zählung eines Minimums von 1000 Epithelzellen berechnet, und die Zahl positiv gefärbter Zellkerne wurde als Prozentsatz der gezählten Gesamtzahl ausgedrückt. Der ER-Status wurde ebenfalls bestimmt, indem 1000 Zellen gezählt wurden, und die Läsionen wurden als ER+ angesehen, wenn > 5% der Zellen positiv auf ER gefärbt waren.
Immunhistochemische Bestimmung von c-erbB-2, EGFR und pErk1/Erk2
Es wurden Paraffinwachsteile (3 μm dick) des Gewebes jeder Probe geschnitten, auf mit APES (3-Aminpropylethoxysilan) beschichtete Objektträger aufgetragen, entparaffiniert und vor der himmunhistochemischen Färbung für c-erbB-2, EGFR hydriert und für (p) Erk1/Erk2 phosphoryliert. Die Antigene wurden mithilfe eines Mikrowellenverfahrens (650 W) über 30 Minuten (min) gewonnen. Die endogene Peroxidaseaktivität wurde durch Inkubation in Wasserstoffperoxid [1,5 (Vol.-%) für EGFR und c-erbB, 2,3 (Vol.-%) für pErk1/Erk2] in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) 15 Minuten lang blockiert. Für das c-erbB-2- und EGFR-Antigen wurden die Objektträger in TBS gewaschen, bevor 10% normales Kaninchenserum zum Blockieren der nicht-spezifischen Bindung verwendet wurde, dann wurden sie mit dem primären Antikörper in einer Verdünnung von 1:20 für EGFR (monoklonaler Maus-Anti-Human, NCL-EGFR, Novocastra labs, Newcastle upon Tyne, Vereinigtes Königreich) und in einer Verdünnung von 1:40 für c-erbB-2 (monoklonaler Maus, MAB4022, Chemicon, Harrow, Vereinigtes Königreich) 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Es wurde ein biotinyliertes Kaninchen-Anti-Maus-Immunglobulin (E413, Dako, High Wycombe, Vereinigtes Königreich) als sekundärer Antikörper eingesetzt (Verdünnung 1:350, Inkubation für 30 Minuten), darauf folgte eine 30-minütige Inkubation bei RT mit dem standardmäßigen dreischichtigen Streptavidin-Avidin-Biotin-Meerrettich (K0377, Dako) für c-erbB-2 und EGFR.
Zur Detektion der pErk1/Erk2-Antigene wurden die Abschnitte mit 20% normalem menschlichem Serum 15 min lang vor Anwendung der polyklonalen Kaninchen-Anti- Human-pMEK-, -pErk1/Erk2-, -pElk1-Primärantikörper bei einer Verdünnung von 1:20 (9101 L, New England Biolabs, Vereinigtes Königreich) blockiert. Biogenex Multil Link in einer Verdünnung von 1:100 (Euro/DPC, Llanberis, Vereinigtes Königreich) wurde 1 Stunde lang als sekundärer Antikörper eingesetzt. Es wurde ein Verfahren verwendet, das ein immunhistochemisches Avidin/Biotinkomplex-Set (Biogenex Concentrated Label, Euro/DPC) einsetzt.
Das Chromogen Diaminobenzidin (Sigma, Poole, Vereinigtes Königreich) wurde 5 Minuten lang angewendet, dann wurde Hämatoxylin 5 Minuten lang als Gegenfärbung verwendet.
Es wurden negative (generisches Maus-IgG, X0931, Dako) und positive Kontrollen (Teile der A431-Zellen für den EGFR und aus dem DCIS-Gewebe, das zuvor als stark positiv für c-erbB-2 und pERk1/Erk2 identifiziert worden ist) verwendet.
Die Färbung auf c-erbB-2 und EGFR war überwiegend membranös, es lag aber auch zytoplasmatische und nukleare Aufnahme vor. Diese wurden positiv (Skala 1–4) oder negativ in Bezug auf positive und negative Kontrollobjektträger beurteilt. Die Färbung für pErk1/Erk2 war nuklear und zytoplasmatisch und wurde gemäß der Intensität der Färbung in den nuklearen und zytoplasmatischen Komponenten wie zuvor beschrieben (Gee et al., Int. J. Cancer 64, 269–273 (1995)) beurteilt.
