ES2263501T3 - Procedimiento y composiciones que utilizan quinazolinonas. - Google Patents

Abstract

Un compuesto de fórmula 1a (Ver fórmula) en la que: (1) R1 es bencilo; R2 es etilo; R2¿ es hidrógeno; R3 es 2-fluorofenilo; R4 es 2-dimetilaminoetilo; R5-R8 son hidrógeno. (2) R1 es bencilo; R2 es etilo; R2¿ es hidrógeno; R3 es 3-fluorofenilo; R4 es 2-dimetilaminoetilo; R5-R8 son hidrógeno. (3) R1 es bencilo; R2 es etilo; R2¿ es hidrógeno; R3 es 4-fluorofenilo; R4 es 2-dimetilaminoetilo; R5-R8 son hidrógeno.

Description

Procedimientos y composiciones que utilizan quinazolinonas.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a derivados de la quinazolinona que son inhibidores de la quinesina KSP mitótica y son útiles en el tratamiento de las enfermedades proliferativas celulares, por ejemplo cáncer, hiperplasias, restenosis, hipertrofia cardiaca, trastornos inmunes e inflamación.

Antecedentes de la invención

El interés en la química médica de los derivados de la quinazolina se estimuló a principios de los años 50 con la elucidación de la estructura de un alcaloide de la quinazolina, la 2-[\beta-ceto-gamma-(3-hidroxi-2-piperidil)-propil]-4-quinazolona, procedente de una planta de Asia conocida por sus propiedades antimalaria. En una búsqueda para encontrar otros agentes antimalaria, se han sintetizado diversas quinazolinas sustituidas. De particular importancia fue la síntesis del derivado 2-metil-3-o-tolil-4-(3H)-quinazolinona. Este compuesto, conocido por el nombre de metaqualona, se piensa que no es efectivo frente a los protozoos, se encontró que era un potente hipnótico.

Desde la introducción de la metaqualona y su descubrimiento como hipnótico, se ha investigado la actividad farmacológica de las quinazolinonas y los compuestos relacionados. Se sabe ahora que las quinazolinonas y los derivados de las mismas tienen una amplia variedad de propiedades biológicas entre las que se incluyen las actividades hipnóticas, sedativas, analgésicas, anticonvulsivas, antitusivas y las antiinflamatorias.

Los derivados de la quinazolinona para los cuales se han descrito usos biológicos específicos incluyen la Patente de los Estados Unidos Nº 5.147.875 que describe las 2-(fenilo sustituido)-4-oxo quinazolinas con actividad broncodilatadora. Las Patentes de los Estados Unidos N^{os} 3.723.432, 3.740.442, y 3.925.548 describen una clase de derivados 1-sustituido-4-aril-2(1H)-quinazolinona útiles como gentes antiinflamatorios. La publicación de patente europea EP 0 056 637 B1 reivindica una clase de derivados 4(3H)-quinazolinona para el tratamiento de la hipertensión. La publicación de patente europea EP 0 884 319 A1 describe las composiciones farmacéuticas de derivados de quinazolin-4-ona usados para tratar trastornos del sistema nervioso periférico y central inducidos por el alcohol y los fármacos y neurodegenerativos, y psicotrópicos.

Las quinazolinonas están entre un número creciente de agentes terapéuticos usados para tratar trastornos proliferativos celulares, entre los que se incluye el cáncer. Por ejemplo, el Documento PCT WO 96/06616 describe una composición farmacéutica que contiene un derivado de quinazolinona para inhibir la proliferación celular uniforme vascular. El Documento PCT WO 96/19224 usa el mismo derivado de quinazolinona para inhibir la proliferación celular mesengial. Las Patentes de los Estados Unidos N^{os} 4.981.856, 5.081.124 y 5.280.027 describen el uso de derivados de quinazolinona para inhibir la timidilato sintasa, el enzima que cataliza la metilación de la monofosfato desoxiuridina para producir monofosfato de timidina, que se necesita para la síntesis del ADN. Las Patentes de los Estados Unidos N^{os} 5.747.498 y 5.773.476 describen derivados de quinazolinona usados para tratar cánceres caracterizados por la sobreactividad o actividad inapropiada de los receptores de las tirosina quinasas. La Patente de los Estados Unidos Nº 5.037.829 reivindica las composiciones de quinazolina (1H-azol-1-ilmetil) sustituidas para tratar carcinomas que se producen en las células epiteliales. El Documento PCT WO 98/34613 describe una composición que contiene un derivado de quinazolinona útil para atenuar la neovascularización y para tratar malignidades. La Patente de los Estados Unidos 5.187.167 describe composiciones farmacéuticas que comprenden derivados de quinazolin-4-ona que poseen actividad antitumoral.

Otros agentes terapéuticos usados para tratar el cáncer incluyen los taxanos y los alcaloides de la vinca. Los taxanos y los alcaloides de la vinca actúan sobre los microtúbulos, que están presentes en una variedad de estructuras celulares. Los microtúbulos son los elementos estructurales primarios del huso mitótico. El huso mitótico es el responsable de la distribución de las copias replicadas del genoma en cada una de las dos células hijas que resultan de la división celular. Se presume que la interrupción del huso mitótico por estos fármacos da como resultado la inhibición de la división de células cancerosas y la inducción de la muerte de las células cancerosas. Sin embargo, los microtúbulos forman otros tipos de estructuras celulares, que incluyen vías para el transporte intracelular en los procesos nerviosos. Debido a que estos agentes no se dirigen de manera específica a los husos mitóticos, tienen efectos secundarios que limitan su utilidad.

Son de considerable interés las mejoras en la especificidad de los agentes usados para tratar el cáncer debido a los beneficios terapéuticos que podrían obtenerse si pudieran reducirse los efectos asociados con la administración de estos agentes. De manera tradicional, las grandes mejoras en el tratamiento del cáncer se asocian con la identificación de los agentes terapéuticos que actúan a través de mecanismos nuevos. Los ejemplos de esto no incluyen únicamente los taxanos, sino también la clase captotecina de los inhibidores de la topoisomerasa I. A partir de estas perspectivas, las quinesinas mitóticas son objetivos atractivos para los nuevos agentes anticancerosos.

Las quinesinas mitóticas son enzimas esenciales para la unión y funcionamiento del huso mitótico, pero no forman parte por lo general de otras estructuras de microtúbulos, tales como en los procesos nerviosos. Las quinesinas mitóticas juegan papeles esenciales durante todas las fases de la mitosis. Estos enzimas son "motores moleculares" que transforman la energía liberada por la hidrólisis del ATP en fuerza mecánica que controla el movimiento direccional de los productos celulares a lo largo de los microtúbulos. La región catalítica suficiente para esta tarea es una estructura compacta de aproximadamente 340 aminoácidos. Durante la mitosis, las quinesinas organizan los microtúbulos en la estructura bipolar que es el huso mitótico. Las quinesinas median en el movimiento de los cromosomas a lo largo de los microtúbulos del huso, así como en los cambios estructurales en el huso mitótico asociados con las fases específicas de la mitosis. La perturbación experimental de la función de la quinosina mitótica que produce la malformación o disfunción del huso mitótico, da como resultado frecuentemente un bloqueo en el ciclo celular y la muerte celular.

Entre las quinesinas mitóticas que se han identificado está la KSP. La KSP pertenece a una subfamilia de las quinesinas evolutivamente conservada de motores microtubulares dirigidos al extremo positivo que se ensamblan en el interior de homotetrámeros bipolares constituidos por homodímeros antiparalelos. Durante la mitosis, la KSP se asocia con los microtúbulos del huso mitótico. La microinyección de anticuerpos dirigidos contra la KSP en células humanas evita la separación de los polos del huso durante la prometafase, dando lugar a husos monopolares y produciendo el bloqueo mitótico y la inducción de la muerte celular programada. La KSP y las quinesinas relacionadas en otros organismos no humanos disponen en un haz los microtúbulos antiparalelos y los deslizan entre sí, forzando de esta manera los dos husos polares a separarse. La KSP puede también mediar en la elongación de los haces en la anafase B y focalizar los microtúbulos en el polo del haz.

Se ha descrito la KSP humana (denominada también HsEg5) [Blangy y col., Cell, 83:1159-69 (1995); Whitehead, y col., Artritis Rheum., 39:1635-42 (1996); Galgio y col., J. Cell. Biol., 135:339-414 (1996); Blangy, y col., J Biol. Chem., 272:19418-24 (1997); Blangy, y col., Cell Motil Cytoskeleton, 40:174-82 (1998); Whitehead y Rattner, J. Cell Sci., 111:2551-61 (1998); Kaiser, y col., JBC 274:18925-31 (1999); números de acceso al GenBank: X85137, NM004523 y U37426], y se ha descrito un fragmento del gen KSP (TRIP5) [Lee, y col., Mol Endocrinol., 9:243-54 (1995); número de acceso al GenBank L40372]. Se ha informado de la KSP homóloga de Xenopus (Eg5), así como de la KLP61 F/KRP1 30 de Drosophila.

