ES2272061T5 - Secuencia genómica de la proteína activadora de 5-lipoxigenasa (flap), marcadores polimórficos de la misma y métodos para la detección de asma. - Google Patents

Abstract

Un método de genotipado que comprende determinar la identidad de un nucleótido en un marcador bialélico relacionado con FLAP de SEQ ID No 1, el com- plemento del mismo o marcadores bialélicos en desequilibrio de unión con el mismo, en una muestra biológica, en el que dicho marcador bialélico relacionado con FLAP se elige entre el grupo consistente en los marcadores bialélicos en las posiciones 3950, 4243, 4312, 4490, 4670, 4687, 4968, 5140, 5213, 5364, 5594, 6370, 6693, 6763, 7445, 7870, 16288, 16347, 16383, 16440, 24361, 28336, 28368, 36183, 36509, 38681, 42440 y 42445 de la SEQ ID No 1.

Description

Secuencia genómica de la proteína activadora de 5-lipoxigenasa (FLAP), marcadores polimórficos de la misma y métodos para la detección de asma.

Campo de la invención

La invención se refiere a marcadores bialélicos de un gen FLAP y a la asociación establecida entre estos marcadores y enfermedades que implican a la vía de los leucotrienos, tales como el asma. La invención proporciona medios para determinar la predisposición de individuos a enfermedades que implican a la vía de los leucotrienos, tal como el asma.

Fundamento de la invención

La progresión de las enfermedades inflamatorias en las que la síntesis de leucotrienos desempeña un papel activo, tales como el asma y la artritis, constituye un importante problema sanitario en las sociedades occidentales.

Por ejemplo, la prevalencia del asma en los países occidentales ha ido creciendo constantemente durante el último siglo, afectando a aproximadamente el 10% de la población. En 1994 afectó a más de 14 millones de personas solamente en los EE.UU. (incluyendo 4,8 millones, es decir un 6,9%, de menores de 18 años), mientras que solamente 8 millones de personas padecían la misma enfermedad en 1982. Se cobra más de 5000 vidas al año (incluyendo 342 fallecimientos entre las personas de menos de 25 años en 1993). El asma afecta a un niño de cada siete en Gran Bretaña y, en los EE.UU., es causa de la tercera parte de las consultas en las urgencias pediátricas. Es la enfermedad crónica más frecuente en la infancia.

El asma bronquial es más bien un síndrome multifactorial que una enfermedad simple, definido como la obstrucción de las vías respiratorias, y está caracterizado por cambios inflamatorios en las vías respiratorias y por la hiperreactividad bronquial. Los estímulos que producen los ataques de asma reales incluyen alérgenos (en individuos sensibilizados), el ejercicio (en el que un estímulo puede ser el aire frío), las infecciones respiratorias y los contaminantes atmosféricos tales como el dióxido de azufre. El sujeto asmático tiene ataques intermitentes de disnea (dificultad en la exhalación), respiración sibilante y tos, que pueden llegar a ser fatales.

La manifestación de asma implica probablemente factores tanto genéticos como medioambientales, y en la mayor parte de los sujetos el ataque asmático consiste en dos fases que ilustran la fisiopatología de la enfermedad:

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una fase inmediata, consistente principalmente en broncoespasmos debidos a espasmos del músculo liso bronquial; las células implicadas son mastocitos que liberan histamina, pero también eosinófilos, macrófagos y plaquetas que liberan leucotrienos, prostaglandinas, y factor activador de las plaquetas; estos espasmógenos añadidos a quimiotaxinas y quimiocinas atraen a leucocitos a la zona, estableciendo la etapa para una fase retardada;

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una fase posterior que consiste en un tipo especial de inflamación que comprende vasodilatación, edema, secreción de moco y broncoespasmo; está producida por mediadores inflamatorios liberados de células T activadas liberadoras de citocina y eosinófilos y, posiblemente, neuropéptidos liberados por reflejos axónicos; estos mediadores producen lesiones y pérdida de epitelio bronquial.

El factor de predisposición identificable más intenso para el desarrollo del asma es la atopía, la predisposición para el desarrollo de una respuesta mediada por IgE frente a aeroalérgenos comunes. Cuando la IgE se une a los receptores de IgE de las células, el sistema se ceba de forma que la subsiguiente re-exposición al alérgeno relevante producirá un ataque asmático. La mayoría de los casos de asma (95%) están asociados con la atopía.

Además de su papel en el asma antes mencionado, los leucotrienos están implicados más generalmente en reacciones de defensa de un hospedador y desempeñan un importante papel en la hipersensibilidad inmediata así como en enfermedades inflamatorias distintas del asma, tales como la enfermedad intestinal inflamatoria, la soriasis y la artritis.

La vía de los leucotrienos

Los leucotrienos son productos de las vías de la lipoxigenasa. Las lipoxigenasas son enzimas solubles situadas en el citosol y se encuentran en el pulmón, plaquetas, mastocitos y glóbulos blancos. La enzima principal de este grupo es la 5-lipoxigenasa, que es la primera enzima en la biosíntesis de los leucotrienos.

La primera etapa en la biosíntesis de los leucotrienos es la liberación de ácido araquidónico desde los fosfolípidos de la membrana al tener lugar la estimulación de la célula (por ejemplo, por complejos inmunológicos y ionóforos de calcio). Después el ácido araquidónico se convierte en leucotrienos A4 por una 5-lipoxigenasa (5-LO) que se trasloca a la membrana celular, en la que se asocia a una proteína denominada "proteína de activación de la cincolipoxigenasa" (FLAP: Five-Lipoxygenase Activating Protein), que es necesaria para la síntesis de leucotrieno en células intactas. La 5-LO tiene actividad de hidrolasa de leucotrieno A4.

El leucotrieno A4 (LTA4), un producto intermedio de epóxido inestable, se hidroliza después dando leucotrieno B4 (actividad de hidrolasa de LTA4) o se conjuga con glutatión para dar leucotrieno C4 (actividad de LTC4-sintetasa) y sus metabolitos, leucotrieno D4 y leucotrieno E4. El LTB4 es producido principalmente por neutrófilos, mientras que los cisteinil-leucotrienos (LTC4, LTD4 y LTE4) son producidos principalmente por eosinófilos, mastocitos, basófilos y macrófagos.

El LTB4 es un potente agente quimiotáctico tanto para neutrófilos como para macrófagos. En los neutrófilos, produce también regulación por aumento de las moléculas de adhesión a la membrana, y hace aumentar la producción de productos de oxígeno tóxicos y la liberación de enzimas granulares. En los macrófagos y linfocitos, estimula la proliferación y la liberación de citocina. Así pues, el LTB4 es un importante mediador en todos los tipos de inflamaciones.

Los cisteinil-leucotrienos actúan en los sistemas respiratorio y cardiovascular. En el sistema respiratorio, son potentes espasmógenos que provocan una contracción del músculo bronquiolar y un aumento de la secreción de moco. En el sistema cardiovascular, producen vasodilatación de la mayor parte de los vasos, pero también actúan como vasoconstrictores coronarios. Los cisteinil-leucotrienos son de particular importancia en el asma.

FLAP (proteína de activación de la 5-lipoxigenasa)

La FLAP es un polipéptido unido a la membrana de 18 kD que une específicamente ácido araquidónico y que activa la 5-LO, actuando como una proteína de transferencia de ácido araquidónico. El gen FLAP abarca más de 31 kb y consiste en cinco exones pequeños y cuatro exones grandes (véase GenBank 182657, Kennedy et al. 1991, incorporado al presente texto como referencia, Genbank M60470 para el exón 1, Genbank M63259 para el exón 2, Genbank M63260 para el exón 3, Genbank M63261 para el exón 4, Genbank M6322 para el exón 5).

La envoltura nuclear es el sitio intracelular en el que la 5-LO y la FLAP actúan metabolizando el ácido araquidónico, y la activación por ionóforos de neutrófilos y monocitos tiene por resultado la translocación de la 5-LO desde una posición no sedimentable a la envoltura nuclear. Los inhibidores de la función de la FLAP evitan la translocación de la 5-LO desde el citosol a la membrana, e inhiben la activación de la 5-LO. Por tanto son interesantes candidatos a fármacos anti-inflamatorios. En realidad, los antagonistas de la FLAP pueden atenuar las respuestas broncoconstrictoras inducidas por alérgeno que soportan un importante papel para los cisteinil-leucotrienos en la mediación de estas respuestas asmáticas.

Farmacogenómica

Para establecer los orígenes de variaciones individuales de la susceptibilidad o de la respuesta a un fármaco, la farmacogenómica utiliza la tecnología genómica para identificar polimorfismos dentro de genes que son parte de vías biológicas implicadas en la susceptibilidad, la etiología y el desarrollo de una enfermedad, o más específicamente en vías de respuesta al fármaco responsables de la eficacia de un fármaco, su tolerancia o su toxicidad, incluyendo, pero sin limitarse a ellas, las cascadas metabólicas del fármaco.

En este aspecto, los fenómenos inflamatorios que están implicados en numerosas enfermedades presentan una gran relevancia para la farmacogenómica, porque están en el núcleo de muchas graves enfermedades muy extendidas, y también porque la señalización de vías de inflamación para diseñar nuevos fármacos eficaces incluye numerosos riesgos de potenciación de graves efectos secundarios. La vía de los leucotrienos es particularmente interesante ya que sus productos son poderosas moléculas inflamatorias.

La gran mayoría de enfermedades comunes, tales como el cáncer, la hipertensión y la diabetes, son poligénicas (que implican a varios genes). Además, estas enfermedades están moduladas por factores medioambientales tales como los contaminantes, los productos químicos y la dieta. Es por ello por lo que muchas enfermedades se denominan multifactoriales; resultan de una combinación sinérgica de factores, tanto genéticos como medioambientales.

Por ejemplo, además del impacto que se ha evidenciado de factores medioambientales en el desarrollo del asma, el análisis de los patrones de arracimamiento y segregación en familias asmáticas han sugerido un componente genético para el asma. Sin embargo, la falta de un fenotipo del asma definido y específico está probando ser uno de los más importantes obstáculos para detectar con fiabilidad genes asociados con el asma.

El asma suele diagnosticarse mediante examen clínico y pruebas biológicas. La hiper-reactividad bronquial no específica que acompaña al asma se mide por la variación del flujo de aire desencadenada en un paciente por la administración de un broncoconstrictor tal como histamina o metacolina. La atopía se detecta mediante pruebas de punción en la piel que miden títulos de IgE en suero. También se usan normalmente cuestionarios de síntomas estándar, para detectar síntomas característicos del asma, pero no únicos (como son la respiración sibilante nocturna y la disnea).

Sin embargo, no hay ninguna prueba sanguínea sencilla, fisiológica o biológica, para el estado asmático. A pesar de los avances en el conocimiento de la fisiopatología del asma y su desarrollo, la evidencia sugiere que la prevalencia del estado asmático y la gravedad de los ataques de asma están subestimadas. Como resultado de ello, es frecuente que el tratamiento adecuado del asma se vea retardado, permitiendo así que se establezca mejor el proceso inflamatorio. Así pues, existe la necesidad de una prueba diagnóstica del asma que sea eficaz y fiable.

La eficacia de un fármaco y su toxicidad pueden también considerarse como rasgos multifactoriales que implican componentes genéticos de la misma forma que en enfermedades complejas. En relación con esto, hay tres categorías principales de genes que teóricamente puede esperarse que estén asociados con la respuesta al fármaco, que son genes ligados a la enfermedad señalada, genes relacionados con el modo de acción del fármaco y genes implicados en el metabolismo del fármaco.

El objetivo principal de la farmacogenómica en el estudio del asma es buscar genes que estén relacionados con la respuesta al fármaco. Primero puede proporcionar herramientas para refinar el diseño del desarrollo del fármaco haciendo disminuir la incidencia de casos adversos en estudios de tolerancia del fármaco, definiendo mejor subpoblaciones de pacientes que responden o que no responden al tratamiento en estudios de eficacia y, combinando los resultados obtenidos de los mismos, seguir permitiendo un uso del fármaco mejor individualizado, basado en el pronóstico de eficacia/tolerancia.

La farmacogenómica puede proporcionar también herramientas para identificar nuevos diseños de fármacos diana y para optimizar el uso de fármacos ya existentes, con el fin de aumentar su velocidad de respuesta y/o excluir a los pacientes que no responden a tratamientos particulares, o reducir efectos secundarios no deseables y/o excluir del correspondiente tratamiento a pacientes con un riesgo significativo de efectos secundarios no deseables.

Para esta segunda aplicación de la farmacogenómica, la vía de los leucotrienos es también útil porque muchos agentes anti-asmáticos y anti-inflamatorios que actúan a través de la vía de los leucotrienos están bajo desarrollo, muchos de los cuales muestran alguna incidencia de graves efectos secundarios.

Por ejemplo, hay dos categorías principales de fármacos anti-asma: los agentes broncodilatadores y los antiinflamatorios. Los broncodilatadores son eficaces para invertir el broncoespasmo de la fase inmediata de la enfermedad. Los fármacos usados como broncodilatadores incluyen los agonistas del 12-adrenoceptor (que dilatan los bronquios por una acción directa sobre el músculo liso, p. ej. salbutamol), las xantinas (p. ej. teofilina) y los antagonistas del receptor muscarínico (p. ej. bromuro de ipratropio). Estos representan el tratamiento sintomático del ataque a corto plazo.

Los agentes anti-inflamatorios son efectivos para inhibir o prevenir la producción de componentes inflamatorios en las dos fases del asma. Incluyen glucocorticoides, cromoglicato sódico y antagonistas del receptor H1 de la histamina. Estos agentes representan el actual tratamiento a largo plazo del estado asmático.

Sin embargo, ninguno de estos fármacos anti-asmáticos usados actualmente es completamente satisfactorio ya que ninguno de ellos "cura" realmente a todos los pacientes que tienen la enfermedad. Los glucocorticoides son los compuestos activos más interesantes en este aspecto, pero tienen efectos secundarios no deseados y potencialmente graves (candidiasis orofarínfea, disfonía y osteoporosis para los glucocorticoides inhalados, y trastornos del ánimo, aumento del apetito y pérdida del control de la glucosa en la diabetes para los glucocorticoides sistémicos).

En los últimos años se han desarrollado inhibidores de la biosíntesis de leucotrienos más efectivos y selectivos (p. ej. los inhibidores de la unión de la 5-LO y la FLAP) y se han utilizado como nuevas terapias para el asma bronquial y otros trastornos inflamatorios. Por ejemplo, se ha demostrado que el Zileuton (Zyflo®), un inhibidor de la 5-LO comercializado por Abbott Laboratories (Abbott Park, Illinois), mejora la función de las vías respiratorias y reduce los síntomas relacionados con el asma.

Desgraciadamente, en estudios clínicos para el Zileuton se han referido efectos secundarios indeseables, tales como una exacerbación aguda del asma, dispepsia y aumento de las enzimas hepáticas. Hay también problemas relacionados con interacciones entre fármacos con medicamentos que se aclaran hepáticamente.

Así pues, además de la necesidad de desarrollar un ensayo diagnóstico del asma eficiente y fiable, también existe la necesidad de desarrollar estrategias terapéuticas más efectivas y mejor dirigidas actuando sobre la vía de los leucotrienos con menores efectos secundarios y una toxicidad baja para el usuario. Una forma de conseguir esto en un plazo relativamente corto sería a través del empleo de resultados farmacogenómicos, para definir mejor el uso de fármacos existentes o candidatos a fármaco, con el fin de mejorar la relación beneficio/riesgo en subpoblaciones de pacientes diana.

Sumario de la invención

La presente invención procede del aislamiento y la caracterización de la secuencia de ácidos nucleicos que comprenden un nucleótido en un marcador bialélico relacionado con FLAP que está asociado con el asma. Otro objeto de la presente invención consiste en vectores recombinantes que comprenden cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención, así como células hospedadoras que comprenden dichas secuencias de ácidos nucleicos o vectores recombinantes. La presente invención comprende también la variante 127-Ile de la proteína FLAP y una composición de anticuerpo capaz de unirse selectivamente a dicha variante.

La invención se dirige también al uso de las secuencias genómicas de FLAP para determinar la identidad de los nucleótidos en estos marcadores bialélicos relacionados con FLAP que están asociados con el asma, y a un método para identificar una asociación estadísticamente significativa entre alelos específicos del gen FLAP y el asma.

Más en particular, la presente invención procede de la identificación de asociaciones genéticas entre alelos de marcadores bialélicos del gen FLAP y el asma, como se confirma y se caracteriza en un panel de sujetos humanos.

Se proporcionan métodos y productos para la detección molecular de una susceptibilidad genética en seres humanos al asma.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un diagrama del gen FLAP con una indicación de la posición relativa de los marcadores bialélicos de la presente invención.

La Figura 2 muestra los resultados de un estudio de asociación entre los marcadores bialélicos de FLAP y el asma, con 290 individuos asmáticos y 280 testigos caucásicos de los EE.UU. La Figura 2 es un gráfico que demuestra la asociación entre algunos de los marcadores bialélicos de la presente invención y el asma, mostrándose en el eje Y el valor absoluto del logaritmo (en base 10) del valor de p de los valores la ji al cuadrado para cada marcador y una estimación aproximada de la posición de cada marcador con respecto a los elementos del gen FLAP en el eje X.

La Figura 3 es una tabla que demuestra los resultados de un análisis de asociación de haplotipos entre el asma y haplotipos que consisten en marcadores bialélicos de la presente invención (297 casos frente a 286 testigos caucásicos de los EE.UU.).

La Figura 4 es una tabla que demuestra los resultados de un análisis de frecuencia de haplotipos que incluye pruebas de permutación con más de 1000 iteraciones.

Breve descripcion de las secuencias que se proporcionan en la lista de secuencias

La SEQ ID No 1 contiene una secuencia genómica de FLAP que comprende la región reguladora 5' (región no transcrita secuencia arriba), los exones e intrones, y la región reguladora 3' (región no transcrita secuencia abajo). La SEQ ID No 2 contiene un cDNA de FLAP humano completo con UTRs 5' y 3'. La SEQ ID No 3 contiene la proteína FLAP codificada por el cDNA de la SEQ ID No 2. Las SEQ ID Nos 4 y 5 contienen el alelo 1 o el 2 del marcador bialélico A14, y su secuencia circundante. Las SEQ ID Nos 6 y 7 contienen la secuencia de los cebadores de amplificación para el marcador bialélico A14. La SEQ ID No 8 contiene la secuencia de un cebador de microsecuenciación del marcador bialélico A14. Las SEQ ID Nos 9 y 10 contienen el alelo 1 o el alelo 2 del marcador bialélico A19 y su secuencia circundante. Las SEQ ID Nos 11 y 12 contienen la secuencia de los cebadores de amplificación para el marcador bialélico A19.

La SEQ ID No 13 contiene la secuencia de un cebador de microsecuenciación del marcador bialélico A19. La SEQ ID No 14 contiene un cebador que contiene la secuencia PU 5' adicional descrita con más detalle en el Ejemplo 2.

La SEQ ID No 15 contiene un cebador que contiene la secuencia RP 5' adicional descrita con más detalle en el Ejemplo 2.

Descripcion detallada de la invención

La 5-LO está asociada con la la FLAP para la síntesis de leucotrienos. En realidad, parece que la regulación de la producción de leucotrienos puede conseguirse mediante la acción de inhibidores de 5-LO directos o inhibidores de la biosíntesis de leucotrieno indirectos que se unen a FLAP.

La presente invención se refiere a la identificación y la caracterización de marcadores bialélicos en un gen que codifica la FLAP que están asociados con el asma, así como a la identificación de polimorfismos significativos asociados con el asma.

Los polimorfismos identificados se usan en el diseño de ensayos para la detección fiable de la susceptibilidad genética al asma. También pueden usarse en el diseño de protocolos de selección o cribado de fármacos para proporcionar una evaluación precisa y eficiente del potencial terapéutico y de efectos secundarios de medicamentes nuevos o ya existentes.

I. Definiciones

Antes de describir la presente invención con más detalle, se exponen las definiciones que siguen con el fin de ilustrar y definir el significado y el alcance de los términos y expresiones que se usan para describir la invención en el presente texto.

La expresión "gen FLAP", cuando se usa en el presente texto, abarca secuencias genómicas, de mRNA y de cDNA que codifican la proteína FLAP. En el caso de una secuencia genómica, el gen FLAP incluye también regiones reguladoras nativas que controlan la expresión de la secuencia de codificación del gen FLAP.

Como se usa indistintamente en el presente texto, los términos "oligonucleótidos" y "polinucleótidos" incluyen RNA, DNA o secuencias híbridas RNA/DNA de más de un nucleótido, bien sea en forma de cadena simple o bien en forma dúplex. El término "nucleótido", como se usa en el presente texto, es un adjetivo para describir moléculas que comprenden RNA, DNA o secuencias híbridas RNA/DNA de cualquier longitud en forma de cadena simple o dúplex. El término "nucleótido" se usa también en el presente texto como nombre para referirse a nucleótidos individuales o variedades de nucleótidos, significando una molécula o unidad individual en una gran molécula de ácido nucleico, que comprende una purina o pirimidina, un resto de azúcar ribosa o desoxirribosa, y un grupo fosfato, o unión fosfodiéster en el caso de nucleótidos dentro de un oligonucleótido o polinucleótido. Aunque el término "nucleótido" se usa también en el presente texto para abarcar "nucleótidos modificados" que comprenden al menos una modificación (a) un grupo de unión alternativo, (b) una forma análoga de purina, (c) una forma análoga de pirimidina, o (d) un azúcar análogo, para ejemplos de grupos de unión análogos, purina, pirimidinas y azúcares véase, por ejemplo, la publicación PCT No. WO 95/04064. Sin embargo, los polinucleótidos de la presente invención están formados preferentemente por más de 50% de nucleótidos de desoxirribosa convencionales, y lo más preferentemente más del 90% de nucleótidos de desoxirribosa convencionales. Las secuencias de polinucleótido de la presente invención pueden prepararse por cualquier método conocido, incluyendo el sintético, recombinante, generación ex vivo, o una combinación de los mismos, así como utilizando cualquier método de purificación conocido en la técnica.

El término "purificado" se usa en el presente texto para describir un polinucleótido o un vector de polinucleótido de la invención de la presente invención que ha sido separado de otros compuestos incluyendo, pero sin limitarse a ellos, otros ácidos nucleicos, carbohidratos, lípidos y proteínas (tales como las enzimas usadas en la síntesis del polinucleótido), o la separación de polinucleótidos cerrados covalentemente a partir de polinucleótidos lineales. Un polinucleótido es sustancialmente puro cuando al menos aproximadamente el 50%, preferentemente del 60 al 75% de una muestra, presenta una secuencia de polinucleótidos y una conformación simples (lineal frente a cierre covalente). Un polinucleótido sustancialmente puro comprende típicamente aproximadamente el 50%, preferentemente del 60 al 90% en peso/peso de una muestra de ácido nucleico, más habitualmente aproximadamente el 95%, y preferentemente es más de aproximadamente el 99% puro. La pureza o la homogeneidad del polinucleótido puede estar indicada por varios medios conocidos en la técnica, tales como la electroforesis de una muestra en gel de agarosa o de poliacrilamida, seguida por la visualización de una banda de polinucleótido individual al teñir el gel. Para determinados fines puede proporcionarse una resolución más elevada usando HPLC u otros medios bien conocidos en la técnica.

Como se usa en el presente texto, el término "aislado" requiere que el material sea retirado de su entorno original (p. ej. el ambiente natural si es de origen natural). Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido de origen natural presente en un animal vivo no está aislado, pero el mismo polinucleótido o DNA o polipéptido, separado de algunos o de todos los materiales coexistentes en el sistema natural, sí que es aislado. Tal polinucleótido podría ser parte de un vector y/o tal polinucleótido o polipéptido podría ser parte de una composición, y ser aún aislado por cuanto el vector

o la composición no son parte de su entorno natural.

El término "polipéptido" se refiere a un polímero de aminoácidos al margen de la longitud del polímero; así, péptidos, polipéptidos y proteínas se incluyen dentro de la definición de polipéptido. Este término tampoco especifica ni excluye modificaciones post-expresión de polipéptidos, por ejemplo los polipéptidos que incluyen la unión covalente de grupos glicosilo, grupos acetilo, grupos fosfato, grupos lipídicos y similares están expresamente comprendidos por el término polipéptido. También están incluidos en la definición los polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no de origen natural, aminoácidos que solo se presentan naturalmente en un sistema biológico no relacionado, aminoácidos modificados a partir de sistemas de mamíferos, etc.), polipéptidos con uniones sustituidas, así como otras modificaciones conocidas en la técnica, tanto las que son de origen natural como las que no son de origen natural.

El término "purificado" se usa en el presente texto para describir un polipéptido de la presente invención que ha sido separado de otros compuestos, incluyendo, pero sin limitarse a ellos, ácidos nucleicos, lípidos, carbohidratos, y otras proteínas. Un polipéptido es sustancialmente puro cuando al menos aproximadamente el 50%, preferentemente del 60 al 75% de una muestra presenta una secuencia polipeptídica simple. Un polipéptido sustancialmente puro comprende típicamente aproximadamente 50%, preferentemente del 60 al 90% en peso/peso de una muestra de proteína, y preferentemente es más del 99% puro. La pureza u homogeneidad del polipéptido está indicada por varios métodos bien conocidos en la técnica, tales como la electroforesis en gel de agarosa o de poliacrilamida de una muestra, seguida por la visualización de una banda simple de polipéptido al teñir el gel. Para ciertos fines, puede propocionarse una resolución más alta usando HPLC u otros medios bien conocidos en la técnica.

La expresión "polipéptido recombinante" se usa en el presente texto para hacer referencia a polipéptidos que han sido diseñados artificialmente y que comprenden al menos dos secuencias de polipéptido que no se encuentran como secuencias de polipéptido contiguas en su entorno natural inicial, o para hacer referencia a polipéptidos que han sido expresados a partir de un polinucleótido recombinante.

Como se usa en el presente texto, el término "anticuerpo" se refiere a un polipéptido o un grupo de polipéptidos que están formados por al menos un dominio de unión, en el que un dominio de unión del anticuerpo está formado por el plegamiento de dominios variables de una molécula de anticuerpo para formar espacios de unión tridimensionales con una forma de la superficie interna y una distribución de carga complementaria con las características del determinante antigénico de un antígeno, lo que permite una reacción inmunológica con el antígeno. Los anticuerpos incluyen proteínas recombinantes que comprenden los dominios de unión así como fragmentos, incluyendo los fragmentos Fab, Fab’, F(ab)2 y F(ab’)2.

Como se usa en el presente texto, un "determinante antigénico" es la porción de una molécula de antígeno, en este caso un polipéptido FLAP, que determina la especificidad de la reacción antígeno-anticuerpo. Un "epítopo" se refiere a un determinante antigénico de un polipéptido. Un epítopo puede comprender un número tan reducido como tres aminoácidos, en una conformación espacial que es única para el epítopo. Generalmente un epítopo consiste en al menos 6 de tales aminoácidos, y más habitualmente al menos de 8 a 10 de tales aminoácidos. Los métodos para determinar los aminoácidos que constituyen un epítopo incluyen cristalografía de rayos X, resonancia magnética nuclear bidimensional y cartografiado de epítopo, p. ej. el método Pepscan descrito por H. Mario Geysen et al. 1984; publicación PCT No. WO 84/03564; y publicación PCT No. WO 84/03506.

A lo largo de la presente memoria descriptiva, la expresión "secuencia de nucleótidos" puede emplearse para designar indistintamente un polinucleótido o un ácido nucleico. Más exactamente, la expresión "secuencia de nucleótidos" abarca el propio material nucleico y por tanto no está restringido a la información de la secuencia (es decir, la sucesión de letras escogidas entre las cuatro letras de las bases) que caracteriza bioquímicamente una molécula específica de DNA o RNA.

La expresión "secuencia arriba" se usa en el presente texto para hacer referencia a una localización que está hacia el extremo 5' del polinucleótido desde un punto de referencia concreto.

Las expresiones "emparejados por las bases" y "emparejados por las bases de Watson y Crick" se usan indistintamente en el presente texto para hacer referencia a nucleótidos que pueden estar unidos entre sí por enlaces de hidrógeno en virtud de la identidad de sus secuencias, de una manera similar a la que se encuentra en el DNA de doble hélice con restos de timina o uracilo unidos a restos de adenina por dos enlaces de hidrógeno y restos de citosina y guanina unidos por tres enlaces de hidrógeno (véase Stryer, L., 1995).

Las expresiones "complementario" o "complemento del mismo" se usan en el presente texto para hacer referencia a las secuencias de polinucleótidos que son capaces de formar emparejamiento de bases de Watson y Crick con otro polinucleótido concreto por la totalidad de la región complementaria. Este término se aplica a pares de polinucleótidos basados solamente en sus secuencias y no en cualquier conjunto particular de condiciones bajo las cuales los dos polinucleótidos se unirían realmente.

El término "alelo", como se usa en el presente texto, se refiere a variantes de una secuencia de nucleótidos. Los organismos diploides pueden ser homocigóticos o heterocigóticos para una forma alélica.

Un "promotor" se refiere a una secuencia de DNA reconocida por la maquinaria de síntesis de la célula requerida para iniciar la transcripción específica de un gen.

Una secuencia que está "operativamente unida" a una secuencia reguladora tal como un promotor, significa que dicho elemento regulador está en la situación y orientación correctas en relación con el ácido nucleico para controlar la iniciación de la RNA polimerasa y la expresión del ácido nucleico de interés. Como se usa en el presente texto, la expresión "operativamente unido" se refiere a una unión de elementos de polinucleótido en una relación funcional. Por ejemplo, un promotor o potenciador está operativamente unido a una secuencia de codificación si afecta a la transcripción de la secuencia codificadora. Más concretamente, se dice que dos moléculas de DNA (tales como un polinucleótido que contiene una región promotora y un polinucleótido que codifica un polipéptido o polinucleótido deseado) están "operativamente unidas" si la naturaleza de la unión entre los dos polinucleótidos (1) no tiene por resultado la introducción de una mutación por desplazamiento del marco o (2) no interfiere con la capacidad del polinucleótido que contiene el promotor para dirigir la transcripción del polinucleótido codificador.

El término "cebador" designa una secuencia específica de oligonucleótido que es complementaria a una secuencia de nucleótidos diana y se usa para hibridarse con la secuencia de nucleótidos diana. Un cebador sirve de punto de iniciación para la polimerización de nucleótidos catalizada por DNA polimerasa, por RNA polimerasa o por transcriptasa inversa.

El término "sonda" indica un segmento de ácido nucleico definido (o un segmento análogo de un nucleótido, p. ej. polinucleótido como se define más adelante en el presente texto) que puede ser usado para identificar una secuencia de polinucleótido específica presente en muestras, comprendiendo dicho segmento de ácido nucleico una secuencia de nucleótidos complementaria de la secuencia de polinucleótidos específica que se ha de identificar.

La expresión "tasa de heterocigosidad" se usa en el presente texto para referirse a la incidencia de individuos en una población que son heterocigóticos en un alelo particular. En un sistema bialélico, la tasa de heterocigosidad es como media igual a 2Pa(1-Pa), en donde Pa es la frecuencia del alelo menos común. Para que sea útil en estudios genéticos, un marcador genético debe tener un nivel adecuado de heterocigosidad para permitir una probabilidad razonable de que una persona elegida al azar sea heterocigótica.

El término "genotipo", como se usa en el presente texto, se refiere a la identidad de los alelos presentes en un individuo o una muestra. En el contexto de la presente invención, un genotipo se refiere preferentemente a la descripción de los alelos del marcador bialélico presentes en un individuo o en una muestra. El término "genotipar" (o determinar el genotipo) una muestra o un individuo en relación con un marcador bialélico consiste en determinar el alelo específico o el nucleótido específico portado por un individuo en un marcador bialélico.

El término "mutación", como se usa en el presente texto, se refiere a una diferencia en la secuencia de DNA entre genomas o individuos diferentes que tiene una frecuencia inferior al 1%.

El término "haplotipo" se refiere a una combinación de alelos presentes en un individuo o en una muestra. En el contexto de la presente invención, un haplotipo se refiere preferentemente a una combinación de alelos del marcador bialélico que se encuentra en un individuo dado y que puede ser asociado con un fenotipo.

El término "polimorfismo", como se usa en el presente texto, se refiere a la presencia de dos o más secuencias genómicas alternativas o alelos, entre diferentes genomas o individuos. "Polimórfico" se refiere a la condición en la que dos o más variantes de una secuencia genómica específica pueden encontrarse en una población. Un "sitio polimórfico" es el locus en el que se presenta la variación. Un polimorfismo de nucleótido único es un único cambio de pares de bases. Típicamente un polimorfismo de nucleótido único es el reemplazo de un nucleótido por otro nucleótido en el sitio polimórfico. La deleción o borrado de un nucleótido único o la inserción de un nucleótido único da también lugar a polimorfismos de nucleótido único. En el contexto de la presente invención, "polimorfismo de nucleótido único" se refiere preferentemente a una sustitución de un único nucleótido. Típicamente, entre genomas diferentes o entre individuos diferentes, el sitio polimórfico puede estar ocupado por dos nucleótidos diferentes.

Los "marcadores bialélicos" consisten en un polimorfismo de una base única. Cada marcador bialélico por tanto corresponde a dos formas de una secuencia de polinucleótidos incluida en un gen, que, cuando se comparan entre sí, presentan una modificación de nucleótido en una posición. Normalmente, la modificación del nucleótido implica la sustitución de un nucleótido por otro (por ejemplo C en vez de T). Típicamente, la frecuencia del alelo menos común de los marcadores bialélicos de la presente invención ha sido validada para que sea mayor que el 1%, preferentemente la frecuencia es mayor que el 10%, más preferentemente la frecuencia es al menos el 20% (es decir, una tasa de heterocigosidad de al menos 0,32), incluso más preferentemente la frecuencia es al menos el 30% (es decir, una tasa de heterocigosidad de al menos 0,42). Un marcador bialélico en el que la frecuencia del alelo menos común es 30% o más se denomina "marcador bialélico de alta calidad".

Como se usa en el presente texto, la terminología "que define un marcador bialélico" significa que una secuencia incluye una base polimórfica procedente de un marcador bialélico. Las secuencias que definen un marcador bialélico pueden ser de cualquier longitud consistente con el uso al que se destina, siempre y cuando contengan una base polimórfica procedente de un marcador bialélico. La secuencia tiene una longitud entre 1 y 500 nucleótidos, preferentemente entre 5, 10, 15, 20, 25 ó 40 y 200 nucleótidos, y más preferentemente entre 30 y 50 nucleótidos. Preferentemente, las secuencias que definen un marcador bialélico incluyen una base polimórfica elegida entre el grupo que consiste en marcadores bialélicos A1 a A28. En algunas realizaciones las secuencias que definen un marcador bialélico comprenden una de las secuencias elegidas entre el grupo consistente en P1 a P28. Del mismo modo, el término "marcador" o "marcador bialélico" requiere que la secuencia sea de longitud suficiente para identificar prácticamente (aunque no necesariamente de forma no ambigua) el alelo polimórfico, lo que normalmente implica una longitud de al menos 4, 5, 6, 10, 15, 20, 25 ó 40 nucleótidos.

La invención se refiere también a marcadores bialélicos relacionados con FLAP que están asociados con el asma. La expresión "marcador bialélico relacionado con FLAP" incluye, pero sin limitarse a ellos, los marcadores bialélicos tanto génicos como no génicos descritos en la Figura 1.

La expresión "no génico" se usa en el presente texto para describir marcadores bialélicos relacionados con FLAP, así como polinucleótidos y cebadores que aparecen fuera de las posiciones de nucleótido que se muestran en la secuencia genómica de FLAP humano de la SEQ ID No 1. El término "génico" se usa en el presente texto para describir marcadores bialélicos relacionados con FLAP así como polinucleótidos y cebadores que se presentan en las posiciones de nucleótido que se muestran en la secuencia genómica de FLAP humano de la SEQ ID No 1.

La situación de nucleótidos en un polinucleótido con respecto al centro del polinucleótido se describe en el presente texto de la manera que sigue. Cuando un polinucleótido tiene un número impar de nucleótidos, se considera que el nucleótido que está a igual distancia de los extremos 3' y 5' del polinucleótido está "en el centro" del polinucleótido, y se considera que cualquier nucleótido inmediatamente adyacente al nucleótido del centro, o el nucleótido en el propio centro está "a 1 nucleótido del centro". Con un número impar de nucleótidos en un polinucleótido, se consideraría que cualquiera de las cinco posiciones de nucleótidos en el medio del polinucleótido está a 2 nucleótidos del centro, y así sucesivamente. Cuando un polinucleótido tiene un número par de nucleótidos, habría un enlace y no un nucleótido en el centro del polinucleótido. Así pues, se consideraría que cualquiera de los dos nucleótidos centrales está "a 1 nucleótido del centro" y se consideraría que cualquiera de los cuatro nucleótidos del medio del polinucleótido esta "a 2 nucleótidos del centro", y así sucesivamente. Para polimorfismos que implican la sustitución, la inserción

o la deleción de 1 o más nucleótidos, el polimorfismo, alelo o marcador bialélico está "en el centro" de un polinucleótido si la diferencia entre la distancia de los polinucleótidos sustituidos, insertados o borrados del polimorfismo y el extremo 3' del polinucleótido, y la distancia desde los polinucleótidos sustituidos, insertados o borrados del polimorfismo y el extremo 5' del polinucleótido, es cero o un nucleótido. Si esta diferencia es 0 a 3, entonces se considera que el polimorfismo está "a 1 nucleótido del centro". Si la diferencia es 0 a 5, entonces se considera que el polimorfismo está "a 2 nucleótidos del centro". Si la diferencia es 0 a 7, entonces se considera que el polimorfismo está "a 3 nucleótidos del centro", y así sucesivamente.

Los términos "rasgo" y "fenotipo" se usan indistintamente en el presente texto y se refieren a cualquier propiedad visible, detectable o mensurable de cualquier otra forma, de un organismo, tales como síntomas de una enfermedad

o susceptibilidad a la misma, por ejemplo. Típicamente los términos "rasgo" o "fenotipo" se usan en el presente texto para referirse a síntomas de una enfermedad, o susceptibilidad a la misma, que implica la vía de los leucotrienos; o para referirse a la respuesta de un individuo a un agente que actúa sobre la vía de los leucotrienos; o para referirse a síntomas o susceptibilidad a los efectos secundarios ante un agente que actúa sobre la vía de los leucotrienos.

La expresión "enfermedad que implica a la vía de los leucotrienos" (o en la que interviene la vía de los leucotrienos) se refiere a una condición ligada a trastornos en la expresión, la producción o la respuesta celular a los leucotrienos. Las enfermedades que implican a la vía de los leucotrienos incluyen, pero sin limitarse a ellas, enfermedades tales como angina, choque endotóxico, soriasis, eczema atópico, artritis reumatoide, enfermedad intestinal inflamatoria, osteoartritis, tendinitis, bursitis, colitis ulcerosa, broncoasma alérgico, rinitis alérgica, conjuntivitis alérgica, glomerulonefritis, jaquecas, y más en particular asma.

La expresión "respuesta a un agente que actúa sobre la vía de los leucotrienos" se refiere a eficacia del fármaco, incluyendo, pero sin limitarse a ellas, la capacidad para metabolizar un compuesto, a la capacidad para convertir un pro-fármaco en un fármaco activo, y a la farmacocinética (absorción, distribución, eliminación) y farmacodinámica (relacionada con el receptor) de un fármaco en un individuo. En el contexto de la presente invención, una "respuesta positiva" a un medicamento puede definirse como la que comprende una reducción de los síntomas relacionados con el enfermedad o condición que se está tratando. En el contexto de la presente invención, una "respuesta negativa" a un medicamento puede definirse como la que comprende o bien una carencia de respuesta positiva al medicamento, que no conduce a una reducción de los síntomas, o bien un efecto secundario observado después de la administración del medicamento.

La expresión "efectos secundarios a un agente que actúa sobre la vía de los leucotrienos" se refiere a efectos adversos de la terapia, resultantes de extensiones de la acción farmacológica principal del fármaco o a reacciones adversas de carácter idiosincrático, resultantes de una interacción del fármaco con factores del hospedador singulares. Los efectos secundarios relacionados con el tratamiento con agentes que actúan sobre la vía de los leucotrienos son preferentemente una exacerbación aguda de una enfermedad inflamatoria tal como el asma, la infección y la jaqueca, y más preferentemente el aumento en los niveles de transaminasa en el hígado.

La expresión "agentes que actúan sobre la vía de los leucotrienos" se refiere preferentemente a un fármaco o un compuesto que modula la actividad o la concentración de cualquier enzima o molécula reguladora que interviene en la vía de los leucotrienos en una célula o animal. Preferentemente estos agentes pueden elegirse entre el grupo siguiente: inhibidores de FLAP tales como BAYx 1005, MK-886 y MK-0591; inhibidores de la 5-lipoxigenasa tales como Zileuton, BAY-G576, RS-43.179, Wy-47.288, vitamina A, y BW A4C; antagonistas del receptor de leucotrieno LTD4 tales como zafirlukast, ICI 204.219, MK-571, MK-679, ONO-RS-411, SK&F 104.353, y WY-48.252; antagonistas del receptor de leucotrieno B4; inhibidores de la leucotrieno C4 sintetasa; e inhibidores de la leucotrieno A4 hidrolasa. "Agentes que actúan sobre la vía de los leucotrienos" se refiere además a fármacos anti-inflamatorios no esteroides (NSAIDs, por sus siglas en inglés), antagonistas del receptor de leucotrieno y análogos de leucotrieno. "Agentes que actúan sobre la vía de los leucotrienos" se refiere también a compuestos que modulan la formación y la acción de los leucotrienos.