Alle histologischen Bewertungen wurden von Wissenschaftern durchgeführt, denen die Behandlungsgruppe nicht bekannt war. Die Reproduzierbarkeit der Zählung wurde vom selben Wissenschafter beurteilt, der 10 mit dem Ki67-Antikörper gefärbte Objektträger und 10 H&E-Objektträger einige Monate nach der ersten Beurteilung erneut auf Apoptose testete. Die zwei so erhaltenen Ergebnisreihen korrelierten mittels Regressionsanalyse (r = 0,95, P < 0,0001) gut.
Epithelproliferation in normalem Mausdarm
Die Entfernung und Verarbeitung von Darmgewebe zur Ki67-Beurteilung und die Verfahren zur Bewertung sind zuvor beschrieben worden (Potten and Grant, Br. J. Cancer 78, 993–1003 (1998)).
Statistische Verfahren
Die statistische Analyse wird unter Einsatz von SPSS-Software (SPSS, Chicago, IL, USA) vom CRC Department of Computing and Biomathematics (Abteilung für Computertechnologie und Biomathematik) am Paterson Institute for Cancer Research durchgeführt. Für jeden Fall eines normalen Brustepithels oder DCIS wurde ein Vergleich zwischen Proben angestellt, die zu jedem Bewertungszeitpunkt den mit ZD1839 behandelten Mäusen und den Kontrollmäusen entnommen wurden. Die zu jedem Bewertungszeitpunkt in den zwei Gruppen der Studie erhaltenen Gewebsproben wurden als statistisch unabhängig angesehen und unter Einsatz eines U-Tests von Mann Whitney verglichen. Alle Signifikanztests waren zweiseitig und verwendeten das herkömmliche 5-%-Signifikanzniveau. Die Daten aus den separaten ZD1839-Dosen wurden zusammengefasst, nachdem die anfängliche Analyse in allen Dosen Wirkung zeigte. Pearsons Korrelationskoeffizient wurde verwendet, um den Korrelationsgrad zwischen metrischen Variablen zu bestimmen. Die statistische Analyse der Proliferation im Darmepithel wurde durch den Vergleich der Mediane auf jeder Epithelzellenposition in den Krypten durchgeführt.
Ergebnisse
Das Durchschnittsalter der Frauen, die sich einer Operation unterzogen, war n = Bereich (Status der Menopause).
Implantation und Entfernung eines Xenotransplantats
DCIS
Von den 16 Brustgewebsproben, von denen bei der Operation festgestellt wurde, dass sie DCIS enthielten, produzierten 13 (81,3%) Tag-0-Proben, die DCIS enthielten, wovon 11 immunhistochemisch EGFR+ mit einem Medianwert von 2 (Bereich 1–3) exprimierten und 2 EGFR– waren. Von diesen 11 EGFR+-Fällen waren 7 ER–/c-erbB-2-positiv (alle mit hohem Nukleargrad) und 3 ER+/c-erbB-2-positiv (1 hoher Grad, 2 Mittelgrade) und 1 ER+/c-erbB-2-negativ (geringer Grad). Die 13 Brustgewebsproben erzeugten eine Gesamtzahl von 273 Tag-0-Proben, wovon 44 (16,1%) Foci von DCIS enthielten. Es wurde eine Gesamtzahl von 1904 Xenotransplantaten implantiert, wovon 1858 (97,5%) erfolgreich entfernt werden konnten. Von den 1858 entfernten Xenotransplantaten enthielten 329 (17,7%) DCIS. Die durchschnittliche Entfernung von DCIS durch Versuche betrug 71% des Erwarteten (Bereich 14–91,3%). Das DCIS wurde an den Tagen 14, 21, 28 und 42 in allen 13 Versuchen entfernt.
