ES2274157T3 - Composiciones de bmp-11. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para aumentar la supervivencia de las células neuronales in vitro que comprende administrar una composición que comprende un polipéptido BMP-11 purificado a una célula, en el que el polipéptido BMP-11 comprende una secuencia aminoácida codificada por una secuencia de ADN seleccionada de entre: (a) las secuencias de ADN que comprenden los nucleótidos 375 o 390 a 701 de la SEC ID nº:1, (b) las secuencias de ADN que comprenden los nucleótidos 760 o 775 a 1.086 de la SEC ID nº:10 (c) las secuencias de ADN que codifican la misma secuencia de aminoácido que las secuencias de ADN de (a) o (b); (d) las variaciones alélicas naturales de la secuencia de ADN de (a) o (b) que codifican un polipéptido que presenta actividad BMP-11; y (e) las secuencias de ADN que se hibridizan en condiciones severas con las secuencias de ADN de (a), (b) o (c) y que codifican un polipéptido que presenta actividad BMP-11.

Description

Composición de BMP-11.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a una nueva familia de proteínas purificadas que se denomina BPM-11, a las moléculas de ADN que las codifican, así como a procedimientos para su obtención. Los inventores han denominado previamente a las proteínas BMP-11 como Activina WC. Las proteínas BPM-11 pueden ser útiles para inducir la formación ósea y/o cartilaginosa y la curación de las heridas y la reparación tisular, o para aumentar la actividad de otras proteínas morfogenéticas óseas. Las proteínas BPM-11 pueden también ser útiles para regular la producción de la hormona estimulante folicular, para la anticoncepción, para promover la supervivencia de las células neuronales, para estimular la hematopoyesis, y para suprimir el desarrollo de tumores gonadales.

La patente US nº 4.798.885 dio a conocer el ADN que codificaba las cadenas \alpha y \beta de la prepro inhibina. La patente US nº 5.071.834 da a conocer composiciones farmacéuticas de activina con dos cadenas beta_{B} que se formulan en un transportador farmacéuticamente aceptable.

La patente US nº 5.102.807 da a conocer una proteína inhibina purificada que suprime la producción de FSH sin suprimir la de la hormona luteinizante.

Sumario de la invención

La proteína BMP-11 constituye un miembro de la superfamilia TGF-\beta de proteínas. La superfamilia TGF-\beta incluye la familia de proteínas conocida como proteínas morfogenéticas óseas (BMP), así como un grupo de proteínas que se denominan inhibina-\beta. Tal como se considera más adelante en la presente memoria, cuando se dimeriza con otra BMP-11 (homodímero), se espera que la proteína BMP-11 demuestre la actividad BPM-11, tal como se describe más adelante en la presente memoria, y como puede medirse según los ensayos que se describen en los ejemplos de la presente memoria. Cuando se dimeriza como un heterodímero con las proteínas inhibina-\alpha ó con otras proteínas inhibina-\beta, se espera que el heterodímero inhibina-\beta/BMP-11 demuestre efectos sobre la producción de la hormona estimulante folicular (FSH), tal como se describe más adelante en la presente memoria. Se espera además que, en forma homodimérica o heterodimérica con otro miembro de la familia de proteínas morfogenéticas, BMP-11 exhibirá actividad BMP, es decir, la capacidad para inducir la formación del hueso, cartílago y/o otros tejidos conjuntivos. Así, dependiendo del medio ambiente de BMP-11, puede formar dímeros que demostrarán actividad de activina o de inhibina, o actividad inductora ósea, del cartílago y/o de otro tejido conjuntivo. De acuerdo con esto, la actividad de BMP-11 se define como la capacidad para regular la producción de FSH en el ensayo que se describe en el Ejemplo 8 en la presente memoria, o la capacidad para inducir la formación de hueso, cartílago y/otros tejidos conjuntivos en los ensayos descritos en los Ejemplos 5 a 7 de la presente memoria.

Las proteínas denominadas inhibinas y activinas se producen en las gónadas y se encuentran de forma natural en el líquido folicular. Estas proteínas actúan a nivel de la glándula pituitaria anterior para inhibir (inhibinas) o estimular (activinas) la liberación de la hormona estimulante folicular (FSH) [para revisiones véase, por ejemplo, Ying, S.-Y., Endocr. Rev., 9: 267-293 (1988) o Ling, N. et al, Vitamins and Hormones, 44: 1-46 (Academic Press 1988)]. Brevemente, las proteínas diméricas compuestas por una cadena de inhibina \alpha y una cadena de inhibina \beta (\beta_{A} ó \beta_{B}) se denominan activinas y se caracterizan por su capacidad para estimular la liberación la hormona estimulante folicular (FSH), mientras que otras proteínas diméricas compuestas por dos cadenas de inhibina \beta (\beta_{A} ó \beta_{B}) se denominan activinas y se caracterizan por su capacidad para estimular la liberación de la hormona estimulante folicular (FSH) [véase, por ejemplo, Ling et al., Nature, 321: 779-782 (1986) o Vale, et al., Nature, 321, 776-779 (1986) o Mason et al., Nature, 318:659-663 (1985) o Forage et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:3091-3095 (1986)].

Se reconoce que la FSH estimula el desarrollo de óvulos en los ovarios de los mamíferos (Ross et al., en Textbook of Endocrinology, ed. Williams, pág 355 (1981) y que la estimulación excesiva de los ovarios con FSH conducirá a ovulaciones múltiples. FSH es también importante en la función testicular. De este modo, BMP-11, en heterodímeros con un miembro de la familia de inhibinas \alpha, puede ser útil como un anticonceptivo basado en la capacidad de las inhibinas para disminuir la fertilidad en los mamíferos hembras y disminuir la espermatogénesis en los mamíferos machos. La administración de cantidades suficientes de otras inhibinas puede inducir infertilidad en estos mamíferos. BMP-11, como homodímero o como heterodímero con otras subunidades proteicas del grupo de la inhibina-\beta, puede ser útil como un medicamento inductor de la fertilidad, basado en la capacidad de las moléculas de activina para estimular la liberación de FSH a partir de las células de la pituitaria anterior. Véase, por ejemplo la patente US nº 4.798.885. BMP-11 puede ser útil asimismo para el avance del comienzo de la fertilidad en los mamíferos sexualmente inmaduros, de forma que se aumente la función reproductora de la vida de los animales domésticos tales como vacas, ovejas y cerdos. Se considera además que las BMP-11 pueden ser útiles en promover la supervivencia de las células neuronales [véase, por ejemplo, Schubert et al., Nature, 344:868-870) (1990)], la modulación de la hematopoyesis induciendo la diferenciación de los hematíes [véase, por ejemplo, Broxmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 9052-9056 (1988) o Eto et al, Biochem. Biophys. Res. Comm., 142:1095-1103 (1987)], para suprimir el desarrollo de los tumores gonadales [véase, por ejemplo, Matzuk et al., Nature, 360:313-319 (1992)] o para aumentar la actividad de las proteínas morfogenéticas óseas [véase, por ejemplo, Ogawa et al., J. Biol. Chem, 267: 14233-14237 (1992)].

Las proteínas BMP-11 pueden caracterizarse además por su capacidad para modular la liberación de la hormona estimulante folicular (FSH) en bioensayos establecidos in vitro utilizando células de la pituitaria anterior de la rata tal como se ha descrito [véase, por ejemplo, Vale et al, Endocrinology, 91:562-572 (1972); Ling et al., Nature, 321:779-782 (1986) o Vale et al, Nature, 321: 776-779 (1986)]. Se considera que la proteína BMP-11 de la invención, cuando está compuesta como homodímero o como heterodímero con otras cadenas de inhibina \beta, mostrará efectos estimulatorios sobre la liberación de la hormona estimulante folicular (FSH) a partir de las células de la pituitaria anterior, tal como se ha descrito [Ling et al., Nature, 321:779-782 (1986) o Vale et al, Nature, 321: 776-779 (1986)]. Además, se considera que la proteína BMP-11 de la invención, cuando está compuesta como un heterodímero con la cadena de la inhibina \alpha, inhibirá la liberación de la hormona estimulante folicular (FSH) a partir de las células de la pituitaria anterior, tal como se ha descrito [véase, por ejemplo, Vale et al, Endocrinology, 91: 562-572 (1972)]. Por tanto, dependiendo de la composición particular, se espera que la proteína BMP-11 de la invención puede tener efectos opuestos y contrastantes sobre la liberación de la hormona estimulante folicular (FSH) a partir de la pituitaria anterior.

Se ha mostrado que la activina A (la composición homodimérica de inhibina \beta_{A}) que tiene actividad estimulante eritropoyética [véase por ejemplo Eto et al., Biochem. Biophys,. Res. Commun., 142: 1095-1103 (1987) y Murata et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2434-2438 (1988) y Yu et al., Nature 330: 765-767 (1987)]. Se considera que la proteína BMP-11 de la invención tiene una actividad estimulante eritropoyética similar. Esta actividad de la proteína BMP-11 puede caracterizarse además por su capacidad para demostrar la actividad eritropoyética en el ensayo biológico llevado a cabo utilizando la progenie celular humana K-562, según se describe por [Lozzio et al., Blood, 45: 321-334 (1975) y patente US nº 5.071.834].

Las estructuras de varias proteínas, denominadas BMP-1 a BMP-9, se han dilucidado previamente. Las excepcionales actividades inductoras de estas proteínas, conjuntamente con su presencia ósea, sugieren que constituyen reguladores importantes de los procesos de reparación del hueso, y pueden estar implicados en el mantenimiento normal del tejido óseo. La proteína BMP-11 de la presente invención está relacionada con las proteínas BMP citadas, y se espera que comparta actividades BMP tales como la capacidad para inducir tejido óseo, cartilaginoso y/o otros tejidos conjuntivos, tales como tendones o ligamentos, y las actividades curativas de heridas de las BMP. Además, se espera que las proteínas de la invención puedan actuar concertadamente con, o quizás de forma sinérgica con otras proteínas relacionadas y factores de crecimiento. Otros procedimientos terapéuticos y composiciones de la invención comprenden por tanto una cantidad terapéutica de una proteína BMP-11, por lo menos, de la invención, con una cantidad terapéutica de una, por lo menos, de las otras proteínas BMP que se han dado a conocer en las patentes copropietarias y en las aplicaciones que se describen a continuación. Dichas combinaciones pueden comprender moléculas separadas de las proteínas BMP o heteromoléculas formadas por distintas fracciones BMP. Además, las proteínas BMP-11 pueden combinarse con otros agentes beneficiosos para el tratamiento de las anomalías óseas y/o del cartílago, heridas, o tejidos en cuestión. Estos agentes incluyen varios factores de crecimiento tales como el factor de crecimiento epidérmico (EGF), el factor de desarrollo fibroblástico (FGF), el factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), los factores transformantes del crecimiento (TGF-\alpha y TGF-\beta), y el factor de crecimiento k-fibroblástico (kFGF), la hormona paratiroidea (PTH), el factor inhibidor de la leucemia (LIF/HILDA/DIA), los factores de crecimiento de tipo sinsulínico (IGF-I e IGF-II). Partes de estos agentes pueden también utilizarse en composiciones de la presente invención.

La secuencia ADN BMP-11 bovina (SEC ID nº:1) y la secuencia aminoácida (SEC ID:2) y la secuencia del ADN BMP-11 humano (SEC ID nº:10) y la secuencia aminoácida (SEC ID nº:11) se exponen en el Listado de Secuencias de la presente memoria. Las proteínas activina son capaces de regular la producción de la hormona estimulante del folículo (FSH), y, de este modo, BMP-11 puede ser útil como una terapéutica inductora de fertilidad o de anticoncepción. En forma homodimérica o en los heterodímeros con proteínas del grupo inhibina-\beta, se espera que la proteína BMP-11 purificada demuestre actividad activina, pudiendo utilizarse para estimular la FSH. Además, se espera que la proteína BMP-11 purificada pueda ser útil para la inducción de hueso, cartílago y/u otro tejido conjuntivo.

Una secuencia de ADN aislada que codifica una BMP-11 es preferentemente seleccionada de entre el grupo constituido por:

(a)

los nucleótidos #375 ó #390 a #704 de la SEC ID nº 1;

(b)

los nucleótidos #76 ó #775 a #1086 de la SEC ID nº10; y

(c)

las secuencias que se hibridizan a los mismos en condiciones de hibridación severas y codifican una proteína que muestra actividad BMP-11.