Algunos de los compuestos citados anteriormente se describen en las patentes de EE.UU. números 4.873.259, 4.970.215, 5.310.744, 5.225.421 y 5.081.138, o en el documento EP 0 419 049.

El término "individuo", como se usa en el presente texto, se refiere a vertebrados, en particular miembros de la especie de mamíferos, e incluye, pero sin limitarse a ellos, animales domésticos, animales para deportes, animales de laboratorio, primates y seres humanos. Preferentemente, un individuo es un ser humano.

Variantes y fragmentos

Polinucleótidos

La presente invención describe también variantes y fragmentos de los polinucleótidos descritos en el presente texto, en particular de un gen FLAP que contiene uno o más marcadores bialélicos descritos en la invención.

Variantes de polinucleótidos, como se usa el término en el presente texto, son polinucleótidos que difieren de un polinucleótido de referencia. Una variante de un polinucleótido puede ser una variante de origen natural, tal como una variante alélica que se da en la naturaleza, o puede ser una variante que no se conoce que se presente en la naturaleza. Tales variantes del polinucleótido no presentes en la naturaleza pueden hacerse por técnicas de mutagénesis, incluyendo las que se aplican a polinucleótidos, células u organismos. Generalmente, las diferencias se limitan de forma que las secuencias de nucleótidos de la referencia y de la variante sean muy similares globalmente y, en muchas regiones, idénticas.

Los cambios en el nucleótido de una variante pueden ser silenciosos, lo que significa que no alteran los aminoácidos codificados por el polinucleótido.

Sin embargo, los cambios de nucleótido pueden tener también como resultado sustituciones, adiciones, deleciones, fusiones y truncamientos en el polipéptido codificado por la secuencia de referencia. Las sustituciones, deleciones o adiciones pueden implicar a uno o más nucleótidos. Las variantes pueden ser alteradas en regiones codificadoras, en regiones no codificadoras, o en ambas. Las alteraciones en las regiones codificadoras pueden producir sustituciones, deleciones o adiciones conservadoras o no conservadoras de aminoácidos.

En el contexto de la presente invención, las realizaciones particularmente preferidas son aquellas en las que los polinucleótidos codifican polipéptidos que conservan sustancialmente la misma función biológica o actividad que la proteína FLAP madura.

Un fragmento de polinucleótido es un polinucleótido que tiene una secuencia que es enteramente la misma como parte, pero no como el todo de una secuencia de nucleótidos dada, preferentemente la secuencia de nucleótidos de un gen FLAP, y variantes de la misma. El fragmento puede ser una porción de un exón o de un intrón de un gen FLAP. También puede ser una porción de las secuencias reguladoras del gen FLAP. Preferentemente, tales fragmentos comprenden la base polimórfica de al menos uno de los marcadores bialélicos A1 a A28 o el complemento para el mismo.

Tales fragmentos pueden ser "independientes" ("free-standing"), es decir, no ser parte de otros polinucleótidos o estar fusionados con ellos, o bien pueden estar comprendidos dentro de un polinucleótido mayor individual del que forma una parte o región. Sin embargo, pueden estar comprendidos varios fragmentos dentro de un polinucleótido mayor individual.

Como ejemplos representativos de fragmentos de polinucleótidos, cabe mencionar aquellos que tienen una longitud de aproximadamente 4, 6, 8, 15, 20, 25, 40, 10 a 20, 10 a 30, 30 a 55, 50 a 100, 75 a 100 ó 100 a 200 nucleótidos. Se prefieren los fragmentos que tienen una longitud de aproximadamente 47 nucleótidos, tales como los de P1 a P28, y que contienen al menos uno de los marcadores bialélicos de un gen FLAP que se describen en el presente texto. Desde luego, se entenderá que los polinucleótidos P1 a P28 pueden ser más cortos o más largos, aunque se prefiere que al menos contengan la base polimórfica del marcador bialélico que puede estar situada en un extremo del fragmento.

Polipéptidos

La presente invención describe también variantes, fragmentos, análogos y derivados de los polipéptidos descritos en el presente texto, incluyendo proteínas FLAP mutadas.

La variante puede ser 1) una variante en la que uno o más de los restos de aminoácidos están sustituidos con un resto de aminoácido conservado o no conservado (preferentemente un resto de aminoácido conservado) y tal resto de aminoácido sustituido puede o no ser un resto codificado por el código genético, o 2) una variante en la que uno u más de los restos de aminoácidos incluye un grupo sustituyente, o 3) una variante en la que la FLAP mutada está fusionada con otro compuesto, tal como un compuesto para aumentar la vida mitad del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol), o 4) una variante en la que los aminoácidos adicionales están fusionados con la FLAP mutada, tal como una secuencia guía (leader) o secretora, o una secuencia que se emplea para la purificación de la FLAP mutada o una secuencia de preproteína. Se considera que tales variantes están dentro del alcance de los expertos en la técnica.

Un fragmento de polipéptido es un polipéptido que tiene una secuencia que es enteramente la misma como parte pero no como el todo de una secuencia de polipéptido dada, preferentemente un polipéptido codificado por un gen FLAP y variantes del mismo. Los fragmentos preferidos incluyen los de la región activa de la proteína FLAP que desempeñan un papel en la biosíntesis de los leucotrienos y las regiones que poseen propiedades antigénicas y que pueden ser usadas para producir anticuerpos contra la proteína FLAP.

Tales fragmentos pueden ser "independientes", es decir, no ser parte de otros polipéptidos ni fusionados con ellos, o pueden estar comprendidos dentro de un polipéptido mayor individual del que forma una parte o región. Sin embargo, pueden estar comprendidos varios fragmentos dentro de un polipéptido mayor individual.

Como ejemplos representativos de fragmentos de polipéptido de la presente invención, cabe mencionar aquellos que tienen una longitud de aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 a 15, 10 a 20, 15 a 40, o 30 a 55 aminoácidos. Se prefieren los fragmentos que contienen al menos una mutación de aminoácido en la proteína FLAP.

Condiciones de hibridación rigurosas

A título de ejemplo, pero no de limitación, los procedimientos que utilizan condiciones de alta rigurosidad son los siguientes: La prehibridación de filtros que contienen DNA se lleva a cabo durante un tiempo entre 8 horas y la noche, a 65°C en un tampón compuesto de 6X SSC, Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM, 0,02% de PVP, 0,02% de Ficoll, 0,02% de BSA, y 500 !g/ml de DNA de esperma de salmón desnaturalizado. Los filtros se hibridan durante 48 horas a 65°C, la temperatura de hibridación preferida, en una mezcla de prehibridación que contiene 100 !g/ml de DNA de esperma de salmón desnaturalizado y 5 a 20 x 106 cpm de sonda marcada con 32P. Alternativamente, la etapa de hibridación puede llevarse a cabo a 65°C en presencia de tampón SCC, correspondiendo 1 x SSC a NaCl 0,15 M y citrato Na 0,05 M. A continuación, pueden hacerse lavados de los filtros a 37°C durante 1 hora en una solución que contiene 2 x SSC, 0,01% de PVP, 0,01% de Ficoll y 0,01% de BSA, seguido por un lavado en 0,1 X SSC a 50°C durante 45 minutos. Alternativamente, los lavados de los filtros pueden realizarse en una solución que contiene 2 x SSC y 0,1% de SDS, o 0,5 x SSC y 0,1% de SDS, ó 0,1 x SSC y 0,1% de SDS a 68°C durante intervalos de 15 minutos. Después de las etapas de lavado, las sondas hibridadas son detectables mediante autorradiografía. Otras condiciones de rigurosidad elevada que pueden usarse son bien conocidas en la técnica, como se citan en Sambrook et al., 1989; y Ausubel et al., 1989, y se incorporan al presente texto en su totalidad. Estas condiciones de hibridación son adecuadas para una molécula de ácido nucleico de una longitud de aproximadamente 20 nucleótidos. No es necesario decir que las condiciones de hibridación descritas anteriormente se han de adaptar de acuerdo con la longitud del ácido nucleico deseado, siguiendo técnicas bien conocidas por los expertos en este campo. Las condiciones de hibridación adecuadas pueden adaptarse, por ejemplo, de acuerdo con las enseñanzas descritas en el libro de Hames y Higgins (1985) o en Sambrook et al. (1989).

Identidad entre ácidos nucleicos o polipéptidos

Las expresiones "porcentaje de identidad de secuencias" y "porcentaje de homología" se usan indistintamente para referirse a comparaciones entre polinucleótidos y polipéptidos, y se determinan comparando dos secuencias alineadas óptimamente sobre una ventana de comparación, en la que la porción de la secuencia del polinucleótido o del polipéptido en la ventana de comparación pueden comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones ni deleciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de las posiciones en las que la base de ácido nucleico o el resto de aminoácido idénticos se presentan en ambas secuencias para dar el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación, y multiplicando el resultado por 100 para dar el porcentaje de identidad de la secuencia. La homología se evalúa usando cualquiera de la diversidad de algoritmos y programas de comparación de secuencias conocidos en la técnica. Tales algoritmos y programas incluyen, pero en modo alguno están limitados por ellos, TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA y CLUSTAL W (Pearson y Lipman, 1988; Altschul et al., 1990; Thompson et al., 1994; Higgins et al., 1996; Altschul et al., 1990; Altschul et al., 1993). En una realización particularmente preferida, las homologías de las secuencias de proteína y ácidos nucleicos se evalúan usando el Basic Local Alignment Search Tool ("BLAST") que es muy conocido en la técnica (véanse p. ej. Karlin y Altschul, 1990; Altschul et al., 1990; Altschul et al., 1993; Altschul et al., 1997. En particular, se usan cinco programas BLAST específicos para realizar la siguiente tarea:

(1)

BLASTP y BLAST3 comparan una secuencia problema de aminoácidos frente a una base de datos de secuencias de proteínas.

(2)

BLASTN compara una secuencia problema de nucleótidos frente a una base de datos de secuencias de nucleótidos.

(3)

BLASTX compara los productos de traducción conceptual de seis marcos de una secuencia problema de nucleótidos (ambas cadenas) frente a una base de datos de secuencias de proteína.

(4)

TBLASTN compara una secuencia problema de proteína frente a una base de datos de secuencias de nucleótidos traducida en los seis marcos de lectura (ambas cadenas); y

(5)

TBLASTX compara las traducciones de seis marcos de una secuencia problema de nucleótidos frente a las traducciones de seis marcos de una base de datos de secuencias de nucleótidos.

Los programas BLAST identifican secuencias homólogas identificando segmentos similares, que se denominan en el presente texto "pares de segmentos de alta puntuación", entre una secuencia problema de aminoácidos o de ácidos nucleicos, y una secuencia de ensayo que se obtiene preferentemente de una base de datos de secuencias de proteínas o de ácidos nucleicos. Los pares de segmentos de alta puntuación son identificados (es decir, alineados) preferentemente por medio de una matriz de puntuación, muchas de las cuales son conocidas en la técnica. Preferentemente, la matriz de puntuación usada es la matriz BLOSUM62 (Gonnet et al., 1992; Henikoff y Henikoff, 1993). Menos preferentemente, también pueden usarse las matrices PAM o PAM250 (véase, p. ej., Schwartz y Dayhoff, ed., 1978). Los programas BLAST evalúan la significación estadística de todos los pares de segmentos de alta puntuación identificados, y preferentemente seleccionan los segmentos que satisfacen un umbral de significación especificado por el usuario, tal como un porcentaje de homología especificado por el usuario. Preferentemente, la significación estadística de un par de segmentos de alta puntuación se evalúa usando la fórmula de significación estadística de Karlin (véase, p. ej., Karlin y Altschul, 1990).

II. Secuencias genómicas de FLAP

Aunque el gen FLAP es de gran relevancia para la investigación farmacéutica, aún se tiene un escaso conocimiento en cuanto al alcance y la naturaleza de la variación de secuencia en este gen y sus elementos reguladores. El cDNA y parte de la secuencia genómica para el FLAP humano ha sido clonados y secuenciados (Kennedy et al., 1991; Dixon et al., 1988). Pero la secuencia genómica completa de FLAP, incluyendo sus elementos reguladores, no ha sido descrita.

La presente invención describe la secuencia genómica del gen FLAP de la SEQ ID No 1 o una variante de la misma o la secuencia complementaria de la misma. Este polinucleótido de secuencia de nucleótidos de la SEQ ID No 1, o una variante del mismo o la secuencia complementaria del mismo, puede ser purificado, aislado o recombinante. Las secuencias genómicas FLAP comprenden exones e intrones. Los ácidos nucleicos derivados de los polinucleótidos intrónicos de FLAP pueden usarse como cebadores o sondas de oligonucleótido con el fin de detectar la presencia de una copia del gen FLAP en una muestra de ensayo, o alternativamente con el fin de amplificar una secuencia de nucleótidos diana dentro de las secuencias de FLAP.

El ácido nucleico genómico de FLAP comprende 5 exones. El exón 1 comienza en el nucleótido en posición 7709 y termina en el nucleótido en posición 7852 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 1; el exón 2 comienza en el nucleótido en posición 16236 y termina en el nucleótido en posición 16335 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 1; el exón 3 comienza en el nucleótido en posición 24227 y termina en el nucleótido en posición 24297 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 1; el exón 4 comienza en el nucleótido en posición 28133 y termina en el nucleótido en posición 28214 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 1; el exón 5 comienza en el nucleótido en posición 36128 y termina en el nucleótido en posición 36605 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 1.

La invención se refiere a polinucleótidos aislados, purificados o recombinantes que comprenden un tramo contiguo de al menos 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 o 1000 nucleótidos de la SEQ ID No 1 o la secuencia complementaria de los mismos, en donde dicho tramo contiguo comprende un nucleótido elegido entre el grupo que consiste en una A en posición 7445, una A en posición 7870, una T en posición 16288, una A en posición 16383, una T en posición 24361, una G en posición 28336, una T en posición 28368, una A en posición 36183, y una G en posición 36509 de la SEQ ID No 1.

Regiones reguladoras del gen FLAP

La secuencia genómica del gen FLAP contiene secuencias reguladoras tanto en la región flanqueante 5' no codificadora como en la región flanqueante 3' no codificadora que limita la región transcrita de FLAP que contiene los 5 exones de este gen. Las secuencias reguladoras 5' del gen FLAP comprenden las secuencias de polinucleótidos situadas entre el nucleótido en posición 1 y el nucleótido en posición 7708 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 1, más preferentemente entre las posiciones 1 y 7007 de la SEQ ID No 1. Las secuencias reguladoras 3' del gen FLAP comprenden las secuencias de polinucleótidos localizadas entre el nucleótido de la posición 36606 y el nucleótido de la posición 43069 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 1.

Los polinucleótidos que llevan los elementos reguladores localizados tanto en el extremo 5' como en el extremo 3' de la región codificadora de FLAP puede usarse ventajosamente para controlar la actividad transcripcional y traduccional de un polinucleótido heterólogo de interés, siendo dicho polinucleótido heterólogo en lo que se refiere a la región reguladora de FLAP.

Tal polipéptido puede ser incluido en un vector de expresión recombinante con el fin de expresar el polipéptido deseado o el ácido nucleico deseado en una célula hospedadora o en un organismo hospedador.

III. Secuencias de cDNA de FLAP

La presente invención describe un cDNA de FLAP de la SEQ ID No 2. El cDNA de la SEQ ID No 2 incluye también una región 5'-UTR y una región 3'-UTR. La región 5'-UTR comienza en el nucleótido en posición 1 y termina en el nucleótido en posición 74 de la SEQ ID No 2. La región 3'-UTR comienza en el nucleótido en posición 561 y termina en el nucleótido en posición 875 de la SEQ ID No 2. El sitio de poliadenilación comienza en el nucleótido en posición 851 y termina en el nucleótido en posición 856 de la SEQ ID No 2.

Otro objeto de la presente invención es un polinucleótido purificado, aislado o recombinante que comprende un tramo contiguo de al menos 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 o 1000 nucleótidos de la SEQ ID No 2 o una secuencia complementaria al mismo, en donde dicho tramo contiguo comprende una A en la posición 453 (A20) o una G en la posición 779 (A21) de la SEQ ID No 2.

La mayor parte del polimorfismo bialélico representa sustituciones silenciosas de nucleótidos pero el marcador bialélico A20 esta asociado con cambios de aminoácido de valina a isoleucina en la posición 127 en el correspondiente polipéptido FLAP.

El polinucleótido descrito anteriormente que contiene la secuencia codificadora del gen FLAP de la presente invención puede expresarse en una célula hospedadora deseada o en un organismo deseado, cuando este polinucleótido se pone bajo el control de señales de expresión adecuadas. Las señales de expresión pueden ser las señales de expresión contenidas en las regiones reguladoras del gen FLAP de la presente invención, o bien pueden ser secuencias nucleicas reguladoras exógenas. Tal nucleótido, cuando se pone bajo las señales de expresión adecuadas, puede también ser insertado en un vector para su expresión.

Regiones codificadoras

El marco de lectura abierto de FLAP está contenido en el correspondiente mRNA de la SEQ ID No 2. Más exactamente, la secuencia codificadora efectiva (CDS) de FLAP abarca desde el nucléotido en la posición 75 (primer nucleótido en el codón ATG) hasta el nucleótido en la posición 560 (nucleótido final del codón TGA) de la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID No 2. La presente invención comprende también polinucleótidos aislados, purificados y recombinantes que codifican polipéptidos que comprenden un tramo contiguo de al menos 6 aminoácidos, preferentemente al menos 8 ó 10 aminoácidos, más preferentemente al menos 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos de la SEQ ID No 3, en donde dicho tramo contiguo incluye un resto de isoleucina en la posición de aminoácido 127 en la SEQ ID No 3.

El polinucleótido anteriormente descrito que contiene la secuencia codificadora del gen FLAP puede expresarse en una célula hospedadora deseada o en un organismo hospedador deseado, cuando este polinucleótido se pone bajo el control de señales de expresión adecuadas. Las señales de expresión pueden ser las señales de expresión contenidas en las regiones reguladoras del gen FLAP de la presente invención, o en cambio las señales pueden ser secuencias nucleicas reguladoras exógenas. Tal polinucleótido, cuando se pone bajo las señales de expresión adecuadas, puede también ser insertado en un vector para su expresión y/o amplificación.

IV. Construcciones de polinucléotidos

Las expresiones "construcción ("constructo") de polinucleótido" y "polinucleótido recombinante" se usan indistintamente en el presente texto para referirse a polinucleótidos lineales o circulares, purificados o aislados, que han sido diseñados artificialmente y que comprenden al menos dos secuencias de nucleótidos que no se encuentran como secuencias de nucleótidos contiguas en su entorno natural inicial.

Construcción de DNA que permite dirigir la expresión del gen FLAP temporal y espacial en células hospedadoras recombinantes y en animales transgénicos

Con el fin de estudiar las consecuencias fisiológicas y fenotípicas de la falta de síntesis de la proteína FLAP. tanto bajo el aspecto celular como bajo el aspecto del organismo multicelular, la invención describe también construcciones de DNA y vectores recombinantes que permiten una expresión condicional de un alelo específico de la secuencia genómica o cDNA de FLAP, y también una copia de esta secuencia genómica o cDNA que alberga sustituciones, deleciones o adiciones de una o más bases en lo que respecta a la secuencia de nucleótidos de FLAP de la SEQ ID Nos 1 y 2, o un fragmento de la misma, estando situadas estas sustituciones, deleciones o adiciones de bases bien en un exón, en un intrón o en una secuencia reguladora, pero preferentemente en la secuencia reguladora 5' o en un exón de la secuencia genómica de FLAP o dentro del cDNA de FLAP de la SEQ ID No 2. En una realización preferida, la secuencia de FLAP comprende un marcador bialélico de la presente invención, preferentemente uno de los marcadores bialélicos A1 a A28.

La presente invención incluye vectores recombinantes que comprenden uno cualquiera de los polinucleótidos de la presente invención.

Se describe una primera construcción de DNA que está basada en el operón tet de resistencia a la tetraciclina procedente del transposón Tn110 de E. coli para controlar la expresión del gen FLAP, tal como se describe en Gossen et al. (1992, 1995) y Furth et al. (1994). Tal construcción de DNA contiene siete secuencias operadoras tet procedentes de Tn10 (tetop) que están fusionadas con un promotor mínimo o con una secuencia reguladora 5' del gen FLAP, estando dicho promotor mínimo o dicha secuencia reguladora de FLAP unidos operativamente a un polinucleótido de interés que codifica un oligonucleótido con sentido o un oligonucleótido antisentido o bien un polipéptido, incluyendo un polipéptido FLAP o un fragmento peptídico del mismo. Esta construcción de DNA es funcional como sistema de expresión condicional para la secuencia de nucleótidos de interés cuando la misma célula comprende también una secuencia de nucleótidos que codifica el represor de tipo silvestre (tTA) o bien el mutante (rTA) fusionado con el dominio de activación de la proteína viral VP16 del virus herpes simplex, puesto bajo el control de un promotor, tal como el potenciador/promotor HCMVIEI o el MMTV-LTR. En realidad, una construcción de DNA preferida comprende tanto el polinucleótido que contiene las secuencias operadoras de tet como el polinucleótido que contiene una secuencia que codifica el represor tTA o el rTA.

En una realización específica, la construcción de DNA de expresión condicional contiene la secuencia que codifica el represor rTA de la tetraciclina mutante, la expresión del polinucleótido de interés es silenciosa en ausencia de tetraciclina y se induce en su presencia.

Construcciones de DNA que permiten la recombinación homóloga: vectores de reemplazo

Se describe una construcción de DNA que comprende, desde el extremo 5' al extremo 3': (a) una primera secuencia de nucleótidos que está comprendida en la secuencia genómica de FLAP; (b) una secuencia de nucleótidos que comprende un marcador de selección positiva, tal como el marcador para la resistencia a la neomicina (neo); y(c) una segunda secuencia de nucleótidos que está comprendida en la secuencia genómica de FLAP, y está situada en el genoma secuencia abajo de la primera secuencia de nucleótidos de FLAP (a).

En una realización preferida, esta construcción de DNA comprende también un marcador de selección negativa situado secuencia arriba de la secuencia de nucleótidos (a) o secuencia abajo de la secuencia de nucleótidos (c). Preferentemente, el marcador de selección negativa consiste en el gen de la timidina cinasa (tk) (Thomas et al., 1986), el gen beta de la higromicina (Te Riele et al., 1990), el gen hprt (Van der Lugt et al., 1991; Reid et al., 1990) o el gen del fragmento A de la toxina de la difteria (Dt-A) (Nada et al., 1993; Yagi et al., 1990). Preferentemente, el marcador de selección positiva está situado dentro de una secuencia exón de FLAP para interrumpir la secuencia que codifica una proteína FLAP. Estos vectores de reemplazo se describen, por ejemplo, en Thomas et al. (1986, 1987), Mansour et al. (1988) y Koller et al. (1992).

La primera y segunda secuencias de nucleótidos (a) y (c) pueden estar localizadas indistintamente dentro de una secuencia reguladora de FLAP, una secuencia intrónica, una secuencia exón o una secuencia que contiene las secuencias reguladora y/o intrónica y/o exón. El tamaño de las secuencias de nucleótidos (a) y (c) se encuentra entre 1 y 50 kb, preferentemente entre 1 y 10 kb, más preferentemente entre 2 y 6 kb, y lo más preferentemente entre 2 y 4 kb.

Construcciones de DNA que permiten recombinación homóloga: Sistema Cre-LoxP

Estas nuevas construcciones de DNA hacen uso del sistema de recombinación específica del sitio del fago P1. El fago P1 posee una recombinasa llamada Cre que interacciona específicamente con un sitio loxP de 34 pares de bases. El sitio loxP está compuesto por dos secuencias palindrómicas de 13 pb separadas por una secuencia conservada de 8 pb (Hoess et al., 1986). La recombinación mediante la enzima Cre entre dos sitios loxP que tienen una orientación idéntica conduce a la deleción del fragmento de DNA.

El sistema Cre-loxP usado en combinación con una técnica de recombinación homóloga ha sido descrito en primer lugar por Gu et al. (1993, 1994). Brevemente, una secuencia de nucleótidos de interés para ser insertada en una situación señalada del genoma alberga al menos dos sitios loxP en la misma orientación y situados en los correspondientes extremos de una secuencia de nucleótidos que se ha de escindir del genoma recombinante. El evento de escisión requiere la presencia de la enzima recombinasa (Cre) dentro del núcleo del hospedador celular recombinante. La enzima recombinasa puede ser traída en el momento deseado bien sea (a) incubando los hospedadores celulares recombinantes en un medio de cultivo que contiene esta enzima, por inyección de la enzima Cre directamente en la célula deseada, tal como se describe en Araki et al. (1995), o por lipofección de la enzima en las células, tal como se describe en Baubonis et al. (1993); o bien (b) transfectando el hospedador celular con un vector que comprende la secuencia codificadora de Cre unida operativamente a un promotor funcional en el hospedador celular recombinante, promotor que es opcionalmente inducible, y siendo introducido dicho vector en el hospedador celular recombinante, tal como se describe en Gu et al. (1993) y en Sauer et al. (1988); o bien (c) introduciendo en el genoma del hospedador celular un polinucleótido que comprende la secuencia codificadora de Cre unida operativamente a un promotor funcional en el hospedador celular recombinante, el cual promotor es opcionalmente inducible, y estando dicho polinucleótido insertado en el genoma del hospedador celular bien sea mediante un evento de inserción aleatoria o un evento de recombinación homóloga, tal como se describe en Gu et al. (1994).

En una realización específica, el vector que contiene la secuencia a insertar en el gen FLAP mediante recombinación homóloga se construye de manera que los marcadores seleccionables estén flanqueados por sitios loxP de la misma orientación, es posible, mediante tratamiento de la enzima Cre, eliminar los marcadores seleccionables dejando al mismo tiempo las secuencias de FLAP de interés que han sido insertadas por un evento de recombinación homóloga. También en este caso se necesitan dos marcadores seleccionables: un marcador de selección positiva para seleccionar por el evento de recombinación y un marcador de selección negativa para seleccionar por el evento de recombinación homóloga. Los vectores y métodos que usan el sistema Cre-loxP se describen en Zou et al. (1994).

Así, se describe una tercera construcción de DNA que comprende, del extremo 5' al extremo 3': (a) una primera secuencia de nucleótidos que está comprendida en la secuencia genómica de FLAP; (b) una secuencia de nucleótidos que comprende un polinucleótido que codifica un marcador de selección positiva, comprendiendo dicha secuencia de nucleótidos adicionalmente dos secuencias que definen un sitio reconocido por una recombinasa, tal como un sitio loxP, estando puestos los dos sitios en la misma orientación; y (c) una segunda secuencia de nucleótidos que está comprendida en la secuencia genómica de FLAP, y está situada en el genoma secuencia abajo de la primera secuencia de nucleótidos (a) de FLAP.

Las secuencias que definen un sitio reconocido por una recombinasa, tal como un sitio loxP, están situadas preferentemente dentro de la secuencia de nucleótidos (b) en situaciones adecuadas que limitan la secuencia de nucleótidos para la que se busca la escisión condicional. En una realización específica, dos sitios loxP está situados en cada lado de la secuencia del marcador de selección positiva, con el fin de permitir su escisión en el momento deseado después de que tenga lugar el evento de recombinación homóloga.

En una realización preferida de un método que usa la tercera construcción de DNA anteriormente descrita, la escisión del fragmento de polinucleótido limitado por los dos sitios reconocidos por una recombinasa, preferentemente dos sitios loxP, se lleva a cabo en el momento deseado, debido a la presencia, dentro del genoma de la célula hospedadora recombinante, de una secuencia que codifica la enzima Cre unida operativamente a una secuencia promotora, preferentemente un promotor inducible, más preferentemente una secuencia promotora específica para el tejido y lo más preferentemente una secuencia promotora que es tanto inducible como específica para el tejido, tal como se describe en Gu et al. (1994).

La presencia de la enzima Cre dentro del genoma del hospedador celular recombinante puede resultar de la cría de dos animales transgénicos, llevando el primer animal transgénico la secuencia derivada de FLAP de interés que contiene los sitios loxP como se describió anteriormente, y llevando el segundo animal transgénico la secuencia codificadora de Cre unida operativamente a una secuencia promotora adecuada, tal como se describe en Gu et al. (1994).

El control espacio-temporal de la expresión de la enzima Cre puede conseguirse también con un vector basado en adenovirus, que contiene el gen Cre, permitiendo así la infección de células, o la infección in vivo de órganos, para el suministro de la enzima Cre, tal como se describe en Anton y Graham (1995) y Kanegae et al. (1995).

Las construcciones de DNA descritas anteriormente pueden ser usadas para introducir una secuencia de nucleótidos deseada de la presente invención, preferentemente una secuencia genómica de FLAP o una secuencia de cDNA de FLAP, y lo más preferentemente una copia alterada de una secuencia de cDNA o genómica de FLAP, dentro de una localización predeterminada del genoma señalado, conduciendo a la generación de una copia alterada de un gen señalado (recombinación homóloga "knock-out" o desactivadora) o al reemplazo de una copia del gen señalado por otra copia suficientemente homóloga para permitir que ocurra un evento de recombinación homóloga (recombinación homóloga "knock-in" o activadora). En una realización específica, las construcciones de DNA descritas anteriormente pueden ser usadas para introducir una secuencia genómica de FLAP o una secuencia de cDNA de FLAP que comprende al menos un marcador bialélico descrito en la presente invención, preferentemente al menos un marcador bialélico elegido entre el grupo consistente en A1 a A28 y los complementos del mismo.

Construcciones de DNA antisentido nuclear

Otras composiciones que contienen un vector que comprende un fragmento de oligonucleótido de la secuencia de ácidos nucleicos SEQ ID No 2 que comprende un marcador bialélico, preferentemente un fragmento que incluye el codón de iniciación del gen FLAP, se describen como herramienta antisentido que inhibe la expresión del correspondiente gen FLAP. Los métodos preferidos que usan polinucleótido antisentido son los procedimientos descritos por Sczakiel et al. (1995) o los descritos en la Solicitud PCT Nº WO 95/24223.

Preferentemente, las herramientas antisentido se eligen entre los polinucleótidos (de 15 a 200 pb de longitud) que son complementarios al extremo 5’ del mRNA de FLAP. En una realización, se usa una combinación de diferentes polinucleótidos antisentido complementarios a diferentes partes del gen señalado deseado.

Los polinucleótidos antisentido preferidos son complementarios a una secuencia de los mRNAs de FLAP que contiene el codón de iniciación de la traducción ATG o bien un sitio de ayuste. Otros polinucleótidos antisentido preferidos son complementarios al sitio de ayuste del mRNA de FLAP.

Preferentemente, los polinucleótidos antisentido tienen una señal de poliadenilación 3’ que ha sido reemplazada con una secuencia de ribozima auto-segmentante, de forma que se producen transcritos de RNA polimerasa II sin poli(A) en sus extremos 3', siendo incapaces estos polinucleótidos antisentido de exportarse desde el núcleo, tal como se describe en Liu et al. (1994). En una realización preferida, estos polinucleótidos antisentido de FLAP comprenden también, dentro de la casete de ribozima, una estructura tallo-bucle "stem-loop" de histona para estabilizar los transcritos segmentados contra la degradación exonucleolítica 3'-5', tal como la estructura descrita por Eckner et al. (1991).

V. Marcadores bialélicos del gen FLAP

La invención describe también marcadores bialélicos relacionados con FLAP asociados con el asma. La expresión marcador bialélico relacionado con FLAP incluye los marcadores bialélicos designados A1 a A28. La invención describe también juegos o conjuntos de estos marcadores bialélicos.

Se han identificado 28 marcadores bialélicos en la secuencia genómica de FLAP. Estos marcadores bialélicos se describen en la Tabla 2 del Ejemplo 3. Su localización en la secuencia genómica y el cDNA de FLAP se indica en la Tabla 2, y también como polimorfismo de base única en las características de la SEQ ID No 1. La Tabla 2 describe también la posición en la SEQ ID No 1 de polinucleótidos de 47 nucleótidos de longitud, designados P1 a P28, que comprenden un marcador bialélico del gen FLAP y definen dicho marcador bialélico. Los pares de cebadores que permiten la amplificación de un ácido nucleico que contiene la base polimórfica de un marcador bialélico de FLAP están listados en la Tabla 1 del Ejemplo 2. Tres marcadores bialélicos, que son A13, A20 y A21, están localizados en regiones exónicas. Dos de ellos no modifican la secuencia de aminoácidos de la proteína FLAP. Sin embargo, el marcador bialélico A20 cambia una valina en una isoleucina en la proteína FLAP.

La invención describe también una secuencia de nucleótidos purificada y/o aislada que comprende una base polimórfica de un marcador bialélico localizado en la secuencia del gen FLAP, preferentemente de un marcador bialélico elegido entre el grupo consistente en A1 a A28, y complementos de la misma.

La invención describe también una secuencia de nucleótidos que define un marcador bialélico que incluye la base polimórfica de uno de los polinucleótidos P1 a P13, P15 y P17 a P28 o los complementos de la misma.

VI. Sondas y cebadores de oligonucleótido

Los polinucleótidos derivados del gen FLAP se describen como útiles para detectar la presencia de al menos una copia de una secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 1 o 2, o un fragmento o una variante de la misma en una muestra para ensayo.

Las sondas y cebadores particularmente preferidos comprenden un tramo contiguo de al menos 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 ó 1000 nucleótidos de SEQ ID No 1 o la secuencia complementaria de la misma, en donde dicho tramo contiguo comprende al menos 1, 2, 3, 5 ó 10 de las siguientes posiciones de nucleótido de SEQ ID No 1: 1-7007, 8117-15994, 16550-24058, 24598-27872, 28413-35976 y 36927-43069. Otros ácido nucleicos preferidos de la presente invención incluyen polinucleótidos aislados, purificados o recombinantes que comprenden un tramo contiguo de al menos 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 ó 1000 nucleótidos de SEQ ID No 1 o la secuencia complementaria de la misma, en donde dicho tramo contiguo comprende una C en la posición 16348, de SEQ ID No 1. Otros ácidos nucleicos preferidos de la presente invención incluyen polinucleótidos aislados, purificados o recombinantes que comprenden un tramo contiguo de al menos 26, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 ó 1000 nucleótidos de SEQ ID No 1 o la secuencia complementaria de la misma, en donde dicho tramo contiguo comprende de las siguientes posiciones de nucleótido de SEQ ID No 1: 7612-7637, 24060-24061, 24067-24068, 27903-27905 y 28327-28329. Otras sondas y cebadores preferidos comprenden un tramo contiguo de al menos 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 ó 1000 nucleótidos de SEQ ID No 1 o la secuencia complementaria de la misma, en donde dicho tramo contiguo comprende un nucleótido elegido entre el grupo consistente en una A en posición 7445, una A en posición 7870, una T en posición 16288, una A en posición 16383, una T en posición 24361, una G en posición 28336, una T en posición 28368, una A en posición 36183, y una G en posición 36509 de la SEQ ID No 1.

Así pues, la presente invención describe también sondas o cebadores de ácidos nucleicos que se hibridan específicamente, bajos las condiciones de hibridación rigurosas definidas anteriormente, con un ácido nucleico elegido entre el grupo consistente en las secuencias de nucleótidos 1-7007, 8117-15994, 16550-24058, 24598-27872, 2841335976 y 36927-43069 de la SEQ ID No 1 o una variante de la misma o una secuencia complementaria a la misma.

Las sondas y cebadores particularmente preferidos comprenden un tramo contiguo de al menos 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 ó 1000 nucleótidos de SEQ ID No 2 o la secuencia complementaria a la misma, en donde dicho tramo contiguo comprende una T en posición 197 (A13), una A en posición 453 (A20), o una G en posición 779 (A21) de la SEQ ID No 2.

La presente invención describe también oligonucleótidos y grupos de oligonucleótidos para la detección de alelos asociados con un polimorfismo del gen FLAP que está asociado con el asma. Estos oligonucleótidos puede hibridarse con un gen FLAP, preferentemente con un gen FLAP polimórfico y más preferentemente con una región de un gen FLAP que comprende el sitio polimórfico cuyos alelos específicos están asociados con el asma. Los oligonucleótidos son útiles como cebadores para ser usados en varios procesos, tales como amplificación y microsecuenciación de DNA, o bien como sondas para reconocimiento de DNA en análisis de hibridación. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos contienen la base polimórfica de una secuencia elegida entre el grupo consistente en P1 a P28 y la secuencia complementaria a la misma. En otras realizaciones, los oligonucleótidos tienen un término 3' inmediatamente adyacente a una base polimórfica en el gen FLAP, tal como una base polimórfica en uno de los P1 a P28 y la secuencia complementaria a la misma. En otras realizaciones, el oligonucleótido es capaz de discriminar entre diferentes alelos de un marcador bialélico en el gen FLAP, siendo elegido dicho marcador bialélico entre el grupo consistente en A1 a A28 y los complementos de los mismos. Por ejemplo, el oligonucleótido puede ser capaz de hibridarse específicamente con un alelo o un marcador bialélico, incluyendo uno de los marcadores bialélicos A1 a A28 y los complementos de los mismos. En otra realización, los oligonucleótidos comprenden una de las secuencias de B1 a B17, C1 a C17, D1 a D28, E1 a E28, y P1 a P28, y la secuencia complementaria de las mismas.

La presente invención describe polinucleótidos aislados, purificados y recombinantes que consisten en, o que consisten esencialmente en, un tramo contiguo de 8 a 50 nucleótidos de SEQ ID No 1 ó 2 y el complemento del mismo, en donde dicho tramo incluye un marcador bialélico relacionado con FLAP en dicha secuencia; opcionalmente, en donde dicho marcador bialélico relacionado con FLAP se elige entre el grupo que consiste en A1 a A28, y los complementos de los mismos; opcionalmente, en donde dicho tramo contiguo tiene una longitud de 18 a 47 nucleótidos y dicho marcador bialélico está a 6, 5, 4, 3, 2 ó 1 nucléotidos del centro del polinucleótido; opcionalmente, en donde dicho polinucleótido consiste en dicho tramo contiguo y dicho tramo contiguo tiene una longitud de 25 nucleótidos y dicho marcador bialélico está en el centro de dicho polinucleótido; opcionalmente, en donde el extremo 3' de dicho tramo contiguo está presente en el extremo 3' de dicho polinucleótido; y, opcionalmente, en donde el extremo 3' de dicho tramo contiguo está situado en el extremo 3' de dicho polinucleótido y dicho marcador bialélico está presente en el extremo 3' de dicho polinucleótido.

En otra realización, la presente invención describe polinucleótidos aislados, purificados y recombinantes que consisten en, o que consisten esencialmente en, un tramo contiguo de 8 a 50 nucleótidos de SEQ ID No 1 ó 2 o el complemento de los mismos, en donde el extremo 3' de dicho tramo contiguo está situado en el extremo 3' de dicho polinucleótido. En una realización, el extremo 3’ de dicho polinucleótido está situado a o al menos 2, 4, 6, 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 50, 100, 250, 500 ó 1000 nucleótidos secuencia arriba del marcador bialélico de FLAP en dicha secuencia o en cualquier otra posición que sea apropiada para su uso pretendido en la secuenciación, amplificación o localización de nuevas secuencias o marcadores. En una realización particular, el extremo 3’ de dicho polinucleótido está localizado a 20 nucleótidos secuencia arriba de un marcador bialélico relacionado con FLAP en dicha secuencia; opcionalmente, en donde dicho marcador bialélico relacionado con FLAP se elige entre el grupo consistente en A1 a A28, y los complementos de los mismos, u opcionalmente los marcadores bialélicos en desequilibrio de unión con los mismos; opcionalmente, en donde el extremo 3' de dicho polinucleótido está localizado 1 nucleótido secuencia arriba de dicho marcador bialélico relacionado con FLAP en dicha secuencia; y opcionalmente en donde dicho polinucleótido consiste esencialmente en una secuencia elegida entre las secuencias siguientes: D1 a D28 y E1 a E28. En otra realización se describen polinucleótidos aislados, purificados o recombinantes que consisten en, o que consisten esencialmente en, una secuencia elegida entre las siguientes secuencias: B1 a B17, y C1 a C17. A estos cebadores pueden añadirse, en cualquier extremo de los mismos, otro polinucleótido útil para secuenciación. Preferentemente, los cebadores PU contienen la secuencia adicional PU 5' de SEQ ID No 14 y los cebadores RP contienen la secuencia RP 5' de SEQ ID No 15.

En una realización adicional, la invención comprende polinucleótidos que comprenden un tramo contiguo de al menos 12 nucleótidos de la SEQ ID No 1 o las secuencias complementarias de los mismos, para ser usados particularmente en ensayos de hibridación, ensayos de secuenciación, ensayos de microsecuenciación y en ensayos específicos de amplificación, para determinar la identidad del nucleótido en un marcador bialélico relacionado con FLAP, en donde dicho marcador bialélico relacionado con FLAP se elige entre el grupo consistente en los marcadores bialélicos en posición 3950, 4243, 4312, 4490, 4670, 4687, 4968, 5140, 5213, 5364, 5594, 6370, 6693, 6763, 7445, 7870, 16288, 16347, 16383, 16440, 24361, 28336, 28368, 36183, 36509, 38681, 42440 y 42445 de SEQ ID No 1. Puede usarse un polinucleótido preferido en un ensayo de hibridación para determinar la identidad del nucleótido en un marcador bialélico del gen FLAP. Otro polinucleótido preferido puede ser usado en un ensayo de secuenciación o microsecuenciación para determinar la identidad del nucleótido en un marcador bialélico del gen FLAP. Un tercer polinucleótido preferido puede ser usado en un ensayo de detección de discordancias basado en una enzima para determinar la identidad del nucleótido en un marcador bialélico del gen FLAP. Un cuarto polinucleótido preferido puede ser usado en la amplificación de un segmento de polinucleótidos que comprende un marcador bialélico del gen FLAP; opcionalmente, dicha amplificación puede realizarse mediante una PCR o una LCR. Opcionalmente, dicho polinucleótido puede estar unido a un soporte sólido, matriz o matriz dirigible. Opcionalmente, dicho polinucleótido puede estar marcado.