Normales Brustgewebe
Bei allen 16 Proben, die in der Operation für DCIS entfernt wurden, wurde histologisch normales Brustgewebe festgestellt. Es wurde die Mehrheit (97,6%) der implantierten Xenotransplantate entfernt, wovon 22,4% normales Brustgewebe umfassten. In 100% aller Versuche wurde zu allen Zeitpunkten normales Brustgewebe entfernt. Alle 16 Fälle waren ER+ und EGFR+ mit einem Mittelwert von 1 (Bereich 1–2), 2 waren auch schwach c-erbB-2-positiv.
Normales Brustgewebe (Tabelle 1)
Tabelle 1 zeigt die Proliferation von EGFR+ (LI) und Apoptose (AI) bei ZD1839 (10–200 mg/kg [zusammengefasste Daten]) im Vergleich zu vehikelbehandeltem (a) normalen Brustgewebe und (b) DCIS-Epithel zu verschiedenen Zeitpunkten. Die Zahlen in Klammern stellen Interquartilbereiche ** p < 0,01, *** p < 0,001 im Vergleich zur Kontrolle dar.
Normale Brust-Xenotransplantate zeigten von den Tagen 0 bis 14 (4,9 [IQR: 4,0–5,7] im Vergleich zu 3,8 [IQR: 2,7–5,1], p < 0,05) einen Rückgang der mittleren LI, die dann für die anderen Zeitpunkte (Tage 21, 28 und 42) unverändert blieb. Die mittlere LI ging bei der mit ZD1839 behandelten Gruppe im Vergleich zu den Kontrollen an Tag 21 (2,3 [IQR 1,0–3,8] im Vergleich zu 4,1 [IQR: 2,8–5,2]), Tag 28 (2,2 [IQR: 1,7–3,3] im Vergleich zu 4,1 [IQR: 2,4–5,4]) und Tag 42 (1,7 [IQR 1,1–2,6] im Vergleich zu 2,8 [IQR: 2,3–5,1]) (alle p < 0,01) zurück.
Die AI-Ergebnisse ähnelten den obigen Ergebnissen der mit DCIS behandelten Xenotransplantate. Von Tag 0 bis 14 (0,20 [IQR: 0,17–0,29] im Vergleich zu 0,18 [IQR: 0,10–0,21], p = 0,90) wurde keine Reduktion der mittleren AI festgestellt. An Tag 21 gab es verglichen mit den Kontrollen bei den mit ZD1839 behandelten Xenotransplanten einen Anstieg der mittleren AI (0,36 (IQR: 0,23–0,53] im Vergleich zu 0,18 [IQR: 0,10 bis 0,25, p < 0,001). Nach 14 Behandlungstagen (Tag 28) war die mittlere AI an die Kontrollniveaus angeglichen (ZD1839 0,19 [IQR: 0,10–0,28] im Vergleich zu Kontrolle 0,18 [IQR: 0,10–0,20], p = 0,35).
EGFR+ DCIS (1)
1 zeigt Veränderungen in LI und AI, die durch ZD1839 in „ER–/EGFR+"-(1a und 1c) beziehungsweise „ER+/EGFR+"-(1b und 1d)DCIS ausgelöst werden. ZD1839 oder das Vehikel wurde von Tag 14 an verabreicht. Die Werte für die Tage 0 und 14 sind Werte unbehandelter Mäuse. In der ZD1839-Gruppe wurde nach 7 und 14 Behandlungstagen (* p < 0,05, ** p < 0,01 im Vergleich zur Kontrolle) sowohl bei „ER–/EGFR+"- und „ER+/EGFR+"-DCIS ein Anstieg von AI und ein Rückgang von LI beobachtet. Die Zahlen in Klammen stehen für die Anzahl der für den bestimmten Zeitpunkt und für diese Gruppe angestellten Beobachtungen. Mittelwerte werden als dicke horizontale Linien dargestellt, die Rechtecke stellen den Interquartilbereich dar.