Las quinesinas mitóticas son objetivos atractivos para el descubrimiento y desarrollo de nuevos quimioterapéuticos mitóticos. De acuerdo con esto, es un objetivo de la presente invención proporcionar procedimientos y composiciones útiles en la inhibición de la KSP, una quinesina mitótica.

Resumen de la invención

De acuerdo con los objetivos detallados anteriormente, la presente invención proporciona composiciones y procedimientos que se pueden usar para tratar enfermedades de células proliferantes. Las composiciones son inhibidores de la KSP, de manera particular, inhibidores de la KSP humana.

En un aspecto, la invención se refiere al uso de algunos derivados de quinazolinona para la fabricación de un medicamento para tratar las enfermedades proliferativas celulares, para tratar los trastornos asociados con la actividad de la quinesina KSP, y para la inhibición de la quinesina KSP. Los compuestos se escogen entre el grupo constituido por:

1

y

(1) R_{1} es bencilo; R_{2} es etilo; R_{2'} es hidrógeno; R_{3} es 2-fluorofenilo; R_{4} es 2-dimetilaminoetilo; R_{5}-R_{8} son hidrógeno.

(2) R_{1} es bencilo; R_{2} es etilo; R_{2'} es hidrógeno; R_{3} es 3-fluorofenilo; R_{4} es 2-dimetilaminoetilo; R_{5}-R_{8} son hidrógeno.

(3) R_{1} es bencilo; R_{2} es etilo; R_{2'} es hidrógeno: R_{3} es 4-fluorofenilo; R_{4} es 2-dimetilaminoetilo; R_{5}-R_{8} son hidrógeno.

(4) R_{1} es bencilo; R_{2} es etilo; R_{2'} es hidrógeno; R_{3} es 3-bromofenilo; R_{4} es 2-dimetilaminoetilo; R_{5}-R_{8} son hidrógeno.

(5) R_{1} es bencilo; R_{2} es etilo; R_{2'} es hidrógeno; R_{3} es 4-bromofenilo; R_{4} es 2-dimetilaminoetilo; R_{5}-R_{8} son hidrógeno.

(6) R_{1} es bencilo; R_{2} es etilo; R_{2'} es hidrógeno; R_{3} es 1-naftilo; R_{4} es 2 dimetilaminoetilo; R_{5}-R_{8} son hidrógeno.

(7) R_{1} es bencilo; R_{2} es metilo; R_{2'} es hidrógeno; R_{3} es 3-bromofenilo; R_{4} es 2-dimetilaminoetilo; R_{5}-R_{8} son hidrógeno.

(8) R_{1} es bencilo; R_{2} es metilo; R_{2'} es hidrógeno; R_{3} es 4-bromofenilo; R_{4} es 2-dimetilaminoetilo; R_{5}-R_{8} son hidrógeno.

(9) R_{1} es bencilo; R_{2} es metilo; R_{2'} es hidrógeno; R_{3} es 4-bromofenilo; R_{4} es 2-aminoetilo; R_{5}-R_{8} son hidrógeno.

(10) R_{1} es bencilo; R_{2} es etilo; R_{2'} es hidrógeno; R_{3} es 4-bromofenilo; R_{4} es 2-aminoetilo; R_{5}-R_{8} son hidrógeno.

(11) El isómero R en el que R_{1} es bencilo; R_{2} es etilo; R_{2'} es hidrógeno; R_{3} es 4-bromofenilo; R_{4} es 2-dimetilaminoetilo; R_{5}-R_{8} son hidrógeno.

(12) El isómero R en el que R_{1} es bencilo; R_{2} es etilo; R_{2'} es hidrógeno; R_{3} es 1 naftilo; R_{4} es 2-dimetilaminoetilo; R_{5}-R_{8} son hidrógeno.

(13) El isómero R en el que R_{1} es bencilo; R_{2} es etilo; R_{2'} es hidrógeno; R_{3} es 4-bromofenilo; R_{4} es 2-dimetilaminoetilo; R_{5}-R_{8} son hidrógeno.

(14) El isómero R en el que R_{1} es bencilo; R_{2} es etilo; R_{2'} es hidrógeno; R_{3} es 4-bromofenilo; R_{4} es 2-aminoetilo; R_{5}; R_{6} y R_{8} son hidrógeno y R_{7} es cloro

o una sal farmacéuticamente aceptables.

Las enfermedades y trastornos que responden a la terapia con compuestos de la invención incluyen cáncer, hiperplasia, restenosis, hipertrofia cardiaca, trastornos inmunes e inflamación.

En otro aspecto, la invención se refiere a compuestos útiles para la inhibición de la quinesina KSP. Los compuestos tienen las estructuras que se muestran anteriormente.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona procedimientos de selección para compuestos que podrían enlazar con una quinesina KSP, por ejemplo, compuestos que podrían desplazar o competir con el enlace de las composiciones de la invención. Los procedimientos comprenden combinar un compuesto marcado de la invención, una quinesina KSP, y al menos un agente candidato, y determinar el enlace del agente bioactivo candidato con la quinesina KSP.

En un aspecto adicional, la invención proporciona procedimientos para la selección de moduladores de la actividad de la quinesina KSP. Los procedimientos comprenden combinar una composición de la invención, una quinesina KSP, y al menos un agente candidato, y determinar el efecto del agente bioactivo candidato sobre la actividad de la quinesina KSP.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 representa un esquema sintético genérico para fabricar las quinazolinonas de la invención.

La Figura 2 representa una ruta sintética para la síntesis de inhibidores KSP de la quinazolinona.

La Figura 3 representa las estructuras químicas representativas de los inhibidores KSP de la quinazolinona.

La Figura 4 representa una ruta sintética para los enantiómeros únicos puros de las quinazolinonas.

La Figura 5 representa rutas sintéticas para algunas quinazolinonas.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se dirige a una clase de nuevos compuestos, basados en un núcleo de la estructura de quinazolinona, que son moduladores de las quinesinas mitóticas. Inhibiendo o modulando las quinesinas mitóticas, pero no otras quinesinas (por ejemplo, quinesinas de transporte), se lleva a cabo la inhibición específica de la proliferación celular. De esta manera, la presente invención se aprovecha del hallazgo que la perturbación de la función de la quinesina mitótica produce malformación o disfunción de los husos mitóticos, dando como resultado frecuentemente un bloqueo del ciclo celular y la muerte celular. Los procedimientos para inhibir una quinesina KSP humana comprenden poner en contacto un inhibidor de la invención con una quinesina KSP, de manera particular las quinesinas KSP humanas, que incluyen fragmentos y variantes de KSP. La inhibición puede ser de la actividad de la hidrólisis del ATP de la quinesina KSP y/o la actividad de la formación del huso, tal que se interrumpen los husos mitóticos. Se pueden interrumpir también los husos meióticos.

Un objetivo de la presente invención es desarrollar inhibidores y moduladores de las quinesinas mitóticas, en particular KSP, para el tratamiento de los trastornos asociados con la proliferación celular. Tradicionalmente, se han asociado las grandes mejoras en el tratamiento del cáncer, un tipo de trastorno proliferativo celular, con la identificación de los agentes terapéuticos que actúan a través de mecanismos nuevos. Los ejemplos de esto incluyen no sólo la clase taxano de agentes que parecen actuar sobre la formación de microtúbulos, sino también la clase camptotecina de inhibidores de la topoisomerasa I. Las composiciones y procedimientos descritos en el presente documento pueden diferir en su selectividad, y se usan de manera preferible para tratar enfermedades de las células proliferantes entre las que se incluyen, pero no se limitan a cáncer, hiperplasias, restenosis, hipertrofia cardiaca, trastornos inmunes e inflamación.

De acuerdo con esto, la presente invención se refiere a procedimientos que emplean quinazolinona amidas de fórmula Ia:

2

en la que R_{1}-R_{8} son tal como se han definido anteriormente.

La mayor parte de los compuestos descritos en el presente documento contienen centros asimétricos (por ejemplo el carbono al cual se unen R_{2} y R_{2}') y de esta manera dan lugar a formas estereoisómeras que se pueden definir, en términos de estereoquímica absoluta, como (R)- o (S)-. Se entiende que la presente invención incluye todos los mencionados isómeros posibles, que incluyen mezclas racémicas, formas óptimamente puras y las mezclas intermedias. Se pueden preparar los isómeros (R)- y (S)- óptimamente activos usando sintones quirales o reactivos quirales, o resolverse usando técnicas convencionales. Igualmente, se pretende que se incluyan también todas las formas
tautómeras.