Se sintetizan cebadores y sondas para que sean "sustancialmente" complementarios a una cadena del gen FLAP a amplificar. La secuencia del cebador no necesita reflejar la secuencia exacta del molde de DNA. Las discordancias menores pueden ajustarse reduciendo la rigurosidad de las condiciones de hibridación. Entre los varios métodos disponibles para diseñar cebadores útiles, los expertos en la técnica pueden usar el software OSP (véase Hillier y Green, 1991).

La formación de híbridos estables depende de la temperatura de fusión (Tm) del DNA. La Tm depende de la longitud del cebador o de la sonda, la fuerza iónica de la solución y el contenido de G+C. Cuanto más alto es el contenido de G+C del cebador o de la sonda, tanto más elevada es la temperatura de fusión porque los pares G:C están mantenidos por tres enlaces de H mientras que los pares A:T tienen solamente dos. El contenido de GC en los cebadores y sondas de la presente invención se encuentra normalmente en el intervalo entre 10 y 75%, preferentemente entre 35 y 60%, y más preferentemente entre 40 y 55%.

Preferentemente, la longitud del cebador y la sonda puede oscilar entre 10 y 100 nucleótidos, preferentemente de 10 a 50, de 10 a 30 o, más preferentemente, de 10 a 25 nucleótidos. Los cebadores y sondas más cortos tienden a carecer de especificidad para una secuencia de ácidos nucleicos diana y generalmente requieren temperaturas más bajas para formar complejos híbridos suficientemente estables con el molde. Los cebadores o las sondas que son más largos son costosos de preparar y a veces pueden autohibridarse para formar estructuras en horquilla. La longitud apropiada para cebadores y sondas bajo un conjunto concreto de condiciones de ensayo puede ser determinada empíricamente por un experto en la técnica.

Las sondas son útiles para varios fines. Pueden usarse en hibridación Southern con DNA genómico o hibridación Northern con mRNA. Las sondas pueden usarse también para detectar productos de amplificación mediante PCR. También pueden usarse para detectar discordancias en el gen FLAP o mRNA usando otras técnicas. Generalmente, las sondas son complementarias a las secuencias de codificación del gen FLAP. No obstante, también se contemplan sondas para intrones y secuencias reguladoras.

Los cebadores y las sondas pueden prepararse por cualquier método adecuado incluyendo, por ejemplo, la clonación y restricción de secuencias apropiadas y síntesis química directa por un método tal como el método del fosfodiéster de Narang et al. (1979), el método del fosfodiéster de Brown et al. (1979), el método de la dietilfosforamidita de Beaucage et al. (1981) y el método del soporte sólido descrito en el documento EP 0 707 592.

Las sondas de detección son generalmente secuencias de ácidos nucleicos o análogos de ácidos nucleicos no cargados tales como, por ejemplo, ácidos nucleicos de péptidos que se describen en la Solicitud de Patente Internacional WO 92/20702; análogos de morfolino que se describen en las Patentes de EE.UU. nos 5.185.444, 5.034.506 y 5.142.047; y similares. Dependiendo del tipo marcador portado por la sonda, la sonda se emplea para capturar o para detectar el amplicón generado por la reacción de amplificación. La sonda no está implicada en la amplificación de la secuencia diana y por tanto puede tener que hacerse "no extensible" en cuanto a que no puedan ser añadidos a la sonda dNTPs adicionales. Los análogos normalmente no son extensibles y las sondas de ácidos nucleicos pueden hacerse no extensibles modificando el extremo 3' de la sonda de forma que el grupo hidroxilo ya no sea capaz de participar en el alargamiento. Por ejemplo, el extremo 3' de la sonda puede ser funcionalizado con la etiqueta de captura o detección para así consumir, o bloquear de alguna otra manera, el grupo hidroxilo. Alternativamente, el grupo hidroxilo 3' simplemente puede ser segmentado, reemplazado o modificado. La Solicitud de Patente de EE.UU. nº de serie 07/049.061, presentada el 19 de Abril de 1993, describe modificaciones que pueden ser usadas para hacer a una sonda no extensible.

Preferentemente las sondas se marcan directamente por ejemplo con isótopos, moléculas informadoras o marcadores fluorescentes, o se marcan indirectamente, por ejemplo con biotina a la que puede unirse más adelante un complejo de estreptavidina. Las técnicas de marcado de sondas son bien conocidas por los expertos en la técnica. Ensayando la presencia de la sonda, se puede detectar la presencia o ausencia de la secuencia de DNA señalada en una muestra dada. Los mismos marcadores pueden usarse con los cebadores. Por ejemplo, los marcadores útiles incluyen sustancias radioactivas (32P, 35S, 3H, 125I), colorantes fluorescentes (5-bromodesoxiuridina, fluoresceína, acetilaminofluoreno, digoxigenina). Preferentemente, los polinucleótidos se marcan en sus extremos 3' y 5'. Ejemplos de marcaje no radioactivo de fragmentos de ácidos nucleicos se describen en la Patente Francesa nº FR-7810975 o en Urdea et al. (1988) o Sanchez-Pescador et al. (1988). Además, las sondas de acuerdo con la presente invención pueden tener características estructurales tales que permitan la señal de amplificación, siendo tales características estructurales, por ejemplo, sondas de DNA ramificadas tales como las descritas por Urdea et al. en 1991 o en la Patente Europea nº EP 0 225 807 (Chiron).

Cualquiera de los cebadores y sondas puede ser convenientemente inmovilizado sobre un soporte sólido. Los soportes sólidos son conocidos por los expertos en la técnica e incluyen las paredes de pocillos de una bandeja de reacción, tubos de ensayo, esferas de poliestireno, esferas magnéticas, tiras de nitrocelulosa, membranas, micropartículas tales como partículas de látex, glóbulos rojos de oveja (u otro animal), duracitos y otros. La "fase sólida" no es crítica y puede ser elegida por un experto en la técnica. Así, las partículas de látex, micropartículas, esferas magnéticas o no magnéticas, membranas, tubos de plástico, paredes de pocillos de microtítulo, chips de vidrio o silicio, glóbulos rojos de oveja (o de otro animal adecuado) y duracitos son todos ellos ejemplos adecuados.

Los métodos adecuados para inmovilizar ácidos nucleicos sobre fases sólidas incluyen interacciones iónicas, hidrófobas, covalentes y similares. Una "fase sólida", como se usa en el presente texto, se refiere a cualquier material que es insoluble o puede hacerse insoluble mediante una reacción subsiguiente. La fase sólida puede elegirse por su capacidad intrínseca para atraer e inmovilizar el reactivo de captura.

Alternativamente, la fase sólida puede retener un receptor adicional que tenga la capacidad de atraer e inmovilizar el reactivo de captura. El receptor adicional puede incluir una sustancia cargada que tiene una carga opuesta con respecto al propio reactivo de captura o a una sustancia cargada conjugada con el reactivo de captura.

Como otra alternativa, la molécula de receptor puede ser cualquier miembro de unión específica que está inmovilizado en la fase sólida (unido a ella) y que tiene la capacidad de inmovilizar el reactivo de captura a través de una reacción de unión específica. La molécula de receptor permite la unión indirecta del reactivo de captura a un material en fase sólida antes de la realización del ensayo o durante la realización del ensayo. La fase sólida puede ser entonces un material plástico, un material plástico derivatizado, metal magnético o no magnético, la superficie de un tubo de ensayo de vidrio o silicio, pocillos de microtítulo, láminas, esferas, micropartículas, chips, glóbulos rojos de oveja (o de otro animal adecuado), duracitos y otras configuraciones conocidas por los profesionales con experiencia normal en la técnica.

Los polinucleótidos de la invención pueden ser unidos a un soporte sólido, o inmovilizados sobre el mismo, individualmente o en grupos de al menos 2, 5, 8, 10, 12, 15, 20 o 25 distintos polinucleótidos de la presente invención a un único soporte sólido. Además, también pueden unirse polinucleótidos distintos de los de la presente invención al mismo soporte sólido como uno o más polinucleótidos de la invención.

La invención describe también un método para detectar la presencia de un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos elegida entre un grupo que consiste en las SEQ ID Nos 1 y 2, un fragmento o una variante del mismo o una secuencia complementaria del mismo en una muestra, comprendiendo dicho método las siguientes etapas de:

a) poner en contacto una sonda de ácido nucleico o una diversidad de sondas de ácidos nucleicos que pueden hibridarse con una secuencia de nucleótidos incluida en un ácido nucleico elegido entre el grupo consistente en las secuencias de nucleótidos de SEQ ID Nos 1 y 2, un fragmento o una variante de las mismas o una secuencia complementaria de las mismas y la muestra a ensayar.

b) detectar el complejo híbrido formado entre la sonda y un ácido nucleico en la muestra.

La invención describe además un kit para la detección de la presencia de un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos elegida entre el grupo consistente en las secuencias de nucleótidos de SEQ ID Nos 1 y 2, un fragmento o una variante de la misma o una secuencia complementaria de la misma, comprendiendo dicho kit:

a) una sonda de ácido nucleico o una diversidad de sondas de ácido nucleico que pueden hibridarse con una secuencia de nucleótidos incluida en un ácido nucleico elegido entre el grupo consistente en las secuencias de nucleótidos de SEQ ID Nos 1 y 2, un fragmento o una variante de la misma o una secuencia complementaria de la misma;

b) opcionalmente, los reactivos necesarios para realizar la reacción de hibridación.

En una primera realización del método y kit de detección, la sonda de ácidos nucleicos o la diversidad de sondas de ácidos nucleicos se marcan con una molécula detectable. En una segunda realización preferida del método y el kit de detección, la sonda de ácidos nucleicos o la diversidad de sondas de ácidos nucleicos han sido inmovilizados sobre un sustrato. En una tercera realización preferida del método y el kit de detección, la sonda de ácidos nucleicos

o la diversidad de sondas de ácidos nucleicos comprenden una secuencia que se elige entre el grupo consistente en la secuencia de nucleótidos: B1 a B17, C1 a C17, D1 a D28, E1 a E28, P1 a P28, o bien un marcador bialélico elegido entre el grupo consistente en A1 a A28 o los complementos del mismo.

Matrices de oligonucleótidos

Un sustrato que comprende una diversidad de cebadores o sondas de oligonucleótidos puede usarse para detectar

o para amplificar secuencias señaladas en el gen FLAP y también puede usarse para detectar mutaciones en las secuencias codificadoras y no codificadoras del gen FLAP.

Cualquier polinucleótido proporcionado aquí pueden ser unido en áreas de solapamiento o en localizaciones aleatorias en el soporte sólido. Alternativamente, los polinucleótidos de la presente invención pueden ser unidos en una matriz ordenada en la que cada polinucleótido está unido a una región distinta del soporte sólido que no se solapa con el sitio de unión de cualquier otro polinucleótido. Preferentemente, tal matriz ordenada de polinucleótidos se diseña para que sea "dirigible" ("addressable") cuando las distintas localizaciones están registradas y puede accederse a ellas como parte de un procedimiento de ensayo. Las matrices de polinucleótidos dirigibles comprenden típicamente una diversidad de distintas sondas de oligonucleótidos que están acopladas a una superficie de un sustrato en distintas posiciones conocidas. El conocimiento de la posición precisa de cada posición de polinucleótidos hace a estas matrices "dirigibles" particularmente útiles en ensayos de hibridación. Puede emplearse cualquier tecnología de matriz dirigible conocida en la técnica con los polinucleótidos de la presente invención. Una realización en particular de estas matrices de polinucleótidos se conoce como GenechipsT, y ha sido descrita de un modo general en la Patente de EE.UU. nº 5.143.854 y en las publicaciones PCT WO 90/15070 y 92/10092. Estas matrices pueden producirse generalmente usando métodos de síntesis mecánicos o métodos de síntesis dirigida por luz que incorporan una combinación de métodos fotolitográficos y de síntesis de oligonucleótidos en fase sólida (Fodor et al., 1991). La inmovilización de matrices de oligonucleótidos sobre soportes sólidos se ha hecho posible gracias al desarrollo de una tecnología identificada de un modo general como "Síntesis de polímeros inmovilizados en muy gran escala" (VLSIPST: Very Large Scale Immobilized Polymer Synthesis) en la que, típicamente, las sondas se inmovilizan en una matriz de alta densidad sobre una superficie sólida de un chip. Se proporcionan ejemplos de tecnologías VLSIPST en las Patentes de EE.UU. números 5.143.854 y 5.412.087 y en las publicaciones PCT WO 90/15070, WO 92/10092 y WO 95/11995, que describen métodos para formar matrices de oligonucleótidos mediante técnicas tales como las técnicas de síntesis dirigidas por luz. Al diseñar estrategias tendentes a proporcionar matrices de nucleótidos inmovilizadas sobre soportes sólidos, se desarrollaron otras estrategias de presentación para ordenar y mostrar las matrices de oligonucleótidos en los chips en un intento de maximizar los patrones de hibridación y la información de secuencias. Ejemplos de tales estrategias de presentación se describen en las publicaciones PCT WO 94/12305, WO 94/11530, WO 97/29212 y WO 97/31256.

En otra realización de las matrices de oligonucleótidos, puede usarse ventajosamente una matriz de sondas de oligonucleótidos para detectar mutaciones que ocurren en el gen FLAP. Para este fin en particular, se diseñan las sondas específicamente para que tengan una secuencia de nucleótidos que permita su hibridación con los genes que llevan mutaciones conocidas (bien sea por deleción, inserción o sustitución de uno o varios nucleótidos). Por mutaciones conocidas se entienden mutaciones en el gen FLAP que han sido identificadas, por ejemplo, de acuerdo con la técnica usada por Huang et al. (1996) o Samson et al. (1996).

Otra técnica que se usa para detectar mutaciones en el gen FLAP es el uso de una matriz de DNA de alta densidad. Cada sonda de oligonucleótido que constituye un elemento unitario de la matriz de DNA de alta densidad está diseñado para coincidir con una subsecuencia específica del DNA genómico o cDNA de FLAP. Así, se usa una matriz que consiste en oligonucleótidos complementarios a subsecuencias de la secuencia génica diana, para determinar la identidad de la secuencia diana con la secuencia génica silvestre, medir su cantidad y detectar diferencias entre la secuencia diana y la secuencia génica silvestre de referencia del gen FLAP. En un diseño así, llamado matriz enlosada 4L, se implementa un conjunto de cuatro sondas (A, C, G, T), preferentemente oligómeros de 15 nucleótidos. En cada conjunto de cuatro sondas, el complemento perfecto se hibridará con más intensidad que las sondas discordantes. En consecuencia, una diana de ácido nucleico de longitud L es explorada por barrido en cuanto a mutaciones con una matriz enlosada que contiene sondas 4L, conteniendo el conjunto completo de sondas todas las mutaciones posibles en la secuencia de referencia silvestre conocida. Las señales de hibridación de la matriz enlosada del conjunto de sondas de 15-meros son perturbadas por un único cambio de base en la secuencia diana. En consecuencia, hay una pérdida de señal característica o una "huella" para las sondas que flanquean una posición de mutación. Esta técnica fue descrita por Chee et al. en 1996.

La presente invención describe una matriz de moléculas de ácidos nucleicos que comprende al menos un polinucleótido descrito anteriormente como sondas y cebadores. Preferentemente se describe una matriz de ácido nucleico que comprende al menos dos polinucleótidos descritos anteriormente como sondas y cebadores.

También se describe otro objeto que consiste en una matriz de secuencias de ácidos nucleicos que comprende al menos una de las secuencias elegidas entre el grupo consistente en P1 a P28, B1 a B17, C1 a C17, D1 a D28 y E1 a E28 o las secuencias complementarias de las mismas o un fragmento de las mismas de al menos 8, 10, 12, 15, 18,20, 25, 30 ó 40 nucleótidos consecutivos de las mismas, o al menos una secuencia que comprende un marcador bialélico elegido entre el grupo consistente en A1 a A28, y los complementos de los mismos.

VII. Identificación de marcadores bialélicos

Hay dos métodos preferidos por los cuales los marcadores bialélicos descritos en la presente invención pueden ser generados. En un primer método, se agrupan en pool muestras de DNA de individuos no relacionados, después de lo cual el DNA genómico de interés es amplificado y secuenciado. Las secuencias de nucleótidos así obtenidas se analizan después para identificar polimorfismos significativos.

Una de las principales ventajas de este método reside en el hecho que el agrupamiento en pool de las muestras de DNA reduce sustancialmente el número de reacciones de amplificación del DNA y de reacciones de secuenciación que han de llevarse a cabo. Además, este método es suficientemente sensible de forma que un marcador bialélico obtenido con el mismo muestra normalmente un grado de capacidad informativa suficiente como para llevar a cabo estudios de asociación.

En un segundo método para generar marcadores bialélicos, las muestras de DNA no se agrupan en pool y por tanto se amplifican y se secuencian individualmente. Después las secuencias de nucleótidos resultantes obtenidas se analizan también para identificar polimorfismos significativos.

Es fácil de apreciar que cuando se usa este segundo método, se han de llevar a cabo un número sustancialmente más alto de reacciones de amplificación de DNA y de reacciones de secuenciación. Además, un marcador bialélico obtenido usando este método puede mostrar un grado de capacidad informativa más bajo para realizar estudios de asociación, p. ej. si la frecuencia de su alelo menos frecuente puede ser menor que aproximadamente 10%. Se apreciará además que incluir tales marcadores bialélicos menos informativos en estudios de asociación para identificar potenciales asociaciones genéticas con un rasgo, puede permitir en algunos casos la identificación directa de mutaciones causales que, dependiendo de su penetración, pueden ser mutaciones raras. Este método es normalmente preferido cuando los marcadores bialélicos necesitan ser identificados con el fin de realizar estudios de asociación dentro de genes candidatos.

Lo que sigue es una descripción de los varios parámetros de un método preferido usado por los inventores para generar los marcadores de la presente invención.

1. Extracción del DNA

Las muestras de DNA genómico a partir de las cuales se generan los marcadores bialélicos se obtienen preferentemente a partir de individuos no emparentados correspondientes a una población heterogénea de antecedentes étnicos conocidos.

El número de individuos de los que se obtienen las muestras de DNA puede variar sustancialmente, preferentemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 1000, preferentemente de aproximadamente 50 a aproximadamente 200 individuos. Normalmente se prefiere recoger muestras de DNA de al menos aproximadamente 100 individuos con el fin de tener diversidad polimórfica en una población dada suficiente para identificar tantos marcadores como sea posible y para generar resultados estadísticamente significativos.

En cuanto a la fuente del DNA genómico a someter a análisis, puede ser prevista cualquier muestra de ensayo sin ninguna limitación particular. Estas muestras de ensayo incluyen muestras biológicas que pueden ser ensayadas por los métodos de la presente invención descritos en el presente texto e incluyen fluidos corporales humanos y animales tales como sangre completa, suero, plasma, líquido cefalorraquídeo, orina, fluidos linfáticos y varias secreciones externas de los tractos respiratorio, intestinal y genitourinario, lágrimas, saliva, leche, glóbulos blancos, mielomas y similares; fluidos biológicos tales como sobrenadantes de cultivos de células; especímenes de tejidos fijados, incluyendo tejido tumoral y no tumoral y tejidos de ganglios linfáticos; aspirados de médula ósea y especímenes de células fijadas. La fuente preferida de DNA genómico usado en el contexto de la presente invención es a partir de sangre venosa periférica de cada donante.

Las técnicas de extracción del DNA son bien conocidas por los técnicos expertos en este campo. En el Ejemplo 1 se proporcionan detalles de una realización preferida.

Una vez que ha sido extraído el DNA genómico de cada individuo de la población dada, se prefiere separar una fracción de cada muestra de DNA, después de lo cual se constituye un pool de DNA juntando cantidades equivalentes de las fracciones separadas en una única. Sin embargo, el profesional experto en la técnica puede elegir amplificar las secuencias agrupadas o no agrupadas.

2. Amplificación del DNA

La identificación de marcadores bialélicos en una muestra de DNA genómico puede ser facilitada mediante el uso de métodos de amplificación o multiplicación de DNA. Las muestras de DNA pueden ser agrupadas en pool o no agrupadas en pool para la etapa de amplificación.

Las técnicas de amplificación de DNA son bien conocidas por los expertos este campo. Las técnicas de amplificación que pueden usarse en el contexto de la presente invención incluyen, pero sin limitarse a ellas, la reacción en cadena de ligasa (LCR) descrita en los documentos EP-A-320 308, WO 9320227 y EP-A-439 182, la reacción en cadena de polimerasa (PCR, RT-PCR) y técnicas tales como la amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA: nucleic acid sequence based amplification) descrita en Guatelli J. C. et al. (1990) y en Compton

J. (1991), amplificación Q-beta como se describe en la Solicitud de Patente Europea nº 4544610, amplificación con desplazamiento de cadena como se describe en Walker et al. (1996) y en el documento EP A 684 315, y amplificación mediada por la diana como se describe en la publicación PCT WO 9322461.

La LCR y Gap LCR son técnicas de amplificación exponencial, ambas dependen de la DNA ligasa para unir cebadores adyacentes reasociados a una molécula de DNA. En la reacción en cadena de ligasa (LCR), se usan pares de sondas que incluyen dos sondas primarias (primera y segunda) y dos sondas secundarias (tercera y cuarta), todas las cuales se emplean en exceso molar respecto a la diana. La primera sonda se hibrida con un primer segmento de la cadena diana y la segunda sonda se hibrida con un segundo segmento de la cadena diana, siendo el primer y segundo segmentos contiguos de forma que las sondas primarias lindan entre sí en relación 5' fosfato - 3' hidroxilo, y de forma que una ligasa puede fusionar o ligar covalentemente las dos sondas en un producto fusionado. Además, una tercera sonda (secundaria) puede hibridarse con una porción de la primera sonda y una cuarta sonda (secundaria) puede hibridarse con una porción de la segunda sonda de una manera colindante similar. Desde luego, si la diana es inicialmente de doble cadena, las sondas secundarias se hibridarán también con el complemento de la diana en el primer caso. Una vez que la cadena ligada de sondas primarias se separa de la cadena diana, se hibridará con la tercera y la cuarta sondas, que pueden ligarse para formar un producto ligado complementario secundario. Es importante darse cuenta de que los productos ligados son funcionalmente equivalentes a la diana o bien a su complemento. Mediante ciclos repetidos de hibridación y ligación, se consigue la amplificación de la secuencia diana. También se ha descrito un método para LCR multiplex (WO 9320227). La Gap LCR (GLCR) es una versión de la LCR en la que las sondas no son adyacentes sino que están separadas (gap) por 2 a 3 bases.

Para la amplificación de mRNAs, está dentro del alcance de la presente invención la transcripción inversa (RT) de mRNA en cDNA, seguida por la reacción en cadena de polimerasa (RT-PCR), o usar una sola enzima para ambas etapas como se describe en la Patente de EE.UU. nº 5.322.770, o usar Gap LCR asimétrica (RT-AGLCR) como se describe en Marshall et al. (1994). La AGLCR es una modificación de la GLCR que permite la amplificación de RNA.

La tecnología de la PCR es la técnica de amplificación preferida usada en la presente invención. Hay varias técnicas de PCR que son familiares para los expertos en este campo. Para una revisión de la tecnología de la PCR, véase White (1997) y la publicación que lleva por título "PCR Methods and Applications" (1991, Cold Spring Harbor Laboratory Press). En cada uno de estos procedimientos de PCR, los cebadores de PCR en cada lado de las secuencias de ácidos nucleicos que se van a amplificar se añaden a una muestra de ácidos nucleicos adecuadamente preparada junto con dNTPs y una polimerasa termoestable tal como polimerasa Taq, polimerasa Pfu o polimerasa Vent. El ácido nculeico de la muestra es desnaturalizado y los cebadores de PCR se hibridan específicamente con secuencias de ácidos nucleicos complementarias de la muestra. Los cebadores hibridados se extienden. A continuación se inicia otro ciclo de desnaturalización, hibridación y extensión o alargamiento. Los ciclos se repiten múltiples veces para producir un fragmento amplificado que contiene la secuencia de ácidos nucleicos entre los sitios de los cebadores. La PCR ha sido descrita con más detalle en varias patentes, incluyendo las Patentes de EE.UU. números 4.683.195, 4.683.202 y 4.965.188.

La tecnología de la PCR es la técnica de amplificación preferida usada para identificar nuevos marcadores bialélicos. Un ejemplo típico de una reacción de PCR adecuada para los fines de la presente invención se proporciona en el Ejemplo 2.

Se describe un método para la amplificación del gen FLAP humano, en particular de la secuencia genómica de SEQ ID No 1 o de la secuencia de cDNA de SEQ ID No 2, o un fragmento o variante de los mismos en una muestra de ensayo, preferentemente usando la tecnología de la PCR. Este método comprende las etapas de poner en contacto una muestra de ensayo sospechosa de contener la secuencia de codificación de FLAP diana o una porción de la misma, con reactivos de la reacción de amplificación que comprenden un par de cebadores de amplificación, y eventualmente en algunos casos una sonda de detección que puede hibridarse con una región interna de secuencias del amplicón para confirmar que ha tenido lugar la reacción de amplificación deseada.

La presente invención describe también un método para la amplificación de una secuencia génica FLAP, en particular de una porción de las secuencias genómicas de SEQ ID No 1 o de la secuencia de cDNA de SEQ ID No 2, o una variante de la misma, en una muestra de ensayo, comprendiendo dicho método las etapas de:

a) poner en contacto una muestra de ensayo sospechosa de contener la secuencia del gen FLAP señalada comprendida en una secuencia de nucleótidos elegida entre el grupo consistente en SEQ ID Nos 1 y 2, o fragmentos o variantes de la misma, con reactivos de la reacción de amplificación que comprenden un par de cebadores de amplificación como se describieron anteriormente y situados en cualquier lado de la región del polinucleótido que se ha de amplificar, y

b) opcionalmente, detectar los productos de la amplificación.

La invención describe también un kit para la amplificación de una secuencia génica de FLAP humano, en particular de una porción de la secuencia genómica de SEQ ID No 1 o de la secuencia de cDNA de SEQ ID No 2, o una variante de las mismas en una muestra de ensayo, en donde dicho kit comprende:

a) un par de cebadores de oligonucleótido situados en cualquier lado de la región de FLAP que se ha de amplificar;

b) opcionalmente, los reactivos necesarios para llevar a cabo la reacción de amplificación.

En una realización del método y del kit de amplificación anteriores, el producto de la amplificación se detecta por hibridación con una sonda marcada que tiene una secuencia que es complementaria a la región amplificada. En otra realización del método y del kit de amplificación anteriores, los cebadores comprenden una secuencia que se elige entre el grupo consistente en las secuencias de nucleótidos de B1 a B17, C1 a C17, D1 a D28 y E1 a E28. En una realización preferida del método y del kit de amplificación anteriores, el producto de la amplificación comprende una base polimórfica de un marcador bialélico de la presente invención, más en particular una base polimórfica de un marcador bialélico elegido entre el grupo de A1 a A28 y los complementos del mismo. Los cebadores están caracterizados más en particular por tener suficiente complementariedad con cualquier secuencia de una cadena de la secuencia genómica próxima a la región a amplificar, por ejemplo con una secuencia no codificadora adyacente a exones a amplificar.

En una primera realización, los marcadores bialélicos se identifican usando información de secuencias genómicas generada por los inventores. Se usan fragmentos de DNA genómico secuenciados, para diseñar cebadores para la amplificación de fragmentos de 500 pb. Estos fragmentos de 500 pb se amplifican a partir de DNA genómico y se exploran en relación con los marcadores bialélicos. Los cebadores pueden ser diseñados usando el software OSP (Hillier L. y Green P., 1991). Todos los cebadores pueden contener, secuencia arriba de las bases diana específicas, una cola de oligonucleótidos común que sirve como cebador de secuenciación. Los expertos en la técnica están familiarizados con extensiones de cebadores, que pueden usarse para estos fines.

Los cebadores preferidos, útiles para la amplificación de secuencias genómicas que codifican los genes candidatos, se enfocan en promotores, exones y sitios de ayuste de los genes. Un marcador bialélico presenta una mayor probabilidad de ser una eventual mutación causal si está situado en estas regiones funcionales del gen. Los cebadores de amplificación preferidos de la invención incluyen las secuencias de nucleótidos B1 a B17 y las secuencias de nucleótidos C1 a C17 descritas en el Ejemplo 2.

3. Secuenciación del DNA genómico amplificado e identificación de polimorfismos

Los productos de amplificación generados como se describió antes con los cebadores se secuencian después usando métodos conocidos y a disposición de los expertos en la técnica. Preferentemente, el DNA amplificado se somete a reacciones automatizadas de secuenciación con terminadores didesoxi usando un protocolo de secuenciación de ciclos colorante-cebador.

Después del análisis de imagen de los geles y de la extracción de la secuencia de DNA, los datos de la secuencia se procesan automáticamente con software para evaluar la calidad de la secuencia.

Los datos de secuencia obtenidos como se describió antes se someten a etapas de control de calidad y de validación basadas en la forma del pico, la resolución entre picos, el número de picos no fiables en un tramo de la secuencia en particular y el nivel de ruido. Los datos de secuencia que se consideran no fiables se desechan.

Después de este primer análisis de calidad de la secuencia, se detectan los polimorfismos entre secuencias amplificadas individualmente agrupadas en pool. La búsqueda de polimorfismo se basa en la presencia de picos superpuestos en el patrón de electroforesis. Estos picos, que presentan dos colores distintos, corresponden a dos nucleótidos diferentes en la misma posición en la secuencia. Para que los picos se consideren significativos, la altura del pico ha de cumplir una condiciones de relación entre los picos y condiciones de la relación entre un pico dado y los picos de alrededor del mismo color.

Sin embargo, como la presencia de dos picos puede ser aberrante a causa del ruido de fondo, se utilizan dos controles para excluir estos resultados aberrantes:

-

Se secuencian las dos cadenas de DNA y se realiza una comparación entre los picos; se ha de detectar el polimorfismo en ambas cadenas para su validación.

-

Se comparan todos los patrones de electroforesis de la secuenciación del mismo producto de amplificación proporcionado por distintos pools y/o individuos. La homogeneidad y la relación de alturas de picos homocigóticos y heterocigóticos se controlan a través de estos DNAs distintos.

El límite de detección para la frecuencia de polimorfismos bialélicos detectados secuenciando pools de 100 individuos es aproximadamente 0,1 para al alelo menor, como se comprueba secuenciando pools de frecuencias alélicas conocidas. Sin embargo, más del 90% de los polimorfismos bialélicos detectados por el método de agrupación (pooling) tienen una frecuencia para el alelo menor superior a 0,25. Por consiguiente, los marcadores bialélicos elegidos por este método tienen una frecuencia de al menos 0,1 para el alelo menor y menor que 0,9 para el alelo mayor, preferentemente al menos 0,2 para el alelo menor y menor que 0,8 para el alelo mayor, más preferentemente al menos 0,3 para el alelo menor y menor que 0,7 para el alelo mayor, por tanto una relación de heterocigosidad superior a 0,18, preferentemente superior a 0,32, más preferentemente superior a 0,42.

En otra realización, los marcadores bialélicos se detectan secuenciando muestras de DNA individuales; la frecuencia del alelo menor de tal marcador bialélico puede ser menor que 0,1.

4.

Validación de los marcadores bialélicos

Los polimorfismos se evalúan en cuanto a su utilidad como marcadores genéticos validando que ambos alelos están presentes en una población. La validación de los marcadores bialélicos se realiza genotipando un grupo de individuos por un método de la presente invención y demostrando que están presentes ambos alelos. La microsecuenciación es un método preferido para genotipar alelos. La validación mediante una etapa de genotipado puede realizarse en muestras individuales derivadas de cada individuo del grupo o genotipando una muestra agrupada en pool derivada de más de un individuo. El grupo puede ser tan pequeño como un solo individuo si ese individuo es heterocigótico para el aleo en cuestión. Preferentemente el grupo contiene al menos tres individuos, más preferentemente el grupo contiene cinco o seis individuos, por lo que es más probable que una prueba de validación única tenga por resultado la validación de más de los marcadores bialélicos que se están ensayando. Sin embargo, se ha de observar que cuando el ensayo de validación se lleva a cabo en un grupo pequeño puede dar por resultado un resultado negativo falso si, como consecuencia de un error de muestreo, ninguno de los individuos ensayados lleva uno de los dos alelos. Así, el proceso de validación es menos útil para demostrar que un resultado inicial en particular es un resultado aberrante, que para demostrar que hay un marcador bialélico genuino en una posición particular de una secuencia.

5.

Evaluación de la frecuencia de los marcadores bialélicos

Los marcadores bialélicos validados se evalúan más en cuanto a su utilidad como marcadores genéticos determinando la frecuencia del alelo menos común en el sitio del marcador bialélico. Cuanto más alta es la frecuencia del alelo menos común, tanto mayor es la utilidad del marcador bialélico en estudios de asociación. La determinación del alelo menos común se lleva a cabo genotipando un grupo de individuos por un método de la invención y demostrando que están presentes ambos alelos. Esta determinación de la frecuencia mediante una etapa de genotipado puede realizarse en muestras individuales derivadas de cada individuo del grupo, o genotipando una muestra agrupada derivada de más de un individuo. El grupo ha de ser suficientemente grande para que sea representativo de la población en su conjunto. Preferentemente el grupo contiene al menos 20 individuos, más preferentemente el grupo contiene al menos 50 individuos, lo más preferentemente el grupo contiene al menos 100 individuos. Por supuesto, cuanto más grande sea el grupo tanto mayor es la precisión de la determinación de la frecuencia a causa de la disminución del error de muestreo. Para una indicación de la frecuencia para el alelo menos común de un marcador bialélico en particular de la presente invención, véase la Tabla 2. Un marcador bialélico en el que la frecuencia del alelo menos común es del 30% o más, se denomina "marcador bialélico de alta calidad".

La invención se refiere también a métodos para estimar la frecuencia de un alelo de un marcador bialélico relacionado con FLAP en una población testigo o positiva para el asma, que comprende: a) genotipar individuos de dicha población en relación con dicho marcador bialélico de acuerdo con el método de la presente invención; b) determinar la representación proporcional de dicho marcador bialélico en dicha población. Además, se describen métodos para estimar la frecuencia de un alelo en una población, que comprenden métodos con cualquier otra limitación descritos en esta descripción, o los que siguen, especificados solos o en cualquier combinación. Dicho marcador bialélico relacionado con FLAP puede elegirse entre el grupo consistente en A1 a A28, y los complementos de los mismos. Opcionalmente, dicho marcador bialélico relacionado con FLAP puede elegirse entre el grupo consistente en A1 a A13, A15 y A17 a A28, y los complementos de los mismos; opcionalmente, dichos marcadores bialélicos se eligen entre el grupo consistente en A1 a A10 y A22 a A28, y los complementos de los mismos; opcionalmente, dichos marcadores bialélicos se eligen entre el grupo consistente en A11 a A13, A15, A17 a A21, y los complementos de los mismos; opcionalmente, dichos marcadores bialélicos se eligen entre el grupo consistente en A14 a A16, y los complementos de los mismos. Opcionalmente, la determinación de la representación proporcional de un nucleótido en un marcador bialélico relacionado con FLAP puede realizarse determinando la identidad de los nucleótidos para ambas copias de dicho marcador bialélico presente en el genoma de cada individuo de dicha población, y calculando la representación proporcional de dicho nucleótido en dicho marcador bialélico relacionado con FLAP para la población. Opcionalmente, la determinación de la representación proporcional puede realizarse llevando a cabo un método de genotipado de la invención en una muestra biológica agrupada en pool, derivada de un número representativo de individuos, o de cada individuo, en dicha población, y calculando la cantidad proporcional de dicho nucleótido en comparación con el total.

VIII. Métodos para genotipar un individuo para marcadores bialélicos

Se describen métodos para genotipar una muestra biológica en relación con uno o más marcadores bialélicos como describe la presente invención, todos los cuales pueden llevarse a cabo in vitro. Tales métodos de genotipado comprenden determinar la identidad de un nucleótido en un sitio del marcador bialélico de FLAP por cualquier método conocido en la técnica. Estos métodos encuentran uso en el genotipado de poblaciones de casos y testigos en estudios de asociación, así como individuos en el contexto de la detección de alelos de marcadores bialélicos que se sabe que están asociados con un rasgo dado, en cuyo caso ambas copias del marcador bialélico presente en el genoma del individuo se determinan de manera que un individuo puede ser clasificado como homocigótico o heterocigótico para un alelo en particular.

Estos métodos de genotipado pueden realizarse en muestras de ácidos nucleicos derivadas de un único individuo o muestras de DNA agrupadas en pool.

La identificación de marcadores bialélicos descritos previamente permite el diseño de oligonucleótidos apropiados, que pueden ser usados como sondas y cebadores, para amplificar un gen FLAP que contiene el sitio polimórfico de interés y para la detección de tales polimorfismos.

El genotipado puede realizarse usando métodos similares a los descritos anteriormente para la identificación de los marcadores bialélicos, o usando otros métodos de genotipado tales como los que se describen más adelante con más detalle. En realizaciones preferidas, la comparación de secuencias de fragmentos genómicos amplificados procedentes de individuos diferentes se usa para identificar nuevos marcadores bialélicos, mientras que la microsecuenciación se usa para genotipar marcadores bialélicos conocidos en aplicaciones de diagnóstico y estudio de asociación.

La invención atañe también a un método de genotipado que comprende determinar la identidad de un nucleótido en un marcador bialélico relacionado con FLAP de SEQ ID No 1, o las secuencias complementarias del mismo, que está asociado con el asma, en una muestra biológica, en donde dicho marcador bialélico relacionado con FLAP se elige entre el grupo consistente en los marcadores bialélicos en posición 3950, 4243, 4312, 4490, 4670, 4687, 4968, 5140, 5213, 5364, 5594, 6370, 6693, 6763, 7445, 7870, 16288, 16347, 16383, 16440, 24361, 28336, 28368, 36183, 36509, 38681, 42440 y 42445 de SEQ ID No 1. Opcionalmente, la muestra biológica se deriva de un único sujeto. En una realización preferida, se determina la identidad de los nucleótidos en dicho marcador bialélico para ambas copias de dicho marcador bialélico presentes en el genoma de dicho individuo. Opcionalmente, dicho método se lleva a cabo in vitro. En una realización también preferida la muestra biológica se deriva de varios sujetos. En otra realización preferida, el método de genotipado descrito anteriormente comprende además amplificar una porción de dicha secuencia que comprende el marcador bialélico antes de dicha etapa de determinación. En otra realización preferida, dicha amplificación se realiza mediante PCR y opcionalmente mediante LCR, o replicación de un vector recombinante que comprende un origen de replicación y dicha porción en una célula hospedadora. En otra realización preferida, la etapa de determinación del anterior método de genotipado puede realizarse mediante un ensayo de hibridación, un ensayo de secuenciación, un ensayo de detección de discordancias basado en una enzima, o mediante un ensayo de microsecuenciación. Además, los métodos de genotipado como se describen en la presente invención comprenden métodos con cualquier otra limitación más descrita en este texto o los que siguen, especificados solos o en cualquier combinación. Dicho marcador bialélico se elige entre el grupo consistente en A1 a A28, y los complementos de los mismos; opcionalmente dicho marcador bialélico se elige entre el grupo consistente en A1 a A13, A15 y A17 a A28, y los complementos de los mismos; opcionalmente, dicho marcador bialélico se elige entre el grupo consistente en A1 a A10, y A22 a A28 y los complementos de los mismos; opcionalmente, dicho marcador bialélico se elige entre el grupo consistente en A11 a A13, A15, A17 a A21 y los complementos de los mismos; opcionalmente, dicho marcador bialélico es A14 o bien A16, y los complementos de los mismos.

Fuente de DNA para el genotipado

Cualquier fuente de ácidos nucleicos, en forma purificada o no purificada, puede ser utilizada como ácido nucleico de partida, siempre y cuando contenga o sea sospechosa de contener la secuencia específica de ácidos nucleicos que se desea. El DNA o el RNA pueden extraerse de células, tejidos, fluidos corporales y similares, como se describió anteriormente. Aunque los ácidos nucleicos para ser usados en los métodos de genotipado de la presente invención pueden ser derivados de cualquier fuente de mamíferos, se entiende que los sujetos e individuos de ensayo de los que se toman las muestras de ácidos nucleicos son por lo general seres humanos.

Amplificación de fragmentos de DNA que comprenden marcadores bialélicos

Se describen los métodos y los polinucleótidos para amplificar un segmento de nucleótidos que comprende uno o más marcadores bialélicos de la presente invención. Se apreciará que la amplificación de fragmentos de DNA que comprenden marcadores bialélicos puede usarse en varios métodos y con diversos propósitos, y no está restringida al genotipado. Sin embargo, muchos métodos de genotipado, aunque no todos, requieren la amplificación previa de la región de DNA que lleva el marcador bialélico de interés. Tales métodos aumentan específicamente la concentración o el número total de secuencias que abarcan el marcador bialélico o incluyen ese sitio y secuencias localizadas bien sea distalmente o bien proximalmente al mismo. También pueden basarse ensayos diagnósticos en la amplificación de segmentos de DNA que llevan un marcador bialélico de la presente invención. La amplificación del DNA puede conseguirse por cualquier método conocido en la técnica. Las técnicas de amplificación se han descrito anteriormente en la sección titulada "Identificación de marcadores bialélicos" VII.(2).