Die mittlere LI und AI bei Tag-0-Proben waren in den 7 Fällen von „ER–/EGFR+"-DCIS höher als in den 4 Fällen von „ER+/EGFR–"-DCIS (14,0 [IQR: 13,0–15,3] im Vergleich zu 7,8 [IQR: 6,5–11,2] beziehungsweise 1,3 [IQR: 1,0–1,6] im Vergleich zu 0,79 [IQR: 0,6–1,0], beide p < 0,05).
Die mittlere LI in „ER–/EGFR+"-DCIS nahm bei der mit ZD1839 behandelten Gruppe verglichen mit der mit dem Vehikel behandelten Gruppe bis zum Tag 21 (4,7 [IQR: 2,6–17,2) im Vergleich zu 11,6 [IQR: 10,7–15,1], p = 0,19), Tag 28 (8,3 [IQR: 2,7–10,9] im Vergleich zu 13,5 [IQR: 12,0–16,3], p < 0,01) und Tag 42 (11,4 [IQR: 10,8–11,8] im Vergleich zu 13,0 [IQR: 12,0–14,8], p < 0,05) ab (1a).
Es gab keine Veränderung in der mittleren AI in „ER–/EGFR+"-DCIS von Tag 0 bis 14 (1,3 [IQR: 1,0–1,6] im Vergleich zu 1,0 [IQR: 0,8–1,44], p = 0,14). Nach 7 Behandlungstagen (Tag 21) gab es einen signifikanten Anstieg der mittleren AI in der mit ZD1839 behandelten Gruppe verglichen mit der mit Vehikel behandelten Gruppe (2,1 [IQR: 1,0–2,3] im Vergleich zu 0,7 [IQR: 0,5 bis 1,1], p < 0,01), obwohl nach 14 Behandlungstagen (Tag 28) die mittlere AI wieder auf die Kontrollniveaus zurückkehrte (ZD1839 1,1 [IQR: 0,8–1,2] im Vergleich zur Kontrolle 1,2 [IQR 0,5–1,5], p = 0,44) (1b).
Ähnliche Veränderungen in LI und AI in „ER+/EGFR+"-DCIS (1b und 1d) wurden mit einem signifikanten Abfallen in LI an Tag 14 beobachtet (ZD1839 4,6 [IQR 3,9–5,2%] im Vergleich zu 11,2 Kontrolle (IQR 9,2–15,55)) und einem Anstieg der Apoptose (ZD1839 1,5 (IQR 1,3–1,6) im Vergleich zur Kontrolle (IQR 0,6–0,9%)).
Ki67-LI in EGFR+ (2)
2 zeigt die Epithelproliferationsraten (Ki67-LI) in „EGFR+"-(a)DCIS und (b) normalen Brustxenotransplantaten nach 2 Wochen (Tag 28) künstlicher Sondenernährung entweder bei verschiedenen Dosen von ZD1839 (10–200 mg/kg) oder Vehikelkontrolle. Die Zahlen in Klammern stehen für die Anzahl der für diesen bestimmten Zeitpunkt und für diese Gruppe angestellten Beobachtungen. Mittelwerte sind als dicke horizontale Linien dargestellt, die Rechtecke stehen für den Interquartilbereich.
Zunehmende Dosen von ZD1839 wurden mit zunehmendem Rückgang der Epithelproliferation sowohl bei „ER–/EGFR+"- als auch „ER+/EGFR+"-DCIS, aber nicht in normalem Brustgewebe festgestellt (2).
Korrelation von Proliferation mit Apoptose
Die Erfinder haben zuvor eine positive Korrelation von LI mit AI bei DCIS gezeigt. LI zeigte in normalem Brustgewebe und nicht mit ZD1839 behandeltem (d.h. an den Tagen 0, 14 und in Vehikelkontrollfällen) DCIS (r = 0, p = 0,02 beziehungsweise r = 0,25, p < 0,01) eine positive Korrelation mit AI.
Der Vergleich der Zellpopulation unter Einsatz eines mittleren LI/AI-Verhältnisses (als Verhältnis des Zellumsatzes) zeigte, dass die ZD1839-Behandlung den Zellumsatz sowohl bei DCIS als auch in normalem Brustgewebe an Tag 28 (4,4 [2,7–6,9] im Vergleich zu 29,7 [13,1–40,2] beziehungsweise 8,5 [5,8–17,4] im Vergleich zu 33,8 [21,4–70,6], p < 0,001) signifikant hemmte.