El ADN de la BMP-11 de la invención comprende preferentemente una secuencia de ADN seleccionada de entre el grupo constituido por:

(a)

los nucleótidos que codifican los aminoácidos 1 ó 6 a 109 de la SEC ID nº 2;

(b)

los nucleótidos que codifican los aminoácidos 1 ó 6 a 109 de la SEC ID nº 11; y

(c)

la secuencia que se hibridiza a los mismos en condiciones de hibridación severas y que codifica una proteína que muestra actividad BMP-11.

La BMP-11 bovina puede ser producida cultivando una célula transformada con una secuencia de ADN que incluya los nucleótidos desde el #375 al #704 tal como se muestra en la SEC ID nº:1 y recuperando y purificando del medio de cultivo una proteína caracterizada por la secuencia aminoácida que comprende desde el #1 al #109, tal como se muestra en la SEC ID nº:2, libre sustancialmente de otros materiales proteináceos con los que se co-produce.

Se espera que la BMP-11 humana sea homóloga a la BMP-11 bovina. La invención, por tanto, incluye procedimientos para la obtención de secuencias de ADN que codifiquen la BMP-11 humana, las secuencias de ADN obtenidas mediante estos procedimientos, y la proteína humana codificada mediante estas secuencias de ADN. Este procedimiento supone la utilización de la secuencia nucleótida de la BMP-11 bovina o de partes suyas para diseñar sondas con el fin de rastrear genotecas en relación con el gen humano o fragmentos suyos, utilizando técnicas estándar. En el Listado de Secuencias se dan a conocer una secuencia de ADN que codifica parte de la proteína BMP-11 humana (SEC ID nº:3) y la correspondiente secuencia aminoácida (SEC ID nº:4). Estas secuencias pueden utilizarse asimismo con objeto de diseñar sondas para obtener el gen BMP-11 humano completo mediante técnicas estándar. La BMP-11 humana puede ser producida cultivando una célula transformada con la secuencia de ADN BMP-11 y recuperando y purificando la BMP-11 del medio de cultivo. La proteína expresada purificada está libre sustancialmente de otros materiales proteináceos con los cuales se co-produce, así como de otros contaminantes.

Se considera la proteína purificada que se recupera como demostración de la capacidad para regular la producción de FSH. Las proteínas de la invención pueden caracterizarse además por la capacidad para regular la producción de la hormona estimulante folicular (FSH) en bioensayos establecidos in vitro, utilizando las células de la pituitaria anterior. Las proteínas BMP-11 pueden también caracterizarse por la capacidad para inducir la formación ósea, del cartílago y/o de otros tejidos conjuntivos, por ejemplo, en el ensayo de formación del hueso de la rata, que se describe a continuación.

Otro aspecto de la invención proporciona composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína BMP-11 en un vehículo o transportador terapéuticamente efectivo. Las composiciones de BMP-11 de la invención pueden ser útiles para la regulación de la hormona estimulante del folículo, y puede ser útil en la anticoncepción. Las composiciones de la invención pueden incluir además, por lo menos, otro agente terapéuticamente efectivo tal como las proteínas BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6 y BMP-7, que se dan a conocer, por ejemplo, en las patentes US nº 5.108.922; nº 5.013.649; nº 5.116.738; nº 5.106.748; nº 5.187.076; y nº 5.141.905; BMP-8, expuesta en la publicación PCT WO91/18098; y BMP-9, dada a conocer en la publicación PCT WO93/00432, y BMP-10, dada a conocer en la solicitud de patente en trámite número de serie 08/061.695, presentada el 12 de mayo de 1993. Las composiciones de BMP-11 pueden también ser útiles para diversos usos que involucran a la regulación de la producción de la hormona estimulante del folículo, que incluye la anticoncepción. Estos procedimientos, según la invención, suponen la administración a un paciente que necesite dicho tratamiento, de una cantidad efectiva de BMP-11.

Las composiciones de la invención pueden comprender, además de una proteína BMP-11, otros miembros del grupo inhibina-\beta de las proteínas, o a las proteínas inhibina-\alpha, así como otros agentes terapéuticamente útiles que incluyen factores de crecimiento tales como el factor de crecimiento epidérmico (EGF), el factor de crecimiento fibroblástico (FGF), el factor transformante de crecimiento (TGF-\alpha y TGF-\beta), y el factor de crecimiento de tipo insulina (IGF).

Las composiciones de BMP-11 de la presente invención pueden ser útiles asimismo para el tratamiento de diversas anomalías óseas y/o cartilaginosas, de la enfermedad periodontal y de varios tipos de heridas. Estos procedimientos, según la invención, suponen la administración a un paciente que necesite dicha formación del cartílago y/o de dicho hueso, la curación de las heridas o la reparación tisular, de una cantidad efectiva de una proteína BMP-11. Estos procedimientos pueden también suponer la administración de una proteína de la invención a la vez que, por lo menos, una de las nuevas proteínas BMP que se dan a conocer en las patentes co-propietarias y en las aplicaciones descritas anteriormente. Además, estos procedimientos pueden incluir también la administración de una proteína BMP-11 con otros factores de crecimiento, que incluyen EGF, FGF, TGF-\alpha, TGF-\beta, e IGF.

Otro aspecto, todavía, de la invención, lo constituyen las secuencias de ADN que codifican la expresión de una proteína BMP-11. Dichas secuencias incluyen la secuencia de nucleótidos en el sentido del extremo 5' hacia el extremo 3', que se muestra en la SEC ID nº:1, o las secuencias de ADN que se hibridizan bajo condiciones rigurosas con la secuencia de ADN de la SEC ID nº:1 y codifican una proteína que tiene actividad BMP-11. Finalmente, también se incluyen en la presente invención las variaciones alélicas u otras de las secuencias de la SEC ID nº:1, si dichos cambios nucleótidos dan lugar a cambios en la secuencia peptídica o no.

Otro aspecto todavía de la invención son las secuencias de ADN que codifican la expresión de una proteína BMP-11. Dichas secuencias incluyen la secuencia de nucleótidos en un sentido 5' a 3' que se ilustra en la SEC ID nº:1 o en la SEC ID nº:10, y las secuencias de ADN que, excepto por la degeneración del código genético, son idénticas a la secuencia de ADN de la SEC ID nº:1 o de la SEC ID nº:10, y codifican la proteína de la SEC ID nº:2 o de la SEC ID nº:11. Se incluyen además en la presente invención las secuencias de ADN que se hibridizan bajo condiciones rigurosas con la secuencia de la SEC ID nº:1, o de la SEC ID nº:10 y codifican una proteína que posee actividad BMP-11. Finalmente, también se incluyen en la presente invención las variaciones alélicas u otras de las secuencias de la SEC ID nº:1 o de la secuencia SEC ID nº:10, si dichos cambios nucleótidos dan lugar a cambios en la secuencia peptídica o no, pero en los que la secuencia peptídica tiene todavía actividad BMP-11.

Otro aspecto de la invención incluye vectores que comprenden una secuencia de ADN según se ha descrito anteriormente, asociada operativamente con una secuencia de control de la expresión.

Estos vectores pueden utilizarse en un nuevo procedimiento para la producción de una proteína BMP-11 de la invención, en el que una progenie celular transformada con una secuencia de ADN que codifique una proteína BMP-11 asociada operativamente con una secuencia de control de la expresión, se cultiva en un medio de cultivo apropiado y, a partir de ahí, se recupera y purifica una proteína BMP-11. Este procedimiento puede utilizar, como células huésped para la expresión del polipéptido, diversas células conocidas, tanto procarióticas como eucarió-
ticas.

La presente invención incluye asimismo la utilización de las secuencias de ADN y los vectores de la invención en aplicaciones de terapia génica. En tal caso, los vectores pueden ser transfectados in vitro a las células de un paciente, pudiéndose reintroducir las células en el paciente. Alternativamente, los vectores pueden introducirse in vivo en un paciente mediante la transfección dirigida.

Otros aspectos y ventajas de la presente invención serán evidentes tras considerar la siguiente descripción detallada y sus formas de realización preferidas.

Descripción de las secuencias

SEC ID nº:1 es una secuencia nucleótida parcial de la BMP-11 bovina, que codifica el polipéptido BMP-11 bovino maduro.

SEC ID nº:2 es la secuencia aminoácida de un propéptido parcial y del polipéptido BMP-11 maduro completo bovino, codificado por la SEC ID nº:1.

La SEC ID nº:3 es una secuencia nucleótida parcial de la BMP-11 humana.

La SEC ID nº:4 es una secuencia aminoácida parcial para el polipéptido BMP-11 humano codificado por la SEC ID nº:3.

La SEC ID nº:5 y 6 constituyen iniciadores para la BMP-11 bovina, utilizados para aislar la BMP-11 humana u otras proteínas BMP-11.

La SEC ID nº:7 es una secuencia de ADN que se inserta en pMT2 CXM para añadir un sitio de reconocimiento XhoI cerca del origen de replicación de SV40.

La SEC ID nº:8 es una secuencia de ADN que se inserta en pMT21 para insertar un sitio de reconocimiento XhoI por encima del gen DHFR.

La SEC ID nº:9 es una secuencia de ADN que incluye una parte de la secuencia conductora del virus EMC.

La SEC ID nº:10 es una secuencia de ADN que codifica un propéptido parcial y la proteína BMP-11 humana madura completa.

La SEC ID nº:11 es la secuencia aminoácida de un propéptido parcial y de la proteína BMP-11 humana madura completa codificada por la SEC ID nº:10.

Descripción detallada de la invención BMP-11

La secuencia nucleótida de la BMP-11 bovina (SEC ID nº:1), la secuencia aminoácida codificada (SEC ID nº:2), la secuencia nucleótida de la BMP-11 humana (SEC ID nº:10), y la secuencia aminoácida codificada (SEC ID nº:11) se muestran en los Listados de Secuencias de la presente memoria. Las proteínas BMP-11 bovinas purificadas de la presente invención se producen cultivando una célula huésped transformada con una secuencia de ADN que comprende la secuencia codificante ADN de la SEC ID nº:1 desde el nucleótido #375 al #704, o la secuencia codificante ADN de la SEC ID nº:10 desde el nucleótido #760 al #1086 y la recuperación y purificación a partir del medio de cultivo de una proteína que contiene la secuencia aminoácida o una secuencia sustancialmente homóloga, tal como la que se representa por los aminoácidos #1 a #109 de SEC ID nº:2, o de los aminoácidos #1 al #109 de SEC ID nº: 11. Para la producción de las proteínas BMP-11 en las células de mamífero, la secuencia de ADN comprende además un propéptido apropiado unido en el marco de lectura con el ADN anterior que codifica secuencias para la BMP-11. El propéptido puede ser el propéptido original de BMP-11 o un propéptido procedentes de otro miembro de la superfamilia TGF-\beta.

La secuencia BMP-11 humana de la presente invención se obtiene utilizando la totalidad o fragmentos de la secuencia de ADN de la BMP-11 bovina, o la secuencia parcial de la BMP-11 humana de SEC ID nº:3, como sonda. De este modo, la secuencia de ADN de la BMP-11 humana comprende la secuencia de ADN de los nucleótidos #28 a #185 de la SEC ID nº:3. La proteína BMP-11 humana incluye la secuencia aminoácida de los aminoácidos #1 a #52 de SEC ID nº:4.

Se espera que la BMP-11, expresada mediante las células de mamíferos tales como las células CHO, exista como una población heterogénea de tipos activos de la proteína BMP-11 con extremos N variables. Se espera que los tipos activos incluyan una secuencia aminoácida que empieza, por lo menos, con el residuo de cisteína en el aminoácido #6 de la SEC ID nº:1 o de la SEC ID nº:11, o ulteriormente en la dirección N-terminal. De este modo, se espera que las secuencias de ADN que codifican las proteínas BMP-11 activas incluirán los nucleótidos #375 o #390 al 701 de la SEC ID nº:1, o los nucleótidos #760 o #775 al #1086 de la SEC ID nº:10, y pueden incluir una secuencia nucleótida adicional en el sentido 5' de la SEC ID nº:1 o de la SEC ID nº:10.

El extremo N de la BMP-11 humana se ha determinado experimentalmente de la siguiente forma por la expresión en E. coli de: [M]NLGLDXDEHSSE, en la que X designa un residuo aminoácido sin una señal clara, que está de acuerdo con la localización de la cisteína en esa posición. Así, se espera que este tipo de BMP-11 tenga un extremo N en el aminoácido #1 de la SEC ID nº:1 o de la SEC ID nº:10, y que las secuencias de ADN que codifiquen esta especie incluirán los nucleótidos #375 al #701 de la SEC ID nº:1 (bovina) o los nucleótidos #760 al 1086 de la SEC ID nº:10 (humana). Se determinó mediante SDS-PAGE que el peso molecular aparente del monómero de la BMP-11 humana, era aproximadamente de 12 kd. La proteína BMP-11 humana se encuentra como una solución límpida, decolorada, en ácido trifluoroacético al 0,1%.