Alguno de estos métodos de amplificación es particularmente adecuado para la detección de polimorfismos de un único nucleótido y permite la amplificación simultánea de una secuencia diana y la identificación del nucleótido polimórfico como se describe más adelante con mayor detalle.

La identificación de marcadores bialélicos como se describió antes permite el diseño de oligonucleótidos apropiados, que pueden ser usados como cebadores para amplificar fragmentos de DNA que comprenden los marcadores bialélicos descritos en la presente invención. La amplificación puede realizarse usando los cebadores usados inicialmente para descubrir nuevos marcadores bialélicos que se describen en el presente texto o cualquier conjunto de cebadores que permitan la amplificación de un fragmento de DNA que comprende un marcador bialélico de la presente invención.

La presente invención describe cebadores para amplificar un fragmento de DNA que contiene uno o más marcadores bialélicos como se describen en la presente invención. En algunas realizaciones el primer par está adaptado para amplificar una secuencia que contiene la base polimórfica de una de las secuencias de P1 a P28, opcionalmente P1 a P13, P15, P17 a P28, y la secuencia complementaria de la misma. Los cebadores de amplificación preferidos están listados en el Ejemplo 2. Se apreciará que los cebadores listados son solamente ejemplos y que cualquier otro conjunto de cebadores que produzcan productos de amplificación que contienen uno o más marcadores bialélicos de la presente invención.

El espaciado de los cebadores determina la longitud de los segmentos a amplificar. En este contexto, los segmentos amplificados que llevan marcadores bialélicos pueden variar en tamaño desde aproximadamente 25 pb a 35 kpb. Los fragmentos de amplificación de 25 a 3000 bp son típicos, los fragmentos de 50 a 1000 pb son preferidos, y los fragmentos de 100 a 600 pb son altamente preferidos. En una realización preferida de la presente invención, los pares de cebadores para amplificación y secuenciación son suficientemente complementarios con una región de un gen FLAP localizada a menos de 500 pb, preferentemente a menos de 100 pb, y más preferentemente a menos de 50 pb, de un sitio polimórfico que corresponde a uno de los marcadores descritos en la presente invención. Los cebadores de amplificación pueden ser marcados o inmovilizados en un soporte sólido, como se describe en "Sondas y cebadores de oligonucleótido".

Métodos para genotipar muestras de DNA para marcadores bialélicos

Cualquier método conocido en la técnica puede ser usado para identificar el nucleótido presente en un sitio del marcador bialélico. Como el alelo del marcador bialélico a detectar ha sido identificado y especificado en la presente invención, la detección resultará simple para un profesional con experiencia normal en la técnica empleando una técnica cualquiera entre un número de ellas. Muchos métodos de genotipado requieren la amplificación previa de la región de DNA que lleva el marcador bialélico de interés. Aunque la amplificación de la diana o señal suele ser preferida actualmente, también se incluyen en los presentes métodos de genotipado métodos de detección ultrasensibles que no requieren amplificación. Los métodos, bien conocidos por los expertos en la técnica, que pueden ser usados para detectar polimorfismos bialélicos incluyen métodos tales como análisis convencional de dot blot o transferencia de punto, análisis de polimorfismo conformacional de cadena simple (SSCP: Single Strand Conformational Polymorphism) descrito por Orita et al. (1999), electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE: Denaturing Gradient Gel Electrophoresis), análisis heterodúplex, detección de segmentación de discordancias, y otras técnicas convencionales como se describen en Sheffield et al. (1991), White et al. (1992), Grompe et al. (1989 y 1993). Otro método para determinar la identidad del nucleótido presente en un sitio polimórfico particular emplea un derivado de nucleótido resistente a la exonucleasa especializado, como se describe en la Patente de EE.UU. nº 4.656.127.

Los métodos preferidos implican determinar directamente la identidad del nucleótido presente en un sitio del marcador bialélico mediante un ensayo de secuenciación, un ensayo de detección de discordancias basado en una enzima, o un ensayo de hibridación. Lo que sigue es una descripción de algunos métodos preferidos. Un método altamente preferido es la técnica de microsecuenciación. El término "secuenciación" se usa en el presente texto para referirse a la extensión por la polimerasa de complejos dúplex cebador/molde e incluye tanto la secuenciación tradicional como la microsecuenciación.

1) Ensayos de secuenciación

Los productos de amplificación generados anteriormente con los cebadores de la invención pueden ser secuenciados usando métodos conocidos y disponibles para un experto en la técnica. Preferentemente, el DNA amplificado es sometido a reacciones de secuenciación automática con terminador didesoxi usando un protocolo de secuenciación de ciclos colorante-cebador. Un análisis de la secuencia puede permitir la identificación de la base presente en el sitio polimórfico.

2) Ensayos de microsecuenciacion

Los análisis de polimorfismo en pools o individuos seleccionados de una población dada pueden ser llevados a cabo realizando reacciones de microsecuenciación en regiones candidatas contenidas en fragmentos amplificados obtenidos mediante PCR realizada sobre muestras de DNA o RNA tomadas de estos individuos.

Para ello, las muestras de DNA se someten a amplificación por PCR de las regiones candidatas, bajo condiciones similares a las descritas anteriormente. Estos productos de amplificación genómicos se someten después a reacciones de microsecuenciación automática usando ddNTPs (fluorescencia específica para cada ddNTP) y cebadores de microsecuenciación de oligonucleótidos apropiados que pueden hibridarse justo secuencia arriba de la base polimórfica de interés. Una vez extendido específicamente en el extremo 3’ por una DNA polimerasa que usa un análogo de didesoxinucleótido fluorescente complementario (ciclación térmica), el cebador se precipita para eliminar los ddNTPs fluorescentes incorporados. Los productos de reacción en los que se han incorporado ddNTPs fluorescentes son después analizados mediante electroforesis en aparatos de secuenciación ABI 377, para determinar la identidad de la base incorporada, identificando de esta forma el marcador polimérico presente en la muestra.

Un ejemplo de un procedimiento de microsecuenciación típico que puede usarse en este contexto se proporciona en el Ejemplo 4. Se ha de entender que ciertos parámetros de este procedimiento, tales como el método de electroforesis o el marcaje de ddNTPs, podrían ser modificados por un experto en la técnica sin modificar sustancialmente sus resultados.

El cebador extendido puede ser también analizado mediante espectrometría de masas MALDI-TOF. La base en el sitio polimórfico es identificada por la masa añadida en el cebador de microsecuenciación (véase Haff y Smirnoff, 1977).

Como otra alternativa al procedimiento descrito antes, se han desarrollado varias reacciones de microsecuenciación en fase sólida. El protocolo básico de microsecuenciación es el mismo que se describió anteriormente, excepto que se inmovilizan los cebadores de microsecuenciación de oligonucleótido o bien los productos amplificados por PCR del fragmento de DNA de interés. Por ejemplo, la inmovilización puede llevarse a cabo mediante una interacción entre DNA biotinilado y pocillos de microtitulación recubiertos con estreptavidina o partículas de poliestireno recubiertas con avidina.

En tales reacciones de microsecuenciación en fase sólida, los ddNTPs incorporados pueden estar radiomarcados (véase Syvänen, 1994, incorporado al presente texto como referencia) o unidos a fluoresceína (Véase Livak y Hainer, 1994, incorporado al presente texto como referencia). La detección de ddNTPs radiomarcados puede conseguirse a través de técnicas basadas en centelleo. La detección de ddNTPs unidos a fluoresceína puede estar basada en la unión de anticuerpo antifluoresceína conjugado con fosfatasa alcalina, seguida por la incubación con un sustrato cromogénico (tal como fosfato de p-nitrofenilo).

Otras posibles parejas reportero-detección incluyen: ddNTP unido a dinitrofenilo (DNP) y conjugado anti-DNP fosfatasa alcalina (véase Harju et al., 1993); y ddNTP biotinilado y estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante con o-fenilendiamina como sustrato (véase el documento WO 92/15712).

Un kit de diagnóstico basado en ddNTP unido a fluoresceína con anticuerpo antifluoresceína conjugado con fosfatasa alcalina es comercializado bajo el nombre de PRONTO por GamidaGen Ltd.

Como otro procedimiento de microsecuenciación alternativo más, Nyren et al. (1993) presentaron un concepto de secuenciación de DNA en fase sólida que se basa en la detección de la actividad de DNA polimerasa mediante un ensayo de detección luminométrica enzimática de pirofosfato orgánico (ELIDA: Enzymatic Luminometric Inorganic Pyrophosphate Detection Assay). Los productos amplificados por PCR son biotinilados e inmovilizados en esferas. El cebador de microsecuenciación se reasocia y cuatro partes alícuotas de esta mezcla se incuban por separado con DNA polimerasa y uno de los cuatro ddNTPs distintos. Después de la reacción, los fragmentos resultantes se lavan y se usan como sustratos en una reacción de extensión del cebador con los cuatro dNPTs presentes. El progreso de las reacciones de polimerización dirigida por DNA se controlan mediante el ELIDA. La incorporación de un ddNTP en la primera reacción impide la formación de pirofosfato durante la subsiguiente reacción con dNPT. En cambio, la no incorporación de ddNTP en la primera reacción da una amplia liberación de pirofosfato durante la reacción con el ddNTP y esto conduce a la generación de luz a lo largo de las reacciones de ELIDA. A partir de los resultados de ELIDA se deduce fácilmente la primera base después del cebador.

Pastinen et al. (1997) describe un método para detección múltiplex de polimorfismo de un único nucleótido en el que el principio de minisecuenciación en fase sólida se aplica a un formato de matriz de oligonucleótidos. Las sondas de matrices de DNA de alta densidad unidas a un soporte sólido (chips de DNA) se describen con más detalle más adelante.

La presente invención describe polinucleótidos y métodos para genotipar uno o más marcadores bialélicos descritos en la presente invención realizando un ensayo de microsecuenciación. Preferentemente los marcadores bialélicos se eligen entre el grupo que consiste en A1 a A28, y los complementos de los mismos. Los cebadores de microsecuenciación preferidos incluyen las secuencias de nucleótidos D1 a D28 y E1 a E28. Se apreciará que los cebadores de microsecuenciación listados en el Ejemplo 4 son meramente a título de ejemplo y que puede usarse cualquier cebador que tenga un extremo 3' inmediatamente adyacente al nucleótido polimórfico. Del mismo modo, se apreciará que puede realizarse el análisis de microsecuenciación para cualquier marcador bialélico o cualquier combinación de marcadores bialélicos descritos en la presente invención. Un aspecto es un soporte sólido que incluye uno o más cebadores de microsecuenciación listados en el Ejemplo 4, o fragmentos que comprenden al menos 8, 12, 15, 20, 25, 30, 40 o 50 nucleótidos consecutivos de los mismos y que tienen un término 3' inmediatamente secuencia arriba del correspondiente marcador bialélico, para determinar la identidad de un nucleótido en un sitio del marcador bialélico.

3) Ensayos de detección de discordancias basado en polimerasas y ligasas

En un aspecto la presente invención describe polinucleótidos y métodos para determinar el alelo de uno o más marcadores bialélicos descritos en la presente invención en una muestra biológica, mediante ensayos de amplificación específica para los alelos. Los métodos, cebadores y parámetros diversos para amplificar fragmentos de DNA que comprenden marcadores bialélicos de la presente invención se describen con más detalle más adelante en "Amplificación de fragmentos de DNA que comprenden marcadores bialélicos".

Cebadores de amplificación específica del alelo

La discriminación entre los dos alelos de un marcador bialélico puede conseguirse también mediante amplificación específica del alelo, una estrategia selectiva en la que uno de los alelos es amplificado sin amplificar el otro. Para la amplificación específica del alelo, al menos un miembro del par de cebadores es suficientemente complementario con una región de un gen FLAP que comprende la base polimórfica de un marcador bialélico de la presente invención, como para hibridarse con la misma. Tales cebadores pueden discriminar entre los dos alelos de un marcador bialélico.

Esto puede realizarse poniendo la base polimórfica en el extremo 3' de los cebadores de amplificación. Tales cebadores específicos del alelo tienden a cebar selectivamente una reacción de amplificación o de secuenciación siempre y cuando se usen con una muestra de ácido nucleico que contiene uno de los dos alelos presentes en un marcador bialélico porque la extensión forma a partir del extremo 3' del cebador una discordancia en esta posición o próxima a ella tiene un efecto inhibidor sobre la amplificación. Por consiguiente, bajo condiciones de amplificación apropiadas estos cebadores dirigen solamente la amplificación en su alelo complementario. La determinación de la situación exacta de la discordancia y las correspondientes condiciones de ensayo están dentro de la experiencia de un profesional de esta técnica.

Métodos basados en ligación/amplificación

El "ensayo de ligación de oligonucleótidos" (OLA: Oligonucleotide Ligation Assay) utiliza dos oligonucleótidos que están diseñados para ser capaces de hibridarse con secuencias colindantes de una sola cadena de una molécula diana. Uno de los oligonucleótidos es biotinilado y el otro está marcado de forma detectable. Si la secuencia complementaria precisa se encuentra en una molécula diana, los oligonucleótidos se hibridarán de forma que sus términos lindan, y crean un sustrato de ligación que puede ser capturado y detectado. El ensayo OLA es capaz de detectar polimorfismos de un único nucleótido y puede combinarse ventajosamente con la PCR, como se describe en Nickerson et al. (1990). En este método, se usa la PCR para conseguir la amplificación exponencial del DNA diana, que después se detecta usando OLA.

Otros métodos de amplificación que están particularmente adaptados para la detección del polimorfismo de un único nucleótido incluyen LCR (reacción en cadena de ligasa), LCR Gap (GLCR) que se describió anteriormente en "Identificación de marcadores bialélicos" (2). La LCR usa dos pares de sondas para amplificar exponencialmente una diana específica. Las secuencias de cada par de oligonucleótidos se elige para permitir que el par se hibride con secuencias colindantes de la misma cadena de la diana. Tal hibridación forma un sustrato para una ligasa dependiente del molde. De acuerdo con la presente invención, la LCR puede llevarse a cabo con oligonucleótidos que tienen las secuencias proximales y distales de la misma cadena de un sitio del marcador bialélico. En una realización, cualquiera de los oligonucleótidos se diseñará para incluir el sitio del marcador bialélico. En tal realización, las condiciones de reacción se eligen de forma que los oligonucleótidos puedan ser ligados solamente si la molécula diana contiene o carece del nucleótido específico que es complementario al marcador bialélico en el oligonucleótido. En una realización alternativa, los oligonucleótidos no incluirán el marcador bialélico, de forma que cuando se hibriden con la molécula diana, se crea un "hueco" o "gap" como se describe en el documento WO 90/01069. Este hueco se rellena después con dNTPs complementarios (según es mediado por la DNA polimerasa), o por un par adicional de oligonucleótidos. Así, al final de cada ciclo, cada cadena simple tiene un complemento capaz de servir como diana durante el ciclo siguiente y se obtiene la amplificación exponencial específica del alelo de la secuencia deseada.

El Genetic Bit AnalysisT mediado por ligasa/polimerasa es otro método para determinar la identidad de un nucleótido en un sitio preseleccionado en una molécula de ácido nucleico (documento WO 95/21271). Este método implica la incorporación de un trifosfato de nucleósido que es complementario al nucleótido presente en el sitio preseleccionado en el términus de una molécula de cebador, y su subsiguiente ligación con un segundo oligonucleótido. La reacción se controla detectando un marcador específico unido a la fase sólida de la reacción o por detección en solución.

4) Métodos de ensayo de hibridación

La invención describe también un grupo de sondas caracterizadas porque preferentemente comprenden entre 10 y 50 nucleótidos y porque son suficientemente complementarias a una secuencia polimórfica definida por un marcador bialélico situado en la secuencia genómica de un gen FLAP como para hibridarse con ella, y preferentemente suficientemente específicas como para poder discriminar la secuencia señalada por solamente una variación de nucleótido.

La longitud de estas sondas puede oscilar de 10, 15, 20 o 30 a 100 nucleótidos, preferentemente de 10 a 50, más preferentemente de 40 a 50 nucleótidos. Una sonda particularmente preferida tiene una longitud de 25 nucleótidos. Otra sonda preferida tiene una longitud de 47 nucleótidos. Incluye un nucleótido central complementario de un sitio polimórfico del gen FLAP, preferentemente un sitio polimórfico correspondiente a uno de los marcadores bialélicos de la presente invención, y una secuencia de 23 nucleótidos que se extiende a cada lado del nucleótido central y sustancialmente complementaria de las secuencias de nucleótidos del gen FLAP que se extiende a cada lado del sitio polimórfico. Opcionalmente, los marcadores bialélicos descritos en la presente invención comprenden las bases polimórficas en las secuencias de P1 a P28 y las secuencias complementarias de las mismas. Opcionalmente, los marcadores bialélicos comprenden las bases polimórficas en las secuencias de P1 a P13, P15 y P17 a P28, y las secuencias complementarias de las mismas.

Pueden analizarse los polimorfismos y cuantificarse la frecuencia de los correspondientes alelos mediante reacciones de hibridación en secuencias codificadoras de FLAP amplificadas. La reacción de amplificación puede llevarse a cabo como se describió con anterioridad. Las sondas de hibridación que pueden usarse convenientemente en tales reacciones incluyen preferentemente las sondas definidas antes como sondas que son suficientemente complementarias a un sitio polimórfico definido por uno de los marcadores bialélicos situados en la secuencia genómica de un gen FLAP, como para hidridarse con el mismo, y suficientemente específicas como para ser capaces de discriminar entre el alelo señalado y un alelo que difiere en tan solo una base.

El DNA diana que comprende un marcador bialélico puede ser amplificado antes de la reacción de hibridación. La presencia de un alelo específico en la muestra se determina detectando la presencia o la ausencia de dúplexes híbridos estables formados entre la sonda y el DNA diana. La detección de dúplexes híbridos puede llevarse a cabo por diversos métodos. Son bien conocidos varios formatos de ensayo de detección que utilizan marcadores detectables, unidos bien sea a la diana o bien a la sonda, para permitir la detección de los dúplexes híbridos. Típicamente, se separan los dúplexes de hibridación de los ácidos nucleicos no hibridados, y entonces de detectan los marcadores unidos a los dúplexes. Los expertos en la técnica reconocerán que pueden emplearse etapas de lavado para eliminar el exceso de DNA diana o de sonda, así como el conjugado no unido. Además, los formatos de ensayo heterogéneo estándar son adecuados para detectar los híbridos usando los marcadores presentes en los cebadores y sondas.

Dos ensayos recientemente desarrollados permiten la discriminación de alelos basada en la hibridación, sin necesidad de separaciones ni lavados (véase Landegren U. et al., 1998). El ensayo TaqMan aprovecha la actividad de 5' nucleasa de la DNA polimerasa Taq para digerir una sonda de DNA reasociada específicamente al producto de amplificación acumulativo. Las sondas TaqMan están marcadas con un par de colorantes donante-aceptor que interacciona por medio de transferencia de energía de fluorescencia. La segmentación de la sonda TaqMan por la polimerasa en avance durante la amplificación disocia el colorante donante del colorante aceptor amortiguador (quenching), aumentando en gran medida la fluorescencia del donante. Todos los reactivos necesarios para detectar dos variantes alélicas pueden juntarse al comienzo de la reacción y los resultados se registran en tiempo real (véase Livak et al., 1995). En un procedimiento alternativo basado en hibridación homogénea, se usan balizas moleculares para discriminaciones de alelos. Las balizas moleculares son sondas de oligonucleótido en forma de horquilla que informan de la presencia de ácidos nucleicos específicos en soluciones homogéneas. Cuando se unen a sus dianas, experimentan una reorganización conformacional que restablece la fluorescencia de un fluoróforo amortiguado internamente (Tyagi et al., 1998).

5) Hibridación con matrices de oligonucleótidos dirigibles

Se obtiene acceso eficiente a información de polimorfismo a través de una estructura básica que comprende matrices de alta densidad de sondas de oligonucleótido unidas a un soporte sólido (el chip) en posiciones seleccionadas. Cada chip de DNA puede contener de miles a millones de sondas de DNA sintético individual dispuestas en un patrón en rejilla y miniaturizadas al tamaño de una moneda. Estos chips de DNA se detallan en "cebadores y sondas de oligonucleótidos", sección "Matriz de oligonucleótidos".

La tecnología de los chips ya ha sido aplicada con éxito en muchos casos. Por ejemplo, se ha emprendido el cribado de mutaciones en el gen BRCA 1, en cepas mutantes de S. cerevisiae, y el gen de la proteasa del virus del VIH-1 (véase Hacia et al., 1996; Shoemaker et al., 1996; Kozal et al., 1996).

Hay por lo menos tres compañías que proponen chips capaces de detectar polimorfismos bialélicos: Affymetrix (GeneChio), Hyseq (HyChip y HyGnostics), y Protogene Laboratories.

Una de las limitaciones encontradas cuando se usa tecnología de chips de DNA es que la hibridación de ácidos nucleicos con las sondas unidas al chip en matrices no es simplemente una reacción en fase solución. Una posible mejora consiste en usar lechos de gel de poliacrilamida aislados unos de otros por regiones hidrófobas en donde las sondas de DNA están unidas covalentemente a una matriz de acrilamida.

Para la detección de polimorfismos, se sintetizan sondas que contienen al menos una porción de uno de los marcadores bialélicos, tal como los marcadores bialélicos de P1 a P28, y las secuencias complementarias de las mismas, bien sea in situ o bien por síntesis convencional, y se inmovilizan en un chip apropiado usando métodos conocidos por los expertos en la técnica. La superficie sólida del chip se hace frecuentemente de silicio o de vidrio, pero puede ser una membrana polimérica. Así, en algunas realizaciones, los chips pueden comprender una matriz de secuencias de ácidos nucleicos o fragmentos de las mismas de al menos 15 nucleótidos de longitud, preferentemente de al menos 20 nucleótidos de longitud, y más preferentemente de al menos 25 nucleótidos de longitud. En otras realizaciones, el chip puede comprender una matriz que incluye al menos una de las secuencias elegidas entre el grupo consistente en P1 a P28, D1 a D28 y E1 a E28, o las secuencias complementarias de las mismas, o un fragmento de las mismas de al menos 15 nucleótidos consecutivos.

La muestra de ácido nucleico que incluye la región candidata para ser analizada se aísla, se amplifica y se marca con un grupo informador (reporter). Este grupo informador puede ser un grupo fluorescente tal como ficoeritrina. El ácido nucleico marcado se incuba después con las sondas inmovilizadas en el chip usando una estación fluídica. Por ejemplo, Manz et al. (1993) describen la fabricación de dispositivos fluídicos y en particular dispositivos microcapilares, en sustratos de silicio y vidrio.

Una vez que la reacción es completa, el chip se inserta en un escáner y se detectan los patrones de hibridación. Los datos de hibridación se recogen como una señal emitida desde los grupos informadores ya incorporados al ácido nucleico, que está ahora unido a las sondas fijadas al chip. Las sondas que coinciden perfectamente con una secuencia de la muestra de ácido nucleico producen generalmente señales más intensas que las que tienen discordancias. Como se conocen la secuencia y la posición de cada sonda inmovilizada en el chip, puede determinarse la identidad del ácido nucleico hibridado con una sonda dada.

Para análisis de polimorfismo de un único nucleótido, se diseñan generalmente conjuntos de cuatro sondas de oligonucleótido (una por cada tipo de base), preferentemente conjuntos de dos sondas de oligonucleótido (una por cada tipo de base del marcador bialélico) que abarcan cada posición de una porción de la región candidata que se encuentra en la muestra de ácido nucleico, que difieren solamente en la identidad de la base polimórfica. La intensidad de hibridación relativa con cada serie de sondas en una situación en particular permite la identificación de la base que corresponde a la base polimórfica de la sonda. Dado que la detección del polimorfismo bialélico implica identificar discordancias de base única en la muestra de ácido nucleico, se requiere mayor rigurosidad de hibridación (una concentración de sal más baja y temperatura más alta durante periodos de tiempo más breves).

El uso del control directo del campo eléctrico mejora la determinación de mutaciones de base única (Nanogen). Un campo eléctrico positivo aumenta la velocidad de transporte de los ácidos nucleicos cargados negativamente y tiene por resultado un aumento de 10 veces en la velocidad de hibridación. Usando esta técnica, se detectan discordancias de pares de bases únicas en menos de 15 segundos (véase Sosnowski et al., 1997).

5) Sistemas integrados

Otra técnica que puede ser usada para analizar polimorfismos incluye sistemas integrados de multicomponentes, que miniaturizan y compartimentalizan procedimientos tales como las reacciones de PCR y de electroforesis capilar, en un solo dispositivo funcional. Un ejemplo de tal técnica se describe en la Patente de EE.UU. nº 5.589.136, que describe la integración de la amplificación por PCR y la electroforesis capilar en chips.

Los sistemas integrados pueden concebirse principalmente cuando se usan sistemas microfluídicos. Estos sistemas comprenden un patrón de microcanales diseñados en una oblea de vidrio, silicio, cuarzo o plástico incluida en un microchip. Los movimientos de las muestras se controlan mediante fuerzas eléctricas, electroosmóticas o hidrostáticas aplicadas a través de diferentes áreas del microchip para crear válvulas y bombas microscópicas funcionales sin partes en movimiento. La variación del voltaje controla el flujo de líquido en las intersecciones entre los canales micromecanizados y cambia el caudal de líquido para bombear a través de diferentes secciones del microchip.

Para el genotipado de marcadores bialélicos, el sistema microfluídico puede integrar amplificación de ácidos nucleicos, microsecuenciación, electroforesis capilar y un método de detección tal como detección de fluorescencia inducida por láser. En una primera etapa, las muestras de DNA son amplificadas, preferentemente mediante PCR. Después, los productos de amplificación son sometidos a reacciones de microsecuenciación automática usando ddNTPs (fluorescencia específica para cada ddNTP) y los cebadores de microsecuenciación de oligonucleótidos apropiados que se hibridan justo secuencia arriba de la base polimórfica señalada. Una vez completada la extensión en el extremo 3’, los cebadores se separan de los ddNTPs fluorescentes no incorporados, mediante electroforesis capilar. El medio de separación usado en la electroforesis capilar puede ser, por ejemplo, poliacrilamida, polietilenglicol o dextrano. Los ddNTPs incorporados presentes en los productos de extensión del cebador de único nucleótido se identifican por detección de la fluorescencia. Este microchip puede usarse para procesar al menos de 96 a 384 muestras en paralelo. Puede usar la detección habitual de fluorescencia inducida por láser de cuatro colores de los ddNTPs.

IX. Estudios de asociación

La identificación de genes asociados con un rasgo particular, tal como la susceptibilidad al asma o la respuesta individual a fármacos anti-asmáticos, puede llevarse a cabo por medio de dos estrategias principales que se usan actualmente para el cartografiado genético: análisis de unión y estudios de asociación. El análisis de unión implica el estudio de familias con múltiples individuos afectados y es ahora útil en la detección de rasgos heredados mono u oligogénicos. A la inversa, los estudios de asociación examinan la frecuencia de alelos marcadores en individuos rasgo positivos (T+) no emparentados en comparación con individuos testigo que se eligen al azar o preferentemente testigos rasgo negativos (T-), y se emplean generalmente en la detección de herencia poligénica.

Los estudios de asociación como método de cartografiado de rasgos genéticos se apoya en el fenómeno del desequilibrio de unión. Si dos loci genéticos están en el mismo cromosoma, entonces juegos de alelos de estos loci en el mismo segmento cromosómico (llamados haplotipos) tienden a ser transmitidos como un bloque de generación en generación. Cuando no se rompen por recombinación, los haplotipos pueden ser rastreados no solo a través de genealogías sino también a través de poblaciones. El fenómeno resultante a nivel de población es que la aparición de pares de alelos específicos en loci diferentes en el mismo cromosoma no es aleatoria, y la desviación de la aleatoriedad se denomina desequilibrio de unión (LD: Linkage Disequilibrium).

Si un alelo específico en un gen dado está directamente implicado en causar un rasgo T en particular, su frecuencia aumentará estadísticamente en una población T+ en comparación con la frecuencia en una población T-. Como consecuencia de la existencia del desequilibrio de unión, la frecuencia de todos los demás alelos presentes en el haplotipo que lleva el alelo causante del rasgo (TCA: Trait Causing Alele) aumentará también en los individuos T+ en comparación con lo individuos T-. Por tanto, la asociación entre el rasgo y cualquier alelo en desequilibrio de unión con el alelo causante del rasgo bastará para sugerir la presencia de un gen relacionado con el rasgo en esa región del alelo en particular. El desequilibrio de unión permite analizar las frecuencias relativas en poblaciones T+ y T- de un número limitado de polimorfismos genéticos (específicamente marcadores bialélicos) como alternativa al cribado de todos los posibles polimorfismos funcionales con el fin de encontrar alelos causantes de un rasgo.

Pueden emplearse dos planteamientos alternativos para realizar estudios de asociación: un estudio de asociación en todo el genoma y un estudio de asociación del gen candidato. El estudio de asociación de todo el genoma se apoya en el cribado de marcadores genéticos espaciados uniformemente y que cubre el genoma completo. El método del gen candidato se basa en el estudio de marcadores genéticos situados específicamente en genes potencialmente implicados en una vía biológica relacionada con el rasgo de interés. El análisis del gen candidato proporciona claramente una aproximación por el atajo para la identificación de genes y polimorfismos génicos relacionados con un rasgo particular cuando se dispone de cierta información que concierne a la biología del rasgo.

La estrategia general para realizar estudios de asociación usando marcadores bialélicos derivados de un gen candidato es explorar dos grupos de individuos (individuos testigo rasgo + y rasgo - que están caracterizados por un fenotipo bien definido como se describe más adelante) con el fin de medir y comparar estadísticamente las frecuencias alélicas de tales marcadores bialélicos en ambos grupos.

Si se identifica una asociación estadísticamente significativa con un rasgo para al menos uno o más de los marcadores bialélicos analizados, se puede asumir que o bien el alelo asociado es directamente responsable de causar el rasgo (el alelo asociado es el TCA), o bien el alelo asociado está en desequilibrio de unión con el TCA. Las características específicas del alelo asociado con respecto a la función del gen candidato da normalmente una mejor perspectiva en la relación entre el alelo asociado y el rasgo (causal o en desequilibrio de unión). Si la evidencia indica que el alelo asociado dentro del gen candidato no es, lo más probablemente, el TCA sino que está en desequilibrio de unión con el TCA real, entonces el TCA puede encontrarse secuenciando la vecindad del marcador asociado.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar un método para la identificación y la caracterización de una asociación entre alelos para uno o varios marcadores bialélicos de la secuencia del gen FLAP y un rasgo. El método para detectar una asociación entre un genotipo y un fenotipo comprende las etapas de: a) determinar la frecuencia de al menos un marcador bialélico relacionado con FLAP en una población asma-positiva de acuerdo con un método de la invención; b) determinar la frecuencia de al menos un marcador bialélico relacionado con FLAP en una población testigo de acuerdo con un método de la invención; y c) determinar si existe una relación estadísticamente significativa entre dicho genotipo y dicho fenotipo. Dichos marcadores bialélicos se eligen entre el grupo que consiste en A1 a A28, y los complementos de los mismos. El rasgo es uno cualquiera de asma, una respuesta beneficiosa al tratamiento con agentes que actúan sobre el asma, o efectos secundarios relacionados con agentes que actúan sobre el asma. Opcionalmente, dichas etapas de genotipado a) y b) pueden realizarse sobre una muestra biológica agrupada en pool derivada de cada una de dichas poblaciones. En una realización preferida, dichas etapas de genotipado a) y b) se realizan separadamente sobre muestras biológicas derivadas de cada individuo de dicha población

o una submuestra de los mismos. En una realización preferida, dichos individuos testigos son testigos rasgo negativos o aleatorios.

La invención comprende también métodos para estimar la frecuencia de un haplotipo para un conjunto de marcadores bialélicos en una población testigo o en una población asma-positiva, que comprende las etapas de: genotipar al menos un marcador bialélico relacionado con FLAP de acuerdo con un método de la presente invención para cada individuo de dicha población; b) genotipar un segundo marcador bialélico determinando la identidad de los nucleótidos en dicho marcador bialélico para ambas copias de dicho segundo marcador bialélico presente en el genoma de cada individuo de dicha población; y c) aplicar un método de determinación de haplotipo a las identidades de los nucleótidos determinados en las etapas a) y b) para obtener una estimación de dicha frecuencia. Además, se describen métodos para estimar la frecuencia de un haplotipo de la invención, que comprenden métodos con cualquier otra limitación descritos en esta descripción, en particular en "Métodos estadísticos", o los que siguen, especificados solos o en cualquier combinación. Opcionalmente, dichos marcadores bialélicos se eligen entre el grupo consistente en A1 a A28, y los complementos de los mismos. En una realización preferida dicho método de determinación de haplotipos se realiza mediante amplificación por PCR asimétrica, amplificación por PCR doble de alelos específicos, el algoritmo de Clark, o un algoritmo de expectación-maximización.

La presente invención describe también un método para la identificación y caracterización de una asociación entre un haplotipo que comprende alelos para varios marcadores bialélicos de la secuencia genómica del gen FLAP, y un rasgo. El método comprende las etapas de: a) genotipar un grupo de marcadores bialélicos de acuerdo con la presente invención en individuos rasgo positivos y testigos; y b) establecer una asociación estadísticamente significativa entre un haplotipo y el rasgo. La invención se refiere a un método para la identificación y la caracterización de una asociación entre un haplotipo que comprende alelos para varios marcadores bialélicos de la secuencia genómica del gen FLAP y un rasgo de asma, que comprende las etapas de: a) estimar la frecuencia de al menos un haplotipo en una población positiva para el rasgo de acuerdo con un método de la presente invención; b) estimar la frecuencia de dicho haplotipo en una población testigo de acuerdo con un método de la presente invención; y c) determinar si existe una asociación estadísticamente significativa entre dicho haplotipo y dicho rasgo de asma. Además, los métodos para detectar una asociación entre un haplotipo y un fenotipo de la invención describen métodos con cualquier otra limitación descritos en esta descripción, o los que siguen. Dichos marcadores bialélicos se eligen entre el grupo consistente en A1 a A28, y los complementos de los mismos. Opcionalmente, el rasgo es una enfermedad, preferentemente una enfermedad en la interviene la vía de los leucotrienos, una respuesta beneficiosa al tratamiento con agentes que actúan sobre la vía de los leucotrienos, o efectos secundarios relacionados con el tratamiento con agentes que actúan sobre la vía de los leucotrienos. Opcionalmente, dichos individuos testigo son negativos al rasgo

o testigos aleatorios. Opcionalmente, dicho método comprende las etapas adicionales de determinar el fenotipo en dichas poblaciones rasgo positivas y dichas poblaciones testigo antes de la etapa c).

Si el rasgo es una respuesta beneficiosa o por el contrario es un efecto secundario del tratamiento con un agente que actúa sobre la vía de los leucotrienos, se describe un método mencionado antes que comprende además alguna

o todas las etapas siguientes: a) seleccionar una población o cohorte de sujetos a los que se ha diagnosticado que padecen una enfermedad específica en la que interviene la vía de los leucotrienos; b) administrar un agente especificado que actúa sobre la vía de los leucotrienos, a tal cohorte de sujetos; c) controlar el resultado de la administración del fármaco e identificar a los individuos que son rasgo positivos o rasgo negativos en relación con el tratamiento; d) tomar de dicha cohorte muestras biológicas que contienen DNA y ensayar este DNA en cuanto a la presencia de un alelo específico o de un juego de alelos para marcadores bialélicos del gen FLAP; e) analizar la distribución de alelos para marcadores bialélicos entre individuos rasgo positivos y rasgo negativos; y f) realizar un análisis estadístico para determinar si hay una asociación estadísticamente significativa entre la presencia o la ausencia de alelos de los marcadores bialélicos del gen FLAP y el rasgo relacionado con el tratamiento. Opcionalmente, dichos marcadores bialélicos se eligen entre el grupo consistente en A1 a A28, y los complementos de los mismos. La etapa de ensayar y detectar la presencia de DNA que comprende alelos específicos de un marcador bialélico o un grupo de marcadores bialélicos puede llevarse a cabo como se describe en la presente invención.

La invención comprende también métodos para determinar si un individuo corre el riesgo de desarrollar asma, métodos que comprenden las etapas de: a) genotipar al menos un marcador bialélico relacionado con FLAP de acuerdo con un método de la presente invención; y b) correlacionar el resultado de la etapa a) con un riesgo de desarrollar asma; en donde dicho marcador bialélico relacionado con FLAP se elige entre el grupo que consiste en A1 a A28; opcionalmente en donde dicho marcador bialélico relacionado con FLAP se elige entre la siguiente lista de marcadores bialélicos: A2, A14, A16, A18, A19, A22 y A23; y opcionalmente en donde dicho marcador bialélico relacionado con FLAP es el marcador bialélico A19.

En una realización preferida, la presente invención comprende los métodos anteriores de acuerdo con la invención, en los que dicho marcador bialélico relacionado con el gen FLAP se elige entre la lista siguiente de los marcadores bialélicos en posición 4670, 16347, 16440, 28336, 28368, 38681 y 42445 de la SEQ ID No 1, siendo la más preferida la posición 28368.

1) Recogida de muestras de DNA de individuos rasgo positivos (Rasgo +) y testigos (criterios de inclusión)

Los estudios de asociación basados en una población no se refieren a herencia familiar sino que comparan la prevalencia de un marcador genético en particular, o de un conjunto de marcadores, en poblaciones de casos-testigos. Hay estudios de casos-testigos basados en la comparación de individuos de casos no emparentados (afectados o rasgo positivos) e individuos testigos no emparentados (no afectado o rasgo negativos o aleatorios). Preferentemente el grupo testigo se compone de individuos no afectados o rasgo negativos. Además, el grupo testigo coincide étnicamente con la población del caso. También, el grupo testigo es preferentemente coincidente con la población caso para el principal factor de confusión conocido para el rasgo bajo estudio (por ejemplo, edad coincidente para un rasgo dependiente de la edad). Idealmente, los individuos de las dos muestras se emparejan de forma que se espera que difieran solamente en su estatus de la enfermedad. En lo sucesivo, "población rasgo positiva", "población caso" y "población afectada" se usan indistintamente.

Para realizar estudios de asociación eficaces y significativos tales como los descritos en el presente texto, el rasgo bajo estudio debe seguir preferentemente una distribución bimodal en la población bajo estudio, presentando dos claros fenotipos no solapantes, rasgo + y rasgo -.

Si embargo, ni siquiera en ausencia de tal distribución bimodal (como de hecho puede ser el caso para rasgos genéticos más complejos), cualquier rasgo genético puede ser también analizado por el método de asociación propuesto en el presente texto, seleccionando cuidadosamente los individuos a incluir en los grupos fenotípicos rasgo + y rasgo -. El procedimiento de selección implica seleccionar individuos en extremos opuestos del espectro de fenotipo bimodal del rasgo bajo estudio, para incluir en estas poblaciones rasgo + y rasgo - individuos que claramente representan fenotipos extremos, preferentemente no solapantes.

La definición de los criterios de inclusión para las poblaciones rasgo + y rasgo– es un importante aspecto de la presente invención.

Entre los ejemplos típicos de los criterios de inclusión se encuentra una enfermedad que implica a la vía de los leucotrienos tal como el asma, o la evaluación de los niveles de transaminasa en el hígado después del tratamiento con un fármaco anti-asmático tal como el Zileuton. Desde el punto de vista estadístico, si se considera que en una población dada los niveles de transaminasa en el hígado siguen una curva de distribución normalizada, los individuos con fenotipos extremos de acuerdo con el criterio óptimo de inclusión corresponderían respectivamente a aquellos que muestran los niveles de transaminasa en el hígado más bajos y a aquellos que muestran los niveles de transaminasa en el hígado más altos.

La selección de esos fenotipos drásticamente distintos pero relativamente uniformes permite comparaciones eficaces en estudios de asociación y la posible detección de diferencias acusadas a nivel genético, siempre y cuando el tamaño de la muestra de las poblaciones bajo estudio sea significativamente suficiente.

Generalmente, las poblaciones rasgo + y rasgo - a incluir en estudios de asociación tales como los descritos en la presente solicitud, consisten en poblaciones de individuos fenotípicamente homogéneas representando cada uno de ellos el 100% del correspondiente rasgo si la distribución del rasgo es bimodal.

Si la distribución del rasgo es no bimodal, las poblaciones rasgo + y rasgo - consisten en poblaciones fenotípicamente uniformes de individuos que representan entre 1 y 98%, preferentemente entre 1 y 80%, más preferentemente entre 1 y 50%, y lo más preferentemente entre 4 y 35% de la población total bajo estudio, y elegidas entre individuos que muestran los fenotipos extremos del grupo. Cuanto más clara es la diferencia entre los dos fenotipos del rasgo, tanto mayor es la probabilidad de observar una asociación con los marcadores bialélicos.

