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ES2264159T3 - Mejoras en/o relacionadas con agentes de diagnostico/terapeuticos. - Google Patents

Mejoras en/o relacionadas con agentes de diagnostico/terapeuticos.

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Publication number
ES2264159T3
ES2264159T3 ES97910514T ES97910514T ES2264159T3 ES 2264159 T3 ES2264159 T3 ES 2264159T3 ES 97910514 T ES97910514 T ES 97910514T ES 97910514 T ES97910514 T ES 97910514T ES 2264159 T3 ES2264159 T3 ES 2264159T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
microbubbles
agent
gas
minutes
vector
Prior art date
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Expired - Lifetime
Application number
ES97910514T
Other languages
English (en)
Inventor
Jo Klaveness
Pal Rongved
Anders Hoegset
Helge Amersham Health AS TOLLESHAUG
Anne Naevestad
Halldis Hellebust
Lars Hoff
Alan Amersham Health AS CUTHBERTSON
Dagfinn Amersham Health AS LOEVHAUG
Magne Amersham Health AS SOLBAKKEN
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
GE Healthcare AS
Original Assignee
Amersham Health AS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority claimed from GBGB9622368.0A external-priority patent/GB9622368D0/en
Priority claimed from GBGB9622366.4A external-priority patent/GB9622366D0/en
Priority claimed from GBGB9700699.3A external-priority patent/GB9700699D0/en
Priority claimed from GBGB9708265.5A external-priority patent/GB9708265D0/en
Priority claimed from GBGB9711842.6A external-priority patent/GB9711842D0/en
Priority claimed from GBGB9711846.7A external-priority patent/GB9711846D0/en
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Abstract

La invención se refiere a agentes de diagnóstico y/o terapéuticamente activos susceptibles de ser focalizados, por ejemplo agentes de contraste utilizados en ecografía, que comprenden indicadores que contienen microburbujas rellenas de gas y estabilizadas por monocapas de tensioactivos filmógenos, estando cada indicador asociado o ligado a al menos un vector.

Description

Mejoras en/o relacionadas con agentes de diagnóstico/terapéuticos.
Esta invención se refiere a agentes de diagnóstico y/o terapéuticamente activos, más particularmente a agentes de diagnóstico y/o terapéuticamente activos que incorporan restos que interaccionan con o tienen afinidad por sitios y/o estructuras en el cuerpo de modo que puede potenciarse la formación de imágenes de diagnóstico y/o terapia de posiciones particulares en el cuerpo. Son de particular interés agentes de diagnóstico para su uso en formación de imágenes por ultrasonidos, que se mencionan más adelante como agentes de contraste por ultrasonidos dirigidos.
Es bien sabido que la formación de imágenes por ultrasonidos comprende una herramienta de diagnóstico potencialmente valiosa, por ejemplo en estudios del sistema vascular, particularmente en cardiopatía, y de la microvasculatura tisular. Se ha propuesto una diversidad de agentes de contraste para potenciar las imágenes acústicas obtenidas de este modo, incluyendo suspensiones de partículas sólidas, gotas líquidas emulsionadas, burbujas de gas y gases o líquidos encapsulados. Generalmente se acepta que los agentes de contraste de baja densidad que son fácilmente comprimibles son particularmente eficaces en términos de la retrodispersión acústica que generan, y por lo tanto se ha demostrado un interés considerable en la preparación de sistemas que contienen gas y generan
gas.
También se sabe que los medios de contraste que contienen gas son eficaces en formación de imágenes por resonancia magnética (MR), por ejemplo, como agentes de contraste de susceptibilidad que funcionarán para reducir la intensidad de la señal MR. Los medios de contraste que contienen oxígeno también representan agentes de contraste MR paramagnéticos potencialmente útiles.
Además, en el campo de la formación de imágenes por rayos X se ha observado que los gases tales como dióxido de carbono pueden: usarse como agentes de contraste orales negativos o agentes de contraste intravasculares.
El uso de gases radiactivos, por ejemplo, isótopos radiactivos de gases inertes tales como xenón, también se ha propuesto en centelleografía, por ejemplo, para formación de imágenes de combinación de sangre.
Los agentes de contraste por ultrasonidos dirigidos puede considerarse que comprenden (i) un resto informador capaz de interaccionar con irradiación de ultrasonidos para generar una señal detectable; (ii) uno o más vectores que tienen afinidad por sitios y/o estructuras diana particulares en el cuerpo, por ejemplo, por células o áreas específicas de patología; y (iii) uno o más enlazadores que conectan dicho informador y vector o vectores, en el caso de que éstos no estén unidos directamente.
Las moléculas y/o estructuras a las que pretende unirse el agente se mencionarán más adelante como la diana. Para obtener formación de imágenes específicas de o un efecto terapéutico en una región/estructura seleccionada en el cuerpo, la diana debe estar presente y disponible en esta región/estructura. De manera ideal, se expresará sólo en la región de interés, pero habitualmente también estará presente en otras posiciones en el cuerpo, creando posibles problemas de fondo. La diana puede especie molecular definida (es decir, una molécula diana) o una molécula desconocida o estructura más compleja (es decir, una estructura diana) que está presente en el área que se quiere formar imágenes y/o tratar, y es capaz de unirse específica o selectivamente a una molécula vector dada.
El vector se acopla o une al resto informador para unir estos restos a la región/estructura que se quiere formar imágenes y/o tratar. El vector puede unirse específicamente a una diana elegida, o puede unirse sólo selectivamente, teniendo afinidad también por una cantidad limitada de moléculas/estructuras diferentes, otra vez creando posibles problemas de fondo.
Hay un cuerpo limitado de la técnica anterior con relación a agentes de contraste por ultrasonidos dirigidos. Por tanto, por ejemplo, el documento US-A-5531980 se refiere a sistemas en los que el informador comprende una suspensión acuosa de aire o microburbujas de gas estabilizadas por uno o más tensioactivos de formación de películas presentes al menos parcialmente en forma lamelar o laminar, estando unido dicho tensioactivo o tensioactivos a uno o más vectores que comprenden "especies bioactivas diseñadas para propósitos de dirección específica". Está establecido que las microburbujas no se encapsulan directamente por el material tensioactivo sino que éste se incorpora en liposomas cargados con líquido que estabilizan las microburbujas. Se apreciará que el material tensioactivo lamelar o laminar tal como fosfolípidos presentes en dichos liposomas estarán inevitablemente presentes en forma de una o más bicapas lipídicas con las colas lipófilas "contiguas" y las cabezas hidrófilas hacia el interior y el exterior (véase, por ejemplo, Schneider, M. en "Liposomes as drug carriers: 10 years of research" en Drug targeting, Nyon, Suiza, 3-5 octubre 1984, Buri, P. y Gumma, A. (Ed), Elsevier, Amsterdam (1984).
El documento EP-A-0727225 describe agentes de contraste por ultrasonidos dirigidos en los que el informador comprende un compuesto químico que tiene una presión de vapor suficiente de modo que una parte del mismo es un gas a temperatura corporal del sujeto. Este compuesto químico está asociado con un tensioactivo o vehículo de albúmina que incluye un ligando molecular de adhesión celular basado en proteína, péptido o carbohidrato como vector. Los restos informadores en dichos agentes de contraste corresponden con sistemas coloidales de cambio de fase descritos en el documento WO-A-9416739; ahora está reconocido que la administración de dichos coloides de cambio de fase puede conducir a la generación de microburbujas que crecen de manera incontrolable, posiblemente hasta el grado en el que provoquen embolia potencialmente peligrosa de, por ejemplo, la vasculatura del miocardio y el cerebro (véase, por ejemplo, Schwarz, Advances in Echo-Contrast [1994(3)], pág. 48-49).
El documento WO-A-9320802 propone que la potenciación de las imágenes por ultrasonidos específicas de tejido pueden conseguirse usando liposomas oligolamelares de reflexión acústica conjugados con ligandos específicos de tejido tales como anticuerpos, péptidos, lectinas, etc. Los liposomas se eligen deliberadamente para que estén desprovistos de gas y por tanto no tendrán las propiedades ecogénicas ventajosas de los agentes de contraste por ultrasonidos basados en gas. Se encuentran referencias adicionales a esta tecnología, por ejemplo, en la dirección a fibrina, trombos y áreas ateroscleróticas en publicaciones por Alkanonyuksel, H. et al. en J. Pharm. Sci. (1996) 85(5), 486-490; J. Am. Coll. Cardiol. (1996) 27(2) Supl. A, 298A; y Circulation, 68 Sci. Sessions, Anaheim 13-16 noviembre
1995.
También hay varias publicaciones con respecto a agentes de contraste por ultrasonidos que se refieren al posible uso de anticuerpos monoclonales como vectores sin proporcionar detalles prácticos significativos y/o informes que comprendan materiales que pueden captarse por el sistema reticuloendotelial y por tanto permitan la potenciación de las imágenes de órganos tales como el hígado - véanse, por ejemplo, los documentos WO-A-9300933, WO-A-9401140, WO-A-9408627, WO-A-9428874, US-A-5088499, US-A-5348016 y US-A-5469854.
La presente invención se basa en el descubrimiento de que las microburbujas rellenas con gas estabilizadas por monocapas de material tensioactivo de formación de películas son informadores particularmente útiles en agentes de diagnóstico y/o terapéuticos dirigidos. Por tanto, por ejemplo, la flexibilidad y deformabilidad de dichas membranas monocapa delgadas potencia sustancialmente la ecogenicidad de dichos informadores en relación a los sistemas de liposoma que contienen bicapas lipídicas o muchas de dichas bicapas. Esto puede permitir el uso de dosis muy bajas del material informador para conseguir una eficacia de contraste por ultrasonidos alta, con beneficios de seguridad consiguientes.
Por tanto, de acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un agente de diagnóstico y/o terapéuticamente activo dirigible, por ejemplo, un agente de contraste por ultrasonidos, que comprende una suspensión en un vehículo líquido acuoso, por ejemplo, un vehículo líquido inyectable, de un informador que comprende microburbujas rellenas con gas estabilizadas por monocapas de material tensioactivo de formación de películas, comprendiendo adicionalmente dicho agente al menos un vector.
El término "monocapa" se usa en este documento para indicar que los restos tensioactivos anfífilos forman películas o membranas monocapa similares a las denominadas películas de Langmuir-Blodgett en las superficies de contacto gas-líquido, con las partes lipófilas de los restos anfífilos alineados hacia la fase gaseosa y las partes hidrófilas interaccionando con la fase acuosa.
Como se indica en el documento WO-A-9729783, se cree que la repulsión electrostática entre membranas fosfolipídicas cargadas estimula la formación de monocapas estables y de estabilización en superficies de contacto microburbuja-vehículo líquido. La flexibilidad y deformabilidad de dichas membranas delgadas se cree que potencia la ecogenicidad de los productos de acuerdo con la invención descritos en la misma con relación a liposomas cargados con gas que comprenden una o más bicapas lipídicas. La cantidad de fosfolípido usado para estabilizar dichas suspensiones acuosas que contienen microburbujas puede ser tan baja como la necesaria para la formación de monocapas únicas de tensioactivo alrededor de cada microburbuja de gas, estabilizando la estructura tipo película resultante a las microburbujas contra el hundimiento o fusión. Las microburbujas con una bicapa de tensioactivo tipo liposoma se cree que no se obtienen cuando se usan dichas concentraciones bajas de fosfolípidos.
Una realización ventajosa de la invención se basa en el descubrimiento adicional de que la adhesión limitada a las dianas es una propiedad altamente útil de los agentes de diagnóstico y/o terapéuticamente activos, propiedad que puede conseguirse usando vectores que proporcionan una retención temporal en lugar de una adhesión fijada a una diana. Por tanto, dichos agentes, en lugar de retenerse de manera fija en los sitios específicos, pueden, por ejemplo, mostrar de manera eficaz una forma de flujo retardado en todo el endotelio vascular debido a sus interacciones transitorias con células endoteliales. Dichos agentes pueden, por tanto, llegar a estar concentrados en las paredes de los vasos sanguíneos, proporcionando en el caso de agentes de contraste por ultrasonidos ecogenicidad potenciada de los mismos con relación al volumen del flujo sanguíneo, que está desprovisto de características anatómicas. Por lo tanto, pueden permitir una formación de imágenes potenciada del sistema capilar, incluyendo la microvasculatura, y por tanto pueden facilitar la distinción entre tejido normal y tejido inadecuadamente perfundido, por ejemplo, en el corazón, y también pueden ser útiles para visualizar estructuras tales como células de Kupffer, trombos y lesiones ateroscleróticas o para visualizar áreas de tejido neovascularizado e inflamado. La presente invención es particularmente adecuada para cambios en la formación de imágenes que sucede en los vasos sanguíneos normales situados en áreas de necrosis tisular.
En una realización adicional de la presente invención, pueden unirse uno o más vectores a o incluirse en el informador de un modo tal que los vectores no se exponen fácilmente a la diana o receptores diana. La especificidad tisular aumentada puede, por ejemplo, conseguirse aplicando un proceso adicional para exponer los vectores, por ejemplo, exponiendo el agente después de la administración a ultrasonidos externos de modo que se modifique la difusibilidad de los restos que contienen los vectores.
Puede estar presente cualquier gas biocompatible en el informador, incluyendo el término "gas" como se usa en este documento cualquier sustancia (incluyendo mezclas) sustancial o completamente en forma gaseosa (incluyendo vapor) a la temperatura corporal humana normal de 37ºC. El gas puede, por tanto, por ejemplo, comprender aire; nitrógeno; oxígeno; dióxido de carbono; hidrógeno; un gas inerte tal como helio, argón, xenón o criptón; un fluoruro de azufre tal como hexafluoruro de azufre, decafluoruro de disulfuro o pentafluoruro de trifluorometilazufre; hexafluoruro de selenio; un silano opcionalmente halogenado tal como metilsilano o dimetilsilano; hidrocarburo de bajo peso molecular (por ejemplo, conteniendo hasta 7 átomos de carbono), por ejemplo, un alcano tal como metano, etano, un propano, un butano o un pentano, un cicloalcano tal como ciclopropano, ciclobutano o ciclopentano, un alqueno tal como etileno, propeno, propadieno o un buteno, o un alquino tal como acetileno o propino; un éter tal como dimetil éter; una cetona; un éster; un hidrocarburo de bajo peso molecular halogenado (por ejemplo, conteniendo hasta 7 átomos de carbono); o una mezcla de cualquiera de los anteriores. De manera ventajosa, al menos algunos de los átomos de halógeno en los gases halogenados son átomos de flúor; por tanto, los gases de hidrocarburo halogenado biocompatibles pueden, por ejemplo, seleccionarse entre bromoclorodifluorometano, clorodifluorometano, diclorodifluorometano, bromotrifluorometano, clorotrifluorometano, cloropentafluoroetano, diclorotetrafluoroetano, clorotrifluoroetileno, fluoroetileno, etilfluoruro, 1,1-difluoroetano y perfluorocarburos, por ejemplo, perfluoroalcanos tales como perfluorometano, perfluoroetano, perfluoropropanos, perfluorobutanos (por ejemplo, perfluoro-n-butano, opcionalmente en mezcla con otros isómeros tales como perfluoro-isobutano), perfluoropentanos, perfluorohexanos y perfluoroheptanos; perfluoroalquenos tales como perfluoropropeno, perfluorobutenos (por ejemplo, perfluorobut-2-eno) y perfluorobutadieno; perfluoroalquinos tales como perfluorobut-2-ino; y perfluorocicloalcanos tales como perfluorociclobutano, perfluorometilciclobutano, perfluorodimetilciclobutanos, perfluorotrimetilciclobutanos, perfluorociclopentano, perfluorometilciclopentano, perfluorodimetilciclopentanos, perfluorociclohexano, perfluorometilciclohexano y perfluorocicloheptano. Otros gases halogenados incluyen cloruro de metilo, cetonas fluoradas (por ejemplo, perfluoradas) tales como perfluoroacetona y éteres fluorados (por ejemplo, perfluorados) tales como perfluorodietil éter. El uso de engases perfluorados, por ejemplo hexafluoruro de azufre y perfluorocarburos tales como perfluoropropano, perfluorobutanos y perfluoropentanos, puede ser particularmente ventajoso en vista de la alta estabilidad reconocida en el flujo sanguíneo de microburbujas que contienen dichos gases.
El gas puede comprender una sustancia tal como butano, ciclobutano, n-pentano, isopentano, neopentano, ciclopentano, perfluoropentano, perfluorociclopentano, perfluorohexano o una mezcla que contenga uno o más de dichos gases que sea líquida a temperaturas de manejo y procesamiento pero gaseosa a temperatura corporal, por ejemplo, como se describe en el documento WO-A-9416739 mencionado anteriormente, ya que las monocapas de tensioactivo de formación de películas en unidades informadoras de acuerdo con la invención pueden estabilizar las microburbujas resultantes contra el crecimiento incontrolable.
En principio, puede emplearse cualquier tensioactivo de formación de películas apropiado para formar las monocapas de encapsulación de gas, incluyendo materiales tensioactivos de formación de paredes no poliméricos y no polimerizables, por ejemplo, como se describe en el documento WO-A-9521631; material tensioactivo polimérico, por ejemplo, como se describe en el documento WO-A-9506518; y fosfolípidos, por ejemplo, como se describe en los documentos WO-A-9211873, WO-A-9217212, WO-A-9222247, WO-A-9428780, WO-A-9503835 o WO-A-9729783. De manera ventajosa, el 75%, preferiblemente sustancialmente todo, el tensioactivo de formación de películas presente en los agentes de acuerdo con la invención se incorpora en las monocapas en las superficies de contacto gas-líquido.
Los ejemplos representativos de fosfolípidos útiles incluyen lecitinas (es decir, fosfatidilcolinas), por ejemplo, lecitinas naturales tales como lecitina de yema de huevo o lecitina de semilla de soja y lecitinas sintéticas o semisintéticas tales como dimiristoilfosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina o diestearoilfosfatidilcolina; ácidos fosfatídicos; fosfatidiletanolaminas; fosfatidilserinas; fosfatidilgliceroles; fosfatidilinositoles; cardiolipinas; esfingomielinas; análogos fluorados de cualquiera de los anteriores; mezclas de cualquiera de los anteriores y mezclas con otros lípidos tales como colesterol.
Se ha descubierto que el uso de fosfolípidos que comprenden predominantemente (por ejemplo, al menos un 75%) moléculas que albergan individualmente una carga neta global pueden ser particularmente ventajosas, especialmente cuando se usan en forma de esencialmente el único componente anfífilo del informador, y pueden transmitir beneficios valiosos en términos de parámetros tales como estabilidad del producto y propiedades acústicas. Sin el deseo de limitarse por ninguna consideración teórica, se cree que la repulsión electrostática entre membranas fosfolipídicas cargadas puede estimular la formación de monocapas estables en las superficies de contacto gas-líquido; como se ha indicado anteriormente, la flexibilidad y deformabilidad de dichas membranas delgadas potenciará la ecogenicidad de los informadores usados de acuerdo con la invención con relación a liposomas cargados con gas que comprenden una o más bicapas lipídicas.
El uso de fosfolípidos cargados también puede proporcionar informadores con propiedades ventajosas con respecto a, por ejemplo, la estabilidad, dispersabilidad y resistencia a la fusión sin recurrir a aditivos tales como tensioactivos adicionales y/o potenciadores de la viscosidad, asegurando de este modo que la cantidad de componentes administrados al cuerpo de un sujeto después de la inyección de los agentes de contraste se mantenga en un mínimo. Por tanto, por ejemplo, las superficies cargadas de las microburbujas pueden minimizar o evitar su agregación como resultado de la repulsión electrostática.
De manera deseable, al menos un 75%, preferiblemente sustancialmente todo el material fosfolipídico usado en los informadores en agentes de la invención consta de moléculas que albergan una carga neta global en condiciones de preparación y/o uso, carga que puede ser positiva o, más preferiblemente, negativa. Los fosfolípidos cargados positivamente representativos incluyen ésteres de ácidos fosfatídicos tales como ácido dipalmitoilfosfatídico o ácido diestearoil-fosfatídico con aminoalcoholes tales como hidroxietiletilendiamina. Los ejemplos de fosfolípidos cargados negativamente incluyen fosfatidilserinas, fosfatidilgliceroles, fosfatidilinositoles, ácidos fosfatídicos y cardiolipinas de origen natural (por ejemplo, obtenidos de semilla de soja o de yema de huevo), semisintéticos (por ejemplo, parcial o completamente hidrogenados) y sintéticos. Los grupos acilo graso de dichos fosfolípidos típicamente contendrán cada uno aproximadamente 14-22 átomos de carbono, por ejemplo, como en los grupos palmitoilo y estearoilo. Las formas liso de dichos fosfolípidos cargados también son útiles de acuerdo con la invención, indicando el término "liso" fosfolípidos que contienen sólo un grupo acilo graso, estando éste preferiblemente unido a un éster en el átomo de carbono de la posición 1 del resto glicerilo. Dichas formas liso de fosfolípidos cargados pueden usarse de manera ventajosa en mezcla con fosfolípidos cargados que contienen dos grupos acilo graso.
Las fosfatidilserinas representan fosfolípidos particularmente preferidos para su uso en agentes de acuerdo con la invención y preferiblemente constituyen una parte sustancial, por ejemplo, al menos un 80% del contenido en fosfolípidos de los mismos, por ejemplo, un 85-92%. Aunque no se desea limitarse por ninguna consideración teórica, puede ser que la formación de puentes iónicos entre los grupos carboxilo y amino de restos de serina adyacentes contribuya a la estabilidad de dichos sistemas informadores. Las fosfatidilserinas preferidas incluyen fosfatidilserina natural saturada (por ejemplo, hidrogenada o sintética) y diestearoilfosfatidilserina, dipalmitoilfosfatidilserina y diaraquidoilfosfatidilserina sintéticas.
Otros lípidos potencialmente útiles incluyen fosfatidiletanolaminas opcionalmente mezcladas con uno o más lípidos tales como ácido esteárico, ácido palmítico, estearilamina, palmitilamina, colesterol, gliceroles de bisalquilo, esfingoglicolípidos, lípidos sintéticos tales como cloruro o bromuro de N,N-dimetil-N-octadecil-1-ocatadecanoamonio (DODAC, DODAB), y/o bisalquilésteres de ácido maleico.
Los lípidos ejemplares adicionales que pueden usarse para preparar agentes de contraste que contienen gas incluyen ácidos grasos, ácido esteárico, ácido palmítico, ácido 2-n-hexadecilesteárico, ácido oleico, y otras estructuras lipídicas que contienen ácido. Dichas estructuras lipídicas pueden acoplarse por formación de enlaces amida a aminoácidos que contienen uno o más grupos amino; los aminoácidos modificados con lípidos resultantes (por ejemplo, dipalmitoil-lisina o ácido diestearoil-2,3-diaminopropiónico) pueden ser precursores útiles para la unión de elementos espaciadores funcionalizados que tienen sitios de acoplamiento para la conjugación de una o más moléculas vector.
Los estabilizadores útiles adicionales incluyen lipopéptidos que comprenden un lípido unido a una parte enlazadora peptídica que está adecuadamente funcionalizada para acoplarse a una o más moléculas vector. Una preferencia particular es la inclusión de un elemento enlazador peptídico cargado positivamente (por ejemplo, que comprende dos o más restos de lisina) capaz de anclarse a través de interacción electrostática con microburbujas informadoras estabilizadas por fosfolípidos cargados negativamente u otras membranas tensioactivas.
Otra realización de la invención comprende microburbujas funcionalizadas que llevan uno o más grupos reactivos para una reacción no específica con moléculas de receptor localizadas en las superficies celulares. Las microburbujas que comprenden un resto tiol, por ejemplo, pueden unirse a receptores de superficie celular mediante reacciones de intercambio de disulfuro. La naturaleza reversible de dichas reacciones supone que el flujo de las microburbujas pueda controlarse alterando el medio redox. De manera similar, las microburbujas funcionalizadas con membranas que comprenden ésteres activados tales como ésteres de N-hidroxisuccinimida pueden usarse para reaccionar con grupos amino encontrados en una multiplicidad de moléculas de superficie celular.
Los agentes de contraste que contienen microburbujas propuestos previamente basados en fosfolípidos, por ejemplo, como se describe en el documento WO-A-9409829, se preparan típicamente poniendo en contacto un tensioactivo en polvo, por ejemplo, liposomas preformados secados por congelación o soluciones de fosfolípidos secadas por congelación o secadas por pulverización, con aire u otro gas y después con un vehículo acuoso, agitando para generar una suspensión de microburbujas que después debe administrarse poco después de su preparación. Dichos procesos, sin embargo, tienen las desventajas de que debe darse energía de agitación sustancial para generar la dispersión necesaria y que el tamaño y distribución de tamaños de las microburbujas dependen de la cantidad de energía aplicada y por tanto no pueden controlarse en la práctica.
Los informadores o agentes de acuerdo con la presente invención, por otro lado, pueden prepararse de manera ventajosa generando una dispersión de microburbujas de gas en un medio acuoso que contiene (por ejemplo, fosfolípido) tensioactivo apropiado, que puede, si se desea, haberse esterilizado en autoclave o esterilizado de otra manera previamente, y después, preferiblemente después de un lavado y/o fraccionamiento de tamaño de las microburbujas formadas de este modo, sometiendo la dispersión a liofilización, por ejemplo, en presencia de uno o más crioprotectores/lioprotectores, para producir un producto secado que se reconstituye fácilmente en agua/soluciones acuosas para generar dispersiones de microburbujas sistemáticamente reproducibles. Este proceso se describe con mayor detalle en el documento WO-A-9729783; la capacidad para retirar las burbujas de tamaño no deseado y el exceso de material tensioactivo vuelve a este proceso sustancialmente ventajoso sobre procesos tales como los descritos en el documento WO-A-9409829 mencionado anteriormente y en la técnica anterior tal como el documento WO-A-9608234 (donde las burbujas se generan en el sitio antes de la inyección agitando una suspensión de fosfolípidos diferentes y potenciadores de la viscosidad tales como propilenglicol y glicerol).
El proceso descrito anteriormente puede usarse para generar microburbujas informadoras con una distribución de tamaño muy reducida, por ejemplo, de modo que más del 90% (por ejemplo, al menos un 95%, preferiblemente al menos un 98%) de las microburbujas tienen un diámetro medio volumétrico en el intervalo de 1-7 \mum y menos del 5% (por ejemplo, no más del 3%, preferiblemente no más del 2%) de las microburbujas tienen un diámetro medio volumétrico por encima de 7 \mum. Puede usarse la etapa de lavado para asegurar que el informador esté sustancialmente libre de componentes no deseados tales como lípidos o potenciadores de viscosidad en exceso. Los agentes que contienen informadores preparados de este modo pueden mostrar las siguientes ventajas sobre materiales de agentes de contraste de la técnica anterior:
La ecogenicidad por dosis puede potenciarse enormemente ya que sustancialmente todo el material tensioactivo participa en la estabilización de las microburbujas en forma de monocapas. Los ensayos de ultrasonidos in vivo en perros han demostrado que los agentes de contraste por ultrasonidos preparados como anteriormente pueden producir un aumento en la intensidad de señal de retrodispersión del miocardio de 15 dB después de inyección intravenosa a dosis tan bajas como de 0,1 \mul de microburbujas/kg de peso corporal.
La seguridad in vivo se mejora por las mismas razones, ya que dichos agentes pueden, por ejemplo, administrarse en dosis de modo que la cantidad de fosfolípidos inyectada sea tan baja como de 0,1-10 \mug/kg de peso corporal, por ejemplo, 1-5 \mug/kg. El uso de dichos niveles bajos de tensioactivo puede ser claramente ventajoso de manera sustancial para minimizar los posibles efectos secundarios tóxicos.
La proporción eficacia/dosis alta también es particularmente ventajosa en aplicaciones de dirección, ya que se entiende en líneas generales que cantidades bastante bajas de informador se acumularán en los sitios de interés cuando se usan productos que comprenden vectores que tienen afinidad por dichos sitios. Estos informadores preferidos de acuerdo con la invención pueden, por lo tanto, mejorar de manera considerable el contraste en los sitios de interés en comparación con agentes de contraste por ultrasonidos dirigibles conocidos. Su alta eficacia puede hacer posible de manera eficaz "ver" microburbujas únicas usando ultrasonidos, dando una sensibilidad cercana a o potencialmente incluso superior a la de centelleografía, que actualmente es la técnica probablemente más útil para dirigir, aunque la resolución de las representaciones por centelleografía no es muy buena:
Una ventaja particular de agentes basados en fosfatidilcolina es su biocompatibilidad; por tanto, no se han observado efectos tóxicos agudos tales como cambios en la presión sanguínea o frecuencia cardiaca en ensayos animales en perros a los que se ha inyectado bolos intravenosos de agentes de contraste basados en fosfatidilserina preparados como se ha descrito anteriormente a dosis de hasta diez veces una dosis para la formación de imágenes normal.
El uso de fosfolípidos cargados también puede ser ventajoso en que contendrán grupos funcionales tales como carboxilo o amino que permiten una unión fácil de los vectores, si se desea, por medio de unidades de unión. Debe observarse que también pueden incorporarse otros grupos funcionales en dichos sistemas mezclando un lípido que contiene un grupo funcional deseado con el tensioactivo de formación de películas antes de la generación de microburbujas.
Generalmente no es necesario incorporar aditivos tales como agentes de emulsión y/o potenciadores de la viscosidad tales como los que se emplean habitualmente en muchas formulaciones de agentes de contraste existentes en agentes de la invención. Como se ha observado anteriormente, esto es ventajoso para mantener una cantidad mínima de componentes administrada al cuerpo de un sujeto y asegurar que la viscosidad de los agentes es lo más baja posible. Como la preparación de los agentes típicamente implica una etapa de secado por congelación como se ha analizado anteriormente, sin embargo puede ser ventajoso incluir un crioproctector/lioprotector o agente de volumen, por ejemplo un alcohol, por ejemplo, un alcohol alifático tal como t-butanol; un poliol tal como glicerol; un carbohidrato, por ejemplo un azúcar tal como sacarosa, manitol, trehalosa o una ciclodextrina, o un polisacárido tal como dextrano; o un poliglicol tal como polietilenglicol. Se prefiere el uso de azúcares fisiológicamente bien tolerados tales como sacarosa.
Los productos secados por liofilización preparados como se ha descrito anteriormente son especialmente fáciles de reconstituir en agua, necesitando sólo una agitación mínima tal como puede proporcionarse, por ejemplo, por agitación manual suave durante unos pocos segundos. El tamaño de las microburbujas generadas de este modo es sistemáticamente reproducible y es independiente de la cantidad de energía de agitación aplicada, determinándose en la práctica por el tamaño de las microburbujas formadas en la dispersión de microburbujas inicial; sorprendentemente este parámetro de tamaño se mantiene sustancialmente en el producto liofilizado y reconstituido. Por tanto, como el tamaño de las microburbujas en la dispersión inicial puede controlarse fácilmente por los parámetros del proceso tales como método, velocidad y duración de la agitación, el tamaño de las microburbujas final puede controlarse fácilmente.
Los productos secados por liofilización también han demostrado ser estables en almacenamiento durante al menos varios meses a condiciones ambiente. Las dispersiones de microburbujas generadas después de la reconstitución en agua son estables durante al menos 8 horas, permitiendo una flexibilidad considerable como cuando el producto secado se reconstituye antes de la inyección.
La alta eficacia de estos informadores preferidos pueden hacer posible el uso de burbujas más pequeñas que las usuales generando aún efectos de contraste por ultrasonidos significativamente por encima de los niveles de detección mínimos del equipo de formación de imágenes por ultrasonidos actual. Dichas burbujas más pequeñas tienen ventajas potenciales tales como obstrucción reducida de los vasos, tiempos de circulación mayores, mayor capacidad para alcanzar las dianas, y acumulación inferior en los pulmones y otros órganos no diana, y su uso y agentes que los contienen constituyen características adicionales de la invención.
También puede ser posible usar dichas burbujas más pequeñas para explotar los efectos de contraste por ultrasonidos potenciados de grupos de burbujas. Se sabe por la teoría que el efecto de contraste por ultrasonidos de una cantidad específica de burbujas con un volumen total V en una dispersión diluida aumenta cuando las burbujas se agregan para formar una fase gaseosa más grande con el mismo volumen total V. Por lo tanto, puede ser posible usar burbujas pequeñas que no proporcionen sustancialmente contraste por ultrasonidos hasta que se agrupen (como puede suceder en áreas diana de preferencia con respecto a sitios no diana que tienen bajas densidades de moléculas diana). También pueden diseñarse burbujas pequeñas que se fusionen, por ejemplo, a través de la unión entre burbujas promovida por la interacción con la diana, de modo que se potencie el contraste en áreas diana con reticulación entre burbujas y la agrupación consiguiente también puede producirse si el informador, además de llevar un vector que conduce a la retención en sitios específicos, tiene restos enlazadores sin reaccionar capaces de reaccionar con grupos funcionales en otras burbujas.
En el contexto de la presente invención, la unidad informadora habitualmente permanecerá unida a los vectores. Sin embargo, en un tipo de procedimiento para dirigir, algunas veces llamado "pre-dirección", el vector (a menudo un anticuerpo monoclonal) se administra solo; posteriormente se administra el informador, acoplado a un resto que es capaz de unirse específicamente a la molécula vector de pre-dirección (cuando el vector de pre-dirección es un anticuerpo, el informador puede acoplarse a una molécula de unión a inmunoglobulina, tal como proteína A o un anticuerpo anti-inmunoglobulina). La ventaja de este protocolo es que puede dejarse un tiempo para la eliminación de las moléculas vector que no se han unido a sus dianas, reduciendo sustancialmente los problemas de fondo que están unidos a la presencia de un exceso de conjugado informador-vector. En el contexto de la presente invención, puede preverse la pre-dirección con un vector específico, seguido por unidades informadoras que están acopladas a otro vector y un resto que se une al primer vector.
Otra vez en el contexto de la presente invención, por ejemplo, en la evaluación de las velocidades de perfusión sanguínea en áreas diana tales como el miocardio, es de interés medir la velocidad a la que los agentes de contraste unidos a la diana se desplazan o liberan de la misma. Esto puede conseguirse de un modo controlado por la administración de un vector adicional y/u otra sustancia capaz de desplazar o liberar el agente de contraste de la diana.
Las modalidades de formación de imágenes por ultrasonidos que pueden usarse de acuerdo con la invención incluyen técnicas de formación de imágenes bi y tridimensionales tales como formación de imágenes en modo B (por ejemplo, usando la amplitud que varía en el tiempo de la envolvente de la señal generada a partir de la frecuencia fundamental del pulso de ultrasonidos emitido, a partir de sub-armónicos o armónicos superiores del mismo o a partir de las frecuencias de suma o diferencia derivadas del pulso emitido y dichos armónicos, prefiriéndose imágenes generadas a partir de la frecuencia fundamental o el segundo armónico del mismo), formación de imágenes en color de Doppler y formación de imágenes por amplitud de Doppler, y combinaciones de las dos últimas con cualquiera de las modalidades anteriores. Sorprendentemente, se han obtenido señales armónicas secundarias excelentes a partir de microesferas dirigidas estabilizadas por monocapas de acuerdo con la presente invención. Para reducir los efectos de movimiento, pueden recogerse sucesivas imágenes de tejidos tales como del corazón o riñón con la ayuda de técnicas de sincronización adecuadas (por ejemplo, dirigido al ECG o movimiento respiratorio del sujeto). La medida de los cambios en la frecuencia de resonancia o absorción de frecuencia que acompaña a las microburbujas retenidas o retardadas también puede hacerse de modo útil para detectar el agente de contraste.
La presente invención proporciona una herramienta para el suministro de fármacos terapéuticos en combinación con la dirección mediada por el vector del producto a un sitio deseado. Por "terapéutico" o "fármaco" se entiende un agente que tiene un efecto beneficioso sobre una enfermedad específica en un animal humano o no humano vivo. Mientras que las combinaciones de fármacos y agentes de contraste por ultrasonidos se han propuesto en, por ejemplo, el documento WO-A-9428873 y el documento WO-A-9507072, estos productos carecen de vectores que tengan afinidad por sitios particulares y por lo cual muestran comparativamente una mala retención específica en sitios deseados antes o durante la liberación de fármaco.
Los compuestos terapéuticos usados de acuerdo con la presente invención pueden encapsularse en el interior de las microburbujas o unirse a o incorporarse en las membranas de estabilización. Por tanto, el compuesto terapéutico puede unirse a una parte de la membrana, por ejemplo, a través de enlaces covalentes o iónicos, o pueden mezclarse físicamente en el material de estabilización, particularmente si el fármaco tiene una polaridad o solubilidad similar al material de membrana, de modo que se evite la filtración del producto antes de cuando se pretende que funcione en el cuerpo. La liberación del fármaco puede comenzarse simplemente por contacto en humedad con la sangre después de la administración o como consecuencia de otra influencia interna o externa, por ejemplo, procesos de disolución catalizados por enzimas o el uso de ultrasonidos. La destrucción de micropartículas que contienen gas usando ultrasonidos externos es un fenómeno bien conocido con respecto a los agentes de contraste por ultrasonidos, por ejemplo, como se describe en el documento WO-A-9325241; la velocidad de liberación de fármaco puede variarse dependiendo del tipo de aplicación terapéutica, usando una cantidad específica de energía de ultrasonidos desde el transductor.