Pueden resolverse cuando se desee los isómeros R- y S- por procedimientos conocidos por aquellos expertos en la técnica, por ejemplo, mediante la formación de sales diasterómeras o complejos que se pueden separar, por ejemplo, mediante cristalización; mediante la formación de derivados diasterómeros que se pueden separar, por ejemplo, mediante cristalización, cromatografía gas-líquido o cromatografía líquida; reacción selectiva de un enantiomero con un reactivo específico de enantiómeros, por ejemplo la oxidación enzimática o la reducción, seguida por la separación de los enantiómeros modificados o sin modificar; o cromatografía gas-líquido o líquido en medio ambiente quiral, por ejemplo sobre un soporte quiral, tal como sílice con un ligando quiral enlazado o en presencia de un solvente quiral. Se apreciará que cuando el enantiomero deseado se convierte en otra entidad química mediante uno de los procedimientos de separación descritos anteriormente, se puede necesitar una etapa adicional para liberar la forma enantiómera deseada. De manera alternativa, se puede sintetizar el enantiomero deseado mediante síntesis asimétrica usando reactivos óptimamente activos, sustratos, catalizadores o solventes, o convirtiendo un enantiomero en otro mediante transformación asimétrica. En la Figura 4 se muestra un ejemplo de una síntesis a partir de materiales de partida ópticamente activos.

Los compuestos de la invención se sintetizan como se reseña a continuación, utilizando técnicas bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, tal como se describe en Ager y col., J. of Med. Chem.- 20:379-386 (1977) incorporado por referencia en el presente documento, se pueden obtener las quinazolinonas mediante condensación catalizada de ácidos N-acilantranílicos con aminas aromáticas primarias. Se describen otros procedimientos para la preparación de quinazolinonas en las Solicitudes de Patentes de los Estados Unidos 5.783.577, 5.922.866 y 5.187.167, todas las cuales se incorporan por referencia.

Se pueden fabricar los compuestos de la invención tal como se muestra en las Figuras 1, 2, 5 y 5. Los compuestos de fórmula Id se fabrican de manera análoga a la figura 1, excepto en que el haluro de acilo de la etapa final se sustituye por un haluro de alquilo.

Una vez fabricadas, las composiciones de la invención encuentran uso en una variedad de aplicaciones. Como se apreciará por aquellos expertos en la técnica, se puede alterar la mitosis en una variedad de vías; esto es, se puede afectar la mitosis aumentando o disminuyendo la actividad de un componente en la ruta mitótica. Dicho de otra forma, se puede afectar la mitosis (por ejemplo, romper) perturbando el equilibrio, inhibiendo o activando algunos componentes. Se pueden usar hipótesis similares para alterar la meiosis.

En una forma de realización preferida, las composiciones de la invención son útiles para modular la formación del huso mitótico, produciendo de esta manera un bloqueo prolongado en el ciclo celular en la mitosis. Por "modular" en el presente documento alterar la formación del huso mitótico, incluyendo el aumento y la disminución en la formación del huso. Por "formación del huso mitótico" en el presente documento se entiende la organización de los microtúbulos en estructuras bipolares mediante las quinesinas mitóticas. Por "disfunción del huso mitótico" en el presente documento se entiende el bloqueo mitótico y la formación del huso monopolar.

Las composiciones de la invención son útiles para enlazar y/o modular la actividad de la quinesina mitótica, KSP. En una forma de realización preferida, la KSP es una KSP humana, aunque se puede usar también la quinesina KSP procedente de otros organismos. En este contexto, modular significa aumentar o disminuir la separación de los polos del huso, produciendo la malformación, es decir, ensanchando los polos del huso mitótico, o de otra manera, produciendo la perturbación morfológica del huso mitótico. Incluidas también dentro de la definición de la KSP para estos objetivos están las variantes y/o fragmentos de la KSP: Véase la Solicitud de Patente de los Estados Unidos "Methods of Screening for Modulators of Cell Proliferation and Methods of Diagnosing Cell Proliferation Status", presentada el 27 de Oct. de 1999 (Documento de los Estados Unidos con Número de Serie 09/428.156) incorporado por referencia en el presente documento en su totalidad. De manera adicional, se pueden usar en la presente invención otras quinesinas mitóticas. Sin embargo, se han mostrado las composiciones de la invención por tener especificidad por la KSP.

Para el ensayo de la actividad, se enlaza por lo general la KSP o un compuesto de acuerdo con la invención de manera no difusible con un soporte insoluble que tiene zonas aisladas receptoras de la muestra (por ejemplo, una placa de microvaloración, una matriz, etc). El soporte insoluble puede fabricarse de cualquier composición a la cual se puedan enlazar las composiciones, se separe fácilmente del material soluble, y sea por otra parte compatible con el procedimiento global de selección. La superficie de dichos soportes puede ser sólida o porosa y de cualquier forma conveniente. Los ejemplos de soportes insolubles adecuados incluyen placas de microvaloración, matrices, membranas y perlas. Estas se fabrican normalmente de vidrio, plástico (por ejemplo, poliestireno), polisacáridos, nylon o nitrocelulosa, Teflon^{TM}, etc. Las placas de microvaloración y las matrices son especialmente convenientes debido a que se pueden llevar a cabo un gran número de ensayos de manera simultánea, usando pequeñas cantidades de reactivos y muestras. No es crucial la manera particular de enlazar la composición de tal manera que sea compatible con los reactivos y los procedimientos globales de la invención, que mantenga la actividad de la composición y no sea difusible. Los procedimientos preferidos de enlace incluyen el uso de anticuerpos (que no bloquean estéricamente el emplazamiento de enlace del ligando o la secuencia de activación cuando la proteína se enlaza con el soporte), enlazando de manera directa a los soportes iónicos o "pegajosos", el entrecruzamiento químico, la síntesis de la proteína o el agente sobre la superficie, etc. Tras el enlace de la proteína o el agente, el exceso de material no enlazado se elimina mediante lavado. Las zonas que reciben la muestra pueden bloquearse a continuación mediante incubación con albúmina de suero bovino (BSA), caseína u otras proteínas inocuas u otra fracción.

Se pueden usar los agentes antimicóticos de la invención por sí mismos para modular la actividad de una quinesina mitótica, de manera particular la KSP. En esta forma de realización, los agentes mitóticos de la invención se combinan con la KSP y se evalúa la actividad de la KSP. Se conoce la actividad de la quinesina en la técnica e incluye una o más actividades de la quinesina. Las actividades de la quinesina incluyen la capacidad de afectar la hidrólisis del ATP; el enlace de los microtúbulos; el deslizamiento y la polimerización/despolimerización (efectos sobre la dinámica de los microtúbulos); el enlace con otras proteínas del huso; el enlace con la proteínas implicadas en el control del ciclo celular; sirviendo como sustrato para otros enzimas; tales como las quinasas o las proteasas; y las actividades celulares específicas de la quinesina tales como la separación de los polos del huso.

Se conocen bien los procedimientos para llevar a cabo los ensayos de motilidad por aquellos expertos en la técnica [véase por ejemplo, Hall, y col. (1996), Biophys. J., 71:3467-3476, Turner y col., 1996. AnaL Biochem. 242 (1): 20-5; Gittes y col., 1996, Biophys. J. 70(1): 418-29; Shirakawa y col., 1995, J. Exp. BioL 198: 1809-15; Winkelmann y col., 1995, Biophys. J. 68: 2444-53; Winkelmann y col., 1995, Biophys. J. 68: 72S].

Se pueden usar también los procedimientos conocidos en la técnica para determinar la actividad de la hidrólisis de la ATPasa. De manera preferible se utilizan ensayos basados en la solución. La solicitud de los Estados Unidos 09/314.464 presentada el 18 de mayo de 1999, incorporada por referencia en el presente documento en su totalidad, describe dichos ensayos. De manera alternativa se usan procedimientos convencionales. Por ejemplo, se puede cuantificar la liberación de P_{i} a partir de la quinesina. En una forma de realización preferida, el ensayo de actividad de la hidrólisis de la ATPasa utiliza PCA (ácido perclórico) 0,3 M y reactivo verde malaquita (molibdato de sodio II 8,27 mM, oxalato verde de malaquita 0,33 mM, y Triton X-1 00 0,8 mM). Para llevar a cabo el ensayo, se detienen súbitamente 10 \mul de la reacción en 90 \mul de PCA 0,3 M frío. Se usan los estándares de fosfato de tal manera que se pueden convertir en mM de fosfato inorgánico liberado. Cuando se han detenido súbitamente todas las reacciones y los estándares en PCA, se añaden 100 \mul de reactivo verde de malaquita a los pocillos relevantes en por ejemplo una placa de microvaloración. Se desarrolla la mezcla durante 10-15 minutos y se lee la placa a una absorbancia de 650 nm. Si se usan los estándares de fosfato, se pueden convertir las lecturas de la absorbancia en mM de P_{i} y representarse gráficamente durante el tiempo. De manera adicional, los ensayos de ATPasa conocidos en la técnica incluyen el ensayo de la luciferasa.

Se puede usar también la actividad ATPasa de las regiones motor de la quinesina para monitorizar los efectos de los agentes de modulación. En una forma de realización se llevan a cabo los ensayos ATPasa de la quinesina en ausencia de microtúbulos. En otra forma de realización, se llevan a cabo los ensayos ATPasa en presencia de microtúbulos. Se pueden detectar diferentes tipos de agentes de modulación en los ensayos anteriores. En una forma de realización preferida, el efecto del agente de modulación es independiente de la concentración de microtúbulos y ATP. En otra forma de realización, se puede disminuir el efecto de los agentes sobre la ATPasa de la quinesina aumentando la concentraciones de ATP, los microtúbulos o ambos. En otra forma de realización más, se aumenta el efecto del agente de modulación aumentando las concentraciones del ATP, los microtúbulos o ambos.