Un primer grupo de entre 50 y 300 individuos rasgo +, preferentemente aproximadamente 100 individuos, se recluta de acuerdo con criterios clínicos de inclusión basados en 1º) la afección por una o varias enfermedades que implican a la vía de los leucotrienos, preferentemente el asma, 2º) la evidencia de efectos secundarios observados después de la administración de un agente que actúa sobre la vía de los leucotrienos, preferentemente el aumento de los niveles de transaminasa en el hígado después de la administración de Zileuton, o 3º) la evidencia de respuestas particulares al tratamiento con agentes que actúan sobre la vía de los leucotrienos.

En cada caso, se incluye en tales estudios un número similar de individuos negativos al rasgo. Se comprueba en ellos la ausencia de los criterios clínicos definidos anteriormente. Ambos individuos rasgo + y rasgo - deben ser casos no emparentados.

En el contexto de la presente invención, se llevó a cabo un estudio de asociación. El rasgo considerado fue el asma. La recogida de muestras de DNA de los individuos rasgo + y rasgo - se describe en el Ejemplo 5.

2) Genotipado de los individuos rasgo + y rasgo -

Las frecuencias alélicas de los marcadores bialélicos en cada una de las poblaciones anteriormente descritas pueden ser determinadas usando uno de los métodos descritos antes bajo el encabezamiento "Métodos de genotipado de muestras de DNA para marcadores bialélicos". Los análisis se realizan preferentemente en fragmentos amplificados obtenidos mediante PCR genómica realizada en las muestras de DNA de cada individuo en condiciones similares a las descritas anteriormente para la generación de marcadores bialélicos.

En una realización preferida, las muestras de DNA amplificado se someten a reacciones de microsecuenciación automática usando ddNTPs fluorescentes (fluorescencia específica para cada ddNTP) y los apropiados cebadores de microsecuenciación de oligonucleótidos que se hibridan justo secuencia arriba de la base polimórfica. El genotipado se describe con más detalle en el Ejemplo 5.

3) Estudios de asociación de marcador simple y análisis de la frecuencia del haplotipo

Los métodos para determinar la significación estadística de una correlación entre un fenotipo y un genotipo, en este caso un alelo en un marcador bialélico o un haplotipo constituido por tales alelos, pueden determinarse por cualquier prueba estadística conocida en la técnica y con cualquier umbral de significación estadística aceptado que se requiera. La aplicación de métodos y umbrales de significación particulares está dentro de los conocimientos de un profesional experto en la técnica.

La prueba de asociación se realiza determinando la frecuencia de un alelo de marcador bialélico en caso de poblaciones testigo y comparando estas frecuencias con una prueba estadística para determinar si hay una diferencia estadísticamente significativa en la frecuencia que indique una correlación entre el rasgo y el alelo del marcador bialélico bajo estudio. Del mismo modo, se realiza un análisis de haplotipo estimando las frecuencias de todos los haplotipos posibles para un conjunto dado de marcadores bialélicos en poblaciones casos y testigos, y comparando estas frecuencias con una prueba estadística para determinar si hay una correlación estadísticamente significativa entre el haplotipo y el fenotipo (rasgo) bajo estudio. Puede usarse cualquier herramienta estadística útil para probar una asociación estadísticamente significativa entre un genotipo y un fenotipo. Preferentemente la prueba estadística empleada es una prueba de la ji al cuadrado con un grado de libertad. Se calcula un valor P (el valor P es la probabilidad de que ocurra por casualidad una estadística tan grande o mayor que la observada).

En realizaciones preferidas, la significación para fines de diagnóstico, sea como base positiva para otras pruebas de diagnóstico o bien como punto de partida preliminar para una terapia preventiva precoz, el valor p relacionado con una asociación de un marcador bialélico es preferentemente aproximadamente 1 x 10-2, más preferentemente aproximadamente 1 x 10-4 o menos, para un análisis de marcador bialélico único, y aproximadamente 1 x 10-3 o menos, aún más preferentemente 1 x 10-6 o menos y lo más preferentemente de aproximadamente 1 x 10-8 o menos, para un análisis de haplotipo que implica dos o más marcadores. Se cree que estos valores son aplicables a cualquier estudio de asociación que implique combinaciones de marcadores simples o múltiples.

Los expertos en la técnica pueden usar el intervalo de valores expuesto anteriormente como punto de partida con el fin de llevar a cabo estudios de asociación con marcadores bialélicos. Haciéndolo así pueden revelarse asociaciones significativas entre los marcadores bialélicos de la presente invención y una enfermedad en la que interviene la vía de los leucotrienos, y usarse con fines de diagnóstico y de cribado de fármacos.

Para abordar el problema de los falsos positivos pueden realizarse análisis similares con las mismas poblaciones de casos-testigos en regiones genómicas al azar. Los resultados en regiones al azar y la región candidata se comparan como se describe en una solicitud de patente provisional de EE.UU. pendiente en común con la presente, titulada "Methods, Software And Apparati For Identifying Genomic Regions Harboring A Gene Associated With A Detectable Trait" (Métodos, software y aparatos para identificar regiones genómicas que albergan un gen asociado con un rasgo detectable), número de serie de EE.UU. 60/107.986, presentada el 10 de Noviembre de 1998.

Asociación de marcador único

Los estudios de asociación se realizan normalmente en dos etapas sucesivas. En una primera fase, las frecuencias de un número reducido de marcadores bialélicos, normalmente entre 2 y 10 marcadores, se determinan en las poblaciones rasgo + y rasgo -. En una segunda parte del análisis, la posición de los loci genéticos responsables del rasgo dado se refina más usando un conjunto de marcadores de densidad más alta. Sin embargo, si el gen candidato bajo estudio es de longitud relativamente corta, como es el caso del gen FLAP, se cree que es suficiente una sola fase para establecer asociaciones significativas.

En una realización preferida en la que se encontró una correlación entre un conjunto de marcadores bialélicos del gen FLAP y el asma, los resultados de la primera etapa del estudio de asociación, del que se proporcionan más detalles en el Ejemplo 7, parecen indicar que el asma está asociado, lo más intensamente, con el marcador bialélico A19 (10-35/390, alelo T). Más detalles concernientes a estas asociaciones se proporcionan en el Ejemplo 7.

También pueden llevarse a cabo estudios de asociación similares con otros marcadores bialélicos, preferentemente con marcadores bialélicos en desequilibrio de unión con los marcadores asociados con el asma, incluyendo los marcadores bialélicos A1 a A28.

Estudios de asociación similares pueden llevarse a cabo de forma rutinaria por un experto en la técnica usando los marcadores bialélicos que se definen anteriormente con diferentes poblaciones rasgo + y rasgo -. Otros ejemplos adecuados de posibles estudios de asociación usando marcadores bialélicos del gen FLAP, incluyendo los marcadores bialélicos A1 a A28, implican estudios en las poblaciones siguientes:

-

una población rasgo + que padece una enfermedad en la que interviene la vía de los leucotrienos y una población no afectada sana; o

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una población rasgo + tratada con agentes que actúan sobre la vía de los leucotrienos, que padece efectos secundarios resultantes del tratamiento y una población rasgo - tratada con los mismos agentes sin ningún efecto secundario; o

-

una población rasgo + tratada con agentes que actúan sobre la vía de los leucotrienos y que muestra una respuesta beneficiosa y una población rasgo - tratada con los mismos agentes sin ninguna respuesta beneficiosa.

Análisis de la frecuencia del haplotipo

Un análisis de haplotipo es interesente por cuanto aumenta la significación estadística de un análisis que implica marcadores individuales. En realidad, combinando la capacidad de información de un conjunto de marcadores bialélicos, incrementa el valor de los resultados obtenidos mediante análisis de asociación, permitiendo eliminar los datos de falsos positivos y/o negativos que pueden resultar de los estudios con el marcador único.

En una primera etapa de un análisis de frecuencia de haplotipo, se determina la frecuencia de los posibles haplotipos basándose en varias combinaciones de los marcadores bialélicos de la presente invención identificados, y se comparan para distintas poblaciones de individuos rasgo + y rasgo -. El número de individuos rasgo + que deben ser sometidos a este análisis para obtener resultados estadísticamente significativos está normalmente en el intervalo entre 30 y 300, estando un número preferido de individuos en el intervalo entre 50 y 150. Las mismas consideraciones son válidas para el número de testigos no afectados usados en el estudio.

Los resultados de este primer análisis proporcionan frecuencias de haplotipo para los individuos rasgo + y rasgo + analizados, y el valor de p estimado para cada haplotipo evaluado.

En la asociación de los marcadores bialélicos del gen FLAP con el asma, se demostró también que varios haplotipos eran importantes (véase la Figura 3). Por ejemplo, los haplotipos preferidos comprenden el alelo T del marcador bialélico A19 (10-35/390). El haplotipo más preferido (HAP 1 de la Figura 3) comprende el alelo A del marcador A14 (10-33/234) y el alelo T del marcador A19 (10-35/390). Se considera que este haplotipo es altamente significativo de una asociación con el asma. Los otros haplotipos significativos se detallan en el Ejemplo 8.

Para confirmar la significación estadística del análisis de haplotipo de primera etapa descrita antes, podría ser adecuado realizar más análisis en los que los datos del genotipado de individuos de casos-testigos se agrupan y se aleatorizan con respecto al fenotipo del rasgo. Cada dato de genotipado individual se asigna al azar a dos grupos, que contienen el mismo número de individuos que las poblaciones de casos y testigos usado para compilar los datos obtenidos en la primera etapa. Preferentemente se realiza un análisis del haplotipo de segunda etapa en estos grupos artificiales, preferentemente para los marcadores incluidos en el haplotipo en el análisis de primera etapa que muestra los coeficientes de riesgo relativo más altos. Este procedimiento se reitera preferentemente al menos entre 100 y 10000 veces. Las repetidas reiteraciones permiten la determinación de la probabilidad de obtener por casualidad el haplotipo probado.

Para la asociación entre el asma y los tres haplotipos considerados, se reiteró 1000 veces o 10000 veces un análisis de haplotipo aleatorizado, y los resultados se muestran en la Figura 4. Estos resultados demuestran que entre 1000 iteraciones ninguno, y entre 10.000 iteraciones solamente 1 de los haplotipos obtenidos tenía un valor de p comparable al obtenido para el haplotipo HAPI. Estos resultados validan claramente la significación estadística de la asociación entre este haplotipo y el asma.

Usando el método descrito anteriormente y evaluando las asociaciones para marcadores de alelos simples o para haplotipos, se permite una estimación del riesgo que un portador correspondiente tiene de desarrollar un rasgo dado, y, en particular en el contexto de la presente invención, una enfermedad, preferentemente una enfermedad en la que interviene la vía de los leucotrienos, más preferentemente el asma. Los umbrales de significación de riesgos relativos se han de adaptar a la población de muestras de referencia usada. La evaluación de los factores de riesgo se detalla en "Métodos estadísticos".

Desde luego, los profesionales expertos en el tratamiento de enfermedades que implican a la vía de los leucotrienos listadas anteriormente, y en particular el asma, entenderán que la presente invención no pretende proporcionar una identificación absoluta de los individuos que podrían estar en riesgo de desarrollar una enfermedad en particular, en la que interviene la vía de los leucotrienos, o quién responderá o no responderá o manifestará efectos secundarios al

5 tratamiento con agentes que actúan sobre la vía de los leucotrienos, sino más bien indicar un cierto grado o probabilidad de desarrollar una enfermedad o de observar en un individuo dado una respuesta o un efecto secundario al tratamiento con dichos agentes.

Sin embargo, esta información es extremadamente valiosa ya que, en ciertas circunstancias, puede ser usada para iniciar tratamientos preventivos o para permitir que un individuo que porta un haplotipo significativo tenga previstos signos de aviso tales como síntomas menores. En enfermedades tales como el asma, en las que los ataques pueden ser extremadamente violentos y a veces fatales si no se tratan a tiempo, el conocimiento de una predisposición potencial, incluso aunque esta predisposición no sea absoluta, podría contribuir de una manera muy significativa a la eficacia del tratamiento. Del mismo modo, una predisposición diagnosticada para un potencial efecto secundario podría dirigir al médico de forma inmediata hacia un tratamiento para el que tales efectos secundarios no hayan sido

15 observados durante estudios clínicos.

X. Métodos estadísticos

En general, puede usarse cualquier método conocido en la técnica para probar si un rasgo y un genotipo muestran una correlación estadísticamente significativa.

1) Métodos para estimar frecuencias de haplotipos en una población

La fase gamética de haplotipos se desconoce cuando los individuos diploides son heterocigóticos en más de un locus. Usando información genealógica en familias, la fase gamética puede ser deducida algunas veces (Perlin et al., 1994). Cuando no se dispone de información genealógica, pueden usarse distintas estrategias. Una posibilidad es que los diploides heterocigóticos en sitios múltiples pueden ser eliminados del análisis, pero este planteamiento podría conducir a una posible parcialidad en la composición de la muestra y a la subestimación de haplotipos de 25 baja frecuencia. Otra posibilidad es que los cromosomas simples puedan ser estudiados independientemente, por ejemplo por amplificación por PCR asimétrica (véanse Newton et al., 1989; Wu et al., 1989) o mediante el aislamiento del cromosoma simple por dilución límite seguido por amplificación mediante PCR (véase Ruano et al., 1990). Además, una muestra puede ser haplotipada para marcadores bialélicos suficientemente próximos mediante amplificación por PCR doble de alelos específicos (Sarker, G. y Sommer, S. S., 1991). Estos planteamientos no son enteramente satisfactorios, bien sea a causa de su complejidad técnica, del coste adicional que entrañan, de su falta de generalización a gran escala, o bien de las posibles parcialidades o sesgos que introducen. Para obviar estas dificultades puede usarse un algoritmo para deducir la fase de genotipos de DNA amplificado por PCR introducido por Clark, A. G. (1990). De forma abreviada, el principio es comenzar rellenando una lista preliminar de haplotipos presentes en la muestra examinando individuos no ambiguos, esto es, los homocigotos completos y los heterocigotos 35 de sitio único. Después se criban otros individuos de la misma muestra en relación con la posible aparición de haplotipos previamente reconocidos. Para cada identificación positiva, se añade el haplotipo complementario a la lista de haplotipos reconocidos, hasta que la información de fase para todos los individuos es resuelta o bien identificada como no resuelta. Este método asigna un único haplotipo a cada individuo multiheterocigótico, mientras que varios haplotipos son posibles cuando hay más de un sitio heterocigótico. Alternativamente, se pueden usar métodos que estimar frecuencias de haplotipos en una población sin asignar haplotipos a cada individuo. Preferentemente, se usa un método basado en un algoritmo de expectación-maximización (EM) (Dempster et al., 1977) que conduce a estimaciones de máxima probabilidad de frecuencias de haplotipos bajo el supuesto de las proporciones de Hardy-Weinberg (apareamiento al azar o "random mating") (véase Excoffier L. y Slatkin M., 1995). El algoritmo de EM es un método de estimación de máxima probabilidad iterativo generalizado, que es útil cuando los datos son ambiguos y/o

45 incompletos. El algoritmo EM se usa para resolver heterocigotos en haplotipos. El algoritmo EM puede aplicarse usando por ejemplo el programa EM-HAPLO (Hawley M. E. et al., 1994) o el programa Arlequin (Schneider et al., 1997). Puede usarse cualquier otro método conocido en la técnica para determinar o estimar la frecuencia de un haplotipo en una población (véanse Lange K., 1997; Weir, B. S., 1996). El algoritmo EM se describe brevemente más adelante.

Una muestra de N individuos no emparentados es tipada en relación con K marcadores. Los datos observados son los fenotipos de K locus de fase desconocida que pueden ser categorizados en F fenotipos diferentes. Supongamos que se tienen H posibles haplotipos subyacentes (en el caso de K marcadores bialélicos, H = 2K).

Para el fenotipo j, supongamos que son posibles cj genotipos. Se tiene entonces la siguiente ecuación:

Ecuación 1

en la que Pj es la probabilidad del fenotipo j, hk y hl son los dos haplotipos que constituyen el genotipo i. Bajo el equilibrio de Hardy-Weinberg, pr(hk,hl) queda:

Ecuación 2

5 Las etapas sucesivas del algoritmo E-M pueden describirse la forma siguiente:

(0)(0)

Partiendo de valores iniciales de las frecuencias de haplotipos, representadas por p1, p2, ... pH(0), estos valores iniciales sirven para estimar las frecuencias de genotipos (etapa de Expectación) y después estimar otro conjunto de

(1)(1)

frecuencias de haplotipos (etapa de maximización), representadas por p1, p2, ... pH(1), estas dos etapas se iteran hasta que los cambios en los conjuntos de frecuencias de haplotipos son muy pequeños.

10 Un criterio de parada puede ser que la máxima diferencia entre frecuencias de haplotipos entre dos iteraciones sea menor que 10-7. Estos valores pueden ajustarse de acuerdo con la precisión de las estimaciones que se desee.

A una iteración dada s, la etapa de Expectación consiste en calcular las frecuencias de genotipos mediante la ecuación siguiente:

Ecuación 3

en la que el genotipo i aparece en el fenotipo j, y en donde hk y hi constituyen el genotipo i. Cada probabilidad se deriva de acuerdo con la ec. 1 y la ec. 2 descritas anteriormente.

Después la etapa de Maximización simplemente estima otro conjunto de frecuencias de haplotipos dadas las frecuencias de genotipos. Este planteamiento se conoce también como método de recuento de genes (Smith, 1957).

Ecuación 4

en donde Oit es in indicador variable que cuenta el número de veces del haplotipo t en el genotipo i. Toma los valores de 0, 1 ó 2. Para asegurar que la estimación finalmente obtenida es la estimación de máxima probabilidad se requieren algunos

25 valores de partidas. Se comparan las estimaciones obtenidas y si son diferentes se mantienen las estimaciones que conducen a la mejor probabilidad.

2) Métodos para calcular el desequilibrio de unión entre marcadores Pueden usarse varios métodos para calcular el desequilibrio de unión entre dos posiciones genéticas cualquiera, en la práctica el desequilibrio de unión se mide aplicando una prueba estadística de asociación a datos de haplotipos

30 tomados de una población. El desequilibrio de unión entre cualquier par de marcadores bialélicos que comprenden al menos uno de los marcadores bialélicos de la presente invención (Mi, Mj) que tiene los alelos (ai/bi) en el marcador Mi y los alelos (aj/bj) en el marcador Mj, puede ser calculado para cada combinación de alelos (ai,aj; ai,bj; bi,aj y bi,bj), de acuerdo con la fórmula de Piazza:

35 Laiaj = >84 - >(84 + 83) (84 + 82) en la que: 84 = - - = frecuencia de genotipos que no tienen alelo ai en Mi y que no tienen alelo aj en Mj 83 = - + = frecuencia de genotipos que no tienen alelo ai en Mi y que tienen alelo aj en Mj 82 = + - = frecuencia de genotipos que tienen alelo ai en Mi y que no tienen alelo aj en Mj.

El desequilibrio de unión (LD) entre pares de marcadores bialélicos (Mi, Mj) puede calcularse también para cada combinación de alelos (ai,aj; ai,bj; bi,aj y bi,bj), de acuerdo con la estimación de máxima probabilidad (MLE: Maximun Likelihood Estimate) para delta (el coeficiente de desequilibrio genotípico compuesto), como describe Weir (Weir B. S., 1996). La MLE para el desequilibrio genotípico compuesto es:

Daiaj = (2n1 + n2 + n3 + n4/2)/N - 2(pr(ai). Pr(aj))

en donde n1 = L fenotipo (ai/ai, aj/aj), n2 = L fenotipo (ai/ai, aj/bj), n3 = L fenotipo (ai/bi, aj/aj), n4 = L fenotipo (ai/bi, aj/bi), y N es el número de individuos en la muestra.

Esta fórmula permite estimar el desequilibrio de unión entre alelos cuando solamente se dispone de datos del genotipo y no del haplotipo.

Otro medio de calcular el desequilibrio de unión entre marcadores es el siguiente. Para una pareja de marcadores bialélicos, Mi(ai/bi) y Mj(aj/bj), que cumple el equilibrio de Hardy-Weinberg, se pueden estimar las cuatro posibles frecuencias de haplotipos en una población dada de acuerdo con el planteamiento descrito anteriormente.

La estimación del desequilibrio gamético entre ai y aj es simplemente:

en donde pr(ai) es la probabilidad del alelo ai y pr(aj) es la probabilidad del alelo aj, y en donde pr(haplotype ai, aj) se estima como en la Ecuación 3 anterior.

Para una pareja de marcadores bialélicos solamente es necesaria una medida del desequilibrio para describir la asociación entre Mi y Mj.

Después se calcula un valor normalizado de lo anterior de la forma siguiente:

Un profesional experimentado apreciará fácilmente que pueden usarse otros métodos de cálculo del desequilibrio de unión.

El desequilibrio de unión entre un conjunto de marcadores bialélicos que tiene una tasa de heterocigosidad adecuada puede determinarse genotipando entre 50 y 1000 individuos no relacionados, preferentemente entre 75 y 200, más preferentemente aproximadamente 100.

3) Evaluación de factores de riesgo

La asociación entre un factor de riesgo (en epidemiología genética es factor de riesgo es la presencia o la ausencia de un cierto alelo o haplotipo en los loci del marcador) y una enfermedad se mide por la "razón de posibilidades" ("odds ratio" OR) y por el riesgo relativo (RR). Si P(R+) es la probabilidad de desarrollar la enfermedad por individuos con R, y P(R-) es la probabilidad para individuos sin el factor de riesgo, entonces el riesgo relativo es simplemente la relación de las dos probabilidades, esto es:

RR = P(R+)/P(R-)

En estudios de casos y testigos no pueden obtenerse medidas directas del riesgo relativo debido al diseño del muestreo. Sin embargo, la razón de posibilidades permite una buena aproximación del riesgo relativo para enfermedades de baja incidencia, y puede calcularse:

OR = (F+/(1–F+))/(F-/(1–F-))

F+ es la frecuencia de la exposición al factor de riesgo en los casos y F- es la frecuencia de exposición al factor de riesgo en los testigos. F+ y F- se calculan usando las frecuencias alélica o de haplotipo del estudio y dependen además del modelo genético subyacente (dominante, recesivo, aditivo,...).

Se puede además estimar el riesgo atribuible (AR) que describe la proporción de individuos de una población que muestran un rasgo debido a un factor de riesgo dado. Esta medida es importante para cuantificar el papel de un factor específico en la etiología de la enfermedad y en términos del impacto de un factor de riesgo en la salud pública. La relevancia de esta medida en la salud pública está en la estimación de la proporción de casos de enfermedad en la población que podrían evitarse si la exposición de interés estuviese ausente. AR se determina como sigue:

AR = PE (RR-1) / (PE (RR-1) + 1)

AR es el riesgo atribuible a un alelo del marcador bialélico o a un haplotipo del marcador bialélico. PE es la frecuen

cia de exposición a un alelo o un haplotipo dentro de la población en general; y RR es el riesgo relativo que es aproximado con la razón de posibilidades (odds ratio) cuando el rasgo bajo estudio tiene una incidencia relativamente baja en la población general.

XI. Identificación de marcadores bialélicos en desequilibrio de unión con los marcadores bialélicos de la presente invención

Una vez que se ha identificado un primer marcador bialélico en una región genómica de interés, un profesional con una experiencia normal en la técnica, usando las enseñanzas de la presente invención, puede identificar fácilmente otros marcadores bialélicos en desequilibrio de unión con este primer marcador. Como se mencionó antes, cualquier marcador en desequilibrio de unión con un primer marcador asociado con un rasgo estará asociado con el rasgo. Por consiguiente, una vez que se ha demostrado una asociación entre un marcador bialélico dado y un rasgo, el descubrimiento de marcadores bialélicos adicionales asociados con este rasgo es de gran interés con el fin de aumentar la densidad de marcadores bialélicos en esta región en particular. El gen causal o mutación se encontrará en las proximidades del marcador o conjunto de marcadores que muestran la correlación más alta con el rasgo.

Se describe también un método para la identificación y caracterización de un marcador bialélico en desequilibrio de unión con un marcador bialélico de un gen FLAP, preferentemente un marcador bialélico de un gen FLAP del que un alelo está asociado con un rasgo. En una realización, el marcador bialélico en desequilibrio de unión con un marcador bialélico del gen FLAP está en la región genómica que alberga el gen FLAP, pero fuera del propio gen FLAP. En otra realización, el marcador bialélico en desequilibrio de unión con un marcador bialélico del gen FLAP está situado él mismo dentro del gen FLAP. El método comprende las siguientes etapas: a) amplificar un fragmento genómico que comprende un primer marcador bialélico procedente de una diversidad de individuos; b) identificar segundos marcadores bialélicos en la región genómica que alberga al primer marcador bialélico; c) realizar un análisis de desequilibrio de unión entre dicho primer marcador bialélico y dichos segundos marcadores bialélicos; y d) seleccionar dichos segundos marcadores bialélicos en desequilibrio de unión con dicho primer marcador.

En una realización, la etapa de secuenciación e identificación de segundos marcadores bialélicos comprende secuenciar segundos marcadores bialélicos dentro del gen FLAP. En otra realización, la etapa de secuenciación e identificación de segundos marcadores bialélicos comprende secuenciar segundos marcadores bialélicos dentro de la región amplificada del gen FLAP.

Una vez identificadas, las secuencias en desequilibrio de unión con un marcador bialélico del gen FLAP pueden ser usadas en cualquiera de los métodos descritos en el presente texto, incluyendo métodos para determinar una asociación entre un marcador bialélico y un rasgo, métodos para identificar individuos que tienen una predisposición por un rasgo, métodos de tratamiento de la enfermedad, métodos para identificar individuos que probablemente respondan positivamente o negativamente al tratamiento con un fármaco, y métodos para usar fármacos. En particular, los marcadores bialélicos en desequilibrio de unión con un marcador bialélico en el gen FLAP pueden usarse para identificar individuos que tienen una predisposición al asma o a respuestas positivas o negativas al tratamiento con fármacos anti-asma, tales como el Zileuton.

Los métodos para identificar marcadores bialélicos y para realizar análisis de desequilibrio de unión se describen en el presente texto en "Métodos estadísticos", y pueden llevarse a cabo por un profesional experto sin una experimentación excesiva. Se describen marcadores bialélicos que están en desequilibrio de unión con los marcadores bialélicos específicos A1 a A28 y que se espera que presenten características similares en términos de su asociación respectiva con un rasgo dado.

XII. Identificación de mutaciones causantes de un rasgo en el gen FLAP

Las mutaciones en el gen FLAP que son responsables de un fenotipo detectable pueden ser identificadas comparando las secuencias de los genes FLAP de individuos rasgo-positivos y rasgo-negativos. Preferentemente, los individuos rasgo + a secuenciar portan el haplotipo que se ha demostrado que está asociado con el rasgo, y los individuos rasgo - a secuenciar no portan el haplotipo asociado con el rasgo. El fenotipo detectable puede comprender una diversidad de manifestaciones de la función de FLAP alterada, incluyendo una enfermedad en la que interviene la vía de los leucotrienos, una respuesta a un agente que actúa sobre la vía de los leucotrienos, o efectos secundarios ligados a un tratamiento con este agente. Las mutaciones pueden comprender mutaciones puntuales, deleciones o inserciones en el gen FLAP. Las mutaciones pueden estar dentro de la secuencia de codificación de la proteína FLAP o dentro de regiones reguladoras en el gen FLAP.

El método usado para detectar tales mutaciones generalmente comprende las etapas siguientes: a) amplificación de una región del gen FLAP que comprende un marcador bialélico o un grupo de marcadores bialélicos asociados con el rasgo a partir de muestras de DNA de pacientes rasgo positivos y testigos rasgo negativos; b) secuenciación de la región amplificada; c) comparación de secuencias de DNA procedentes de pacientes rasgo-positivos y testigos rasgo-negativos; y d) determinación de mutaciones específicas para pacientes rasgo-positivos.

Se construyen cebadores de oligonucleótidos como se describió anteriormente para amplificar las secuencias de cada uno de los exones, intrones o la región promotora del gen FLAP.

Cada par de cebadores se usa para amplificar el exón o la región promotora del que se ha derivado. La amplificación se lleva a cabo en muestras de DNA genómico procedentes de paciente rasgo positivos y testigos rasgo negativos, preferentemente usando las condiciones de PCR descritas en los ejemplos. Los productos de la amplificación de las PCRs genómicas se someten después a secuenciación, preferentemente mediante reacciones automáticas de secuenciación con terminador didesoxi, y a electroforesis, preferentemente en secuenciadores ABI 377. Después del análisis de imágenes del gel y la extracción de la secuencia de DNA, los datos de secuencia ABI se analizan automáticamente para detectar la presencia de variaciones de secuencia entre individuos rasgo positivos y rasgo negativos. Las secuencias se comprueban determinando las secuencias de ambas hebras de DNA para cada individuo.

Los polimorfismos candidatos, sospechosos de ser responsables del fenotipo detectable, tal como una enfermedad, una respuesta beneficiosa a un agente que actúa sobre la vía de los leucotrienos, o efectos secundarios ligados a un tratamiento con este agente, se comprueban después cribando una población mayor de individuos rasgo positivos y rasgo negativos usando técnicas de análisis de polimorfismo, tales como las técnicas descritas anteriormente. Los polimorfismos que muestran una correlación estadísticamente significativa con el fenotipo detectable se consideran responsables del fenotipo detectable.

La mayoría de los polimorfismos bialélicos del gen FLAP observados en el contexto de la presente invención, no parecen modificar drásticamente la secuencia de aminoácidos de la proteína FLAP. Tampoco parecen estar situados en secuencias de ayuste. Sin embargo, puede ser asociados con cambios en la expresión básica de FLAP en uno o más tejidos. Tales polimorfismos pueden eventualmente modificar la velocidad de transcripción del DNA de FLAP, la estabilidad del mRNA de FLAP o la velocidad de traducción del mRNA de FLAP.

Los polimorfismos bialélicos pueden también asociarse con cambios en la modulación de la expresión de FLAP a través de modificadores de la expresión. Se entiende que el concepto de "modificador de la expresión" comprende agentes químicos que modulan la acción de FLAP a través de la modulación de la expresión del gen FLAP.

Los niveles básicos de expresión de FLAP en diferentes tejidos pueden ser determinados por análisis de muestras de tejido procedentes de individuos tipados en cuanto a la presencia o ausencia de un polimorfismo específico. Puede usarse cualquier método conveniente tal como el ELISA o RIA para la cuantificación de proteína, y tal como transferencia Northern u otros análisis de hibridación, y RT-PCR cuantitativa para la cuantificación del mRNA. La expresión específica del tejido puede entonces correlacionarse con el genotipo. Más adelante se proporcionan más detalles sobre algunos de estos métodos, bajo el encabezamiento "Cribado de agentes".

Además, la fuerte asociación observada por primera vez entre el gen FLAP y el asma confirma la necesidad de situar y estudiar cualquier mutación del gen FLAP ya que tal mutación es susceptible de tener una incidencia sobre el metabolismo de los leucotrienos y por tanto sobre las elecciones terapéuticas hechas cuando se consideran varias alternativas de tratamiento para un individuo con una condición particular en la que interviene la vía de los leucotrienos.

Hay muchas posibilidades de mutaciones causales dentro del gen FLAP. Una de las mutaciones causales puede ser un cambio de aminoácido en la proteína FLAP, que puede conducir a alteraciones de la especificidad y/o de la actividad del sustrato de FLAP. Los métodos para analizar interacciones proteína-proteína o proteína-ligando se detallan más adelante bajo el encabezamiento "Cribado de agentes".

Otra posible mutación causal del gen FLAP es una modificación en su región reguladora, y en particular en la secuencia de su promotor nativo. Este tipo de mutación puede estudiarse a través de la determinación de los niveles básicos de expresión mediante ensayos de expresión para la secuencia promotora en particular. Los ensayos pueden realizarse con la secuencia codificadora de FLAP o con una secuencia de marcador detectable. Para determinar la especificidad del tejido, el ensayo se realiza en células procedentes de distintas fuentes. Algunos métodos se discuten más adelante con mayor detalle, bajo el encabezamiento "Cribado de agentes".

Cuando se usa en el presente texto, se pretende que la frase "niveles básicos de expresión" designe niveles de expresión de FLAP normalmente observados en individuos que no llevan el alelo o marcadores bialélicos asociados de la presente invención.

En otra realización el alelo de FLAP mutante que causa un fenotipo detectable puede ser aislado obteniendo una muestra de ácido nucleico, tal como de una genoteca o una librería de cDNA, de un individuo que expresa el fenotipo detectable. La muestra de ácido nucleico puede ponerse en contacto con una o más sondas que están en la región del gen FLAP en la que el marcador bialélico o grupo de marcadores bialélicos asociados, o con cebadores tipables por PCR específicos para la amplificación de este marcador bialélico o grupo de marcadores bialélicos. La mutación puede ser identificada realizando reacciones de secuenciación en los ácidos nucleicos que se hibridan con las sondas definidas en el presente texto o que muestran amplificación por PCR. La región del gen FLAP que contiene la mutación responsable del fenotipo detectable puede usarse en técnicas de diagnóstico tales como las descritas más adelante. Por ejemplo, pueden usarse oligonucleótidos de microsecuenciación, u oligonucleótidos que contienen la mutación responsable del fenotipo detectable para amplificación o diagnósticos basados en la hibridación, tales como los descritos en el presente texto, para detectar individuos que padecen del fenotipo detectable o individuos en riesgo de desarrollar más adelante el fenotipo detectable. Además, el alelo de FLAP responsable del fenotipo detectable puede ser usado en terapia génica. El alelo de FLAP responsable del fenotipo detectable puede también ser clonado en un vector de expresión para expresar la proteína FLAP mutante, como se describe en el presente texto.

XIII. Marcadores bialélicos en métodos de diagnóstico genético

Los marcadores bialélicos descritos en la presente invención pueden ser usados para desarrollar pruebas diagnósticas capaces de identificar individuos que expresan un rasgo detectable como resultado de un genotipo específico, o individuos cuyo genotipo les pone en riesgo de desarrollar un rasgo detectable más adelante. El rasgo analizado usando los presentes diagnósticos es asma, una respuesta beneficiosa al tratamiento con agentes que actúan sobre el asma, o efectos secundarios relacionados con el tratamiento con agentes que actúan sobre el asma.

Las técnicas de diagnóstico pueden emplear una diversidad de metodologías para determinar si un sujeto tiene un patrón de marcador bialélico asociado a un aumento del riesgo de desarrollar un rasgo detectable, o si el individuo padece de un rasgo detectable como resultado de una mutación particular, incluyendo métodos que permiten el análisis de cromosomas individuales por haplotipado, tales como estudios de familias, análisis de DNA de esperma individual o híbridos somáticos.

La presente invención describe métodos de diagnóstico para determinar si un individuo corre el riesgo de desarrollar una enfermedad o padece una enfermedad resultante de una mutación o un polimorfismo en el gen FLAP. La presente invención describe también métodos para determinar si es probable que un individuo responda positivamente a un agente que actúa sobre el asma, o si un individuo corre el riesgo de desarrollar un efecto secundario adverso a un agente que actúa sobre el asma.

Estos métodos implican obtener una muestra de ácido nucleico del individuo y determinar si la muestra de ácido nucleico contiene al menos un alelo o al menos un haplotipo del marcador bialélico, indicativo de un riesgo de desarrollar la enfermedad o indicativo de que el individuo expresa el rasgo como resultado de poseer un polimorfismo o mutación de FLAP en particular (alelo causante del rasgo).

Preferentemente, en tales métodos de diagnóstico se obtiene del individuo una muestra de ácido nucleico, y esta muestra se genotipa usando métodos descritos anteriormente en VIII. El diagnóstico puede basarse en un único marcador bialélico o en un grupo de marcadores bialélicos.

En cada uno de estos métodos, se obtiene del sujeto de ensayo una muestra de ácido nucleico y se determina el patrón de marcador bialélico de uno o más de los marcadores bialélicos A1 a A28, o los complementos de los mismos.

En una realización, se realiza una amplificación por PCR sobre la muestra de ácido nucleico, para amplificar regiones en las que han sido identificados polimorfismos asociados con un fenotipo detectable. Los productos de la amplificación se secuencian para determinar si el individuo posee uno o más polimorfismos de FLAP asociados con un fenotipo detectable. Los cebadores usados para generar productos de amplificación pueden comprender los cebadores B1 a B17 y C1 a C17. Alternativamente, la muestra de ácido nucleico se somete a reacciones de microsecuenciación como se describieron anteriormente, para determinar si el individuo posee uno o más polimorfismos de FLAP asociados con un fenotipo detectable que resulta de una mutación o un polimorfismo en el gen FLAP. Los cebadores usados en las reacciones de microsecuenciación pueden incluir los cebadores D1 a D28 y E1 a E28. En otra realización, la muestra de ácido nucleico se pone en contacto con una o más sondas de oligonucleótido específicas del alelo que se hibridan específicamente con uno o más alelos de FLAP asociados con un fenotipo detectable. Las sondas usadas en el ensayo de hibridación pueden incluir las sondas P1 a P28, una secuencia complementaria de las mismas, o un fragmento de las mismas que comprende la base polimórfica. En otra realización, la muestra de ácido nucleico se pone en contacto con un segundo oligonucleótido de FLAP capaz de producir un producto de amplificación cuando se usa con el oligonucleótido específico del alelo en una reacción de amplificación. La presencia de un producto de amplificación en la reacción de amplificación indica que el individuo posee uno o más alelos de FLAP asociados con un fenotipo detectable.

En una realización preferida, se determina la identidad del nucleótido presente en al menos un marcador bialélico elegido entre el grupo consistente en A2, A14, A16, A18, A19, A22 y A23, y los complementos de los mismos, y el rasgo detectable es el asma. En otra realización preferida se determina la identidad del nucleótido presente en al menos uno de los sitios polimórficos elegidos entre el grupo consistente en A14 y A19, y los complementos de los mismos. En una realización más preferida se determina la identidad del nucleótido presente en el sitio polimórfico A19, y los complementos del mismo. También se describen en la presente invención kits de diagnóstico que comprenden polinucleótidos de la presente invención.

Estos métodos de diagnóstico son extremadamente valiosos ya que, en ciertas circunstancias, pueden ser usados para iniciar tratamientos preventivos o para permitir que un individuo que porta un haplotipo significativo tenga previstos signos de advertencia tales como síntomas menores. En enfermedades en las que los ataques pueden ser extremadamente violentos y a veces fatales si no se tratan a tiempo, tales como el asma, el conocimiento de una predisposición potencial, incluso aunque esta predisposición no sea absoluta, podría contribuir de una manera muy significativa a la eficacia del tratamiento.

La presente invención describe también kits de diagnóstico que comprenden uno o más polinucleótidos de la presente invención con una parte o la totalidad de los reactivos e instrucciones que se necesitan para genotipar un sujeto de ensayo determinando la identidad de un nucleótido en un marcador bialélico relacionado con FLAP que está asociado con el asma. Los polinucleótidos de un kit pueden estar opcionalmente fijados a un soporte sólido, o pueden formar parte de una matriz o una matriz dirigible de polinucleótidos. El kit puede proporcionar la determinación de la identidad del nucleótido que está en una posición del marcador por cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a ellos, un método de ensayo de secuenciación, un método de ensayo de microsecuenciación, un método de ensayo de hibridación, o un método de ensayo de discordancias basado en polimerasas y/o ligasas. Los kits de diagnóstico pueden ser fabricados para realizar cualquiera de los métodos de genotipado descritos en la actual solicitud, usando métodos de fabricación y formulación conocidos comúnmente en la técnica. Preferentemente tal kit puede proporcionar la determinación del alelo de un marcador bialélico elegido entre marcadores bialélicos relacionados con FLAP que están asociados con el asma. Opcionalmente tal kit puede incluir instrucciones para puntuar los resultados de la determinación con respecto al riesgo del sujeto de ensayo de contraer asma, una respuesta beneficiosa al tratamiento con agentes que actúan sobre el asma, o efectos secundarios relacionados con el tratamiento con agentes que actúan sobre el asma.

XIV. Tratamiento de enfermedades que implican a la vía de los leucotrienos

La presente invención describe también un método para determinar si es probable que un sujeto responda positivamente al tratamiento con un medicamento que actúa directa o indirectamente sobre el asma.

El método comprende identificar una primera población de individuos que responden positivamente a dicho medicamento y una segunda población de individuos que responden negativamente a dicho medicamento. Se identifican uno o más marcadores bialélicos en la primera población, que están asociados con una respuesta positiva a dicho medicamento o se identifican uno o más marcadores bialélicos en la segunda población, que están asociados con una respuesta negativa a dicho medicamento. Los marcadores bialélicos pueden ser identificados usando las técnicas descritas en el presente texto.

La muestra de DNA se obtiene entonces del sujeto de ensayo. La muestra de DNA se analiza para determinar si comprende uno o más alelos de marcadores bialélicos asociados con una respuesta positiva a un medicamento o uno o más alelos de marcadores bialélicos asociados con una respuesta negativa al tratamiento con el medicamento. En algunas realizaciones, la muestra de DNA se analiza para identificar sujetos cuyo DNA comprende uno o más alelos de marcadores bialélicos asociados con una respuesta positiva al medicamento y cuyo DNA carece de uno o más alelos de marcadores bialélicos asociados con una respuesta negativa al tratamiento con el medicamento.

En otras realizaciones, se administra el medicamento al sujeto en un estudio clínico si la muestra de DNA contiene uno o más alelos de marcadores bialélicos asociados con la respuesta positiva al medicamento, y/o si la muestra de DNA carece de uno o más alelos de marcadores bialélicos asociados con una respuesta negativa al tratamiento con el medicamento. En realizaciones preferidas, el medicamento es un fármaco contra el asma tal como el Zileuton. En otras realizaciones, la respuesta negativa comprende uno o más efectos secundarios tales como el aumento de los niveles de transaminasa en el hígado. Usando los métodos descritos en la presente invención, la evaluación de la eficacia del fármaco puede ser realizada en una población de individuos que probablemente respondan favorablemente al medicamento.