El agente terapéutico puede estar unido de manera covalente a la superficie de membrana de encapsulación usando un agente de unión adecuado, por ejemplo, como se ha descrito en este documento. Por tanto, por ejemplo, inicialmente se puede preparar un derivado fosfolipídico o lipopeptídico al que el fármaco se una a través de una unión o enlace biodegradable, y después se incorpora este derivado al material usado para preparar el informador, como se ha descrito anteriormente.
Los agentes terapéuticos representativos adecuados para su uso en las presentes composiciones de suministro de fármacos incluyen cualquier fármaco terapéutico o análogo activo del mismo conocido que contenga grupos tiol que pueden acoplarse a microburbujas que contienen tiol en condiciones oxidativas que producen grupos disulfuro. En combinación con un vector o vectores, dichas microburbujas modificadas con fármaco/vector pueden dejarse acumular en el tejido diana; la administración de un agente reductor tal como glutatión reducido después puede liberar la molécula de fármaco de la microburbuja dirigida en las proximidades de la célula diana, aumentando la concentración local del fármaco y potenciando su efecto terapéutico. Como alternativa, la composición puede prepararse inicialmente sin el agente terapéutico, que después puede acoplarse o recubrirse sobre las microburbujas inmediatamente antes de su uso; por tanto, por ejemplo, puede añadirse un agente terapéutico a una suspensión de microburbujas en medios acuosos y agitarse para unir o adherir el agente terapéutico a las microburbujas.
Otros sistemas de suministro de fármacos incluyen membranas fosfolipídicas modificadas con vector recubiertas con estructuras lipopeptídicas que comprenden una cadena de poli-L-lisina o poli-D-lisina en combinación con un vector dirigido. Aplicado a tecnologías de terapia génica/antisentido con énfasis particular sobre el suministro de fármacos mediado por receptor, el vehículo de microburbujas se condensa con ADN o ARN mediante interacción electrostática con la polilisina catiónica. Este método tiene la ventaja de que el vector o vectores usados para el suministro dirigido no están unidos directamente al resto vehículo de polilisina. La cadena de polilisina también se ancla más fuertemente a la membrana de la microburbuja debido a la presencia de cadenas lipídicas. El uso de ultrasonidos para aumentar la eficacia del suministro también es de utilidad considerable.
Como alternativa, las cadenas de polilisina libres se modifican primero con moléculas de fármaco o vector que después se condensan sobre la superficie negativa de las microburbujas diana.
Los ejemplos representativos y no limitantes de fármacos útiles de acuerdo con la invención incluyen agentes antineoplásicos tales como vincristina, vinblastina, vindesina, busulfán, clorambucilo, espiroplatino, cisplatino, carboplatino, metotrexato, adriamicina, mitomicina, bleomicina, arabinósido de citosina, arabinosil adenina, mercaptopurina, mitotano, procarbacina, dactinomicina (antinomicina D), daunorrubicina, clorhidrato de doxorrubicina, taxol, plicamicina, aminoglutetimida, estramustina, flutamida, leuprolida, acetato de megestrol, tamoxifeno, testolactona, trilostano, amsacrina (m-AMSA), asparaginasa (L-asparaginasa), etopósido, interferón a-2a y 2b, productos sanguíneos tales como hematoporfirinas o derivados de los anteriores; modificadores de la respuesta biológica tales como muramilpéptidos; agentes antifúngicos tales como ketoconazol, nistatina, griseofulvina, flucitosina, miconazol o amfotericina B; hormonas o análogos hormonales tales como hormona del crecimiento, hormona estimuladora de melanocitos, estradiol, dipropionato de beclometasona, betametasona, acetato de cortisona, dexametasona, flunisolida, hidrocortisona, metilprednisolona, acetato de parametasona, prednisolona, prednisona, triamcinolona o acetato de fludrocortisona; vitaminas tales como cianocobalamina o retinoides; enzimas tales como fosfatasa alcalina o superóxido de manganeso dismutasa; agentes antialérgicos tales como amelexanox; inhibidores del factor tisular tales como anticuerpos monoclonales y fragmentos Fab de los mismos, péptidos sintéticos, no péptidos y compuestos que regulan negativamente la expresión del factor tisular; inhibidores de plaquetas tales como GPIa, GPIb y GPIIb-llla, receptores de ADP, receptores de trombina, el factor de von Willebrand, prostaglandinas, aspirina, ticlopidina, clopigogrel y reopro; inhibidores de dianas proteicas de coagulación tales como FIIa, FVa, FVIIa, FVIIIa, FIXa, FXa, factor tisular, heparinas, hirudina, hirulog, argatroban, DEGR-rFVIIa y anexina V: inhibidores de la formación de fibrina y promotores de la fibrinolisis tales como t-PA, uroquinasa, Plasmina, Estreptoquinasa, Activador de rt-Plasminógeno y rEstafiloquinasa; factores antiangiogénicos tales como medroxiprogesterona, polisulfato de pentosán, suramin, taxol, talidomida, angiostatina, interferón alfa, inhibidores de metaloproteinasas, factor plaquetario 4, somatostatina, trombospondina; fármacos de la circulación tales como propanolol; potenciadores metabólicos tales como glutatión; agentes antituberculosos tales como ácido p-aminosalicílico, isoniazid, sulfato de capreomicina, ciclosexina, etambutol, etionamida, piracinamida, sulfato de rifampina o estreptomicina; antivirales tales como aciclovir, amantadina, azidotimidina, ribavirina o vidarabina; agentes de dilatación de los vasos sanguíneos tales como diltiazem, nifedipina, verapamil, tetranitrato de eritritol, dinitrato de isosorbida, nitroglicerina o tetranitrato de pentaeritritol; antibióticos tales como dapsona, cloranfenicol, neomicina, cefaclor, cefadroxil, cefalexina, cefradina, eritromicina, clindamicina, lincomicina, amoxicilina, ampicilina, bacampicilina, carbenicilina, dicloxacilina, ciclacilina, picloxacilina, hetacilina, meticilina, nafcilina, penicilina, polimixina o tetraciclina; anti-inflamatorios tales como diflunisal, ibuprofeno, indometacina, meclefenamato, ácido mefenámico, naproxeno, fenilbutazona, piroxicam, tolmetina, aspirina o salicilatos; antiprotozoarios tales como cloroquina, metronidazol, quinina o antimonato de meglumina; antirreumáticos tales como penicilamina; narcóticos tales como paregoric; opiáceos tales como codeína, morfina u opio; glicósidos cardiacos tales como deslanesida, digitoxina, digoxin, digitalina o digitalis; bloqueantes neuromusculares tales como mesilato de atracurio, trietyoduro de galamina, bromuro de hexafluorenio, yoduro de metacurina, bromuro de pancuronio, cloruro de succinilcolina, cloruro de tubocurarina o bromuro de vecuronio; sedantes tales como amobarbital, amobarbital sódico, apropbarbital, butabarbital sódico, hidrato de cloral, etclorvinol, etinamato, clorhidrato de flurazepam, glutetimida, clorhidrato de metotrimepacina, metripilon, clorhidrato de midazolam, paraldehído, pentobarbital, secobarbital sódico, talbutal, temazepam o triozolam; anestésicos locales tales como bupivacaína, cloroprocaína, etidocaína, lidocaína, mepivacaína, procaína o tetracaína; anestésicos generales tales como droperidol, etomidato, citrato de fentanilo con droperidol, clorhidrato de ketamina, metohexital sódico o tiopental y sales farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, sales de adición de ácidos tales como clorhidrato o bromhidrato o sales básicas tales como sales de sodio, calcio o magnesio) o derivados (por ejemplo, acetatos) de los mismos. Otros ejemplos de agentes terapéuticos incluyen material genético tal como ácidos nucleicos, ARN, y ADN de origen natural o sintético, incluyendo ARN y ADN recombinante. Puede usarse ADN que codifica ciertas proteínas en el tratamiento de muchos tipos diferentes de enfermedades. Por ejemplo, pueden proporcionarse genes del factor de necrosis tumoral o interleuquina-2 para tratar cánceres avanzados; pueden proporcionarse genes de timidina quinasa para tratar cáncer de ovario o tumores cerebrales; pueden proporcionarse genes de interleuquina-2 para tratar neuroblastoma, melanoma maligno o cáncer de riñón, y pueden proporcionarse genes de interleuquina-4 para tratar cáncer.
Derivados lipófilos de fármacos unidos a la membrana de microburbujas a través de interacciones hidrófobas pueden mostrar efectos terapéuticos como parte de la microburbuja o después de la liberación de la microburbuja, por ejemplo, por el uso de ultrasonidos. Si el fármaco no tiene las propiedades físicas deseadas, puede introducirse un grupo lipófilo para anclar el fármaco a la membrana. Preferiblemente, el grupo lipófilo debe introducirse de un modo que no influya en la potencia in vivo de la molécula, o el grupo lipófilo puede escindirse liberando el fármaco activo. Los grupos lipófilos pueden introducirse por diversos medios químicos dependiendo de los grupos funcionales disponibles en la molécula de fármaco. El acoplamiento covalente puede realizarse usando grupos funcionales en la molécula de fármaco capaz de reaccionar con compuestos lipófilos apropiadamente funcionalizados. Los ejemplos de restos lipófilos incluyen cadenas de alquilo ramificadas y no ramificadas, compuestos cíclicos, restos aromáticos y sistemas cíclicos aromáticos y no aromáticos condensados. En algunos casos, el resto lipófilo constará de un esteroide adecuadamente funcionalizado, tal como colesterol o un compuesto relacionado. Los ejemplos de grupos funcionales particularmente adecuados para derivatización incluyen grupos nucleófilos como grupos amino, hidroxi y sulfhidrilo. Los procesos adecuados para la derivatización lipófila de cualquier fármaco que contenga un grupo sulfhidrilo, tal como captoprilo, puede incluir la alquilación directa, por ejemplo, reacción con un haluro de alquilo en condiciones básicas y formación de un éster de tiol por reacción con un ácido carboxílico activado. Los ejemplos representativos de derivatización de cualquier fármaco que tenga funciones carboxílicas, por ejemplo, atenolol o clorambucilo, incluyen formación de amida y éster acoplando respectivamente con aminas y alcoholes que tienen propiedades físicas apropiadas. Una reali-
zación preferida comprende la unión de colesterol a un compuesto terapéutico formando un enlace éster degradable.
Una aplicación preferida de la presente invención se refiere a la angiogénesis, que es la formación de nuevos vasos sanguíneos por ramificación de los vasos existentes. El estímulo primario para este proceso puede ser el suministro inadecuado de nutrientes y oxígeno (hipoxia) a células en un tejido. Las células pueden responder secretando factores angiogénicos, de los que hay muchos; un ejemplo es el factor de crecimiento del endotelio vascular. Estos factores inician la secreción de enzimas proteolíticas que descomponen las proteínas de la membrana basal, así como inhibidores que limitan la acción de estas enzimas potencialmente dañinas. El efecto combinado de la pérdida de unión y señales de los receptores para factores angiogénicos es la causa de que las células endoteliales se muevan, multipliquen, y reordenen por sí mismas, y finalmente sinteticen una membrana basal alrededor de los nuevos vasos.
Los tumores deben iniciar la angiogénesis cuando alcanzan un tamaño milimétrico para mantener su velocidad de crecimiento. Como la angiogénesis viene acompañada por cambios característicos en las células endoteliales y su medio, este proceso es una diana prometedora para la intervención terapéutica. Las transformaciones que acompañan la angiogénesis también son muy prometedoras para el diagnóstico, siendo un ejemplo preferido enfermedad maligna, pero el concepto también muestra una gran promesa en la inflamación y una diversidad de enfermedades relacionadas con inflamación. Estos factores también están implicados en la re-vascuralización de partes con infarto en el miocardio, que sucede si se alivia una estenosis en un tiempo corto.
Se proporcionan varios receptores/dianas conocidos asociados con angiogénesis en tablas posteriores. Usando los principios para dirigir descritos en la presente descripción, puede detectarse la angiogénesis por la mayoría de las modalidades de formación de imágenes en su uso en medicina. Los ultrasonidos potenciados por contraste pueden tener ventajas adicionales, siendo el medio de contraste microesferas que están limitadas al interior de los vasos sanguíneos. Incluso si los antígenos diana se encuentran en muchos tipos celulares, las microesferas se unirán exclusivamente a las células endoteliales.
Los denominados profármacos también pueden usarse en agentes de acuerdo con la invención. Por tanto, los fármacos pueden derivatizarse para alterar sus propiedades fisicoquímicas y para adaptarlos para la inclusión en el informador; dichos fármacos derivatizados pueden considerarse profármacos y habitualmente son inactivos hasta que la escisión del grupo de derivatización regenera la forma activa del fármaco.
Dirigiendo las microburbujas rellenas con gas que contienen una enzima de activación del profármaco a áreas de patología, se pueden formar imágenes dirigiendo la enzima, que hace posible la visualización cuando las microburbujas están dirigidas apropiadamente al área de patología y en el mismo tiempo han desaparecido de áreas no diana. De este modo, se puede determinar el tiempo óptimo para la inyección del profármaco en pacientes individuales.
Otra alternativa es incorporar el profármaco, enzima de activación del profármaco y vector en las mismas microburbujas en un sistema en el que el profármaco sólo se activará después de algún estímulo externo. Dicho estímulo puede, por ejemplo, ser una proteasa específica de tumores como se ha descrito anteriormente, o se pueden romper las microburbujas por ultrasonidos externos después de que se haya conseguido la dirección deseada.
Los agentes terapéuticos pueden suministrarse fácilmente de acuerdo con la invención a áreas enfermas o necróticas, por ejemplo, en el corazón, vasculatura general, y al hígado, bazo, riñones y otras regiones tales como el sistema linfático, cavidades corporales o sistema gastrointestinal.
Los productos de acuerdo con la invención pueden usarse para dirigir el suministro terapéutico in vivo o in vitro. En el último contexto, los productos pueden ser útiles en sistemas in vitro tales como kits para el diagnóstico de diferentes enfermedades o caracterización de diferentes componentes en muestras sanguíneas o tisulares. Pueden usarse técnicas similares a las usadas para unir ciertos componentes sanguíneos o células a partículas poliméricas (por ejemplo, partículas magnéticas monodispersas) in vitro para separarlas de una muestra, en la presente invención, usando la baja densidad de las unidades informadoras en agentes de la presente invención para realizar la separación del material que contiene gas por flotación y lavado repetido.
El acoplamiento de una unidad informadora a un vector deseado (y/o agente terapéutico) puede conseguirse por un medio covalente o no covalente, que habitualmente implica la interacción con uno o más grupos funcionales localizados en el informador y/o vector y/o cualquier grupo enlazador/elemento espaciador que intervenga. Los ejemplos de grupos funcionales químicamente reactivos que pueden emplearse para este propósito incluyen grupos amino, hidroxilo, sulfhidrilo, carboxilo, y carbonilo, así como grupos carbohidrato, dioles próximos, tioéteres, 2-aminoalcoholes, 2-aminotioles, grupos guanidinilo, imidazolilo y fenólico.
El acoplamiento covalente del informador y el vector puede, por lo tanto, realizarse usando agentes de enlace que contienen restos reactivos capaces de reaccionar con dichos grupos funcionales. Los ejemplos de restos reactivos capaces de reaccionar con grupos sulfhidrilo incluyen compuestos de \alpha-haloacetilo del tipo X-CH_{2}CO- (donde X = Br, Cl o I), que muestran reactividad particular por grupos sulfhidrilo pero que también pueden usarse para modificar grupos imidazolilo, tioéter, fenol y amino como se describe por Gurd, F.R.N, en Methods Enzymol. (1967) 11, 532. Los derivados de N-maleimida también pueden considerarse selectivos con respecto a los grupos sulfhidrilo, pero pueden ser adicionalmente útiles en el acoplamiento a grupos amino en ciertas condiciones. Las N-maleimidas pueden incorporarse en sistemas de unión para la conjugación informador-vector como se describe por Kitagawa, T. et al. en Chem. Pharm. Bull. (1981) 29, 1130 o usarse como reticulantes poliméricos para la estabilización de burbujas como se describe por Kovacic, P. et al. en J. Am. Chem. Soc. (1959) 81, 1887. Reactivos tales como 2-iminotiolano, por ejemplo, como se describe por Traut, R. et al. en Biochemistry (1973) 12, 3266, que introducen un grupo tiol a través de la conversión de un grupo amino, pueden considerarse como reactivos de sulfhidrilo si la unión sucede a través de la formación de puentes disulfuro. Por tanto, los reactivos que introducen enlaces disulfuro reactivos en el informador o el vector pueden ser útiles, ya que la unión puede conseguirse por el intercambio de disulfuro entre el vector y el informador; los ejemplos de dichos reactivos incluyen reactivo de Ellman (DTNB), 4,4'-ditiodipiridina, disulfuro de metil-3-nitro-2-piridilo y disulfuro de metil-2-piridilo (descrito por Kimura et al. en Analyt. Biochem. (1982) 122, 271).
Los ejemplos de restos reactivos capaces de reaccionar con grupos amino incluyen agentes alquilantes y acilantes. Los agentes alquilantes representativos incluyen:
i) compuestos \alpha-haloacetilo, que muestran especificidad hacia grupos amino en ausencia de grupos tiol reactivos y son del tipo X-CH_{2}CO- (donde X = Cl, Br o I), por ejemplo como se describe por Wong, Y-H.H. en Biochemistry (1979) 24, 5337;
ii) derivados de N-maleimida, que pueden reaccionar con grupos amino a través de una reacción de tipo Michael o a través de acilación mediante la adición al grupo anillo carbonilo como se describe por Smyth, D.G. et al. en J. Am. Chem. Soc. (1960) 82, 4600 y Biochem. J. (1964) 91, 589;
iii) haluros de arilo tales como compuestos nitrohaloaromáticos reactivos;
iv) haluros de alquilo como se describe por McKenzie, J.A. et al. en J. Protein Chem. (1988) 7, 581;
v) aldehídos y cetonas capaces de formación de base de Schiff con grupos amino, estabilizándose normalmente los aductos formados a través de reducción para dar una amina estable;
vi) derivados de epóxido tales como epiclorhidrina y bisoxiranos que pueden reaccionar con grupos amino, sulfhidrilo o hidroxilo fenólico;
vii) derivados que contienen cloro de s-triazinas, que son muy reactivos hacia nucleófilos tales como grupos amino, sulfhidrilo e hidroxi;
viii) aziridinas basadas en compuestos s-triazina detallados anteriormente, por ejemplo como se describe por Ross, W.C.J, en Adv. Cancer Res. (1954) 2, 1, que reaccionan con nucleófilos tales como grupos amino mediante apertura del anillo;
ix) ésteres dietílicos del ácido escuárico como se describe por Tietze, L.F. en Chem. Ber. (1991) 124, 1215; y
x) \alpha-haloalquil éteres, que son agentes alquilantes más reactivos que los haluros de alquilo normales a causa de la activación provocada por el átomo de oxígeno del éter, por ejemplo como se describe por Benneche, T. et al. en Eur. J. Med. Chem. (1993) 28, 463.
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Los agentes acilantes amino-reactivos representativos incluyen:
i) isocianatos e isotiocianatos, particularmente derivados aromáticos, que forman derivados de urea y tiourea estables respectivamente y que se han usado para la reticulación de proteínas como se describe por Schick, A.F. et al. en J. Biol. Chem. (1961) 236, 2477;
ii) cloruros de sulfonilo, que se han descrito por Herzig, D. J. et al. en Biopolymers (1964) 2, 349 y que pueden ser útiles para la introducción de un grupo informador fluorescente en el enlazador;
iii) Haluros de ácido;
iv) Ésteres activos tales como nitrofenilésteres o N-hidroxisuccinimidil ésteres;
v) anhídridos de ácido tales como anhídridos mixtos, simétricos o N-carboxianhídridos;
vi) otros reactivos útiles para la formación de un enlace amida como se describe por Bodansky, M. et al. en "Principles of Peptide Synthesis" (1984) Springer-Verlag;
vii) acilazidas, por ejemplo donde el grupo azida se genera a partir de un derivado de hidrazida formado previamente usando nitrito sódico, por ejemplo como se describe por Wetz, K. et al. en Anal. Biochem. (1974) 58,
347;
viii) azlactonas unidas a polímeros tales como bisacrilamida, por ejemplo como se describe por Rasmussen, J. K. en Reactive Polymers (1991) 16, 199; y
ix) Imidoésteres, que forman amidinas estables tras la reacción con grupos amino, por ejemplo como se describe por Hunter, M. J. y Ludwig, M. L. en J. Am. Chem. Soc. (1962) 84, 34 91.
Grupos carbonilo tales como funciones aldehído pueden reaccionar con bases de proteínas débiles a un pH tal que se protonan las funciones de cadena lateral de proteínas nucleófilas. Las bases débiles incluyen 1,2-aminotioles tales como los que se encuentran en restos de cisteína de extremo N-terminal, que forman selectivamente anillos tiazolidina de 5 miembros estables con grupos aldehído, por ejemplo, como se describe por Ratner, S. et al. en J. Am. Chem. Soc. (1937) 59, 200. Pueden usarse otras bases débiles tales como fenilhidrazonas, por ejemplo como se describe por Heitzman, H. et al. en Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1974) 71, 3537.
También pueden hacerse reaccionar aldehídos y cetonas con aminas para formar bases de Schiff, que pueden estabilizarse de manera ventajosa a través de aminación reductora. Los restos alcoxilamino reaccionan fácilmente con cetonas y aldehídos para producir alcoxaminas estables, por ejemplo como se describe por Webb, R. et al. en Bioconjugate Chem. (1990) 1, 96.
Los ejemplos de restos reactivos capaces de reaccionar con grupos carboxilo incluyen compuestos diazo tales como ésteres de diazoacetato y diazoacetamidas, que reaccionan con elevada especificidad para generar grupos éster, por ejemplo como se describe por Herriot R. M. en Adv. Protein Chem. (1947) 3, 169. También pueden emplearse de forma útil reactivos modificadores de ácido carboxílico tales como carbodiimidas, que reaccionan a través de la formación de O-acilurea seguido de formación de enlace amida; la unión puede facilitarse por la adición de una amina o puede provocar el acoplamiento directo vector-receptor. Las carbodiimidas solubles en agua útiles incluyen 1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-4-etil)carbodiimida (CMC) y 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC), por ejemplo como se describe por Zot, H. G. y Puett, D. en J. Biol. Chem. (1989) 264, 15552. Otros reactivos modificadores de ácido carboxílico útiles incluyen derivados de isoxazolio tales como reactivo K de Woodwards; cloroformiatos tales como p-nitrofenilcloroformiato; carbonildiimidazoles tales como 1,1'-carbonildiimidazol; y N-carbalcoxidihidroquinolinas tales como N-(etoxicarbonil)-2-etoxi-1,2-dihidroquinolina.
Otros restos reactivos potencialmente útiles incluyen dionas próximas tales como p-fenilendiglioxal, que pueden usarse para reaccionar con grupos guanidinilo, por ejemplo como se describe por Wagner et al. en Nucleic acid Res. (1978) 5, 4065; y sales diazonio, que pueden experimentar reacciones de sustitución electrófila, por ejemplo como se describe por Ishizaka, K. e Ishizaka T. en J. Immunol. (1960) 85, 163. Los compuestos bis-diazonio se preparan fácilmente por tratamiento de aril diaminas con nitrito sódico en soluciones ácidas. Se apreciará que los grupos funcionales del informador y/o del vector pueden convertirse, si se desea, en otros grupos funcionales antes de la reacción, por ejemplo, para otorgar reactividad o selectividad adicionales. Los ejemplos de métodos útiles para este propósito incluyen conversión de aminas en ácidos carboxílicos usando reactivos tales como anhídridos dicarboxílicos; conversión de aminas en tioles usando reactivos tales como N-acetilhomocisteína tiolactona, anhídrido S-acetilmercaptosuccínico, 2-iminotiolano o derivados de succinimidilo que contienen tiol; conversión de tioles en ácido carboxílicos usando reactivos tales como \alpha-haloacetatos; conversión de tioles en aminas usando reactivos tales como etilenimina o 2-bromoetilamina; conversión de ácido carboxílicos en aminas usando reactivos tales como carbodiimidas seguido de diaminas; y conversión de alcoholes en tioles usando reactivos tales como cloruro de tosilo seguido de transesterificación con tioacetato e hidrólisis en el tiol con acetato sódico.
El acoplamiento vector-informador también puede realizarse usando enzimas como agentes de unión de longitud cero; por tanto, por ejemplo, pueden usarse transglutaminasa, peroxidasa y xantina oxidasa para producir productos unidos. También puede usarse proteolisis inversa para la unión a través de la formación de un enlace amida.
El acoplamiento vector-informador no covalente puede realizarse, por ejemplo, por interacciones de carga electrostática, por ejemplo, entre un informador funcionalizado con polilisinilo y un vector funcionalizado con poliglutamilo, a través de la quelación en forma de complejos metálicos estables o a través de la interacción de unión de alta afinidad tal como unión avidina/biotina. La polilisina, recubierta no covalentemente en una superficie de membrana cargada negativamente también puede aumentar no específicamente la afinidad de una microburbuja por una célula a través de interacciones de carga.
Como alternativa, un vector puede acoplarse a una proteína conocida para unión de fosfolípidos. En muchos casos, una molécula única de fosfolípido puede unirse a una proteína tal como translocasa, mientras que otras proteínas pueden unirse a superficies constituidas principalmente por grupos principales de fosfolípidos y por tanto pueden usarse para unir vectores con microesferas de fosfolípidos; un ejemplo de dicha proteína es \beta2-glicoproteína I (Chonn, A., Semple, S. C. y Cullis, P. R., Journal of Biological Chemistry (1995) 270, 25845-25849). Las proteínas de unión a fosfatidilserina se han descrito, por ejemplo, por Igarashi, K. et al. en Journal of Biological Chemistry 270 (49), 29075-29078; por lo tanto, puede usarse un conjugado de un vector con dicha proteína de unión a fosfatidilserina para unir el vector a microburbujas encapsuladas con fosfatidilserina. Cuando se conoce la secuencia de aminoácidos de una proteína de unión, la parte de unión a fosfolípidos puede sintetizarse o aislarse y usarse para la conjugación con un vector, evitando de este modo la actividad biológica que puede localizarse en cualquier sitio de la molécula.
También es posible obtener moléculas que se unan específicamente a la superficie (o en la "membrana") de microesferas por exploración directa de bibliotecas moleculares para moléculas de unión a microesferas. Por ejemplo, las bibliotecas de fagos que presentan péptidos pequeños pueden usarse para dicha selección. La selección puede hacerse por mezcla simple de las microesferas y la biblioteca de presentación de fagos y eluyendo los fagos que se unen a las microesferas flotantes. Si se desea, la selección puede hacerse en "condiciones fisiológicas" (por ejemplo en sangre) para eliminar péptidos que reaccionan de manera cruzada con los componentes sanguíneos. Una ventaja de este tipo de procedimiento de selección es que sólo deben seleccionarse moléculas de unión que no desestabilizan las microesferas, ya que sólo las moléculas de unión acopladas a microesferas flotantes intactas alcanzarán la parte superior. También puede ser posible introducir algún tipo de "tensión" durante el procedimiento de selección (por ejemplo, presión) para asegurar que no se seleccionen restos de unión desestabilizadores. Además, la selección puede hacerse en condiciones de ruptura, por ejemplo dejando primero que reaccionen los fagos con las microesferas y después dejando que las microesferas pasen a través de una superficie recubierta con anticuerpos anti-fago en condiciones de flujo. De esta manera es posible seleccionar agentes de unión que puedan resistir a las condiciones de rotura presentes in vivo. Los restos de unión identificados de esta manera pueden acoplarse (por conjugación química o mediante síntesis de péptidos, o al nivel de ADN para vectores recombinantes) a una molécula vector, constituyendo una herramienta general para unir cualquier molécula vector a las microesferas.
También puede ser útil un vector que comprende o está acoplado a un enlazador peptídico, lipo-oligosacárido o lipopeptídico que contiene un elemento capaz de mediar la inserción en la membrana. Un ejemplo se describe por Leenhouts, J. M. et al. en Febs Letters (1995) 370 (3), 189-192. También pueden usarse moléculas no bioactivas constituidas por grupos de anclado/señalización de inserción en la membrana conocidos, como vectores para ciertas aplicaciones, siendo un ejemplo el segmento hidrófobo H1 de la subunidad \alpha de la Na,K-ATPasa descrita por Xie, Y. y Morimoto, T. en J. Biol. Chem. (1995) 270 (20), 11985-11991. El grupo de anclaje también puede ser ácido o ácidos grasos o colesterol.
El acoplamiento también puede realizarse usando avidina o estreptavidina, que tiene cuatro sitios de unión de alta afinidad para biotina. Por lo tanto, la avidina puede usarse para conjugar el vector con el informador si tanto el vector como el informador están biotinilados. Los ejemplos se describen por Bayer, E. A. y Wilchek, M. en Methods Biochem. Anal. (1980) 26, 1. Este método también puede ampliarse para incluir la unión de informador a informador, un proceso que puede estimular la asociación de burbujas y una consiguiente ecogenicidad potencialmente aumentada. Como alternativa, la avidina o estreptavidina pueden unirse directamente a la superficie de micropartículas informadoras.
El acoplamiento no covalente también puede utilizar la naturaleza bifuncional de inmunoglobulinas biespecíficas. Estas moléculas pueden unirse específicamente a dos antígenos, ligándolos de este modo. Por ejemplo, los fragmentos de IgG biespecíficos o F(ab)'_{2} biespecíficos modificados químicamente pueden usarse como agentes de unión. Los anticuerpos biespecíficos heterobifuncionales también se han presentado para unir dos antígenos diferentes, por ejemplo, como se describe por Bode, C. et al. en J. Biol. Chem. (1989) 264, 944 y por Staerz, U. D. et al. en Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83, 1453. De igual forma, cualquier informador y/o vector que contiene dos o más determinantes antigénicos (por ejemplo, como se describe por Chen, Aa et al. en Am. J. Pathol. (1988) 130, 216) puede reticularse con moléculas de anticuerpos y conducir a la formación de ensamblajes reticulados multi-burbuja de ecogenicidad potencialmente aumentada.
En general, los agentes de unión usados de acuerdo con la invención provocarán la unión del vector al informador o de informador a informador con cierto grado de especificidad, y también pueden usarse para unir uno o más agentes terapéuticamente activos.
En algunos casos se considera ventajoso incluir un componente PEG como estabilizador junto con un vector o vectores o directamente al informador en la misma molécula en la que PEG no sirve como espaciador.
Si se desea, pueden usarse los denominados agentes de unión de longitud cero, que inducen la unión covalente directa de los dos grupos químicos reactivos sin introducir un material de unión adicional (por ejemplo, como en la formación de enlace amida inducida usando carbodiimidas o enzimáticamente), de acuerdo con la invención, como pueden los agentes tales como sistemas de biotina/avidina que inducen la unión informador-vector no covalente y agentes que inducen interacciones hidrófobas o electrostáticas.
Más comúnmente, sin embargo, el agente de unión comprenderá dos o más restos reactivos, por ejemplo, como se ha descrito anteriormente, conectados por un elemento espaciador. La presencia de dicho espaciador permite que los enlazadores bifuncionales reaccionen con grupos funcionales específicos en una molécula o entre dos moléculas diferentes, provocando un enlace entre estos dos componentes e introduciendo el material derivado del enlazador extrínseco en el conjugado informador-vector. Los restos reactivos de un agente enlazador pueden ser iguales (agentes homobifuncionales) o diferentes (agentes heterobifuncionales o, cuando están presentes varios restos reactivos diferentes, agentes heteromultifuncionales), proporcionando una diversidad de reactivos potenciales que pueden provocar la unión covalente entre cualquier especie química, de manera intramolecular o intermolecular.
La naturaleza del material extrínseco introducido por el agente enlazador puede tener un comportamiento crítico sobre la capacidad de dirección y estabilidad general del producto final. Por tanto, puede ser deseable introducir enlazadores inestables, por ejemplo, que contienen brazos espaciadores que son biodegradables o químicamente sensibles o que incorporan sitios de escisión enzimática. Como alternativa, el espaciador puede incluir componentes poliméricos, por ejemplo, para que funcionen como tensioactivos y potencien la estabilidad de las burbujas. El espaciador también puede contener restos reactivos, por ejemplo, como se ha descrito anteriormente para potenciar la reticulación de la superficie, o puede contener un elemento indicador tal como una sonda fluorescente, marcador de espín o material radiactivo.
Por lo tanto, los agentes de contraste de acuerdo con la presente invención son útiles en todas las modalidades de formación de imágenes ya que los elementos de contraste tales como agentes de contraste de rayos X, sondas de formación de imágenes por luz, marcadores de espín o unidades radiactivas pueden incorporarse fácilmente en o unirse a las unidades informadoras.
Los elementos espaciadores pueden constar típicamente de cadenas alifáticas que separan de manera eficaz los restos reactivos del enlazador por distancias entre 5 y 30 \ring{A}. También pueden comprender estructuras macromoleculares tales como PEG, en las que se ha puesto mucha atención en aplicaciones biotécnicas y biomédicas (véase, por ejemplo, Milton Harris, J. (ed) "Poly(etilenglicol) chemistry, biotechnical and biomedical applications" Plenum Press, Nueva York, 1992). PEG son solubles en la mayoría de los disolventes, incluyendo agua, y están altamente hidratados en medios acuosos, con dos o tres moléculas de agua unidas a cada segmento de etilenglicol; esto tiene el efecto de evitar la adsorción de otros polímeros o de proteínas sobre superficies modificadas por PEG. Se sabe que los PEG son no tóxicos y no dañan proteínas o células activas, mientras que los PEG unidos covalentemente se sabe que son no inmunogénicos y no antigénicos. Además, los PEG pueden modificarse fácilmente y unirse a otras moléculas sólo con poco efecto sobre su química. Su solubilidad ventajosa y propiedades biológicas son evidentes a partir de los muchos usos posibles de PEG y copolímeros de los mismos, incluyendo copolímeros de bloque tales como PEG-poliuretanos y PEG-polipropilenos.
Los pesos moleculares apropiados para espaciadores de PEG usados de acuerdo con la invención pueden estar, por ejemplo, entre 120 Dalton y 20 kDalton.
El mecanismo principal para la captación de partículas por parte de las células del sistema reticuloendotelial (RES) es la opsonización por proteínas del plasma en la sangre; esto marca las partículas extrañas que después se recogen por el RES. Las propiedades biológicas de los elementos espaciadores de PEG usados de acuerdo con la invención pueden servir para aumentar el tiempo de circulación de agentes de contraste de manera similar a la observada por liposomas PEGilados (véase, por ejemplo, Klibanov, A. L et al. en FEBS Letters (1990) 268, 235-237 y Blume, G. y Cevc, G. en Biochim. Biophys. Acta (1990) 1029, 91-97). La eficacia de acoplamiento aumentada en las áreas de interés también puede alcanzarse usando anticuerpos unidos a los extremos de espaciadores de PEG (véase, por ejemplo Maruyama, K. et al. en Biochim. Biophys. Acta (1995) 1234, 74-80 y Hansen, C. B. et al. en Biochim. Biophys. Acta (1995) 1239, 233-144).
En algunos casos, se considera ventajoso incluir un componente de PEG como estabilizador junto con un vector o vectores o directamente en el informador en la misma molécula en la que PEG no sirve como espaciador.
Otros elementos espaciadores representativos incluyen polisacáridos de tipo estructural tales como ácido poligalacturónico, glicosaminoglicanos, heparinoides, polisacáridos de celulosa y marinos tales como alginatos, quitosanas y carragenanos; polisacáridos de tipo almacenamiento tales como almidón, glucógeno, dextrano y aminodextranos; poliaminoácidos y ésteres metílicos y etílicos de los mismos, como en homo- y co-polímeros de lisina, ácido glutámico y ácido aspártico; y polipéptidos, oligosacáridos y oligonucleótidos, que pueden contener o no sitios de escisión enzimática.
En general, los elementos espaciadores pueden contener grupos escindibles tales como grupos glicol, azo, sulfona, éster, tioéster o disulfuro próximos. Los espaciadores que contienen grupos metilendiéster o diamina biodegradables de fórmula
-(Z)_{m}.Y.X.C(R^{1}R^{2}).X.Y.(Z)_{n}-
[en la que X y Z se seleccionan entre -O-, -S-, y -NR- (donde R es hidrógeno o un grupo orgánico); cada Y es un grupo carbonilo, tiocarbonilo, sulfonilo, fosforilo o formador de ácido similar: cada uno de m y n es cero o 1; y cada uno de R^{1} y R^{2} es hidrógeno, un grupo orgánico o un grupo -X.Y.(Z)_{m}-, o juntos forman un grupo orgánico divalente] también pueden ser útiles; como se analiza en, por ejemplo, el documento WO-A-9217436, dichos grupos son fácilmente biodegradables en presencia de esterasas, por ejemplo in vivo, pero son estables en ausencia de dichas enzimas. Por lo tanto, pueden unirse de manera ventajosa a agentes terapéuticos para permitir una lenta liberación de los
mismos.
Las poli[N-(2-hidroxietil)metacrilamidas] son materiales espaciadores potencialmente útiles debido a su bajo grado de interacción con células y tejidos (véase por ejemplo Volfová, I., Ríhová, B. y V. R. y Vetvicka, P. en J. Bioact. Comp. Polymers (1992) 7, 175-190). El trabajo sobre un polímero similar constituido principalmente por el derivado 2-hidroxipropilo relacionado estrechamente mostró que se endocitaba por el sistema de fagocitos mononucleares sólo a un grado bastante bajo (véase Goddard, P., Williamson, I., Bron, J., Hutchkinson, L. E., Nicholls, J. y Petrak, K. en J. Bioct. Compat. Polym. (1991) 6, 4-24).