A continuación se pueden seleccionar in vivo los agentes que modulan la actividad bioquímica de la KSP in vitro. Los procedimientos para dichos agentes in vivo incluyen los ensayo de distribución del ciclo celular, la viabilidad celular, o la presencia, morfología, actividad, distribución, o cantidad de husos mitóticos. Son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica los procedimientos para monitorizar la distribución del ciclo celular de una población celular, por ejemplo, mediante citometría de flujo, ya que son los procedimientos para determinar la viabilidad celular. Véase por ejemplo, la Solicitud de Patente de los Estados Unidos "Methods of Screening for Modulators of Cell Proliferation and Methods of Diagnosing Cell Proliferation Status" presentada el 22 de Oct de 1999, con número de serie 09/428.156, incorporada por referencia en el presente documento en su totalidad.

De manera adicional a los ensayos descritos anteriormente, son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica los procedimientos microscópicos para monitorizar la formación y malformación del huso (véase, por ejemplo, Whitehead y Rattner (1998), J. Cell Sci. 111:2551-61; Galgio y col, (1996) J. Cell Biol., 135: 399-414).

Las composiciones de la invención inhiben la quinesina KSP. Una medida de la inhibición es la IC_{50}, definida como la concentración de la composición a la cual la actividad de la KSP disminuye un cincuenta por ciento. Las composiciones preferidas tienen una IC_{50} menor de aproximadamente 1 mM, con formas de realización preferidas que tienen IC_{50} menores de aproximadamente 100 \muM, con más formas de realización preferidas que tienen IC_{50} menores de aproximadamente 10 \muM, con formas de realización particularmente preferidas que tienen IC_{50} menores de aproximadamente 1 \muM, y formas de realización especialmente preferidas que tienen IC_{50} menores de aproximadamente 100 nM, y con las formas de realización más preferidas que tienen IC_{50} menores de aproximadamente 10 nM. Se lleva a cabo la medida de IC_{50} usando un ensayo de ATPasa.

Otra medida de la inhibición es la K_{i}. Para compuestos con IC_{50} menores de 1 \muM, se define la K_{i} o K_{d} como la constante de la velocidad de disociación para la interacción de la quinazolinona con KSP. Los compuestos preferidos tienen las K_{i} menores de aproximadamente 100 \muM, con formas de realización preferidas que tienen K_{i} menores de aproximadamente 10 \muM y formas de realización particularmente preferidas que tienen K_{i} menores de aproximadamente 1 \muM y formas de realización especialmente preferidas que tienen K_{i} menores de aproximadamente 100 nM, y con las formas de realización más preferidas que tienen K_{i} menores de aproximadamente 10 nM. Se determina la K_{i} para un compuesto a partir de la IC_{50} basándose en tres suposiciones. En primer lugar, únicamente una molécula de compuesto enlaza con el enzima y no existe cooperatividad. Segundo, se conocen las concentraciones del enzima activo y del compuesto ensayado (es decir, no existen cantidades significativas de impurezas o formas inactivas en las preparaciones). Tercero, la velocidad enzimática del complejo enzima - inhibidor es cero. Los datos de la velocidad (es decir, la concentración del compuesto) se ajustan de la ecuación:

V = V_{max}E_{0} \left[I - \frac{(E_{0} + I_{0} + Kd) - \sqrt{(E_{0} + I_{0} + Kd)^{2} - 4E_{0}I_{0}}}{2E_{0}}\right]

En la que V es la velocidad observada, V_{max} es la velocidad del enzima libre, I_{0} es la concentración del inhibidor, E_{0} es la concentración del enzima, y K_{d} es la constante de disociación del complejo inhibidor del enzima.

Otra medida de la inhibición es GI_{50} definido como la concentración del compuesto que da como resultado una disminución en la velocidad del crecimiento celular en un cincuenta por ciento. Los compuestos preferidos tienen GI_{50} menores de aproximadamente 1 mM. El nivel de preferencia de las formas de realización es una función de su GI_{50}: se prefieren más aquellos que tienen GI_{50} menores de aproximadamente 20 \muM: más todavía aquellos que tienen GI_{50} de 10 \muM; más todavía aquellos que tienen GI_{50} menores de aproximadamente 1 \muM; más todavía aquellos que tienen GI_{50} de 100 nM, incluso más todavía aquellos que tienen GI_{50} menores de aproximadamente 10 nm. Se llevan a cabo las medidas de GI_{50} usando un ensayo de proliferación celular.

Las composiciones de la invención se usan para tratar enfermedades de proliferación celular. Los estados de enfermedad que se pueden tratar mediante los procedimientos y composiciones proporcionados en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, cáncer (descrito de manera adicional a continuación), enfermedad autoinmune, artritis, rechazo al injerto, enfermedad inflamatoria del intestino, proliferación inducida tras procedimientos médicos, que incluye, pero no se limita a, cirugía, angioplastia, y similares. Se apreciará que en algunos casos las células no estarán en estado de hiper o hipo proliferación (estado anormal) y requieren tratamiento adicional. Por ejemplo, durante la sanación de la herida, las células pueden estar proliferando "normalmente", pero se puede desear la mejora de la proliferación. De manera similar, tal como se ha descrito anteriormente, en el campo agrícola, las células pueden estar en estado normal, pero se puede desear la modulación de la proliferación para mejorar un cultivo mediante la mejora directa del crecimiento de un cultivo, o inhibiendo el crecimiento de una planta u organismo que afecta de manera adversa el cultivo. De esta manera, en una forma de realización, la invención del presente documento incluye la aplicación a las células o individuos afectados o impedir la afección de uno cualquiera de estos trastornos o estados.

Las composiciones y procedimientos proporcionados en el presente documento se consideran particularmente útiles para el tratamiento del cáncer que incluye los tumores sólidos tales como los de la piel, seno, cerebro, carcinomas cervicales, carcinomas testiculares, etc. De manera más particular, los cánceres que se pueden tratar mediante las composiciones y procedimientos de la invención incluyen, pero no se limitan a: Cardíacos: sarcoma (angiosarcoma, fibrosarcoma, rabdomiosarcoma, liposarcoma), mixoma, rabdomioma, fibroma, lipoma y teratoma; Pulmón: carcinoma broncogénico (células escamosas, pequeñas células sin diferenciar, grandes células sin diferenciar, adenocarcinoma) carcinoma alveolar (bronquiolar), adenoma bronquial, sarcoma, linfoma, amartoma condromatoso, mesotelioma; Gastrointestinal: esófago (carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma, leiomiosarcoma, linfoma), estómago (carcinoma, linfoma, leiomiosarcoma), páncreas (adenocarcinoma ductal, insulinota, glucagnoma, gastrónoma, tumores carcinoideos, vipoma), intestino delgado (adenocarcinoma, linfoma, tumores carcinoideos, sarcoma de Karposi, leiomioma, hemangioma, lipoma, neurofibroma, fibroma), intestino grueso (adenocarcinoma, adenoma tubular, adenoma velloso, hamartoma, leiomioma); Tracto genitourinario: riñón (adenocarcinoma, tumor de Wilms [nefroblastoma], linfoma, leucemia), vejiga y uretra (carcinoma celular escamoso), testículos (seminoma, teratoma, carcinoma embrional, teratocarcinoma, coriocarcinoma, sarcoma, carcinoma celular intersticial, fibroma, fibroadenoma, tumores adenomatoideos, lipoma); Hígado: hematoma (carcinoma hepatocelular), colangiocarcinoma, hepatoblastoma, angiosarcoma, adenoma hepatocelular, hemangioma; Hueso: sarcoma osteogénico (osteosarcoma), fibrosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, condrosarcoma, sarcoma de Swing, linfoma maligno (sarcoma del retículo celular), mieloma múltiple, cordoma del tumor celular gigante maligno, osteocronfroma (exostosis osteocartilaginosa), condroma benigno, condroblastoma, condromixofibroma, osteoma osteoide y tumores celulares gigantes; Sistema nervioso: cráneo (osteoma, hemangioma, granuloma, xantoma, osteitis deformante), meninges (meningioma, meningiosarcoma, gliomatosis), cerebro (astrocitoma, meduloblastoma, glioma, ependimoma, germinoma [pinealoma], glioblastoma multiforme, oligodendroglioma, schwannoma, retinoblastoma, tumores congénitos), neurofibroma de la médula espinal, meningioma, glioma, sarcoma; Ginecológicos: útero (carcinoma endometrial), cérviz (carcinoma cervical, displasia cervical pretumoral, ovarios (carcinoma de ovarios [cistadenocarcinoma seroso, cistadenocarcinoma mucoso, carcinoma sin clasificar], tumores celulares granulosa tecales, tumores celulares de Sertoli-Leydig, disgerminoma, teratoma maligno), vulva (carcinoma celular escamoso, carcinoma intraepitelial, adenocarcinoma, fibrosarcoma, melanoma), vagina, carcinoma celular transparente, carcinoma celular escamoso, sarcoma botrioide (rabdomiosarcoma embrional], trompas de Falopio (carcinoma); Hematológico: sangre (leucemia mieloide [aguda y crónica], leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, enfermedades mieloproliferativas, mieloma múltiple, síndrome mielodisplástico), enfermedad de Hodgkin, linfoma no-Hodgkin [linfoma maligno]; Piel: melanoma maligno, carcinoma celular basal, carcinoma celular escamoso, sarcoma de Karposi, pecas de naevus displásico, lipoma, angioma, dermatofibroma, queloides, psoriasis; y Glándulas adrenales: neuroblastoma. De esta manera, el término "célula cancerosa" tal como se proporciona en el presente documento, incluye cualquier célula afectada por una cualquiera de las dolencias anteriormente identificadas.