La presente invención describe también un método para la prueba clínica de un medicamento que actúa directa o indirectamente sobre el asma. El método comprende las etapas siguientes: a) administrar un medicamento capaz de actuar directa o indirectamente sobre el asma a una población heterogénea de individuos; b) identificar una primera población de individuos que responden positivamente a dicho medicamento, y una segunda población de individuos que responden negativamente a dicho medicamento; c) identificar marcadores bialélicos en dicha primera población, que están asociados con una respuesta negativa a dicho medicamento; d) seleccionar los individuos cuyo DNA comprende uno o más alelos de marcadores bialélicos asociados con una respuesta positiva a dicho medicamento y/o aquellos cuyo DNA carece de uno o más alelos de marcadores bialélicos asociados con una respuesta negativa a dicho medicamento; y d) administrar dicho medicamento a dichos individuos.

Se considera que tales métodos son extremadamente útiles para aumentar la relación beneficio/riesgo resultante de la administración de medicamentos que pueden producir efectos secundarios no deseables y/o ser ineficaces para una parte de la población de pacientes a los que se administra normalmente.

Una vez que se ha diagnosticado que el individuo padece asma, se llevan a cabo pruebas de selección para determinar si el DNA de este individuo comprende alelos de un marcador bialélico o de un grupo de marcadores bialélicos asociados con una respuesta positiva al tratamiento o con una respuesta negativa al tratamiento, que puede incluir efectos secundarios o falta de respuesta.

La selección del paciente a tratar usando el método de la presente invención puede llevarse a cabo mediante los métodos de detección descritos anteriormente. Los individuos que se han de seleccionar son preferentemente aquellos cuyo DNA no comprende alelos de un marcador bialélico o de un grupo de marcadores bialélicos asociados con una respuesta negativa al tratamiento.

Una vez que se han determinado las predisposiciones genéticas del paciente, el clínico puede elegir un tratamiento apropiado para el cual el efecto secundario en particular observado para el paciente no ha sido referido o ha sido referido solamente de forma marginal, y preferentemente de una asociación alélica que no implica al mismo marcador o marcadores bialélicos que se han encontrado en el DNA del paciente. Pueden escogerse varios fármacos útiles en el tratamiento de enfermedades que implican a la vía de los leucotrienos. Los compuestos que actúan sobre la vía de los leucotrienos se describen por ejemplo en las Patentes de EE.UU. 4.873.259, 4.970.215, 5.310.744,

5.225.421 y 5.081.138, o en el documento EP 0 419 049.

XV. Proteínas FLAP y fragmentos de polipéptido

La expresión "polipéptidos FLAP" se usa en el presente texto abarcando todas las proteínas y polipéptidos descritos en la presente invención. También se describen polipéptidos codificados por los polinucleótidos de la presente invención, así como polipéptidos de fusión que comprenden tales polipéptidos. La presente invención describe proteínas FLAP procedentes de seres humanos, incluyendo proteínas FLAP aisladas o purificadas que consisten, consisten esencialmente, o comprenden, la secuencia de SEQ ID No 3 y que comprenden una isoleucina en posición 127 en la SEQ ID No 3. Ha de observarse que las proteínas FLAP de la presente invención están basadas en la variante natural de la secuencia de aminoácidos de la FLAP humana en la que el resto de valina en la posición del aminoácido 127 de la SEQ ID No 3 ha sido reemplazada con un resto de isoleucina. Esta proteína variante y los fragmentos de la misma que contienen la posición de aminoácido 127 de SEQ ID No 3 se denominan colectivamente "variantes 127-Ile" o "polipéptidos FLAP 127-Ile".

La presente invención incorpora polipéptidos aislados, purificados y recombinantes que comprenden un tramo contiguo de al menos 6 aminoácidos, preferentemente al menos 8 a 10 aminoácidos, más preferentemente al menos 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 o 100 aminoácidos de la SEQ ID No 3, en donde dicho tramo contiguo incluye un resto de isoleucina en la posición de aminoácido 127 en SEQ ID No 3. En otras realizaciones preferidas el tramo contiguo de aminoácidos comprende el sitio de una mutación o una mutación funcional, incluyendo una deleción, adición, intercambio o truncamiento de los aminoácidos en la secuencia de la proteína FLAP.

Las proteínas FLAP se aíslan preferentemente de muestras de tejidos de seres humanos o de mamíferos o se expresan a partir de genes humanos o de mamíferos. Los polipéptidos FLAP de la presente invención pueden hacerse usando métodos de expresión rutinarios conocidos en la técnica. El polinucleótido que codifica el polipéptido deseado es ligado en un vector de expresión adecuado para cualquier hospedador conveniente. Se usan los dos sistemas de hospedadores, eucarióticos y procarióticos, para formar polipéptidos recombinantes, y un resumen de algunos de los sistemas más comunes. Después el polipéptido se aísla de las células lisadas o del medio de cultivo, y se purifica hasta el punto necesario para el uso al que se destina. La purificación se hace por cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo extracción diferencial, fraccionamiento salino, cromatografía, centrifugación y métodos similares. Véase, por ejemplo, Methods in Enzymology, para consultar una diversidad de métodos de purificación de proteínas.

Además, se producen fragmentos de proteína más cortos por síntesis química. Alternativamente las proteínas de la invención se extraen de las células o tejidos de seres humanos o de animales no humanos. Los métodos para purificar proteínas son conocidos en la técnica e incluyen el uso de detergentes o agentes caotrópicos para romper partículas, seguido por extracción diferencial y separación de los polipéptidos mediante cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, sedimentación según la densidad y electroforesis en gel.

Cualquier cDNA de FLAP, incluyendo la SEQ ID NO 2, se usa para expresar proteínas y polipéptidos FLAP. El cDNA de FLAP preferido comprende el alelo A del marcador bialélico A21. El ácido nucleico que codifica la proteína o polipéptido FLAP que se ha de expresar está unido operativamente a un promotor en un vector de expresión que usa tecnología de clonación convencional. El inserto de FLAP en el vector de expresión puede comprender la secuencia codificadora completa para la proteína FLAP o una parte de la misma. Por ejemplo, el inserto derivado de FLAP puede codificar un polipéptido que comprende al menos 10 aminoácidos consecutivos de la proteína FLAP de la SEQ ID No 3, en donde en dichos aminoácidos consecutivos que comprenden un resto de isoleucina en la posición de aminoácido 127.

El vector de expresión es cualquiera de los sistemas de expresión de mamífero, de levadura, de insectos o bacteriano, conocidos en la técnica. Los vectores y sistemas de expresión conocidos comercialmente son disponibles de una diversidad de suministradores, incluyendo Genetics Institute (Cambridge, MA), Stratagene (La Jolla, California), Promega (Madison, Wisconsin) e Invitrogen (San Diego, California). Si se desea, para potenciar la expresión y facilitar el apropiado plegamiento de la proteína, el contexto de codón y emparejamiento de codón de la secuencia se optimizan para el organismo de expresión en particular en el que se introduce el vector de expresión, como se expone en Hartfield et al., Patente de EE.UU. nº 5.082.767.

En una realización, toda la secuencia de codificación del cDNA de FLAP a través de la señal de poli A del cDNA está unida operativamente a un promotor en el vector de expresión. Alternativamente, si al ácido nucleico que codifica una porción de la proteína FLAP le falta una metionina que sirva de sitio de iniciación, puede introducirse una metionina iniciadora cerca del primer codón del ácido nucleico usando técnicas convencionales. Del mismo modo, si el inserto procedente del cDNA de FLAP carece de una señal de poli A, esta secuencia puede ser añadida a la construcción, por ejemplo haciendo corte y empalme de la señal de Poli A de pSG5 (Stratagene) usando enzimas endonucleasa de restricción BGlI y SalI e incorporándolas en el vector de expresión de mamífero pXT1 (Stratagene). El pXT1 contiene las LTRs y una parte del gen gag del virus de la leucemia murina de Moloney. La posición de las LTRs en la construcción permite una transfección estable eficiente. El vector incluye el promotor de timidina cinasa del virus herpes simplex y el gen seleccionable de neomicina. El ácido nucleico que codifica la proteína FLAP o una parte de la misma se obtiene por PCR a partir de un vector bacteriano que contiene el cDNA de FLAP de SEQ ID No 3, usando cebadores de oligonucleótidos complementarios al cDNA de FLAP o una parte del mismo, y que contienen secuencias de endonucleasa de restricción para Pst I incorporadas al cebador 5' y BglII en el extremo 5' del correspondiente cebador 3' de cDNA, teniendo cuidado de asegurarse de que la secuencia que codifica la proteína FLAP o una parte de la misma está situada apropiadamente con respecto a la señal de poli A. El fragmento purificado obtenido de la reacción de PCR resultante se digiere con PstI, se hacen los extremos romos con una exonucleasa, se digiere con Bgl II, se purifica y se liga a pXT1, que ahora contiene una señal de poli A, y se digiere con BglII.

El producto ligado es transfectado en células NIH 3T3 de ratones usando lipofectina (Life Techonologies, Inc., Grand Island, Nueva York) bajo las condiciones que se perfilan en las especificaciones del producto. Los transfectantes positivos se seleccionan después de desarrollar las células transfectadas en 600 !g/ml de G418 (Sigma, St. Louis, Missouri).

Alternativamente, los ácidos nucleicos que codifican la proteína FLAP o una porción de la misma se clonan en pED6dpc2 (Genetics Institute, Cambridge, MA). Las construcciones de pED6dpc2 resultantes se transfieren a una célula hospedadora adecuada, tal como células COS 1. Las células resistentes al metotrexato se seleccionan y se expanden.

Los procedimientos anteriores pueden ser usados también para expresar una proteína FLAP mutante, responsable de un fenotipo detectable, o una porción de la misma.

Las proteínas expresadas se purifican usando técnicas de purificación convencionales tales como precipitación con sulfato amónico o separación cromatográfica basada en tamaño o carga. La proteína codificada por el inserto de ácido nucleico puede purificarse también usando técnicas estándar de inmunocromatografía. En tales procedimientos, una solución que contiene la proteína FLAP expresada o una parte de la misma, tal como un extracto celular, se aplica a una columna que tiene anticuerpos contra la proteína FLAP o una porción de la misma se fija a la matriz de cromatografía. Se deja que la proteína expresada se una a la columna de cromatografía. A continuación, la columna se lava para eliminar las proteínas unidas no específicamente. La proteína expresada unida específicamente se libera después de la columna y se recupera usando técnicas estándar.

Para confirmar la expresión de la proteína FLAP o una porción de la misma, las proteínas expresadas a partir de células hospedadoras que contienen un vector de expresión que contiene un inserto que codifica la proteína FLAP o una porción de la misma, pueden ser comparadas con las proteínas expresadas en células hospedadoras que contiene el vector de expresión sin inserto. La presencia de una banda en muestras procedentes de células que contienen el vector de expresión con un inserto que está ausente en muestras de células que contienen el vector de expresión sin un inserto, indica que se está expresando la proteína FLAP o una porción de la mismas. Generalmente, la banda tendrá la movilidad esperada para la proteína FLAP o una porción de la misma. Sin embargo, la banda puede tener una movilidad diferente de la esperada como resultado de modificaciones tales como glicosilación, ubiquitinación o segmentación enzimática.

Más adelante se describen anticuerpos capaces de reconocer específicamente a proteína FLAP expresada o una porción de la misma.

Si la producción de anticuerpos no es posible, los ácidos nucleicos que codifican la proteína FLA o una porción de la misma se incorporan a vectores de expresión diseñados para ser usados en esquemas de purificación que emplean polipéptidos quiméricos. En tales estrategias el ácido nucleico que codifica la proteína FLAP o una porción de la misma se inserta en marco con el gen que codifica la otra mitad de la quimera. La otra mitad de la quimera es �globina o una secuencia de codificación de un polipéptido de unión de níquel. Después se usa una matriz cromatográfica que tiene un anticuerpo contra �-globina o níquel unido al mismo, para purificar la proteína quimérica. Se construyen por ingeniería genética sitios de segmentación de proteasa entre el gen de �-globina o el polipéptido de unión con níquel y la proteína FLAP o una porción de la misma. Así, los dos polipéptidos de la quimera se separan del otro por digestión con proteasa.

Un vector de expresión útil para generar quiméricos de �-globina es pSG5 (Stratagene), que codifica �-globina de conejo. El intrón II del gen de �-globina de conejo facilita el ayuste del transcrito expresado, y la señal de poliadenilación incorporada a la construcción aumenta el nivel de expresión. Estas técnicas son bien conocidas por los expertos en el campo de la biología molecular. Los métodos estándar están publicados en textos de métodos tales como Davies et al. (1986), y muchos de los métodos son disponibles de Stratagene, Life Technologies, Inc., o Promega. Adicionalmente puede producirse el polipéptido a partir de la construcción que usa sistemas de traducción in vitro, tales como el kit de traducción In Vitro ExpressT (Stratagene).

Anticuerpos que se unen a polipéptidos de FLAP de la invención Cualquier polipéptido o proteína completa de FLAP puede usarse para generar anticuerpos capaces de unirse específicamente a la proteína FLAP expresada o a fragmentos de la misma, como se ha descrito. Las composiciones de anticuerpos son capaces de unirse específicamente o de la unión específica a la variante 127-Ile de la proteína FLAP. Para que una composición de anticuerpo se una específicamente a la variante 127-Ile de FLAP ha de demostrar al menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 50% o 100% de afinidad de unión más grande para la variante 127-Ile de FLAP de longitud completa que para la variante 127-Val de FLAP de longitud completa, en un ensayo ELISA, RIA u otro ensayo de unión basado en anticuerpos.

La presente invención comprende una composición de anticuerpo aislado o purificado capaz de unirse selectivamente a un fragmento que contiene un epítopo de un polipéptido que comprende un tramo contiguo de al menos 6 aminoácidos, preferentemente al menos de 8 a 10 aminoácidos, más preferentemente al menos 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos de SEQ ID No 3, en donde dicho epítopo comprende un resto isoleucina en la posición de aminoácido 127 en SEQ ID No 3, en donde dicha composición de anticuerpo es opcionalmente policlonal o bien monoclonal.

La presente invención describe también el uso de polipéptidos que comprenden un tramo contiguo de al menos 6 aminoácidos, preferentemente al menos de 8 a 10 aminoácidos, más preferentemente al menos 12, 15, 20, 25, 50 ó 100 aminoácidos de un polipéptido FLAP, en la preparación de anticuerpos, en los que dicho tramo contiguo comprende un resto isoleucina en la posición de aminoácido 127 de la SEQ ID No 3. En una realización preferida tales polipéptidos son útiles en la preparación de anticuerpos para detectar la presencia y ausencia de la variante 127-Ile.

Los animales o mamíferos no humanos, sean de tipo silvestre o transgénicos, que expresan una especie de FLAP diferente de aquella para la que se desea la unión del anticuerpo, y animales que no expresan FLAP (es decir, animales genosuprimidos para FLAP o animales en los que el gen FLAP ha sido anulado o desactivado (knock-out)) son particularmente útiles para preparar anticuerpos. Los animales con FLAP anulado reconocerán todas o la mayoría de las regiones de FLAP expuestas como antígenos extraños y por tanto producirán anticuerpos con una matriz de epítopos de FLAP más amplia. También, polipéptidos más pequeños con tan solo 10 a 30 aminoácidos pueden ser útiles para obtener la unión específica a la variante 127-Ile. Además, el sistema inmunitario humoral de animales que producen una especie de FLAP que se parece a la secuencia antigénica reconocerá preferentemente las diferencias entre la especie de FLAP nativa del animal y la secuencia del antígeno, y producirá anticuerpos contra estos sitios únicos en la secuencia del antígeno. Tal técnica será particularmente útil para obtener anticuerpos que se unen específicamente a la variante 127-Ile.

XVI. Vectores recombinantes, células hospedadoras y animales transgénicos

Vectores recombinantes

El término "vector" se usa en el presente texto para designar una molécula de DNA o RNA, sea circular o lineal, que es bicatenaria (de dos hebras) o bien monocatenaria (de una sola hebra) y que comprende al menos un polinucleótido de interés que se intentar transferir en una célula hospedadora o en un organismo hospedador unicelular o pluricelular.

La presente invención incluye vectores recombinantes que comprenden un polinucleótido de acuerdo con la presente invención. La presente invención describe vectores recombinantes que comprenden un polinucleótido regulador comprendido en el ácido nucleico de SEQ ID No 1 o bien un polinucleótido que comprende la secuencia de codificación FLAP, o ambos.

Generalmente, un vector recombinante puede comprender cualquiera de los polinucleótidos descritos en el presente texto, incluyendo secuencias reguladoras y secuencias codificadoras, así como cualquier cebador o sonda de FLAP como se definieron antes.

En una primera realización, se usa un vector recombinante para amplificar el polinucleótido insertado derivado de una secuencia genómica de FLAP de SEQ ID No 1 o un cDNA de FLAP, por ejemplo el cDNA de la SEQ ID No 2 en una célula hospedadora adecuada, siendo amplificado este polinucleótido cada vez que se replica el vector recombinante.

Una segunda realización preferida de los vectores recombinantes consiste en vectores de expresión que comprenden un polinucleótido regulador o un ácido nucleico codificador de la invención, o ambos. Dentro de ciertas realizaciones, se emplean vectores de expresión para expresar el polipéptido FLAP que después puede ser purificado y, por ejemplo, ser usado en ensayos de cribado de ligandos, o como inmunógeno con el fin de producir anticuerpos específicos dirigidos contra la proteína FLAP. En otras realizaciones, los vectores de expresión se usan para construir animales transgénicos y también para terapia génica. La expresión requiere proporcionar a los vectores las señales apropiadas, incluyendo dichas señales varios elementos reguladores tales como potenciadores/promotores de fuentes tanto virales como de mamíferos, que impulsen la expresión de los genes de interés en las células hospedadoras. Generalmente en los vectores de expresión de la presente invención se incluyen marcadores de selección de fármacos dominantes, para establecer clones de células estables permanentes que expresan los productos, como son elementos que ligan la expresión de los marcadores de selección de fármacos a la expresión del polipéptido.

Más en particular, la presente invención describe vectores de expresión que incluyen ácidos nucleicos que codifican una proteína FLAP, preferentemente la proteína FLAP de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No 3, más preferentemente la proteína FLAP de la SEQ ID No 3 que lleva un resto isoleucina en posición 127 o variantes o fragmentos de la misma, bajo el control de una secuencia reguladora elegida entre los polipéptidos reguladores de FLAP, o alternativamente bajo el control de una secuencia reguladora exógena.

En consecuencia, los vectores de expresión preferidos se eligen entre el grupo consistente en: (a) la secuencia reguladora de FLAP comprendida en la misma impulsa la expresión de un polinucleótido codificador unido operativamente a la misma; (b) la secuencia codificadora de FLAP está unida operativamente a secuencias de regulación que permiten su expresión en una célula hospedadora y/o un organismo hospedador adecuados.

También se describen vectores recombinantes que comprenden un ácido nucleico que contiene un marcador bialélico relacionado con FLAP. En una realización preferida, dicho marcador bialélico se elige entre el grupo consistente en A1 a A28, y los complementos de los mismos. Opcionalmente, dicho marcador bialélico se elige entre el grupo consistente en A1 a A13, A15, A17 a A28, y los complementos de los mismos.

Algunos de los elementos que pueden encontrarse en los vectores de la presente invención se describen con más detalle en las secciones siguientes.

1. Características generales de los vectores de expresión de la invención

Un vector recombinante comprende, pero no se limita a ello, un YAC (Yeast Artificial Chromosome: cromosoma artificial de levadura), un BAC (Bacterial Artificial Chromosome: cromosoma artificial bacteriano), un fago, un fagémido, un cósmido, un plásmido o incluso una molécula de DNA lineal que puede consistir en un DNA cromosómico, no cromosómico, semisintético y sintético. Tal vector recombinante puede comprender una unidad transcripcional que comprende un montaje de:

(1)

un elemento o elementos genéticos que tienen un papel regulador en la expresión génica, por ejemplo promotores o potenciadores. Los potenciadores son elementos de DNA que actúan en cis, normalmente de aproximadamente 10 a 300 pb de longitud, que actúan sobre el promotor para aumentar la transcripción;

(2)

una secuencia estructural o codificadora que se transcribe en el mRNA y eventualmente se traduce a un polipéptido, estando dicha secuencia estructural o codificadora operativamente unida a los elementos reguladores descritos en (1); y

(3)

secuencias de iniciación y terminación de la transcripción apropiadas. Las unidades estructurales que se pretenden usar en sistemas de expresión de levadura o eucarióticos incluyen preferentemente una secuencia líder que habilita la secreción extracelular de la proteína traducida, por una células hospedadora. Alternativamente, cuando una proteína recombinante se expresa sin una secuencia guía o de transporte, puede incluir una secuencia N-terminal. Este resto puede o no ser subsiguientemente segmentado de la proteína recombinante expresada, para proporcionar un producto final.

Generalmente, los vectores de expresión recombinantes incluirán orígenes de replicación, marcadores seleccionables que permiten la transformación de la célula hospedadora, y un promotor derivado de un gen altamente expresado para dirigir la transcripción de una secuencia estructural secuencia abajo. La secuencia heteróloga estructural se ensambla en la fase apropiada con secuencias de iniciación y terminación de la traducción, y preferentemente una secuencia guía capaz de dirigir la secreción de la proteína traducida al espacio periplásmico o al medio extracelular. En una realización específica en la que el vector es adaptado para transfectar y expresar secuencias deseadas en células hospedadoras de mamíferos, los vectores preferidos comprenderán un origen de la replicación en el hospedador deseado, un promotor y potenciador adecuados, y también cualquier sitio de unión con el ribosoma, sitio de poliadenilación, donante de ayuste y aceptor, secuencias de terminación transcripcional, y secuencias flanqueantes 5' no transcritas que sean necesarios. Las secuencias de DNA derivadas del genoma viral SV 40, por ejemplo origen de SV40, promotor temprano, potenciador, sitios de ayuste y poliadenilación, pueden ser usadas para proporcionar los elementos genéticos no transcritos requeridos.

La expresión in vivo de un polipéptido FLAP de SEQ ID No 3 o fragmentos o variantes del mismo puede ser útil para corregir un defecto genético relacionado con la expresión del gen nativo en un organismo hospedador o con la producción de una proteína FLAP biológicamente inactiva.

En consecuencia, la presente invención describe también vectores de expresión recombinantes diseñados principalmente para la producción in vivo del polipéptido FLAP de SEQ ID No 3 o fragmentos o variantes del mismo, mediante la introducción del material genético apropiado en el organismo del paciente a tratar. Este material genético puede ser introducido in vitro en una célula que ha sido previamente extraída del organismo, siendo la célula modificada subsiguientemente reintroducida en dicho organismo, directamente in vivo en el tejido apropiado.

2. Elementos reguladores

Promotores Las regiones promotoras adecuadas usadas en los vectores de expresión se eligen teniendo en cuenta la célula hospedadora en la que ha de expresarse el gen heterólogo. El promotor particular empleado para controlar la expresión de una secuencia de ácidos nucleicos de interés no se considera importante, siempre y cuando sea capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico en la célula señalada como diana. Así, cuando se señala como diana una célula humana, es preferible situar la región codificadora del ácido nucleico adyacente a, y bajo el control de, un promotor que sea capaz de expresarse en una célula humana, tal como, por ejemplo, un promotor humano o viral.

Un promotor adecuado puede ser heterólogo con respecto al ácido nucleico para el que controla la expresión, o alternativamente puede ser endógeno respecto al polinucleótido nativo que contiene la secuencia codificadora a expresar. Adicionalmente, el promotor es generalmente heterólogo en relación con las secuencias del vector recombinante dentro de las cuales se ha de insertar la construcción promotor/secuencia codificadora.

Las regiones promotoras se pueden seleccionar a partir de cualquier gen deseado usando, por ejemplo, vectores CAT (cloranfenicol transferasa) y más preferentemente vectores pKK232-8 y pCM7.

Los promotores bacterianos preferidos son los promotores LacI, LacZ, los promotores de RNA polimerasa del bacteriófago T3 o T7, los promotores gpt, lambda PR, PL y trp (documento EP 0036776), el promotor de polihedrina o el promotor de proteína p10 de baculovirus (Kit Novagen) (Smith et al., 1983; O’Reilly et al., 1992), el promotor PR lambda y también el promotor trc.

Los promotores eucarióticos incluyen el inmediato temprano de CMV, timidina quinasa de HSV, temprano y tardío de SV40, LTRs de retrovirus y metalotioneína L de ratón. La selección de un vector y promotor conveniente está al nivel de un profesional con experiencia normal en la técnica.

La elección de un promotor está alcance de la capacidad de una persona experta en el campo de la ingeniería genética. Por ejemplo, puede hacerse referencia al texto de Sambrook et al. (1989) o también a los procedimientos descritos por Fuller et al. (1996).

Otros elementos reguladores

Cuando se emplea un inserto de cDNA, típicamente se deseará incluir una señal de poliadenilación para realizar la apropiada poliadenilación del transcrito del gen. No se cree que la naturaleza de la señal de poliadenilación sea crucial para el éxito de la puesta en práctica de la presente invención, y puede emplearse cualquiera de secuencias tales como la hormona del crecimiento humano y señales de poliadenilación de SV40. También se contempla un terminador como elemento de la casete de expresión. Estos elementos pueden servir para potenciar los niveles del mensaje y para minimizar la lectura a través de la casete en otras secuencias.

El vector que contiene la secuencia de DNA apropiada como se describió antes, más preferentemente polinucleótido regulador del gen FLAP, un polinucleótido que codifica el polipéptido FLAP elegido entre el grupo consistente en SEQ ID No 1 o un fragmento o una variante de la misma y SEQ ID No 2, o ambas, puede ser utilizado para transformar un hospedador apropiado para permitir la expresión del polipéptido o polinucleótido deseados.

3.

Marcadores seleccionables

Tales marcadores conferirían un cambio identificable a la célula, que permitiría la fácil identificación de las células que contienen la construcción de expresión. Los genes marcadores seleccionables para la selección de células hospedadoras transformadas, son preferentemente de dihidrofolato reductasa o de resistencia a la neomicina para cultivo de células eucarióticas, TRP1 para S. cerevisiae o resistencia a tetraciclina, rifampicina o ampicilina en E. coli, o levansacarasa para micobacterias, siendo este último marcador un marcador de selección negativa.

4.

Vectores preferidos

Vectores bacterianos

Como ejemplo representativo, pero no limitante, los vectores de expresión útiles para uso bacteriano pueden comprender un marcador seleccionable y un origen de replicación bacteriano derivado de plásmidos disponibles comercialmente, que comprenden elementos genéticos de pBR322 (ATCC 37017). Tales vectores comerciales incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia, Uppsala, Suecia) y GEMI (Promega Biotec, Madison, WI, EE.UU.).

Hay un gran número de otros vectores adecuados que son conocidos por los expertos en la técnica, y comercialmente disponibles, tales como los siguientes vectores bacterianos: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pbs, pD10, phagescript, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNHSA, PNH16A, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia); pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene); pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia); pQE-30 (QIAexpress).

Vectores de bacteriófago

El vector del bacteriófago P1 puede contener grandes insertos que oscilan entre aproximadamente 80 y aproximadamente 100 pb.

La construcción de vectores del bacteriófago P1 tales como p158 o p158/neo8 está notablemente descrita por Sternberg (1992, 1994). Los clones de P1 recombinantes que comprenden secuencias de nucleótidos de FLAP pueden ser diseñados para insertar grandes polinucleótidos de más de 40 kb (Linton et al., 1993). Para generar DNA de P1 para experimentos transgénicos, un protocolo preferido es el protocolo descrito por McCormick et al. (1994).

Vectores de baculovirus

Un vector adecuado para la expresión del polipéptido FLAP de SEQ ID No 6 o fragmentos o variantes del mismo es un vector de baculovirus que puede ser propagado en células de insectos y en líneas de células de insectos. Un sistema de vector hospedador específico adecuado es el vector de transferencia de baculovirus pVL1392/1393 (Pharmingen) que se usa para transfectar la línea de células SF9 (ATCC Nº CRL 1711) que se deriva de Spodoptera frugiperda.

Otros vectores adecuados para la expresión del polipéptido FLAP de SEQ ID No 6 o fragmentos o variantes del mismo en un sistema de expresión de baculovirus incluyen los descritos por Chai et al. (1993), Vlasak et al. (1983) y Lenhard et al. (1996).

Vectores virales

En una realización específica, el vector se deriva de un adenovirus. Los vectores de adenovirus preferidos de acuerdo con la presente invención son los descritos por Feldmen y Steg (1996) o por Ohno et al. (1994). Otro adenovirus recombinante preferido de acuerdo con esta realización específica de la presente invención es el adenovirus humano del tipo 2 o 5 (Ad 2 o Ad 5) o un adenovirus de origen animal (Solicitud de Patente Francesa nº FR-93 05954).

Se entiende generalmente que los vectores de retrovirus y vectores de virus adeno-asociados son los sistemas de suministro de genes recombinantes de elección para la transferencia de polinucleótidos exógenos in vivo, particularmente a mamíferos, incluyendo personas. Estos vectores proporcionan el eficiente suministro de genes a células, y los ácidos nucleicos transfectados se integran establemente en el DNA cromosómico del hospedador.

Los retrovirus particularmente preferidos para la preparación o construcción de vehículos retrovirales de suministro de genes in vitro o in vivo de la presente invención incluyen retrovirus elegidos entre el grupo consistente en virus inductor del focus en células de visón, virus del sarcoma murino, virus de la reticuloendoteliosis y virus del sarcoma de Rous. Los virus de la leucemia murina particularmente preferidos incluyen los virus 4070A y 1504A, virus de la leucemia murina de Abelson (ATCC Nº VR-999), de Friend (ATCC nº VR-245), de Gross (ATCC nº VR-590), de Rauscher (ATCC nº VR-998) y de Moloney (ATCC nº VR-190; Solicitud PCT nº WO 94/24298). Los virus del sarcoma de Rous particularmente preferidos incluyen el título elevado de Bryan (ATCC Nos. VR-334, VR-657, VR-726, VR-659 y VR-728). Otros vectores retrovirales preferidos son los que se describen en Roth et al. (1996), Solicitud PCT nº WO 93/25234, Solicitud PCT nº WO 94/0620, Roux et al., 1989, Julan et al., 1992 y Neda et al., 1991.

Otro sistema vector viral que se describe en la invención consiste en el virus adenoasociado (AAV). El virus adenoasociado es un virus defectivo (incompleto) de origen natural que requiere otro virus, tal como un adenovirus o un virus herpes, como virus colaborador para una eficiente replicación y un ciclo de vida productivo (Muzyczka et al., 1992). También es uno de los pocos virus que pueden integrar su DNA en células no en división, y muestra una elevada frecuencia de integración estable (Flotte et al., 1992; Samulski et al., 1989; McLaughlin et al., 1989). Una característica ventajosa del AAV deriva de su reducida eficacia para transducir células primarias en relación con células transformadas.

Vectores BAC

El sistema de clonación de cromosoma artificial bacteriano (BAC: Bacterial Artificial Chromosome) (Shizuya et al., 1992) ha sido desarrollado para mantener establemente grandes fragmentos de DNA genómico (100 a 300 kb) en E. coli. Un vector BAC preferido consiste en el vector pBeloBAC11que ha sido descrito por Kim et al. (1996). Se preparan genotecas de BAC con este vector usando DNA genómico seleccionado por tamaño que ha sido parcialmente digerido usando enzimas que permiten la ligación en los sitios Bam HI o bien en los HindIII en el vector. Flanqueando estos sitios de clonación están los sitios de iniciación de la transcripción de la RNA polimerasa T7 y SP6, que pueden ser usados para generar sondas terminales por métodos de transcripción de RNA o bien de PCR. Después de la construcción de una genoteca BAC en E. coli, el DNA de BAC se purifica de la célula hospedadora como un círculo super-enrrolado. La conversión de estas moléculas circulares en una forma lineal precede a la determinación de tamaño y a la introducción de los BACs en células receptoras. El sitio de clonación está flanqueado por dos sitios Not I, que permiten que segmentos clonados sean escindidos del vector por digestión con Not I. Alternativamente, el inserto de DNA contenido en el vector pVeloBAC11 puede ser linealizado mediante el tratamiento del vector de BAC con la enzima lambda terminasa disponible comercialmente, que conduce a la segmentación en un único sitio cosN, pero este método de segmentación tiene por resultado un clon de BAC de longitud completa que contiene ambas secuencias del inserto de DNA y de BAC.

5. Suministro de los vectores recombinantes

Con el fin de efectuar la expresión de los polinucleótidos y construcciones de polinucleótidos de la presente invención, estas construcciones han de ser suministradas a una célula. Este suministro puede realizarse in vitro, como en procedimientos de laboratorio para transformar líneas de células, o in vivo o ex vivo, como en el tratamiento de ciertas enfermedades.

Un mecanismo es la infección viral en la que la construcción de expresión es encapsulada en una partícula viral infecciosa.

Hay varios métodos no virales para la transferencia de polinucleótidos a células de mamífero cultivadas que también son considerados por la presente invención, e incluyen, sin limitarse a ellos, precipitación con fosfato cálcico (Graham et al., 1973; Chen et al., 1987), DEAE-dextrano (Gopal, 1985), electroporación (Tur-Kaspa et al., 1986; Potter et al., 1984), microinyección directa (Harland et al., 1985), liposomas cargados con DNA (Nicolau et al., 1982; Fraley et al., 1979) y transfección mediada por un receptor (Wu y Wu, 1987; 1988). Algunas de estas técnicas puede ser adaptadas con éxito para uso in vivo o ex vivo.

Una vez que el polinucleótido de expresión ha sido suministrado a la célula, puede ser integrado establemente en el genoma de la célula receptora. Esta integración puede ser en la posición y orientación cognadas, vía recombinación homóloga (reemplazo de gen) o puede ser integrada en una situación aleatoria no específica (aumento del gen). En otras realizaciones más, el ácido nucleico puede ser mantenido establemente en la célula como un segmento de DNA episomal separado. Tales segmentos de ácido nucleico o "episomas" codifican secuencias suficientes para permitir el mantenimiento y la replicación independientes de la célula hospedadora, o en sincronización con el ciclo de la misma.

Una realización específica para un método para suministrar una proteína o un péptido al interior de una célula de un vertebrado in vivo, comprende la etapa de introducir un preparado que comprende un vehículo aceptable fisiológicamente y un polinucleótido desnudo que codifica operativamente el polipéptido de interés, en el espacio intersticial de un tejido que comprende la célula, con lo que el polinucleótido desnudo es captado en el interior de la célula y tiene un efecto fisiológico. Esto es particularmente aplicable para la transferencia in vitro pero puede aplicarse también a la transferencia in vivo.

Las composiciones para uso in vitro e in vivo que comprenden un polinucleótido "desnudo" se describen en la solicitud PCT Nº WO 90/11092 (Vical Inc.) y también en la solicitud PCT Nº WO 95/11307 (Instituto Pasteur, INSERM, Universidad de Otawa) así como en los artículos de Tacson et al. (1996) y de Huygen et al. (1996).

En otra realización más, la transferencia a células de un polinucleótido desnudo de la invención, incluyendo una construcción de polinucleótido de la invención, puede hacerse con un bombardeo de partículas (biolística), siendo dichas partículas microproyectiles recubiertos con DNA acelerados a alta velocidad que les permite perforar las membranas celulares y entrar en las células sin matarlas, como se describe en Klein et al. (1987).

En otra realización más, el polinucleótido puede ser atrapado en un liposoma (Ghosh y Bacchawat, 1991; Wong et al., 1980; Nicolau et al., 1987).

En una realización específica, se describe una composición para la producción in vivo de la proteína o polipéptido FLAP descritos en el presente texto. Comprende un polinucleótido desnudo que codifica operativamente este polipéptido, en solución en un vehículo aceptable fisológicamente, y adecuado para la introducción en un tejido para hacer que las células del tejido expresen dicha proteína o polipéptido.

La cantidad de vector a inyectar al organismo hospedador deseado varía de acuerdo con el sitio de inyección. Como dosis indicativa, se inyectarán entre 0,1 y 100 !g del vector en el cuerpo de un animal, preferentemente de un mamífero, por ejemplo de un ratón.

En otra realización del vector, puede ser introducido in vitro en una célula hospedadora, preferentemente una célula hospedadora previamente recolectada del animal a tratar, y más preferentemente una célula somática tal como una célula muscular. En una etapa subsiguiente, la célula que ha sido transformada con el vector que codifica el polipéptido FLAP deseado, o el fragmento deseado del mismo, es reintroducida en el cuerpo del animal con el fin de suministrar la proteína recombinante dentro del cuerpo, bien sea localmente o bien sistémicamente.

Hospedadores celulares

Otro objeto consiste en una célula hospedadora que ha sido transformada o transfectada con un de los polinucleótidos descritos en el presente texto. Se incluyen células hospedadoras que son transformadas (células procarióticas)

o que son transfectadas (células eucarióticas) con un vector recombinante tal como uno de los descritos anteriormente.

La presente invención se refiere a una célula hospedadora que comprende un vector recombinante de acuerdo con la presente invención.

Otra célula hospedadora recombinante comprende un polinucleótido que contiene un marcador bialélico elegido entre el grupo consistente en A1 a A28, y los complementos de los mismos. Opcionalmente, dicho marcador bialélico se elige entre el grupo consistente en A1 a A13, A15, A17 a A28, y los complementos de los mismos.

Las células hospedadoras preferidas usadas como destinatarios para los vectores de expresión son las siguientes:

a) Células hospedadoras procarióticas: cepas de Escherichia coli (cepa I.E.DH5-a), Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, y cepas de especies similares a Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus.

b) Células hospedadoras eucarióticas: células HeLa (ATCC nº CCL2, nº CCL2. 1, nº CCL2. 2), células Cv 1 (ATCC nº CCL70), células COS (ATCC nº CRL1650; nº CRL1651), células Sf-9(ATCC nº CRL1711), células C127 (ATCC nº CRL-1804), 3T3 (ATCC nº CRL-6361), CHO (ATCC nº CCL-61), riñón humano 293. (ATCC nº 45504; nº CRL-1573) y BHK (ECACC nº 84100501; nº 84111301).

c) Otras células hospedadoras de mamíferos.

La expresión del gen FLAP en células de mamíferos, y típicamente en células humanas, puede hacerse defectiva, o alternativamente puede proceder con la inserción de una secuencia genómica o de cDNA de FLAP con el reemplazo del equivalente del gen FLAP en el genoma de una célula animal por un polinucleótido de FLAP. Estas alteraciones genéticas pueden ser generadas por eventos de recombinación homóloga que usan construcciones de DNA específicas que han sido descritas con anterioridad.

Un tipo de células hospedadoras que pueden usarse son cigotos de mamíferos tales como cigotos murinos. Por ejemplo, los cigotos murinos pueden experimentar una microinyección con una molécula de DNA purificado de interés, por ejemplo con una molécula de DNA purificado que previamente ha sido ajustado a un intervalo de concentración de 1 ng/ml -para insertos de BAC- a 3 ng/!l -para insertos de bacteriófago P1- en Tris-HCl 10 mM, pH 7,4, EDTA 250 !M que contiene NaCl 100 mM, espermina 30 !M, y espermidina 70 !M. Cuando el DNA que se ha de microinyectar tiene un tamaño grande, pueden usarse poliaminas y elevadas concentraciones de sal para evitar la rotura mecánica de este DNA, como se describe en Schedl et al. (1993b).

Cualquiera de los polinucleótidos de la presente invención, incluyendo las construcciones de DNA descritas en el presente texto, puede ser introducido en un sistema de líneas de células madre embrionarias (ES: Embryonic Stem), preferentemente una línea de células ES de ratón. Las líneas de células ES se derivan de células pluripotenciales no comprometidas de la masa celular interna de blastocitos pre-implantación. Las líneas de células ES preferidas son las siguientes: ES-E14TG2a (ATCC nº CRL-1821), ES-D3 (ATCC nº CRL-1934 y nº CRL-11632), YS001 (ATCC nº CRL-11776), 36. 5 (ATCC nº CRL-11116). Para mantener las células ES en un estado no comprometido, se cultivan en presencia de células alimentadoras (feeder cells) de crecimiento inhibido, que proporcionan las señales apropiadas para preservar este fenotipo embrionario y sirven como matriz para la adherencia de las células ES. Las células alimentadoras preferidas consisten en fibroblastos embrionarios primarios que se establecen de tejido de embriones del día 13 al día 14 de prácticamente cualquier cepa de ratón, que se mantienen en cultivo tal como se describe en Abbondanzo et al. (1993) y que se inhiben en su crecimiento por irradiación, tal como se describe en Robertson (1987) o mediante la presencia de una concentración inhibidora de LIF, tal como se describe en Pease y Williams (1990).

Las construcciones en las células hospedadoras pueden ser usadas de una manera convencional para producir el producto génico codificado por la secuencia recombinante.

Después de la transformación de un hospedador adecuado y del desarrollo del hospedador hasta una densidad de células apropiada, el promotor seleccionado se induce por medios apropiados, tal como el desplazamiento de la temperatura o la inducción química, y las células se cultivan durante un periodo adicional.

Las células se recolectan típicamente por centrifugación, se rompen por medios físicos o químicos y el extracto crudo resultante se retiene para más purificación.