Herabregulierung von pErk1/2 in mit EGFR-TKI behandeltem DCIS und normalem Brustgewebe
Zur Bestimmung, ob der MAP-Kinase-Signalgebungs-Stoffwechselweg mittels EGFR-Tyrosinkinaseinhibition ausgeführt wurde, wurde an Tag-0- und Tag-42-Schnitten von DCIS und normalen Brustxenotransplantaten, die mit ZD1839 oder Vehikel behandelt worden waren, die immunhistochemische Detektion von phosphoryliertem (p) ErK1/Erk2 durchgeführt. Das mittlere Tag-0-DCIS und der normale Brustnuklear-H-Wert betrugen 30 (IQR: 12–45) und 22 (IQR: 12–34). Bei DCIS wurde der nukleare H-Wert der mit ZD1839 behandelten Gruppe verglichen mit den Kontrollen nach 28 Tagen Behandlung gesenkt (8 [IQR: 5–18] im Vergleich zu 25 [IQR: 8–30], p < 0,05). In normalem Brustgewebe gab es eine ähnliche Differenz (7 [IQR: 3–17,5] im Vergleich zu 18 [IQR 8–32], p < 0,01). Der nukleare H-Wert von pErk1/Erk2 korrelierte mit der Ki67-LI in DCIS und in normalem Brustgewebe (beide Male r = 0,52, p = 0,05).
Diskussion
ER-DCIS überexprimiert das c-erbB-2-Onkogen und soll in 50% der Fälle EGFR exprimieren. Die Erfinder stellten eine zweifache Expression von beiden Rezeptoren in derselben Zellpopulation in 10 von 11 (90%) ER-DCIS fest. Die ER-DCIS weist eine hohe Proliferationsrate auf, die in Proben, die vor der Behandlung entnommen wurden, mit der hohen Expression des MAP-Kinase-Signalübertragungsenzyms korrelierte.
Die Erfinder stellten daher die Hypothese auf, dass die Bildung von EGFR/c-erbB-2-Heterodimeren für die hohe Proliferationsrate und MAP-Kinaseexpression verantwortlich war, und die Erfinder testeten ihre Theorie unter Einsatz eines EGFR-TKI-Peptids, ZD1839. Bei Behandlung mit ZD1839 wurde ein andauernder Rückgang der Epithelproliferation und ein Rückgang der Expression von aktivierter MAP-Kinase kombiniert mit einem Anstieg von Apoptose in einem früheren Stadium beobachtet, was die Hypothese der Erfinder bestätigte. Es ist bekannt, dass EGFR ein mitogene tisches Signal produziert und mit der Proliferation und Tumorverdoppelung bei invasivem Brustkrebs korreliert, und die Inhibition dieses Wegs führte zu einem Rückgang des Ki67-Markierungsindexes bei DCIS-Xenotransplantaten.
Es wurde sowohl bei DCIS als auch in normalem Brustepithel nach sieben Behandlungstagen ein Anstieg der Apoptose beobachtet. Obwohl der insulinähnliche Wachstumsfaktor-1 (IGF-1) für das Überleben der Zelle wichtig sein soll, hat die jüngste Arbeit von Roudabush et al., J. Biol. Chem. 275, 22583–22589 (2000), gezeigt, dass die IGF-1-Rezeptorstimulation zur extrazellulären Sekretion von heparinbindendem EGF führt und die Transaktivierung im EGF-Rezeptor fördert. Daher kann der EGFR in der normalen Brust für das Überleben der Zelle wichtiger sein als bisher angenommen. Da die Epithelproliferation mit Apoptose in normaler Brust korreliert, kann erwartet werden, dass eine Reduktion der Proliferation mit einer Reduktion der Apoptose korreliert.