De acuerdo con esto, las composiciones de la invención se administran a las células. Por "administrar" se entiende en el presente documento la administración de una dosis terapéuticamente efectiva de los agentes mitóticos de la invención a una célula en un cultivo celular o en un paciente. Por "dosis terapéuticamente efectiva" se entiende en el presente documento una dosis que produce los efectos para los cuales esta se administra. La dosis exacta dependerá del objetivo del tratamiento y será verificable por una persona experta en la técnica usando las técnicas conocidas. Como se conoce en la técnica, pueden ser necesarios ajustes para la liberación sistémica frente a la local, edad, peso corporal, salud general, sexo, dieta, tiempo de administración, interacción del fármaco y gravedad de la dolencia, y será verificable con la experimentación rutinaria por aquellas personas expertas en la técnica. Por "células" se entiende en el presente documento casi cualquier célula en la que se pueda alterar la mitosis o la meiosis.

Un "paciente" para los objetivos de la presente invención incluye tanto a los seres humanos como a otros animales, de manera particular los mamíferos, y otros organismos. De esta manera, los procedimientos son aplicables en terapia humana y aplicaciones veterinarias. En la forma de realización preferida el paciente es un mamífero, y en la forma de realización más preferida, el paciente es un ser humano.

Se pueden administrar a un paciente los agentes mitóticos que tienen la actividad farmacológica deseada en un vehículo fisiológicamente aceptable, tal como se describe en el presente documento. Dependiendo de la manera de introducción, se pueden formular los compuestos en una variedad de formas tal como se describe a continuación. Puede variar la concentración del compuesto terapéuticamente activo entre aproximadamente un 0,1-100% en peso. Se pueden administrar los agentes solos o en combinación con otros tratamientos, es decir, radiación, u otros agentes quimioterapéuticos.

En una forma de realización preferida, la composición farmacéutica está en forma soluble en agua, tal como las sales farmacéuticamente aceptables, que se entiende que incluyen las sales de adición tanto de ácido como de base. "Sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas sales que retienen la efectividad biológica de las bases libres y que no son biológicamente o de otra manera indeseables, formadas con ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico y similares, y ácidos orgánicos tales como ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido maleico, ácido masónico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinnámico, ácido mandélico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido p-toluén sulfónico, ácido salicílico y similares. Las "sales de adición de base farmacéuticamente aceptables" incluyen aquellas derivadas de bases inorgánicas tales como sales de sodio, potasio, litio, amonio, calcio, magnesio, hierro, zinc, cobre, manganeso, aluminio y similares. Las sales derivadas de bases no tóxicas orgánicas farmacéuticamente aceptables incluyen sales de aminas primarias, secundarias y terciarias, aminas sustituidas que incluyen aminas sustituidas que se producen de manera natural, aminas cíclicas y resinas de intercambio iónico básicas, tales como isopropilamina, trimetilamina, dietilamina, trietilamina, tripropilamina, y etanolamina.

Se pueden preparar las composiciones farmacéuticas de diversas formas, tales como gránulos, comprimidos, píldoras, supositorios, cápsulas, suspensiones, pomadas, lociones y similares. Se pueden usar los vehículos orgánicos o inorgánicos de calidad farmacéutica y/o los diluyentes adecuados para uso oral y tópico para fabricar composiciones que contienen los compuestos terapéuticamente activos. Los diluyentes conocidos en la técnica incluyen el medio acuoso, los aceites vegetales y animales y las grasas. Se pueden usar como agentes auxiliares los agentes estabilizantes, humectantes y emulsificantes, las sales para variar la presión osmótica o los tampones para asegurar un valor de pH adecuado, y los mejoradores de la penetración en la pie. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir también una o más de las siguientes: proteínas de transporte tales como albúmina de suero; tampones; rellenos tales como celulosa microcristalina, lactosa, maíz y otros almidones; agentes de enlace; endulzantes y otros agentes aromatizantes; agentes coloran-
tes; y polietilén glicol. Son bien conocidos en la técnica los aditivos, y se usan en una variedad de formulaciones.

Se puede llevar a cabo la administración de los agentes mitóticos de la presente invención por una variedad de rutas tal como se ha descrito anteriormente, entre las que se incluyen, pero no se limitan a, oral, subcutánea, intravenosa, intranasal, transdermal, intraperitoneal, intramuscular, intrapulmonar, vaginal, rectal, o intraocularmente. En algunos ejemplos, por ejemplo, en el tratamiento de heridas e inflamación, se pueden aplicar los agentes antimicóticos de manera directa como una solución o spray.

Para emplear los compuestos de la invención en un procedimiento de selección de compuestos que enlazan con la quinesina KSP, se enlaza la KSP con un soporte, y se añade al ensayo un compuesto de la invención (que es un agente mitótico). De manera adicional, se añade el compuesto de la invención que se enlaza con el soporte y la KSP. Las clases de compuestos entre las cuales se pueden buscar los nuevos agentes de enlace incluyen anticuerpos específicos, agentes de enlace no naturales identificados en selecciones de bibliotecas químicas, análogos de péptidos, etc. De particular interés son los ensayos de selección de agentes candidatos que tienen una baja toxicidad para las células humanas. Se pueden usar una amplia variedad de ensayos con este objetivo que incluyen ensayos de enlace proteína-proteína in vitro marcados, ensayos de desplazamiento de movilidad electroforética, inmunoensayos para enlace de proteínas, ensayos funcionales (ensayos de fosforilación, etc.) y similares.

Se puede llevar a cabo la determinación del enlace del agente mitótico con la KSP por numerosos caminos. En una forma de realización preferida, se marca el agente mitótico (el compuesto de la invención), por ejemplo, con una fracción fluorescente o radioactiva y se determina el enlace de manera directa. Por ejemplo, puede llevarse esto a cabo ligando toda o una porción de la KSP con un soporte sólido, añadiendo un agente mitótico marcado (por ejemplo un compuesto de la invención en el que se ha sustituido al menos un átomo por un isótopo detectable), eliminando el reactivo en exceso, y determinando si la cantidad de marca es la que está presente sobre el soporte sólido. Se pueden usar diversas etapas de bloqueo y lavado tal como se conoce en la técnica.

Por "marcado" se entiende en el presente documento que el compuesto está marcado de manera directa o indirecta con una marca que proporciona una señal detectable, por ejemplo, un radioisótopo, etiqueta fluorescente, enzima, anticuerpos, partículas tales como partículas magnéticas, etiquetas quimioluminiscentes, o moléculas de enlace específicas, etc. Las moléculas de enlace específicas incluyen parejas, tales como biotina y estreptavidina, digoxina y antidigoxina, etc. Para los miembros de enlace específicos, podría marcarse normalmente el miembro complementario con una molécula que se proporciona para la detección, de acuerdo con procedimientos conocidos, como se ha detallado anteriormente. La marca puede proporcionar de manera directa o indirecta una señal detectable.

En algunas formas de realización, únicamente está marcado uno de los componentes. Por ejemplo, se pueden marcar las proteínas quinesinas en las posiciones de la tirosina usando ^{125}I, o con fluoróforos. De manera alternativa, se puede marcar más de un componente con diferentes marcas; usando ^{125}I para las proteínas, por ejemplo, y un fluoróforo para los agentes mitóticos.