Las células microbianas empleadas en la expresión de proteínas pueden romperse por cualquier método conveniente, incluyendo ciclos de congelación y descongelación, sonicación, rotura mecánica o el uso de agentes de lisis celular. Tales métodos son bien conocidos por los profesionales expertos.

Animales transgénicos

Las expresiones "animales transgénicos" o "animales hospedadores" se usan en el presente texto para designar animales que tienen su genoma manipulado genéticamente y artificialmente, de forma que incluyan uno de los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención. Los animales preferidos son mamíferos no humanos e incluyen los que pertenecen a un género elegido entre Mus (p. ej., ratones), Rattus (p. ej. ratas) y Oryctogalus (p. ej. conejos) que tienen su genoma artificialmente y genéticamente alterado por la inserción de un ácido nucleico descrito en la presente invención. En una realización, la invención describe mamíferos y animales hospedadores no humanos que comprenden un vector recombinante descrito en la presente invención o un gen FLAP interrumpido por recombinación homóloga con un vector anulado (knock out).

Los animales transgénicos incluyen dentro de una diversidad de sus células una secuencia de DNA recombinante clonada o sintética, más específicamente uno de los ácidos nucleicos purificados o aislados que comprenden una secuencia codificadora de FLAP, un polinucleótido regulador de FLAP o una secuencia de DNA que codifica un polinucleótido antisentido tal como se describe en la presente memoria descriptiva.

Generalmente, un animal transgénico comprende uno cualquiera de los polinucleótidos, los vectores recombinantes y los hospedadores celulares descritos en la presente invención.

Otros animales transgénicos contienen en sus células somáticas y/o en sus líneas de células germinales un polinucleótido que comprende un marcador bialélico elegido entre el grupo que consiste en A1 a A28 y los complementos de los mismos. Opcionalmente dicho marcador bialélico se elige entre el grupo que consiste en A1 a A13, A15, A17 a A28, y los complementos de los mismos.

En una primera realización preferida, estos animales transgénicos pueden ser buenos modelos experimentales para estudiar las diversas patologías relacionadas con la diferenciación celular, en particular concernientes a los animales transgénicos dentro de cuyo genoma se ha insertado una o varias copias de un polinucleótido que codifica una proteína FLAP nativa, o alternativamente una proteína FLAP mutante.

En una segunda realización preferida, estos animales transgénicos pueden expresar un polipéptido deseado de interés, bajo el control de los polinucleótidos reguladores del gen FLAP, conduciendo a buenos rendimientos en la síntesis de esta proteína de interés, y eventualmente una expresión específica del tejido de esta proteína de interés.

El diseño de los animales transgénicos, incluyendo animales genosuprimidos (knock out: con un gen anulado o desactivado), puede hacerse de acuerdo con las técnicas convencionales bien conocidas por los expertos en este campo. Para más detalles relacionados con la producción de animales transgénicos, y específicamente ratones transgénicos, cabe hacer referencia a las Patentes de EE.UU. nº 4.873.191, expedida el 10 de Octubre de 1989, nº 5.464.764, expedida el 7 de Noviembre de 1995, nº 5.789.215, expedida el 4 de Agosto de 1998, y a los documento de Capecchi, M. R. (1989a); Capecchi, M. R. (1989b); y Tsuzuki, T. y Rancourt, D. E. (1998).

La presente invención comprende vectores knock out que comprenden los nuevos polinucleótidos de la invención, así como células hospedadoras de mamíferos y mamíferos hospedadores no humanos que comprenden un gen FLAP interrumpido por recombinación homóloga con tal vector knock out.

Los animales transgénicos de la presente invención se producen por la aplicación de procedimientos que tengan por resultado un animal con un genoma que ha incorporado material genético exógeno. El procedimiento implica obtener el material genético, o una porción del mismo, que codifica una secuencia codificadora de FLAP, un polinucleótido regulador de FLAP o una secuencia de DNA que codifica un polinucleótido antisentido FLAP tal como se describe en la presente memoria descriptiva.

Un polinucleótido recombinante descrito en la invención es insertado en una línea de células madre ES o embrionarias. La inserción se hace preferentemente usando electroporación, tal como se describe en Thomas et al. (1987). Las células sometidas a electroporación son cribadas (p. ej. por selección mediante marcadores seleccionables, mediante PCR o mediante análisis de transferencia Southern) para encontrar células positivas que han integrado el polinucleótido recombinante exógeno en su genoma, preferentemente a través de un evento de recombinación homóloga. Un procedimiento de selección positiva-negativa ilustrativo que puede usarse se describe en Mansour et al. (1988).

Después, las células positivas se aíslan, se clonan y se inyectan en blastocitos de una edad de 3,5 días procedentes de ratones, tal como se describe en Bradley (1987). Los blastocitos son después insertados en un animal hospedador hembra y se dejan crecer a término.

Alternativamente, las células ES positivas se ponen en contacto con embriones en el estadio de 8-16 células de 2,5 días de edad (mórulas) tal como se describe en Wood et al. (1993) o en Nagy et al. (1993), siendo las células ES internalizadas para colonizar extensivamente el blastocisto incluyendo las células que darán lugar a la línea de células germinales.

Las crías del hospedador hembra se ensayan para determinar qué animales son transgénicos, p. ej. incluyen la secuencia de DNA exógeno insertado y cuáles son de tipo silvestre.

Líneas de células recombinantes derivadas de los animales transgénicos

Otro objeto describe células hospedadoras recombinantes obtenidas de un animal transgénico descrito en el presente texto. En una realización la invención comprende células derivadas de mamíferos hospedadores no humanos y animales, que comprenden un vector recombinante de la invención o un gen FLAP interrumpido por recombinación homóloga con un vector knock out.

Las líneas de células recombinantes pueden establecerse in vitro a partir de células obtenidas a partir de cualquier tejido de un animal transgénico de acuerdo con la presente invención, por ejemplo por transfección de cultivos de células primarias con vectores que expresan genes onc tales como el antígeno T grande de SV40, como se describe en Chou (1989) y en Shay et al. (1991).

XVII. Cribado de agentes que actúan sobre la vía de los leucotrienos

En otra realización, la presente invención describe también un método para el cribado de nuevos agentes, o sustancias candidatas, que actúan sobre el asma y que pueden ser adecuadas para el tratamiento de un paciente cuyo DNA comprende un alelo del gen FLAP asociado con el asma.

En una realización preferida, se describe un método para el cribado de sustancias candidatas, en cuanto a su capacidad para alterar la biosíntesis de leucotrienos, preferentemente para identificar sustancias candidatas activas sin efectos secundarios no deseados, tales como el aumento de los niveles de transaminasa en el hígado. El método comprende las etapas siguientes: a) proporcionar una línea celular, un órgano o un mamífero que exprese 5-LO y o bien un gen FLAP que comprenda alelos para uno o más marcadores bialélicos relacionados con FLAP, preferentemente asociados con el asma, o bien un gen FLAP mutado que comprende la mutación causa del rasgo, determinado usando el método antes señalado; b) obtener una sustancia candidata; y c) probar la capacidad de la sustancia candidata para modificar la biosíntesis de leucotrienos, y en particular para interaccionar con la 5-LO y/o con la FLAP producida por la línea celular o el mamífero transgénico y/o para modificar la interacción entre 5-LO y FLAP y/o para modular los niveles de expresión de FLAP.

En una realización del método anterior, el método comprende proporcionar una línea celular, un órgano o un mamífero que expresen 5-LO, un gen FLAP que comprenda alelos para uno o más marcadores bialélicos relacionados con FLAP asociados con el asma, y un gen FLAP mutado que comprende la mutación causa del rasgo determinada usando el método antes señalado. Dichos marcadores bialélicos pueden elegirse entre el grupo que consiste en A1 a A28, y los complementos de los mismos. Opcionalmente dicho marcador bialélico relacionado con FLAP puede elegirse entre el grupo que consiste en A1 a A13, A15, A17 a A28 y los complementos de los mismos; opcionalmente dichos marcadores bialélicos se eligen entre el grupo que consiste en A14 o A16, y los complementos de los mismos. En una realización preferida dichos marcadores bialélicos son elegidos entre el grupo que consiste en A2, A14, A16, A18, A19, A22 y A23, y los complementos de los mismos. En otra realización preferida dichos marcadores bialélicos son elegidos entre el grupo que consiste en A14 y A19, y los complementos de los mismos. En una realización más preferida dichos marcadores bialélicos comprenden el marcador bialélico A19, y los complementos del mismo.

Una sustancia candidata es una sustancia que puede presentar interacción o modular, por unión o por otras interacciones moleculares, la 5-LO o la FLAP. Tales sustancias pueden ser potencialmente interesantes para pacientes que no responden a los fármacos existentes. El cribado puede ser efectuado usando métodos in vitro o bien métodos in vivo.

Los métodos in vitro pueden llevarse cabo de muchas formas tales como en células transformadas que expresan los alelos considerados del gen FLAP, a través de la activación de la 5-lipoxigenesa y la medida de la síntesis de leucotrienos, o en FLAP codificada por la variante alélica considerada de FLAP a través de ensayos de unión de FLAP.

Los ensayos de cribado de la presente invención implican generalmente la capacidad de una sustancia candidata para afectar a la actividad de la 5-LO o la FLAP, tal como el cribado de sustancias candidatas para identificar a aquellas que inhiben o modifican de otra forma la función de 5-LO o FLAP en el asma.

Un método de cribado de fármacos utiliza células hospedadoras eucarióticas que están establemente transformadas con polinucleótidos recombinantes que expresan 5-LO y los alelos considerados del gen FLAP. Tales células, sea en forma viable o bien fijada, pueden usarse para ensayos de unión estándar. Se puede medir, por ejemplo, la formación de productos de la vía de los leucotrienos tales como la síntesis de LTB4, o examinar el grado hasta el que la formación de tales productos se ve interferida por el agente que se está ensayando.

Típicamente, este método incluye preparar células transformadas que expresan 5-LO y diferentes formas de FLAP codificadas por secuencias de DNA que contienen alelos particulares de uno o más de los marcadores bialélicos y/o mutaciones que se han descrito anteriormente. Esto viene seguido por las pruebas de las células que expresan la 5-LO y la FLAP con una sustancia candidata, para determinar la capacidad de la sustancia para afectar a la función de la vía de los leucotrienos, con el fin de identificar a aquellas que afectan a la actividad enzimática de 5-LO o la actividad de FLAP, y que por tanto puede ser adecuada para ser usada en seres humanos.

Ejemplos típicos de tales ensayos de cribado de fármacos se proporcionan más adelante. Se ha de entender que los parámetros expuestos en estos ejemplos pueden ser modificados por un experto en la técnica sin una experimentación excesiva.

Cribado para inhibidores de 5-LO

Los efectos del fármaco pueden ser evaluados estableciendo los productos de 5-LO generados por las células que expresan tanto el gen de 5-LO como el alelo considerado del gen FLAP. Las células eucarióticas previamente transformadas con vectores apropiados como se describieron antes, y que expresan 5-LO y el alelo del gen FLAP bajo estudio, se recolectan mediante centrifugación (300 g, 5 minutos y temperatura ambiente) y se lavan con un tampón apropiado. Después se resuspenden las células en tampón, se precalientan a 37°C, preferentemente a una densidad celular de 5 x 106 células/ml. Se incuban partes alícuotas de la suspensión de células con el fármaco considerado durante preferentemente 5 minutos a 37°C. La reacción se inicia mediante la adición de ionóforo de calcio A23187 y ácido araquidónico. Después de la incubación a 37°C, la reacción se detiene añadiendo metanol que contiene prostaglandina B2 como patrón interno para el análisis por HPLC. Los productos de reacción de 5-LO se extraen en cloroformo, se secan bajo una corriente de nitrógeno y se resuspenden en disolvente para HPLC. Las muestras se analizan mediante HPLC en fase inversa usando preferentemente un sistema isocrático de disolventes de metanol, agua y ácido acético (75:25:0,01). La elución se controla a preferentemente 270 y 234 nm. Los productos de 5-LO se cuantifican por comparación de las áreas de los picos con los de curvas estándar de patrones auténticos, y se corrigen en cuanto a diferencias minoritarias en la eficiencia de extracción determinada usando el patrón interno de prostaglandina B2. Este método se describe con más detalle en Dixon et al. (1990) y Abramovitz et al. (1993).

Cribado para inhibidores de FLAP

La proteína FLAP descrita antes, o porciones de la misma, puede ser usada en procedimientos de cribado de fármacos para identificar moléculas que son agonistas, antagonistas o inhibidores de la actividad de FLAP. La proteína FLAP, o la porción de la misma usada en tales análisis, puede estar libre en solución o ligada a un soporte sólido. Alternativamente la proteína FLAP, o porciones de la misma, puede expresarse en la superficie de una célula. La células pueden expresar naturalmente la proteína FLAP, o una porción de la misma, o alternativamente la célula puede expresar la proteína FLAP o una porción de la misma a partir de un vector de expresión tal como los descritos anteriormente.

En un método de cribado de fármacos, células hospedadoras eucarióticas o procarióticas que son establemente transformadas con polinucleótidos recombinantes con el fin de que expresen la proteína FLAP o una porción de la misma, son usadas en ensayos de unión competitiva convencionales o en ensayos de unión directa estándar. Por ejemplo, la formación de un complejo entre la proteína FLAP o una porción de la misma y el agente que se está ensayando puede medirse en ensayos de unión directa. Alternativamente, puede medirse la capacidad de un agente de prueba para prevenir la formación de un complejo entre la proteína FLAP o una porción de la misma y un ligando conocido.

Por ejemplo, un ensayo de inhibidor de FLAP puede basarse en la observación de que MK-886, un inhibidor de la biosíntesis de indol leucotrieno, se une con gran afinidad y especificidad a FLAP. La unión del fármaco considerado a FLAP puede ser ensayada mediante un experimento de competición con un análogo radiomarcado de MK-886, el125I-L-691-831. Una suspensión de células que expresan el alelo considerado de FLAP, que contiene preferentemente 2.107 células, se centrifuga a 500 x g durante 10 minutos. Las células sedimentadas se resuspenden después en tampón para lisis. Esta suspensión se somete a sonicación en hielo en tres descargas de 20 segundos. La lisis de las células se comprueba visualmente. La unión se inicia mediante la adición de muestras de lisis celular a pocillos que contienen 125I-L-691-831 y, o bien el fármaco considerado, o nada (testigo). La placa se incuba durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después las muestras se filtran y se lavan. El 125I-L-691-831 unido se determina en un contador. La unión de fármaco específica se define como la diferencia entre la unión en ausencia y en presencia del fármaco considerado. Este ensayo de unión de FLAP se describe con más detalle en Charleson et al. (1992).

Alternativamente, pueden usarse las técnicas de cribado de alta productividad descritas en la Solicitud PCT publicada WO 84/03564. En tales técnicas, un gran número de pequeños péptidos a ensayar en cuanto a la actividad de unión con FLAP son sintetizados sobre una superficie y fijados en la misma. Los péptidos de prueba se ponen en contacto con la proteína FLAP o una porción de la misma, y a continuación se hace una etapa de lavado. La cantidad de proteína FLAP o una porción de la misma que se une al compuesto de prueba se cuantifica usando técnicas convencionales.

En algunos métodos, la proteína FLAP o una porción de la misma puede fijarse a una superficie y ponerse en contacto con un compuesto de prueba. Después de una etapa de lavado, se mide la cantidad de compuesto de prueba que se une a la proteína FLAP o a una porción de la misma.

Cribado en relación con inhibidores de la interacción entre 5-LO y FLAP

Los efectos de un fármaco pueden ser estimados a través de la evaluación de la interacción entre las proteínas 5-LO y FLAP.

La interacción entre las proteínas 5-LO y FLAP puede evaluarse usando dos sistemas híbridos tales como el Matchmaker Two Hybrid System 2 (nº de catálogo K1604-1, Clontech). Como se describe en el manual que acompaña al Matchmaker Two Hybrid System 2 (nº de catálogo K1604-1, Clontech), los ácidos nucleicos que codifican la proteína FLAP o una porción de la misma, se insertan en un vector de expresión de forma que estén en marco con el DNA que codifica el dominio de unión de DNA del activador transcripcional de levadura GAL4. El cDNA de 5-LO o una porción del mismo es insertado en un segundo vector de expresión de forma que estén en marco con el DNA que codifica el dominio de activación de GAL4. Los dos plásmidos de expresión son transformados en la levadura, y la levadura se cultiva en placa en medio de selección que selecciona de acuerdo con la expresión de marcadores seleccionables en cada uno de los vectores de expresión, así como expresión dependiente de GAL4 del gen HIS3.

Los transformantes capaces de desarrollarse en medio falto de histidina son cribados en relación con la expresión de lacZ dependiente de GAL4. Las células que son positivas tanto en la selección de histidina y el ensayo de lacZ, contienen interacción entre las proteínas FLAP y 5-LO.

En otro método, pueden construirse columnas de afinidad que contienen la proteína FLAP o una porción de la misma. En algunas versiones de este método la columna de afinidad contiene proteínas quiméricas en las que la proteína FLAP o una porción de la misma está fusionada con glutatión S-transferasa. La proteína 5-LO se aplica a la columna de afinidad. La proteína 5-LO retenida en la columna de afinidad puede medirse y puede permitir evaluar la interacción entre las proteínas FLAP y 5-LO.

La asociación entre las proteínas FLAP y 5-LO puede también evaluarse usando un biosensor óptico como se describe en Edwards y Leatherbarrow (1997). La principal ventaja del método es que permite la determinación de la velocidad de asociación. Típicamente una molécula de FLAP se une a la superficie del sensor (a través de una matriz de carboximetil dextrano) y una muestra de moléculas de 5-LO se pone en contacto con las moléculas de FLAP. La unión de una molécula de 5-LO a la molécula de FLAP produce un cambio en el índice de refracción y/o el espesor. Este cambio se detecta mediante el biosensor siempre y cuando ocurra en el campo evanescente (que se extiende unos pocos nanómetros de la superficie del sensor). Por ello, el efecto del fármaco candidato sobre la asociación entre las proteínas FLAP y 5-LO puede ser medido con facilidad.

Cribado en relación con modificadores de la expresión

El cribado de modificadores de la expresión es importante ya que puede usarse para detectar modificadores específicos para un alelo o un grupo de alelos de gen FLAP. La alteración de la expresión de FLAP en respuesta a un modificador puede determinarse administrando o combinando el modificador candidato con un sistema de expresión tal como un animal, o una célula, y en un ensayo de transcripción in vitro.

Puede también determinarse el efecto del modificador sobre la transcripción de FLAP y/o los niveles de mRNA en el estado estacionario. Como con los niveles de expresión básicos, son de interés las interacciones específicas del tejido. Se hacen correlaciones entre la capacidad de un modificador de la expresión para afectar a la actividad de FLAP y la presencia de los polimorfismos señalados. Un panel de diferentes modificadores puede ser cribado con el fin de determinar el efecto bajo varias condiciones distintas.

Los niveles de expresión y patrones de FLAP pueden ser analizados mediante hibridación en solución con sondas largas como se describe en la Solicitud de Patente Internacional Nº WO 97/05277. De un modo abreviado, el cDNA de FLAP o el DNA genómico de FLAP descritos anteriormente, o fragmentos de los mismos, se insertan en un sitio de clonación inmediatamente secuencia abajo de una RNA polimerasa de bacteriófago (T3, T7 o SP6) para producir RNA antisentido. Preferentemente, el inserto de FLAP comprende al menos 100 nucleótidos consecutivos o más, de la secuencia de DNA genómico o las secuencias de cDNA, en particular aquellas que comprenden al menos uno de los marcadores bialélicos de la presente invención o los que codifican FLAP mutada. El plásmido se linealiza y se transcribe en presencia de ribonucleótidos que comprenden ribonucleótidos modificados (p. ej. biotina-UTP y DIG-UTP). Un exceso de este RNA doblemente marcado se hibrida en solución con mRNA aislado de células o tejidos de interés. Las hibridaciones se realizan bajo condiciones rigurosas estándar (40-50°C durante 16 horas en un tampón de 80% de formamida, NaCl 0,4 M, pH 7-8). La sonda no hibridada se elimina por digestión con ribonucleasas específicas para RNA monocatenario (es decir, RNasas CL3, T1, Phy M, U2 o A). La presencia de la modificación biotina-UTP permite la captura del híbrido en una placa de microtítulo recubierta con estreptavidina. La presencia de la modificación DIG permite que el híbrido sea detectado y cuantificado mediante ELISA usando un anticuerpo anti-DIG acoplado a fosfatasa alcalina.

El análisis cuantitativo de la expresión del gen FLAP puede realizarse también usando matrices. Como se usa en el presente texto, el término matriz significa una disposición monodimensional, bidimensional o multidimensional de una diversidad de ácidos nucleicos de longitud suficiente para permitir la detección de la expresión de mRNAs capaces de hibridarse con ellos. Por ejemplo, las matrices pueden contener una diversidad de ácidos nucleicos derivados de genes cuyos niveles de expresión se han de evaluar. Las matrices pueden incluir el DNA genómico de FLAP, las secuencias de cDNA de FLAP o las secuencias complementarias a las mismas o fragmentos de las mismas, en particular aquellas que comprenden al menos uno de los marcadores bialélicos descritos en la presente invención o las que codifican FLAP mutada. Preferentemente, los fragmentos son al menos de 15 nucleótidos de longitud. En otras realizaciones, los fragmentos son al menos de 25 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, los fragmentos son al menos de 50 nucleótidos de longitud. Más preferentemente, los fragmentos son al menos de 100 nucleótidos de longitud. En otra realización preferida, los fragmentos son de más de 100 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, los fragmentos pueden ser de más de 500 nucleótidos de longitud.

Por ejemplo, el análisis cuantitativo de la expresión del gen FLAP puede realizarse con una micromatriz de DNA complementario, como se describe en Schena et al. (1995 y 1996). Los cDNAs de FLAP de longitud completa o fragmentos de los mismos se amplifican mediante PCR y se disponen en matriz a partir de una placa de microtítulo de 96 pocillos en portaobjetos de microscopio sililados usando robótica de alta velocidad. Las matrices impresas se incuban en una cámara húmeda para permitir la rehidratación de los elementos de la matriz y se aclaran, una vez en SDS al 0,2% durante 1 minuto, dos veces en agua durante 1 minuto, y una vez durante 5 minutos en solución de

borohidruro sódico. Las matrices se sumergen en agua durante 2 minutos a 95°C, se transfieren en 0,2% de SDS durante 1 minuto, se aclaran dos veces con agua, se secan al aire y se almacenan en la oscuridad a 25°C.

El mRNA de células o de tejido se aísla o se obtiene comercialmente y se preparan sondas mediante una sola ronda de transcripción inversa. Las sondas se hibridan con micromatrices de 1 cm2 bajo un cubreobjetos de vidrio de 14 mm x 14 mm, durante 6 a 12 horas a 60°C. Las matrices se lavan durante 5 minutos a 25°C en tampón de lavado de baja rigurosidad (0,1 x SSC/0,2% de SDS). Las matrices se exploran en 0,1 x SSC usando un dispositivo de escaneo de láser de fluorescencia dotado de un juego de filtros personalizados. Se obtienen medidas exactas de expresión diferencial tomando el promedio de las relaciones de dos hibridaciones independientes.

También puede realizarse el análisis cuantitativo de la expresión del gen FLAP con cDNAs de FLAP de longitud completa o fragmentos de los mismos en matrices de DNA complementario, como se describe en Pietu et al. (1996). El cDNA de FLAP de longitud completa o fragmentos de los mismos se amplifica mediante PCR y se transfiere a membranas. Después, los mRNAs que proceden de varios tejidos o células se marcan con nucleótidos radioactivos. Después de la hibridación y el lavado en condiciones controladas, los mRNAs hibridados se detectan mediante formación de imagen de fósforo o autorradiografía. Se realizan experimentos por duplicado y después se lleva a cabo un análisis cuantitativo de los mRNAs expresados diferencialmente.

Alternativamente, pueden hacerse análisis de expresión usando el DNA genómico de FLAP, el cDNA de FLAP o fragmentos de los mismos, mediante matrices de nucleótidos de alta densidad, como se describe en Lockhardt et al. (1996) y Sosnowsky et al. (1997). Oligonucleótidos de 15 a 50 nucleótidos a partir de las secuencias del DNA genómico de FLAP, las secuencias de cDNA de FLAP, en particular aquellas que comprenden al menos uno de los marcadores bialélicos de la presente invención o las que codifican FLAP mutada, o las secuencias complementarias de las mismas, se sintetizan directamente sobre el chip (Lockhart et al., 1996) o se sintetizan y después se dirigen al chip. (Sosnowski et al., 1997). Preferentemente, los oligonucleótidos son de aproximadamente 20 nucleótidos de longitud.

Las sondas de cDNA de FLAP marcadas con un compuesto apropiado, tal como biotina, digoxigenina o colorante fluorescente, se sintetizan a partir de la población de mRNA apropiada y después se fragmentan al azar hasta un tamaño medio de 50 a 100 nucleótidos. Dichas sondas se hibridan después con el chip. Después de lavar como se describe en Lockhart et al., supra, y aplicar distintos campos eléctricos (Sosnowsky et al., 1997) los colorantes o compuestos marcadores se detectan y se cuantifican. Se realizan hibridaciones por duplicado. El análisis comparativo de la intensidad de la señal que se origina de las sondas de cDNA en el mismo oligonucleótido diana en diferentes muestras de cDNA, indica una expresión diferencial del mRNA de FLAP.

Cribado usando animales transgénicos

Los métodos in vivo pueden utilizar animales transgénicos para el cribado de fármacos. Los ácidos nucleicos que incluyen al menos uno de los polimorfismos dialélicos de interés pueden usarse para generar animales no humanos modificados genéticamente o para generar modificaciones génicas específicas del sitio en líneas de células. Se entiende que el término "transgénico" abarca animales modificados genéticamente que tienen una deleción u otra desactivación (knock out) de la actividad de gen FLAP, que tienen un gen FLAP exógeno que es transmitido establemente en las células hospedadoras, o que tienen un promotor FLAP exógeno unido operativamente a un gen informador (reporter). Pueden hacerse animales transgénicos mediante recombinación homóloga, en la que el locus de FLAP es alterado. Alternativamente, una construcción de ácido nucleico es integrada aleatoriamente en el genoma. Los vectores para la integración estable incluyen, por ejemplo, plásmidos, retrovirus y otros virus animales, y YACs. Son de interés los mamíferos transgénicos, p. ej. vacas, cerdos, cabras, caballos y en particular roedores tales como ratas y ratones. Los animales transgénicos permiten estudiar tanto la eficacia como la toxicidad del fármaco candidato.

A lo largo de esta solicitud, varias publicaciones, patentes y solicitudes de patente publicadas se citan en la presente descripción para describir con más detalle el estado de la técnica a la que pertenece esta patente.

EJEMPLOS

Ejemplo 1

Detección de marcadores bialélicos de FLAP: extracción del DNA

Los donantes eran no emparentados y sanos. Presentaban una diversidad suficiente como para ser representativa de una población francesa heterogénea. El DNA de 100 individuos fue extraído y ensayado para tratar de detectar los marcadores bialélicos.

Se tomaron 30 ml de sangre venosa periférica de cada donante en presencia de EDTA. Las células (el sedimento) se recogieron después de centrifugación durante 10 minutos a 2000 rpm. Los glóbulos rojos se lisaron mediante una solución para lisis (50 ml de volumen final: Tris 10 mM pH 7,6; MgCl2 5 mM; NaCl 10 mM). La solución se centrifugó (10 minutos, 2000 rpm) tantas veces como fueron necesarias para eliminar los glóbulos rojos residuales presentes en el sobrenadante, después de la resuspensión del sedimento en la solución para lisis. El sedimento de glóbulos blancos se lisó durante la noche a 42°C con 3,7 ml de solución para lisis compuesta por:

-

3 ml de TE 10-2 (Tris-HCl 10 mM, EDTA 2 mM)/NaCl 0,4 M;

-

200 !l de SDS al 10%; y

-

500 !l de proteinasa K (2 mg de proteinasa K en TE 10-2/NaCl 0,4 M).

Para la extracción de proteínas, se añadió 1 ml de solución saturada de NaCl (6 M) (1/3,5 v/v). Después de agitar vigorosamente, la solución se centrifugó durante 20 minutos a 10000 rpm.

Para la precipitación de DNA, se añadieron 2 a 3 volúmenes de etanol al 100% al sobrenadante anterior, y la solución se centrifugó durante 30 minutos a 2000 rpm. La solución de DNA se aclaró tres veces con etanol al 70% para eliminar las sales, y se centrifugó durante 20 minutos a 2000 rpm. El sedimento se secó a 37°C y se resuspendió en 1 ml de TE 10-1 o 1 ml de agua. La concentración de DNA se evaluó midiendo la OD (densidad óptica) a 260 nm (1 unidad de OD = 50 !g de DNA/ml).

Para determinar la presencia de proteínas en la solución de DNA, se determinó la relación de OD 260/OD 280. Solamente los preparados de DNA que tienen una relación de OD 260/OD 280 entre 1,8 y 2 fueron usados en los ejemplos subsiguientes que se describen a continuación.

El pool fue constituido mezclando cantidades equivalentes de DNA de cada individuo.

Ejemplo 2

Detección de los marcadores bialélicos: amplificación del DNA genómico mediante PCR

La amplificación de secuencias genómicas específicas de las muestras de DNA del Ejemplo 1 se llevó a cabo en el pool de DNA obtenido con anterioridad. Además, se amplificaron del mismo modo 50 muestras individuales.

Los ensayos de PCR se realizaron usando el protocolo siguiente:

Volumen final

25 !l

DNA

2 ng/!l

MgCl2

2 mM

dNTP (cada uno)

200 !M

cebador (cada uno)

2,9 ng/!l

DNA polimerasa Ampli Taq Gold

0,05 unidades/!l

Tampón para PCR (10x = Tris-HCl 0,1 M pH 8,3 KCl 0,5 M) 1 x

Cada par de primeros cebadores fue diseñado usando la información de secuencia del gen FLAP) GenBank 182657, Kennedy et al. 1991, incorporado al presente texto como referencia) y el software OSP (Hillier y Green, 1991). Estos primeros cebadores tenían aproximadamente 20 nucleótidos de longitud y sus secuencias respectivas se describen en la Tabla 1.

Tabla 1

Amplicón

Margen de posición del amplicón en SEQ ID No 1 PU Margen de posición del cebador de amplificación en SEQ ID No 1 RP Margen de posición complementaria del cebador de amplificación en SEQ ID No 1

10-517

3851 4189 B15 3851 3869 C15 4171 4189

10-518

4120 4390 B16 4120 4138 C16 4372 4390

10-253

4373 4792 B1 4373 4391 C1 4773 4792

10-499

4814 5043 B2 4814 4833 C2 5026 5043

10-500

4956 5422 B3 4956 4972 C3 5405 5422

10-522

5524 5996 B17 5524 5542 C17 5978 5996

10-503

6218 6672 B4 6218 6235 C4 6652 6672

10-504

6522 6790 B5 6522 6539 C5 6772 6790

10-204

7120 7574 B6 7120 7137 C6 7557 7574

10-32

7513 7933 B7 7513 7531 C7 7914 7933

10-33

16114 16533 B8 16114 16132 C8 16515 16533

10-34

24072 24425 B9 24072 24089 C9 24408 24425

10-35

27978 28401 B10 27978 27995 C10 28384 28401

10-36

36020 36465 B11 36020 36039 C11 36446 36465

10-498

36318 36669 B12 36318 36337 C12 36652 36669

12-629

38441 38840 B13 38441 38460 C13 38820 38840

12-628

42233 42749 B14 42233 42253 C14 42731 42749

Preferentemente los cebadores contenían una cola de oligonucleótido común secuencia arriba de las bases específicas señaladas para amplificación que era útil para la secuenciación.

5 Los cebadores PU contienen la siguiente secuencia PU 5' adicional: TGTAAAACGACGGCCAGT (SEQ ID No 14); los cebadores RP contienen la siguiente secuencia RP 5' adicional: CAGGAAACAGCTATGACC (SEQ ID No 15).

La síntesis de estos cebadores se llevó a cabo siguiendo el método de la fosforamidita, en un sintetizador GENSET UFPS 24.1.

La amplificación del DNA se llevó a cabo en un termociclador Genius II. Después de calentar a 94°C durante 10 10 minutos, se realizaron 40 ciclos. cada ciclo comprendía: 30 segundos a 94°C, 55°C durante 1 minuto y 30 segundos a 72°C. Para el alargamiento final, 7 minutos a 72°C terminan la amplificación. Las cantidades de los productos de amplificación obtenidas se determinaron en placas de microtítulo de 96 pocillos, usando un fluorómetro y Picogreen como agente intercalante (Molecular Probes).

Ejemplo 3

15 Detección de los marcadores bialélicos: Secuenciación del DNA genómico amplificado e identificación de polimorfismos

La secuenciación del DNA amplificado obtenido en el Ejemplo 2 se llevó a cabo en secuenciadores ABI 377. Las secuencias de los productos de amplificación se determinaron usando reacciones de secuenciación con terminador didesoxi automáticas, con un protocolo de secuenciación de ciclos con terminador y colorante. Los productos de las 20 reacciones de secuenciación se aplicaron a geles de secuenciación y se determinaron las secuencias.

Los datos de secuencia se siguieron evaluando en cuanto a polimorfismos, para detectar la presencia de marcadores bialélicos entre los fragmento amplificados agrupados en pool. La búsqueda de polimorfismos se basó en la presencia de picos superpuestos en el patrón de electroforesis resultante de diferentes bases que aparecen en la misma posición.

25 Se analizaron 17 fragmentos de amplificación. En estos segmentos se detectaron 28 marcadores bialélicos. La localización de los marcadores bialélicos fue como se muestra en la Tabla 2. Tabla 2

Ampli-Cón

BM Nombre del marcador Frec. de al2 Localiz. en gen FLAP Polimorfismo Posic. del BM en SEQ ID Posic. de 47meros en SEQ ID No 1 Nombre 47meros

al1

al2 No 1 No 2

10-517

A25 10-517-100 5' regul. G C 3950 3927 3973 P25

10-518

A26 10-518-125 5' regul. G T 4243 4220 4266 P26

10-518

A27 10-518-194 5' regul. A G 4312 4289 4335 P27

10-253

A1 10-253-118 4,57 5' regul. A G 4490 4467 4513 P1

10-253

A2 10-253-298 5' regul. G C 4670 4647 4693 P2

10-253

A3 10-253-315 5' regul. C T 4687 4664 4710 P3

10-499

A4 10-499-155 5' regul. A G 4968 4945 4991 P4

10-500

A5 10-500-185 5' regul. C T 5140 5117 5163 P5

10-500

A6 10-500-258 5' regul.. G T 5213 5190 5236 P6

10-500

A7 10-500-410 5' regul. A G 5364 5341 5387 P7

10-522

A28 10-522-71 5' regul. A G 5594 5571 5617 P28

10-503

A8 10-503-159 5' regul. G T 6370 6347 6393 P8

10-504

A9 10-504-172 5' regul. A T 6693 6670 6716 P9

10-504

A10 10-504-243 5' regul. A C 6763 6740 6786 P10

10-204

A11 10-204-326 6,63 5' regul. A G 7445 7422 7498 P11

10-32

A12 10-32-357 33,45 Intrón 1 A C 7870 7847 7893 P12

10-33

A13 10-33-175 2,3 Exón 2 C T 16288 197 16265 16311 P13

10-33

A14 10-33-234 43,98 Intrón 2 A C 16347 16324 16370 P14

10-33

A15 10-33-270 Intrón 2 A G 16383 16360 16406 P15

10-33

A16 10-33-327 24,26 Intrón 2 C T 16440 16417 16463 P16

10-34

A17 10-34-290 Intrón 3 G T 24361 24338 24384 P17

10-35

A18 10-35-358 31,25 Intrón 4 G C 28336 28313 28359 P18

10-35

A19 10-35-390 22,98 Intrón 4 C T 28368 28345 28391 P19

10-36

A20 10-36-164 Exón 5 V127 T 1 A G 36183 423 36160 36206 P20

10-498

A21 10-498-192 Exón 5 A G 36509 779 36486 36532 P21

12-629

A22 12-629-241 28,3 3' regul. G C 38681 38658 38704 P22

12-628

A24 12-628-311 3' regul. T C 42440 42417 42463 P24

12-628

A23 12-628-306 10,27 3' regul. G A 42445 42422 42468 P23

BM se refiere a "marcador bialélico" (por sus siglas en inglés). al1 y al2 se refieren respectivamente al alelo 1 y al

5 alelo 2 del marcador bialélico. "Frec. de al2" se refiere a la frecuencia del alelo 2 en porcentaje en la población testigo caucásica de EE.UU., excepto para el marcador bialélico 10-204/326 para el cual la población son los testigos caucásicos franceses. Las frecuencias correspondieron a una población de donantes de sangre aleatorios de origen caucásico francés.

Los polimorfismos A14 (10-33-234) y A16 (10-33-327) han sido observados en Kennedy et al., 1991. Sin embargo,

10 sus frecuencias en la población eran desconocidas, y por tanto no pueden considerarse marcadores bialélicos validados, hasta que fueron obtenidos los resultados de los presentes inventores.

Ejemplo 4

Validación de los polimorfismos mediante microsecuenciación

Los marcadores bialélicos identificados en el Ejemplo 3 fueron confirmados con más detalle y sus frecuencias respectivas se determinaron mediante microsecuenciación. La microsecuenciación se llevó a cabo para cada muestra 5 de DNA individual descrita en el Ejemplo 1.

La amplificación a partir del DNA genómico de los individuos se llevó a cabo mediante PCR como se describió anteriormente para la detección de los marcadores bialélicos con el mismo conjunto de cebadores de PCR (Tabla 1).

Los cebadores preferidos usados en la microsecuenciación tenían aproximadamente 19 nucleótidos de longitud y se hibridaron justo secuencia arriba de la base polimórfica considerada. Sus secuencias se describen en la Tabla 3 a 10 continuación.

Tabla 3

Nombre del marcador

marcador bialélico Mis. 1 Margen de posición del cebador de microsec. mis. 1 en SEQ ID No 1 Mis. 2 Margen de posición complementaria del cebador de microsec. mis. 2 en SEQ ID No 1

10-517-100

A25 D25 3930 3949 E25 3951 3970

10-518-125

A26 D26 4223 4242 E26 4244 4263

10-518-194

A27 D27 4292 4311 E27 4313 4332

10-253-118

A1 D1 4470 4489 E1 4491 4510

10-253-298

A2 D2 4650 4669 E2 4671 4690

10-253-315

A3 D3 4667 4686 E3 4688 4707

10-499-155

A4 D4 4948 4967 E4 4969 4988

10-500-185

A5 D5 5120 5239 E5 5141 5160

10-500-258

A6 D6 5193 5212 E6 5214 5233

10-500-410

A7 D7 5344 5363 E7 5365 5384

10-522-71

A28 D28 5574 5593 E28 5595 5614

10-503-159

A8 D8 6350 6369 E8 6371 6390

10-504-172

A9 D9 6673 6692 E9 6694 6713

10-504-243

A10 D10 6743 6762 E10 6764 6783

10-204-326

A11 D11 7425 7444 E11 7646 7465

10-32-357

A12 D12 7850 7869 E12 7871 7890

10-33-175

A13 D13 16268 16287 E13 16289 16308

10-33-234

A14 D14 16327 16346 E14 16348 16367

10-33-270

A15 D15 16363 16382 E15 16384 16403

10-33-327

A16 D16 16420 16439 E16 16441 16460

10-34-290

A17 D17 24341 24360 E17 24362 24381

10-35-358

A18 D18 28316 28335 E18 28337 28356

10-35-390

A19 D19 28348 28367 E19 28369 28388

10-36-164

A20 D20 36163 36182 E20 36184 36203

10-498-192

A21 D21 36489 36508 E21 36510 36529

12-629-241

A22 D22 38661 38680 E22 38682 38701

12-628-311

A24 D24 42420 42439 E24 42441 42460

12-628-306

A23 D23 42425 42444 E23 42446 42465

Mis 1 y Mis 2 se refieren respectivamente a cebadores de microsecuenciación que se hibridan con la cadena no codificadora del gen FLAP o con la cadena codificadora del gen FLAP.

Las reacciones de microsecuenciación se realizaron de la forma siguiente:

Se añadieron 5 !l de productos de la PCR a 5 !l de mezcla de purificación 2U SAP (fosfato alcalino Shrimp) (Amersham E70092X)); 2U Exonucleasa I (Amersham E70073Z); 1 !l de tampón SAP (Tris-HCl 200 mM pH 8, Mg2Cl 100 mM) en una placa de microtítulo. La mezcla de reacción se incubó 30 minutos a 37°C y después se desnaturalizó 10 minutos a 94°C. Entonces se añadieron a cada pocillo 20 !l de mezcla de reacción de microsecuenciación que contiene 10 pmoles de oligonucleótido para microsecuenciación (19meros, GENSET, síntesis cruda, 5 OD), 1 U de Thermosequenase (Amersham E79000G), 1,25 !l de tampón Thermosequenase (Tris HCl 260 mM pH 9,5, MgCl2 65 mM), y los dos ddNTPs fluorescentes apropiados, complementarios a los nucleótidos en el sitio polimórfico correspondiente a ambas bases polimórficas (TAMRA-ddTTP 11,25 nM; ROX-ddCTP 16,25 nM; REG-ddATP 1,675 nM; RHO-ddGTP 1,24 nM; Dye Terminator Set 401095 (terminador marcado con colorante) de Perkin Elmer). Después de 4 minutos a 94°C, se llevaron a cabo 20 ciclos de PCR de 15 segundos a 55°C, 5 segundos a 72°C y 10 segundos a 94°C en un termociclador Tetrad PTC-225 (MJ Research). La placa de microtítulo se centrifugó durante 10 segundos a 1500 rpm. Los terminadores con colorante no incorporados se eliminaron por precipitación con 19 !l de MgCl2 2 mM y 55 !l de etanol al 100%. Después de 15 minutos de incubación a temperatura ambiente, la placa de microtítulo se centrifugó a 3300 rpm durante 15 minutos a 4°C. Después de desechar los sobrenadantes, la placa de microtítulo se evaporó a sequedad bajo presión reducida (Speed Vac); las muestras se resuspendieron en 2,5 !l de tampón de carga de EDTA formamida y se calentaron durante 2 minutos a 95°C. Se cargaron 0,8 !l de reacción de microsecuenciación en un gel para microsecuenciación de poliacrilamida al 10% (19:1). Los datos fueron recogidos por un secuenciador de DNA ABI PRISM 377 y se procesaron usando el software GENESCAN (Perkin Elmer).