Las proteínas BMP-11 recuperadas a partir del medio de cultivo se purificaron aislándolas de otros materiales proteináceos a partir de los cuales son co-producidas, y a partir de otros contaminantes que se encuentran presentes.

Las proteínas BMP-11 pueden ser caracterizadas por su capacidad para regular la producción de FSH. Las proteínas BMP-11 pueden caracterizarse además por su capacidad para modular la liberación de la hormona estimulante del folículo (FSH) en bioensayos establecidos in vitro utilizando células de la pituitaria anterior tal como se describe [véase, por ejemplo, Vale et al, Endocrinology, 91:562-572 (1972); Ling et al., Nature, 321:779-782 (1986) o Vale et al., Nature, 321: 776-779 (1986)]. Las proteínas BMP-11 pueden también caracterizarse por la capacidad para inducir la formación ósea, del cartílago y/u otro tejido conjuntivo. Dicha actividad inductora tisular de BMP-11 puede caracterizarse además por la capacidad para inducir la formación ósea, del cartílago y/o de otro tejido conjuntivo en los ensayos descritos en los ejemplos que siguen a continuación.

Las proteínas BMP-11 que se proveen en la presente memoria incluyen factores codificados por secuencias similares a las SEC ID nº:1 o SEC ID nº:10, pero en las que las modificaciones se proporcionan naturalmente (por ejemplo, variaciones alélicas en la secuencia nucleótida que pueden dar lugar a cambios aminoácidos en el polipéptido), o se construyen deliberadamente. Por ejemplo, los polipéptidos sintéticos pueden duplicar total o parcialmente secuencias continuas de los residuos aminoácidos de la SEC ID nº:2 o de la SEC ID nº:11. Estas secuencias, en virtud de que comparten características conformacionales y estructurales primarias, secundarias o terciarias con los polipéptidos inhibina-\beta de la SEC ID nº:2 o la SEC ID nº:11, pueden poseer en común con ellas actividad BMP-11. De este modo, pueden utilizarse como sustitutivos biológicamente activos para los polipéptidos BMP-11 que se encuentran de modo natural, en procedimientos terapéuticos.

Otras mutaciones específicas de las secuencias de las proteínas BMP-11 descritas en la presente memoria, implican modificaciones de sitios de glicosilación. Estas modificaciones pueden involucrar a sitios de glicosilación unidos a O- o N-. Por ejemplo, la ausencia de glicosilación o sólo la glicosilación parcial se deriva de la sustitución o deleción de aminoácidos en los sitios de reconocimiento de la glicosilación unida a la asparagina. Los sitios de reconocimiento de la glicosilación unida a la asparagina incluyen secuencias tripeptídicas que son reconocidas específicamente mediante enzimas celulares apropiados de glicosilación. Estas secuencias tripeptídicas son, bien asparagina-X-treonina, o asparagina-X-serina, donde X es habitualmente cualquier aminoácido. Distintas sustituciones o deleciones de aminoácidos en una o ambas de la primera o tercera posiciones aminoácidas de un sitio de reconocimiento de la glicosilación (y/o la deleción aminoácida en la segunda posición) da lugar a la no glicosilación en la secuencia tripeptídica modificada. Además, la expresión de la proteína BMP-11 en las células bacterianas da lugar a una proteína no-glicosilada, sin alteración de los sitios de reconocimiento de la glicosilación.

La presente invención abarca asimismo las nuevas secuencias de ADN, libres de asociación con las secuencias de ADN que codifican otros materiales proteináceos, y que codifican la expresión de las proteínas BMP-11. Estas secuencias de ADN incluyen aquéllas que se muestran en la SEC ID nº:1 o en SEC ID nº:10 en una dirección 5' a 3' y aquellas secuencias que se hibridizan a ellas bajo condiciones de hibridación severas, por ejemplo SSC al 0,1, SDS al 0,1% a 65ºC [véase, Maniatis et al, Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory (1982), páginas 387 a 389] y codifican una proteína que posee actividad BMP-11. Estas secuencias de ADN incluyen también aquéllas que comprenden la secuencia de ADN de SEC ID nº:3 y aquéllas que se hibridizan bajo condiciones bajo condiciones de hibridación severas y codifican una proteína que tiene actividad BMP-11.

De modo similar, las secuencias de ADN que codifican proteínas BMP-11 codificadas por las secuencias SEC ID nº:1 o SEC ID nº:10, pero que difieren en la secuencia de los codones, debido a las degeneraciones del código genético o a variaciones alélicas (cambios en las bases que tienen lugar de modo natural en la población de especies que pueden o no dar lugar a un cambio aminoácido), codifican también los nuevos factores que se describen en la presente memoria. Las variaciones en las secuencias de ADN de SEC ID nº:1 o de SEC ID nº:10 que están causadas por mutaciones puntuales o por modificaciones inducidas (que incluyen la inserción, deleción, y sustitución) para aumentar la actividad, la vida media o la producción de los polipéptidos codificados, tienen cabida también en la invención.

Otro aspecto de la presente invención proporciona un nuevo procedimiento para producir proteínas BMP-11. El procedimiento de la presente invención implica el cultivo de una progenie celular apropiada, que se ha transformado con una secuencia de ADN que codifica una proteína BMP-11 de la invención, bajo el control de secuencias reguladoras conocidas. Las células huésped transformadas se cultivan y las proteínas BMP-11 se recuperan y purifican a partir del medio de cultivo. Las proteínas purificadas están libres sustancialmente de otras proteínas con las que se co-producen, así como de otros contaminantes.

Las células apropiadas o las progenies celulares pueden ser células de mamífero, tales como células ováricas de hámster chino (CHO). La selección de células huésped apropiadas de mamíferos y de procedimientos para la transformación, cultivo, amplificación, rastreo, producción del producto y purificación, son conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Gething y Sambrook, Nature, 293:620-625 (1981), o alternativamente, Kaufman et al, Mol. Cell. Biol., 5(7):1750-1759 (1985) o Howley et al, patente US nº 4.419.446. Otra progenie celular apropiada de mamífero, que se describe en los ejemplos que se acompañan, es la progenie celular COS-1 del mono. Las células CV-1 de mamíferos pueden también ser apropiadas.

Las células bacterianas pueden ser huéspedes apropiados. Por ejemplo, las diversas cepas de E. coli (por ejemplo, HB101, MC1061) se conocen bien como células huésped en el campo de la biotecnología. Varias cepas de B. subtilis, Pseudomonas, otros bacilos y similares pueden también utilizarse en este procedimiento.

Muchas cepas de células de levadura conocidas por los expertos en la materia, pueden estar también disponibles como células huésped para la expresión de los polipéptidos de la presente invención. Adicionalmente, si se desea, en el procedimiento de la presente invención, pueden utilizarse células de insecto como células huésped. Véase, por ejemplo, Miller et al, Genetic Engineering, 8:277-298 (Plenum Press 1986) y las referencias que se citan en la presente memoria.

Otro aspecto de la presente invención proporciona vectores para ser utilizados en el procedimiento de la expresión de estos nuevos polipéptidos BMP-11. Preferentemente, los vectores contienen las nuevas secuencias completas de ADN que se describen anteriormente que codifican los nuevos factores de la invención. Adicionalmente, los vectores contienen secuencias apropiadas de control de la expresión que permiten la expresión de las secuencias proteicas de BMP-11. Alternativamente, los vectores que incorporan secuencias modificadas tal como se han descrito anteriormente, constituyen también formas de realización de la presente invención. Además, la secuencia de SEC ID nº:1 o SEC ID nº:10 u otras secuencias que codifican las proteínas BMP-11 podrían manipularse para expresar una BMP-11 madura mediante la eliminación de secuencias BMP-11 codificantes propeptídicas codificantes y reemplazándolas con secuencias que codifiquen los propéptidos completos de otras proteínas BMP, proteínas de activina u otros miembros de la superfamilia TGF-\beta.

Los vectores pueden utilizarse en el procedimiento de transformación de las progenies celulares y contienen secuencias reguladoras seleccionadas y asociadas operativamente con las secuencias codificantes de ADN de la invención que son capaces de dirigir la replicación y su expresión en células huésped seleccionadas. Las secuencias reguladoras para dichos vectores son conocidas por los expertos en la materia y pueden seleccionarse dependiendo de las células huésped. Dicha selección es rutinaria y no forma parte de la presente invención. Para la expresión en las células huéspedes de los mamíferos, el vector puede comprender una secuencia codificante que codifica un propéptido apropiado para la secreción de proteínas por la célula huésped, unida en un marco de lectura apropiado a la secuencia que codifica la proteína BMP-11 madura. Secuencias apropiadas que codifiquen propéptidos pueden obtenerse a partir de ADN que codifique proteínas de la superfamilia TGF-\beta de proteínas, que incluyen, por ejemplo, de BMP-2 a BMP-9. Véase, por ejemplo, la patente US nº 5.168.150, cuya exposición se incorpora a la presente memoria como referencia, en la que un ADN que codifica una parte precursora de una proteína de mamífero distinta a la BMP-2, se fusiona con el ADN que codifica una proteína BMP-2 madura. De este modo, la presente invención incluye moléculas de ADN híbrido que incluyen una secuencia de ADN que codifica un propéptido de un miembro de la superfamilia TGF-\beta de proteínas, que se une, en un marco de lectura correcto, a una secuencia de ADN que codifica un polipéptido BMP-11. El término "híbrido" se utiliza para indicar que el propéptido se origina de un polipéptido distinto que
BMP-11.

Una proteína de la presente invención, que regula la producción de FSH, tiene una aplicación posible en el aumento de la fertilidad, cuando se expresa en una composición como un homodímero o como un heterodímero con otras proteínas de la familia de la inhibina-\beta. Las proteínas de la presente invención pueden también ser también útiles para la anticoncepción, cuando se expresan en una composición como un heterodímero con proteínas de la familia
inhibina-\alpha.

Una proteína de la presente invención, que induce la formación del cartílago y/del hueso en circunstancias en las que éste no se forma normalmente, tiene aplicación en la curación de las fracturas óseas y en las anomalías cartilaginosas en el hombre y en otros animales. Dicha preparación que utiliza una proteína BMP-11 puede tener una utilización profiláctica en la reducción de las fracturas abiertas, así como de las cerradas, y también en la mejora de la fijación de las articulaciones artificiales. La formación ósea de novo inducida por un agente osteogénico contribuye a la reparación de las anomalías craneofaciales inducidas por la oncoectomía, inducidas por traumas, o congénitas, y también es útil en la cirugía plástica cosmética. Una proteína BMP-11 puede utilizarse en el tratamiento de la enfermedad periodontal, y en otros procedimientos de reparación dentaria. Dichos agentes pueden proporcionar un medio para atraer a las células formadoras óseas, estimular su crecimiento o inducir la diferenciación de sus progenitores. Los polipéptidos BMP-11 de la invención pueden también ser útiles en el tratamiento de la osteoporosis. Se han descrito diversos factores inductores óseos, cartilaginosos y osteogénicos. Véase, por ejemplo, las solicitudes nº 148.155 y nº 169.016 de patente europea para su consideración.

Las proteínas de la invención pueden también utilizarse en la curación de heridas y en la reparación tisular relacionada. Los tipos de heridas incluyen, pero no se limitan a quemaduras, incisiones y úlceras. (Véase, por ejemplo, la Publicación PCT de WO84/01106 para la consideración de la curación de las heridas y de la reparación tisular relacionada).

Otro aspecto de la invención consiste en un procedimiento terapéutico y una composición para la reparación de fracturas y otras situaciones relacionadas con anomalías cartilaginosas y/u óseas o enfermedades periodontales. La invención comprende además procedimientos terapéuticos y composiciones para la curación de las heridas y la reparación tisular. Dichas composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de, por lo menos, una de las proteínas BMP-11 de la invención, mezclada con un vehículo farmacéuticamente aceptable, un transportador o una matriz.

Dicha preparación, que utiliza una proteína BMP-11 puede también aumentar la supervivencia neuronal y por tanto, ser útil en el transplante y en el tratamiento de situaciones que muestren una disminución en la supervivencia neuronal.