Otros materiales espaciadores poliméricos potencialmente útiles incluyen:
i) copolímeros de metacrilato de metilo con ácido metacrílico; éstos pueden ser erosionables (véase, Lee, P. I. en Pharm. Res. (1993) 10, 980) y los sustituyentes carboxilato pueden provocar un grado más elevado de hinchamiento que con polímeros neutros;
ii) copolímeros de bloque de polimetacrilatos con poliésteres biodegradables (véase, por ejemplo San Roman, J. y Guillen-Garcia, P. en Biomaterials (1991) 12, 236-241);
iii) cianoacrilatos, es decir polímeros de ésteres de ácido 2-cianoacrílico - éstos son biodegradables y se han usado en forma de nanopartículas para el suministro selectivo de fármacos (véase Forestier, F., Gerrier, P., Chaumard, C, Quero, A. M., Couvreur, P. y Labarre, C. en J. Antimicrob. Chemoter. (1992) 30, 173-179);
iv) alcoholes polivinílicos, que son solubles en agua y generalmente se consideran biocompatibles (véase, por ejemplo Langer, R. en J. Control. Release (1991) 16, 53-60);
v) copolímeros de vinil metil éter con anhídrido maleico, que se ha indicado que son bioerosionables (véase, Finne, U., Hannus, M. y Urtti, A. en Int. J. Pharm. (1992) 78, 237-241);
vi) polivinilpirrolidonas, por ejemplo con un peso molecular menor de aproximadamente 25.000, que se filtran rápidamente por los riñones (véase Hespe, W., Meier, A. M. y Blankagua, Y. M. en Arzeim.-Forsch./Drug Res. (1977) 27, 1158-1162);
vii) polímeros y copolímeros de hidroxiácidos alifáticos de cadena corta tales como ácidos glicólico, láctico, butírico, valérico y caproico (véase, por ejemplo Carli, F. en Chim. Ind. (Milan) (1993) 75, 494-9), incluyendo copolímeros que incorporan hidroxiácidos aromáticos para aumentar su velocidad de degradación (véase Imasaki, K., Yoshida, M., Fukuzaki, H., Asano, M., Kumakura, M., Mashimo, T., Yamanaka, H. y Nagai. T. en Int. J. Pharm. (1992) 81,
31-38);
viii) poliésteres constituidos por unidades alternas de etilenglicol y ácido tereftálico, por ejemplo Dacron^{R}, que no son degradables pero altamente biocompatibles;
ix) copolímeros de bloque que comprenden segmentos biodegradables de polímeros de hidroxiácido alifático (véase, por ejemplo Younes, H., Nataf, P. R., Cohn, D., Appelbaum, Y. J., Pizov, G. y Uretzky, G. en Biomater. Artif. Cells Artif. Organs (1988) 16, 705-719), por ejemplo junto con poliuretanos (véase Kobayashi, H., Hyon, S. H. e Ikada, Y. en "Water-curable and biodegradable prepolymers" - J. Biomed. Mater. Res. (1991) 25, 1481-1494);
x) poliuretanos, que se sabe que se toleran bien en implantes, y que pueden combinarse con segmentos "blandos" flexibles, por ejemplo que comprenden poli(tetrametilenglicol), poli(propilenglicol) o poli(etilenglicol) y segmentos "duros" aromáticos, por ejemplo que comprenden 4,4'-metilenobis(fenilenisocianato) (véase, por ejemplo Ratner, B. D., Johnston, A. B. y Lenk, T. J. en J. Biomed. Mater. Res: Applied Biomaterials (1987) 21, 59-90; Sa Da Costa, V. et al. en J. Coll. Interface Sci. (1981) 80, 445-452 y Affrossman, S. et al. en Clinical Materials (1991) 8,
25-31);
xi) poli(1,4-dioxan-2-onas), que pueden considerarse ésteres biodegradables en vista de sus engarces éster hidrolizables (véase, por ejemplo Song, C. X., Cui, X. M. y Schindler, A. en Med. Biol. Eng. Comput. (1993) 31, S147-150), y que pueden incluir unidades glicolida para mejorar su capacidad de absorción (véase Bezwada, R. S., Shalaby, S. W. y Newman, H. D. J, en Agricultural and synthetic polimers: Biodegradability and utilization (1990) (ed. Glass, J.E. y Swift, G.), 167-174 - ACS symposium Series, Nº 433, Washington D.C., Estados Unidos - American Chemical Society);
xii) polianhídridos tales como copolímeros de ácido sebácico (ácido octanodioico) con bis(4-carboxi-fenoxi)propano, que se ha demostrado en estudios con conejos (véase Brem, H., Kader, A., Epstein, J. I., Tamargo, R. J., Domb, A., Langer, R. y Leong, K. W. en Sel. Cancer Ther. (1989) 5, 55-65) y estudios con ratas (véase Tamargo, R. J., Epstein, J. I., Reinhard, C. S., Chasin, M. y Brem, H. en J. Biomed. Mater. Res. (1989) 23, 253-266) que son útiles para la liberación controlada de fármacos en el cerebro sin efectos tóxicos evidentes;
xiii) polímeros biodegradables que contienen grupos orto-éster, que se han empleado para la liberación controlada in vivo (véase Maa, Y. F. y Heller, J. en J. Control. Release (1990) 14, 21-28); y
xiv) polifosfazenos, que son polímeros inorgánicos constituidos por átomos alternos de fósforo y nitrógeno (véase Crommen, J. H., Vandorpe, J. y Schacht, E. H. en J. Control. Release (1993) 24, 167-180).
Las siguientes tablas enumeran agentes enlazadores y agentes para la modificación de proteínas que pueden ser útiles para preparar agentes dirigibles de acuerdo con la invención.
Agentes enlazadores heterobifuncionales
1
2 
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Agentes enlazadores homobifuncionales
3
Agentes de biotinilación
5 
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Agentes para modificación de proteínas
6
Otras modificaciones de las proteínas potencialmente útiles incluyen desglicosidación parcial o completa por neuraminidasa, endoglicosidasas o peryodato, ya que la desglicosidación a menudo provoca una menor captación por el hígado, bazo, macrófagos, etc., mientras que la neo-glicosilación de las proteínas a menudo provoca una captación aumentada por el hígado y los macrófagos; preparación de formas truncadas por escisión proteolítica, que conduce a un tamaño reducido y vida media en circulación más corta; y cationización, por ejemplo, como se describe por Kumagi et al., en J. Biol. Chem. (1987) 262, 15214-15219; Triguero et al., en Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86, 4761-4765; Pardridge et al., en J. Pharmacol. Exp. Therap. (1989) 251, 821-826 y Pardridge y Boado, Febs Lett. (1991) 288, 30-32.
Los vectores que pueden emplearse de manera útil en agentes dirigibles de acuerdo con la invención incluyen los siguientes:
i) Anticuerpos, que pueden usarse como vectores para un intervalo muy amplio de dianas, y que tienen propiedades ventajosas tales como especificidad muy alta, alta afinidad (si se desea), la posibilidad de modificar la afinidad de acuerdo con las necesidades etc. Que los anticuerpos sean o no bioactivos dependerá de la combinación vector/diana específica. Pueden emplearse tanto anticuerpos convencionales como modificados genéticamente, permitiendo los últimos modificar anticuerpos para necesidades particulares, por ejemplo, con respecto a la afinidad y la especificidad. Puede preferirse el uso de anticuerpos humanos para evitar reacciones inmunes posibles contra la molécula vector. Una clase útil adicional de anticuerpos comprende los denominados anticuerpos bi y multiespecíficos, es decir, anticuerpos que tienen especificidad por dos o más antígenos diferentes en un molécula de anticuerpo. Dichos anticuerpos pueden, por ejemplo, se útiles para promover la formación de grupos de burbujas y también pueden usarse para diversos propósitos terapéuticos, por ejemplo, para que lleven restos tóxicos a la diana. Diversos aspectos de anticuerpos biespecíficos se describen por McGuinness, B.T. et al. en Nat. Biotechnol. (1996) 14, 1149-1154; por George, A.J. et al., en J. Immunol. (1994) 152, 1802-1811; por Bonardi et al., en Cancer Res. (1993) 53, 3015-3021; y por French, R.R. et al. en Cancer Res. (1991) 51, 2353-2361.
ii) Moléculas de adhesión celular, sus receptores, citoquinas, factores de crecimiento, hormonas peptídicas y trozos de los mismos. Dichos vectores dependen de las interacciones proteína-proteína biológicas normales con receptores de moléculas diana, y por tanto en muchos casos generarán una respuesta biológica al unirse con las dianas y por tanto serán bioactivos; esto puede ser una preocupación relativamente insignificante con vectores que se dirigen a proteoglicanos.
iii) Agonistas/antagonistas no peptídicos y agentes de unión no bioactivos de receptores para moléculas de adhesión celular, citoquinas, factores de crecimientos y hormonas peptídicas. Esta categoría puede incluir vectores no bioactivos que no serán ni agonistas ni antagonistas pero que pueden mostrar de otro modo una capacidad de dirección
valiosa.
iv) Oligonucleótidos y oligonucleótidos modificados que se unen a ADN o ARN a través de apareamiento de bases de Watson-Crick y otros tipos de apareamiento de bases. El ADN habitualmente sólo está presente en el espacio extracelular como consecuencia de daño celular, de modo que dichos oligonucleótidos, que habitualmente serán no bioactivos, pueden ser útiles en, por ejemplo, dirigirse a regiones necróticas, que está asociadas con muchas afecciones patológicas diferentes. Los oligonucleótidos también pueden diseñarse para que se unan a proteínas de unión de ADN o ARN específicas, por ejemplo factores de transcripción que muy a menudo están altamente sobre-expresados o activados en células tumorales o en células inmunes activadas o endoteliales. Las bibliotecas combinatorias pueden usarse seleccionar oligonucleótidos que se unen específicamente a cualquier molécula diana posible y que, por lo tanto, pueden emplearse como vectores para dirigir.
v) Los fármacos de unión a ADN pueden comportarse de manera similar a los oligonucleótidos, pero pueden mostrar actividad biológica y/o efectos tóxicos si los captan las células.
vi) Sustrato/inhibidores de proteasas. Las proteasas están implicadas en muchas afecciones patológicas. Muchos sustratos/inhibidores son no peptídicos pero, al menos en el caso de los inhibidores, a menudo son bioactivos.
vii) Pueden generarse moléculas vector a partir de bibliotecas combinatorias sin conocer necesariamente la diana molecular exacta, seleccionando de manera funcional (in vitro, ex vivo o in vivo) moléculas que se unen a la región/estructura de la que se quiere formar imágenes.
viii) Diversas moléculas pequeñas, incluyendo compuestos bioactivos se sabe que se unen a receptores biológicos de diversos tipos. Dichos vectores o sus dianas pueden usarse para generar compuestos no bioactivos que se unen a las mismas dianas.
ix) Proteínas o péptidos que se unen a cadenas laterales de glucosaminoglicanos, por ejemplo, heparán sulfato, incluyendo partes de unión a glucosaminoglicanos de moléculas más grandes, ya que la unión a glucosaminoglicanos no provoca una respuesta biológica. Los proteoglicanos no se encuentran en glóbulos rojos, que elimina la adsorción no deseable a estas células.
Otros vectores peptídicos y lipopéptidos de los mismos de particular interés para la formación de imágenes por ultrasonidos dirigida se enumeran a continuación: Péptidos de unión a placas ateroscleróticas tales como YRALVD
TLK, YAKFRETLEDTRDRMY y RALVDTEFKVKQEAGAK; péptidos de unión a trombos tales como NDGDF
EEIPEEYLQ y GPRG, péptidos de unión a plaquetas tales como PLYKKIIKKLLES; y colecistoquinina, hormona estimuladora de \alpha-melanocitos, enterotoxina estable al calor 1, péptido intestinal vasoactivo, péptido alfa-M2 sintético de la tercera región determinante de complementariedad de la cadena pesada y análogos de los mismos para dirigir a tumores.
Las siguientes tablas identifican diversos vectores que pueden dirigirse a tipos particulares de dianas y áreas indicadas de uso para agentes de diagnóstico y/o terapéuticos dirigibles de acuerdo con la invención que contienen dichos vectores.
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(Tabla pasa a página siguiente)
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Vectores proteicos y peptídicos - anticuerpos
8
9
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Vectores proteicos y peptídicos - moléculas de adhesión celular etc.
10 
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Vectores que comprenden citoquinas/factores de crecimiento/hormonas peptídicas y fragmentos de los mismos
11 
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Vectores proteicos y peptídicos variados
12
14
Vectores que comprenden agonistas/antagonistas no peptídicos o agentes de unión no bioactivos de receptores de citoquinas/factores de crecimiento/hormonas peptídicas/moléculas de adhesión celular
15
Vectores que comprenden factores anti-angiogénicos
16
17
Vectores que comprenden factores angiogénicos
18
19
Moléculas vector distintas de los factores angiogénicos reconocidos con afinidad conocida por receptores asociados a angiogénesis
20
21
Receptores/dianas asociados con angiogénesis
22
23
24
Vectores oligonucleotídicos
25
26
Vectores de oligonucleótidos modificados
27
Vectores de nucleósidos y nucleótidos
28 
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Receptores que comprenden fármacos de unión a ADN
29
Receptores que comprenden sustratos de proteasa
31
Receptores que comprenden inhibidores de proteasa
32 
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Vectores de bibliotecas combinatorias
33
Vectores de carbohidratos
35
Vectores de (glico)lípidos
36
Vectores de moléculas pequeñas
37
38
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Los siguientes ejemplos no limitantes sirven para ilustrar la invención. La confirmación de la naturaleza microparticulada de los productos se realiza usando microscopía como se describe en el documento WO-A-9607434. Las medidas de transmisión de ultrasonidos puede hacerse usando un transductor de banda ancha para indicar las suspensiones de microburbujas que dan una atenuación del haz de sonido aumentada en comparación con un análisis por citometría de flujo convencional de los productos que puede usarse para confirmar la unión de las macromoléculas a los mismos. La capacidad de las microburbujas dirigidas de unirse específicamente a células que expresan una diana puede estudiarse in vitro por microscopía y/o usando una cámara de flujo que contiene células inmovilizadas, por ejemplo, que emplean una población de células que expresan la estructura diana y una población adicional de células que no expresan la diana. Puede usarse estreptavidina/avidina marcada con radiactividad, fluorescencia o enzimas para analizar la unión de la biotina.
Ejemplo 1 Adhesión de microburbujas encapsuladas con fosfatidilserina recubiertas con poli-L-lisina a células endoteliales
Poli-L-lisina (8 mg) que tiene un peso molecular de 115 kDa se disolvió en agua (400 \mul). Las microburbujas de perfluorobutano encapsulado con fosfatidilserina (40 \mul) redispersadas recientemente se incubaron en agua (400 \mul) o la solución de poli-L-lisina durante 15 minutos a temperatura ambiente. Las medidas del potencial Z confirmaron que las microburbujas recubiertas con poli-L-lisina estaban cargadas positivamente mientras que las burbujas no recubiertas estaban cargadas negativamente. Un estudio de adhesión celular usando células endoteliales humanas cultivadas en placas de cultivo se realizó con las micro-burbujas descritas anteriormente, usándose las microburbujas no recubiertas como un control. La microscopía de las células endoteliales después de la incubación mostró un número mucho mayor de microburbujas recubiertas con poli-L-lisina que se adhieren a las células endoteliales en comparación con las microburbujas no recubiertas.
Ejemplo 2 Microburbujas rellenas con gas que comprenden fosfatidilserina y RGDC-Mal-PEG_{3400}-DSPE a) Síntesis de Boc-NH-PEG_{3400}-DSPE (t-butil carbamato poli (etilenglicol) distearoilfosfatidiletanolamina)
Se añadió DSPE (distearoilfosfatidiletanolamina) (31 mg, sygena Inc.) a una solución de BOC-NH-PEG_{3400}-SC (poli (etilenglicol)-succinimidil carbonato de t-butil carbamato) (150 mg) en cloroformo (2 ml), seguido de trietilamina (33 \mul). La mezcla formó una solución transparente después de agitar a 41ºC durante 10 minutos. El disolvente se evaporó rotatoriamente y el residuo se recogió en acetonitrilo (5 ml). La dispersión obtenida de esta manera se enfrió a 4ºC y se centrifugó, separándose después la solución del material sin disolver y se evaporó a sequedad. La estructura del producto resultante se confirmó por RMN.
b) Síntesis de H_{2}N-PEG_{3400}-DSPE (amino-poli(etilenglicol)-distearoilfosfatidiletanolamina)
Boc-NH-PEG-_{3400}-DSPE (167 mg) se agitó en ácido clorhídrico 4 M en dioxano (5 ml) durante 2,5 horas a temperatura ambiente. El disolvente se retiró por evaporación rotatoria y el residuo se recogió en cloroformo (1,5 ml) y se lavó con agua (2 x 1,5 ml). La fase orgánica se retiró por evaporación rotatoria. TLC (cloroformo/metanol/agua 13:5:0,8) dio el producto del título con Rf = 0,6; la estructura del producto, que era positivo a ninhidrina, se confirmó por RMN.
c) Síntesis de Mal-PEG-_{3400}-DSPE (3-maleimidopropionato poli-(etilenglicol) distearoilfosfatidiletanolamina)
Una solución de N-succinimidil-3-maleimidopropionato (5,6 mg, 0,018 mmol) en tetrahidrofurano (0,2 ml) se añade a H_{2}N-PEG_{3400}-DSPE (65 mg, 0,012 mmol) disuelto en tetrahidrofurano (1 ml) y tampón fosfato sódico 0,1 M pH 7,5 (2 ml). La mezcla de reacción se calienta a 30ºC y la reacción se sigue hasta que se completa por TLC, el disolvente se evapora posteriormente.
d) Síntesis de RGDC-Mal-PEG_{3400}-DSPE
Mal-PEG_{3400}-DSPE (0,010 mmol) en tampón fosfato sódico 0,1 M que tiene un pH de 7,5 se añade al péptido RGDC (0,010 mmol). La mezcla de reacción se calienta a 37ºC si fuera necesario y la reacción se sigue por TLC hasta completarse, el disolvente se retira posteriormente.
e) Preparación de microburbujas rellenas con gas encapsuladas con fosfatidilserina y RGDC-Mal-PEG_{3400}-DSPE
A una mezcla (5 mg) de fosfatidilserina (90-99,9% en moles) y Mal-PEG_{3400}-DSPE (10-0,1% en moles) se añade propilenglicol al 5%-glicerol en agua (1 ml). La dispersión se calienta a no más de 80ºC durante 5 minutos y después se enfrió a temperatura ambiente. La dispersión (0,8 ml) se transfiere después a un vial (1 ml) y el espacio de cabeza se lava abundantemente con perfluorobutano. El vial se agita en una mezcladora con tapa durante 45 segundos, poniéndose la muestra posteriormente en una mesa vibratoria. Después de la centrifugación el infranadante se intercambia con tampón fosfato sódico 0,1 M que tiene un pH de 7,5. El péptido RGDC, disuelto en tampón fosfato sódico 0,1 M que tiene un pH de 7,5, se añade a las microburbujas lavadas, que se ponen sobre la mesa vibratoria. El procedimiento de lavado se repite después.
f) Preparación alternativa de microburbujas rellenas con gas encapsuladas con fosfatidilserina y RGDC-Mal-PEG_{3400}-DSPE
A fosfatidilserina (5 mg) se le añade propilenglicol al 5%-glicerol en agua (1 ml). La dispersión se calienta a no más de 80ºC durante 5 minutos y después se enfrió a temperatura ambiente. La dispersión (0,8 ml) se transfiere a un vial (1 ml) y el espacio de cabeza se lava abundantemente con perfluorobutano. El vial se agita en una mezcladora con tapa durante 45 segundos, poniéndose la muestra posteriormente en una mesa vibratoria. Después de la centrifugación el infranadante se intercambia con tampón fosfato sódico 0,1 M que tiene un pH de 7,5. Se añade RGDC-Mal-PEG_{3400}-DSPE disuelto en tampón fosfato sódico 0,1 M que tiene un pH de 7,5 a las microburbujas lavadas, que se ponen después en la mesa vibratoria. El procedimiento de lavado se repite después de la incorporación de the RGDC-Mal-PEG_{3400}-DSPE en las membranas de las microburbujas.
Ejemplo 3 Microburbujas rellenas con gas encapsuladas con fosfatidilserina, fosfatidilcolina y biotinamidocaproato-PEG_{3400}-Ala-colesterol a) Síntesis de Z-Ala-colesterol (3-O-(carbobenciloxi-L-alanil)colesterol)
Colesterol (4 mmol), Z-alanina (5 mmol) y dimetilaminopiridina (4 mmol) se disolvieron en dimetilformamida/tetrahidrofurano (20 ml + 5 ml) y se añadió diciclohexilcarbodiimida. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante una noche. Diciclohexilurea se retiró por filtración y el disolvente se evaporó rotatoriamente. El residuo se recogió en cloroformo, la diciclohexilurea sin disolver se retiró por filtración y el disolvente se retiró por evaporación rotatoria. El residuo se puso en una columna de gel de sílice, y Z-Ala-colesterol se eluyó con tolueno/éter de petróleo (20:2) seguido de tolueno/éter dietílico (20:2). Las fracciones que contienen el compuesto del título se combinaron y el disolvente se retiró por evaporación rotatoria. La estructura del producto se confirmó por RMN.
b) Síntesis de Ala-colesterol (3-O-(L-alanil)-colesterol)
Z-Ala-colesterol (0,48 mmol) se pone en tetrahidrofurano (20 ml) y ácido acético glacial (3 ml) y se hidrogenó en presencia de paladio al 5% sobre carbono durante 2 horas. La mezcla de reacción se filtra y se concentra al vacío.
c) Síntesis de Boc-NH-PEG3400-Ala-colesterol
Se añade Ala-colesterol a una solución de Boc-NH-PEG_{3400}-SC (poli(etilenglicol)-succinimidil carbonato de t-butil carbamato) en cloroformo, seguido de trietilamina. La suspensión se agita a 41ºC durante 10 minutos. El producto bruto se purifica por cromatografía.
d) Síntesis de H_{2}N-PEG_{3400}-Ala-colesterol
Boc-NH-PEG_{3400}-Ala-colesterol se agita en ácido clorhídrico 4 M en dioxano durante 2,5 horas a temperatura ambiente. El disolvente se retira por evaporación rotatoria y el residuo se recoge en cloroformo y se lava con agua. La fase orgánica se evapora rotatoriamente a sequedad. El producto bruto puede purificarse por cromatografía.
e) Síntesis de biotinaamidocaproato-PEG_{3400}-Ala-colesterol
Una solución de biotinaamidocaproato N-hidroxisuccinimida éster en tetrahidrofurano se añade a H_{2}N-PEG_{3400}-Ala-colesterol disuelto en tetrahidrofurano y tampón fosfato sódico 0,1 M que tiene un pH de 7,5 (2 ml). La mezcla de reacción se calienta a 30ºC y la reacción se sigue hasta que se completa por TLC, el disolvente se evapora posteriormente.
f) Preparación de microburbujas rellenas con gas encapsuladas con fosfatidilserina, fosfatidilcolina y biotinamido-caproato-PEG_{3400}-Ala-colesterol
A una mezcla (5 mg) de fosfatidilserina y fosfatidilcolina (en total 90-99,9% en moles) y biotinamidocaproato-PEG_{3400}-Ala-colesterol (10-0,1% en moles) se añade propilenglicol al 5%-glicerol en agua (1 ml). La dispersión se calienta a no más de 80ºC durante 5 minutos y después se enfrió a temperatura ambiente. La dispersión (0,8 ml) se transfiere después a un vial (1 ml) y el espacio de cabeza se lava abundantemente con perfluorobutano. El vial se agita en una mezcladora con tapa durante 45 segundos, poniéndose la muestra posteriormente en una mesa vibratoria. Después de la centrifugación el infranadante se intercambia con agua y se repite el lavado.
g) Preparación alternativa de microburbujas rellenas con gas encapsuladas con fosfatidilserina, fosfatidilcolina y biotinamidocaproato-PEG_{3400}-Ala-colesterol
A una mezcla (5 mg) de fosfatidilserina y fosfatidilcolina se añade propilenglicol al 5%-glicerol en agua (1 ml). La dispersión se calienta a no más de 80ºC durante 5 minutos y después se enfrió a temperatura ambiente. La dispersión (0,8 ml) se transfiere después a un vial (1 ml) y el espacio de cabeza se lava abundantemente con perfluorobutano. El vial se agita en una mezcladora con tapa durante 45 segundos, poniéndose la muestra posteriormente en una mesa vibratoria. Después de la centrifugación el infranadante se intercambia con agua. biotinamidocaproato-PEG_{3400}-Ala-colesterol disuelto en agua se añade a las microburbujas lavadas, que se ponen en una tabla vibratoria varias horas. El procedimiento de lavado se repite después de la incorporación del biotinamidocaproato-PEG_{3400}-Ala-colesterol en las membranas de las microburbujas.
Ejemplo 4 Microburbujas rellenas con gas que comprenden fosfatidilserina, fosfatidilcolina, biotinamidocaproato-PEG_{3400}-Ala-Colesterol y fármaco-colesterol a) Síntesis de fármaco-colesterol
Colesterol (4 mmol), un fármaco que tiene un grupo ácido y dimetilaminopiridina (4 mmol) se disuelven en dimetilformamida/tetrahidrofurano (20 ml + 5 ml) y se añade diciclohexilcarbodiimida. La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante una noche. Diciclohexilurea se retira por filtración y el disolvente se evapora rotatoriamente. El compuesto del título se purifica por cromatografía.
b) Preparación de microburbujas rellenas con gas encapsuladas con fosfatidilserina, fosfatidilcolina biotinaamidocaproato-PEG_{3400}-Ala-colesterol y fármaco-colesterol
A una mezcla (5 mg) de fosfatidilserina y fosfatidilcolina (en total 90-99,9% en moles) y biotinaamidocaproato-PEG_{3400}-Ala-colesterol (preparado como en el Ejemplo 3) y fármaco-colesterol (en total 10-0,1% en moles) se añade propilenglicol al 5%-glicerol en agua (1 ml). La dispersión se calienta a no más de 80ºC durante 5 minutos y después se enfrió a temperatura ambiente. La dispersión (0,8 ml) se transfiere a un vial (1 ml) y el espacio de cabeza se lava abundantemente con perfluorobutano. El vial se agita en una mezcladora con tapa durante 45 segundos poniéndose la muestra posteriormente en una mesa vibratoria. Después de la centrifugación el infranadante se intercambia con agua y se repite el lavado.
Ejemplo 5 Microburbujas rellenas con gas encapsuladas con fosfatidilserina y anti-CD34-Mal-PEG_{3400}-DSPE tiolado a) Preparación de anticuerpos anti-CD34 tiolados
La tiolación de anticuerpos anti-CD34 puede realizarse como se describe por Hansen, C.B. et al. (1995) Biochim. Biophys. Acta 1239, 133-144.
b) Preparación de microburbujas rellenas con gas encapsuladas con fosfatidilserina y anti-CD34-Mal-PEG_{3400}-DSPE tiolado
A una mezcla (5 mg) de fosfatidilserina (90-99,9% en moles) y Mal-PEG_{3400}-DSPE (10-0,1% en moles, preparado como en el Ejemplo 2) se añade propilenglicol al 5%-glicerol en agua (1 ml). La dispersión se calienta a no más de 80ºC durante 5 minutos y después se enfrió a temperatura ambiente. La dispersión (0,8 ml) se transfiere a un vial (1 ml) y el espacio de cabeza se lava abundantemente con perfluorobutano. El vial se agita en una mezcladora con tapa durante 45 segundos, poniéndose la muestra posteriormente en una mesa vibratoria. Después de la centrifugación el infranadante se intercambia con un tampón apropiado y se realiza el acoplamiento del anticuerpo tiolado con las microburbujas, por ejemplo como se describe por Goundalkar, A., Ghose, T. y Mezei, M. en J. Pharm. Pharmacol. (1984) 36 465-66 o Hansen, C.B. et al. (1995) Biochim. Biophys. Acta 1239 133-144. Las microburbujas se ponen después sobre una mesa vibratoria durante varias horas y se lavan. El análisis por citometría de flujo de las microburbujas resultantes (empleando un anticuerpo secundario marcado fluorescentemente) se usa para confirmar la unión del anticuerpo anti-CD34 a las burbujas. La capacidad de las burbujas para unirse específicamente a células que expresan CD34 se estudia por microscopía empleando una población de células que expresan CD34 y una población que no expresa CD34.
Ejemplo 6 Biotina unida a microburbujas rellenas con gas
La biotina puede unirse a microburbujas de muchas maneras diferentes, por ejemplo de una manera similar a la descrita por Corley, P. y Loughrey, H.C. en (1994) Biochim. Biophys. Acta 1195, 149-156. Las burbujas resultantes se analizan por citometría de flujo, por ejemplo empleando estreptavidina fluorescente para detectar la unión de biotina a las burbujas. Como alternativa se usa estreptavidina/avidina radiactiva o marcada enzimáticamente para analizar la unión a biotina.
Ejemplo 7 Microburbujas rellenas con gas encapsuladas con distearoilfosfatidilserina y biotina-DPPE
A distearoilfosfatidilserina (DSPS) (22,6 mg) se le añadió propilenglicol-glicerol al 4% en agua (4 ml). La dispersión se calentó a no más de 80ºC durante cinco minutos y después se enfrió a temperatura ambiente. Se añadió una dispersión acuosa de biotina-DPPE (1,5 mg) en propilenglicol-glicerol al 4% (1 ml) y la muestra se puso sobre una mesa vibratoria durante 1-2 horas. La suspensión se rellenó en viales y los espacios de cabeza se lavaron abundantemente con perfluorobutano. Los viales se agitaron durante 45 segundos, posteriormente se pusieron sobre una mesa vibratoria. Después de la centrifugación durante 7 minutos el infranadante se intercambió con agua y se repitió el lavado dos veces. HPLC en fase normal con un Detector de Dispersión de luz Evaporativo confirmó que las membranas de las microburbujas contenían un 4% en moles de biotina-DPPE. El diámetro medio de partícula de las microburbujas era de 4 \mum medido mediante un Contador Coulter. Las medidas de transmisión por ultrasonidos usando un transductor con ancho de banda de 3,5 MHz mostraron que una dispersión de partículas de < 2 mg/ml dio una atenuación del rayo sonoro mayor de 5 dB/cm.
Ejemplo 8 Microburbujas rellenas con gas encapsuladas con fosfatidilserina y anticuerpo biotinilado unido de manera no covalente a estreptavidina-Succ-PEG-DSPE a) Síntesis de Succ-PEG_{3400}-DSPE
NH_{2}-PEG34QQ-DSPE (preparado como en el Ejemplo 2) se carboxila usando anhídrido succínico, por ejemplo mediante un método similar al descrito por Nayar, R. y Schroit, A. J. en Biochemistry (1985) 24, 5967-71.
b) Preparación de microburbujas rellenas con gas encapsuladas con fosfatidilserina y Succ-PEG_{3400}-DSPE
A una mezcla (5 mg) de fosfatidilserina (90-99,9% en moles) y Succ-PEG_{3400}-DSPE (10-0,1% en moles) se añade propilenglicol al 5%-glicerol en agua (1 ml). La dispersión se calienta a no más de 80ºC durante 5 minutos y después se enfrió a temperatura ambiente. La dispersión (0,8 ml) se transfiere a un vial (1 ml) y el espacio de cabeza se lava abundantemente con perfluorobutano. El vial se agita en una mezcladora con tapa durante 45 segundos, poniéndose la muestra posteriormente en una mesa vibratoria. Después de la centrifugación el infranadante se intercambia con agua y se repite el lavado. Como alternativa las microburbujas pueden prepararse como se describe en el Ejemplo 2(f).
c) Acoplamiento de estreptavidina a microburbujas rellenas con gas encapsuladas con fosfatidilserina y Succ-PEG_{3400}-DSPE
La estreptavidina se une covalentemente a Succ-PEG_{3400}-DSPE en las membranas de las microburbujas mediante método de acoplamiento convencionales usando una carbodiimida soluble en agua. La muestra se pone sobre una mesa vibratoria durante la reacción. Después de la centrifugación el infranadante se intercambia con agua y se repite el lavado. La funcionalidad de la estreptavidina unida se analiza mediante la unión, por ejemplo a biotina marcada fluorescentemente, anticuerpos biotinilados (detectado con un anticuerpo secundario marcado fluorescentemente) u oligonucleótidos biotinilados y maracos por fluorescencia o radiactivamente. El análisis se realiza por microscopía de fluorescencia o conteo de centelleo.
d) Preparación de microburbujas rellenas con gas encapsuladas con fosfatidilserina y biotina unida de manera no covalente a estreptavidina-Succ-PEG_{3400}-DSPE
Las microburbujas del Ejemplo 8(c) se incuban en una solución que contiene vectores biotinilados, por ejemplo anticuerpos biotinilados. Las microburbujas recubiertas con vector se lavan como se ha descrito anteriormente.
Ejemplo 9 Microburbujas rellenas con gas encapsuladas con fosfatidilserina y oligonucleótido biotinilado unido de manera no covalente a estreptavidina-Succ-PEG-DSPE a) Síntesis de Succ-PEG_{3400}-DSPE
NH_{2}-PEG_{3400}-DSPE (preparado como en el Ejemplo 2) se carboxila usando anhídrido succínico, por ejemplo mediante un método similar al descrito por Nayar, R. y Schroit, A.J. en Biochemistry (1985) 24, 5967-71.
b) Preparación de microburbujas rellenas con gas encapsuladas con fosfatidilserina y Succ-PEG_{3400}-DSPE
A una mezcla (5 mg) de fosfatidilserina (90-99,9% en moles) y Succ-PEG_{3400}-DSPE (10-0,1% en moles) se añade propilenglicol al 5%-glicerol en agua (1 ml). La dispersión se calienta a no más de 80ºC durante 5 minutos y después se enfrió a temperatura ambiente. La dispersión (0,8 ml) se transfiere a un vial (1 ml) y el espacio de cabeza se lava abundantemente con perfluorobutano. El vial se agita en una mezcladora con tapa durante 45 segundos, poniéndose la muestra posteriormente en una mesa vibratoria. Después de la centrifugación el infranadante se intercambia con agua y se repite el lavado. Como alternativa las microburbujas pueden prepararse como se describe en el Ejemplo 2(f).
c) Acoplamiento de estreptavidina a microburbujas rellenas con gas encapsuladas con fosfatidilserina y Succ-PEG_{3400}-DSPE
Estreptavidina se une covalentemente a Succ-PEG_{3400}-DSPE en las membranas de las microburbujas por métodos de acoplamiento convencionales usando una carbodiimida soluble en agua. La muestra se pone sobre una mesa vibratoria durante la reacción. Después de la centrifugación el infranadante se intercambia con agua y se repite el lavado. La funcionalidad de la estreptavidina unida se analiza mediante la unión, por ejemplo a biotina marcada fluorescentemente, anticuerpos biotinilados (detectados con un anticuerpo secundario marcado fluorescentemente) u oligonucleótidos biotinilados y marcados por fluorescencia o radiactivamente. El análisis se realiza por microscopía de fluorescencia o conteo de centelleo.
d) Preparación de microburbujas rellenas con gas encapsuladas con fosfatidilserina y un oligonucleótido biotinilado unido de manera no covalente a estreptavidina-Succ-PEG_{3400}-DSPE
Las microburbujas del Ejemplo 9(c) se incuban en una solución que contiene un oligonucleótido biotinilado. Las burbujas recubiertas con oligonucleótido se lavan como se ha descrito anteriormente. La unión del oligonucleótido a las burbujas se detecta por ejemplo usando oligonucleótidos marcadas por fluorescencia para la unión a las burbujas, o por hibridación del oligonucleótido unido a un oligonucleótido complementario marcado (por fluorescencia o radiactividad). La funcionalidad de las microburbujas que llevan oligonucleótido se analiza, por ejemplo hibridando las burbujas con secuencias complementarias que contienen ADN inmovilizado al oligonucleótido unido. Como ejemplos, pueden usarse un oligonucleótido complementario al ADN ribosómico (del que hay muchas copias por genoma haploide) y un oligonucleótido complementario a un oncogén (por ejemplo, ras del que hay una copia por genoma haploide).
Ejemplo 10 Microburbujas rellenas con gas encapsuladas con fosfatidilserina y folato-PEG-Succ-DSPE a) Preparación de folato-PEG-Succ-DSPE
El Folato-PEG-Succ-DSPE se sintetiza como se describe por Lee, R.J. y Low, P.S. en (1995) Biochimica. Bio-physica. Acta 1233, 134-144.
b) Preparación de microburbujas rellenas con gas encapsuladas con fosfatidilserina y folato-PEG-Succ-DSPE
A una mezcla (5 mg) de fosfatidilserina (90-99,9% en moles) y folato-PEG-DSPE (10-0,1% en moles) se le añade propilenglicol al 5%-glicerol en agua (1 ml). La dispersión se calienta a no más de 80ºC durante 5 minutos y después se enfrió a temperatura ambiente. La dispersión (0,8 ml) se transfiere a un vial (1 ml) y el espacio de cabeza se lava abundantemente con perfluorobutano. El vial se agita en una mezcladora con tapa durante 45 segundos, poniéndose la muestra posteriormente en una mesa vibratoria. Después de la centrifugación el infranadante se intercambia con agua y se repite el lavado. Como alternativa las microburbujas se preparan como se describe en el Ejemplo 2(e) o
2(f). El análisis de unión de folato puede realizarse, por ejemplo, mediante un estudio microscópico de la unión de las microburbujas que contienen folato a las células que expresan diferente niveles de receptores de folato.