Ejemplo 5

Estudio de asociación entre el asma y los marcadores bialélicos del gen FLAP: recogida de muestras de DNA de individuos no afectados y afectados

El rasgo de enfermedad seguido en este estudio de asociación fue el asma, una enfermedad en la que interviene la vía de los leucotrienos.

La población asmática correspondía a 297 individuos que tomaron parte en un estudio clínico para la evaluación del fármaco anti-asmático Zileuton. Más del 90% de estos 297 individuos asmáticos tenían un origen étnico caucásico.

La población testigo correspondía a individuos no afectados. En este estudio de asociación se usa o bien la población caucásica francesa (190 individuos) o la población caucásica de EE.UU. (286 individuos) como población testigo. La población testigo preferida es la población caucásica de EE.UU. ya que la población asmática comprende esencialmente individuos de EE.UU.

Ejemplo 6

Estudio de asociación entre el asma y los marcadores bialélicos del gen FLAP: genotipado de individuos afectados y testigos

La estrategia general para realizar los estudios de asociación fue explorar individualmente las muestras de DNA procedentes de todos los individuos de cada una de las poblaciones descritas anteriormente, con el fin de establecer las frecuencias de alelos de los marcadores bialélicos anteriormente descritos en cada una de estas poblaciones.

Las frecuencias alélicas de los marcadores bialélicos anteriormente descritos en cada población se determinaron realizando reacciones de microsecuenciación en fragmentos amplificados obtenidos mediante PCR genómica realizada en las muestras de DNA de cada individuo. La PCR genómica y la microsecuenciación se realizaron como se detalla en los ejemplos 2 y 4 usando la PCR descrita y cebadores de microsecuenciación.

Ejemplo 7

Estudio de asociación entre el asma y los marcadores bialélicos del gen FLAP

A) Estudios de asociación para el gen del asma con población testigo caucásica francesa

Este estudio de asociación utiliza 293 individuos asmáticos y 185 testigos caucásicos franceses.

Como se muestra en la Figura 2 (A), los marcadores 10-32/357 y 10-35/390 presentaba una intensa asociación con el asma, siendo esta asociación altamente significativa (valor de p = 1,95 X 10-3 para el marcador 10-32/357 y 1,75 x 10-3 para el marcador 10-35/390). Los dos marcadores 10-32/357 y 10-35/390 pueden usarse entonces en diagnóstico con una prueba basada en cada marcador. Los otros dos marcadores mostraron una asociación moderada cuando se ensayaron independientemente, a saber 33/234 y 35/358.

B) Estudios de asociación para el gen del asma con población testigo caucásica de EE.UU.

Este estudio de asociación utiliza 297 individuos asmáticos y 286 testigos caucásicos de EE.UU.

Como se muestra en la Figura 2 (B), el marcador bialélico 10-35/390 presentaba una intensa asociación con el asma, siendo esta asociación altamente significativa (valor de p = 2,29 X 10-3). Los dos marcadores 10-32/357 y 1032/234 mostraron una débil asociación cuando se ensayaron independientemente.

El marcador bialélico 10-35/390 está situado en la secuencia genómica de FLAP. Por tanto, los resultados del estudio de asociación indican que un polimorfismo del gen FLAP parece estar relacionado con el asma. El marcador bialélico 10-35/390 puede entonces ser usado in diagnóstico con una prueba basada en este marcador o en una combinación de marcadores bialélicos que comprenden este marcador.

Ejemplo 8

Estudios de asociación: análisis de la frecuencia de haplotipos

Una forma de aumentar el poder estadístico de marcadores individuales es realizando el análisis de asociación de haplotipos.

El análisis de haplotipos para observar la asociación de marcadores FLAP y asma se realizó estimando las frecuencias de todos los haplotipos posibles que comprenden marcadores bialélicos elegidos entre el grupo consistente en 10-253/298, 10-32/357, 10-33/175, 10-33/234, 10-33/327, 10-35/358, 10-35/390, 12-628/306, y 12-629/241 en las poblaciones testigo asmáticas y caucásicas de EE.UU. descritas en el Ejemplo 7, y comparando estas frecuencias por medio de una prueba estadística de la ji al cuadrado (un grado de libertad). Las estimaciones de haplotipos se realizaron aplicando el algoritmo de Expectación-Maximización (EM) (Excoffier L y Slatkin M, 1995), usando el programa EM-HAPLO (Hawley ME, Pakstis AJ y Kidd KK, 1994).

Los haplotipos más significativos obtenidos se muestran en la Figura 3.

Los haplotipos de dos marcadores preferidos, descritos en la Figura 3 como HAP1 a HAP7, comprenden o bien el marcador 10-33/234 (alelo A) o bien el marcador 10-35/390 (alelo T). El haplotipo de dos marcadores más preferido HAP1 (A en 10-33/234 y T en 10-35/390) presentaron un valor p de 8,2 x 10-4 y una razón de posibilidades (odd ratio) de 1,61. Las frecuencias de haplotipos estimadas fueron 28,3% en los casos y 19,7% en los testigos de EE.UU. Los otros dos haplotipos HAP2 (A en 10-33/234 y G en 12-629/241) y HAP3 (T en 10-33/327 y T en 1033/390) presentaron respectivamente un valor de p de 1,6 x 10-3 y 1,8 x 10-3, una razón de posibilidades de 1,65 y 1,53 y frecuencias de haplotipos de 0,305 y 0,307 para la población asmática y de 0,210 y 0,224 para la población testigo de EE.UU.

Los haplotipos de tres marcadores preferidos comprenden el marcador 10-33/234 (alelo A) y el marcador 10-35/390 (alelo T): HAP37, HAP38, HAP39 y HAP41. El haplotipo de tres marcadores más preferido HAP37 (A en 10-33/234, T en 10-33/390 y C en 12-628/306) presentó un valor de p de 8,6 x 10-4 y una razón de posibilidades de 1,76. Las frecuencias de haplotipo estimadas fueron 26,5% en los casos y 17,1% en los testigos de EE.UU. Hay otro haplotipo de tres marcadores HAP40 (A en 10-33/234 , C en 12-628/306 y G en 12-629/241) que es también significativo.

Los haplotipos de cuatro marcadores (HAP121 a HAP125), haplotipos de cinco marcadores (HAP247 y HAP248) y haplotipos de seis marcadores (HAP373) mostraron valores de p significativos. Todos ellos comprenden el marcador 10-33/234 (alelo A) y el marcador 10-35/390 (alelo T), excepto el haplotipo HAP124 que no comprende el marcador 10-35/390. Los otros marcadores se eligen entre el grupo consistente en 10-235/298 (alelo C), 10-35/358 (alelo G), 12-628/306 (alelo C) y 12-629/241 (alelo G).

El haplotipo más preferido que comprende A en 10-33/234 y T en 10-35/390 (HAP1 en la Figura 3) es también significativo en un análisis de frecuencias de haplotipos con una población asmática y testigos caucásicos franceses. En realidad, este haplotipo presentó un valor de p de 2,7 x 10-3 y una razón de posibilidades de 1,67. Las frecuencias de haplotipo estimadas fueron 28,3% en los casos y 19,2% en los testigos franceses (véase la Figura 4).

El haplotipo HAP1 es el haplotipo más preferido de la presente invención. Puede usarse en el diagnóstico del asma. Además, la mayor parte de los haplotipos significativos asociados con el asma comprenden el marcador bialélico 1035/390 (alelo A) y también podrían usarse en diagnóstico.

La significación estadística de los resultados obtenidos para el análisis de haplotipos fue evaluada mediante una prueba de permutación fenotípica reiterada 1000 o 10000 veces en un ordenador. Para esta simulación por ordenador, los datos de los individuos asmáticos y testigos se agruparon en pool y se asignaron aleatoriamente a dos grupos que contenían el mismo número de individuos que en las poblaciones de caso-testigo usadas para producir los datos que se resumen en la Figura 3. Después se realizó un análisis de haplotipo en estos grupos artificiales para los 2 marcadores incluidos en el haplotipo HAP1 que mostró la asociación más intensa con el asma. Este experimento se reiteró 1000 y 10000 veces y los resultados se muestran en la Figura 4. Estos resultados demuestran que entre 1000 iteraciones ninguno, y entre 10000 iteraciones solamente 1 de los haplotipos obtenidos tenía un valor de p comparable al obtenido para el haplotipo HAP1. Estos resultados validad claramente la significación estadística de la asociación entre este haplotipo y el asma.

Ejemplo 9

Preparación de composiciones de anticuerpos contra la variante 127-Ile de FLAP

Se aísla proteína o polipéptido sustancialmente puros de células transfectadas o transformadas que contienen un vector de expresión que codifica la proteína FLAP o una porción de la misma. La concentración de proteína en el preparado final se ajusta, por ejemplo, mediante concentración en un dispositivo de filtración Amicon, hasta el nivel de unos pocos microgramos/ml. El anticuerpo monoclonal o policlonal contra la proteína puede entonces prepararse de la forma que sigue:

A. Producción de anticuerpo monoclonal por fusión de hibridoma

El anticuerpo monoclonal contra epítopos de la proteína FLAP o una porción de la misma puede prepararse a partir de hibridomas murinos de acuerdo con el métodos clásico de Kohler, G. y Milstein, C. (1975) o métodos derivados del mismo. Véase también Harlow, E. y D. Lane, 1988.

De forma abreviada, se inocula un ratón repetidas veces con unos pocos microgramos de la proteína FLAP o una porción de la misma, a lo largo de un periodo de unas pocas semanas. El ratón es después sacrificado, y se aíslan las células productoras de anticuerpo del bazo. Las células del bazo se fusionan mediante polietilenglicol con células de mieloma de ratón, y el exceso de células no fusionadas se destruye desarrollando el sistema en medio selectivo que comprende aminopterina (medio HAT). Las células fusionadas con éxito se diluyen y se ponen partes alícuotas de la dilución en los pocillos de una placa de microtítulo, en los que prosigue el desarrollo del cultivo. Los clones productores de anticuerpo se identifican, detectando el anticuerpo en el líquido sobrenadante de los pocillos por procedimientos de inmunoensayo, tales como ELISA, como se describe originalmente en Engvall, E (1980), y métodos derivados del mismo. Los clones positivos seleccionados pueden expandirse y su producto de anticuerpos monoclonales puede recolectarse para su uso. Los procedimientos detallados para la producción de anticuerpos monoclonales se describen en Davies, L. et al. "Basic Methods in Molecular Biology", Elsevier, Nueva York, Seccción 21

2.

B. Producción de anticuerpos policlonales por inmunización

Puede prepararse un antisuero policlonal que contiene anticuerpos contra epítopos heterogéneos en la proteína FLAP o una porción de la misma, inmunizando animales no humanos adecuados con la proteína FLAP o una porción de la misma, que puede ser no modificada o modificada para potenciar la inmunogenicidad. Un animal no humano adecuado es preferentemente un mamífero no humano, normalmente un ratón, rata, conejo, cabra o caballo. Alternativamente, un preparado crudo que ha sido enriquecido para concentración de FLAP puede ser usado para generar anticuerpos. Tales proteínas, fragmentos o preparados se introducen en el mamífero no humano en presencia de un coadyuvante apropiado (p. ej. hidróxido de aluminio, RIBI, etc.) que es conocido en la técnica. Además, la proteína, el fragmento o el preparado pueden ser pretratados con un agente que aumente la antigenicidad; tales agentes son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, albúmina de suero bovino metilada (mBSA, por sus siglas en inglés), albúmina de suero bovino (BSA), antígeno de superficie de la hepatitis B, y hemocianina de la lapa californiana (KLH: Keyhole Limpet hemocyanin). El suero del animal inmunizado se recoge, se trata y se ensaya de acuerdo con procedimientos conocidos. Si el suero contiene anticuerpos policlonales contra los epítopos no deseados, los anticuerpos policlonales pueden ser purificados por cromatografía de inmunoafinidad.

La producción de anticuerpos policlonales efectivos es afectada por muchos factores relacionados tanto con el antígeno como con la especie hospedadora. También, los animales hospedadores varían en respuesta al sitio de las inoculaciones y la dosis, con el resultado de que una dosis de antígeno tanto inadecuada como excesiva dan lugar a antisueros de título bajo. Las dosis de antígeno pequeñas (a nivel de ng) administradas en múltiples sitios intradérmicos parecen ser las más fiables. Las técnicas para producir y procesar antisueros policlonales son conocidas en este campo; véase por ejemplo Mayer y Walker (1987). Un protocolo de inmunización efectivo para conejos puede encontrarse en Vaitukaitis, J. et al. (1971).

Pueden darse inyecciones de refuerzo o reinmunización (booster) a intervalos regulares, y puede recolectarse el antisuero cuando comienza a descender su título de anticuerpo, determinado de forma semi-cuantitativa, por ejemplo por doble inmunodifusión en agar frente a concentraciones conocidas de antígeno. Véase por ejemplo Ouchterlony, O. et al. (1973). La concentración plató de anticuerpo está habitualmente en el intervalo de 0,1 a 0,2 mg/ml de suero (aproximadamente 12 !M). La afinidad de los antisueros por el antígeno se determina preparando curvas de unión competitiva, como se describe por ejemplo en Fisher, D. (1980).

Los preparados de anticuerpo obtenidos de acuerdo con el protocolo monoclonal, o bien con el policlonal, son útiles en inmunoensayos cuantitativos que determinan concentraciones de sustancias que llevan antígeno en muestras biológicas; también se usan de forma semi-cuantitativa o cualitativa para identificar la presencia de antígeno en una muestra biológica. Los anticuerpos pueden también usarse en composiciones terapéuticas para destruir células que expresan la proteína o reducir los niveles de la proteína en el cuerpo.

Aunque la realización preferida de la invención ha sido ilustrada y descrita, se apreciará que un experto en la técnica puede hacer varios cambios en la misma sin apartarse del espíritu ni del alcance de la invención.

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Listado de secuencias

<110> Genset SA

<120> Secuencia genómica de la proteína que activa la 5-lipoxigenasa (FLAP), marcadores polimorficos de la misma y métodos para la detección de asma.

<130> FLAP

<150> 60/081,893

<151> 1998-04-15

<150> 60/091,314

<151> 1998-06-30

<150> 60/123,406

<151> 1999-03-08

<160> 15

<170> Patent.pm

<210> 1

<211> 43069

<212> DNA

<213> homo sapiens

<220> <221> característica_miscelánea

<222> 1..7708

<223> región potencialmente reguladora de 5'

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> 36604..43069

<223> región potencialmente reguladora de 5'

<220>

<221> exón

<222> 7709..7852

<223> exón1

<220>

<221> exón

<222> 16236..16335

<223> exón2

<220>

<221> exón

<222> 24227..24297

<223> exón3

<220>

<221> exón

<222> 28133..28214

<223> exón4

<220>

<221> exón

<222> 36128..36605

<223> exón5

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> 7783..7785

<223> ATG

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> 36288.. 36290

<223> parada: TAA

<220>

<221> señal_poliA

<222> 36581.. 36586

<223> AATAAA

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> 7008.. 8116

<223> homología con secuencia en banco génico ref: M60470

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> 15995.. 16549

<223> homología con secuencia en banco génico ref: M63259

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> 24059.. 24597

<223> homología con secuencia en banco génico ref: M63260

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> 27873.. 28412

<223> homología con secuencia en banco génico ref: M63261

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> 35977.. 36926

<223> homología con secuencia en banco génico ref: M63262

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> 7613

<223> deleción nucleotídica divergente de un A en ref : M60470

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> 16347

<223> nucleótido divergente G en ref : M63259

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> 16348

<223> nucleótido divergente A en ref : M63259

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> 24060

<223> deleción nucleotídica divergente de un G en ref : M63260

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> 24067

<223> deleción nucleotídica divergente de un G en ref : M63260

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> 27903

<223> deleción nucleotídica divergente de un C en ref : M63261

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> 28327

<223> deleción nucleotídica divergente de un G en ref : M63261

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> 3851.. 4189

<223> 10-517

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> 4120.. 4390

<223> 10-518

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> 4373_.4792

<223> 10-253

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> 4814...5043

<223> 10-499

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> 4956_.5422

<223> 10-500

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> 5524.. 5996

<223> 10-522

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> 6218.. 6672

<223> 10-503

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> 6522.. 6790

<223> 10-504

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> 7120..7574

<223> 10-204

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> 7513.. 7933

<223> 10-32

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> 16114..16533

<223> 10-33

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> 24072..24425

<223> 10-34

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> 27978..28401

<223> 10-35

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> 36020..36465

<223> 10-36

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> 36318..36669

<223> 10-498

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> 38441..38840

<223> 12-629

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> 42233..42749

<223> complemento 12-628

<220>

<221> alelo

<222> 3950

<223> 10-517-100 : base polimórfica G o C

<220>

<221> alelo

<222> 4243

<223> 10-518-125 : base polimórfica G o T

<220>

<221> alelo

<222> 4312

<223> 10-518-194 : base polimórfica A o G

<220>

<221> alelo

<222> 4490

<223> 10-253-118 : base polimórfica A o G

<220>

<221> alelo

<222> 4670

<223> 10-253-298 : base polimórfica G o C

<220>

<221> alelo

<222> 4687

<223> 10-253-315 : base polimórfica C o T

<220>

<221> alelo

<222> 4968

<223> 10-499-155 : base polimórfica A o G

<220>

<221> alelo

<222> 5140

<223> 10-500-185 : base polimórfica C o T

<220>

<221> alelo

<222> 5213

<223> 10-500-258 : base polimórfica G o T

<220>

<221> alelo

<222> 5364

<223> 10-500-410 : base polimórfica A o G

<220>

<221> alelo

<222> 5594

<223> 10-522-71 : base polimórfica A o G

<220>

<221> alelo

<222> 6370

<223> 10-503-159 : base polimórfica G o T

<220>

<221> alelo

<222> 6693

<223> 10-504-172 : base polimórfica A o T

<220>

<221> alelo

<222> 6763

<223> 10-504-243 : base polimórfica A o C

<220>

<221> alelo

<222> 7445

<223> 10-204-326 : base polimórfica A o G

<220>

<221> alelo

<222> 7870

<223> 10-32-357 : base polimórfica A o C

<220>

<221> alelo

<222> 16288

<223> 10-33-175 : base polimórfica C o T

<220>

<221> alelo

<222> 16347

<223> 10-33-234 : base polimórfica A o C

<220>

<221> alelo

<222> 16383

<223> 10-33-270 : base polimórfica A o G

<220>

<221> alelo

<222> 16440

<223> 10-33-327 : base polimórfica C o T

<220>

<221> alelo

<222> 24361

<223> 10-34-290 : base polimórfica G o T

<220>

<221> alelo

<222> 28336

<223> 10-35-358 : base polimórfica G o C

<220>

<221> alelo

<222> 28368

<223> 10-35-390 : base polimórfica C o T

<220>

<221> alelo

<222> 36183

<223> 10-36-164 : base polimórfica A o G

<220>

<221> alelo

<222> 36509

<223> 10-498-192 : base polimórfica A o G

<220>

<221> alelo

<222> 38681 <223> 12-629-241 : base polimórfica G o C

<220>

<221> alelo

<222> 42440

<223> 12-628-311 : base polimórfica T o C

<220>

<221> alelo

<222> 42445

<223> 12-628-306 : base polimórfica G o A

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 3930..3949

<223> potencialmente 10-517-100.mis1

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 3951..3970

<223> potencialmente 10-517-100.mis2 complementaria

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 4223..4242

<223> potencialmente 10-518-125.mis1

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 4244..4263

<223> potencialmente 10-518-125.mis2 complementaria

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 4292..4311

<223> potencialmente 10-518-194.mis1

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 4313..4332

<223> potencialmente 10-518-194.mis2 complementaria

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 4470..4489

<223> potencialmente 10-253-118.mis1

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 4491..4510

<223> potencialmente 10-253-118.mis2 complementaria

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 4650..4669

<223> potencialmente 10-253-298.mis1

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 4671..4690

<223> potencialmente 10-253-298.mis2 complementaria

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 4667..4686

<223> potencialmente 10-253-315.mis1

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 4688..4707

<223> potencialmente 10-253-315.mis2 complementaria

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 4948..4967

<223> potencialmente 10-499-155.mis1

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 4969..4988

<223> potencialmente 10-499-155.mis2 complementaria

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 5120..5139

<223> potencialmente 10-500-185.mis1

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 5141..5160

<223> potencialmente 10-500-185.mis2 complementaria

<220> <221> unión_miscelánea

<222> 5193..5212

<223> potencialmente 10-500-258.mis1

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 5214..5233

<223> potencialmente 10-500-258.mis2 complementaria

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 5344..5363

<223> potencialmente 10-500-410.mis1

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 5365..5384

<223> potencialmente 10-500-410.mis2 complementaria

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 5574..5593

<223> potencialmente 10-522-71.mis1

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 5595..5614

<223> potencialmente 10-522-71.mis2 complementaria

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 6350..6369

<223> potencialmente 10-503-159.mis1

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 6371..6390

<223> potencialmente 10-503-159.mis2 complementaria

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 6673..6692

<223> potencialmente 10-504-172.mis1

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 6694..6713

<223> potencialmente 10-504-172.mis2 complementaria

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 6743..6762

<223> potencialmente 10-504-243.mis1

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 6764..6783

<223> potencialmente 10-504-243.mis2 complementaria

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 7425..7444

<223> potencialmente 10-204-326.mis1

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 7446..7465

<223> 10-204-326.mis2 complementaria

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 78507869

<223> 10-32-357.mis1

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 7871..7890

<223> potencialmente 10-32-357.mis2 complementaria

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 16268..16287

<223> 10-33-175.mis1

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 16289..16308

<223> potencialmente 10-33-175.mis2 complementaria

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 16327..16346

<223> 10-33-234.mis1

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 16348..16367

<223> potencialmente 10-33-234.mis2 complementaria

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 16363..16382

<223> 10-33-270.mis1

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 16384..16403

<223> potencialmente 10-33-270.mis2 complementaria

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 16420..16439

<223> 10-33-327.mis1

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 16441..16460

<223> potencialmente 10-33-327.mis2 complementaria

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 24341..24360

<223> 10-34-290.mis1

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 24362..24381

<223> potencialmente 10-34-290.mis2 complementaria

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 28316..28335

<223> potencialmente 10-35-358.mis1

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 28337..28356

<223> 10-35-358.mis2 complementaria

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 28348..28367

<223> potencialmente 10-35-390.mis1

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 28369..28388

<223> potencialmente 10-35-390.mis2 complementaria

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 36163..36182

<223> potencialmente 10-36-164.mis1

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 36184..36203

<223> 10-36-164.mis2 complementaria

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 36489..36508

<223> potencialmente 10-498-192.mis1

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 36510..36529

<223> potencialmente 10-498-192.mis2 complementaria

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 38661..38680

<223> 12-629-241.mis1

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 38682..38701

<223> potencialmente 12-629-241.mis2 complementaria

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 42420..42439

<223> potencialmente 12-628-311.mis2

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 42441..42460

<223> potencialmente 12-628-311.mis1 complementaria

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 42425..42444

<223> potencialmente 12-628-306.mis2

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 42446..42465

<223> 12-628-306.mis1 complementaria

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 3927..3973

<223> potencialmente 10-517-100.sonda

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 4220..4266

<223> potencialmente 10-518-125.sonda

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 4289..4335

<223> potencialmente 10-518-194.sonda

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 4467..4513

<223> potencialmente 10-253-118.sonda

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 4647..4693

<223> potencialmente 10-253-298.sonda

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 4664..4710

<223> potencialmente 10-253-315.sonda

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 4945..4991

<223> potencialmente 10-499-155.sonda

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 5117..5163

<223> potencialmente 10-500-185.sonda

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 5190..5236

<223> potencialmente 10-500-258.sonda

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 5341..5387

<223> potencialmente 10-500-410.sonda

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 5571..5617

<223> potencialmente 10-522-71.sonda

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 6347..6393

<223> potencialmente 10-503-159.sonda

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 6670..6716

<223> potencialmente 10-504-172.sonda

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 6740..6786

<223> potencialmente 10-504-243.sonda

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 7422..7468

<223> potencialmente 10-204-326.sonda

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 7847..7893

<223> potencialmente 10-32-357.sonda

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 16265..16311

<223> potencialmente 10-33-175.sonda

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 16324..16370

<223> potencialmente 10-33-234.sonda

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 16360..16406

<223> potencialmente 10-33-270.sonda

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 16417..16463

<223> potencialmente 10-33-327.sonda

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 24338..24384

<223> potencialmente 10-34-290.sonda

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 28313..28359

<223> potencialmente 10-35-358.sonda

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 28345..28391

<223> potencialmente 10-35-390.sonda

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 36160..36206

<223> potencialmente 10-36-164.sonda

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 36486..36532

<223> potencialmente 10-498-192.sonda

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 38658..38704

<223> potencialmente 12-629-241.sonda

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 42417..42463

<223> potencialmente 12-628-311.sonda

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 42422..42468

<223> potencialmente 12-628-306.sonda

<220>

<221> unión_cebador

<222> 3851..3869

<223> cebador 10-517 para amplificación secuencia arriba

<220>

<221> unión_cebador

<222> 4171..4189

<223> cebador 10-517 para amplificación secuencia abajo, complement.

<220>

<221> unión_cebador

<222> 4120..4138

<223> cebador 10-518 para amplificación secuencia arriba

<220>

<221> unión_cebador

<222> 4372..4390

<223> cebador 10-518 para amplificación secuencia abajo, complement.

<220>

<221> unión_cebador

<222> 4373..4391

<223> cebador 10-253 para amplificación secuencia arriba

<220>

<221> unión_cebador

<222> 4773..4792

<223> cebador 10-253 para amplificación secuencia abajo, complement. <220>

<221> unión_cebador

<222> 4814..4833

<223> cebador 10-499 para amplificación secuencia arriba

<220>

<221> unión_cebador

<222> 5026..5043

<223> cebador 10-499 para amplificación secuencia abajo, complement.

<220>

<221> unión_cebador

<222> 4956..4972

<223> cebador 10-500 para amplificación secuencia arriba

<220>

<221> unión_cebador

<222> 5405..5422

<223> cebador 10-500 para amplificación secuencia abajo, complement.

<220>

<221> unión_cebador

<222> 5524..5542

<223> cebador 10-522 para amplificación secuencia arriba

<220>

<221> unión_cebador

<222> 5978..5996

<223> cebador 10-522 para amplificación secuencia abajo, complement.

<220>

<221> unión_cebador

<222> 6218..6235

<223> cebador 10-503 para amplificación secuencia arriba

<220>

<221> unión_cebador

<222> 6652..6672

<223> cebador 10-503 para amplificación secuencia abajo, complement.

<220>

<221> unión_cebador

<222> 6522..6539

<223> cebador 10-504 para amplificación secuencia arriba

<220> <221> unión_cebador

<222> 6772..6790

<223> cebador 10-504 para amplificación secuencia abajo, complement.

<220>

<221> unión_cebador

<222> 7120..7137

<223> cebador 10-204 para amplificación secuencia arriba

<220>

<221> unión_cebador

<222> 7557..7574

<223> cebador 10-204 para amplificación secuencia abajo, complement.

<220>

<221> unión_cebador

<222> 7513..7531

<223> cebador 10-32 para amplificación secuencia arriba

<220>

<221> unión_cebador

<222> 7914..7933

<223> cebador 10-32 para amplificación secuencia abajo, complementaria

<220>

<221> unión_cebador

<222> 16114..16132

<223> cebador 10-33 para amplificación secuencia arriba

<220>

<221> unión_cebador

<222> 16515..16533

<223> cebador 10-33 para amplificación secuencia abajo, complementaria

<220>

<221> unión_cebador

<222> 24072..24089

<223> cebador 10-34 para amplificación secuencia arriba

<220>

<221> unión_cebador

<222> 24408..24425

<223> cebador 10-34 para amplificación secuencia abajo, complementaria

<220>

<221> unión_cebador

<222> 27978..27995

<223> cebador 10-35 para amplificación secuencia arriba

<220>

<221> unión_cebador

<222> 28384..28401

<223> cebador 10-35 para amplificación secuencia abajo, complementaria

<220>

<221> unión_cebador

<222> 36020..36039

<223> cebador 10-36 para amplificación secuencia arriba

<220>

<221> unión_cebador

<222> 36446..36465

<223> cebador 10-36 para amplificación secuencia abajo, complementaria

<220>

<221> unión_cebador

<222> 36318..36337

<223> cebador 10-498 para amplificación secuencia arriba

<220>

<221> unión_cebador

<222> 36652..36669

<223> cebador 10-498 para amplificación secuencia abajo, complement.

<220>

<221> unión_cebador

<222> 38441..38460

<223> cebador 12-629 para amplificación secuencia arriba

<220>

<221> unión_cebador

<222> 38820..38840

<223> cebador 12-629 para amplificación secuencia abajo, complement.

<220>

<221> unión_cebador

<222> 42233..42253

<223> cebador 12-628 para amplificación secuencia abajo

<220>

<221> unión_cebador

<222> 42731..42749

<223> cebador 12-628 para amplificación secuencia arriba, complement.

<210> 2

<211> 875

<212> DNA

<213> homo sapiens

<220>

<221> 5'UTR

<222> 1..74

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> 75..77

<223> ATG

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> 558..560

<223> parada: TAA

<220>

<221> señal_poliA

<222> 851..856

<223> AATAAA

<220>

<221> 3'UTR

<222> 561..875

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> 74..584

<223> homología con secuencia en embl ref: X52195

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> 354

<223> nucleótido divergente C en embl ref : X52195

<220>

<221> característica_miscelánea

<222> 555

<223> nucleótido divergente T en embl ref : X52195

<220>

<221> alelo

<222> 197

<223> 10-33-175 : base polimórfica C o T

<220>

<221> alelo

<222> 453

<223> 10-36-164 : base polimórfica A o G

<220>

<221> alelo

<222> 779

<223> 10-498-192 : base polimórfica A o G <210> 3

<211> 161

<212> PRT

<213> homo sapiens

<220>

<221> VARIANTE

<222> 127

<223> 10-36-164 : aminoácido polimórfico Val o Ile

<210> 4

<211> 46

<212> DNA

<213> homo sapiens

<400> 4

ctacactgcc aagtgagtcc taaacctgat gttgctaata agtggg

46

<210> 5

<211> 46

<212> DNA

<213> homo sapiens

<400> 5

ctacactgcc aagtgagtcc taaccctgat gttgctaata agtggg

46

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> homo sapiens

<400> 6

ggacatttag ggttgcttg

19

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> homo sapiens

<400> 7

tgttttgaca ctagcactc

19

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> homo sapiens

<400> 8

actgccaagt gagtcctaa

19

<210> 9

<211> 48

<212> DNA

<213> homo sapiens

<400> 9

ctgactagga cctctgattc ttctctccct gagctttgaa ggctctga

48

<210> 10

<211> 48

<212> DNA

<213> homo sapiens

<400> 10

ctgactagga cctctgattc ttctttccct gagctttgaa ggctctga

18

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> homo sapiens

<400> 11

gaaggttctc aggtttcc

18

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> homo sapiens

<400> 12

agctgtattt tcagagcc

18

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> homo sapiens

<400> 13

taggacctct gattcttct

19

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> homo sapiens

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 1..18

<223> secuenciación oligonucleótido CebadorPU

<400> 14

tgtaaaacga cggccagt

18

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> homo sapiens

<220>

<221> unión_miscelánea

<222> 1..18

<223> secuenciación oligonucleótido CebadorRP

<400> 15

caggaaacag ctatgacc

18

Claims (33)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un método de genotipado que comprende determinar la identidad de un nucleótido en un marcador bialélico relacionado con FLAP de SEQ ID No 1, o el complemento del mismo, que está asociado con el asma, en una muestra biológica, en el que dicho marcador bialélico relacionado con FLAP se elige entre el grupo consistente en los marcadores bialélicos en las posiciones 3950, 4243, 4312, 4490, 4670, 4687, 4968, 5140, 5213, 5364, 5594, 6370, 6693, 6763, 7445, 7870, 16288, 16347, 16383, 16440, 24361, 28336, 28368, 36183, 36509, 38681, 42440 y 42445 de la SEQ ID No 1.

2. 2.

   Un método según la reivindicación 1, en el que dicha muestra biológica se deriva de un único sujeto.

3. 3.

   Un método según la reivindicación 2, en el que la identidad de los nucleótidos en dichos marcadores bialélicos se determina para ambas copias de dicho marcador bialélico presente en el genoma de dicho individuo.

4. 4.

   Un método según la reivindicación 1, en el que dicha muestra biológica se deriva de múltiples sujetos.

5. 5.

   Un método según la reivindicación 1, que comprende además amplificar una parte de dicha secuencia que comprende el marcador bialélico, antes de dicha etapa de determinación.

6. 6.

   Un método según la reivindicación 5, en el que dicha amplificación se realiza mediante PCR.

7. 7.

   Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicha determinación se realiza mediante un ensayo elegido entre el grupo consistente en un ensayo de hibridación, un ensayo de secuenciación, un ensayo de microsecuenciación y un ensayo de detección de discordancias basado en enzimas.

8. 8.

   Un método para estimar la frecuencia de un alelo de un marcador bialélico relacionado con FLAP en una población testigo o positiva para el asma, que comprende:

   a) genotipar individuos de dicha población en relación con dicho marcador bialélico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7; y

   b) determinar la representación proporcional de dicho marcador bialélico en dicha población.
9. 9. Un método para detectar una asociación entre un genotipo y un fenotipo, que comprende las etapas de:

   a) determinar la frecuencia de al menos un marcador bialélico relacionado con FLAP en una población positiva para el asma de acuerdo con el método según la reivindicación 8;

   b) determinar la frecuencia de al menos un marcador bialélico relacionado con FLAP en una población testigo de acuerdo con el método según la reivindicación 8; y

   c) determinar si existe una asociación estadísticamente significativa entre dicho genotipo y dicho fenotipo.
10. 10. Un método para estimar la frecuencia de un haplotipo para un conjunto de marcadores bialélicos en una población testigo o en una población positiva para el asma, que comprende:

    a) genotipar al menos un marcador bialélico relacionado con FLAP de acuerdo con la reivindicación 3 para cada individuo de dicha población;

    b) genotipar un segundo marcador bialélico determinando la identidad de los nucleótidos en dicho segundo marcador bialélico para ambas copias de dicho segundo marcador bialélico presente en el genoma de cada individuo de dicha población; y

    c) aplicar un método de determinación de haplotipos a las identidades de los nucleótidos determinadas en las etapas a) y b) para obtener una estimación de dicha frecuencia.

11. 11.

    Un método según la reivindicación 10, en el que dicho método de determinación de haplotipos se elige entre el grupo que consiste en amplificación mediante PCR asimétrica, amplificación mediante PCR doble de alelos específicos, el algoritmo de Clark, o un algoritmo de expectación-maximización.

12. 12.

    Un método para detectar una asociación entre un haplotipo y un rasgo de asma, que comprende las etapas de:

    a) estimar la frecuencia de al menos un haplotipo en una población positiva para el asma, de acuerdo con el método según la reivindicación 10;

    b) estimar la frecuencia de dicho haplotipo en una población testigo, de acuerdo con el método según la reivindicación 10; y

    c) determinar si existe una asociación estadísticamente significativa entre dicho haplotipo y dicho rasgo de asma.

13. 13.

    Un método según la reivindicación 9, en el que dichas etapas de genotipado a) y b) se realizan en una única muestra biológica agrupada, derivada de cada una de dichas poblaciones.

14. 14.

    Un método según la reivindicación 9, en el que dichas etapas de genotipado a) y b) se realizan por separado en muestras biológicas derivadas de cada individuo de dichas poblaciones.

15. 15.

    Un método según la reivindicación 9 o la reivindicación 12, en el que dicha población testigo es una población negativa para el asma.

16. 16.

    Un método según la reivindicación 9 o la reivindicación 12, en el que dicha población testigo es una población aleatoria.

17. 17.

    Un método para determinar si un individuo corre el riesgo de desarrollar asma, que comprende:

    a) genotipar al menos un marcador bialélico relacionado con FLAP de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7; y

    b) correlacionar el resultado de la etapa a) con el riesgo de desarrollar asma.

18. 18.

    Un método según las reivindicaciones 1 a 17, en el que dicho marcador bialélico relacionado con FLAP se elige entre la siguiente lista de marcadores bialélicos situados en las posiciones 4670, 16347, 16440, 28336, 28368, 38681 y 42445 de la SEQ ID No 1.

19. 19.

    Un método según la reivindicación 18, en el que dicho marcador bialélico relacionado con FLAP es el marcador bialélico en la posición 28368 de SEQ ID No 1.

20. 20.

    El uso de un polinucleótido que comprende un tramo contiguo de al menos 12 nucleótidos de la SEQ ID No 1 o la secuencia complementaria del mismo, para determinar la identidad del nucleótido en un marcador bialélico relacionado con FLAP, en el que dicho marcador bialélico relacionado con FLAP se elige entre el grupo consistente en el marcador bialélico en posición 3950, 4243, 4312, 4490, 4670, 4687, 4968, 5140, 5213, 5364, 5594, 6370, 6693, 6763, 7445, 7870, 16288, 16347, 16383, 16440, 24361, 28336, 28368, 36183, 36509, 38681, 42440 y 42445 de SEQ ID No 1.

21. 21.

    El uso según la reivindicación 20 en un ensayo de microsecuenciación, en el que el extremo 3' de dicho tramo contiguo está situado en el extremo 3' de dicho polinucleótido, y en el que el extremo 3' de dicho polinucleótido está situado 1 nucleótido secuencia arriba de dicho marcador bialélico relacionado con FLAP en dicha secuencia.

22. 22.

    El uso según la reivindicación 20 en un ensayo de hibridación, en el que dicho tramo incluye dicho marcador bialélico relacionado con FLAP.

23. 23.

    El uso según la reivindicación 20 en un ensayo de amplificación específica, en el que el extremo 3’ de dicho tramo contiguo está situado en el extremo 3' de dicho polinucleótido, y dicho marcador bialélico relacionado con FLAP está presente en el extremo 3' de dicho polinucleótido.

24. 24.

    El uso según la reivindicación 20 en un ensayo de secuenciación, en el que el extremo 3' de dicho tramo contiguo está situado en el extremo 3' de dicho polinucleótido.

25. 25.

    El uso según las reivindicaciones 20 a 24, en el que dicho marcador bialélico relacionado con FLAP es un marcador bialélico elegido entre el grupo que consiste en los marcadores bialélicos en las posiciones 4670, 16347, 16440, 28336, 28368, 38681 y 42445 de la SEQ ID No 1.

26. 26.

    El uso según la reivindicación 25, en el que dicho marcador bialélico relacionado con FLAP es el marcador bialélico en posición 28368 de SEQ ID No 1.

27. 27.

    Un polinucleótido aislado, purificado o recombinante que comprende un tramo contiguo de al menos 25 nucleótidos de SEQ ID No 1, o la secuencia complementaria del mismo, en el que dicho tramo contiguo comprende:

    -un nucleótido elegido entre el grupo que consiste en una A en la posición 7445, una A en la posición 7870, una A en la posición 16383, una T en la posición 24361, una G en la posición 28336, una T en la posición 28368, una A en la posición 36183, y una G en la posición 36509 de SEQ ID No 1.

28. 28.

    Un polinucleótido aislado, purificado o recombinante que comprende un tramo contiguo de al menos 25 nucleótidos de SEQ ID No 2 o la secuencia complementaria del mismo, en el que dicho tramo contiguo comprende una A en la posición 453, o una G en la posición 779 de SEQ ID No 2.

29. 29.

    Un polinucleótido aislado, purificado o recombinante que codifica un polipéptido que comprende un tramo contiguo de al menos 6 aminoácidos de SEQ ID No 3, en el que dicho tramo contiguo incluye un resto de isoleucina en la posición de aminoácido 127 en SEQ ID No 3.

30. 30.

    Un vector recombinante que comprende un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 29.

31. 31.

    Una célula hospedadora que comprende un vector recombinante según la reivindicación 30.

32. 32.

    Un polipéptido aislado, purificado o recombinante que comprende un tramo contiguo de al menos 6 aminoácidos de SEQ ID No 3, en el que dicho tramo contiguo incluye un resto de isoleucina en la posición de aminoácido 127 de SEQ ID No 3.

33. 33.

    Una composición de anticuerpo aislado o purificado capaz de unirse selectivamente a un fragmento que contiene un epítopo, de un polipéptido según la reivindicación 32, en la que dicho epítopo comprende un resto de isoleucina en la posición de aminoácido 127 de SEQ ID No 3.