Se pueden usar también los compuestos de la invención como competidores para seleccionar los candidatos de fármacos adicionales. "Agente bioactivo candidato" o "fármaco candidato" o los equivalentes gramáticos tal como se usan en el presente documento describen cualquier molécula, por ejemplo, una proteína, un oligopéptido, pequeñas moléculas orgánicas, un polisacárido, polinucleótido, etc, que se va a ensayar respecto de su bioactividad. Pueden ser capaces de alterar de manera directa o indirecta el fenotipo de la proliferación celular o la expresión de una secuencia de proliferación celular, que incluye secuencias de ácido nucleico y secuencias de proteína. En otros casos, se selecciona la alteración de la proliferación celular del enlace de la proteína y/o la actividad. Se pueden llevar a cabo selecciones de este tipo en presencia o ausencia de microtúbulos. En el caso en el que se seleccione el enlace de la proteína o la actividad, las formas de realización preferidas excluyen las moléculas ya conocidas por enlazar con la de la proteína concreta, por ejemplo, las estructuras de polímero tales como los microtúbulos, y las fuentes de energía tales como el ATP. Las formas de realización de los ensayos en el presente documento incluyen agentes candidatos que no enlazan la proteína de proliferación celular en su estado nativo endógeno denominado en el presente documento como agentes "exógenos". En otra forma de realización preferida, los agentes exógenos excluyen de manera adicional los anticuerpos para la KSP.

Los agentes candidatos pueden abarcar numerosas clases químicas, aunque normalmente son moléculas orgánicas, de manera preferible pequeños compuestos orgánicos que tienen un peso molecular de más de 100 y menos de aproximadamente 2.500 daltons. Los agentes candidatos comprenden grupos funcionales necesarios para la interacción estructural con las proteínas, de manera particular, enlaces de hidrógeno y enlaces lipófilos, y normalmente incluyen al menos un grupo amina, carbonilo, hidroxilo, éter, o carboxilo, de manera preferible al menos dos grupos químicos funcionales. Los agentes candidatos comprenden a menudo estructuras de carbono cíclico o heterocíclico y/o estructuras aromáticas o poliaromáticas sustituidas con uno o más de los grupos funcionales anteriores. Se encuentran también agentes candidatos entre las biomoléculas que incluyen péptidos, sacáridos, ácidos grasos, esteroides, purinas, pirimidinas, derivados, análogos estructurales o las combinaciones de los mismos. Particularmente preferidos son los péptidos.

Se obtienen los agentes candidatos de una amplia variedad de fuentes entre las que se incluyen bibliotecas de compuestos sintéticos o naturales, Por ejemplo están disponibles numerosos medios para la síntesis dirigida y aleatoria de una amplia variedad de compuestos orgánicos y biomoléculas, que incluyen la expresión de oligonucleótidos aleatorizados. De manera alternativa, están disponibles o se producen fácilmente las bibliotecas de compuestos naturales en forma de extractos de bacterias, hongos, plantas y animales. De manera adicional, se modifican fácilmente las bibliotecas y los compuestos producidos de manera natural o sintética a través de medios químicos, físicos y bioquímicos. Se pueden someter los agentes farmacológicos conocidos a modificaciones químicas dirigidas o aleatorias, tales como la acilación, alquilación, esterificación, acidificación para producir análogos estructurales.

Se pueden llevar a cabo ensayos de selección competitiva combinando la KSP y un fármaco candidato en una primera muestra. Una segunda muestra comprende un agente mitótico, la KSP y un fármaco candidato. Esto se puede llevar a cabo en presencia o ausencia de microtúbulos. El enlace del fármaco candidato se determina para ambas muestras, y un cambio, o diferencia en el enlace entre las dos muestras indica la presencia de un agente capaz de enlazar con la KSP y modular de manera potencial su actividad. Esto es, si el enlace del fármaco candidato es diferente en la segunda muestra en relación con la primera muestra, el fármaco candidato es capaz de enlazar con la KSP.

En una forma de realización preferida, el enlace del agente candidato se determina mediante el uso de los ensayos de enlace competitivo. En esta forma de realización el competidor es una fracción del enlace conocida por enlazar con la KSP, tal como un anticuerpo, péptido, compañero de enlace, ligando, etc. Bajo ciertas circunstancias puede ser competitivo el enlace entre el agente candidato y la fracción de enlace, desplazando la fracción de enlace al agente candidato.

En una forma de realización se marca el agente candidato. El agente candidato, el competidor, o ambos, se añaden en primer lugar a la KSP durante un tiempo suficiente para permitir el enlace, si se presenta. Se pueden llevar a cabo las incubaciones a cualquier temperatura que facilite la actividad óptima, normalmente entre 4 y 40ºC.

Se seleccionan los períodos de incubación para la actividad óptima, pero se pueden también optimizar para facilitar una selección muy rápida con un rendimiento elevado. Será suficiente normalmente entre 0,1 y 1 hora. El exceso de reactivo se descarta por lo general o se elimina por lavado. A continuación se añade el segundo componente y se sigue la presencia o ausencia del componte marcado para indicar el enlace.

En una forma de realización preferida, se añade en primer lugar el competidor, seguido por el agente candidato. El desplazamiento del competidor es una indicación de que el agente candidato se enlaza con la KSP y es capaz de esta manera de enlazar con, y modular potencialmente, la actividad de la KSP. En esta forma de realización, se puede marcar cualquier componente. De esta manera, por ejemplo, si se marca el competidor, la presencia de la marca en la solución de lavado indica el desplazamiento por el agente. De manera alternativa, si se marca el agente candidato, la presencia de la marca sobre el soporte indica el desplazamiento.

En una forma de realización alternativa, se añade en primer lugar el agente candidato, con incubación y lavado, seguida por el competidor. La ausencia de enlace por el competidor puede indicar que el agente candidato se enlaza con la KSP con una mayor afinidad. De esta manera, si se marca el agente candidato, la presencia de la marca sobre el soporte, acoplada con una carencia de enlace del competidor, puede indicar que el agente candidato es capaz de enlazar con la KSP.

Puede ser valioso identificar el emplazamiento de enlace con la KSP, Esto se puede llevar a cabo por una variedad de medios. En una forma de realización, una vez que se ha identificado la KSP como enlace con el agente mitótico, se fragmenta o modifica la KSP y se repiten los ensayos para identificar los componentes necesarios para el enlace.

Se ensaya la modulación seleccionando los agentes candidatos capaces de modular la actividad de la KSP que comprende las etapas de combinar un agente candidato con la KSP, tal como anteriormente, y determinar una alteración en la actividad biológica de la KSP. De esta manera, en esta forma de realización, el agente candidato deberá enlazarse a la vez con la KSP (aunque esto puede no ser necesario), y alterar su actividad biológica o bioquímica tal como se define en el presente documento. Los procedimientos incluyen los procedimientos de selección de células in vitro e in vivo para las alteraciones en la distribución del ciclo celular, la viabilidad celular, o para la presencia, la morfología, la actividad, la distribución, o la cantidad de husos mitóticos, tal como se han destacado por lo general con anterioridad.

De manera alternativa, se puede usar la selección diferencial para identificar los fármacos candidatos que enlazan con la KSP nativa, pero no pueden enlazar con la KSP modificada.

Se pueden usar controles positivos y controles negativos en los ensayos. De manera preferible, todos los controles y muestras de ensayo se llevan a cabo al menos por triplicado para obtener resultados estadísticamente significativos. La incubación de todas las muestras se lleva a cabo durante tiempo suficiente para el enlace del agente con la proteína. Tras la incubación se lavan todas las muestras para dejarlas libres de material no enlazado de manera específica y se determina la cantidad de enlace, por lo general se determina el agente marcado. Por ejemplo, cuando se emplea una radiomarca, se pueden contar las muestras en un contador por centelleo para determinar la cantidad de compuesto enlazado.

Se pueden incluir una variedad de reactivos diferentes en los ensayos de selección. Estos incluyen las sales similares a reactivos, proteínas neutras, por ejemplo, albúmina, detergentes, etc, que se pueden usar para facilitar el enlace proteína-proteína óptimo y/o reducir las interacciones no específicas o de fondo. También se puede usar los reactivos que mejoran de otra manera la eficiencia del ensayo, tales como los inhibidores de la proteasa, los inhibidores de la nucleasa, los gentes antimicrobianos, etc. Se puede añadir la mezcla de componentes en cualquier orden que se proporcione para los requisito del enlace.

Los siguientes ejemplos ilustran los compuestos de la invención y se incluyen los compuestos relacionados con objetivos de comparación.