Ejemplo 11 Microburbujas rellenas con gas encapsuladas con fosfatidilserina y anti-CD34-Mal-PEG_{3400}-DSPE tiolado, anti-ICAM-1-Mal-PEG_{3400}-DSPE tiolado y anti-E-Selectina-Mal-PEG_{3400}-DSPE tiolado a) Preparación de anticuerpos anti-CD34 tiolados
La tiolación de anticuerpos anti-CD34 puede realizarse como se describe por Hansen, C.B. et al. en (1995) Biochim. Biophys. Acta 1239, 133-144.
b) Preparación de anticuerpos anti-ICAM-1 tiolados
La tiolación de anticuerpos anti-ICAM-1 puede realizarse como se describe por Hansen, C.B. et al. en (1995) Biochim. Biophys. Acta 1239, 133-144.
c) Preparación de anticuerpos anti-E-selectina tiolados
La tiolación de anticuerpos anti-E-selectina puede realizarse como se describe por Hansen, C.B. et al. en (1995) Biochim. Biophys. Acta 1239, 133-144.
d) Preparación de microburbujas rellenas con gas encapsuladas con fosfatidilserina y anti-CD34-Mal-PEG_{3400}-DSPE tiolado anti-ICAM-1-Mal-PEG_{3400}-DSPE tiolado, anti-E-selectina-Mal-PEG_{3400}-DSPE tiolado
A una mezcla (5 mg) de fosfatidilserina (90-99,9% en moles) y Mal-PEG_{3400}-DSPE (10-0,1% en moles, preparado como en el Ejemplo 2) se le añade propilenglicol al 5%-glicerol en agua (1 ml). La dispersión se calienta a no más de 80ºC durante 5 minutos y después se enfrió a temperatura ambiente. La dispersión (0,8 ml) se transfiere a un vial (1 ml) y el espacio de cabeza se lava abundantemente con perfluorobutano. El vial se agita en una mezcladora con tapa durante 45 segundos, poniéndose después la muestra sobre una mesa vibratoria. Después de la centrifugación el infranadante se intercambia con un tampón apropiado, y se realiza el acoplamiento de los anticuerpos del Ejemplo
11(a), 11(b) y 11(c) a las microburbujas, por ejemplo como se describe por Goundalkar, A., Ghose, T. y Mezei, M. en J. Pharm. Pharmacol. (1984) 36, 465-466 o by Hansen, C.B. et al. en (1995) Biochim. Biophys. Acta 1239, 133-144. Las microburbujas se ponen sobre una mesa vibratoria durante varias horas y después se lavan.
Ejemplo 12 El péptido FNFRLKAGOKIRFGAAAWEPPRARI unido a microburbujas rellenas con gas encapsuladas con fosfatidilserina
El péptido FNFRLKAGQKIRFGAAAWEPPRARI, que comprende secciones de unión a fosfatidilserina y de unión a heparina, se sintetiza. El péptido se añade a microburbujas encapsuladas con fosfatidilserina preformadas con perfluorobutano y se añade minuciosamente.
Ejemplo 13 Fibronectina unida covalentemente a microburbujas rellenas con gas encapsuladas con fosfatidilserina y fosfatidiletanolamina a) Preparación de las microburbujas
DSPS (25 mg) y DSPE (5,0 mg) se pesaron en un vial limpio y se añadieron 5 ml de una solución de propilenglicol al 1,4%/glicerol al 2,4%. La mezcla se calentó a 80ºC durante 5 minutos. La muestra se enfrió a temperatura ambiente y el espacio de cabeza se lavó abundantemente con gas perfluorobutano. Los viales se agitaron en una mezcladora con tapa durante 45 segundos y las microburbujas se lavaron dos veces con agua destilada después se resuspendieron en tampón borato sódico 0,1 M, pH 9.
b) Modificación de fibronectina
Se añadió fibronectina (1,0 mg) en 5 ml de tampón Hepes 0,01 M, pH 8, a 0,1 mmol del agente de reticulación SDBP. La mezcla se incubó en hielo durante 2 horas.
c) Modificación de las microburbujas
A la solución de proteína de (b) se le añadió la suspensión de microburbujas de (a) y se permitió que la incubación transcurriera durante 2 horas a temperatura ambiente sobre una mesa vibratoria. El material sin reaccionar se retiró permitiendo que las microburbujas flotaran y después sustituyendo el tampón con tampón borato sódico 0,1 M, pH 9. Este proceso se repitió tres veces.
d) Análisis in vitro
Las microburbujas se ensayaron en el ensayo in vitro detallado en el Ejemplo 21. Se observó una acumulación gradual de micro-burbujas que se unían a las células.
Ejemplo 14 Microburbujas rellenas con gas encapsuladas con fosfatidilserina, y 3\beta-[N-(N',N'-dimetilaminoetano)carbamoil]colesterol a) Síntesis de 3\beta-[N-(N',N'-dimetilaminoetano)-carbamoil]colesterol (DC-col) (Farhood. H. Gao. X. Barsoum. J. y Huan9, L Anal. Biochem. 225, 89-93 (1995))
A una solución agitada de 2-dimetilaminoetilamina (19,40 mg, 24:1, 0,22 mmol) y trietilamina (310 \mul, 2,23 mmol) en diclorometano (3 ml) a temperatura ambiente se le añadió lentamente una solución de cloroformiato de colesterilo (100 mg, 0,22 mmol) en 1,4-dioxano. Cuando la reacción se hubo completado, la mezcla se evaporó a sequedad y el residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida (CHCl_{3}/MeOH, 4:1). Se obtuvo un sólido blanco, rendimiento 105 mg (95%). La estructura se verificó por RMN y MALDI.
b) Preparación de la dispersión de microburbujas
Las microburbujas encapsuladas en monocapas que contienen perfluorobutano se preparan a partir de una mezcla de fosfatidilserina al 90% y (DC-col) al 10% pesando DSPS (4,5 mg) y (DC-col) (0,5 mg) en un vial de 2 ml. Se añaden 0,8 ml propilenglicol/glicerol (4%) en agua. La solución se calentó a 80ºC durante 5 minutos y se agitó. La solución se enfrió después a temperatura ambiente y el espacio de cabeza se lavó abundantemente con perfluorobutano. El vial se agitó en una mezcladora con tapa a 4450 oscilaciones/minuto durante 45 segundos y se puso sobre una mesa vibratoria. La muestra se lavó centrifugando a 2000 rpm durante 5 minutos. El infranadante se retiró mediante una jeringuilla y se añadió agua destilada hasta el mismo volumen. El espacio de cabeza se lavó abundantemente de nuevo con perfluorobutano y la muestra se mantuvo sobre una mesa vibratoria hasta que se obtuvo una apariencia homogénea. El procedimiento de lavado se repitió de nuevo.
Ejemplo 15 Microburbujas rellenas con gas encapsuladas con fosfatidilserina y WEPPRARI-PE
La fosfatidiletanolamina (PE) se hace reaccionar con una cantidad equimolar del agente de reticulación/V-hidroxisuccinimidil-2,3-dibromopropionato en una mezcla 1:1 de dioxano y tampón HEPES 0,02 M, pH 8,0. Después de la incubación durante 2 horas en hielo, se añade una cantidad equimolar del péptido WEPPRARI de unión a Heparina, el pH se lleva a 9 mediante la adición de tetraborato disódico 0,2 M, y la incubación se continúa durante 2 horas a temperatura ambiente. El producto de reacción se purifica por cromatografía. Las microburbujas encapsuladas en monocapas que contienen perfluorobutano se preparan a partir de una mezcla de 80-95% de fosfatidilserina (PS) y 5-20% de PE sustituido con péptido.
Ejemplo 16 Microburbujas rellenas con gas encapsuladas con fosfatidilserina y trombina humana inactivada-Succ-PEG_{3400}-DSPE a) Inactivación de trombina humana
La trombina humana se inactivó por incubación con un exceso del 20% molar de D-Phe-L-Pro-L-Arg-clorometil cetona en tampón HEPES 0,05 M, pH 8,0, a 37ºC durante 30 minutos.
b) Preparación de microburbujas rellenas con gas encapsuladas con fosfatidilserina y Succ-PEG_{3400}-DSPE
A una mezcla (5 mg) de fosfatidilserina (90-99,9% en moles) y Succ-PEG_{3400}-DSPE (10-0,1% en moles, preparado como en el Ejemplo 9(a)) se añadió propilenglicol al 5%-glicerol en agua (1 ml). La dispersión se calentó a no más de 80ºC durante 5 minutos y se enfrió después a temperatura ambiente. La dispersión (0,8 ml) se transfirió a un vial (1 ml) y el espacio de cabeza se lavó abundantemente con perfluorobutano. El vial se agitó en una mezcladora con tapa durante 45 segundos, posteriormente la muestra se puso sobre una mesa vibratoria. Después de la centrifugación el infranadante se intercambió con agua y se repitió el lavado. Como alternativa las microburbujas pueden prepararse como se describe en el Ejemplo 2(f).
c) Preparación de microburbujas rellenas con gas encapsuladas con fosfatidilserina y trombina humana inactivada-Succ-PFG_{3400}-DSPE
La trombina humana inactivada estaba unida covalentemente a Succ-PEG_{3400}-DSPE en las microburbujas del Ejemplo 16 (b) por métodos de acoplamiento convencionales usando una carbodiimida soluble en agua. La muestra se puso sobre una mesa vibratoria durante la reacción. Después de la centrifugación el infranadante se intercambió con agua y se repitió el lavado.
Ejemplo 17 Microburbujas rellenas con gas que tienen unidos metotrexato y enzima activadora del profármaco a) Metotrexato unido mediante un péptido enlazador a microburbujas rellenas con gas
Los métodos para unir aminoácidos al fármaco anticanceroso metotrexato (MTX) están bien descritos en la bibliografía (véase por ejemplo Huennekens, F.M. (1994), TIBTECH 12, 234-239 y las referencias allí citadas). En lugar de un solo aminoácido puede unirse un péptido a MTX usando la misma tecnología. Dicho péptido puede constituir un enlazador para la unión de MTX a la superficie de las microburbujas. Una clase de dichos enlazadores comprende péptidos de la estructura general (MTX) -F-K/R-X-R-Z-C en la que X es cualquier aminoácido y Z es un aminoácido hidrófobo. Un ejemplo específico de dicho enlazador es (MTX)-F-K-L-R-L-C. El grupo SH en el resto Cys se emplea para la unión del MTX-péptido a las microburbujas (por ejemplo, compuesto por fosfatidilserina y Mal-PEG-DSPE) usando tecnología convencional, por ejemplo como en el Ejemplo 2. Se espera que un enlazador de esta clase sea escindido por la enzima catepsina B que a menudo se sobreexpresa selectivamente fuera y sobre la superficie de las células tumorales (Panchal, R.G. et al. (1996), Nat. Biotechnol. 14, 852-856). Por lo tanto, el profármaco potencial (MTX)-F-K/R-X-R se liberaría selectivamente en tumores. Este profármaco puede activarse adicionalmente al fármaco activo MTX por la acción de las carboxipeptidasas, que están presentes endógenamente en el tumor o dirigidas al tumor por ejemplo por anticuerpos asociados al tumor (véase más
adelante).
b) Enzima activadora de profármaco unida covalentemente a la superficie de microburbujas rellenas con gas
Un ejemplo de una enzima activadora del profármaco es carboxipeptidasa A (CPA), que puede conjugarse a la superficie de las microburbujas encapsuladas con, por ejemplo, una mezcla de fosfatidilserina y fosfatidiletanolamina, por ejemplo usando una cadena de poli(etilenglicol) de 3400 Da que lleva un grupo N-hidroxisuccinimida en ambos extremos (Perron, M.J. y Page, M., Br. J. Cancer 73, 281-287); las microburbujas pueden prepararse por métodos convencionales. Las microburbujas que contienen CPA pueden dirigirse a áreas de patología incorporando un vector director adecuado en las burbujas que contienen CPA. Como alternativa CPA puede unirse directamente al vector (por ejemplo, un anticuerpo), por ejemplo mediante el método como se ha descrito anteriormente. En este último caso el conjugado CPA-vector se unirá a la superficie de las microburbujas como se describe en Hansen, C.B. et al. (1995) Biochim. Biophys. Acta 1239, 133-144. Los ejemplos de las muchas parejas profármaco-enzima posibles se describen por ejemplo en Huennekens, F.M. (1994) TIBTECH 12, 234-239.
Ejemplo 18 Microburbujas rellenas con gas encapsuladas con fosfatidilserina, anti-CEA-Mal-PEG_{3400}-DSPE tiolado y el profármaco anticanceroso 3',5'-O-dipamitoil-5-fluoro-2'-desoxiuridina a) Preparación de anticuerpos anti-CEA tiolados
La tiolación de anticuerpos anti-CEA puede realizarse como se describe por Hansen, C.B. et al. en (1995) Biochim. Biophys. Acta 1239, 133-144.
b) Preparación de microburbujas rellenas con gas encapsuladas con fosfatidilserina, anti-CEA-Mal-PEG_{3400}-DSPE tiolado y el profármaco anticanceroso 3',5'-O-dipamitoil-5-fluoro-2'-desoxiuridina
A una mezcla (5 mg) de fosfatidilserina (90-99,9% en moles), Mal-PEG_{3400}-DSPE (10-0,1% en moles, preparado como en el Ejemplo 2) y el profármaco anticanceroso 3',5'-O-dipamitoil-5-fluoro-2'-desoxiuridina (Mori, A. et al. (1995) Cancer Chemother. Pharmacol. 35, 447-456) se le añade propilenglicol al 5%-glicerol en agua (1 ml). La dispersión se calienta a no más de 80ºC durante 5 minutos y después se enfrió a temperatura ambiente. La dispersión (0,8 ml) se transfiere a un vial (1 ml) y el espacio de cabeza se lava abundantemente con perfluorobutano. El vial se agita en una mezcladora con tapa durante 45 segundos, poniéndose la muestra posteriormente en una mesa vibratoria. Después de la centrifugación el infranadante se intercambia con un tampón apropiado, y se realiza el acoplamiento del anticuerpo a la microburbuja, por ejemplo como se describe por Goundalkar, A., Ghose, T. y Mezei, M. en J. Pharm. Pharmacol. (1984) 36 465-466 o por Hansen, C.B. et al. en (1995) Biochim. Biophys. Acta 1239, 133-144. Las microburbujas se ponen sobre una mesa vibratoria durante varias horas y después se lavan.
Ejemplo 19 Microburbujas rellenas con gas encapsuladas con fosfatidilserina anti-CEA-Mal-PEG_{3400}-DSPE tiolado y el profármaco anticanceroso N-trifluoroacetil-adriamicina-14-valerato a) Preparación de anticuerpos anti-CEA tiolados
La tiolación de anticuerpos anti-CEA puede realizarse como se describe por Hansen, C.B. et al. en (1995) Biochim. Biophys. Acta 1239, 133-144.
b) Preparación de microburbujas rellenas con gas encapsuladas con fosfatidilserina anti-CEA-Mal-PEG_{3400}-DSPE tiolado y el profármaco anticanceroso N-trifluoroacetil-adriamicina-14-valerato
A una mezcla (5 mg) de fosfatidilserina (90-99,9% en moles), Mal-PEG_{3400}-DSPE (10-0,1% en moles, preparado como en el Ejemplo 2) y el profármaco anticanceroso N-trifluoroacetil-adriamicina-14-valerato (Mori, A. et al. (1993) Pharm. Res. 10, 507-514), se le añade propilenglicol al 5%-glicerol en agua (1 ml). La dispersión se calienta a no más de 80ºC durante 5 minutos y después se enfrió a temperatura ambiente. La dispersión (0,8 ml) se transfiere a un vial (1 ml) y el espacio de cabeza se lava abundantemente con perfluorobutano. El vial se agita en una mezcladora con tapa durante 45 segundos, poniéndose la muestra posteriormente en una mesa vibratoria. Después de la centrifugación el infranadante se intercambia con un tampón apropiado, y se realiza el acoplamiento del anticuerpo a la microburbuja, por ejemplo como se describe por Goundalkar, A., Ghose, T. y Mezei, M. en J. Pharm. Pharmacol. (1984) 36 465-66 o por Hansen, C.B. et al. en (1995) Biochim. Biophys. Acta 1239, 133-144. Las microburbujas se ponen sobre una mesa vibratoria durante varias horas y después se lavan.
Ejemplo 20 Método de uso
Un agente que comprende microburbujas encapsuladas con fosfatidilserina que tiene trombina humana inactivada-Succ-PEG_{3400}-DSPE incorporada en la membrana de encapsulación se liofiliza en tampón fosfato 0,01 M, pH 7,4. El producto se redispersa en agua estéril y se inyecta por vía intravenosa en un paciente del que se sospecha que tiene trombosis venosa en una vena de la pierna. La pierna se examina por técnicas de ultrasonido convencionales. El trombo se localiza por un aumento del contraste comparado con el tejido circundante.
Ejemplo 21 Preparación y evaluación biológica de microburbujas que contienen gas de DSPS "dopado" con un lipopéptido que comprende un péptido de unión a sulfato de heparina (KRKR) y un péptido de fibronectina (WOPPRARI)
Este ejemplo se refiere a la preparación de microburbujas dirigidas que comprenden múltiples vectores peptídicos dispuestos en una secuencia lineal.
a) Síntesis de un lipopéptido constituido por un péptido de unión a sulfato de heparina (KRKR) y un péptido de fibronectina (WOP-PRARI)
39
El lipopéptido se sintetizó en un sintetizador de péptidos automático ABI 433A partiendo de resina Fmoc-lle-Wang a una escala de 0,1 mmol usando cartuchos de 1 mmol de aminoácido. Todos los aminoácidos y el ácido palmítico se preactivaron usando HBTU antes del acoplamiento. La retirada simultánea del péptido de la resina y los grupos protectores de la cadena lateral se realizó en TFA que contenía 5% de fenol, 5% de EDT, 5% de anisol y 5% de H_{2}O durante 2 horas, dando un rendimiento de producto bruto de 150 mg. La purificación por HPLC preparativa de una alícuota de 40 mg de material bruto se realizó usando un gradiente del 70 al 100% de B durante 40 minutos (A = TFA al 0,1%/agua y B = MeOH) a un caudal de 9 ml/min. Después de la liofilización, se obtuvieron 16 mg de material puro (HPLC analítica, gradiente 70-100% de B donde B = MeOH, A = TFA al 0,01%/agua: detección - UV 260 y fluorescencia, Ex_{280}, Em_{350} - tiempo de retención del producto = 19,44 minutos). La caracterización adicional del producto se realizó usando espectrometría de masas MALDI, esperado M+H a 2198, encontrado a 2199.
b) Preparación de microburbujas rellenas con gas de DSPS "dopado" con un lipopéptido multi-específico constituido por un péptido de unión a sulfato de heparina (KRKR) y un péptido de fibronectina (WOPPRARI)
DSPS (4,5 mg) y el lipopéptido de (a) (0,5 mg) se pesaron en cada uno de dos viales y se añadieron 0,8 ml de una solución de propilenglicol al 1,4%/glicerol al 2,4% a cada vial. Las mezclas se calentaron a 80ºC durante 5 minutos (los viales se agitaron durante el calentamiento). Las muestras se enfriaron a temperatura ambiente y los espacios de cabeza se lavaron abundantemente con gas perfluorobutano. Los viales se agitaron en una mezcladora con tapa durante 45 segundos y se hicieron rotar durante una noche. Las microburbujas resultantes se lavaron varias veces con agua desionizada y se analizaron mediante un contador Coulter [tamaño: 1-3 micrómetros (87%), 3-5 micrómetros (11,5%)] y atenuación acústica (frecuencia a la atenuación máxima: 3,5 MHz). Las microburbujas eran estables a 120 mm de Hg. Se usó análisis de espectro de masas MALDI para confirmar la incorporación del lipopéptido a las microburbujas DSPS de la siguiente manera: aproximadamente 0,05-0,1 ml de suspensión de microburbujas se transfirió a un vial limpio y se añadieron 0,05-0,1 ml de metanol. La suspensión se sonicó durante 30 segundos y la solución se analizó por MALDI MS. El modo positivo dio M+H a 2200 (esperado para el lipopéptido, 2198).
c) Estudio in vitro de microburbujas rellenas con gas de DSPS "dopado" con un lipopéptido multi-específico constituido por un péptido de unión a sulfato de heparina (KRKR) y un péptido de fibronectina (WOPPRARI): unión a las células endoteliales en condiciones de flujo
La línea celular endotelial humana ECV 304, derivada de un cordón umbilical normal (ATCC CRL-1998) se cultivó en matraces de cultivo Nunc de 260 ml (chutney 153732) en medio RPMI 1640 al que se añadieron L-glutamina (200 mM), penicilina/estreptomicina (10.000 U/ml y 10.000 \mug/ml) y suero bovino fetal al 10%. Las células se subcultivaron con una proporción de división de 1:5 a 1:7 cuando alcanzaron la confluencia. Los cubreobjetos, de 22 mm de diámetro, se esterilizaron y se pusieron en el fondo de placas de cultivo de 12 pocillos, posteriormente las células en 0,5 ml de medio completo con suero se añadieron por encima de las placas. Cuando las células alcanzaron la confluencia los cubreobjetos se pusieron en una cámara de flujo a medida constituida por un surco tallado en una placa de vidrio sobre el que se pone el cubreobjetos con células, con las células mirando hacia el surco, de manera que se forma un canal de flujo. Las microburbujas preparadas como en (b) se hicieron pasar desde un depósito mantenido a 37ºC a través de la cámara de flujo y de vuelta al depósito usando una bomba peristáltica. El caudal se ajustó para similar las velocidades de cizalla fisiológicamente pertinentes. La cámara de flujo se puso bajo un microscopio y se vio directamente la interacción entre las microburbujas y las células. Una cámara montada sobre el microscopio se conectó a una vídeo-impresora y un monitor a color. Tuvo lugar una acumulación gradual de microburbujas sobre las células a una velocidad dependiente del caudal. Aumentando más el caudal, las células empezaron a desprenderse del cubreobjetos, aunque las microburbujas permanecían unidas a las células. Las burbujas de control que no llevaban el vector no se adhirieron a las células endoteliales y desaparecieron de la cámara en condiciones de flujo mínimo.
d) Experimento in vivo en perros
Caso 1)
Un perro mestizo de 22 kg se anestesió con pentobarbital y se ventiló mecánicamente. El pecho se abrió mediante una esternotomía media, se retiró el pericardio anterior, y se insertó un espaciador de caucho de silicona gelificada de 30 mm entre el corazón y un transductor P5-3 de un escáner de ultrasonidos ATL HDI-3000. El escáner se ajustó para la formación de imágenes de eje corto intermitente una vez en cada sístole terminal provocando EGC retardado. Un volumen neto de 2 ml de microburbujas de (b) se inyectó en forma de un bolo intravenoso rápido; 3 segundos después, se vio que el ventrículo derecho en imágenes contenía material de contraste, y otros 3 segundos después también se llenó el ventrículo izquierdo y se observó una sombra de atenuación transitoria que oscurecía la vista de las partes posteriores del ventrículo izquierdo. Se vieron aumentos sustanciales en el brillo en el miocardio y, cuando la sombra de atenuación disminuyó, en las partes del corazón distales al ventrículo izquierdo. Después de paso del bolo inicial, el escáner de ultrasonidos se ajustó para formación de imágenes de alta potencia de salida, alta velocidad de tramo, continua, un procedimiento que se sabe que causa la destrucción de las microburbujas del agente de contraste por ultrasonidos en las regiones de tejido con imágenes. Después de unos poco segundos, el escáner se ajustó de nuevo a su ajuste inicial. El miocardio después estuvo más oscuro, y cercano al valor inicial. El movimiento del corte con imágenes a una nueva posición provocó una re-aparición de efectos de contraste; el movimiento del corte de nuevo a la posición inicial volvió a provocar un brillo del tejido cercano a la medida inicial.
Caso 2) [comparativo]
Un volumen neto de 2 ml de microburbujas preparadas de un modo idéntico a (b) anterior con la excepción de que no se incluyó lipopéptido en la preparación que se inyectó, usando el mismo procedimiento de formación de imágenes que el anterior. La ecopotenciación del miocardio fue mucho menos intensa y de duración más corta que la observada en el Caso 1. Al completarse la fase de atenuación del ventrículo izquierdo, también hubo una pérdida casi completa de los efectos de contraste del miocardio, y no se observaron los aumentos en la resonancia del miocardio en la parte posterior del ventrículo izquierdo observados en el Caso 1.
Ejemplo 22 Preparación de microburbujas rellenas con gas encapsuladas con DSPS que comprenden anti-CD34-MAL-PEG_{2000}-PE tiolado a) Preparación de microburbujas rellenas con gas encapsuladas con DSPS y PE-PEG_{2000}-Mal
DSPS (4,5 mg, 3,9 mmol) y PE-PEG_{2000}-Mal del Ejemplo 50 (0,5 mg) se pesaron en un vial limpio y se añadió 1 ml de una solución de propilenglicol al 1,4%/glicerol al 2,4%. La mezcla se calentó a 80ºC durante 5 minutos después se filtró a través de un filtro de 4,5 micrómetros. La muestra se enfrió a temperatura ambiente y el espacio de cabeza se lavó abundantemente con gas perfluorobutano. Los viales se agitaron en una mezcladora con tapa durante 45 segundos y las microburbujas resultantes se lavaron tres veces con agua destilada.
b) Tiolación de anticuerpos anti-CD34
A 0,3 mg de anticuerpo anti-CD34 disuelto en 0,5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7, se le añadieron 0,3 mg de reactivo de Traut y la solución se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. El exceso de reactivo se separó de la proteína modificada en una columna NAP-5.
c) Conjugación del anticuerpo anti-CD34 tiolado a microburbujas rellenas con gas encapsuladas con DSPS y que comprenden DSPE-PEG_{2000}-MAL
Se añadieron 0,5 ml de la preparación de anticuerpo tiolado de (b) a una alícuota de microburbujas de (a) y se dejó que la reacción de conjugación transcurriera durante 30 minutos sobre una mesa vibratoria. Después de la centrifugación a 2000 rpm durante 5 minutos el infranadante se retiró. Las microburbujas se lavaron tres veces más con agua.
d) Detección del anticuerpo encapsulado en las microburbujas usando un anticuerpo secundario conjugado con FITC
A la suspensión de microburbujas de (c) se le añadieron 0,025 ml de anticuerpo cabra anti-ratón conjugado con FITC. La mezcla se incubó en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos sobre una mesa vibratoria y después se centrifugó a 2000 rpm durante 5 minutos. El infranadante se retiró después y las microburbujas se lavaron tres veces más con agua. El análisis por citometría de flujo de la suspensión de microburbujas mostró que el 98% de la población era fluorescente.
Ejemplo 23 Preparación de microburbujas rellenas con gas encapsuladas con DSPS que comprenden anti-CD62-MAL-PEG_{2000}-PE tiolado
Se usó un procedimiento idéntico al descrito en el Ejemplo 22 para preparar microburbujas que comprenden anticuerpos anti-CD62.
Ejemplo 24 Preparación de microburbujas rellenas con gas encapsuladas con DSPS que comprenden anti-ICAM-1-MAL-PEG_{2000}-PE tiolado
Se usó un procedimiento idéntico al descrito en el Ejemplo 22 para preparar microburbujas que comprenden anticuerpos anti-ICAM-1.
Ejemplo 25 Preparación de microburbujas rellenas con gas encapsuladas con DSPS y anti-CD62-Mal-PEG_{2000}-PE tiolado y anti-ICAM-1-Mal-PEG_{2000}-PE tiolado
Este ejemplo se refiere a la preparación de microburbujas que comprenden múltiple vectores anticuerpo para formación de imágenes por ultrasonidos dirigidas.
a) Preparación de microburbujas rellenas con gas encapsuladas con DSPS y PE-PEG_{2000}-Mal
DSPS (4,5 mg) y PE-PEG_{2000}-Mal del Ejemplo 2 (a) (0,5 mg) se pesaron en un vial limpio y se añadió 1 ml de una solución de propilenglicol al 1,4%/glicerol al 2,4%. La mezcla se calentó a 80ºC durante 5 minutos y después se filtró a través de un filtro de 4,5 micrómetros. La muestra se enfrió a temperatura ambiente y el espacio de cabeza se lavó abundantemente con gas perfluorobutano. Los viales se agitaron en una mezcladora con tapa durante 45 segundos y las microburbujas se lavaron tres veces con agua destilada.
b) Tiolación de anticuerpos anti-CD62 y anti-ICAM-1
A 0,3 mg de cada uno de los anticuerpos anti-CD62 y anti-ICAM-1 disueltos en tampón PBS (pH 7, 0,5 ml) se añadió reactivo de Traut y las soluciones se agitaron a temperatura ambiente durante 1 hora. El exceso de reactivo se separó de la proteína modificada en una columna NAP-5.
c) Conjugación de anticuerpos anti-CD62 y anti-ICAM-1 tiolados a microburbujas rellenas con gas encapsuladas con DSPS y DSPE-PEG_{2000}-Mal
Se añadieron 0,5 ml de la preparación de anticuerpo tiolado mixto de (b) a una alícuota de microburbujas de (a) y se dejó que la reacción de conjugación transcurriera durante 30 minutos sobre una mesa vibratoria. Después de la centrifugación a 2000 rpm durante 5 minutos, el infranadante se retiró. Las microburbujas se lavaron tres veces más con agua. La longitud del espaciador PEG puede variarse para que incluya cadenas más largas (por ejemplo, PEG_{3400} y PEG_{5000}), o más cortas (por ejemplo, PEG_{600} o PEG_{800}). La adición de un tercer anticuerpo tal como anti-CD34 tiolado también es posible.
Ejemplo 26 Microburbujas rellenas con gas dirigidas que comprenden DSPS recubierto no covalentemente con polilisina y un péptido de fusión que comprende un componente de unión a PS y una secuencia peptídica de fibronectina FNFRLKAGOKIRFGGGGWOPPRAI a) Síntesis de fragmento unión a PS/fibronectina del péptido de fusión FNFRLKAGOKIRFGGGGWOPPRAI
El péptido se sintetizó en un sintetizador de péptidos automático ABI433A partiendo de resina Fmoc-lle-Wang a una escala de 0,1 mmol usando cartuchos de 1 mmol de aminoácido. Todos los aminoácidos se preactivaron usando HBTU antes del acoplamiento. La retirada simultánea del péptido de la resina y los grupos protectores de la cadena lateral se realizó en TFA que contenía 5% de fenol, 5% de EDT y 5% de H_{2}O durante 2 horas, dando un rendimiento de producto bruto de 302 mg. La purificación por HPLC preparativa de a 25 mg alícuota de material bruto se realizó usando un gradiente del 20 al 40% de B durante 40 minutos (A = TFA al 0,1%/agua y B = TFA al 0,1%/acetonitrilo) a un caudal de 9 ml/min. Después de la liofilización se obtuvieron 10 mg de material puro (HPLC analítica, gradiente del 20 al 50% de B donde B = TFA al 0,1%/acetonitrilo, A = 0,01% TFA/agua: detección - UV 214 y 260 nm - tiempo de retención del producto = 12,4 minutos). La caracterización adicional del producto se realizó usando espectrometría de masas MALDI: esperado M+H a 2856, encontrado a 2866.
b) Preparación de microburbujas rellenas con gas que comprenden DSPS recubierto no covalentemente con polilisina y la unión al fragmento PS/fibronectina del péptido de fusión FNFRLKAGOKIRFGGGGWOPPRAI
DSPS (5 mg) se pesó en un vial limpio junto con poli-L-lisina (0,2 mg) y péptido de (a) anterior (0,2 mg). Al vial se añadieron 1,0 ml de una solución de propilenglicol al 1,4%/glicerol al 2,4%. La mezcla se calentó a 80ºC durante 5 minutos. La muestra se enfrió a temperatura ambiente y el espacio de cabeza se lavó abundantemente con gas perfluorobutano. Los viales se agitaron en una mezcladora con tapa durante 45 segundos y las microburbujas resultantes se centrifugaron a 1000 rpm durante 3 minutos. Después de un lavado exhaustivo con agua, PBS y agua, la solución final se examinó para el contenido de polilisina y péptido usando MALDI MS. No se observó material polipeptídico en la solución de lavado final. Después se añadió acetonitrilo (0,5 ml) y las microburbujas se destruyeron por sonicación. El análisis de la solución resultante para polilisina y péptido de fusión de unión a PS/fibronectina se realizó después usando MALDI MS. Los resultados fueron los siguientes:
MALDI esperado MALDI encontrado
Poli-L-lisina 786, 914, 790, 919,
1042, 1170 1048, 1177
péptido de unión a DSPS 2856 2866
El elemento espaciador contenido en el péptido de fusión de unión a PS/fibronectina (-GGG-) puede reemplazarse también con otros espaciadores tales como PEG2000 o polialanina (-AAA-). Puede emplearse también una forma de pre-dirigir, donde el fragmento del péptido de fusión de unión a DSPS/fibronectina se permite en primer lugar que se asocie con las células mediante un péptido de unión a fibronectina, seguido de administración de microburbujas de PS que se unen después al péptido de unión a PS.
Ejemplo 27 Microburbujas rellenas con gas encapsuladas con fosfatidilserina y biotina-PEG_{3400}-alanil-colesterol y funcionalizado con el péptido estreptavidina/biotinil-endotelina-1 (biotina-D-Trp-Leu-Asp-lle-lle-Trp.OH) y el péptido biotinil-fibrin-anti-polimerante (biotina-GPRPPERHOS,NH_{2})
Este ejemplo se refiere a la preparación de microburbujas de ultrasonidos dirigidas donde la estreptavidina se usa como un enlazador entre el informador o informadores biotinilados y el vector o vectores.
a) Síntesis de biotina-PEG_{3400}-b-Alanina colesterol
A una solución de clorhidrato de colesteril-b-alanina (como se describe en el Ejemplo 59) (15 mg, 0,03 mmol) en 3 ml de cloroformo/metanol húmedo (2,6:1) se le añadió trietilamina (42 ml, 0,30 mmol). La mezcla se agitó durante 10 minutos a temperatura ambiente y una solución de biotina-PEG_{3400}-NHS (100 mg, 0,03 mmol) en 1,4-dioxano (1 ml) se añadió gota a gota. Después de agitar a temperatura ambiente durante 3 horas, la mezcla se evaporó a sequedad y el residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida para dar cristales blancos, rendimiento 102 mg (89%). La estructura se verificó por MALDI-MS y RMN.
b) Síntesis de endotelina-1 péptido biotinilado (Biotina-D-Trp-Leu-Asp-lle-lle-Trp.OH)
El péptido se sintetizó en un sintetizador de péptidos automático ABI 433A partiendo de resina Fmoc-Trp(Boc)-Wang a una escala de 0,1 mmol usando cartuchos de 1 mmol de aminoácido. Todos los aminoácidos se preactivaron usando HBTU antes del acoplamiento. La retirada simultánea del péptido de la resina y los grupos protectores de la cadena lateral se realizó en TFA que contenía 5% de anisol y 5% de H_{2}O durante 2 horas dando un rendimiento de producto bruto de 75 mg. La purificación por HPLC preparativa de una alícuota de 20 mg de material bruto se realizó usando un gradiente del 30 al 80% de B durante 40 minutos (A = TFA al 0,1%/agua y B = TFA al 0,1%/acetonitrilo) y un caudal de 9 ml/min. Después de la liofilización de las fracciones puras se obtuvieron 2 mg de material puro (HPLC analítica, gradiente 30-80% de B donde B = TFA al 0,1%/acetonitrilo, A = 0,01% TFA/agua detección - UV 214 nm - tiempo de retención del producto = 12,6 minutos). La caracterización adicional del producto se realizó usando espectrometría de masas MALDI: esperado M+H a 1077, encontrado a 1077.
c) Síntesis de péptido biotinil-fibrina-anti-polimerante (Biotina-GPRPPERHOS.NH_{2})
Este péptido se sintetizó y se purificó usando protocolos similares a los descritos en (b) anterior. El producto puro se caracterizó por HPLC y MALDI MS.
d) Preparación de microburbujas multi-específicas rellenas con gas encapsuladas con fosfatidilserina y biotina-PEG_{3400}-b-Alanina colesterol
DSPS (4,5 mg) y biotina-PEG_{3400}-b-alanina colesterol de (a) (0,5 mg) se pesaron en un vial y se añadieron 0,8 ml de una solución de propilenglicol al 1,4%/glicerol al 2,4%. La mezcla se calentó a 80ºC durante 5 minutos (los viales se agitaron durante el calentamiento). La muestra se enfrió a temperatura ambiente y el espacio de cabeza se lavó abundantemente con gas perfluorobutano. El vial se agitó en una mezcladora con tapa durante 45 segundos y el vial se rotó durante una noche. La suspensión de microburbujas se lavó varias veces con agua desionizada y se analizó mediante un contador Coulter y atenuación acústica.
e) Conjugación con estreptavidina marcada con fluoresceína y péptidos biotinilados de (b) y (c)
A la preparación de microburbujas de (d) se añadió estreptavidina conjugada con fluoresceína (0,2 mg) disuelto en PBS (1 ml). Las burbujas se pusieron sobre una mesa vibratoria durante 3 horas a temperatura ambiente. Después de un lavado exhaustivo con agua y análisis por microscopía de fluorescencia, las microburbujas se incubaron en 1 ml de PBS que contenía el péptido biotinil-endotelina-1 (0,5 mg) y el péptido biotinil-fibrina-anti-polimerante (0,5 mg) de (b) y (c) respectivamente durante 2 horas. Se realizó el lavado exhaustivo de las microburbujas para retirar el péptido no conjugado.