Nach dem anfänglichen Anstieg von Apoptose bei der mit ZD1839 behandelten Gruppe nach 7 Tagen führte der Rückgang des Markierungsindexes (Proliferation) zu einem Rückgang der Apoptose nach 14 Tagen. Jedoch wurde das Gesamt-LI/AI-Verhältnis in den mit ZD1839 behandelten Gruppen sowohl bei DCIS als auch bei normalem Brustgewebe reduziert, was einen geringeren Gesamtzellumsatz mit EGFR-TK-Inhibition anzeigte. Außerdem zeigt der Gesamtrückgang des Zellumsatzes die mögliche chemopräventive Wirkung eines EGFR-TKI auf normales Brustgewebe.
Es wird berichtet, dass das „ER–"-DCIS hoher Reinheit wahrscheinlich nach umfassender lokaler Exzision rückfällig werden würde und bei einem Rückfall zumindest 50% zu invasivem, hochgradigem Brustkrebs mit damit verbundenen knotigen oder entfernten Metastasen werden würden. Die Prävention eines Rückfalls und die Progression zu invasivem Krebs erfordern ein Arzneimittel, das die Proliferation unterdrückt oder Apoptose erhöht. Der beschriebene EGFR-TKI erfüllt diese Kriterien.
Eine Unterdrückung der normalen Brustepithelproliferation kombiniert mit einem Anstieg der Apoptose zeigt das Potenzial von EGFR-TK-Inhibitoren als chemopräventive Mittel bei Frauen mit erhöhtem Brustkrebsrisiko.
Es wird davon ausgegangen, dass der EGFR-MAP-Kinaseweg bei der Zellproliferation, beim Überleben der Zellen und bei der Zelldifferenzierung von Bedeutung ist. Die signifikante positive Korrelation von pErk1/Erk2 mit dem Ki67-Markierungsindex bei DCIS und normalem Brustgewebe deutet darauf hin, dass die MAP-Kinase-Signalgebung in der Vermittlung der Zellproliferation im Brustepithel wichtig ist. Ein Rückgang von pErk1/Erk2 bei der mit ZD1839 behandelten Gruppe korrelierte mit einem Rückgang der Proliferation, und es ist wahrscheinlich, dass die EGFR-Signale über diesen Weg und die MAP-Kinase-Veränderungen eine Arzneimittelreaktion vorhersagen.
Beispiel 3
Unter Einsatz des Verfahrens aus Beispiel 1, dessen Verfahrensschritte in Beispiel 2 genauer beschrieben sind, wurde die Wirkung von ZD1839 auf die Proliferation (Ki67-LI) in einem östrogenstimulierten normalen Brustepithel gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben.
Im normalen Brustepithel betrug der Ki67-LI-Wert an Tag 0, dem Tag der Implantation in eine Maus, 4,1 und sank am 14. Tag auf 2,6. Die Kontrollmäuse wurden dann nur mit Östrogen behandelt, während die Versuchsmäuse sowohl mit Östrogen als auch mit ZD1839 behandelt wurden. Die Menge des verabreichten Östrogens entsprach einer Menge vor der Menopause, d.h. 17-β-Östradiol-Pellet (2 mg) (siehe Holland et al., Verweis in Beispiel 1). Nach 21 Tagen betrug der Ki67-LI-Wert für die Kontrollmäuse 6,5, während der Wert für die Versuchsmäuse erheblich auf einen Wert von 1,4 reduziert wurde. Nach 28 Tagen betrug der Ki67-LI-Wert für die Kontrollmäuse 5,4, während der Wert für die Versuchsmäuse weiter auf einen Wert von 1,1 sank. Tabelle 2 Die Wirkung von ZD1839 auf die Proliferation (Ki67 LI) in östrogenstimuliertem normalem Brustepithel

Die Zahlen in Klammern stehen für Interquartilbereiche. * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001 gegenüber Kontrolle

Beispiel 4
Die Wirkung von ZD1839 auf Apoptose (AI) in östrogenstimuliertem normalem Brustepithel wurde wieder unter Einsatz des Verfahrens aus Beispiel 1 gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 angeführt.