Ejemplos Abreviaturas y definiciones

Las siguientes abreviaturas y términos tienen los significados indicados en todo momento:

Ac

= acetilo

BNB

= ácido 4-bromometil-3-nitrobenzoico

Boc

= t-butiloxi carbonilo

Bu

= butilo

c-

= ciclo

CBZ

= carbobenzoxi = benciloxicarbonilo

DBU

= diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno

DCM

= diclorometano = cloruro de metileno = CH_{2}Cl_{2}

DCE

= dicloroetileno

DEAD

= dietil azodicarboxilato

DIC

= diisopropilcarbodiimida

DIEA

= N,N-diisopropiletil amina

DMAP

= 4-N,N-dimetilaminopiridina

DMF

= N,N-dimetilformamida

DMSO

= dimetil sulfóxido

DVB

= 1,4-divinilbenceno

EEDQ

= 2-etoxi-1-etoxicarbonil-1,2-dihidroquinolina

Et

= etilo

Fmoc

= 9-fluorenilmetoxicarbonilo

GC

= cromatografía de gases

HATU

= hexaflluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio

HMDS

= hexametildisilazano

HOAc

= ácido acético

HOBt

= hidroxibenzotriazol

Me

= metilo

Mesil

= metanosulfonilo

MTBE

= metil t-butil éter

NMO

= óxido de N-metilmorfolino

PEG

= polietilén glicol

Ph

= fenilo

PhOH

= fenol

PfP

= pentafluorofenol

PPTS

= p-toluensulfato de piridinio

Pi

= piridina

PyBrop

= hexafluorofosfato de bromo-tris-pirrolidino-fosfonio

rt

= temperatura ambiente

sat=d

= saturado

s-

= secundario

t-

= terciario

TBDMS

= t-butildimetilsililo

TES

= trietilsilano

TFA

= ácido trifluoroacético

THF

= tetrahidrofurano

TMOF

= ortoformiato de trimetilo

TMS

= trimetilsililo

Tosil

= p-toluénsulfonilo

Trt

= trifenilmetilo

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Ejemplo 1 Síntesis de compuestos

En las Figuras 1 y 2 se muestra la síntesis general

Etapa 1

Ácido N-butiril antranílico

A un matraz de fondo redondo de 500 mL con tres bocas, equipado con un termómetro, embudo de adición y una barrita de agitación magnética eficiente, se le añadió ácido antranílico (I) (0,5 moles, 68,5 g) y dimetil formamida (250 mL). Se añadió a esta solución cloruro de butirilo (0,55 moles, 57,1 mL) gota a gota a una velocidad tal que la temperatura de la mezcla no supere los 40ºC. Se agitó la suspensión vigorosamente a temperatura ambiente durante al menos 3 h más. Se vertió la mezcla en agua (2000 mL) y se agitó durante 1 h más. Se recogió el producto precipitado mediante filtración, se lavó con agua fría, y se secó bajo presión reducida sobre P_{2}O_{5}, dando como resultado el compuesto 2 (67,3 g, 65%).

Etapa 2

2-propil-3,1-[4H]benzoxazin-4-ona

Se disolvió el compuesto 2 (51,8 g, 0,25 moles) en ahídrido acético (180 mL) en un matraz de fondo redondo de 500 mL equipado con una barrita de agitación magnética, un cabezal de destilación Claisen (con entrada de vacío) y un termómetro. Se colocó el matraz en un baño de aceite y se calentó lentamente a 170-180ºC con agitación vigorosa. Se destiló lentamente el ácido acético producido bajo presión atmosférica. Se usó la monitorización de la temperatura del cabezal de la unidad de destilación para seguir el progreso de la transformación. A continuación se enfrió la mezcla de reacción a 60ºC y se eliminó el exceso de anhídrido acético mediante destilación bajo presión reducida (2,66 kPa, circa de 20 mm de Hg). Posteriormente el residuo se enfrió y el producto se cristalizó. Se trituró el producto con n-hexano (75 mL) y se aisló mediante filtración para dar como resultado 2-propil-3,1-[4H]benzoxazin-4-ona (3) (29,3 g, 62%). El procedimiento anterior proporcionó el compuesto 3 suficientemente puro para usar en la etapa siguiente.

Etapa 3

2-propil-3-bencilquinazolin-4-ona

Se sometieron a reflujo el compuesto 3 (28,4 g, 0,15 moles) y bencilamina (17,5 mL, 0,16 moles) en cloroformo (50 ml) en un matraz de fondo redondo de 250 mL de una boca durante 6 h. Tras agotamiento del compuesto 3, se evaporó el cloroformo bajo presión reducida. Se añadieron al residuo etilén glicol (100 mL) y lentejas de NaOH (0,60 g) y se equipó el matraz con un cabezal de destilación Claisen y una barrita de agitación magnética. Se sumergió el matraz en un baño de aceite y se volvió a calentar en el baño a una temperatura de 130-140ºC con agitación vigorosa y se mantuvo así durante 5 h a la vez que el agua producida se eliminaba mediante destilación. Tras el agotamiento de la reacción, se dejó enfriar la solución transparente a temperatura ambiente y se mantuvo durante toda la noche para precipitar el producto. Se ajustó el pH de la suspensión a 7-8 añadiendo HCl ac. Al 3%, se filtraron los cristales y se lavaron con agua fría, y a continuación se recristalizaron a partir de isopropanol (o de manera alternativa a partir de acetona) para proporcionar el compuesto, 2-propil-3-bencilquinazolin-4-ona (compuesto 4) (28,0 g, 67%).

Etapa 4

2-(1'-bromopropil)-3-bencilquinazolin-4-ona

A un matraz de fondo redondo de 250 mL con tres bocas, equipado con un termómetro, embudo de adición, y una barrita de agitación magnética eficiente se le añadió el compuesto 4 (27,8 g, 0,10 moles), acetato de sodio anhidro (10,0 g) y ácido acético glacial (130 mL). Se añadió a la solución anterior gota a gota bromo (16,0 g, 0,10 moles) disuelto en ácido acético (10 mL) a 40ºC durante 1-2 h. Después que estuviera completa la adición, se vertió la mezcla en agua (1500 mL) y se agitó durante 1-2 h a temperatura ambiente. Se aisló mediante filtración el producto precipitado, 2-(1'-bromopropil)-3-bencilquinazolin-4-ona (5), se lavó con agua templada para eliminar las trazas de ácido acético, y se aclaró con una pequeña cantidad de isopropanol. El secado proporcionó el compuesto 5 (33 g, 93%).

Etapa 5

2-[1'-(N,N-dimetiletiléndiamino)propil]-3-bencilquinazolin-4-ona

Se disolvieron el compuesto 5 (10,7 g, 0,03 moles) y N,N-dimetiletiléndiamina (6,6 mL, 0,06 moles) en etanol abs. (60 mL) y se calentaron a reflujo durante 6 h. Tras el agotamiento de la reacción, se evaporó el solvente bajo presión reducida. Se disolvió el residuo en diclorometano (150 mL) y se lavó con solución de NaOH ac. Al 3% (circa de 10-20 mL). Se secó la capa orgánica sobre MgSO_{4} y se evaporó hasta sequedad bajo presión reducida. Se purificó el producto oleoso restante mediante cromatografía instantánea sobre una placa de gel de sílice corto usando un eluyente de CHCl_{3}-MeOH-NH_{3} ac., 90:10:0,1 para dar el compuesto (5) deseado, 2-[1'-(N,N-dimetiletilediamino)propil]-3-bencilquinazolin-4-ona (6) (6,0 g, 55%).

Etapa 6

2-[1'-(N-4-fluorobenzoil)-(N,N-dimetiletiléndiamino)propil]-3-bencilquinazolin-4-ona

Se preparó una solución madre del compuesto 5 (1,822 g, 5,0 mmol) en CHCl_{3} calidad HPLC (0,5 mL). Se preparó una solución madre de cloruro de p-fluorobenzoílo (1602 mg, 1 mmol) en 1,2-dicloroetano (2,0 mL) calidad HPLC en un matraz volumétrico de 2,0 mL. Se preparó una tercera solución de trietilamina (2,0 mL de 0,5 M9 en 1,2-dicloroetano calidad HPLC, Se pipeteó una alícuota de 100 \mul de cada solución en un recipiente de reacción de vidrio usando un dispensador de líquido automatizado Beckman Biomet 200. Se agitó la mezcla de reacción usando un agitador mecánico, se sonicó en un baño de agua ultrasónico, y se incubó a continuación durante toda la noche a temperatura ambiente. Se diluyó la mezcla en CHCl_{3} (300 \mul) y se lavó con NaHCO_{3} acuoso al 5% y agua. Se eliminó el solvente al vacío para proporcionar el compuesto 6 (65%). Se analizó la pureza del compuesto mediante TLC eluído con CH_{2}Cl_{2}-etanol-NH_{3} acuoso concentrado, 100:10:1.

Ejemplos 2 y 3

Síntesis de los compuestos de estructura general Id

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3

Se compraron todos los solventes anhidros en la compañía química Aldrich en contenedores SureSeal®. Se compraron la mayor parte de reactivos en la Aldrich Chemical Company. Abreviaturas: DCM, diclorometano; DIEA, N,N-diisopropiletilamina; DMF, N,N-dimetilformamida; TES, trietilsilano; TFA, ácido trifluoroacético. La matriz de síntesis se llevó a cabo en viales con tapón de rosca de fondo redondo de vidrio de 15 x 75 mm contenidos en un bloque de matriz de síntesis de aluminio de 4 x 6, sellados con una membrana de caucho revestida de Teflón. Se añadieron los reactivos y se llevaron a cabo las extracciones acuosas con pipeteadores únicos o multicanal. Se llevaron a cabo las filtraciones usando bloques de filtración de 10 mL con 24 pocillos Whatman / polyfiltronics. Se llevó a cabo la evaporación de los materiales volátiles de la matriz con un Labconco Vortex Evaporator o mediante barrido con un manguito de nitrógeno de 4 x 6.