Ejemplo 28 Microburbujas rellenas con gas encapsuladas con fosfatidilserina y biotina-DPPE usadas para preparar un "sándwich" de estreptavidina con una mezcla de péptido biotinil-endotelina-1 (biotina-D-Trp-Leu-Asp-lle-lle-Trp.OH) y péptido biotinil-fibrin-anti-polimerante (biotina-GPRPPERHOS.NH_{2}) a) Preparación de microburbujas que contienen biotina
A una mezcla de fosfatidilserina (5 mg) y biotina-DPPE (0,6 mg) en un vial limpio se añadió propilenglicol al 5%-glicerol en agua (1 ml). La dispersión se calentó a 80ºC durante 5 minutos y después se enfrió a temperatura ambiente. El espacio de cabeza después se lavó abundantemente con perfluorobutano y el vial se agitó en una mezcladora con tapa durante 45 segundos. Después de la centrifugación el infranadante se retiró y las microburbujas se lavaron exhaustivamente con agua.
b) Conjugación de microburbujas rellenas con gas encapsuladas con fosfatidilserina y biotina-DPPE con estreptavidina y una mezcla de biotinil-endotelina-1 (biotina-D-Trp-Leu-Asp-lle-lle-Trp-OH) y péptido biotinil-fibrina-anti-polimerante (biotina-GPRPPERHOS.NH_{2})
Se siguió el procedimiento detallado en el Ejemplo 27.
Ejemplo 29 Microburbujas que contienen gas PFB de DSPS funcionalizado con péptido de unión a sulfato de Heparina/péptido de Fibronectina/Péptido RGD y fluoresceína a) Síntesis de un lipopéptido que contiene la secuencia RGD y un grupo informador de fluoresceína: Dipalmitoil-Lys-Lys-Lys-Lys[acetil-Ara-Gly-Asp-Lys(fluoresceína)Gly.OH
40
El lipopéptido se sintetizó como se describe en el Ejemplo 21(a) usando aminoácidos y polímeros disponibles en el mercado. El lipopéptido se escindió de la resina en TFA que contiene agua al 5%, fenol al 5% y EDT al 5% durante 2 horas. Después de la evaporación al vacío el producto bruto se precipitó y trituró con éter dietílico. La purificación por HPLC preparativa de una alícuota de 40 mg de material bruto se realizó usando un gradiente del 60 al 100% de B durante 40 minutos (A = TFA al 0,1%/agua y B = TFA al 0,1%/acetonitrilo) a un caudal de 9 ml/min. Después de la liofilización había 10 mg de material puro (HPLC analítica, gradiente 60-100% de B donde B = TFA al 0,1%/acetonitrilo, A = TFA al 0,01%/agua: detección - UV 260 - tiempo de retención del producto = 20-22 minutos). La caracterización adicional del producto se realizó usando espectrometría de masas MALDI: esperado M+H a 1922, encontrado a 1920.
b) Síntesis de un lipopéptido que contiene una secuencia de unión a sulfato de heparina y un péptido de fibronectina
La síntesis y purificación se realizaron como se describe en el Ejemplo 21 (a).
c-1 Preparación de microburbujas multi-específicas rellenas con gas de DSPS funcionalizado con un péptido de unión a sulfato de heparina, un péptido de fibronectina, acetil-péptido RGD y fluoresceína
DSPS (4 mg, 3,9 mmol), lipopéptido de (a) (0,5 mg, 0,2 mmol) y lipopéptido de (b) (0,5 mg) se pesaron en cada uno de dos viales y se añadieron 0,8 ml de una solución de propilenglicol al 1,4%/glicerol al 2,4% a cada vial. Las mezclas se calentaron a 80ºC durante 5 minutos (los viales se agitaron durante el calentamiento). Las muestras se enfriaron a temperatura ambiente y los espacios de cabeza se lavaron abundantemente con gas perfluorobutano. Los viales se agitaron en una mezcladora con tapa durante 45 segundos y después se hicieron rotar durante una noche. Las microburbujas obtenidas de este modo se lavaron varias veces con agua desionizada y se analizaron por espectrometría de masas MALDI como se describe en el Ejemplo 21 (b). Las microburbujas se investigaron por microscopía y se vio que tenían un intervalo de tamaños entre 1 y 5 micrómetros. Además, las microburbujas eran fluores-
centes.
Ejemplo 30 Microburbujas rellenas con gas que comprenden DSPS modificado covalentemente con anticuerpo anti-receptor de transferrina CD71 marcado con FITC y "dopado" con un lipopéptido con afinidad por células endoteliales
Este ejemplo se refiere a la preparación de agentes de ultrasonidos dirigidos por múltiples vectores.
a) Síntesis de un lipopéptido de unión a células endoteliales: 2-n-hexadecilestearil-Lys-Leu-Ala-Leu-Lys-Leu-Ala-Leu-Lys-Ala-Leu-Lys-Ala-Ala-Leu-Lys-Leu-Ala-NH_{2}
El lipopéptido mostrado a continuación se sintetizó en un sintetizador de péptidos automático ABI 433A partiendo de una resina amida de Rink a una escala de 0,1 mmol usando cartuchos de 1 mmol de aminoácido.
41
Todos los aminoácidos y el ácido 2-n-hexadecilesteárico se preactivaron usando HBTU antes del acoplamiento. La retirada simultánea del péptido de la resina y los grupos protectores de la cadena lateral se realizó en TFA que contiene EDT al 5% y H_{2}O al 5% durante 2 horas, dando un rendimiento de producto bruto de 150 mg. La purificación por HPLC preparativa de una alícuota de 40 mg de material bruto se realizó usando un gradiente del 90 al 100% de B durante 50 minutos (A = TFA al 0,1%/agua y B = MeOH) a un caudal de 9 ml/min. Después de la liofilización, se obtuvieron 10 mg de material puro (HPLC analítica, gradiente 90-100% de B donde B = MeOH, A = TFA al 0,01%/agua: detección - UV 214 nm - tiempo de retención del producto = 23 minutos). La caracterización adicional del producto se realizó usando espectrometría de masas MALDI: esperado M+H a 2369, encontrado a 2373.
b) Preparación de microburbujas rellenas con gas que comprenden DSPS "dopado" con un lipopéptido de unión a células endoteliales y PE-PEG_{2000}-Mal
DSPS (4,5 mg) y lipopéptido de (a) (0,5 mg) junto con PE-PEG_{2000}-Mal del Ejemplo 50 (0,5 mg) se pesaron en un vial limpio y se añadió 1 ml de una solución de propilenglicol al 1,4%/glicerol al 2,4%. La mezcla se calentó a 80ºC durante 5 minutos y después se filtró a través de un filtro de 4,5 micrómetros. La muestra se enfrió a temperatura ambiente y el espacio de cabeza se lavó abundantemente con gas perfluorobutano. El vial se agitó en una mezcladora con tapa durante 45 segundos y las microburbujas resultantes se lavaron tres veces con agua destilada.
c) Tiolación de anticuerpo anti-receptor de transferrina marcado con FITC
Se hizo reaccionar Ab anti-receptor de transferrina CD71 marcado con FITC (100 mg/ml en PBS, 0,7 ml) con reactivo de Traut (0,9 mg) a temperatura ambiente durante 1 hora. El exceso de reactivo se separó de la proteína modificada en una columna NAP-5.
d) Conjugación de anticuerpo anti-receptor de transferrina marcado con FITC tiolado con microburbujas rellenas con gas que comprenden DSPS "dopado" con un lipopéptido de unión a células endoteliales y DSPE-PEG_{2000}-Mal
Se añadió una alícuota de 0,5 ml de la fracción proteica (2 ml en total) de (c) anterior a las microburbujas de (b) y se dejó que la reacción de conjugación transcurriera durante 10 minutos sobre una mesa vibratoria. Después de la centrifugación a 1000 rpm durante 3 minutos la solución de proteína se retiró y se repitió la conjugación dos veces más con alícuotas de 1 ml y 0,5 ml de solución de proteína respectivamente. Las burbujas después se lavaron cuatro veces en agua destilada y se analizó una muestra para la presencia de anticuerpo por citometría de flujo y microscopía. Se observó una población fluorescente de >92%.
La Figura 1 de los dibujos adjuntos representa la comparación por citometría de flujo de las microburbujas de control negativo de DSPS (curva de la izquierda) con burbujas conjugadas con anticuerpo anti-transferrina CD71 marcado con FITC (curva rellena, derecha), que muestra que el 92% de la población tiene fluorescencia.
La incorporación de lipopéptido en las microburbujas se confirmó por espectrometría de masas MALDI como se describe en el Ejemplo 21 (b).
Ejemplo 31 Microburbujas rellenas con gas que comprenden DSPS, un lipopéptido para dirigirse a células endoteliales y una molécula que contiene captoprilo
Este ejemplo se refiere a la preparación de agentes de ultrasonidos para aplicaciones de dirección y terapéuticas combinadas.
a) Síntesis de un lipopéptido funcionalizado con captoprilo
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La estructura mostrada anteriormente se sintetizó usando un aparato para burbujear nitrógeno manual partiendo de una resina Rink Amida MBHA protegida con Fmoc a una escala de 0,125 mmol. El acoplamiento se realizó usando protocolos TBTU/HOBt/DIEA convencionales. Se acopló ácido bromoacético a través de la cadena lateral de Lys en forma de un anhídrido usando preactivación DIC. Se introdujo captoprilo disuelto en DMF en la fase sólida usando DBU como base. La retirada simultánea del péptido de la resina y la desprotección de los grupos protectores de la cadena lateral se realizó en TFA que contiene EDT al 5%, agua al 5% y sulfuro de etil metilo al 5% durante 2 horas. Se purificó una alícuota de 10 mg del material bruto por cromatografía líquida preparativa usando un gradiente del 70 al 100% de B durante 60 minutos (A = TFA al 0,1%/agua y B = TFA al 0,1%/acetonitrilo) a un caudal de 10 ml/min. Después de la liofilización se obtuvo un rendimiento de 2 mg de material puro (HPLC analítica, gradiente 70-100% B durante 20 minutos, A = TFA al 0,1%/agua y B = TFA al 0,1%/acetonitrilo, caudal 1 ml/min, detección UV 214 nm, tiempo de retención 26 minutos). Se realizó una caracterización adicional usando espectrometría de masas MALDI, dando M+H a 1265 como se esperaba.
b) Síntesis de un lipopéptido con afinidad por células endoteliales: Dipalmitoil-Lys-Lys-Lys-Aca-lle-Arg-Arg-Val-Ala-Arg-Pro-Pro-Leu-NH_{2}
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El lipopéptido se sintetizó en un sintetizador de péptidos automático ABI 433A partiendo de resina amida de Rink a una escala de 0,1 mmol usando cartuchos de 1 mmol de aminoácido. Todos los aminoácidos y el ácido palmítico se preactivaron usando HBTU antes del acoplamiento. La retirada simultánea del péptido de la resina y los grupos protectores de la cadena lateral se realizó en TFA que contiene fenol al 5%, EDT al 5% y H_{2}O al 5% durante 2 horas, dando un rendimiento de producto bruto de 160 mg. La purificación por HPLC preparativa de una alícuota de 35 mg de material bruto se realizó usando un gradiente del 70 al 100% de B durante 40 minutos (A = TFA al 0,1%/agua y B = MeOH) a un caudal de 9 ml/min. Después de la liofilización, se obtuvieron 20 mg de material puro (HPLC analítica, gradiente 70-100% de B donde B = MeOH, A = TFA al 0,01%/agua: detección - UV 214 y 260 nm - tiempo de retención del producto = 16 minutos). La caracterización adicional del producto se realizó usando espectrometría de masas MALDI: esperado M+H a 2050, encontrado a 2055.
c) Preparación de microburbujas rellenas con gas que comprenden DSPS, un lipopéptido para dirigirlas a células endoteliales y una molécula que contiene captoprilo para el suministro de fármaco
DSPS (4,5 mg), el producto de (a) (0,5 mg) y el producto de (b) (0,5 mg) se pesaron en un vial y se añadió 1,0 ml de una solución de propilenglicol al 1,4%/glicerol al 2,4%. La mezcla se calentó a 80ºC durante 5 minutos (vial agitado durante el calentamiento). La muestra se enfrió a temperatura ambiente y el espacio de cabeza se lavó abundantemente con gas perfluorobutano. El vial primero se agitó en una mezcladora con tapa durante 45 segundos después se hizo rotar durante 1 hora, posteriormente los contenidos se lavaron exhaustivamente con agua desionizada. No se encontró un nivel detectable de material de partida en la solución de lavado final como fue evidente por MALDI MS. Se usó análisis de espectro de masas MALDI para confirmar la incorporación de los productos de (a) y (b) en las microburbujas como se describe en el Ejemplo 21 (b).
d) Estudio in vitro de microburbujas rellenas con gas que comprenden DSPS, un lipopéptido para dirigirlas a células endoteliales y una molécula que contiene captoprilo para aplicaciones terapéuticas
El ensayo in vitro descrito en el Ejemplo 21 (c) se usó para examinar la unión celular en condiciones de flujo. Tuvo lugar una acumulación gradual de microburbujas en las células, dependiendo del caudal. Al aumentar adicionalmente el caudal las células comenzaron a llegar a estar despegadas del cubreobjetos, pero las microburbujas permanecieron unidas a las células. Las microburbujas que no llevan el vector no se adhirieron a las células endoteliales y desaparecieron de la cámara en condiciones de flujo mínimo.
Ejemplo 32 Preparación de microburbujas rellenas con gas que comprenden DSPS cargado con un lipopéptido que comprenden un péptido helicoide con afinidad por membranas celulares y el antibiótico peptídico sulfato de polimixina B
Este ejemplo se refiere a la preparación de microburbujas dirigidas que comprenden vectores peptídicos múltiples que tienen una aplicación de dirección y terapéutica combinada.
a) Síntesis de un lipopéptido que comprende un péptido helicoide con afinidad por membranas celulares: hexadecilestearil-Lys-Leu-Ala-Leu-Lys-Leu-Ala-Leu-Lys-Ala-Leu-Lys-Ala-Ala-Leu-Lys-Leu-Ala-NH_{2}
Esto se preparó como se describe en el Ejemplo 30(a).
b) Preparación de microburbujas multi-específicas rellenas con gas
DSPS (5,0 mg), lipopéptido de (a) (0,3 mg) y sulfato de polimixina B (0,5 mg) se pesaron en un vial limpio y se añadió 1,0 ml de una solución de propilenglicol al 1,4%/glicerol al 2,4%. La mezcla se sonicó durante 3-5 minutos, se calentó a 80ºC durante 5 minutos y después se filtró a través de un filtro de 4,5 micrómetros. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente y el espacio de cabeza se lavó abundantemente con gas perfluorobutano. El vial se agitó en una mezcladora con tapa durante 45 segundos y las microburbujas resultantes se centrifugaron a 1000 rpm durante 3 minutos. Las microburbujas se lavaron con agua hasta que no pudo detectarse sulfato de polimixina B o lipopéptido en el infranadante por MALDI-MS. La microscopía mostró que la distribución de tamaños de la población de burbujas estaba en el intervalo deseado de 1-8 micrómetros. A las burbujas lavadas (aprox. 0,2 ml) se añadió metanol (0,5 ml), y la mezcla se puso en un baño sonicador durante 2 minutos. Se descubrió que la solución transparente resultante, por análisis por MALDI-MS, contiene tanto lipopéptido como sulfato de polimixina B (esperado 1203, encontrado 1207).
Ejemplo 33 Preparación de microburbujas rellenas con gas que comprenden DSPS "dopado" con un lipopéptido que comprende una secuencia de unión al receptor de IL-1 y modificado con una estructura ramificada que contiene el fármaco metotrexato
Este ejemplo se refiere a la preparación de microburbujas dirigidas que comprenden vectores múltiples para aplicaciones dirigidas/terapéuticas.
a) Síntesis de un lipopéptido que comprende un péptido de unión al receptor de interleuquina-1: Dipalmitoil-Lys-Gly-Asp-Trp-Asp-Gln-Phe-Gly-Leu-Trp-Arg-Gly-Ala-Ala,OH
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El lipopéptido se sintetizó en un sintetizador de péptidos automático ABI 433A partiendo de una resina Fmoc-Ala-Wang a una escala de 0,1 mmol usando cartuchos de 1 mmol de aminoácido. Todos los aminoácidos y el ácido palmítico se preactivaron usando HBTU antes del acoplamiento. La retirada simultánea de lipopéptido de la resina y los grupos protectores de la cadena lateral se realizó en TFA que contiene H_{2}O al 5%, anisol al 5%, fenol al 5% y EDT al 5% durante 2 horas, dando un rendimiento de producto bruto de 150 mg. La purificación por HPLC preparativa de una alícuota de 30 mg de material bruto se realizó usando un gradiente del 90 al 100% de B durante 40 minutos (A = TFA al 0,1%/agua y B = MeOH) a un caudal de 9 ml/min. Después de la liofilización, se obtuvieron 4 mg de material puro (HPLC analítica, gradiente 90-100% de B durante 20 minutos donde B = MeOH, A = TFA al 0,01%/agua: detección - UV 214 nm - tiempo de retención del producto = 23 minutos). La caracterización adicional del producto se realizó usando espectrometría de masas MALDI: esperado M+H a 2083, encontrado a 2088.
b) Síntesis de una estructura central de metotrexato ramificada que contiene un resto tiol
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La estructura de metotrexato se sintetizó en un sintetizador de péptidos automático ABI 433A partiendo de una resina Fmoc-Cys(Trt) Tentagel a una escala de 0,1 mmol. La retirada simultánea de producto de la resina y la desprotección de grupos protectores se realizó en TFA que contenía EDT al 5% y H_{2}O al 5% durante 2 horas, dando un rendimiento de producto bruto de 160 mg. La purificación por HPLC preparativa de una alícuota de 30 mg de material bruto se realizó usando un gradiente del 10 al 30% de B durante 40 minutos (A = TFA al 0,1%/agua y B = TFA al 0,1%/acetonitrilo) y un caudal de 9 ml/min. Después de la liofilización de las fracciones puras, se obtuvieron 9 mg de material puro (HPLC analítica, gradiente 5-50% de B donde B = TFA al 0,1%/acetonitrilo, A = TFA al 0,01%/agua: detección - UV 214 nm - tiempo de retención del producto = 9,5 minutos). La caracterización adicional del producto se realizó usando espectrometría de masas MALDI: esperado M+H a 1523, encontrado a 1523.
c) Preparación de microburbujas multi-específicas rellenas con gas
DSPS (4,5 mg), lipopéptido que contiene tiol del Ejemplo 64(a) (0,5 mg) y lipopéptido de (a) (0,2 mg) se pesaron en un vial limpio y se añadió 1,0 ml de una solución de propilenglicol al 1,4%/glicerol al 2,4%. La mezcla se sonicó durante 3-5 minutos, se calentó al 80ºC durante 5 minutos y después se filtró a través de un filtro de 4,5 micrómetros. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente y el espacio de cabeza se lavó abundantemente con gas perfluorobutano. El vial se agitó en una mezcladora con tapa durante 45 segundos y las microburbujas resultantes se centrifugaron a 1000 rpm durante 3 minutos, posteriormente se desechó el infranadante.
d) Conjugación de estructura de metotrexato ramificada con microburbujas tioladas
La estructura de metotrexato de (b) anterior (0,5 mg) se disolvió en PBS, pH 8,0. La solución después se añadió a las microburbujas que contienen tiol de (c) y se dejó que transcurriera la formación del enlace disulfuro durante 16 horas. Después de un lavado exhaustivo con PBS y agua las burbujas se analizaron por microscopía y MALDI MS.
El enlace disulfuro que une la estructura de metotrexato a las microburbujas puede reducirse in vivo para liberar la molécula de fármaco libre, de modo que dichas microburbujas en combinación con un vector específico de tumor comprenden un sistema de suministro de fármaco. Un agente reductor fisiológicamente aceptable tal como glutatión puede usarse para provocar la liberación de fármaco.
Ejemplo 34 Preparación de microburbujas rellenas con gas recubiertas con poli-L-lisina complejada con fragmentos de ADN marcados con fluoresceína del plásmido pBR322
Este ejemplo se refiere a la preparación de microburbujas para aplicaciones de terapia génica/antisentido. Puede conseguirse una dirección específica dopando adicionalmente las membranas de microburbuja con estructuras lipídicas modificadas con vector como se describe en el Ejemplo 21.
a) Preparación de microburbujas rellenas con gas encapsuladas con DPS
DSPS (4,5 mg) se pesó en un vial limpio. Se añadió 1,0 ml de una solución de propilenglicol al 1,4%/glicerol al 2,4% y la mezcla se sonicó durante 2 minutos y después se calentó a 80ºC durante 5 minutos. Inmediatamente después del calentamiento la solución se filtró a través de un filtro de 4 micrómetros. La muestra se enfrió a temperatura ambiente y el espacio de cabeza se lavó abundantemente con gas perfluorobutano. El vial se agitó en una mezcladora con tapa durante 45 segundos. Las microburbujas resultantes después se lavaron una vez con agua desionizada y se desechó el infranadante. Las microburbujas después se resuspendieron en 0,5 ml de agua.
b) Preparación de complejo de poli-L-lisina/ADN y carga de las microburbujas encapsuladas con DSPS
A 1 mg de poli-L-lisina (70-150 kD) en un vial limpio se añadió 0,1 ml de un producto de digestión marcado con fluoresceína del plásmido pBR322 disuelto en Tampón TE (tris-HCl 10 mM, pH 8). La solución se preparó a un total de 0,6 ml mediante la adición de agua y el pH se ajustó a 8. La formación del complejo se dejó que transcurriera durante 1 hora, después de lo cual se añadieron 0,05 ml de la solución de polilisina-ADN a la suspensión de microburbujas de (a) anterior. Después de 1 hora se usó microscopía para demostrar que las burbujas eran fluorescentes, confirmando la presencia de ADN.
Ejemplo 35 Preparación de microburbujas rellenas con gas que contienen un péptido central ramificado que comprende una secuencia de unión a placas ateroscleróticas Dabsiladas y RGDS
Este ejemplo se refiere a la preparación de microburbujas que tienen un grupo tiol en la superficie para la modificación con vectores que contiene tiol para dirigir/suministro de fármaco y la liberación de fármaco.
a) Síntesis de péptido ramificado Dabsil-Tyr-Arg-Ala-Leu-Val-Asp-Thr-leu-Lys-Lys (NH_{2}-Arg-Gly-Asp-Ser)-Gly-Cys, OH
46
El péptido se sintetizó en un sintetizador de péptidos automático ABI 433A partiendo de una resina Fmoc-Cys(Trt)-Tentagel a una escala de 0,1 mmol usando cartuchos de 1 mmol de aminoácido. Todos los aminoácidos se preactivaron usando HBTU antes del acoplamiento. La retirada simultánea del péptido de la resina y los grupos protectores de la cadena lateral se realizó en TFA que contiene fenol al 5%, EDT al 5% y H_{2}O al 5% durante 2 horas, dando un rendimiento de producto bruto de 160 mg. La purificación por HPLC preparativa de una alícuota de 30 mg de material bruto se realizó usando un gradiente del 10 al 60% B durante 40 minutos (donde A = TFA al 0,1%/agua y B = acetonitrilo) a un caudal de 9 ml/min. Después de la liofilización, se obtuvieron 2,5 mg de material puro (HPLC analítica, gradiente 10-50% de B durante 20 minutos donde B = TFA al 0,1%/acetonitrilo y A = TFA al 0,01%/agua: detección - UV 214 y 435 nm - tiempo de retención del producto = 21 minutos). La caracterización adicional del producto se realizó usando espectrometría de masas MALDI: esperado M+H a 2070, encontrado a 2073.
b) Preparación de microburbujas que contienen tiol rellenas con gas
Éstas se prepararon como se describe en el Ejemplo 64(a).
c) Acoplamiento oxidativo de microburbujas tioladas con péptidos multiespecíficos mediante la formación del enlace disulfuro
El infranadante de las microburbujas de (b) anterior se desecharon y remplazaron con una solución de dabsil-péptido de (a) (1 mg) en 0,7 ml de solución de amoniaco diluido (pH 8). A esto se añadieron 0,2 ml de una solución madre que contiene 6 mg de ferricianato de potasio disuelto en 2 ml de agua. El vial se puso sobre una mesa vibratoria y la oxidación del tiol se dejó transcurrir durante 2 horas. Las burbujas después se lavaron exhaustivamente con agua hasta el infranadante estuvo libre del dabsil-péptido como fue evidente por HPLC y MALDI MS. La detección de péptido unido a las microburbujas se realizó por reducción del enlace disulfuro usando el agente reductor soluble en agua tris-(2-carboxietil)-fosfina. Después de la reducción, se descubrió que el infranadante contenía dabsil-péptido libre como fue evidente por HPLC y MALDI MS.
También pueden ser útiles otros agentes de reducción fisiológicamente aceptables tales como glutatión reducido para iniciar la liberación.
Ejemplo 36 Preparación de microburbujas rellenas con gas encapsuladas con DSPS y biotina-PEG_{3400}-acil-fosfatidiletanolamina y funcionalizadas con estreptavidina, oligonucleótido biotina-GAAAGGTAGTGGGGTCGTGTGCCGG y péptido anti-polimerante de fibrina biotinilado (Biotina-GPRPPERHOS.HH_{2}) a) Síntesis de biotina-PEG_{3400}-acil-fosfatidil etanolamina
Una mezcla de dipalmitoil fosfatidil etanolamina, (21,00 mg, 0,03 mmol), biotina-PEG-CO_{2}-NHS, (100 mg, 0,03 mmol) y trietilamina (42 \mul, 0,30 mmol) en una solución de cloroformo/metanol (3:1) se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de la evaporación de los disolventes a presión reducida, el residuo se sometió a cromatografía ultrarrápida (cloruro de metileno/metanol/agua, 40:8:1). El producto se obtuvo en forma de una goma amarilla (112 mg, 94%), y la estructura se verificó por RMN y MALDI-MS.
b) Unión de estreptavidina conjugada con fluoresceína a microburbujas rellenas con gas
Las microburbujas rellenas con gas se prepararon mezclando DSPS y biotina-PEG_{3400}-acil-fosfatidiletanolamina como se describe en ejemplos previos. La suspensión de microburbujas se dividió en alícuotas de 0,2 ml y la estreptavidina conjugada con fluoresceína se añadió como se muestra en la siguiente tabla. Las muestras se incubaron sobre una mesa vibratoria durante 15 o 30 minutos a temperatura ambiente antes de la retirada del exceso de proteína lavando en PBS. Las muestras se analizaron por citometría de flujo y Contador Coulter. Los resultados se resumen en la siguiente tabla.
Resultados
Nº alícuota Estreptavidina añadida Tiempo de incubación % partículas Diámetro medio de las
(mg/200:1 muestra) (temp. amb.) fluorescentes partículas (micrómetros)
1 0 2,0 -
2 0 - 12 (espuma)
3 0,2 (3 x 10^{-9} mmol) 30 min 7,8 3,9
4 2 (3 x 10^{-8} mmol) 30 min 26,2 4,2
5 10 (1,5 x 10^{-7} mmol) 15 min 30,5 na
6 20 (3 x 10^{-7} mmol) 30 min 97,9 5,2
7 40 (6 x 10^{-7} mmol) 15 min 96,7 5,1
8 DSPS control 20 (3 x 10^{-7} mmol) 15 min 0,6 3,7
c) Conjugación de microburbujas recubiertas con estreptavidina con el oligonucleótido biotina-GAAAGGTAGTGGGGTCGTGTGCCGG y péptidos biotinilados fibrina-anti-polimerante biotina-GPRPPERHOS
Las partículas de la alícuota Nº 6 anterior se centrifugaron y el sobrenadante se reemplazó con 1 ml de tampón PBS, pH 7,5, que contenía 0,2 mg de biotina-GAAAGGTAGTGGGGTCGTGTGCCGG y 0,2 mg de biotina-GPRP
PERHQS (preparado como en el Ejemplo 27(b) y (c)). Después de incubación durante 24 horas las partículas se lavaron exhaustivamente con PBS y agua.
Otros vectores biotinilados o agentes terapéuticos pueden conjugarse a microburbujas recubiertas con estreptavidina o avidita usando este procedimiento.
Ejemplo 37 Preparación de microburbujas rellenas con gas encapsuladas con DSPS y funcionalizadas con a lipopéptido director de trombos y la enzima trombolítica activadora de plasminógeno tisular
Este ejemplo se refiere a la preparación de agentes de contraste dirigidos por ultrasonidos a trombos que comprenden un agente trombolítico terapéutico.
a) Síntesis de un lipopéptido con afinidad por trombos (Dipalmitoil-Lys-Asn-Asp-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-lle-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln.NH_{2})
47
El lipopéptido se sintetizó en un sintetizador de péptidos automático ABI433 A partiendo de resina amida de Rink a una escala de 0,1 mmol usando cartuchos de 1 mmol de aminoácido. Todos los aminoácidos y el ácido palmítico se preactivaron usando HBTU antes del acoplamiento. La retirada simultánea del péptido de la resina y los grupos protectores de la cadena lateral se realizó en TFA que contenía fenol al 5%, EDT al 5%, anisol al 5% y H_{2}O al 5% durante 2 horas, dando un rendimiento de producto bruto de 80 mg. Se realizó la purificación por HPLC preparativa de una alícuota de 20 mg del material bruto. Después de la liofilización, se obtuvieron 6 mg de material puro. El producto se caracterizó por espectrometría de masas MALDI y HPLC analítica.
b) Modificación de activador de plasminógeno tisular con Sulfo-SMPB
Una solución de 0,1 ml de tampón carbonato amónico que contiene 0,1 mg de t-PA se preparó hasta 0,2 ml mediante la adición de agua. A esta solución se añadió 0,4 mg de Sulfo-SMPB (disuelto en 0,05 ml de DMSO). La solución de proteína se dejó reposar a temperatura ambiente durante 45 minutos, posteriormente se realizó la purificación en una columna Superdex 200. El producto se eluyó en PBS y se recogieron las fracciones de proteína modificadas.
c) Preparación de microburbujas rellenas con gas encapsuladas con DSPS/lipopéptido de unión a trombos lipopéptido que contiene tiol y conjugación del activador de plasminógeno tisular modificado
DSPS (5,0 mg) se pesó en un vial limpio junto con 0,5 mg del lipopéptido de (a) y 0,5 mg del lipopéptido que contiene tiol del Ejemplo 64(a). A esto se le añadió 1,0 ml de una solución de propilenglicol al 1,4%/glicerol al 2,4% y la mezcla se sonicó durante 2 minutos y después se calentó a 80ºC durante 5 minutos. Inmediatamente después del calentamiento, la solución se filtró a través de un filtro de 4 micrómetros. La muestra se enfrió a temperatura ambiente y el espacio de cabeza se lavó abundantemente con gas perfluorobutano. El vial se agitó en una mezcladora con tapa durante 45 segundos y las microburbujas resultantes se lavaron dos veces con agua desionizada. Se desechó el infranadante y se reemplazó con una alícuota de 1 ml de la solución de proteína de (b) anterior. La reacción de conjugación se dejó que transcurriera durante 1 hora. Las microburbujas se centrifugaron y el infranadante se intercambió con 1 ml adicional de solución de proteína. La etapa de incubación se repitió hasta que se usó toda la solución de proteína. Las microburbujas después se lavaron exhaustivamente con agua y se analizaron mediante un contador Coulter. Las microburbujas se ensayaron en el ensayo de la cámara de flujo descrito en el Ejemplo 21 (c). Se encontró que las microburbujas modificadas con proteína se unían en mayor cantidad que aquellas que comprenden lipopéptido/DSPS o DSPS solo. Se evaluó la actividad directora/terapéutica/de ultrasonidos de estas microburbujas en modelos de trombogénesis tanto in vitro como in vivo.
Ejemplo 38 Preparación de microburbujas rellenas con gas que comprenden DSPS cargado con un lipopéptido que comprende un péptido helicoide con afinidad por membranas celulares
Este ejemplo se refiere a la preparación de microburbujas dirigidas que comprenden un vector peptídico para dirigir estructuras de membrana celular.
a) Síntesis de un lipopéptido que comprende un péptido helicoide con afinidad por membranas celulares
48
El lipopéptido se sintetizó en un sintetizador de péptidos automático ABI433A partiendo de resina amida de Rink a una escala de 0,2 mmol usando cartuchos de 1 mmol de aminoácido. Todos los aminoácidos y ácido 2-n-hexadecilesteárico se preactivaron usando HBTU antes del acoplamiento. La retirada simultánea de lipopéptido de la resina y los grupos protectores de la cadena lateral se realizó en TFA que contenía H_{2}O al 5% durante 2 horas, dando un rendimiento de producto bruto de 520 mg. La purificación por HPLC preparativa de una alícuota de 30 mg de material bruto se realizó usando un gradiente del 90 al 100% B durante 40 minutos (A = TFA al 0,1%/agua y B = MeOH) a un caudal de 9 ml/min. Después de la liofilización, se obtuvieron 10 mg de material puro (HPLC analítica, gradiente 90-100% B durante 20 minutos donde B = MeOH, A= TFA al 0,01%/agua detección - UV 214 nm - tiempo de retención del producto = 23 minutos). La caracterización adicional del producto se realizó usando espectrometría de masas MALDI: esperado M+H a 2369, encontrado a 2375.
b) Preparación de microburbujas rellenas con gas
DSPS (4,5 mg) y lipopéptido de (a) (0,5 mg) se pesaron en un vial limpio y se añadió 1,0 ml de una solución de propilenglicol al 1,4%/glicerol al 2,4%. La mezcla se sonicó durante 3-5 minutos, se calentó a 80ºC durante 5 minutos y después se filtró a través de un filtro de 4,5 mm. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente y el espacio de cabeza se lavó abundantemente con gas perfluorobutano. El vial se agitó en una mezcladora con tapa durante 45 segundos y las microburbujas resultantes se centrifugaron a 1000 rpm durante 3 minutos. Las microburbujas después se lavaron con agua hasta que no pudo detectarse lipopéptido por MALDI-MS. Se realizaron estudios en el contador Coulter, atenuación acústica y estabilidad a presión. A una alícuota de las burbujas lavadas (aprox. 0,2 ml) se le añadió metanol (0,5 ml), y la mezcla se puso en un baño sonicador durante 2 minutos. La solución transparente resultante, que se analizó por MALDI-MS, se encontró que contenía el lipopéptido.
c) Ensayos in vitro e in vivo
Las microburbujas tenían características similares in vitro e in vivo como las encontradas para las microburbujas preparadas en el Ejemplo 21.
Ejemplo 39 Microburbujas rellenas con gas encapsuladas con fosfatidilserina y un lipopéptido biotinilado a) Síntesis del lipopéptido diplomatoil-lisinil-triptofanil-lisinil-lisinil-lisinil (biotinil)-glicina
El lipopéptido se sintetizó en un sintetizador de péptidos automático ABI 433A partiendo de resina Fmoc-Gly-Wang a una escala de 0,1 mmol usando cartuchos de 1 mmol de aminoácido. Todos los aminoácidos y el ácido palmítico se preactivaron usando HBTU antes del acoplamiento. La retirada simultánea del péptido de la resina y los grupos protectores de la cadena lateral se realizó en TFA que contenía fenol al 5%, EDT al 5%, anisol al 5% y H_{2}O al 5% durante 2 horas, dando un rendimiento de producto bruto de 150 mg. La purificación por HPLC preparativa de una alícuota de 40 mg de material bruto se realizó usando un gradiente del 70 al 100% de B durante 40 minutos (A = TFA al 0,1%/agua y B = MeOH) a un caudal de 9 ml/min. Después de la liofilización, 14 mg de material puro (HPLC analítica, gradiente 70-100% de B donde B = MeOH, A = TFA al 0,01%/agua: detección - UV 260 y fluorescencia, Ex280, Em350 - tiempo de retención del producto = 22 minutos). La caracterización adicional del producto se realizó usando espectrometría de masas MALDI: esperado M+H a 1478, encontrado a 1471.
b) Preparación de microburbujas rellenas con gas que comprenden DSPS "dopado" con la secuencia de lipopéptido biotinilado de (a)
DSPS (4,5 mg) y lipopéptido de (a) (0,5 mg, 0,2 mmol) se pesaron en cada uno de dos viales, y se añadieron 0,8 ml de una solución de propilenglicol al 1,4%/glicerol al 2,4% a cada vial. Las mezclas se calentaron a 80ºC durante 5 minutos (los viales se agitaron durante el calentamiento). Las muestras se enfriaron a temperatura ambiente y los espacios de cabeza se lavaron abundantemente con gas perfluorobutano. Los viales se agitaron en una mezcladora con tapa durante 45 segundos y después se hicieron rotar durante una noche. Las microburbujas resultantes se lavaron varias veces con agua desionizada y se analizaron mediante un contador Coulter y atenuación acústica. Se usó análisis de espectro de masas MALDI para confirmar la incorporación del lipopéptido a las microburbujas DSPS de la siguiente manera: aproximadamente 50-100 ml de microburbujas se transfirieron a un vial limpio y 50-100 ml de agua se añadieron. La mezcla se sonicó durante 30 segundos y se formaron manchas sobre un disco diana limpio (1 ml + 0,5 ml de matriz ACH). El modo positivo dio M+H a 1474, esperado para el lipopéptido a 1478.