Im normalen Brustepithel war der AI-Wert an Tag 0, dem Tag der Implantation in eine Maus, 0,3 und reduzierte sich am 14. Tag auf 0,2. Die Kontrollmäuse wurden nur mit Östrogen behandelt, während die Versuchsmäuse sowohl mit Östrogen als auch mit ZD1839 behandelt wurden. Die Menge des verabreichten Östrogens entsprach der Menge vor der Menopause. Nach 21 Tagen war der AI-Wert für die Kontrollmäuse 0,5, während der Wert für die Versuchsmäuse bei einem Wert von 0,7 noch höher war. Nach 28 Tagen war der AI-Wert für die Kontrollmäuse 0,6, während bei den Versuchsmäusen der Wert auf einem Wert von 0,7 blieb. Tabelle 3 Die Wirkung von ZD1839 auf Apoptose (AI) in östrogenstimuliertem normalem Brustepithel

Die Zahlen in Klammern stehen für die Interquartilbereiche. ** p < 0,01 gegenüber Kontrolle

Beispiel 5
Unter Einsatz desselben Anwendungsplans wie in Beispiel 1 wurde die Wirkung von ZD1839 auf die Progesteronrezeptorexpression (PR-LI) in östrogenstimuliertem normalem Brustepithel gemessen (der Progesteronrezeptor erhöht die hormonelle Reaktion der Zelle). Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 angeführt.
Im normalen Brustepithel betrug der PR-LI-Wert an Tag 0, dem Tag der Implantation in eine Maus, 11,8 und reduzierte sich am 14. Tag auf 5,8. Die Kontrollmäuse wurden dann nur mit Östrogen behandelt, während die Versuchsmäuse sowohl mit Östrogen als auch mit ZD1839 behandelt wurden. Die Menge des verabreichten Östrogens entsprach einer Menge vor der Menopause. Nach 21 Tagen stieg der PR-LI-Wert für die Kontrollmäuse auf 17,2, während der Wert für die Versuchsmäuse nur 10,4 betrug. Die Östrogeninduktion der PR-Expression wurde deshalb von ZD1839 unterdrückt. Daher werden die hormonellen Wirkungen (normalerweise durch Progesteronrezeptoren vermittelt) des Sexualsteroids Progesteron und Androgen gehemmt. Tabelle 4 Die Wirkung von ZD1839 auf die PR-Expression (PR-LI) in östrogenstimulierter normaler Brust und Epithel

Die Zahlen in Klammern stehen für Interquartilbereiche. ** p < 0,001 gegenüber Kontrolle

Aus den obigen Ergebnissen kann entnommen werden, dass, wie zuvor behauptet worden ist, die hemmende Wirkung auf das konstitutive Wachstum und die fördernde Wirkung auf das Absterben des normalen Brustzellgewebes ein Verfahren zur Inhibition der Transformation von normalen Zellen in Krebszellen, d.h. die Basis für eine chemopräventive Behandlung von Frauen, insbesondere jener Frauen mit einem höheren Risiko für malignen Brustkrebs, bereitstellt.
Studien von normalen Brustepithelen zeigen, dass die Hormonersatztherapie (HRT) die Expression des Progesteronrezeptors erhöht (Hargreaves et al., Br. J. Cancer 78 (7), 945–949 (Okt. 1998), und Hofscth et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 84 (12), 4559–4565 (Dez. 1999)) und kombinierte HRT (Östrogen und Progesteron) die Brustepithelproliferation signifikant stärker erhöht als HRT mit Östrogen alleine (siehe Hofstch, s.o.). Eine langfristigere Verwendung von kombinierter HRT weist eine höhere Brustkrebsinduktionsrate im Vergleich zu HRT mit Östrogen alleine auf (siehe Persson et al., Cancer Causes Control 10 (4), 253–260 (Aug. 1999), Colditz, J. Womens Health 8 (3), 347–357 (Apr. 1999), und Magnusson et al., Int. J. Cancer, 81 (3), 339–344 (5. Mai 1999)). Durch die Inhibition der Induktion des Progesteronrezeptors kann Progesteron seine Wirkungen nicht ausüben, und die Häufigkeit des Entstehens von Brustkrebs wird reduziert.