Se espera que las proteínas BMP-11 de la invención pueden actuar de común acuerdo o quizás sinérgicamente, con otras proteínas relacionadas y factores de crecimiento. Otros procedimientos terapéuticos y composiciones de la invención comprenden, por lo tanto, una cantidad terapéutica de por lo menos una proteína BMP-11 de la invención, con una cantidad terapéutica de, por lo menos, una de las proteínas BMP o de otros factores de crecimiento, que se dan a conocer en las patentes co-propietarias y solicitudes que se describen anteriormente. Dichas combinaciones pueden incluir moléculas separadas o heteromoléculas formadas por distintas fracciones. Por ejemplo, un procedimiento y composición de la invención puede incluir un dímero unido mediante un puente disulfuro que comprende una subunidad proteica BMP-11 y una subunidad de una proteína inhibina-\alpha, una proteína inhibina-\beta o una proteína BMP, tal como desde BMP-1 hasta BMP-10. Los agentes útiles con BMP-11 pueden incluir varios factores de crecimiento tales como el factor de crecimiento epidérmico (EGF), el factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), los factores de crecimiento transformantes (TGF-\alpha y TGF-\beta), y el factor de crecimiento tipo insulínico (IGF). Otros procedimientos terapéuticos y composiciones de la invención incluyen una cantidad terapéutica de, por lo menos, una proteína BMP-11 de la invención con una cantidad terapéutica de, por lo menos, una de las proteínas BMP dadas a conocer en las patentes co-propietarias y en las solicitudes que se describen anteriormente. Dichas composiciones pueden incluir moléculas separadas de las proteínas BMP o heteromoléculas formadas por distintas fracciones BMP. Por ejemplo, un procedimiento y composición de la invención puede comprender un dímero unido mediante puentes disulfuro que comprende una subunidad proteica BMP-11 y una subunidad de una de las proteínas "BMP" descritas anteriormente. De esta forma, la presente invención incluye un polipéptido BMP-11 purificado que es un heterodímero, en el que una subunidad comprende por lo menos la secuencia aminoácida a partir del aminoácido #1 al aminoácido #109 de la SEC ID nº: 2 o de la SEC ID nº:11, y otra subunidad incluye una secuencia aminoácida para una proteína morfogenética ósea seleccionada de entre el grupo formado por BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8 y BMP-9. Otra forma de realización puede comprender un heterodímero de fracciones BMP-11. Además, las proteínas BMP-11 pueden combinarse con otros agentes beneficiosos para el tratamiento de anomalías óseas y/o del cartílago, heridas, o tejidos en cuestión. Estos agentes incluyen varios factores de crecimiento tales como el factor de crecimiento epidérmico (EGF), el factor de crecimiento fibroblástico (FGF), el factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), los factores de crecimiento transformantes (TGF-\alpha y TGF-\beta), y el factor de crecimiento k-fibroblástico (kFGF), hormona paratiroidea (PTH), factor inhibitorio leucémico (LIF/HILDA/DIA), factores de crecimiento de tipo insulínico (IGF-I y IGF-II). Porciones de estos agentes pueden también utilizarse en las composiciones de la presente invención.

Las proteínas BMP-11 de la presente invención pueden utilizarse asimismo en composiciones que se combinan con proteínas morfogenéticas óseas. Véase, por ejemplo, Ogawa et al., WO 92/14481 (1992); Ogawa et al., J. Biol. Chem., 267:14233-14237 (1992). Las proteínas morfogenéticas óseas útiles en dichas composiciones incluyen BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6 y BMP-7, que se dan a conocer, por ejemplo, en las patentes US nº 5.108.922; nº 5.013.649; nº 5.116.738; nº 5.106.748; nº 5.187.076; y nº 5.141.905; BMP-8, expuesta en la publicación PCT WO91/18098; y BMP-9, dada a conocer en la publicación PCT WO93/00432, y BMP-10, dada a conocer en la solicitud de la patente en trámite número de serie 08/061.695, presentada el 12 de mayo de 1993.

La preparación y formulación de dichas composiciones proteicas fisiológicamente aceptables, relacionándolas debidamente con el pH, isotonicidad, estabilidad y similares, pertenecen a los conocimientos de la técnica. Las composiciones terapéuticas son también válidas actualmente para aplicaciones veterinarias, debido a la falta de especificidades específicas en las proteínas BMP y TGF. Particularmente, los animales domésticos y los caballos de pura sangre, además del hombre, constituyen pacientes deseados para dicho tratamiento con la BMP-11 de la presente invención.

El procedimiento terapéutico incluye la administración de la composición tópica, sistémica, o localmente, como un injerto o dispositivo. Cuando se administra, la composición terapéutica para utilizar en la presente invención se encuentra, desde luego, en una forma fisiológicamente aceptable, libre de pirógenos. Además, la composición puede encapsularse o inyectarse deseablemente en forma viscosa para el suministro al sitio del daño óseo, cartilaginoso o tisular. La administración tópica puede ser apropiada para la curación de las heridas y la reparación tisular. Agentes terapéuticamente útiles distintos a las proteínas BMP-22 que también pueden incluirse opcionalmente en la composición tal como anteriormente se ha descrito, pueden alternativa o adicionalmente, administrarse de modo simultáneo o secuencial con la composición de BMP-11 en los procedimientos de la invención.

Para la formación, preferentemente, del hueso, del cartílago o de otros tejidos conjuntivos, la composición incluye una matriz capaz de proporcionar BMP-11 u otras proteínas BMP al sitio del daño tisular que necesita reparación, suministrando una estructura para el hueso y el cartílago en desarrollo, que es capaz de forma óptima de absorberse en el organismo. La matriz puede proporcionar la liberación lenta de BMP-11 y/u otra proteína inductora ósea, así como la presentación y entorno apropiados para la infiltración celular. Dichas matrices pueden estar formadas de materiales que se utilicen actualmente para otros injertos médicos que se implanten. La selección del material matricial se basa en la biocompatibilidad, biodegradabilidad, propiedades mecánicas, apariencia cosmética y propiedades interfásicas. La aplicación particular de las composiciones de BMP-11 definirá la formulación apropiada. Las matrices potenciales para las composiciones pueden ser biodegradables y estar químicamente definidas como de sulfato cálcico, fosfato tricálcico, hidroxiapatito, ácido poliláctico y polianhídridos. Otros materiales potenciales son biodegradables y bien definidos biológicamente, tales como el hueso, los tendones o el colágeno dérmico. Otras matrices están compuestas de proteínas puras o de componentes matriciales extracelulares. Otras matrices potenciales son biodegradables y biológicamente bien definidas, tales como el hidroxiapatito sinterizado, biovidrio, aluminatos, u otras cerámicas. Las matrices pueden estar compuestas de combinaciones de cualquiera de los tipos anteriormente mencionados de material, tal como el ácido poliláctico y el hidroxiapatito o el colágeno y el fosfato tricálcico. Las biocerámicas pueden alterarse en su composición, tal como en el fosfato aluminato cálcico y el procesamiento para alterar el tamaño de los poros, el tamaño de las partículas, la forma de éstas y la biodegradabilidad.

La evolución puede monitorizarse mediante la evaluación periódica del desarrollo óseo y/o reparación. La evolución puede monitorizarse, por ejemplo, mediante rayos X, determinaciones histomorfométricas y marcaje de tetraciclinas.

El régimen de dosificación será determinado por el médico asistente considerando varios factores que modifican la acción de la proteína BMP-11, por ejemplo, la edad, sexo y dieta del paciente, la gravedad de cualquier infección, tiempo de administración y otros factores clínicos. La dosificación puede variar con el tipo de proteína BMP o de factor de crecimiento que se encuentre en la composición. La dosis puede también variar con el tipo de matriz utilizada.

Los siguientes ejemplos ilustran la práctica de la presente invención para recuperar y caracterizar la proteína BMP-11 bovina y su utilización para recuperar las proteínas BMP-11 humanas y otras, obteniendo las proteínas humanas y expresándolas mediante técnicas recombinantes.

Ejemplo 1 BPM-11 bovina

800.000 recombinantes de una genoteca genómica bovina construidos en el vector EMBL3 se sembraron con una densidad de 8000 calvas de bacteriófagos recombinantes por placa sobre 100 placas. A partir de estas placas, se obtuvieron y amplificaron réplicas por duplicado en nitrocelulosa de las calvas bacteriofágicas recombinantes. Un fragmento del ADN BMP-7 humano que corresponde a los nucleótidos #1081 al #1403 (Figura 4, patente US nº 5.141.905) se marca con ^{32}p mediante el procedimiento de cebado al azar de Feinberg et al [Anal. Biochem. 132: 6-13 (1983)] y se hibridiza a un conjunto de filtros en un tampón de hibridación estándar (SHB) (5x SSC, 0,170 SDS, 5x de Denhardt, 100 \mug/ml de ADN espermático de salmón) a 60ºC durante 2 a 3 días. Los filtros se lavaron bajo condiciones de severidad reducidas (4X SSC, SDS al 0,1% a 60ºC). Se apuntaron múltiples recombinantes que se hibridizaban positivamente. Se seleccionaron 52 calvas de bacteriófagos recombinantes que se hibridizaban positivamente y se volvieron a sembrar secundariamente. A partir de estas 52 placas secundarias se obtuvieron y amplificaron réplicas por duplicado en nitrocelulosa de las calvas bacteriofágicas recombinantes. Un conjunto de filtros de nitrocelulosa se hibridizó a la sonda del ADN BMP-7 humano tal como se ha descrito anteriormente, lavándose bajo las mismas condiciones reducidas de severidad. El otro conjunto de filtros se hibridizó a una mezcla de sondas constituida por BMP-5, BMP-6 y BMP-7 en SHB, a 65ºC durante la noche, lavándose con 0,1X SSC, 0,1% SDS a 65ºC (condiciones severas de hibridación y lavado). La mezcla de sondas estaba compuesta por cantidades relativamente iguales de fragmentos de ADN marcado con ^{32}P que incluían los nucleótidos #1452 a #2060 (Figura 4, patente US nº 5.106.748) de la secuencia BMP-5 humana, nucleótidos #1395 al #1698 (Figura 4, patente US nº 5.187.076) de la secuencia BMP-6 humana, y nucleótidos #1081 al #1403 (Figura 4, patente US nº 5.141.905) de la secuencia BMP-7. Los fragmentos de ADN BMP-7, BMP-6 y BMP-5 se marcaron con ^{32}P mediante el procedimiento de cebado al azar, combinándose números iguales de contaje por minuto (cpms) de cada sonda y añadiéndolos al SHB que contiene el otro conjunto de réplicas de las 52 placas secundarias en filtros de nitrocelulosa. 14 recombinantes, que se hibridizaron positivamente a la sonda humana BMP-7 bajo las condiciones de severidad reducidas y exhibieron una hibridación débil o no la exhibieron a la mezcla de sondas BMP-5/6/7 bajo condiciones de severidad intensa, se seleccionaron para un análisis posterior. La totalidad de los 14 recombinantes que mostraron estas características de hibridación se purificaron en placa y a partir de cada uno, se preparó un ADN bacteriofágico. La región que se hibridizó positivamente de uno de los 14 recombinantes que exhibía las características de hibridación descritas anteriormente, denominada. \lambda7 r-30, se localizó para un fragmento de restricción SacI de 0,5 kb. Este fragmento se subclonó en un vector plasmídico (pGEM-3) y se realizó el análisis secuencial del ADN. La secuencia parcial del ADN (SECUENCIA ID nº.1) y la secuencia aminoácida derivada (SECUENCIA ID nº. 2) del clon \lambda7r-30 se muestran en los Listados de Secuencia.

El bacteriófago \lambda7r-30 se ha depositado en ATCC el 7 de abril de 1993, con el Número de registro ATCC 75439. Este depósito cumple los requerimientos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los Procedimientos de Patente y las Normas por las que se rige.

Este clon \lambda7r-30 codifica por lo menos una parte de la proteína bovina BMP-11 de la presente invención. La secuencia nucleótida del clon \lambda7r-30 contiene un marco de lectura abierto de 456 nucleótidos, desde el #246 al 701 de la SEC ID nº:1. La secuencia nucleótida #324 al #701 de la SEC ID nº:1 define un marco de lectura abierto de 378 nucleótidos, que codifican por lo menos 126 aminoácidos del extremo C-terminal de una proteína bovina BMP-11, determinada por la alineación con otras proteínas BMP y otras proteínas pertenecientes a la familia TGF-\beta. La secuencia nucleótida #246 a #323 define un marco de lectura abierto, contiguo a la secuencia que codifica al péptido BMP-11 de 126 aminoácidos, pero sin embargo, un grado reducido de identidad aminoácida del péptido deducido de esta región de la secuencia ADN (#246 a #323) respecto a otras proteínas BMP y otras proteínas de la familia TGF-\beta, y la presencia de múltiples secuencias consensuadas aceptantes de corte y empalme hace difícil definir el límite del extremo 5' de este exon del gen BMP-11 bovino. La presencia de un codon de detención en el marco de lectura en las posiciones nucleótidas #243 a #245 indica que la secuencia nucleótida del clon \lambda7r-30 contiene por lo menos un límite exon/intrón del gen BMP-11 bovino.