Ejemplo 40 Preparación de microburbujas multi-específicas rellenas con gas que comprenden DSPS cargado con un lipopéptido que comprende un péptido de unión al receptor de interleuquina no bioactiva-1
Este ejemplo se refiere a la preparación de microburbujas dirigidas que comprenden un vector peptídico no bioactivo para dirigir al receptor de IL-1 que no induce transducción de señal o que evita la unión a IL-1.
a) Síntesis de un lipopéptido que comprende un péptido de unión al receptor de interleuquina no bioactiva-1
49
El lipopéptido se sintetizó en un sintetizador de péptidos automático ABI433A partiendo de resina Fmoc-Ala-Wang a una escala de 0,1 mmol usando cartuchos de 1 mmol de aminoácido. Todos los aminoácidos y el ácido palmítico se preactivaron usando HBTU antes del acoplamiento. La retirada simultánea de lipopéptido de la resina y los grupos protectores de la cadena lateral se realizó en TFA que contenía H_{2}O al 5%, anisol al 5%, fenol al 5% y EDT al 5% durante 2 horas, dando un rendimiento de producto bruto de 150 mg. La purificación por HPLC preparativa de una alícuota de 30 mg de material bruto se realizó usando un gradiente del 90 al 100% de B durante 40 minutos (A = TFA al 0,1%/agua y B = MeOH) a un caudal de 9 ml/min. Después de la liofilización, se obtuvieron 4 mg de material puro (HPLC analítica, gradiente 90-100% de B durante 20 minutos donde B = MeOH, A = TFA al 0,01%/agua, detección - UV 214 nm - tiempo de retención del producto = 23 minutos). La caracterización adicional del producto se realizó usando espectrometría de masas MALDI: esperado M+H a 2083, encontrado a 2088.
b) Preparación de microburbujas rellenas con gas
DSPS (4,5 mg) y el lipopéptido de (a) (0,5 mg) se pesaron en un vial limpio y se añadió 1,0 ml de una solución de propilenglicol al 1,4%/glicerol al 2,4%. La mezcla se sonicó durante 3-5 minutos, se calentó a 80ºC durante 5 minutos y después se filtró a través de un filtro de 4,5 micrómetros. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente y el espacio de cabeza se lavó abundantemente con gas perfluorobutano. Los viales se agitaron en una mezcladora con tapa durante 45 segundos y las microburbujas resultantes se centrifugaron a 1000 rpm durante 3 minutos. Las microburbujas después se lavaron con agua hasta que no pudo detectarse lipopéptido por MALDI-MS. A las microburbujas lavadas (aprox. 0,2 ml) se les añadió metanol (0,5 ml), y la mezcla se puso en un baño sonicador durante 2 minutos. Se encontró que la solución transparente resultante, que se analizó por MALDI-MS, contenía lipopéptido (esperado 2083, encontrado 2088).
Ejemplo 41 Preparación de microburbujas rellenas con perfluoropropano que comprenden DSPC. DSPS y lipopéptido de unión a células endoteliales para formación de imágenes dirigida por ultrasonidos
A 0,8 ml de una solución que contiene DSPC:DSPS (3:1) (5 mg/ml) en propilenglicol/glicerol (4% en agua) se le añadieron 0,5 mg del lipopéptido del Ejemplo 31 (b). La mezcla se calentó a 80ºC durante 5 minutos y se agitó. La solución se enfrió después a temperatura ambiente y el espacio de cabeza se lavó abundantemente con perfluoropropano. El vial se agitó en una mezcladora con tapa durante 45 segundos y se puso sobre una mesa vibratoria durante 5 minutos. La muestra se centrifugó a 2000 rpm durante 5 minutos y el infranadante se retiró y se reemplazó con agua destilada. El espacio de cabeza se lavó abundantemente de nuevo con perfluoropropano y la muestra se mantuvo sobre una mesa vibratoria hasta que se obtuvo una apariencia homogénea. El procedimiento de lavado se repitió. El agente de contraste por ultrasonidos resultante se caracterizó por análisis en contador Coulter, medidas de atenuación acústica y resistencia a la presión externa. Las microburbujas se ensayaron en el ensayo in vitro como se detalla en el Ejemplo 21. Se observó una acumulación gradual de microburbujas que se unían a las células.
Ejemplo 42 Preparación de microburbujas que contienen hexafluoruro de azufre que comprenden DSPC, DSPS y lipopéptido de unión a células endoteliales para formación de imágenes dirigida por ultrasonidos
A 0,8 ml de una solución que contiene DSPC:DSPS (3:1) (5 mg/ml) en propilenglicol/glicerol (4% en agua) se le añadieron 0,5 mg del lipopéptido del Ejemplo 31 (b). La mezcla se calentó a 80ºC durante 5 minutos y se agitó. La solución se enfrió después a temperatura ambiente y el espacio de cabeza se lavó abundantemente con hexafluoruro de azufre gas. El vial se agitó en una mezcladora con tapa durante 45 segundos y se puso sobre una mesa vibratoria durante 5 minutos. La muestra se centrifugó a 2000 rpm durante 5 minutos y el infranadante se retiró y se reemplazó con agua destilada. El espacio de cabeza se lavó abundantemente de nuevo con hexafluoruro de azufre y la muestra se mantuvo sobre una mesa vibratoria hasta que se obtuvo una apariencia homogénea. El procedimiento de lavado se repitió.
El agente de contraste por ultrasonidos resultante se confirmó mediante un contador de Coulter, medidas de atenuación acústica y resistencia a la presión externa.
Ejemplo 43 Preparación de microburbujas rellenas con gas que comprenden DSPG y lipopéptido de unión a células endoteliales para formación de imágenes dirigida por ultrasonidos
A 0,8 ml de una solución que contiene DSPG (5 mg/ml) en propilenglicol/glicerol (4% en agua) se le añadieron 0,5 mg del lipopéptido del Ejemplo 31 (b). La mezcla se calentó a 80ºC durante 5 minutos y se agitó. La solución se enfrió después a temperatura ambiente y el espacio de cabeza se lavó abundantemente con perfluorobutano. El vial se agitó en una mezcladora con tapa durante 45 segundos y se puso sobre una mesa vibratoria durante 5 minutos. La muestra se centrifugó a 2000 rpm durante 5 minutos y el infranadante se retiró y se reemplazó con agua destilada. El espacio de cabeza se lavó abundantemente de nuevo con perfluorobutano y la muestra se mantuvo sobre una mesa vibratoria hasta que se obtuvo una apariencia homogénea. El procedimiento de lavado se repitió. El agente de contraste por ultrasonidos resultante se caracterizó por análisis en contador Coulter, medidas de atenuación acústica y resistencia a la presión externa. Las microburbujas se ensayaron en el ensayo in vitro como se detalla en el Ejemplo 21: se observó una acumulación gradual de microburbujas que se unían a las células.
Ejemplo 44 Preparación de microburbujas rellenas con perfluoropropano que comprenden DSPG y lipopéptido de unión a células endoteliales para formación de imágenes dirigida por ultrasonidos
A 0,8 ml de una solución que contiene DSPG (5 mg/ml) en propilenglicol/glicerol (4% en agua) se le añadieron 0,5 mg del lipopéptido del Ejemplo 31 (b). La mezcla se calentó a 80ºC durante 5 minutos y después se agitó. La solución se enfrió después a temperatura ambiente y el espacio de cabeza se lavó abundantemente con perfluoropropano. El vial se agitó en una mezcladora con tapa durante 45 segundos y se puso sobre una mesa vibratoria durante 5 minutos. La muestra se centrifugó a 2000 rpm durante 5 minutos y el infranadante se retiró y se reemplazó con agua destilada. El espacio de cabeza se lavó abundantemente de nuevo con perfluorobutano y la muestra se mantuvo sobre una mesa vibratoria hasta que se obtuvo una apariencia homogénea. El procedimiento de lavado se repitió. El agente de contraste por ultrasonidos resultante se caracterizó por análisis en contador Coulter, medidas de atenuación acústica y resistencia a la presión externa. Las microburbujas se ensayaron en el ensayo in vitro detallado en el Ejemplo 21: se observó una acumulación gradual de microburbujas que se unían a las células.
Ejemplo 45 Preparación de microburbujas que contienen hexafluoruro de azufre que comprenden DSPG y lipopéptido de unión a células endoteliales para formación de imágenes dirigida por ultrasonidos
A 0,8 ml de una solución que contiene DSPG (5 mg/ml) en propilenglicol/glicerol (4% en agua) se le añadieron 0,5 mg del lipopéptido del Ejemplo 31 (b). La mezcla se calentó a 80ºC durante 5 minutos y se agitó. La solución se enfrió después a temperatura ambiente y el espacio de cabeza se lavó abundantemente con hexafluoruro de azufre gas. El vial se agitó en una mezcladora con tapa durante 45 segundos y se puso sobre una mesa vibratoria durante 5 minutos. La muestra se centrifugó a 2000 rpm durante 5 minutos y el infranadante se retiró y se reemplazó con agua destilada. El espacio de cabeza se lavó abundantemente de nuevo con hexafluoruro de azufre y la muestra se mantuvo sobre una mesa vibratoria hasta que se obtuvo una apariencia homogénea. El procedimiento de lavado se repitió. El agente de contraste por ultrasonidos resultante se caracterizó por análisis en contador Coulter, medidas de atenuación acústica y resistencia a la presión externa.
Ejemplo 46 Microburbujas rellenas con gas dirigidas que comprenden DSPS recubierto no covalentemente con polilisina
DSPS (5 mg) se pesó en un vial limpio junto con poli-L-lisina (0,2 mg). Al vial se añadieron 1,0 ml de una solución de propilenglicol al 1,4%/glicerol al 2,4%. La mezcla se calentó a 80ºC durante 5 minutos. La muestra se enfrió a temperatura ambiente y el espacio de cabeza se lavó abundantemente con gas perfluorobutano. El vial se agitó en una mezcladora con tapa durante 45 segundos y las microburbujas resultantes se centrifugaron a 1000 rpm durante 3 minutos. Después de un lavado exhaustivo con agua, PBS y agua, se examinó el contenido de polilisina de la solución final usando MALDI MS. No se observó material polipeptídico en la solución de lavado final. Después se añadió acetonitrilo (0,5 ml) y las microburbujas se sonicaron hasta que todas las burbujas hubieron explotado. El análisis de la solución resultante para polilisina se realizó de nuevo usando MALDI MS. Los resultados fueron los siguientes:
MALDI esperado MALDI encontrado
Poli-L-lisina 786, 914, 1042, 1170 790, 919, 1048, 1177
Ejemplo 47 Preparación de microburbujas funcionalizadas rellenas con gas para formación de imágenes dirigida por ultrasonidos
Este ejemplo se refiere a la preparación de microburbujas que tienen un grupo reactivo sobre la superficie para la dirección no específica, utilizando principalmente reacciones de intercambio de disulfuro para realizar la unión a una multiplicidad de dianas celulares.
a) Síntesis de una molécula lipídica funcionalizada con tiol
50
La estructura lipídica mostrada anteriormente se sintetizó en un sintetizador de péptidos automático ABI 433A partiendo de resina Fmoc-Cys(Trt)-Wang a una escala de 0,25 mmol usando cartuchos de 1 mmol de aminoácido. Todos los aminoácidos y el ácido palmítico se preactivaron usando química de acoplamiento a HBTU. La retirada simultánea del péptido de la resina y la desprotección de los grupos protectores de la cadena lateral se realizó en TFA que contenía EDT al 5% y H_{2}O al 5% durante 2 horas, dando un rendimiento de producto bruto de 250 mg. La purificación por HPLC preparativa de una alícuota de 40 mg de material bruto se realizó usando un gradiente del 90 al 100% B durante 50 minutos (A = TFA al 0,1%/agua y B = MeOH) a un caudal de 9 ml/min. Después de la liofilización, se obtuvieron 24 mg de material puro (HPLC analítica, gradiente 70-100% de B donde B = TFA al 0,1%/acetonitrilo, A = TFA al 0,01%/agua: detección - UV 214 nm - tiempo de retención del producto - 23 minutos). La caracterización adicional del producto se realizó usando espectrometría de masas MALDI: esperado M+H a 1096, encontrado a
1099.
b) Preparación de microburbujas rellenas con gas que comprenden DSPS "dopado" con una estructura lipídica que contiene tiol
DSPS (4,5 mg) y la estructura lipídica de (a) anterior (0,5 mg, 0,4 mmol) se pesaron en un vial limpio y se añadieron 0,8 ml de una solución que contiene propilenglicol al 1,4%/glicerol al 2,4% en agua. La mezcla se calentó a 80ºC durante 5 minutos (vial agitado durante el calentamiento) y se filtró mientras aún estaba caliente a través de un filtro de 40 mm. La muestra se enfrió a temperatura ambiente y el espacio de cabeza se lavó abundantemente con gas perfluorobutano. El vial se agitó en una mezcladora con tapa durante 45 segundos y después se puso sobre una mesa vibratoria durante una noche. Las microburbujas resultantes se lavaron varias veces con agua desionizada y se analizaron para la incorporación del grupo tiol usando reactivo de Ellman.
Ejemplo 48 Preparación de microburbujas rellenas con gas que comprenden DSPS dopado con un lipopéptido de unión a trombo a) Síntesis de un lipopéptido con afinidad por trombos (Dipalmitoil-Lys-Asn-Asp-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-lle-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln.NH_{2})
51
El lipopéptido se sintetizó en un sintetizador de péptidos automático ABI433 A partiendo de resina amida de Rink a una escala de 0,1 mmol usando cartuchos de 1 mmol de aminoácido. Todos los aminoácidos y el ácido palmítico se preactivaron usando HBTU antes del acoplamiento. La retirada simultánea del péptido de la resina y los grupos protectores de la cadena lateral se realizó en TFA que contenía fenol al 5%, EDT al 5%, anisol al 5% y H_{2}O al 5% durante 2 horas, dando un rendimiento de producto bruto de 80 mg. Se realizó la purificación por HPLC preparativa de una alícuota de 20 mg del material bruto. Después de la liofilización, se obtuvieron 6 mg de material puro. El producto se caracterizó por espectrometría de masas MALDI y HPLC analítica.
b) Preparación de microburbujas dirigidas a trombos por ultrasonidos
DSPS (4,5 mg) y lipopéptido de (a) (1,0 mg) se pesaron en un vial y se añadieron 0,8 ml de una solución de propilenglicol al 1,4%/glicerol al 2,4%. La mezcla se calentó a 80ºC durante 5 minutos y después se filtró a través de un filtro de 4 micrómetros. Después de enfriar a temperatura ambiente el espacio de cabeza se lavó abundantemente con gas perfluorobutano. El vial se agitó en una mezcladora con tapa durante 45 segundos y las microburbujas resultantes se lavaron exhaustivamente con agua desionizada. Las microburbujas se caracterizaron por microscopía y análisis en contador Coulter. MALDI-MS se usó para confirmar la presencia de lipopéptido como se describe en los ejemplos anteriores.
Ejemplo 49 Preparación de microburbujas recubiertas con transferrina rellenas con gas para formación de imágenes dirigidas por ultrasonidos a) Síntesis de una molécula lipídica funcionalizada con tiol
52
La estructura lipídica mostrada anteriormente se sintetizó en un sintetizador de péptidos automático ABI 433A partiendo de resina Fmoc-Cys(Trt)-Wang a una escala de 0,25 mmol usando cartuchos de 1 mmol de aminoácido. Todos los aminoácidos y el ácido palmítico se preactivaron usando HBTU antes del acoplamiento. La retirada simultánea del péptido de la resina y la desprotección de los grupos protectores de la cadena lateral se realizó en TFA que contenía EDT al 5% y H_{2}O al 5% durante 2 horas, dando un rendimiento de producto bruto de 250 mg. La purificación por HPLC preparativa de una alícuota de 40 mg de material bruto se realizó usando un gradiente del 90 al 100% de B durante 50 minutos (A = TFA al 0,1%/agua y B = MeOH) a un caudal de 9 ml/min. Después de la liofilización, se obtuvieron 24 mg de material puro (HPLC analítica, gradiente 70-100% de B donde B = TFA al 0,1%/acetonitrilo, A = TFA al 0,01%/agua: detección - UV 214 nm - tiempo de retención del producto = 23 minutos). La caracterización adicional del producto se realizó usando espectrometría de masas MALDI: esperado M+H a 1096, encontrado a 1099.
b) Preparación de microburbujas rellenas con gas que comprenden DSPS "dopado" con una estructura lipídica que contiene tiol
DSPS (4,5 mg) y la estructura lipídica de (a) anterior (0,5 mg, 0,4 mmol) se pesaron en un vial limpio y se añadieron 0,8 ml de una solución de propilenglicol al 1,4%/glicerol al 2,4%. La mezcla se calentó a 80ºC durante 5 minutos (vial agitado durante el calentamiento) y se filtró mientras aún estaba caliente a través de un filtro de 40 mm. La muestra se enfrió a temperatura ambiente y el espacio de cabeza se lavó abundantemente con gas perfluorobutano. El vial se agitó en una mezcladora con tapa durante 45 segundos y después se puso sobre una mesa vibratoria durante una noche. Las microburbujas resultantes se lavaron varias veces con agua desionizada y se analizaron para la incorporación del grupo tiol usando reactivo de Ellman.
c) Modificación de transferrina con fluoresceína-NHS y Sulfo-SMPB
A 4 mg de transferrina (Holo, humano) en PBS (1 ml) se le añadieron 0,5 ml de solución en DMSO que contiene 1 mg de Sulfo-SMPB y 0,5 mg de fluoresceína-NHS. La mezcla se agitó durante 45 minutos a temperatura ambiente y después se hizo pasar a través de una columna Sephadex 200 usando PBS como eluyente. Las fracciones de proteínas se recogieron y almacenaron a 4ºC antes de usarlas.
d) Conjugación de microburbujas con transferrina
A las microburbujas que contienen tiol de (b) se les añadió 1 ml de la solución de proteína modificada con transferrina de (c). Después de ajustar el pH de la solución a 9 se dejó que la reacción de conjugación transcurriera durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de un lavado exhaustivo con agua desionizada las microburbujas se analizaron mediante un contador Coulter (97% entre 1 y 5 mm) y microscopía de fluorescencia (microburbujas muy fluorescentes).
Ejemplo 50 Microburbujas rellenas con gas que comprenden DSPS que incorpora PE-PEG_{2000}-Mal conjugado con tripsina fluoresceína tiolada a) Síntesis de Boc-NH-PEG_{2000}-DSPE (t-butil carbamato de politetilenglicol) distearoilfoafatidil-etanolamina)
DSPE (31 mg) se añadió a una solución de Boc-NH-PEG_{2000}-SC (150 mg) en cloroformo (2 ml), seguido de trietilamina (33 \mul). La mezcla se agitó a 41ºC durante 10 minutos hasta que el material de partida se hubo disuelto. El disolvente se evaporó rotatoriamente y el residuo se recogió en acetonitrilo (5 ml). La dispersión resultante se enfrió a 4ºC y se centrifugó, posteriormente la solución se filtró y se evaporó a sequedad. La estructura del producto resultante se confirmó por RMN.
b) Síntesis de H_{2}N-PEG_{2000}-DSPE (amino-poli(etilenglicol)-distearoilfosfatidiletanolamina)
Boc-NH-PEG_{2000}-DSPE (167 mg) se agitó en ácido clorhídrico 4 M en dioxano (5 ml) durante 2,5 horas a temperatura ambiente. El disolvente se retiró por evaporación rotatoria y el residuo se recogió en cloroformo (1,5 ml) y se lavó con agua (2 x 1,5 ml). La fase orgánica se evaporó al vacío. El análisis por TLC (cloroformo/metanol/agua 13:5:0,8) dio una sola mancha positiva a ninhidrina con Rf = 0,6; la confirmación de la estructura se obtuvo por RMN.
c) Síntesis de Mal-PEG_{2000}-DSPE (3-maleimidopropionato poli(etilenglicol) distearoilfosfatidiletanolamina)
Una solución de N-succinimidil-3-maleimidopropionato (5,6 mg, 0,018 mmol) en tetrahidrofurano (0,2 ml) se añadió a H_{2}N-PEG_{2000}-DSPE (65 mg, 0,012 mmol) disuelto en tetrahidrofurano (1 ml) y tampón fosfato sódico 0,1 M pH 7,5 (2 ml). La mezcla se calentó a 30ºC y la reacción se siguió hasta que se completó por TLC, posteriormente el disolvente se retiró al vacío. El material del título se purificó en una columna ultrarrápida de sílice usando 80:20 de cloroformo:metanol como eluyente. La estructura del producto puro se confirmó por RMN y espectrometría de masas.
d) Preparación de microburbujas rellenas con gas de DSPS "dopado" con PE-PEG_{2000}-Mal
DSPS (4,5 mg) y PE-PEG_{2000}-Mal de (c) anterior (0,5 mg) se pesaron en un vial limpio y se añadió 1 ml de una solución de propilenglicol al 1,4%/glicerol al 2,4%. La mezcla se calentó a 80ºC durante 5 minutos y después se filtró a través de un filtro de 4,5 mm. La muestra se enfrió a temperatura ambiente y el espacio de cabeza se lavó abundantemente con gas perfluorobutano. El vial se agitó en una mezcladora con tapa durante 45 segundos y las microburbujas resultantes se lavaron tres veces con agua destilada.
e) Preparación de tripsina marcada con fluoresceína
A 5 mg de tripsina en PBS (1 ml) se le añadieron 0,2 ml solución en DMSO que contiene 1 mg de fluoresceína-NHS. La mezcla se agitó durante 45 minutos a temperatura ambiente. Después se cargó una columna Sephadex 200 con la mezcla de proteína modifica y el producto se eluyó a un caudal de 1 ml/min usando PBS. La fracción proteica (5 ml) se recogió y se almacenó a 4ºC.
f) Preparación de tripsina tiolada marcada con fluoresceína
A la fracción proteica de (e) se le añadió 1 mg de reactivo de Traut y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora más. 4 ml del producto modificado con Traut se cargaron después en una columna Sephadex 200 y el producto se eluyó con PBS. La fracción proteica que contiene una intensidad fluorescente máxima se recogió en un volumen total de 6 ml.
g) Conjugación de microburbujas con tripsina tiolada marcada con fluoresceína
Las microburbujas de (d) se incubaron sobre una mesa vibratoria en 1 ml de solución de proteína de (f) anterior. La conjugación se dejó que transcurriera a pH 7,3-7,8 durante 10 minutos antes de la centrifugación y retirada del infranadante. El proceso se repitió tres veces más, después de lo cual las burbujas se lavaron cuatro veces con agua para retirar la proteína no conjugada.
D. Las burbujas contenían enzima activa como fue evidente por la escisión de un derivado de Arg-pNA en PBS.
E. Se realizó el análisis de las burbujas por Coulter y medida de ecogenicidad.
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FEK-022-015
Concentración total 0,83
Diámetro 1-3 mm 40
Diámetro 3-5 mm 28
Diámetro 5-7 mm 13
Frecuencia de atenuación máxima 3,3
Atenuación a 2 MHz 4,9
Atenuación a 3,5 MHz 7,8
Atenuación a 5,0 MHz 7,2 
\vskip1.000000\baselineskip
Las burbujas eran estables a la presión.
La Fig. 2 de los dibujos adjuntos representa datos de citometría de flujo que muestran una comparación con burbujas de control negativo (curva de la izquierda). Se calculó que el 98% de las burbujas era fluorescente.
Ejemplo 51 Microburbujas rellenas con gas que comprenden DSPS y una molécula que contiene captoprilo para diagnóstico y aplicaciones terapéuticas a) Síntesis de un lipopéptido funcionalizado con captoprilo
53
La estructura mostrada anteriormente se sintetizó mediante el método de burbujeo manual partiendo de resina MBHA de amida de Rink protegida con Fmoc a una escala de 0,125 mmol. El acoplamiento se realizó usando un protocolo TBTU/HOBt/DIEA convencional. Se acopló ácido bromoacético a través de la cadena lateral de Lys en forma de un anhídrido usando preactivación DIC. Se introdujo captoprilo disuelto en DMF en la fase sólida usando DBU como base. La retirada simultánea del péptido de la resina y la desprotección de los grupos protectores de la cadena lateral se realizó en TFA que contenía EDT al 5%, agua al 5% y sulfuro de etil metilo al 5% durante 2 horas. Una alícuota de 10 mg del material bruto se purificó por cromatografía líquida preparativa usando un gradiente del 70 al 100% de B durante 60 minutos (A = TFA al 0,1%/agua y B = TFA al 0,1%/acetonitrilo) a un caudal de 10 ml/min. Después de la liofilización, se obtuvo un rendimiento de 2 mg de material puro (HPLC analítica, gradiente 70-100% de B durante 20 minutos, A = TFA al 0,1%/agua y B = TFA al 0,1%/acetonitrilo, caudal 1 ml/min, detección UV 214 nm, tiempo de retención 26 minutos). Se realizó una caracterización adicional usando espectrometría de masas MALDI, dando M+H a 1265 como se esperaba.
b) Preparación de microburbujas rellenas con gas que comprenden DSPS y un compuesto que contiene captoprilo
Una solución de propilenglicol al 1,4%/glicerol al 2,4% (1,0 ml) se añadió a una mezcla de DSPS (4,5 mg) y el producto de (a) (0,5 mg) en un vial. La mezcla se sonicó durante 5 minutos y después se calentó a 80ºC durante 5 minutos (el vial se agitó durante el calentamiento). El vial se enfrió después y el espacio de cabeza se lavó abundantemente con gas perfluorobutano. El vial se agitó en una mezcladora con tapa durante 45 segundos y las microburbujas resultantes se lavaron exhaustivamente con agua desionizada. La espectrometría de masas MALDI no mostró un nivel detectable de compuesto de (a) en la solución de lavado final. La incorporación del lipopéptido que contiene captoprilo a las microburbujas se confirmó por MALDI-MS de la siguiente manera: aproximadamente 50 \mul de microburbujas se transfirieron a un vial limpio que contenía aproximadamente 100 \mul de metanol al 90%. La mezcla se sonicó durante 30 segundos y se analizó por espectrometría de masas MALDI, dando un pico M+H correspondiente al lipopéptido de (a).
Ejemplo 52 Microburbujas rellenas con gas que comprenden DSPS y un vector con afinidad por receptores adrenérgicos para diagnóstico y aplicaciones terapéuticas a) Síntesis de un derivado de atenolol protegido adecuado para el acoplamiento de la fase sólida i) Síntesis de 4-[(2,3-epoxi)propoxi]-fenilacetato de metilo
Una mezcla de 4-hidroxifenilacetato de metilo (4,98 g, 0,030 mol), epiclorhidrina (23,5 ml, 0,30 mol) y piridina (121 \mul, 1,5 mmol) se agitó a 85ºC durante 2 horas. La mezcla de reacción se enfrió y el exceso de epiclorhidrina se retiró por destilación (rotavapor). El residuo se recogió en acetato de etilo, se lavó con salmuera y se secó (Na_{2}SO_{4}). La solución se filtró y se concentró. El residuo oscuro se cromatografió (sílice, hexano/acetato de etilo 7:3) para dar 2,25 g (34%) de un aceite incoloro. Los espectros ^{1}H (300 MHz) y ^{13}C RMN (75 MHz) estuvieron de acuerdo con la estructura.
ii) Síntesis de 4-[2-hidroxi-3-[(1-metiletil)-amino]propoxi]fenilacetato de metilo
Una mezcla de 4-[(2,3-epoxi)propoxi]fenilacetato de metilo (2,00 g, 9,00 mmol), isopropilamina (23 ml, 0,27 mol) y agua (1,35 ml, 74,7 mmol) se agitó a temperatura ambiente durante una noche. La mezcla de reacción se concentró (rotavapor) y el residuo oleoso se disolvió en cloroformo y se secó (Na_{2}SO_{4}). La filtración y concentración dieron un rendimiento cuantitativo de un aceite amarillo que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional. La estructura se verificó por análisis RMN ^{1}H y ^{13}C.
iii) Síntesis de clorhidrato del ácido 4-(2-hidroxi-3-[(1-metiletil)-amino]propoxi]fenilacético
Una solución de 4-[2-hidroxi-3-[(1-metiletil)-amino]propoxi]fenilacetato de metil (563 mg, 2,00 mmol) en ácido clorhídrico 6 M (15 ml) se calentó a 100ºC durante 4 horas. La mezcla de reacción se concentró (rotavapor) y el residuo se recogió en agua y se liofilizó. Los espectros RMN ^{1}H y ^{13}C estaban de acuerdo con la estructura y la espectrometría de masas MALDI dio un M+H a 268 como se esperaba.
iv) Síntesis de ácido N-Boc-4-[2-hidroxi-3-[(1-metiletil)-amino]propoxi]fenilacético
Una solución de clorhidrato del ácido N-Boc-4-[2-hidroxi-3-[(1-metiletil)-amino]propoxi]fenilacético (2,0 mmol) en agua (2 ml) se añadió a una solución de bicarbonato sódico (0,60 g, 7,2 mmol) en agua/dioxano (2:1,15 ml). Se añadió una solución de dicarbonato de di-terc-butilo (0,48 g, 2,2 mmol) en dioxano (5 ml). El progreso de la reacción se controló mediante análisis por TLC (sílice, CHCl_{3}/MeOH/AcOH 85:10:5), y se añadieron porciones de dicarbonato de di-terc-butilo hasta que se completó la conversión. La mezcla de reacción se vertió en agua saturada con hidrogenosulfato potásico y se extrajo material orgánico en acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con agua y salmuera, se secó (Na_{2}SO_{4}) y se filtró para dar 0,6 g de material bruto. El producto se purificó por cromatografía (sílice, CHCl_{3}/MeOH/AcOH 85:10:5). La solución se concentró y el residuo se recogió en ácido acético glacial y se liofilizó. Rendimiento 415 mg (56%), sólido blanco. La estructura se confirmó por análisis RMN ^{1}H y ^{13}C.
b) Síntesis de un lipopéptido funcionalizado con atenolol
54
La estructura mostrada anteriormente se sintetizó por el método de burbujeo manual partiendo de resina MBHA de amida de Rink protegida con Fmoc a una escala de 0,125 mmol, usando el compuesto de (a). El acoplamiento se realizó usando protocolos TBTU/HOBt/DIEA convencionales. La retirada simultánea del péptido de la resina y la desprotección de los grupos protectores de la cadena lateral se realizó en TFA que contenía EDT al 5% y agua al 5% durante 2 horas. El material bruto se precipitó en éter y se purificó por cromatografía líquida preparativa usando un gradiente del 70 al 100% de B durante 60 minutos (A = TFA al 0,1%/agua y B = TFA al 0,1%/acetonitrilo) a un caudal de 10 ml/min. Después de la liofilización, se obtuvo un rendimiento de 38 mg de material puro (HPLC analítica, gradiente 70-100% de B durante 20 minutos, A = 0-1% TFA/agua y B = TFA al 0,1%/acetonitrilo, caudal 1 ml/minuto, detección UV 214 nm, tiempo de retención 25 minutos). Se realizó una caracterización adicional usando espectrometría de masas MALDI (matriz ACH), dando M+H a 1258, esperado 1257.
c) Preparación de microburbujas rellenas con gas que comprenden DSPS y un lipopéptido que contiene atenolol
Una solución de propilenglicol al 1,4%/glicerol al 2,4% (1,0 ml) se añadió a una mezcla de DSPS (4,5 mg) y el producto de (b) (0,5 mg) en un vial. La mezcla se sonicó durante 5 minutos, calentó a 80ºC durante 5 minutos (el vial se agitó durante el calentamiento) y después se enfrió. El espacio de cabeza se lavó abundantemente con gas perfluorobutano y el vial se agitó en una mezcladora con tapa durante 45 segundos, posteriormente los contenidos se lavaron exhaustivamente con agua desionizada. La espectrometría de masas MALDI no mostró un nivel detectable del compuesto de (b) en la solución de lavado final. La incorporación del lipopéptido que contiene atenolol en las microburbujas se confirmó por MALDI-MS de la siguiente manera: aproximadamente 50 \mul de microburbujas se transfirieron a un vial limpio que contenía aproximadamente 100 \mul de metanol al 90%. La mezcla se sonicó durante 30 segundos y se analizó por MALDI-MS (matriz ACH), dando un pico M+H a 1259 correspondiente al lipopéptido (b).
d) Análisis in vitro
Las microburbujas se ensayaron en el ensayo in vitro detallado en el Ejemplo 21. Se observó una acumulación gradual de microburbujas que se unían a las células.
Ejemplo 53 Microburbujas rellenas con gas que comprenden DSPS y un lipopéptido constituido por un péptido de unión a sulfato de heparina (KRKR) y un péptido de fibronectina (WOPPRARI) para dirigir y un lipopéptido que contienen atenolol para aplicación terapéutica a) Síntesis de un lipopéptido constituido por un péptido de unión a sulfato de heparina (KRKR) y un péptido de fibronectina (WOP-PRARI)
55
El lipopéptido se sintetizó en un sintetizador de péptidos automático ABI 433A partiendo de resina Fmoc-Ile-Wang a una escala de 0,1 mmol usando cartuchos de 1 mmol de aminoácido. Todos los aminoácidos y el ácido palmítico se preactivaron usando HBTU antes del acoplamiento. La retirada simultánea del péptido de la resina y los grupos protectores de la cadena lateral se realizó en TFA que contenía fenol al 5%, EDT al 5%, anisol al 5% y H_{2}O al 5% durante 2 horas, dando un rendimiento de producto bruto de 150 mg. La purificación por HPLC preparativa de una alícuota de 40 mg de material bruto se realizó usando un gradiente del 70 al 100% de B durante 40 minutos (A = TFA al 0,1%/agua y B = MeOH) a un caudal de 9 ml/min. Después de la liofilización, se obtuvieron 16 mg de material puro (HPLC analítica, gradiente 70-100% de B donde B = MeOH, A = TFA al 0,01%/agua: detección - UV 260 y fluorescencia, Ex280, Em350 - tiempo de retención del producto = 19,44 minutos). La caracterización adicional del producto se realizó usando espectrometría de masas MALDI: esperado M+H a 2198, encontrado a 2199.
b) Síntesis de un derivado protegido de atenolol adecuado para acoplamiento en fase sólida i) Síntesis de 4-[(2,3-epoxi)propoxi)fenilacetato de metilo
Una mezcla de 4-hidroxifenilacetato de metilo (4,98 g, 0,030 mol), epiclorhidrina (23,5 ml, 0,30 mol) y piridina (121 \mul, 1,5 mmol) se agitó a 85ºC durante 2 horas. La mezcla de reacción se enfrió, y el exceso de epiclorhidrina se retiró por destilación (rotavapor). El residuo se recogió en acetato de etilo, se lavó con salmuera y se secó (Na_{2}SO_{4}). La solución se filtró y se concentró. El residuo oscuro se cromatografió (sílice, hexano/acetato de etilo 7:3) para dar 2,25 g (34%) de un aceite incoloro. Los espectros RMN ^{1}H (300 MHz) y ^{13}C (75 MHz) estaban de acuerdo con la estructura.
ii) Síntesis de 4-[2-hidroxi-3-[(1-metiletil)-amino]propoxi]fenilacetato de metilo
Una mezcla de 4-[(2,3-epoxi)propoxi]fenilacetato de metil (2,00 g, 9,00 mmol), isopropilamina (23 ml, 0,27 mol) y agua (1,35 ml, 74,7 mmol) se agitó a temperatura ambiente durante una noche. La mezcla de reacción se concentró (rotavapor) y el residuo oleoso se disolvió en cloroformo y se secó (Na_{2}SO_{4}). La filtración y concentración dio un rendimiento cuantitativo de un aceite amarillo que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional. La estructura se verificó por análisis RMN ^{1}H y ^{13}C.
iii) Síntesis de clorhidrato del ácido 4-[2-hidroxi-3-[(1-metiletil)-amino]propoxi]fenilacético
Una solución de 4-[2-hidroxi-3-[(1-metiletil)-amino]propoxi]fenilacetato de metilo (563 mg, 2,00 mmol) en ácido clorhídrico 6 M (15 ml) se calentó a 100ºC durante 4 horas. La mezcla de reacción se concentró (rotavapor) y el residuo se recogió en agua y se liofilizó. Los espectros RMN ^{1}H y ^{13}C estaban de acuerdo con la estructura y la espectrometría de masas MALDI dio un M+H a 268 como se esperaba.
iv) Síntesis de ácido N-Boc-4-[2-hidroxi-3-[(1-metiletil)-amino]propoxi]fenilacético
Una solución de clorhidrato del ácido 4-[2-hidroxi-3-[(1-metiletil)-amino]propoxi]fenilacético (2,0 mmol) en agua (2 ml) se añadió a una solución de bicarbonato sódico (0,60 g, 7,2 mmol) en agua/dioxano (2:1,15 ml). Se añadió una solución de dicarbonato de di-terc-butilo (0,48 g, 2,2 mmol) en dioxano (5 ml). El progreso de la reacción se controló mediante análisis por TLC (sílice, CHCl_{3}/MeOH/AcOH 85:10:5), y porciones de dicarbonato de di-terc-butilo se añadieron hasta que se completó la conversión. La mezcla de reacción se vertió en agua saturada con hidrogenosulfato potásico y se extrajo material orgánico en acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con agua y salmuera, se secó (Na_{2}SO_{4}) y se filtró para dar 0,6 g de material bruto. El producto se purificó por cromatografía (sílice, CHCl_{3}/MeOH/AcOH 85:10:5). La solución se concentró y el residuo se recogió en ácido acético glacial y se liofilizó. Rendimiento 415 mg (56%), sólido blanco. La estructura se confirmó por análisis RMN ^{1}H y ^{13}C.
c) Síntesis de un lipopéptido funcionalizado con atenolol
56
La estructura mostrada anteriormente se sintetizó por el método de burbujeo manual partiendo de resina MBHA de amida de Rink protegida con Fmoc a una escala de 0,125 mmol, usando los aminoácidos apropiados, ácido palmítico y el compuesto de (a). El acoplamiento se realizó usando protocolos TBTU/HOBt/DIEA convencionales. La retirada simultánea del péptido de la resina y la desprotección de los grupos protectores de la cadena lateral se realizó en TFA que contenía EDT al 5% y agua al 5% durante 2 horas. El material bruto se precipitó en éter y se purificó por cromatografía líquida preparativa usando un gradiente del 70 al 100% de B durante 60 minutos (A = TFA al 0,1%/agua y B = TFA al 0,1%/acetonitrilo) a un caudal de 10 ml/min. Después de la liofilización, se obtuvo un rendimiento de 38 mg de material puro (HPLC analítica, gradiente 70-100% de B durante 20 minutos, A = TFA al 0,1%/agua y B = TFA al 0,1%/acetonitrilo, caudal 1 ml/minuto, detección UV 214 nm, tiempo de retención 25 minutos). Se realizó una caracterización adicional usando espectrometría de masas MALDI (matriz ACH), dando M+H a 1258, esperado 1257.
d) Preparación de microburbujas rellenas con gas que comprenden DSPS y un lipopéptido constituido por un péptido de unión a sulfato de heparina (KRKR), un péptido de fibronectina (WOPPRARI) y un lipopéptido que contiene atenolol
Una solución de propilenglicol al 1,4%/glicerol al 2,4% (1,0 ml) se añadió a una mezcla de DSPS (5,0 mg), producto de (a) (0,5 mg) y producto de (c) (0,5 mg) en un vial. La mezcla se sonicó durante 5 minutos y después se calentó a 80ºC durante 5 minutos (el vial se agitó durante el calentamiento). La solución se filtró y se enfrió. El espacio de cabeza se lavó abundantemente con gas perfluorobutano y el vial se agitó en una mezcladora con tapa durante 45 segundos, posteriormente los contenidos se lavaron exhaustivamente con agua desionizada. La incorporación de lipopéptido que contiene atenolol en las microburbujas se confirmó por MALDI-MS de la siguiente manera: aproximadamente 50 \mul demicroburbujas se transfirieron a un vial limpio que contenía aproximadamente 100 \mul de metanol al 90%. La mezcla se sonicó durante 30 segundos y se analizó por MALDI-MS (matriz ACH), dando dos picos M+H a 2202 y 1259, correspondientes al lipopéptido (a) y al lipopéptido (c) respectivamente.
e) Análisis in vitro
Las microburbujas se ensayaron en el ensayo in vitro como se detalle en el ejemplo 21. Se observó una acumulación gradual de microburbujas que se unían a las células.