Zusätzlich zeigt die hemmende Wirkung auf östrogenstimuliertes normales Brustgewebe, dass der EGFR-Tyrosinkinaseinhibitor alleine funktioniert, sogar in Gegenwart hoher Östrogenspiegel: d.h. um bei Frauen vor der Menopause Chemoprävention zu erreichen.
Daher bietet die EGFR-TK-Inhibition unter Einsatz von ZD1839 einen neuen Ansatz für die Behandlung und Prävention von Krebs unabhängig vom ER-Status und stellt, besonders für Familien, die ein hohes Risiko für Brustkrebs aufweisen, einen potenziellen neuen chemopräventiven Ansatz bereit.

Claims

Verwendung eines EGFR-Tyrosinkinase-Inhibitors bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Chemoprävention des Ausbruchs von Brustkrebs bei einem Menschen, der frei von invasivem Brustkrebs ist, und zwar durch gleichzeitige Verringerung der Proliferation und Steigerung der Apoptose von Epithelzellen im Normalstadium oder in einem Intermediärstadium, das zwischen normalem Epithel und malignem invasivem Epithel liegt, wobei (a) die Transformation der Zellen von einem normalen zu einem malignen Stadium bei einem Menschen, der frei von invasivem Brustkrebs ist, verringert wird; (b) die Transformation der Zellen von einem Intermediärstadium, das zwischen normalem Epithel und malignem invasivem Epithel liegt, zu einem malignem Stadium bei einem Menschen, der frei von invasivem Brustkrebs ist, verringert wird; oder (c) eine maßgebliche Reversion des Epithelgewebes vom Intermediärstadium, das zwischen normalem Epithel und malignem invasivem Epithel liegt, zurück in das Normalstadium ausgelöst wird; wobei der EGFR-Tyrosinkinase-Inhibitor ZD1839 ist.
Verwendung nach Anspruch 1, worin das Medikament eine Kombination aus dem EGFR-Tyrosinkinase-Inhibitor als erste Wirkstoffkomponente und einem Antiöstrogen als zweite Wirkstoffkomponente ist, wobei die Komponenten gleichzeitig oder separat verabreicht werden können.
Verwendung nach Anspruch 2, worin das Antiöstrogen aus Tamoxifen, Fulvestrant und Raloxifen ausgewählt ist.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Epithelgewebe Säugetier-Epithelgewebe ist.
Medizinisches Set aus einer ersten und einer zweiten Wirkstoffkomponente zum kombinierten Einsatz bei der Chemoprävention des Ausbruchs von Brustkrebs bei einem Menschen, der frei von invasivem Brustkrebs ist, und zwar durch gleichzeitige Verringerung der Proliferation und Steigerung der Apoptose von Epithelzellen im Normalstadium oder in einem Intermediärstadium, das zwischen normalem Epithel und malignem invasivem Epithel liegt, wobei (a) die Transformation der Epithelzellen von einem normalen zu einem malignen Stadium bei einem Menschen, der frei von invasivem Brustkrebs ist, verringert wird; (b) die Transformation der Zellen von einem Intermediärstadium, das zwischen normalem Epithel und malignem invasivem Epithel liegt, zu einem malignem Stadium bei einem Menschen, der frei von invasivem Brustkrebs ist, verringert wird; oder (c) eine maßgebliche Reversion des Epithelgewebes vom Intermediärstadium, das zwischen normalem Epithel und malignem invasivem Epithel liegt, zurück in das Normalstadium ausgelöst wird; worin die erste Wirkstoffkomponente ein EGFR-Tyrosinkinase-Inhibitor ist, bei dem es sich um ZD1839 handelt, und die zweite Wirkstoffkomponente ein Antiöstrogen ist.
Medizinisches Set nach Anspruch 5, worin das Antiöstrogen aus Tamoxifen, Fulvestrant und Raloxifen ausgewählt ist.