Basándose en el conocimiento de otras proteínas dentro de la familia TGF-\beta, se pronostica que el polipéptido precursor de BMP-11 se fragmentará en la secuencia multibásica ARG-SER-ARG-ARG de acuerdo con una secuencia ARG-X-X-ARG propuesta y consensuada, de procesamiento proteolítico. Se espera que la fragmentación del polipéptido precursor de BMP-11 genere un péptido maduro de 109 aminoácidos que empieza con el aminoácido ASN en posición #1. Se espera que el procesamiento de BMP-11 en la forma madura implique la dimerización y remoción de la región N-terminal de forma análoga al procesamiento de la proteína relacionada TGF-\beta [Gentry et al., Molec. & Cell. Biol., 8:4162 (1988); Derynck et al., Nature, 316:701 (1985)].

Por tanto, se considera que los tipos activos maduros de la BMP-11 incluyan un homodímero de dos subunidades polipeptídicas, comprendiendo cada una de ellas los aminoácidos #1 a #109 con un peso molecular pronosticado de 12.000 daltons aproximadamente. Se consideran otros tipos activos que comprenden los aminoácidos #6 a #109, incluyendo por ello el primer residuo conservado de cisteína. Como con otros miembros de la familia TGF-\beta de proteínas, la región carboxi-terminal de la proteína BMP-11 exhibe una conservación secuencial mayor que la parte más amino-terminal. La identidad porcentual de los aminoácidos de la proteína BMP-11 en el dominio C-terminal rico en cisteína (aminoácidos #6 a #109) respecto a la región correspondiente de otras proteínas dentro de la familia TGF-\beta de la manera siguiente: BMP-2, 39%; BMP-3, 37%; BMP-4, 37%; BMP-5, 42%; BMP-6, 45%; BMP-7, 42%; BMP-8, 39%; BMP-9, 40%; Vg1, 39%; GDF-1, 34%; TGF-\beta1, 36%; TGF-\beta2, 38%; TGF-\beta3, 38%; inhibina \beta (B), 41%; inhibina \beta (A), 39%.

Ejemplo 2 BMP-11 humana

Se piensa que los genes BMP-11 humano y bovino son significativamente homólogos, por lo que la secuencia codificante bovina o una parte suya se utiliza como una sonda para rastrear una genoteca genómica humana o como una sonda para identificar una progenie celular humana o tejido que sintetice la proteína humana análoga. Una genoteca genómica humana, tal como el catálogo Stratagene #944201, puede rastrearse con dicha sonda, aislándose los presuntos positivos y obtenerse la secuencia del ADN. La evidencia de que este recombinante codifica una parte del BMP-11 humano descansa en las homologías de estructura génica y proteica bovina/humana.

Una vez es obtenido un bacteriófago recombinante que contiene ADN que codifica una parte de la molécula BMP-11 humana, la secuencia codificante humana puede utilizarse como una sonda para identificar una progenie celular humana o tisular que sintetice el ARNm BMP-11. Alternativamente, la secuencia codificante BMP-11 bovina puede utilizarse como una sonda para identificar dicha progenie celular o tejido humano. Brevemente descrito, el ARN se extrae a partir de una fuente tisular o celular seleccionada, realizándose la electroforesis sobre un gel de agarosa-formaldehído y transfiriéndose a la nitrocelulosa, o haciéndole reaccionar con formaldehído y rociándose directamente sobre la nitrocelulosa. Esta se hibridiza entonces a una sonda derivada de una secuencia codificante de la BMP-11 bovina o humana. Alternativamente, la secuencia codificante de la BMP-11 bovina se utilizó para diseñar los iniciadores oligonucleótidos que amplificarán específicamente una parte de la secuencia codificante de BMP-11 localizada en la región situada entre los iniciadores utilizados para llevar a cabo la reacción específica de amplificación. Se considera que las secuencias de la BMP-11 bovina y humana permitirían amplificar específicamente las secuencias codificantes correspondientes a la BMP-11 humana a partir del ARNm , ADNc o de las matrices del ADN genómico. Una vez que una fuente positiva se identificó mediante uno de los procedimientos descritos anteriormente, se seleccionó el ARNm mediante cromatografía de oligo (dT) celulosa, sintetizándose el ADNc y clonándose en \lambdagt10 o en otros vectores bacteriofágicos \lambda conocidos por los expertos en la materia. (es decir, \lambdaZAP) mediante técnicas establecidas (Toole et al., supra). También es posible llevar a cabo directamente la reacción de amplificación dirigida por el iniciador oligonucleótido, antes descrita, sobre un ADNc humano pre-establecido o una genoteca genómica clonada en un vector bacteriofágico \lambda. En tales casos, una genoteca que produce un producto de ADN amplificado específicamente que codifica una parte de la proteína BMP-11 humana, podría rastrearse directamente, utilizando como sonda el fragmento del ADN amplificado que codifica la BMP-11.

Los iniciadores oligonucleótidos diseñados basándose en la secuencia del ADN del clon \lambda7r-30 genómico de la BMP-11 bovina se pronosticaron para permitir la amplificación específica de las secuencias codificantes de la BMP-11 humana. El siguiente iniciador oligonucleótido se diseñó basándose en los nucleótidos #501 a #521 de la secuencia de ADN dada a conocer en la SEC ID nº.1 y se sintetizó en un sintetizador automatizado de ADN.

Iniciador C: TAGTCTAGATGCTCCGGCCAGTGCGAGTAC

Los primeros nueve nucleótidos del iniciador C (subrayados) comprenden la secuencia de reconocimiento para la endonucleasa de restricción XbaI que puede utilizarse para facilitar la manipulación de una secuencia de ADN específicamente amplificada que codifica la proteína BMP-11 de la invención, y por tanto no se deriva de la secuencia de ADN que se encuentra en la SEC ID nº:1.

El iniciador oligonucleótido siguiente se diseña basándose en los nucleótidos #701 a #678 de la secuencia de ADN que se expone en la SEC ID nº:1 y que se sintetiza con un sintetizador automatizado de ADN.

Iniciador D: TGCGGATCCGGAGCAGCCACAGCGATCCAC

Los primeros nueve nucleótidos del iniciador D (subrayados) comprenden la secuencia de reconocimiento para la endonucleasa de restricción BamHI que puede utilizarse para facilitar la manipulación de una secuencia de ADN específicamente amplificada que codifica la proteína BMP-11 de la invención, y por tanto no se deriva de la secuencia de ADN que se encuentra en la SEC ID nº:1.

Los símbolos estándar de los nucleótidos en los iniciadores anteriormente identificados son: A, adenosina; C, citosina, G, guanina; y T, timina.

Los iniciadores C y D anteriormente identificados se utilizan como iniciadores para permitir la amplificación de un nucleótido específico del ADN genómico humano. La reacción de amplificación se lleva a cabo de la siguiente forma:

ADN genómico humano (fuente: linfocitos de la sangre periférica) se desnaturalizó a 100ºC durante cinco minutos, enfriándose entonces en hielo, antes de añadirlo a una mezcla reactiva que contenía 200 \muM de cada uno de los desoxinucleótidos trifosfato (dATP, dGTP, dCTP y dTTP), 10 mM de Tris-HCl pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl_{2}, gelatina al 0,001%, 1,25 unidades de TAq ADN polimerasa, 100 pM del iniciador oligonucleótido C y 100 pM del iniciador oligonucleótido D. Esta mezcla reactiva se somete entonces a ciclación térmica de la siguiente manera: 3 minutos a 94ºC, 1 minuto a 50ºC, 1 minuto a 72ºC durante un ciclo, 1 minuto entonces a 94ºC, 1 minuto a 50ºC, 1 minuto a 72ºC durante treinta y nueve ciclos.

El ADN que se amplificó específicamente mediante esta reacción, se separó de los iniciadores oligonucleótidos C y D en exceso que se utilizaron para iniciar la amplificación, utilizando un protocolo basado en una resina de purificación del ADN bajo las condiciones sugeridas por el fabricante. El producto resultante de ADN se digirió con las endonucleasas de restricción XbaI y BamHI, extrayéndose con fenol y cloroformo. El intercambio del tampón y la eliminación de pequeños fragmentos del ADN resultante del digesto de restricción XbaI/BaHI se llevó a cabo diluyendo el producto de ADN digerido en 10 mM de Tris-Hcl pH 8,0, 1 Mm EDTA seguido por centrifugación mediante un microconcentrador Centricon ^{TM} 30 (W. R. Grace & Co., Beverly, Ma; producto #4209). El producto resultante del ADN amplificado digerido mediante XbaI/BamHI se subclonó en un vector plasmídico (pBluescript) entre los sitios de restricción XbaI y BamHI de la región poliengarce. El análisis de la secuencia de ADN de los subclones resultantes indica que el producto de la secuencia específicamente amplificada de ADN codifica una parte de la proteína BMP-11 humana de la presente invención. La secuencia de ADN (SEC ID nº:3) y la secuencia aminoácida derivada (SEC ID nº:4) de este fragmento de ADN específicamente amplificado se exponen en el Listado de Secuencias.

Los nucleótidos #1 a #27 de esta secuencia comprenden una parte del iniciador oligonucleótido C y los nucleótidos #186 a #213 comprenden una parte del iniciador oligonucleótido D utilizados para llevar a cabo la reacción de amplificación específica. Debido a la función de los iniciadores oligonucléotidos C y D (denominados basándose en la secuencia de ADN de la BMP-11 bovina) en la iniciación de la reacción de amplificación, no pueden corresponder exactamente a la secuencia actual que codifica una BMP-11 humana y por tanto no se traducen en la derivación de la secuencia aminoácida anterior. La secuencia de ADN, desde el nucleótido #28 al #185 de la SEC ID nº:3, o sus partes, amplificadas especialmente a partir de la matriz del ADN genómico humano, pueden utilizarse como sonda para identificar secuencias codificantes adicionales de la BMP-11 humana a partir de genotecas de ADNc humano o genómicas humanas, mediante técnicas estándar de rastreo/hibridación conocidas por los expertos en la
materia.

Un millón doscientos mil recombinantes de una genoteca de ADNc cerebral fetal humano (catálogo # 936206 de Stratagene) construidos en el vector \lambdaZAPII, se sembraron con una densidad de 24.000 calvas bacteriofágicas recombinantes por placa en 50 placas. Réplicas por duplicado en nitrocelulosa de las calvas bacteriofágicas recombinantes, se obtuvieron a partir de estas placas. Una sonda oligonucleótida diseñada basándose en los nucleótidos #53-#82 de la SEC ID nº:3, se sintetizó en un sintetizador automatizado de ADN. Esta sonda oligonucleótida se marcó radioactivamente con \gamma^{32}P-ATP y se hibridizó en SHB a 65ºC a ambos conjuntos de las réplicas por duplicado en nitrocelulosa. Se anotaron nueve recombinantes que se hibridizaron positivamente. Uno de éstos, denominado \lambdaFB30.5 se purificó en calva. Se prepararon reservas de placas bacteriofágicas de los clones \lambdaFB30.5 ADNc, aislándose después el ADN del bacteriófago. Un plásmido bacteriano denominado FB30.5, generado mediante el protocolo de excisión in vivo descrito por el suministrador (Stratagene) y que contiene la inserción entera del clon ADNc del bacteriófago \lambdaFB30.5, se depositó en ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, Estados Unidos, bajo los requerimientos del Tratado de Budapest y se denominó ATCC # 69619. Una parte de la secuencia de ADN del clon FB30.5 se da a conocer en la SEC ID nº:10.