Ejemplo 54 Microburbujas rellenas con gas que comprenden DSPS y un derivado lipófilo de atenolol con afinidad por receptores adrenérgicos para diagnóstico y aplicaciones terapéuticas a) Síntesis de N-hexadecil-4-[2-hidroxi-3-[(1-metiletil)amino]propoxi]fenilacetamida i) Síntesis de 4-[(2,3-epoxi)propoxi]-fenilacetato de metilo
Una mezcla de 4-hidroxifenilacetato de metilo (4,98 g, 0,030 mol), epiclorhidrina (23,5 ml, 0,30 mol) y piridina (121 \mul, 1,5 mmol) se agitó a 85ºC durante 2 horas. La mezcla de reacción se enfrió y el exceso de epiclorhidrina se retiró por destilación (rotavapor). El residuo se recogió en acetato de etilo, se lavó con salmuera y se secó (Na_{2}SO_{4}). La solución se filtró y se concentró. El residuo oscuro se cromatografió (sílice, hexano/acetato de etilo 7:3) para dar 2,25 g (34%) de un aceite incoloro. Los espectros RMN ^{1}H (300 MHz) y ^{13}C (75 MHz) estaban de acuerdo con la estructura.
ii) Síntesis de 4-[2-hidroxi-3-[(1-metiletil)amino]propoxi]fenilacetato de metilo
Una mezcla de 4-[(2,3-epoxi)propoxi]fenilacetato de metilo (2,00 g, 9,00 mmol), isopropilamina (23 ml, 0,27 mol) y agua (1,35 ml, 74,7 mmol) se agitó a temperatura ambiente durante una noche. La mezcla de reacción se concentró (rotavapor) y el residuo oleoso se disolvió en cloroformo y se secó (Na_{2}SO_{4}) La filtración y concentración dio un rendimiento cuantitativo de un aceite amarillo que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional. La estructura se verificó por análisis RMN ^{1}H y ^{13}C.
iii) Síntesis de clorhidrato del ácido 4-[2-hidroxi-3-[(1-metiletil)amino]propoxi]fenilacético
Una solución de 4-[2-hidroxi-3-[(1-metiletil)amino]propoxi]fenilacetato de metilo (563 mg, 2,00 mmol) en ácido clorhídrico 6 M (15 ml) se calentó a 100ºC durante 4 horas. La mezcla de reacción se concentró (rotavapor) y el residuo se recogió en agua y se liofilizó. Los espectros RMN ^{1}H y ^{13}C estaban de acuerdo con la estructura y la espectrometría de masas MALDI dio un M+H a 268 como se esperaba.
iv) Síntesis de ácido N-Boc-4-[2-hidroxi-3-[(1-metiletil)amino]propoxi]fenilacético
Una solución de clorhidrato del ácido 4-[2-hidroxi-3-[(1-metiletil)amino]propoxi]fenilacético (2,0 mmol) en agua (2 ml) se añadió a una solución de bicarbonato sódico (0,60 g, 7,2 mmol) en agua/dioxano (2:1, 15 ml). Se añadió una solución de dicarbonato de di-terc-butilo (0,48 g, 2,2 mmol) en dioxano (5 ml). El progreso de la reacción se controló mediante análisis por TLC (sílice, CHCl_{3}/MeOH/AcOH 85:10:5), y porciones de dicarbonato de di-terc-butilo se añadieron hasta que se completó la conversión. La mezcla de reacción se vertió en agua saturada con hidrogenosulfato potásico y se extrajo material orgánico en acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con agua y salmuera, se secó (Na_{2}SO_{4}) y se filtró para dar 0,6 g de material bruto. El producto se purificó por cromatografía (sílice, CHCl_{3}/MeOH/AcOH 85:10: 5). La solución se concentró y el residuo se recogió en ácido acético glacial y se liofilizó. Rendimiento. 415 mg (56%), sólido blanco. La estructura se confirmó por análisis RMN ^{1}H y ^{13}C.
v) Síntesis de N'-Boc,N-hexadecil-4-[2-hidroxi-3-[(1-metiletil)amino]propoxi]fenilacetamida
Una solución de ácido N-Boc-4-[2-hidroxi-3-[(1-metiletil)-amino]propoxi]fenilacético (92 mg, 0,25 mmol) y hexadecilamina (60 mg, 0,25 mmol) en DMF (5 ml) se enfrió a 0ºC. Se añadieron HOBt (39 mg, 0,25 mmol) y clorhidrato de N-(3-dimetil-aminopropil)-N'-etilcarbodiimida (carbodiimida soluble en agua) (48 mg, 0,25 mmol). La mezcla de reacción se agitó a 0ºC durante 1 hora y después a temperatura ambiente durante una noche. La mezcla de reacción se vertió en agua (25 ml) que contenía carbonato sódico (2,5 g) y cloruro sódico (4,0 g). El material precipitado se retiró por filtración, se lavó con agua y se recogió en cloroformo. La fase cloroformo se lavó con carbonato sódico al 5% y agua y se secó (Na_{2}SO_{4}). La solución se filtró y se concentró para dar 150 mg de material bruto blanco-amarillento. El producto se purificó por cromatografía en columna (sílice, cloroformo/metanol 95:5) para dar 118 mg (80%) de material blanco. La estructura se verificó por RMN ^{1}H (500 MHz) y ^{13}C (125 MHz). El producto se caracterizó adicionalmente por espectrometría de masas MALDI, dando un pico M+Na a 614 como se esperaba.
vi) Síntesis de N-hexadecil-4-[2-hidroxi-3-[(1-metiletil)amino]propoxi]fenilacetamida
A una solución de N'-Boc-N-hexadecil-4-[2-hidroxi-3-[(1-metil-etil)amino]propoxi]fenilacetamida (10 mg) en diclorometano (9 ml) se le añadió ácido trifluoroacético (1 ml). La mezcla de reacción se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente. TLC (sílice, cloroformo/metanol 95:5) mostró una conversión completa del material de partida. Los disolventes se retiraron por evaporación y el residuo se recogió en agua/acetonitrilo y se liofilizó para dar un rendimiento cuantitativo de material blanco sólido. La estructura se verificó por análisis RMN ^{1}H (500 MHz) y ^{13}C (125 MHz) y se caracterizó adicionalmente por espectrometría de masas MALDI, dando M+H a 492 y M+Na a 514 como se esperaba.
b) Preparación de microburbujas rellenas con gas que comprenden DSPS y N-hexadecil-4-[2-hidroxi-3-[(1-metiletil)-amino]propoxilfenilacetamida para diagnóstico y aplicaciones terapéuticas
Una solución de propilenglicol al 1,4%/glicerol al 2,4% (1,0 ml) se añadió a una mezcla de DSPS (4,5 mg) y N-hexadecil-4-[2-hidroxi-3-[(1-metiletil)-amino]propoxi]fenilacetamida (0,5 mg) en un vial. La mezcla se sonicó durante 5 minutos y después se calentó a 80ºC durante 5 minutos (el vial se agitó durante el calentamiento). La solución se filtró y se enfrió. El espacio de cabeza se lavó abundantemente con gas perfluorobutano y el vial se agitó en una mezcladora con tapa durante 45 segundos, posteriormente los contenidos se lavaron exhaustivamente con agua desionizada. La incorporación del compuesto de (a) en las microburbujas se confirmó por MALDI-MS de la siguiente manera; aproximadamente 50 \mul de microburbujas se transfirieron a un vial limpio que contenía aproximadamente 100 \mul demetanol al 90%. La mezcla se sonicó durante 30 segundos y se analizó por MALDI-MS, dando un pico M+H a 492 correspondiente a N-hexadecil-4-[2-hidroxi-3-[(1-metiletil)amino]propoxi]fenilacetamida.
Ejemplo 55 Microburbujas rellenas con gas encapsuladas con DSPS y un compuesto que contiene ácido fólico para aplicaciones de diagnóstico a) Síntesis de un lipopéptido que contiene ácido fólico
57
La estructura mostrada anteriormente se sintetizó por el método de burbujeo manual partiendo de resina MBHA de Amida de Rink protegida con Fmoc en una escala de 0,125 mmol, usando aminoácidos apropiados, ácido palmítico y ácido fólico. El acoplamiento se realizó usando protocolos TBTU/HOBt/DIEA convencionales. La retirada simultánea del péptido de la resina y desprotección de los grupos protectores de la cadena lateral se realizó en TFA que contenía EDT al 5% y agua al 5% durante 2 horas. El material bruto se precipitó en éter y se analizó por espectrometría de masas MALDI, dando un pico M+H que corresponde a la estructura a 1435, esperado 1430. El material se caracterizó adicionalmente por HPLC analítica, gradiente del 70-100% B durante 20 minutos, A = TFA al 0,1%/agua y B = TFA al 0,1%/acetonitrilo, caudal 1,0 ml/minuto, dando un pico del producto con tiempo de retención de 27 minutos detectado a UV 368 nm.
b) Preparación de microburbujas rellenas con gas que comprenden DSPS y un lipopéptido que contiene ácido fólico
Una solución de propilenglicol al 1,4%/glicerol al 2,4% (1,0 ml) se añadió a una mezcla de DSPS (4,5 mg) y el producto de (a) (0,5 mg) en un vial. Se añadieron amoniaco diluido (a pH 8) y DMSO (40 \mul) y la mezcla se sonicó durante 5 minutos y después calentó a 80ºC durante 5 minutos (vial agitado durante el calentamiento). La solución se filtró y se enfrió. El espacio de cabeza se lavó abundantemente con gas perfluorobutano y el vial se agitó en una mezcladora con tapa durante 45 segundos, posteriormente los contenidos se lavaron exhaustivamente con agua desionizada. La incorporación de la estructura de (a) en las burbujas se confirmó por MALDI-MS de la siguiente manera: aproximadamente 50 \mul de microburbujas se transfirieron a un vial limpio que contenía aproximadamente 100 \mul de metanol al 90%. La mezcla se sonicó durante 30 segundos y se analizó por MALDI-MS (matriz ACH), dando un pico M+H a 1238 que corresponde a la estructura de (a).
c) Análisis in vitro
Las microburbujas se ensayaron en el ensayo in vitro detallado en el Ejemplo 21. Se observó una acumulación gradual de microburbujas que se unían a las células.
Ejemplo 56 Microburbujas rellenas con gas que comprenden DSPS y un colesteril éster de clorambucilo para aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas a) Síntesis de 4-[4-[bis(2-cloroetil)amino]fenil]butanoato de colesterilo
DIC (170 \mul, 1,10 mmol) se añadió a una solución de clorambucilo (669 mg, 2,20 mmol) en diclorometano seco (15 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 0,5 horas y se añadió a una solución de colesterol (387 mg, 1,00 mmol) y DMAP (122 mg, 1,00 mmol) en diclorometano (10 ml). La mezcla de reacción se agitó durante una noche y después se vertió en bicarbonato sódico al 5%. Las fases se separaron y la fase orgánica se lavó con salmuera y se secó (MgSO_{4}). La solución se filtró y se concentró y el producto se purificó por cromatografía en columna (sílice, cloroformo) para dar 560 mg (83%) de un aceite incoloro. El producto se caracterizó por espectrometría de masas MALDI, dando M+H a 674 como se esperaba. Se realizó una caracterización adicional usando análisis por RMN ^{1}H (500 MHz) y ^{13}C (125 MHz), dando espectros de acuerdo con la estructura.
b) Preparación de microburbujas rellenas con gas que comprenden DSPS y un colesteril éster de clorambucilo para aplicaciones de diagnóstico y/o terapéuticas
Una solución de propilenglicol al 1,4%/glicerol al 2,4% (1,0 ml) se añadió a una mezcla de DSPS (4,5 mg) y el producto de (a) (0,5 mg) en un vial. La mezcla se sonicó durante 5 minutos y después se calentó a 80ºC durante 5 minutos (vial agitado durante el calentamiento) y se enfrió. El espacio de cabeza se lavó abundantemente con gas perfluorobutano y el vial se agitó en una mezcladora con tapa durante 45 segundos, posteriormente los contenidos se lavaron exhaustivamente con agua desionizada. La espectrometría de masas MALDI no mostró un nivel detectable de compuesto de (a) en la solución de lavado final. La incorporación de colesteril éster de clorambucilo en las burbujas se confirmó por MALDI-MS de la siguiente manera: aproximadamente 50 \mul de microburbujas se transfirieron a un vial limpio que contenía aproximadamente 100 \mul de metanol al 90%. La mezcla se sonicó durante 30 segundos y se analizó por MALDI-MS, dando un pico M+H a 668 que corresponde a la estructura de (a).
Ejemplo 57 Microburbujas rellenas con gas que comprenden DSPS y un lipopéptido que contiene atenolol y un derivado de colesterol de clorambucilo para aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas a) Síntesis de un derivado de atenolol protegido adecuado para acoplamiento en fase sólida i) Síntesis de 4-[(2,3-epoxi)propoxi]-fenilacetato de metilo
Una mezcla de 4-hidroxifenilacetato de metilo (4,98 g, 0,030 mol), epiclorhidrina (23,5 ml, 0,30 mol) y piridina (121 \mul, 1,5 mmol) se agitó a 85ºC durante 2 horas. La mezcla de reacción se enfrió y el exceso de epiclorhidrina se extrajo por destilación (rotavapor). El residuo se recogió en acetato de etilo, se lavó con salmuera y se secó (Na_{2}SO_{4}). La solución se filtró y se concentró. El residuo oscuro se cromatografió (sílice, hexano/acetato de etilo 7:3) para dar 2,25 g (34%) de un aceite incoloro. Los espectros de RMN ^{1}H (300 MHz) y ^{13}C (75 MHz) fueron de acuerdo con la estructura.
ii) Síntesis de 4-[2-hidroxi-3-[(1-metiletil)amino]propoxi]fenilacetato de metilo
Una mezcla de 4-[(2,3-epoxi)propoxi]fenilacetato de metilo (2,00 g, 9,00 mmol), isopropilamina (23 ml, 0,27 mol) y agua (1,35 ml, 74,7 mmol) se agitó a temperatura ambiente durante una noche. La mezcla de reacción se concentró (rotavapor) y el residuo oleoso se disolvió en cloroformo y se secó (Na_{2}SO_{4}). La filtración y concentración dio un rendimiento cuantitativo de un aceite amarillo que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional. La estructura se verificó por análisis por RMN ^{1}H y ^{13}C.
iii) Síntesis de clorhidrato del ácido 4-[2-hidroxi-3-[(1-metiletil)amino]propoxi]fenilacético
Una solución de 4-[2-hidroxi-3-[(1-metiletil)amino]propoxi]fenilacetato de metilo (563 mg, 2,00 mmol) en ácido clorhídrico 6 M (15 ml) se calentó a 100ºC durante 4 horas. La mezcla de reacción se concentró (rotavapor) y el residuo se recogió en agua y se liofilizó. Los espectros de RMN ^{1}H y ^{13}C fueron de acuerdo con la estructura y la espectrometría de masas MALDI dio un M+H a 268 como se esperaba.
iv) Síntesis de ácido N-Boc-4-[2-hidroxi-3-[(1-metiletil)amino]propoxi]fenilacético
Una solución del clorhidrato del ácido 4-[2-hidroxi-3-[(1-metiletil)amino]propoxi]fenilacético (2,0 mmol) en agua (2 ml) se añadió a una solución de bicarbonato sódico (0,60 g, 7,2 mmol) en agua/dioxano (2:1, 15 ml). Se añadió una solución de dicarbonato de di-terc-butilo (0,48 g, 2,2 mmol) en dioxano (5 ml). El progreso de la reacción se controló por análisis por TLC (sílice, CHCl_{3}/MeOH/AcOH 85:10:5), y se añadieron porciones de dicarbonato de di-terc-butilo hasta que se completó la conversión. La mezcla de reacción se vertió en agua saturada con hidrogenosulfato de potasio y el material orgánico se extrajo en acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con agua y salmuera, se secó (Na_{2}SO_{4}) y se filtró para dar 0,6 g de material bruto. El producto se purificó por cromatografía (sílice, CHCl_{3}/MeOH/AcOH 85:10:5). La solución se concentró y el residuo se recogió en ácido acético glacial y se liofilizó. Rendimiento 415 mg (56%), sólido blanco. La estructura se confirmó por análisis por RMN ^{1}H y ^{13}C.
b) Síntesis de un lipopéptido funcionalizado con atenolol
58
La estructura mostrada anteriormente se sintetizó por el método de burbujeo manual partiendo de resina MBHA de Amida de Rink protegida con Fmoc en una escala de 0,125 mmol, usando aminoácidos apropiados, ácido palmítico y el compuesto de (a). El acoplamiento se realizó usando protocolos TBTU/HOBt/DIEA convencionales. La retirada simultánea del péptido de la resina y la desprotección de los grupos protectores de la cadena lateral se realizó en TFA que contenía EDT al 5% y agua al 5% durante 2 horas. El material bruto se precipitó en éter y se purificó por cromatografía líquida preparativa usando un gradiente del 70 al 100% de B durante 60 minutos (A = TFA al 0,1%/agua y B = TFA al 0,1%/acetonitrilo) a un caudal de 10 ml/min. Después de la liofilización, se obtuvo un rendimiento de 38 mg de material puro (HPLC analítica, gradiente del 70-100% de B durante 20 minutos, A = TFA al 0,1%/agua y B = TFA al 0,1%/acetonitrilo, caudal 1 ml/minuto, detección UV 214 nm, tiempo de retención 25 minutos). Se realizó una caracterización adicional usando espectrometría de masas MALDI (matriz ACH), dando M+H a 1258, esperado 1257.
c) Síntesis de 4-[4-[bis(2-cloroetil)amino]fenil]butanoato de colesterilo
DIC (170 \mul, 1,10 mmol) se añadió a una solución de clorambucilo (669 mg, 2,20 mmol) en diclorometano seco (15 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 0,5 horas y se añadió a una solución de colesterol (387 mg, 1,00 mmol) y DMAP (122 mg, 1,00 mmol) en diclorometano (10 ml). La mezcla de reacción se agitó durante una noche y después se vertió en bicarbonato sódico al 5%. Las fases se separaron y la fase orgánica se lavó con salmuera y se secó (MgSO_{4}). La solución se filtró y se concentró y el producto se purificó por cromatografía en columna (sílice, cloroformo) para dar 560 mg (83%) de un aceite incoloro. El producto se caracterizó por espectrometría de masas MALDI, dando M+H a 674 como se esperaba. Se realizó una caracterización adicional usando análisis por RMN ^{1}H (500 MHz) y ^{13}C (125 MHz), dando espectros de acuerdo con la estructura.
d) Preparación de microburbujas rellenas con gas que comprenden DSPS y un lipopéptido que contiene atenolol y un colesteril éster de clorambucilo
Una solución de propilenglicol al 1,4%/glicerol al 2,4% (1,0 ml) se añadió a una mezcla de DSPS (5,0 mg), el producto de (b) (0,5 mg) y el producto de (c) (0,5 mg) en un vial. La mezcla se sonicó durante 5 minutos y después se calentó a 80ºC durante 5 minutos (vial agitado durante el calentamiento). La solución se filtró y se enfrió. El espacio de cabeza se lavó abundantemente con gas perfluorobutano y el vial se agitó en una mezcladora con tapa durante 45 segundos, posteriormente los contenidos se lavaron exhaustivamente con agua desionizada. La incorporación de los compuestos (b) y (c) en las microburbujas se confirmó por MALDI-MS de la siguiente manera: aproximadamente 50 \mul demicroburbujas se transfirieron a un vial limpio que contenía aproximadamente 100 \mul de metanol al 90%. La mezcla se sonicó durante 30 segundos y se analizó por MALDI-MS (matriz ACH), dando un pico M+H que corresponde al lipopéptido (b) y éster de colesterilo (c).
e) Análisis in vitro
Las microburbujas se ensayaron en el ensayo in vitro detallado en el Ejemplo 21. Se observó una acumulación gradual de microburbujas que se unían a las células.
Ejemplo 58 Microburbujas rellenas con gas que comprenden DSPS y un lipopéptido que contiene atenolol para dirigir a las células y un tiol éster de captoprilo lipófilo para uso terapéutico a) Síntesis de un derivado de atenolol protegido adecuado para acoplamiento en fase sólida i) Síntesis de 4-[(2,3-epoxi)propoxi]-fenilacetato de metilo
Una mezcla de 4-hidroxifenilacetato de metilo (4,98 g, 0,030 mol), epiclorhidrina (23,5 ml, 0,30 mol) y piridina (121 \mul, 1,5 mmol) se agitó a 85ºC durante 2 horas. La mezcla de reacción se enfrió y el exceso de epiclorhidrina se extrajo por destilación (rotavapor). El residuo se recogió en acetato de etilo, se lavó con salmuera y se secó (Na_{2}SO_{4}). La solución se filtró y se concentró. El residuo oscuro se cromatografió (sílice, hexano/acetato de etilo 7:3) para dar 2,25 g (34%) de un aceite incoloro. Los espectros de RMN ^{1}H (300 MHz) y ^{13}C (75 MHz) fueron de acuerdo con la estructura.
ii) Síntesis de 4-[2-hidroxi-3-[(1-metiletil)amino]propoxi]fenilacetato de metilo
Una mezcla de 4-[(2,3-epoxi)propoxi]fenilacetato de metilo (2,00 g, 9,00 mmol), isopropilamina (23 ml, 0,27 mol) y agua (1,35 ml, 74,7 mmol) se agitó a temperatura ambiente durante una noche. La mezcla de reacción se concentró (rotavapor) y el residuo oleoso se disolvió en cloroformo y se secó (Na_{2}SO_{4}). La filtración y concentración dio un rendimiento cuantitativo de un aceite amarillo que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional. La estructura se verificó por análisis por RMN ^{1}H y ^{13}C.
iii) Síntesis de clorhidrato del ácido 4-[2-hidroxi-3-[(1-metiletil)amino]propoxi]fenilacético
Una solución de 4-[2-hidroxi-3-[(1-metiletil)amino]propoxi]fenilacetato de metilo (563 mg, 2,00 mmol) en ácido clorhídrico 6 M (15 ml) se calentó a 100ºC durante 4 horas. La mezcla de reacción se concentró (rotavapor) y el residuo se recogió en agua y se liofilizó. Los espectros de RMN ^{1}H y ^{13}C fueron de acuerdo con la estructura y la espectrometría de masas MALDI dio un M+H a 268 como se esperaba.
iv) Síntesis de ácido N-Boc-4-[2-hidroxi-3-[(1-metiletil)amino]propoxi]fenilacético
Una solución del clorhidrato del ácido 4-[2-hidroxi-3-[(1-metiletil)amino]propoxi]fenilacético (2,0 mmol) en agua (2 ml) se añadió a una solución de bicarbonato sódico (0,60 g, 7,2 mmol) en agua/dioxano (2:1, 15 ml). Se añadió una solución de dicarbonato de di-terc-butilo (0,48 g, 2,2 mmol) en dioxano (5 ml). El progreso de la reacción se controló por análisis por TLC (sílice, CHCl_{3}/MeOH/AcOH 85:10:5), y se añadieron porciones de bicarbonato de di-terc-butilo hasta que se completó la conversión. La mezcla de reacción se vertió en agua saturada con hidrogenosulfato de potasio y el material orgánico se extrajo en acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con agua y salmuera, se secó (Na_{2}SO_{4}) y se filtró para dar 0,6 g de material bruto. El producto se purificó por cromatografía (sílice, CHCl_{3}/MeOH/AcOH 85:10:5). La solución se concentró y el residuo se recogió en ácido acético glacial y se liofilizó. Rendimiento 415 mg (56%), sólido blanco. La estructura se confirmó por análisis por RMN ^{1}H y ^{13}C.
b) Síntesis de un lipopéptido funcionalizado con atenolol
59
La estructura mostrada anteriormente se sintetizó por el método de burbujeo manual partiendo de resina MBHA de Amida de Rink protegida con Fmoc en una escala de 0,125 mmol, usando aminoácidos apropiados, ácido palmítico y el compuesto de (a). El acoplamiento se realizó usando protocolos TBTU/HOBt/DIEA convencionales. La retirada simultánea del péptido de la resina y la desprotección de los grupos protectores de la cadena lateral se realizó en TFA que contenía EDT al 5% y agua al 5% durante 2 horas. El material bruto se precipitó en éter y se purificó por cromatografía líquida preparativa usando un gradiente del 70 al 100% de B durante 60 minutos (A = TFA al 0,1%/agua y B = TFA al 0,1%/acetonitrilo) a un caudal de 10 ml/min. Después de la liofilización, se obtuvo un rendimiento de 38 mg de material puro (HPLC analítica, gradiente del 70-100% B durante 20 minutos, A = TFA al 0,1%/agua y B = TFA al 0,1%/acetonitrilo, caudal 1 ml/minuto, detección UV 214 nm, tiempo de retención 25 minutos). Se realizó una caracterización adicional usando espectrometría de masas MALDI (matriz ACH), dando M+H a 1258, esperado 1257.
c) Síntesis de tiol de captoprilo del ácido colánico
Una mezcla de ácido 5-\beta-colánico (361 mg, 1,00 mmol) y DIC (77 \mul, 0,50 mmol) en diclorometano (5 ml) se agitó durante 10 minutos y después se añadió a una solución de captoprilo (130 mg, 0,600 mmol) y DBU (180 \mul, 1,20 mmol) en diclorometano (10 ml). La mezcla de reacción se agitó durante una noche y después se vertió en ácido clorhídrico diluido. Se añadió cloroformo (30 ml). Las fases se separaron y la fase orgánica se lavó con agua y salmuera y se secó (MgSO_{4}). Después de la filtración y concentración, el material bruto se cromatografió (sílice, cloroformo/metanol/ácido acético 95:4:1). El producto se liofilizó en una mezcla de acetonitrilo/agua/etanol. Rendimiento 137 mg (49%) de un sólido blanquecino. La estructura se verificó por espectroscopía por RMN ^{1}H (500 MHz) y ^{13}C (125 MHz). Se realizó una caracterización adicional usando espectrometría de masas MALDI, dando un pico M+Na en modo positivo a m/z 584.
d) Preparación de microburbujas rellenas con gas que comprenden DSPS y un lipopéptido que contiene atenolol para dirigir a las células y un tiol éster de captoprilo lipófilo para uso terapéutico
Una solución de propilenglicol al 1,4%/glicerol al 2,4% (1,0 ml) se añadió a una mezcla de DSPS (5,0 mg) y los productos de (b) (0,5 mg) y (c) (0,5 mg) en un vial. La mezcla se sonicó durante 5 minutos y después calentó a 80ºC durante 5 minutos (vial agitado durante el calentamiento) y se enfrió. El espacio de cabeza se lavó abundantemente con gas perfluorobutano y el vial se agitó en una mezcladora con tapa durante 45 segundos seguido de lavado exhaustivo con agua desionizada. La espectrometría de masas MALDI no mostró un nivel detectable de compuesto de (b) o (c) en la solución de lavado final. La incorporación de los compuestos de (b) y (c) en las microburbujas se confirmó por MALDI-MS de la siguiente manera: aproximadamente 50 \mul de microburbujas se transfirieron a un vial limpio que contenía aproximadamente 100 \mul de metanol al 90%. La mezcla se sonicó durante 30 segundos y se analizó por MALDI-MS (matriz ACH), dando picos de acuerdo con las estructuras de (b) y (c) respectivamente.
e) Análisis in vitro
Las microburbujas se ensayaron en el ensayo in vitro detallado en el Ejemplo 21. Se observó una acumulación gradual de microburbujas que se unían a las células.
Ejemplo 59 Microburbujas rellenas con gas que comprenden fosfatidilserina y biotinamida-PEG-\beta-Ala-colesterol y un colesteril éster de clorambucilo para aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas a) Síntesis de N-Boc-\beta-alaninato de colesterilo
Se añadió DIC (510 \mul) a una solución de Boc-\beta-Ala-OH (1,25 g, 6,60 mmol) en diclorometano (15 ml) en una atmósfera inerte. La mezcla de reacción se agitó durante 30 minutos y después se transfirió a un matraz que contenía una solución de colesterol (1,16 g, 3,00 mmol) y DMAP (367 mg, 3,00 mmol) en diclorometano (15 ml). La mezcla de reacción se agitó durante 2 horas y después se vertió en una solución acuosa de hidrogenosulfato de potasio. Después de la separación de fases se extrajo la fase acuosa con cloroformo. Las fases orgánicas combinadas se lavaron con hidrogenosulfato de potasio acuoso y agua y se secaron (MgSO_{4}). Después de la filtración y evaporación el producto bruto se cromatografió (sílice, cloroformo/metanol 99:1) para dar 1,63 g (97%) de un sólido blanco. La estructura se confirmó por ^{1}H RMN (500 MHz).
b) Síntesis de clorhidrato de \beta-alaninato de colesterilo
Una solución de compuesto de (a) (279 mg, 0,500 mmol) en ácido clorhídrico 1 M en 1,4-dioxano (5 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. La mezcla de reacción se concentró para dar a rendimiento cuantitativo de clorhidrato de \beta-alaninato de colesterilo. La estructura se confirmó por análisis por ^{1}H RMN (500 MHz) y por espectrometría de masas MALDI, dando un pico M+Na a 482, esperado 481.
c) Biotina-PEG_{3400}-\beta-Ala-Colesterol
A una solución de clorhidrato de \beta-alaninato de colesterilo (15 mg, 0,03 mmol) en cloroformo/metanol húmedo (2,6:1, 3 ml) se añadió trietilamina (42 \mul, 0,30 mmol). La mezcla se agitó durante 10 minutos a temperatura ambiente y se añadió gota a gota una solución de biotina-PEG_{3400}-NHS (100 mg, 0,03 mmol) en 1,4-dioxano (1 ml). Después de agitar a temperatura ambiente durante 3 horas la mezcla se evaporó a sequedad y el residuo se purificó por cromatografía ultrarrápida para dar cristales blancos, rendimiento 102 mg (89%). La estructura se verificó por MALDI-MS y por análisis por RMN.
d) Síntesis de 4-[4-[bis(2-cloroetil)amino]fenil]butanoato de colesterilo
Se añadió DIC (170 \mul, 1,10 mmol) a una solución de clorambucilo (669 mg, 2,20 mmol) en diclorometano seco (15 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 0,5 horas y se añadió a una solución de colesterol (387 mg, 1,00 mmol) y DMAP (122 mg, 1,00 mmol) en diclorometano (10 ml). La mezcla de reacción se agitó durante una noche y después se vertió en bicarbonato sódico al 5%. Las fases se separaron y la fase orgánica se lavó con salmuera y se secó (MgSO_{4}). La solución se filtró y se concentró y el producto se purificó por cromatografía en columna (sílice, cloroformo) para dar un rendimiento de 560 mg (83%) de un aceite incoloro. El producto se caracterizó por espectrometría de masas MALDI, dando M+H a 674 como se esperaba. Se realizó una caracterización adicional usando análisis por RMN ^{1}H (500 MHz) y ^{13}C (125 MHz), dando espectros de acuerdo con la estructura.
e) Preparación de microburbujas rellenas con gas
Se añadió una solución de propilenglicol al 1,4%/glicerol al 2,4% (1,0 ml) a una mezcla de DSPS (5 mg) y los productos de (c) (0,5 mg) y (d) (0,5 mg) en a vial. La mezcla se sonicó durante 5 minutos y después se calentó a 80ºC durante 5 minutos (vial agitado durante el calentamiento) y se enfrió. El espacio de cabeza se lavó abundantemente con gas perfluorobutano y el vial se agitó en una mezcladora con tapa durante 45 segundos, posteriormente los contenidos se lavaron exhaustivamente con agua desionizada. La espectrometría de masas MALDI no mostró un nivel detectable del compuesto de (c) o (d) en la solución de lavado final. La incorporación de compuestos de (c) y (d) en las microburbujas se confirmó por MALDI-MS de la siguiente manera: aproximadamente 50 \mul demicroburbujas se transfirieron a un vial limpio que contenía aproximadamente 100 \mul de metanol al 90%. La mezcla se sonicó durante 30 segundos y se analizó por MALDI-MS (matriz ACH), dando picos M+H que corresponden a compuestos de (c) y (d).
Ejemplo 60 Microburbujas rellenas con gas que comprenden DSPS y un lipopéptido que contiene un derivado de bestatina para aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas a) Síntesis de un lipopéptido que contiene un derivado de bestatina
60
La estructura mostrada anteriormente se sintetizó por el método de burbujeo manual partiendo de resina MBHA de Amida de Rink protegida con Fmoc en una escala de 0,125 mmol, usando aminoácidos apropiados y ácido palmítico. El acoplamiento se realizó usando protocolos TBTU/HOBt/DIEA convencionales. La retirada simultánea del péptido de la resina y la desprotección de los grupos protectores de la cadena lateral se realizó en TFA que contenía EDT al 5% y agua al 5% durante 2 horas. El material bruto se precipitó en éter y se purificó por cromatografía líquida preparativa usando un gradiente del 70 al 100% de B durante 60 minutos (A = TFA al 0,1%/agua y B = TFA al 0,1%/acetonitrilo) a un caudal de 10 ml/min. Después de la liofilización, se obtuvo un rendimiento de 12 mg de material puro (HPLC analítica, gradiente del 70-100% de B durante 20 minutos, A = TFA al 0,1%/agua y B = TFA al 0,1%/acetonitrilo, caudal 1 ml/minuto, detección UV 214 nm, tiempo de retención 25 minutos). Se realizó una caracterización adicional usando espectrometría de masas MALDI (matriz ACH), dando M+H a 1315, esperado 1314.
b) Preparación de microburbujas rellenas con gas que contienen DSPS y un lipopéptido que contiene un derivado de bestatina para aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas
Una solución de propilenglicol al 1,4%/glicerol al 2,4% (1,0 ml) se añadió a una mezcla de DSPS (4,5 mg) y el producto de (a) (0,5 mg) en un vial. La mezcla se sonicó durante 5 minutos y después se calentó a 80ºC durante 5 minutos (vial agitado durante el calentamiento) y se enfrió. El espacio de cabeza se lavó abundantemente con gas perfluorobutano y el vial se agitó en una mezcladora con tapa durante 45 segundos y los contenidos se lavaron exhaustivamente con agua desionizada. La espectrometría de masas MALDI no mostró un nivel detectable de compuesto de (b) en la solución de lavado final. La incorporación de lipopéptido que contiene atenolol en las microburbujas se confirmó por MALDI-MS de la siguiente manera: aproximadamente 50 \mul de microburbujas se transfirieron a un vial limpio que contenía aproximadamente 100 \mul de metanol al 90%. La mezcla se sonicó durante 30 segundos y se analizó por MALDI-MS (matriz ACH), dando un pico M+H a 1320, esperado a 1314, que corresponde a lipopéptido de (a).
c) Análisis in vitro
Las microburbujas se ensayaron en el ensayo in vitro detallado en el Ejemplo 21. Se observó una acumulación gradual de microburbujas que se unían a las células.
Ejemplo 61 Microburbujas rellenas con gas que comprenden DSPS y un lipopéptido que contiene clorambucilo para aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas a) de un lipopéptido que contiene clorambucilo
61
La estructura mostrada anteriormente se sintetizó por el método de burbujeo manual partiendo de resina MBHA de Amida de Rink protegida con Fmoc en una escala de 0,125 mmol, usando aminoácidos apropiados y ácido palmítico. El acoplamiento se realizó usando protocolos TBTU/HOBt/DIEA convencionales. Se acopló el clorambucilo a través de la cadena lateral de Lys en forma de un anhídrido simétrico usando preactivación con DIC. La retirada simultánea del péptido de la resina y la desprotección de los grupos protectores de la cadena lateral se realizó en TFA que contenía EDT al 5%, agua al 5% y sulfuro de etil metilo al 5% durante 2 horas. Se purificó una alícuota de 10 mg del material bruto por cromatografía líquida preparativa usando un gradiente del 70 al 100% de B durante 60 minutos (A = TFA al 0,1%/agua y B = TFA al 0,1%/acetonitrilo) a un caudal de 10 ml/min. Después de la liofilización, se obtuvo un rendimiento de 30 mg de material puro (HPLC analítica, gradiente del 70-100% de B durante 20 minutos, A = TFA al 0,1%/agua y B = TFA al 0,1%/acetonitrilo, caudal 1 ml/minuto, detección UV 214 nm, tiempo de retención 26,5 minutos). Se realizó una caracterización adicional usando espectrometría de masas MALDI, dando M+H a 1295, esperado 1294.
b) Preparación de microburbujas rellenas con gas que comprenden DSPS y un lipopéptido que contiene clorambucilo para aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas
Una solución de propilenglicol al 1,4%/glicerol al 2,4% (1,0 ml) se añadió a una mezcla de DSPS (4,5 mg) y el producto de (a) (0,5 mg) en un vial. La mezcla se sonicó durante 5 minutos y después se calentó a 80ºC durante 5 minutos (vial agitado durante el calentamiento) y se enfrió. El espacio de cabeza se lavó abundantemente con gas perfluorobutano y el vial se agitó en una mezcladora con tapa durante 45 segundos, posteriormente los contenidos se lavaron exhaustivamente con agua desionizada. La espectrometría de masas MALDI no mostró un nivel detectable del compuesto de (a) en la solución de lavado final. La incorporación de lipopéptido que contiene clorambucilo en las burbujas se confirmó por MALDI-MS de la siguiente manera: aproximadamente 50 \mul de microburbujas se transfirieron a un vial limpio que contenía aproximadamente 100 \mul de metanol al 90%. La mezcla se sonicó durante 30 segundos y se analizó por MALDI-MS (matriz ACH), dando un pico M+H a 1300, esperado a 1294 y un pico M+Na a 1324, esperado 1317.
c) Análisis in vitro
Las microburbujas se ensayaron en ensayo in vitro detallado en el Ejemplo 21. Se observó una acumulación gradual de microburbujas que se unían a las células.
Ejemplo 62 Microburbujas rellenas con gas que comprenden DSPS, un lipopéptido que contiene atenolol y un derivado lipófilo de captoprilo para aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas a) Síntesis de un derivado de atenolol protegido adecuado para acoplamiento en fase sólida i) Síntesis de 4-[(2,3-epoxi)propoxi)-fenilacetato de metilo
Una mezcla de 4-hidroxifenilacetato de metilo (4,98 g, 0,030 mol), epiclorhidrina (23,5 ml, 0,30 mol) y piridina (121 \mul, 1,5 mmol) se agitó a 85ºC durante 2 horas. La mezcla de reacción se enfrió, y el exceso de epiclorhidrina se extrajo por destilación (rotavapor). El residuo se recogió en acetato de etilo, se lavó con salmuera y se secó (Na_{2}SO_{4}) La solución se filtró y se concentró. El residuo oscuro se cromatografió (sílice, hexano/acetato de etilo 7:3) para dar 2,25 g (34%) de un aceite incoloro. Los espectros de RMN ^{1}H (300 MHz) y ^{13}C (75 MHz) fueron de acuerdo con la estructura.
ii) Síntesis de 4-[2-hidroxi-3-[(1-metiletil)amino]propoxi]fenilacetato de metilo
Una mezcla de 4-[(2,3-epoxi)propoxi]fenilacetato de metilo (2,00 g, 9,00 mmol), isopropilamina (23 ml, 0,27 mol) y agua (1,35 ml, 74,7 mmol) se agitó a temperatura ambiente durante una noche. La mezcla de reacción se concentró (rotavapor) y el residuo oleoso se disolvió en cloroformo y se secó (Na_{2}SO_{4}). La filtración y concentración dieron un rendimiento cuantitativo de un aceite amarillo que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional. La estructura se verificó por análisis por RMN ^{1}H y ^{13}C.
iii) Síntesis de clorhidrato del ácido 4-[2-hidroxi-3-[(1-metiletil)amino]propoxi]fenilacético
Una solución de 4-[2-hidroxi-3-[(1-metiletil)amino]propoxi]fenilacetato de metilo (563 mg, 2,00 mmol) en ácido clorhídrico 6 M (15 ml) se calentó a 100ºC durante 4 horas. La mezcla de reacción se concentró (rotavapor) y el residuo se recogió en agua y se liofilizó. Los espectros de RMN ^{1}H y ^{13}C fueron de acuerdo con la estructura y la espectrometría de masas MALDI dio un M+H a 268 como se esperaba.
iv) Síntesis de ácido N-Boc-4-[2-hidroxi-3-[(1-metiletil)amino]propoxi]fenilacético
Una solución del clorhidrato del ácido 4-[2-hidroxi-3-[(1-metiletil)amino]propoxi]fenilacético (2,0 mmol) en agua (2 ml) se añadió a una solución de bicarbonato sódico (0,60 g, 7,2 mmol) en agua/dioxano (2:1, 15 ml). Se añadió una solución de dicarbonato de di-terc-butilo (0,48 g, 2,2 mmol) en dioxano (5 ml). El progreso de la reacción se controló por análisis por TLC (sílice, CHCl_{3}/MeOH/AcOH 85:10:5), y se añadieron porciones de bicarbonato de di-terc-butilo hasta que se completó la conversión. La mezcla de reacción se vertió en agua saturada con hidrogenosulfato de potasio y el material orgánico se extrajo en acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con agua y salmuera, se secó (Na_{2}SO_{4}) y se filtró para dar 0,6 g de material bruto. El producto se purificó por cromatografía (sílice, CHCl_{3}/MeOH/AcOH 85:10:5). La solución se concentró y el residuo se recogió en ácido acético glacial y se liofilizó. Rendimiento 415 mg (56%), sólido blanco. La estructura se confirmó por análisis por RMN ^{1}H y ^{13}C.
b) Síntesis de un lipopéptido funcionalizado con atenolol
62
La estructura mostrada anteriormente se sintetizó por el método de burbujeo manual partiendo de resina MBHA de Amida de Rink protegida con Fmoc en una escala de 0,125 mmol, usando aminoácidos apropiados, ácido palmítico y el compuesto de (a). El acoplamiento se realizó usando protocolos TBTU/HOBt/DIEA convencionales. La retirada simultánea del péptido de la resina y la desprotección de los grupos protectores de la cadena lateral se realizó en TFA que contenía EDT al 5% y agua al 5% durante 2 horas. El material bruto se precipitó en éter y se purificó por cromatografía líquida preparativa usando un gradiente del 70 al 100% de B durante 60 minutos (A = TFA al 0,1%/agua y B = TFA al 0,1%/acetonitrilo) a un caudal de 10 ml/min. Después de la liofilización, se obtuvo un rendimiento de 38 mg de material puro (HPLC analítica, gradiente del 70-100% de B durante 20 minutos, A = TFA al 0,1%/agua y B = TFA al 0,1%/acetonitrilo, caudal 1 ml/minuto, detección UV 214 nm, tiempo de retención 25 minutos). Se realizó una ca-
racterización adicional usando espectrometría de masas MALDI (matriz ACH), dando M+H a 1258, esperado 1257.
c) Síntesis de N-[(S)-3-hexadeciltio-2-metilpropionil]prolina
Se añadió DIEA (188 \mul, 1,10 mmol) a una solución de 1-yodohexadecano (176 mg, 0,500 mmol), captoprilo (120 mg, 0,550 mmol) y DBU (165 \mul,1,10 mmol) en tetrahidrofurano (5 ml). La mezcla se calentó a 70ºC durante 2 horas y después se concentró. El residuo se vertió en agua saturada con hidrogenosulfato de potasio y el material orgánico se extrajo en cloroformo. La fase orgánica se lavó con agua y se secó (MgSO_{4}). El producto se purificó por cromatografía (sílice, CHCl_{3}/MeOH/AcOH 85:10:5) y se liofilizó para dar 105 mg (48%) de un material sólido blanco. La estructura se verificó por análisis por RMN ^{1}H (500 MHz) y ^{13}C (125 MHz) y se caracterizó adicionalmente por espectrometría de masas MALDI, dando M-H en modo negativo a m/z 440 como se esperaba.
d) Preparación de microburbujas rellenas con gas que comprenden DSPS, un lipopéptido que contiene atenolol y un derivado lipófilo de captoprilo para aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas
Una solución de propilenglicol al 1,4%/glicerol al 2,4% (1,0 ml) se añadió a una mezcla de DSPS (4,5 mg) y los productos de (b) (0,5 mg) y (c) en un vial. La mezcla se sonicó durante 5 minutos y después se calentó a 80ºC durante 5 minutos (vial agitado durante el calentamiento) y se enfrió. El espacio de cabeza se lavó abundantemente con gas perfluorobutano y el vial se agitó en una mezcladora con tapa durante 45 segundos, posteriormente los contenidos se lavaron exhaustivamente con agua desionizada. La espectrometría de masas MALDI no mostró un nivel detectable de compuesto de (b) o (c) en la solución de lavado final. La incorporación de los compuestos (b) y (c) en las microburbujas se confirmó por MALDI-MS de la siguiente manera: aproximadamente 50 \mul de microburbujas se transfirieron a un vial limpio que contenía aproximadamente 100 \mul de metanol al 90%. La mezcla se sonicó durante 30 segundos y se analizó por MALDI-MS (matriz ACH), dando picos M+H que corresponden a estructuras (b) y (c) respectiva-
mente.
e) Análisis in vitro
Las microburbujas se ensayaron en el ensayo in vitro detallado en el Ejemplo 21. Se observó una acumulación gradual de microburbujas que se unían a las células.
Ejemplo 63 Microburbujas rellenas con gas que comprenden DSPS y un derivado de colesterol de atenolol para aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas a) Síntesis de 4-[(2,3-epoxi)propoxi]-fenilacetato de metilo
Una mezcla de 4-hidroxifenilacetato de metilo (4,98 g, 0,030 mol), epiclorhidrina (23,5 ml, 0,30 mol) y piridina (121 \mul, 1,5 mmol) se agitó a 85ºC durante 2 horas. La mezcla de reacción se enfrió, y el exceso de epiclorhidrina se extrajo por destilación (rotavapor). El residuo se recogió en acetato de etilo, se lavó con salmuera y se secó (Na_{2}SO_{4}). La solución se filtró y se concentró. El residuo oscuro se cromatografió (sílice, hexano/acetato de etilo 7:3) para dar 2,25 g (34%) de un aceite incoloro. Los espectros de RMN ^{1}H (300 MHz) y ^{13}C (75 MHz) fueron de acuerdo con la estructura.
b) Síntesis de 4-[2-hidroxi-3-[(1-metiletil)amino]propoxi]fenilacetato de metilo
Una mezcla de 4-[(2,3-epoxi)propoxi]fenilacetato de metilo (2,00 g, 9,00 mmol), isopropilamina (23 ml, 0,27 mol) y agua (1,35 ml, 74,7 mmol) se agitó a temperatura ambiente durante una noche. La mezcla de reacción se concentró (rotavapor) y el residuo oleoso se disolvió en cloroformo y se secó (Na_{2}SO_{4}). La filtración y la concentración dieron un rendimiento cuantitativo de un aceite amarillo que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional. La estructura se verificó por análisis por RMN ^{1}H y ^{13}C.
c) Síntesis de clorhidrato del ácido 4-[2-hidroxi-3-[(1-metiletil)amino]propoxi]fenilacético
Una solución de 4-[2-hidroxi-3-[(1-metiletil)amino]propoxi]fenilacetato de metilo (563 mg, 2,00 mmol) en ácido clorhídrico 6 M (15 ml) se calentó a 100ºC durante 4 horas. La mezcla de reacción se concentró (rotavapor) y el residuo se recogió en agua y se liofilizó. Los espectros de RMN ^{1}H y ^{13}C fueron de acuerdo con la estructura y la espectrometría de masas MALDI dio un M+H a 268 como se esperaba.
d) Síntesis de ácido N-Boc-4-[2-hidroxi-3-[(1-metiletil)amino]propoxi]fenilacético
Una solución del clorhidrato del ácido 4-[2-hidroxi-3-[(1-metiletil)amino]propoxi]fenilacético (2,0 mmol) en agua (2 ml) se añadió a una solución de bicarbonato sódico (0,60 g, 7,2 mmol) en agua/dioxano (2:1, 15 ml). Se añadió una solución de dicarbonato de di-terc-butilo (0,48 g, 2,2 mmol) en dioxano (5 ml). El progreso de la reacción se controló por análisis por TLC (sílice, CHCl_{3}/MeOH/AcOH 85:10:5), y se añadieron porciones de bicarbonato de di-terc-butilo hasta que se completó la conversión. La mezcla de reacción se vertió en agua saturada con hidrogenosulfato de potasio y el material orgánico se extrajo en acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con agua y salmuera, se secó (Na_{2}SO_{4}) y se filtró para dar 0,6 g del material bruto. El producto se purificó por cromatografía (sílice, CHCl_{3}/MeOH/AcOH 85:10:5). La solución se concentró y el residuo se recogió en ácido acético glacial y se liofilizó. Rendimiento 415 mg (56%), sólido blanco. La estructura se confirmó por análisis por RMN ^{1}H y ^{13}C.
e) Síntesis de N-Boc-\beta-alaninato de colesterilo
Se añadió DIC (510 \mul) a una solución de Boc-\beta-Ala-OH (1,25 g, 6,60 mmol) en diclorometano (15 ml) en una atmósfera inerte. La mezcla de reacción se agitó durante 30 minutos y después se transfirió a un matraz que contenía una solución de colesterol (1,16 g, 3,00 mmol) y DMAP (367 mg, 3,00 mmol) en diclorometano (15 ml). La mezcla de reacción se agitó durante 2 horas y después se vertió en una solución acuosa de hidrogenosulfato de potasio. Después de la separación de fases se extrajo la fase acuosa con cloroformo. Las fases orgánicas combinadas se lavaron con hidrogenosulfato de potasio acuoso y agua y se secaron (MgSO_{4}). Después de la filtración y la evaporación el producto bruto se cromatografió (sílice, cloroformo/metanol 99:1) para dar 1,63 g (97%) de sólido blanco. La estructura se confirmó por ^{1}H RMN (500 MHz).
f) Síntesis de clorhidrato de \beta-alaninato de colesterilo
Una solución de compuesto de (a) (279 mg, 0,500 mmol) en ácido clorhídrico 1 M en 1,4-dioxano (5 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. La mezcla de reacción se concentró para dar a rendimiento cuantitativo de clorhidrato de \beta-alaninato de colesterilo. La estructura se confirmó por análisis por ^{1}H RMN (500 MHz) y por espectrometría de masas MALDI, dando un pico M+Na a 482, esperado 481.
g) Síntesis de N-Boc-4-[2-hidroxi-3-[(1-metiletil)amino]propoxi]fenilacetil-\beta-alaninato de colesterilo
A una solución de ácido N-Boc-4-(2-hidroxi-3-[(1-metiletil)amino]propoxi]fenilacético (55 mg, 0,15 mmol) y clorhidrato de \beta-alaninato de colesterilo (74 mg, 0,15 mmol) en DMF (5 ml) se añadió DIEA (26 ml, 0,15 mmol). Se añadieron HOBt (23 mg, 0,15 mmol) y carbodiimida soluble en agua (WSC) (29 mg, 0,15 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante una noche y después se vertió en agua (25 ml) que contenía carbonato sódico (2,5 g) y cloruro sódico (4,0 g). El material precipitado se extrajo en cloroformo. La fase orgánica se lavó con agua y se secó (MgSO_{4}). Después de la filtración y la concentración, el material bruto (132 mg) se purificó por cromatografía en columna (sílice, cloroformo/metanol/ácido acético, 95:4:1). Las fracciones combinadas se concentraron, se recogieron en ácido acético glacial y se liofilizaron. Rendimiento 83 mg (69%), sólido amarillo-blanco. La estructura se confirmó por análisis por ^{1}H RMN.
h) Síntesis de trifluoroacetato de 4-[2-hidroxi-3-[(1-metiletil)amino]propoxi]fenilacetil]-\beta-alaninato de colesterilo
A una solución de N-Boc-4-[2-hidroxi-3-[(1-metiletil)amino]propoxi]fenilacetil-\beta-alaninato (40 mg, 0,05 mmol) en diclorometano seco (4 ml) se añadió ácido trifluoroacético (2 ml). La mezcla de reacción se agitó durante 2 horas y después se concentró. El producto se liofilizó en una mezcla de acetonitrilo/agua para dar un rendimiento cuantitativo de material blanco-amarillo. El producto se caracterizó por espectrometría de masas MALDI dando M+H a 708 como se esperaba.
i) Preparación de microburbujas rellenas con gas que comprenden DSPS y un derivado de colesterol de atenolol para aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas
Una solución de propilenglicol al 1,4%/glicerol al 2,4% (1,0 ml) se añadió a una mezcla de DSPS (4,5 mg) y el producto de (h) (0,5 mg) en un vial. La mezcla se sonicó durante 5 minutos y después se calentó a 80ºC durante 5 minutos (vial agitado durante el calentamiento) y se enfrió. El espacio de cabeza se lavó abundantemente con gas perfluorobutano y el vial se agitó en una mezcladora con tapa durante 45 segundos, posteriormente los contenidos se lavaron exhaustivamente con agua desionizada, la espectrometría de masas MALDI no mostró un nivel detectable de compuesto de (b) en la solución de lavado final. La incorporación de compuesto de (h) en las microburbujas se confirmó por espectrometría de masas MALDI.
i) Análisis in vitro
Las microburbujas se ensayaron en el ensayo in vitro detallado en el Ejemplo 21. Se observó una acumulación gradual de burbujas que se unían a las células.
Ejemplo 64 Preparación de microburbujas rellenas con gas recubiertas con transferrina/avidina multiespecíficas para formación de imágenes por ultrasonidos dirigidas
Este ejemplo se refiere a la preparación de microburbujas que contienen vectores para ultrasonidos/terapia dirigidos.
a) Síntesis de una molécula lipídica funcionarizada con tiol: Dipalmitoil-Lys-Lys-Lys-Aca-Cys-OH
63
La estructura lipídica mostrada anteriormente se sintetizó en un sintetizador de péptidos automático ABI 433A partiendo de una resina Fmoc-Cys(Trt)-Wang en una escala de 0,25 mmol usando cartuchos de 1 mmol de aminoácido. Todos los aminoácidos y el ácido palmítico se preactivaron usando química de acoplamiento con HBTU. La retirada simultánea del péptido de la resina y la desprotección de los grupos protectores de la cadena lateral se realizó en TFA que contenía EDT al 5% y H_{2}O al 5% durante 2 horas, dando un rendimiento del producto bruto de 250 mg. La purificación por HPLC preparativa de una alícuota de 40 mg de material bruto se realizó usando un gradiente del 90 al 100% de B durante 50 minutos (A = TFA al 0,1%/agua y B = MeOH) a un caudal de 9 ml/min. Después de la liofilización, se obtuvieron 24 mg de material puro (HPLC analítica, gradiente del 70-100% de B donde B = TFA al 0,1%/acetonitrilo, A = TFA al 0,01%/agua: detección - UV 214 nm - tiempo de retención del producto = 23 minutos). La caracterización adicional del producto se realizó usando espectrometría de masas MALDI: esperado M+H a 1096, encontrado a 1099.
b) Preparación de microburbujas que contienen gas que comprenden DSPS "dopado" con una estructura lipídica que contiene tiol
DSPS (4,5 mg) y la estructura lipídica de (a) anterior (0,5 mg) se pesaron en un vial limpio y se añadieron 0,8 ml de una solución que contenía propilenglicol al 1,4%/glicerol al 2,4% en agua. La mezcla se calentó a 80ºC durante 5 minutos (vial agitado durante el calentamiento) y se filtró mientras aún estaba caliente a través de un filtro de 40 micrómetros. La muestra se enfrió a temperatura ambiente y el espacio de cabeza se lavó abundantemente con gas perfluorobutano. El vial se agitó en una mezcladora con tapa durante 45 segundos y después se puso en una mesa vibratoria durante una noche. Las microburbujas resultantes se lavaron varias veces con agua desionizada y se analizaron para la incorporación de grupo tiol usando Reactivo de Ellman.
c) Modificación de transferrina y avidina con fluoresceína-NHS y Sulfo-SMPB
A una mezcla de 2 mg de transferrina (Holo, humana) y 2 mg de avidina en PBS (1 ml) se añadió 0,5 ml de una solución de DMSO que contenía 1 mg de Sulfo-SMPB y 0,5 mg de fluoresceína-NHS. La mezcla se agitó durante 45 minutos a temperatura ambiente, después se pasó a través de una columna Sephadex 200 usando PBS como eluyente. La fracción proteica se recogió y se almacenó a 4ºC antes de su uso.
d) Conjugación de microburbujas con transferrina/avidina modificada
A las microburbujas que contienen tiol de (b) se añadió 1 ml de la solución de proteína transferrina/avidina modificada de (c). Después de ajustar el pH de la solución a 9, se dejó que la reacción de conjugación transcurriera durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de un lavado exhaustivo con agua desionizada las microburbujas se analizaron mediante un contador Coulter (81% entre 1 y 7 micrómetros) y microscopía de fluorescencia (se observaron microburbujas altamente fluorescentes).
Ejemplo 65 Transferencia génica por microburbujas rellenas con gas
Este ejemplo se refiere a la preparación de microburbujas dirigidas para transferencia génica.
a) Preparación de microburbujas rellenas con gas que comprenden DSPS y lipopéptido recubierto con poli-L-lisina
DSPS (4,5 mg) y lipopéptido del Ejemplo 41 (0,5 mg) se pesaron en dos viales de 2 ml. A cada vial, se añadieron 0,8 ml de propilenglicol/glicerol (4%) en agua. Cada solución se calentó a 80ºC durante 5 minutos, se agitó y después se enfrió a temperatura ambiente, posteriormente los espacios de cabeza se lavaron abundantemente con perfluorobutano. Los viales se agitaron en una mezcladora con tapa a 4450 oscilaciones/minuto durante 45 segundos y se pusieron sobre una mesa vibratoria durante 5 minutos. El contenido de los viales se mezcló y la muestra resultante se lavó por centrifugación a 2000 rpm durante 5 minutos. El infranadante se retiró y se añadió el mismo volumen de agua destilada. El procedimiento de lavado se repitió una vez. Se disolvió HBr de poli-L-lisina (20,6 mg) en 2 ml de agua, después se preparó una alícuota (0,4 ml) hasta 2 ml con agua. A 1,2 ml de la solución de poli-L-lisina se añadieron 0,12 ml de la suspensión de microburbujas DSPS-lipopéptido. Después de la incubación, se retiró el exceso de polilisina por lavado exhaustivo con agua.
b) Transfección de células
Se cultivaron células endoteliales (ECV 304) en placas de 6 pocillos a una capa subconfluente uniforme. Se preparó una mezcla de transfección constituida por 5 \mug de ADN (un vector de Proteína Fluorescente Verde Potenciada de CLONTECH) y 50 \mul de suspensión de microburbujas de (a) en medio RPMI a un volumen final de 250 \mul. La mezcla se dejó reposar durante 15 minutos a temperatura ambiente después se añadió 1 ml de medio RPMI completo. El medio se retiró de la placa de cultivo celular y se añadió la mezcla de ADN-microburbujas a las células. Las células se incubaron en incubadora de cultivo celular (37ºC).
c) Tratamiento con ultrasonidos
Después de 15 minutos de incubación, se expusieron los pocillos seleccionados a ultrasonidos de onda continua de 1 MHz, 0,5 W/cm^{2}, durante 30 segundos.
d) Incubación y examen
Las células se incubaron adicionalmente en la incubadora de cultivo celular (37ºC) durante aproximadamente 4,5 horas. El medio que contenía ADN-microburbujas se retiró después por aspiración, y se añadieron 2 ml de medio RPMI completo. Las células se incubaron durante 40-70 horas antes del examen. La mayoría del medio se retiró después y las células se examinaron por microscopía de fluorescencia. Los resultados se compararon con los resultados de experimentos de control en los que se añadió ADN o ADN-poli-lisina a las células.
Ejemplo 66 Flotación de células endoteliales por microburbujas con vectores que se unen específicamente a las células endoteliales
Este experimento se realizó para demostrar que la presente invención puede usarse para la separación de células a las que las microburbujas están dirigidas. La línea celular endotelial humana ECV 304, obtenida de un cordón umbilical normal (ATCC CRL-1998) se cultivó en matraces de cultivo Nunc (chutney 153732) en medio RPMI 1640 al que se añadieron L-glutamina (200 mM), penicilina/estreptomicina (10,000 U/ml y 10,00 \mug/ml) y suero de ternera fetal al 10%. Las células se subcultivaron después de tratamiento con tripsina con una proporción de división de 1:5 a 1:7 cuando alcanzaron la confluencia. Se añadieron 2 millones de células de los cultivos confluentes tratados con tripsina a cada conjunto de cinco tubos de centrífuga. Después se añadieron microburbujas de control o microburbujas de unión a las células endoteliales, producidas como se ha descrito en el Ejemplo 21 y en el Ejemplo 38, a 2, 4, 6, 8 o 10 millones de burbujas por tubo. Las células en la parte inferior de los tubos después de centrifugación a 400 g durante 5 minutos se contaron con un contador Coulter. Se descubrió que 4 o más microburbujas de unión a una célula lleva a las células a la parte superior del fluido en el tubo de centrifugación. Todas las células se hicieron flotar por las microburbujas del Ejemplo 38 mientras que aproximadamente el 50% flotaron con las microburbujas del
Ejemplo 21.
Ejemplo 67 Microburbujas rellenas con gas de diestearoilfosfatidilserina que comprenden un lipopéptido que contienen a vector con afinidad por receptores de endotelina para la formación de imágenes por ultrasonidos dirigidas a) Síntesis de ácido 4'-[(3,4-dimetil-5-isoxazolil)-sulfamoil]succinanílico
A una solución de sulfisoxazol (267 mg, 1,00 mmol) en DMF (10 ml) se añadió anhídrido succínico (1,00 g, 10,0 mmol) y 4-dimetilaminopiridina (122 mg, 1,00 mmol). La mezcla de reacción se agitó a 80ºC durante 2 horas y después se concentró. El residuo se recogió en solución de bicarbonato sódico acuoso al 5% y se extrajo con acetato de etilo. La solución acuosa se acidificó con ácido clorhídrico diluido y el material orgánico se extrajo en acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con ácido clorhídrico diluido, agua y salmuera, se trató con carbón vegetal activo y se secó (MgSO_{4}). La solución se filtró y se concentró para dar 280 mg (76%) de sólido blanco. La estructura se verificó por espectroscopía por RMN ^{1}H (300 MHz) y ^{13}C (75 MHz). Se realizó una caracterización adicional usando espectrometría de masas MALDI (matriz ACH), dando un pico M+Na a m/z 390 y un pico M+K a m/z 406 como se esperaba.
b) Síntesis de un lipopéptido funcionalizado con sulfisoxazol
64
La estructura mostrada anteriormente se sintetizó en un aparato para burbujear nitrógeno manual partiendo de resina BMHA de Amida de Rink protegida con Fmoc en una escala de 0,125 mmol, usando aminoácidos apropiados, ácido palmítico y el compuesto de (a). El acoplamiento se realizó usando protocolos TBTU/HOBt/DIEA convencionales. La retirada simultánea del péptido de la resina y la desprotección de los grupos protectores de la cadena lateral se realizó en TFA que contenía EDT al 5% y agua al 5% durante 2 horas. El material bruto se precipitó en éter. El producto se analizó por HPLC analítica, gradiente del 70-100% de B durante 20 minutos, A = TFA al 0,1%/agua y B = TFA al 0,1%/acetonitrilo, caudal 1 ml/minuto, detección UV 214 nm, tiempo de retención 27 minutos. Se realizó una caracterización adicional usando espectrometría de masas MALDI, dando un M+H a m/z 1359, esperado
1356.
c) Preparación de microburbujas rellenas con gas que comprenden el compuesto de (b)
Una solución de propilenglicol al 1,4%/glicerol al 2,4% (1,0 ml) se añadió a una mezcla de DSPS (4,5 mg) y el producto de (b) (0,5 mg) en un vial. La mezcla se sonicó durante 5 minutos y después se calentó a 80ºC durante 5 minutos (vial agitado durante el calentamiento) y se enfrió. El espacio de cabeza se lavó abundantemente con gas perfluorobutano y el vial se agitó en una mezcladora con tapa durante 45 segundos seguido de lavado exhaustivo con agua desionizada. La espectrometría de masas MALDI no mostró un nivel detectable de compuesto de (b) en la solución de lavado final. La incorporación de lipopéptido que contiene isoxazol en las microburbujas se confirmó por MALDI-MS de la siguiente manera: aproximadamente 50 \mul de microburbujas se transfirieron a un vial limpio que contenía aproximadamente 100 \mul de metanol al 90%. La mezcla se sonicó durante 30 segundos y se analizó por MALDI-MS (matriz ACH), dando un pico M+H a m/z 1359 que corresponde a lipopéptido (b).

Claims (34)

  1. \global\parskip0.950000\baselineskip
    1. Un agente de diagnóstico y/o terapéuticamente activo dirigible que comprende una suspensión en un vehículo líquido acuoso de un informador que comprende microburbujas rellenas con gas estabilizadas por monocapas de tensioactivo de formación de películas, comprendiendo adicionalmente dicho agente al menos un vector.
  2. 2. Un agente de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el gas comprende aire, nitrógeno, oxígeno, dióxido de carbono, hidrógeno, un gas inerte, un fluoruro de azufre, hexafluoruro de selenio, un hidrocarburo de bajo peso molecular, una cetona, un éster, un hidrocarburo de bajo peso molecular halogenado o una mezcla de los anteriores.
  3. 3. Un agente de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el gas comprende una cetona perfluorada, éter perfluorado o perfluorocarburo.
  4. 4. Un agente de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el gas comprende hexafluoruro de azufre o un perfluoropropano, perfluorobutano o perfluoropentano.
  5. 5. Un agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el material tensioactivo de formación de películas comprende un material tensioactivo de formación de paredes no polimérico y no polimerizable, un material tensioactivo polimérico o un fosfolípido.
  6. 6. Un agente de acuerdo con la reivindicación 5, en el que al menos el 75% del material tensioactivo de formación de películas comprende moléculas fosfolipídicas que albergan individualmente una carga global neta.
  7. 7. Un agente de acuerdo con la reivindicación 6, en el que al menos un 75% del material tensioactivo de formación de películas comprende uno o más fosfolípidos seleccionados entre fosfatidilserinas, fosfatidilgliceroles, fosfatidilinositoles, ácidos fosfatídicos y cardiolipinas.
  8. 8. Un agente de acuerdo con la reivindicación 7, en el que al menos un 80% de dichos fosfolípidos comprende fosfatidilserinas.
  9. 9. Un agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el material tensioactivo de formación de películas comprende un lipopéptido.
  10. 10. Un agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el vector se selecciona entre anticuerpos; moléculas de adhesión celular; receptores de moléculas de adhesión celular; citoquinas; factores de crecimiento; hormonas peptídicas y trozos de las mismas; agonistas/antagonistas no peptídicos y agentes de unión no bioactivos de receptores de moléculas de adhesión celular, citoquinas, factores de crecimiento y hormonas peptídicas; oligonucleótidos y oligonucleótidos modificados; fármacos de unión a ADN; sustratos/inhibidores de proteasa; moléculas generadas a partir de bibliotecas combinatorias; y moléculas bioactivas pequeñas.
  11. 11. Un agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el vector o vectores tienen afinidad por las dianas a un nivel tal que el agente interacciona con pero no se une de manera fija a dichas dianas.
  12. 12. Un agente de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el vector o vectores se seleccionan entre ligandos para proteínas de adhesión celular y proteínas de adhesión celular que tienen ligandos correspondientes en superficies de células endoteliales.
  13. 13. Un agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el vector o vectores se colocan de modo que no se exponen fácilmente a la diana.
  14. 14. Un agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el vector está acoplado o unido covalentemente al informador.
  15. 15. Un agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el vector está acoplado o unido al informador a través de interacciones de carga electrostática.
  16. 16. Un agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el vector está acoplado o unido al informador por medio de interacciones avidina-biotina y/o estreptavidina-biotina.
  17. 17. Un agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes que contiene adicionalmente restos que son radiactivos o son eficaces como agentes de contraste por rayos X, sondas de formación de imágenes por luz y marcadores de espín.
  18. 18. Un agente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende adicionalmente un compuesto terapéutico.
  19. 19. Un agente de acuerdo con la reivindicación 18, en el que dicho compuesto terapéutico es un agente antineoplásico, producto sanguíneo, modificador de la respuesta biológica, agente antifúngico, hormona o análogo hormonal, vitamina, enzima, agente antialérgico, inhibidor del factor tisular, inhibidor de plaquetas, inhibidor de dianas proteicas de coagulación, inhibidor de formación de fibrina, promotor de fibrinolisis, agente antiangiogénico, fármaco de la circulación, potenciador metabólico, agente antituberculoso, antiviral, vasodilatador, antibiótico, anti-inflamatorio, antiprotozoario, antirreumático, narcótico, opiáceo, glicósido cardiaco, bloqueante neuromuscular, sedante, anestésico local, anestésico general o material genético.
  20. 20. Un agente de acuerdo con la reivindicación 18 o reivindicación 19, en el que dicho compuesto terapéutico está acoplado o unido covalentemente al informador a través de grupos disulfuro.
  21. 21. Un agente de acuerdo con la reivindicación 18 o reivindicación 19, en el que un compuesto terapéutico lipófilo o derivatizado de manera lipófila está unido a las monocapas del tensioactivo estabilizando las microburbujas rellenas con gas del informador a través de interacciones hidrófobas.
  22. 22. Una formulación combinada que comprende:
    i) una primera composición administrable que comprende un vector de pre-dirección que tiene afinidad por una diana seleccionada; y
    ii) una segunda composición administrable que comprende un agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, comprendiendo dicho agente un vector que tiene afinidad por dicho vector de pre-dirección.
  23. 23. Una formulación combinada de acuerdo con la reivindicación 22, en la que dicho vector de pre-dirección es un anticuerpo monoclonal.
  24. 24. Una formulación combinada que comprende:
    i) una primera composición administrable que comprende un agente de acuerdo con cualquiera de las 1 a 21, y
    ii) una segunda composición administrable que comprende una sustancia capaz de desplazar o liberar dicho agente de su diana.
  25. 25. Una formulación combinada que comprende:
    i) una primera composición administrable que comprende un agente de acuerdo con la reivindicación 20; y
    ii) una segunda composición administrable que comprende un agente reductor capaz de escindir en condiciones reductoras los grupos disulfuro acoplando o uniendo el compuesto terapéutico e informador en el agente de dicha primera composición administrable.
  26. 26. Un proceso para la preparación de un agente de diagnóstico y/o terapéuticamente activo dirigible como se define en la reivindicación 1, que comprende acoplar o unir al menos un vector a un informador que comprende microburbujas rellenas con gas estabilizadas por monocapas de tensioactivo de formación de películas o generando microburbujas informadoras rellenas con gas usando tensioactivo de formación de películas que tiene al menos un vector unido al mismo.
  27. 27. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 26, en el que también se combina un compuesto terapéutico con el informador.
  28. 28. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 27, en el que el compuesto terapéutico que contiene grupos tiol está unido a monocapas de tensioactivo que contiene un grupo tiol que estabilizan las microburbujas rellenas con gas del informador por reacción en condiciones oxidativas para generar grupos disulfuro.
  29. 29. Un agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 para su uso como agente de contraste.
  30. 30. Un agente de acuerdo con la reivindicación 29 para su uso como agente de contraste dirigible.
  31. 31. Un agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 29 a 30 para su uso como agente de contraste para formación de imágenes por ultrasonidos, resonancia magnética, rayos X, radiografía o luz dirigible.
  32. 32. Un agente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21 para su uso en una composición terapéutica.
  33. 33. Un método para la investigación in vitro la dirección por un agente, como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en el que las células que expresan una diana se colocan de manera fijada en una cámara de flujo, se pasa una suspensión de dicho agente en un vehículo líquido a través de dicha cámara, y se examina la unión de dicho agente a dichas células.
  34. 34. Un método de acuerdo con la reivindicación 33, en el que el caudal del vehículo líquido se controla para estimular la velocidad de rotura encontrada in vivo.
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