Un millón de recombinantes de una genoteca genómica humana (Catálogo de Stratagene #944201), construidos en el vector \lambdaFIX se sembraron con una densidad de 20.000 calvas bacteriofágicas recombinantes por placa en 50 placas. Réplicas por duplicado en nitrocelulosa de las calvas bacteriofágicas recombinantes, se obtuvieron a partir de estas placas. Una sonda oligonucleótida diseñada basándose en los nucleótidos #57-#86 de la SEC ID nº:10, con la excepción de una sustitución inadvertida de CAC por GCG en los nucleótidos #59-#61 de la SEC ID nº:10, se sintetizó en un sintetizador automatizado de ADN. Esta sonda oligonucleótida se marcó radioactivamente con \gamma^{32}P-ATP y se hibridizó, en SHB a 65ºC, a ambos conjuntos de las réplicas por duplicado en nitrocelulosa. Se anotaron cinco recombinantes que se hibridizaron positivamente. Uno de éstos, denominado 30GEN.4 se purificó en calva. Se prepararon reservas de placas bacteriofágicas de los clones genómicos 30GEN.4, aislándose después el ADN del bacteriófago. Una reserva bacteriofágica de este clon genómico se depositó en ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, Estados Unidos, bajo los requerimientos del Tratado de Budapest y se denominó como ATCC # 75775. Una parte de la secuencia de ADN del clon 30GEN.4 se da a conocer en la SEC ID nº:10. Se determinó que una parte de la secuencia de ADN del clon genómico 30GEN.4 era idéntica a una parte de la secuencia de ADN del clon FB30.5 de ADNc. El grado de este solapamiento (nucleótidos #1-#198) de la SEC ID nº:10 se utilizó como base para compilar la secuencia codificante parcial de la proteína BMP-10. Se espera que el clon genómico 30GEN.4 contenga secuencias codificantes adicionales del extremo 5' de la proteína humana BMP-11 que se espera que codifiquen el resto del polipéptido precursor de BMP-11, incluyendo la metionina iniciadora. La secuencia parcial de la BMP-11 se presenta en la SEC ID nº:10 y deberá apreciarse que se ha determinado que los nucleótidos #1-198 se encuentran tanto en el clon genómico 30GEN.4 como en el clon FB30.5 de ADNc, mientras los nucleótidos #199-#1270 se derivan enteramente del clon FB30.5 de ADNc. La SEC ID nº:10 preconiza una proteína precursora BMP-11 humana de por lo menos 362 aminoácidos. Basándose en el conocimiento de otras BMP y de otras proteínas que pertenecen a la familia TGF-\beta, se pronostica que el polipéptido precursor podría fragmentarse en la secuencia multibásica ARG-SER-ARG-ARG (aminoácidos #-4 hasta #-1 de la SEC ID nº.11) de acuerdo con LA secuencia consensuada ARG-X-X-ARG propuesta, de procesamiento proteolítico. La fragmentación del polipéptido precursor BMP-11 humano en esta localización generará un péptido maduro de 109 aminoácidos que empieza con el aminoácido ASN en posición #1 de la SEC ID nº:11. El procesamiento de la BMP-11 humana en la forma madura se espera que implique la dimerización y eliminación de la región N-terminal de forma análoga al procesamiento de la proteína TGF-\beta relacionada [L.E. Gentry et al. Molec. & Cell. Biol. 8:4162 (1988); R. Derynck, et al, Nature 316:701 (1985). Se considera que los tipos activos maduros de la BMP-11 humana comprende un homodímero de dos subunidades polipeptídicas, incluyendo cada una de ellas los aminoácidos #-1-#108 de la SEC ID nº:11, con un peso molecular previsto de 12.000 daltons. Se considera que otros tipos activos comprenden los aminoácidos #7-#108 de la SEC ID nº:11, incluyendo por tanto el primer residuo de cisteína conservado. También se tienen en cuenta las moléculas heterodiméricas que comprenden una subunidad de BMP-11 y otra de otro miembro de la superfamilia BMP/TGF-\beta.

Ejemplo 3 Expresión de BMP-11

Con objeto de producir proteínas BMP-11 bovinas, humanas o de otros mamíferos, el ADN que las codifica se transfiere a un vector de expresión apropiado y se introduce en las células de mamífero o de otros huéspedes eucarióticos o procarióticos preferidos, mediante técnicas convencionales de ingeniería genética. Se considera que el sistema de expresión preferido para la BMP-11 humana recombinante biológicamente activa lo constituyen las células de mamífero transformadas establemente.

El experto en la materia puede construir vectores de expresión en mamíferos utilizando la secuencia de SEC ID nº:1 o de SEC ID nº:10, o otras secuencias de ADN que codifiquen proteínas BMP-11 u otras secuencias modificadas y vectores conocidos, tales como pCD [Okayama et al., Mol. Cell. Biol., 2:161-170 (1982)], pJL3, pJL4 [Gough et al., EMBO J., 4:645-653 (1985)] y pMT2 CXM.

El vector de expresión pMT2 CXM de mamíferos es un derivado de p91023 (b) (Wong et al., Science, 228: 810-815, 1985) que difiere de p91023 en que contiene el gen de resistencia a la ampicilina en vez del gen de resistencia a la tetraciclina y además un sitio XhoI para la inserción de los clones ADNc. Se han descrito los elementos funcionales de pMT2 CXM (Kaufman, R.J., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:689-693) e incluyen los genes VA adenovíricos, el origen de replicación de SV40 que incluye el potenciador de 72 pares de bases, el promotor tardío más importante del adenovirus que incluye un sitio de corte y empalme del extremo 5' y la mayor parte de la secuencia conductora tripartita que se encuentra en los ARNm tardíos del adenovirus, un sitio aceptor de corte y empalme, un inserto DHFR, el sitio de poliadenilación temprana de SV40 (SV40), y las secuencias de pBR322 necesarias para la propagación en E. coli.

El pMT2 CXM plasmídico se obtiene mediante la digestión con EcoRI de pMT2-VWF, que se depositó en la American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD (USA) con el número de registro ATCC 67122. La digestión con EcoRI extirpa la inserción de ADNc que se encuentra en pMT2-VWF, dando lugar a pMT2 en forma lineal que puede unirse y utilizarse para transformar E. coli HB 101 o DH-5 a la resistencia a la ampicilina. El ADN pMT2 plasmídico puede prepararse mediante procedimientos convencionales. Se construye entonces pMT2 CXM utilizando la mutagénesis de lazo externo/ó interno [Morinaga et al., Biotechnology 84: 636 (1984). Esta suprime las bases 1075 a 1145 relativas al sitio Hind III cerca del origen de replicación de SV40 y de las secuencias potenciadoras de pMT2. Además, inserta la secuencia siguiente:

5' PO-CATGGGCAGCTCGAG-3'

en el nucleótido 1145. Esta secuencia contiene el sitio de reconocimiento para la endonucleasa de restricción Xho I. Un derivado de pMT2CXM, denominado pMT23, contiene sitios de reconocimiento para las endonucleasas de restricción PstI, Eco RI, SalI y XhoI. El ADN plasmídico pMT2 CXM y pMT23 puede prepararse mediante procedimientos convencionales.

pEMC2\beta1 derivado de pMT21 puede también ser apropiado para llevar a cabo la invención. pMT21 se deriva de pMT2 que se deriva de pMT2-VWF. Tal como se describe anteriormente, la digestión mediante EcoRI extirpa la inserción de ADNc que se encuentra en pMT-VWF, dando lugar a pMT2 en forma lineal que puede unirse y utilizarse para transformar E. coli HB 101 o DH-5 a la resistencia a la ampicilina. El ADN pMT2 plasmídico puede prepararse mediante procedimientos convencionales.

pMT21 se deriva de pMT2 mediante las dos modificaciones siguientes. En primer lugar, se suprimen 76 pares de bases de la región no traducida del extremo 5' del ADNc DHFR, que incluyen un alargamiento de 19 residuos G de la adición de una cola G/C para la clonación de ADNc. En este procedimiento, se inserta un sitio XhoI para obtener inmediatamente por encima de DHFR, la secuencia siguiente:

100

En segundo lugar, un único sitio ClaI se introduce mediante digestión con EcoRV y XbaI, tratamiento con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I, y unión a un engarce ClaI (CATCGATG). Esto suprime un fragmento de 250 pares de bases de la región del ARN asociada con el adenovirus (VAI), pero no interfiere con la expresión o función del gen VAI ARN. pMT21 es digerido con EcoRI y XhoI, y se utiliza para derivar el vector pEMC2B1.

Una parte del conductor EMCV se obtiene a partir de pMT2-ECAT1 [S.K. Jung, et al, J.Virol 63:1651-1660 (1989)] mediante digestión con Eco RI y PstI, dando lugar a un fragmento de 2752 pares de bases. Este fragmento es digerido con TaqI, dando lugar a un fragmento Eco RI-TaqI de 508 pares de bases que se purifica mediante electroforesis en un gel de agarosa de temperatura de fusión baja. Un adaptador de 68 pares de bases y su cadena complementaria son sintetizados con un extremo 5' sobresaliente de TaqI y un extremo 3' sobresaliente de XhoI, que tiene la siguiente secuencia:

101

Esta secuencia se empareja con la secuencia conductora del virus EMC desde el nucleótido 763 al 827. También cambia el ATG en la posición 10 en el interior de la secuencia conductora del virus EMC a un ATT y es seguido por un sitio XhoI. El vector pEMC2\beta1 resulta de la unión tripartita del fragmento pMT21 Eco RI-XhoI, el fragmento EcoRI-TagI del virus EMC, y el adaptador TaqI-XhoI oligonucleótido de 68 pares de bases.

Este vector contiene el origen de replicación y el potenciador de SV40, el promotor tardío más importante del adenovirus, una copia del ADNc de la mayoría de la secuencia conductora tripartita adenovírica, una pequeña secuencia híbrida de intervención, una señal de poliadenilación SV40 y el gen VA I del adenovirus, los marcadores DHFR y \beta-lactamasa y una secuencia EMC, relacionados apropiadamente para dirigir la expresión de alto nivel del ADNc deseado en las células de mamífero.

La construcción de vectores puede implicar la modificación de las secuencias del ADN BPM-11. Por ejemplo, el ADNc BMP-11 puede modificarse mediante supresión de los nucleótidos no codificantes en los extremos 5' y 3' de la región codificante. Los nucleótidos no codificantes suprimidos pueden o no ser reemplazados por otras secuencias que se sabe son beneficiosas para la expresión. Estos vectores se transforman en las células huésped apropiadas para la expresión de las proteínas BMP-11. Además, las secuencia SEC ID nº:1 o SEC ID nº:10 u otras secuencias que codifiquen proteínas BMP-11 podrían ser manipuladas para expresar una BMP-11 madura, suprimiendo las secuencias propeptídicas que codifican la BMP-11 y reemplazándolas con secuencias que codifiquen los propéptidos completos de otras proteínas BMP, proteínas activinas u otros miembros de la superfamilia TGF-\beta.

Un experto en la materia puede manipular la secuencia SEC ID nº:1 o la SEC ID nº:10, eliminando o reemplazando las secuencias regulatorias de los mamíferos, que flanquean a la secuencia codificante, con secuencias bacterianas, con objeto de crear vectores bacterianos para la expresión extracelular o intracelular mediante las células bacterianas. Por ejemplo, las secuencias codificantes podrían ser manipuladas posteriormente (por ejemplo, uniéndolas a otros engarces conocidos, o modificándolas suprimiendo secuencias no codificantes suyas o alterando nucleótidos mediante otras técnicas conocidas). La secuencia codificante de la BMP-11 modificada podría entonces insertarse en un vector bacteriano conocido utilizando procedimientos tales como los descritos en T. Taniguchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5230-5233 (1980). Este vector bacteriano ejemplar podría entonces transformarse en las células huésped bacterianas y expresar por tanto, una proteína BMP-11. Para consultar estrategias para la producción de la expresión extracelular de proteínas BMP-11 en las células bacterianas, véase, por ejemplo, la solicitud de patente europea EPA 177.343.

Manipulaciones similares pueden llevarse a cabo para la construcción de un vector de insecto [Véase, por ejemplo, los procedimientos que se describen en la solicitud publicada de la patente europea 155.476] para la expresión en las células de insectos. Asimismo, podría construirse un vector de levadura que utilizara las secuencias reguladoras de la levadura para la expresión intra o extracelular de los factores de la presente invención mediante las células de levadura. -[Véase, por ejemplo, los procedimientos descritos en la solicitud publicada de la patente PCT, WO86/00639, y en la solicitud de patente europea EPA 123.289].

Un procedimiento para la producción de altos niveles de una proteína BMP-11 de la invención en las células de mamífero, puede implicar la construcción de células que contengan copias múltiples del gen heterólogo de BMP-11. El gen heterólogo se une a un marcador capaz de ser amplificado, por ejemplo el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) para el cual las células que contienen un aumento de copias del gen, pueden ser seleccionadas para que se propaguen en concentraciones crecientes de metotrexato (MTX), según los procedimientos de Kaufman y Sharp, J. Mol.Biol., 159:601-629 (1982). Este planteamiento puede utilizarse con diversos tipos celulares diferentes.

Por ejemplo, un plásmido que contiene una secuencia de ADN para una BMP-11 de la invención, asociado operativamente con otras secuencias plasmídicas que permitan su expresión y el plásmido pAdA26SV(A)3 que expresa DHFR [Kaufman y Sharp, Mol. Cell. Biol., 2:1304 (1982)], puede co-introducirse en células CHO deficientes en DHFR, DUKX-BII, mediante diversos procedimientos que incluyen la coprecipitación mediante fosfato cálcico y la transfección, electroporación o fusión protoplástica. Los transformantes que expresan DHFR se seleccionan para que crezcan en medio alfa con suero dializado de ternera fetal dializado, seleccionándose a continuación para su amplificación haciéndolos crecer en concentraciones crecientes de MTX (por ejemplo, etapas secuenciales en 0,02, 0,2, 1,0 y 5 uM MTX), tal como se describe en Kaufman et al., Mol. Cell Biol., 5:1750 (1983). Los transformantes se clonan, y la expresión de la BMP-11 biológicamente activa se controla mediante uno o más de los ensayos de actividad de la BMP-11 que se describen en los Ejemplos siguientes 5 a 8. La expresión de BMP-11 aumentará con los niveles crecientes de resistencia a MTX. Los polipéptidos BMP-11 se caracterizan utilizando técnicas estándar conocidas en la técnica, tales como el marcado mediante impulsos de [35 S] metionina o cisteína y la electroforesis en gel de poliacrilamida. Procedimientos similares pueden seguirse para producir otras proteínas relacionadas con BMP-11.

Ejemplo 4 Actividad biológica de la BMP-11 de expresión

Para medir la actividad biológica de las proteínas BMP-11 que se expresan, obtenidas en el Ejemplo 3 anterior, dichas proteínas se recuperan a partir del cultivo celular y se purifican aislándolas a partir de otros materiales proteináceos con los cuales son co-producidas, así también como a partir de otros contaminantes. Las proteínas purificadas pueden ensayarse según los ensayos para la actividad BMP-11 que se describen en los Ejemplos 5 a 8 que siguen a continuación.

Ejemplo 5 Bioensayos de W-20 A. Descripción de las células W-20

La utilización de las células estromáticas de la médula ósea W-20 como una progenie celular indicadora, se basa en la conversión de estas células a células de tipo osteoblasto después del tratamiento con una proteína BMP [Thies et al, Journal of Bone and Mineral Research, 1:305 (1990); y Thies et al, Endocrinology, 130:1318 (1992)]. Específicamente, las células W-20 constituyen una progenie celular clónica estromática de la médula ósea derivada de ratones adultos por investigadores del laboratorio del Dr. D. Nathan, Children's Hospital, Boston, MA. El tratamiento de las células W-20 con ciertas proteínas BMP da lugar a (1), aumento en la producción de fosfatasa alcalina, (2), inducción de cAMP estimulado por PTH y (3), inducción de la síntesis de osteocalcina por las células. Aunque (1) y (2) representan características asociadas con el fenotipo osteoblástico, la capacidad para sintetizar osteocalcina es una propiedad fenotípica que sólo es exhibida por los osteoblastos maduros. Además, hasta la fecha, se observó la conversión de las células estromáticas W-20 a células de tipo osteoblástico sólo después del tratamiento con las BMP. De esta forma, las actividades in vitro mostradas por las células W-20 tratadas con BMP, se correlacionan con la actividad óseo-formadora in vivo que se sabe poseen las BMP.

A continuación se describen dos ensayos in vitro, útiles en comparación con las actividades BMP de nuevas moléculas osteoinductoras.

B. Protocolo de ensayo de la fosfatasa alcalina en las células W-20

Las células W-20 se sembraron en placas de cultivo tisular con 96 pocillos, con una densidad de 10.000 células por pocillo, en 200 \mul de medio DME con suero al 10% de ternera fetal inactivado térmicamente, 2 mM de glutamina y 100 Unidades/ml de penicilina + 100 \mug/ml de estreptomicina. Se dejó que las células se unieran durante la noche en una atmósfera con 95% de aire, en un incubador con un 5% de CO_{2} a 37ºC.

Los 200 \mul de medio se quitaron de cada pocillo con una pipeta multicanal y se reemplazaron con un volumen idéntico de la muestra del ensayo, que se había suministrado en DME con suero al 10% de ternera fetal inactivado térmicamente, 2 mM de glutamina y penicilina - estreptomicina al 1%. Las sustancias de la prueba se ensayaron por triplicado.

Se dejó que las muestras del ensayo y las estándar se incubaran durante 24 horas con las células indicadoras W-20. Después de 24 horas, se quitaron las placas del incubador a 37ºC y los medios de ensayo se eliminaron de las células.

Las capas celulares W-20 se lavaron 3 veces con 200 \mul por pocillo de solución salina tamponada con fosfato libre de magnesio/calcio, desechándose estos lavados.

50 \mul de agua destilada se añadieron a cada pocillo, situándose entonces las placas de ensayo en un baño de etanol/hielo seco para que se congelaran rápidamente. Una vez congeladas, las placas de ensayo se quitaron del baño de etanol/hielo seco y se descongelaron a 37ºC. Esta proceso se repitió 2 veces más durante un total de 3 procedimientos congelación-descongelación. Una vez se llevaron a cabo, la fosfatasa alcalina unida a la membrana estaba dispuesta para que se realizara su evaluación.

50 \mul de una mezcla de ensayo (50 mM glicina, Triton X-100 al 0,05%, 4 mM de MgCl_{2}, 5 mM de fosfato de p-nitrofenol, pH = 10,3) se añadieron a cada pocillo de ensayo y las placas de ensayo se incubaron entonces durante 30 minutos a 37ºC en un baño acuoso con una agitación de 60 oscilaciones por minuto.

Al final de la incubación de 30 minutos, se detuvo la reacción añadiendo 100 \mul de 0,2 N NaOH a cada pocillo, y situando las placas del ensayo en hielo.

La absorbancia espectrofotométrica para cada pocillo se leyó a una longitud de onda de 405 nanómetros. Estos valores se compararon entonces a estándares conocidos para estimar la actividad fosfatasa alcalina en cada muestra. Por ejemplo, utilizando cantidades conocidas del fosfato de p-nitrofenol, se generan valores de absorbancia. Este se muestra en la Tabla 1.

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TABLA I

1

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Los valores de absorbancia para cantidades conocidas de BMP pueden determinarse y convertirse a \mumoles de fosfato de p-nitrofenol liberados por unidad de tiempo, tal como se muestra en la Tabla II.

TABLA II

2

Estos valores se utilizan entonces para comparar las actividades de cantidades conocidas de BMP-11 respecto a BMP-2.

C. Protocolo RIA de osteocalcina

Células W-20 se sembraron a razón de 10^{6} por pocillo en placas de cultivo tisular multipocillo de 24 pocillos, en 2 ml de DME que contenían suero de ternera fetal al 10% termo-inactivado y 2 mM de glutamina. Se dejó que las células se unieran durante la noche en una atmósfera de 95% de aire y 5% de CO_{2}, a 37ºC.

Al día siguiente se cambió el medio a DME que contenía suero de ternera fetal al 10%, 2 mM de glutamina y la sustancia de prueba, en un volumen total de 2 ml. Cada sustancia de prueba se administró a los pocillos por triplicado. Las sustancias de prueba se incubaron con las células W-20 durante 96 horas en total, reemplazándolas a las 48 horas por los mismos medios de ensayo.

Después de 96 horas, 50 \mul de los medios de ensayo se eliminaron de cada pocillo y se ensayaron respecto a la producción de osteocalcina utilizando un radioinmunoensayo para la osteocalcina murina. Los detalles del ensayo se describen en el equipo fabricado por Biomedical Technologies Inc., 378 Page Street, Stoughton, MA 02072. Los reactivos para el ensayo se encontraron como números de producto BT-431 (estándar de ostecalcina del ratón), BT-432 (Osteocalcina anti-ratón de cabra), BT-431R (osteocalcina yodada de ratón), BT-415 (suero normal de cabra) y BT-414 (IgG anti cabra de asno). El RIA para la osteocalcina sintetizada por las células W-20 en respuesta al tratamiento con BMP se llevó a cabo tal como se describe en el protocolo proporcionado por el fabricante.

Los valores obtenidos para las muestras de ensayo se compararon con los valores para los estándares conocidos de la osteocalcina murina y con la cantidad de osteocalcina producida por las células W-20 en respuesta a la estimulación con cantidades conocidas de BMP-2. En la Tabla III se muestran los valores de la síntesis de osteocalcina por las células W-20 inducida por BMP-2.

TABLA III

3

Ejemplo 6 Ensayo Sampath-Reddi modificado por Rosen

Una versión modificada del ensayo de formación ósea en la rata descrito en Sampath y Reddi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 6591-6595 (1983), se utilizó para evaluar la actividad inductora de las proteínas BMP-11 sobre el hueso, el cartílago y/u otros tejidos conjuntivos. Este ensayo modificado se denomina en la presente memoria el ensayo Sampath-Reddi modificado por Rosen. La etapa de precipitación etanólica del procedimiento Sampath-Reddi es reemplazada por la diálisis (si la composición ese una solución) o la filtración (si la composición es una suspensión) la fracción que va a ensayarse, contra agua. La solución o suspensión se equilibra entonces a 0,1% TFA. A la solución resultante se añaden 20 mg de matriz de rata. Una muestra simulada de matriz de rata que no es tratada con la proteína, sirve como control. Este material se congela y liofiliza y el polvo resultante, se encierra en cápsulas de gelatina del #5. Estas se implantan subcutáneamente en el área torácica abdominal de ratas Long Evans macho de 21-49 días de edad. Los implantes se quitan a los 7-14 días. La mitad de cada implante se utiliza para el análisis de la fosfatasa alcalina [véase, Reddi et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69:1601 (1972)].

La otra mitad de cada implante se fija y procesa para análisis histológico. Cortes de 1 \mum en glicolmetacrilato se tiñen con Von Kossa y fucsina ácida para calificar la cantidad formada, mediante inducción, de cartílago y hueso, que se encuentra presente en cada implante. Los términos +1 a +5 representan el área de cada corte histológico de un implante ocupada por nuevas células óseas y/o cartilaginosas y por la matriz. Una calificación de +5 indica que más del 50% del implante es nuevo hueso y/o cartílago producido como resultado directo de la proteína en el implante. Una calificación de +4, +3, +2 y +1 indicarían que más del 40%, 30%, 20% y 10% del implante, respectivamente, contiene nuevo cartílago y/o hueso.

Las proteínas BMP-11 de la presente invención pueden evaluarse mediante la actividad en este ensayo.

Ejemplo 7 Actividad biológica de la BMP-11 que se expresa

Para medir la actividad biológica de las proteínas BMP-11 que se expresan, obtenidas en el Ejemplo 3 anterior, las proteínas se recuperan a partir del cultivo celular y se purifican aislándolas de otros materiales proteináceos con los que se co-producen, así como de otros contaminantes. Las proteínas purificadas pueden ensayarse según el ensayo de formación ósea de la rata descrito en el Ejemplo 6.

La purificación se lleva a cabo utilizando técnicas estándar conocidas por los expertos en la materia.

El análisis proteico se lleva a cabo utilizando técnicas estándar tales como SDS-PAGE acrilamida [Laemmli, Nature 227:680 (1970)], tinción con plata [Oakley et al. Anal. Biochem. 105:361 (1980)] y mediante inmunotransferencia [Towbin, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350 (1979)].

Las descripciones anteriormente mencionadas detallan las formas de realización actualmente preferidas de la presente invención. Después de considerar dichas descripciones, se espera que, a los expertos en la técnica, se les ocurran numerosas modificaciones y variaciones en su práctica. Se cree que estas modificaciones y variaciones forman parte de las reivindicaciones que se adjuntan a la presente invención.

Ejemplo 8 Ensayos para determinar la actividad activina de BMP-11

La purificación se lleva a cabo utilizando técnicas estándar conocidas por los expertos en la materia. Se considera, como con otras proteínas de la superfamilia TGF-\beta, que la purificación puede incluir la utilización de Heparina sepharose.

El análisis proteico se lleva a cabo utilizando técnicas estándar tales como SDS-PAGE acrilamida [Laemmli, Nature 227:680 (1970)], tinción con plata [Oakley et al. Anal. Biochem. 105:361 (1980)] y mediante inmunotransferencia [Towbin, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350 (1979)].

Las proteínas BMP-11 pueden caracterizarse además por su capacidad para modular la liberación de la hormona estimulante folicular (FSH) en bioensayos establecidos in vitro utilizando células de la pituitaria anterior de la rata tal como se ha descrito en, por ejemplo, Vale et al, Endocrinology, 91:562-572 (1972); Ling et al., Nature, 321:779-782 (1986) o Vale et al, Nature, 321: 776-779 (1986), cuyas descripciones se incorporan en la presente memoria como referencia.

Alternativamente, la BMP-11 puede caracterizarse por su capacidad para estimular la actividad eritropoyética en la progenie celular humana K-562, tal como se describe por Lozzio et al., Blood, 45:321-334 (1975) y en la patente US nº 5.071.834, en la columna 15, cuyas exposiciones se incorporan en la presente memoria como referencia.

Además, la BMP-11 puede caracterizarse por su actividad en los ensayos de supervivencia celular, tal como se describe en Schubert, Nature, 344: 868-870 (1990), cuya exposición se incorpora como referencia.

Las descripciones anteriormente mencionadas detallan las formas de realización actualmente preferidas de la presente invención. Después de considerar dichas descripciones, se espera que, a los expertos en la técnica, se les ocurran numerosas modificaciones y variaciones en su práctica. Se cree que estas modificaciones y variaciones forman parte de las reivindicaciones que se adjuntan a la presente invención.

(1)INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE: GENETICS INSTITUTE, LLC

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Composiciones de BMP-11

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 11

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(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: GENETICS INSTITUTE, INC.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 87 CambridgePark Drive

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Cambridge

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: MA

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: USA

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 02140

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

MEDIO LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: PC compatible IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release #1,0, Versión #1,25

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE CONTACTO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: 617 876-1170

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: 617 876-5851

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 789 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Bos Taurus

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: Activina bovina WC

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 324..704

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 322..323

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "putativa 3' extremo del intrón"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: mat_peptide

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 375..701

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 126 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

SECUENCIA DESCRIPCIÓN: SEC ID nº 2:

5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 213 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo Sapiens

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CEPA: Activina humana WC

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 28..183

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 184..185

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "dos tercios del codon en el extremo del clon parcial"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 3:

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 52 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

SECUENCIA DE LA DESCRIPCIÓN: SEC ID nº: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

7

\vskip1.000000\baselineskip

2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: primer C de Bovine Activin WC

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..9

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Sitio de restricción para XbaI"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAGTCTAGAT GCTCCGGCCA GTGCGAGTAC

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: primer D de Bovine Activin WC

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..9

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Sitio de restricción para BamHI"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGCGGATCCG GAGCAGCCAC AGCGATCCAC

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 15 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: ADN insertado en pMT2 CXM

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATGGGCAGC TCGAG

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 34 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: ADN insertado en pMT21

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..6

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Sitio de restricción Pst"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 15..26

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Sitios de restricción Eco RI y XhoI"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTGCAGGCGA GCCTGAATTC CTCGAGCCAT CATG

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 68 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Porción de la secuencia líder del virus EMC

\vskip0.800000\baselineskip

(x)

INFORMACIÓN PUBLICADA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

AUTORES: Jung, S K

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

DIARIO: J. Virol.

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

VOLUMEN: 63

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

PÁGINAS: 1651-1660

\vskip0.500000\baselineskip

(G)

FECHA: 1989

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1270 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO FILAMENTO: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: BMP-11 humano

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

CLON: FB30.5

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..1086

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: péptido mat

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 70..1086

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

9

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 362 pares de base

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO MOLECULAR: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: BMP-11 humano

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 11:

11

Claims (19)

1. Procedimiento para aumentar la supervivencia de las células neuronales in vitro que comprende administrar una composición que comprende un polipéptido BMP-11 purificado a una célula, en el que el polipéptido BMP-11 comprende una secuencia aminoácida codificada por una secuencia de ADN seleccionada de entre:

(a)

las secuencias de ADN que comprenden los nucleótidos 375 o 390 a 701 de la SEC ID nº:1,

(b)

las secuencias de ADN que comprenden los nucleótidos 760 o 775 a 1.086 de la SEC ID nº:10

(c)

las secuencias de ADN que codifican la misma secuencia de aminoácido que las secuencias de ADN de (a) o (b);

(d)

las variaciones alélicas naturales de la secuencia de ADN de (a) o (b) que codifican un polipéptido que presenta actividad BMP-11; y

(e)

las secuencias de ADN que se hibridizan en condiciones severas con las secuencias de ADN de (a), (b) o (c) y que codifican un polipéptido que presenta actividad BMP-11.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el polipéptido BMP-11 comprende una secuencia aminoácida codificada por una secuencia de ADN seleccionada de entre:

(a)

los nucleótidos 375 o 390 a 701 de la SEC ID nº:1;

(b)

los nucleótidos 760 o 775 a 1086 de la SEC ID nº:10;

(c)

las secuencias de ADN que codifican la misma secuencia aminoácida que las secuencias de ADN de (a) o (b);

(d)

las variaciones alélicas naturales de la secuencia de ADN de (a) o (b) que codifican un polipéptido que presenta actividad BMP-11; y

(e)

las secuencias de ADN que se hibridizan en condiciones severas con las secuencias de ADN de (a), (b) o (c) y codifican un polipéptido que presenta actividad BMP-11.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el polipéptido BMP-11 comprende una secuencia aminoácida seleccionada de entre:

(a)

una secuencia aminoácida de entre el aminoácido 1 a 108 de la SEC ID nº:11;

(b)

una secuencia aminoácida de entre el aminoácido 7 a 108 de la SEC ID nº:11;

(c)

una secuencia aminoácida de entre el aminoácido 1 a 109 de la SEC ID nº:11; y

(d)

una secuencia aminoácida de entre el aminoácido 6 a 109 de la SEC ID nº:11.

4. Utilización de un polipéptido BMP-11 en la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de una afección, en la que dicha afección está caracterizada por una disminución en la supervivencia neuronal, y en la que el polipéptido BMP-11 comprende una secuencia aminoácida codificada por una secuencia de ADN seleccionada de entre:

(a)

las secuencias de ADN que comprenden los nucleótidos 375 o 390 a 701 de la SEC ID nº:1;

(b)

las secuencias de ADN que comprenden los nucleótidos 760 o 775 a 1086 de la SEC ID nº:10;

(c)

las secuencias de ADN que codifican la misma secuencia aminoácida que las secuencias de ADN de (a) o (b);

(d)

las variaciones alélicas naturales de la secuencia de ADN de (a) o (b) que codifican un polipéptido que presenta actividad BMP-11; y

(e)

las secuencias de ADN que se hibridizan en condiciones severas con las secuencias de ADN de (a), (b) o (c) y codifican un polipéptido que presenta actividad BMP-11.

5. Utilización de un polipéptido BMP-11 en la preparación de un medicamento destinado a aumentar la supervivencia neuronal en un tratamiento de trasplante, en la que el polipéptido BMP-11 comprende una secuencia aminoácida codificada por una secuencia de ADN seleccionada de entre:

(a)

las secuencias de ADN que comprenden los nucleótidos 375 o 390 a 701 de la SEC ID nº:1;

(b)

las secuencias de ADN que comprenden los nucleótidos 760 o 775 a 1086 de la SEC ID Nº:10;

(c)

las secuencias de ADN que codifican la misma secuencia aminoácida que las secuencias de ADN de (a) o (b);

(d)

las variaciones alélicas naturales de la secuencia de ADN de (a) o (b) que codifican un polipéptido que presenta actividad BMP-11; y

(e)

las secuencias de ADN que se hibridizan en condiciones severas con las secuencias de ADN de (a), (b) o (c) y que codifican un polipéptido que presenta actividad BMP-11.

6. Utilización según la reivindicación 4 o 5, en la que el polipéptido BMP-11 comprende una secuencia aminoácida codificada por un ADN seleccionado de entre:

(a)

los nucleótidos 375 o 390 a 701 de la SEC ID nº:1;

(b)

los nucleótidos 760 o 775 a 1086 de la SEC ID nº:10; y

(c)

las secuencias de ADN que codifican la misma secuencia aminoácida que las secuencias de ADN de (a) o (b).

7. Utilización según la reivindicación 4 o 5, en la que el polipéptido BMP-11 es un dímero.

8. Polipéptido BMP-11 que comprende una secuencia aminoácida seleccionada de entre:

(a)

una secuencia aminoácida de entre el aminoácido 1 a 108 de la SEC ID nº:11; y

(b)

una secuencia aminoácida de entre el aminoácido 7 a 108 de la SEC ID nº:11.

9. Polipéptido BMP-11, que comprende un homodímero de dos subunidades polipéptidas, comprendiendo cada subunidad los aminoácidos 7 a 108 de la SEC ID nº:11.

10. Polipéptido BMP-11 que comprende una secuencia aminoácida codificada por una secuencia de ADN seleccionada de entre:

(a)

los nucleótidos 375 o 390 a 701 de la SEC ID nº:1;

(b)

los nucleótidos 760 o 775 a 1086 de la SEC ID nº:10; y

(c)

las secuencias alélicas naturales y las secuencias de codones degenerativas equivalentes de (a) y (b)

para su utilización como medicamento

11. Polipéptido BMP-11 que comprende una secuencia aminoácida seleccionada de entre:

(a)

una secuencia aminoácida de -17 a -1 de la SEC ID nº:2;

(b)

una secuencia aminoácida de -253 a -1 de la SEC ID nº:11;

(c)

una secuencia aminoácida codificada por la secuencia de nucleótidos 1 a 759 de la SEC ID nº:10;

(d)

una secuencia aminoácida codificada por las secuencias alélicas naturales y las secuencias de codones degenerativas equivalentes de las secuencia de nucleótidos de (c); y

(e)

una secuencia aminoácida codificada por una secuencia de ADN que se hibridiza en condiciones severas con la secuencia de nucleótidos de (c) y codifica un polipéptido que presenta actividad BMP-11.

12. Polipéptido BMP-11 constituido por una secuencia aminoácida seleccionada de entre:

(a)

una secuencia aminoácida de -17 a -1 de la SEC ID nº:2;

(b)

una secuencia aminoácida de -253 a -1 de la SEC ID nº:11;

(c)

una secuencia aminoácida codificada por la secuencia de nucleótidos 1 a 759 de la SEC ID nº:10;

\newpage

(d)

una secuencia aminoácida codificada por las secuencias alélicas naturales y las secuencias de codones degenerativas equivalentes de las secuencia de nucleótidos de (c); y

(e)

una secuencia aminoácida codificada por una secuencia de ADN que se hibridiza en condiciones severas con la secuencia de nucleótidos de (c) y codifica un polipéptido que presenta actividad BMP-11.

13. Polipéptido BMP-11 según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, para su utilización como medicamento.

14. Composición farmacéutica que comprende el polipéptido BMP-11 según la reivindicación 13.

15. Composición farmacéutica que comprende una proteína BMP-11 codificada por una secuencia de ADN seleccionada de entre el grupo constituido por:

(a)

las secuencias de ADN que comprenden los nucleótidos 375 o 390 a 701 de la SEC ID nº:1;

(b)

las secuencias de ADN que comprenden los nucleótidos 760 o 775 a 1086 de la SEC ID nº:10;

(c)

las secuencias de ADN que codifican los aminoácidos 1 o 6 a 109 de la SEC ID nº:2;

(d)

las secuencias de ADN que codifican los aminoácidos 1 o 6 a 109 de la SEC ID nº:11;

(e)

las secuencias de ADN que comprenden las secuencias naturales y las secuencias de codones degenerativas equivalentes de cualquiera de (a) a (d); y

(f)

las secuencias de ADN que se hibridizan en condiciones severas con las secuencias de ADN de cualquiera de (a) a (e) y que codifican un polipéptido que presenta actividad BMP-11, en las que la actividad BMP-11 se selecciona de entre la regulación de la producción de la hormona estimulante folicular, la promoción de la supervivencia de las células neuronales, la estimulación de la hematopoyesis y la supresión del desarrollo de los tumores gonadales.

16. Composición farmacéutica según la reivindicación 15, en la que dicha secuencia de ADN comprende además una segunda secuencia de ADN que codifica un propéptido adecuado en el extremo 5' y que se une en el marco de lectura a dicha secuencia de ADN.

17. Composición farmacéutica según la reivindicación 16, en la que propéptido proviene de un miembro de la superfamilia TGF-\beta de proteínas.

18. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, que comprende además por lo menos una proteína morfogenética ósea.

19. Utilización de la composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, para la preparación de una composición farmacéutica destinada a regular la producción de la hormona estimulante folicular, para la anticoncepción, o para el tratamiento de anomalías óseas y/o del cartílago, enfermedad periodontal o heridas.