Ejemplo 2

Síntesis en fase sólida de un compuesto único

Etapa 1

Se pesó resina de 1,3-diaminopropano tritilo (Novabiochem, 1,2 mmol/g) (0,20 g, 0,24 mmol) en un vial con tapón de rosca y se añadieron 3 mL de una mezcla 1:1 de DMF y cloroformo. Se añadieron DIEA (0,130 mL, 0,73 mmol) y 2-(1'-bromopropil)-3-bencilquinazolin-4-ona (del Ejemplo 1) (0,188 , 0,48 mmol). Se selló el vial, se calentó a 70ºC y se agitó durante toda la noche. Se filtró la resina y se lavó ( 3 x DCM, 2 x MeOH, 1 x DCM, 2 x éter) y se secó bajo vacío. Se trató una alícuota de 27 mg de resina con 5:5:90 de TFA:TES:DCM durante 15 min y se filtró y evaporó la mezcla, dando como resultado 8 mg (rendimiento del 64%) de la quinazolinona diamina intermedia. El análisis LCMS mostró una pureza > del 80%.

\newpage

Etapa 2

Se bombeó la resina de la Etapa 1 en 3 mL de DCM. Se añadieron DIEA (0,130 mL, 0,72 mmol) y bromuro de 4-bromobencilo (0,12 g, 0,48 mmol). Se selló el vial y se agitó durante toda la noche. El análisis LCMS de la alícuota rota reveló una mezcla aproximada 1:1 de material de partida y producto. Se añadieron otros 0,130 mL de DIEA y 0,12 g de bromuro de 4-bromobencilo y se agitó la mezcla a 70ºC durante 8 h. Se filtró la resina, se lavó (tal como anteriormente) y se secó bajo vacío.

Etapa 3

Se agitó dos veces la resina de la Etapa 2 durante 30 min con 5:5:90 de TFA:TES:DCM y se filtró. Se combinaron y evaporaron los filtrados, dando como resultado 140 mg de un aceite naranja. Se purificó este material mediante HPLC preparativa en fase reversa (gradiente de acetonitrilo-agua) para proporcionar 27 mg (17% para 3 etapas) de la sal mono-TFA.

Ejemplo 3

Síntesis combinatoria de compuestos múltiples

Etapa 1

La resina 1,2-diaminoetano tritilo (Novabiochem, 0,95 mmol/g) (200 g, 1,9 mmol) y la resina 1,3-diaminopropano tritilo (Novabiochem, 1,14 mmol/g) (2,0 g, 2,28 mmol) se colocaron cada una en diferentes tubos fritados de propileno de 10 mL (Bio-Rad). Se añadieron a cada una 4 mL de DMF, 4 mL de cloroformo, 3 eq. de DIEA (1,0 mL y 1,2 mL, de manera respectiva) y 2 eq. de 2-(1'-bromopropil)-3-bencilquinazolina-4-ona (del Ejemplo 1) (1,5 g y 1,8 g, de manera respectiva). Se agitaron las mezclas a 70ºC durante toda la noche. Se lavó cada mezcla (3 x DCM, 2 x MeOH, 1 x DCM, 2 x éter) y se secaron bajo vacío. El análisis de una alícuota rota reveló la presencia de la quinazolinona-diamina apropiada cada una en una pureza > del 90%.

Etapa 2

Se colocó la resina de quinazolinona etil-diamina (105 mg, 0,10 mmol) en cada uno de los viales en las 2 primeras filas de la matriz, y se colocó la resina de quinazolinona propil-diamina (88 mg, 0,10 mmol) en cada vial de las 2 últimas filas de al matriz. Se añadió a cada vial DIEA (0,131 mL, 0,75 mmol). Se añadió en cada vial de la 2 primeras filas de la matriz una amina diferente, y se repitieron las adiciones para las dos últimas filas de la matriz. Se agitó el bloque de reacción a 70ºC durante toda la noche. Se eliminó el líquido procedente de cada vial mediante pipeta multicanal usando puntas gel-well de punta fina, y se lavaron las resinas (2 x DCM, 1 x MeOH, 1 x DCM) y se secaron bajo vacío.

Etapa 3

Se añadieron a cada vial de la matriz 2 mL de una solución 10:5:85 de TFA:TES:DCM. Se agitó el bloque de reacción durante 45 min y se transfirieron las mezclas a un bloque con filtro, se filtraron, y se lavaron dos veces con 0,75 mL de DCM. Se evaporaron las soluciones para dar como resultado aceites de color amarillo a rojo. Estos aceites espesos se trituraron dos veces con éter, se disolvieron en DCM y se trataron con HCl 4 M en dioxano para proporcionar las sales de HCl (número desconocido de sales por compuesto) como un polvo o sólido amorfo de color castaño a blanco. Los análisis mediante LCMS demostraron que tenían una pureza > de un 75%.

Ejemplos 4-6

Se separaron seis quinazolinonas racémicas en sus enantiómeros mediante cromatografía quiral. Se describe a continuación la cromatografía quiral de tres de estos compuestos:

Ejemplo 4

4

Columna - Criralpak AD, 250 x 4,6 mm (Diacel Inc.). Muestra - 0,5 mg/mL en EtOH. Condiciones - 15 min a un 60% de EtOH en Hexano, el enantiómero 1 eluye a 4,5 min, el enantiómero 2 eluye a 4,9 min.

Ejemplo 5

5

Columna - Chiralcel OJ, 250 x 4,6 mm (Diacel Inc.). Muestra - 0,5 mg/mL en EtOH. Condiciones - 15 min a un 10% de EtOH en Hexano, el enantiómero ® eluye a 8,4 min, el enantiómero (S) eluye a 9,6 min.

Ejemplo 6

6

Columna - Chiralpak AD, 250 x 4,6 mm (Diacel Inc.). Muestra - 0,5 mg/mL en EtOH. Condiciones - 15 min a un 70% de EtOH en Hexano, el enantiómero 1 eluye a 6,5 min, el enantiómero 2 eluye a 8,8 min.

La tabla siguiente representa la actividad IC_{50} del racemato y los enantiómeros de los otros tres compuestos separados tal como anteriormente. En los tres casos, un enantiómero fue significativamente más potente que el otro. Mediante la síntesis quiral independiente, parece que el enantiómero más activo es el enantiómero R.

7

8

Ejemplos 7 y 8

Se sintetizaron los dos siguientes compuestos como enantiómeros únicos mediante la ruta que se muestra en la Figura 4. Los datos indican que el enantiómero más activo es el enantiómero R

9

Ejemplo 9 Resolución quiral mediante recristalización con ácido tartárico

El intermedio A, preparado en el Ejemplo 1, se puede convertir en un intermedio B, que, tras resolución, proporciona una alternativa a las cinco primeras etapas que se muestran en la Figura 4. En el esquema a continuación se muestra el proceso:

10

Se puede cristalizar de manera selectiva el enantiómero R de B calentando una mezcla de B con 1,1 equivalentes de ácido tartárico-D en una mezcla de isopropanol y metanol y a continuación extrayendo e retorno de la mezcla a temperatura ambiente.

Ejemplo 9

X = Cl, R = H

Se mezcló el intermedio B racémico (1,5 g) disuelto en 100 mL de isopropanol en ebullición con 0,8 g de ácido tartárico-D en 100 mL de metanol en ebullición. Se dejó a la mezcla alcanzar lentamente la temperatura ambiente. Tras la interrupción durante toda la noche, se eliminó el sólido mediante filtración y se aclaró con acetato de etilo y hexanos, y se dejó secar al aire. A continuación se disolvió el sólido seco (0,8 g) en una mezcla en ebullición de 50 mL de isopropanol y 50 mL de metanol y se dejó enfriar lentamente a temperatura ambiente. Tras la interrupción durante toda la noche, se eliminó el sólido resultante mediante filtración y se aclaró con acetato de etilo y hexanos, y se dejó secar al aire. A continuación se agitó el sólido seco con bicarbonato de sodio saturado durante 30 min y se extrajo con acetato de tilo. Se sacaron las capas orgánicas (MgSO_{4}), se filtraron y vaporaron hasta sequedad. El aceite transparente resultante pesó 345 mg. Se determinó una pureza quiral > de un 95% mediante conversión de una porción con la amida S-Mosher y el examen del producto mediante ^{1}HRMN. Se prepararon a continuación los compuestos enantioméricamente puros de acuerdo con las etapas restantes en la Figura 4, a partir del material resultante procedente del procedimiento descrito anteriormente usando ácido D- y L-tartárico.

11

Inducción del bloqueo mitótico en poblaciones de células tratadas con un inhibidor KSP de la quinazolinona

Se llevaron a cabo los análisis FACS para determinar la etapa del ciclo celular midiendo el contenido de ADN tal como sigue. Se rompieron 1:10 células Skov-3 (cáncer de ovarios humano) para plaquear en placas de 10 cm y se hicieron crecer en subconfluencia con medio RPMI 1640 que contenía suero fetal bovino (FBS) al 5%. A continuación se trataron las células con paclitaxel 10 nM, quinazolinona 400 nM, quinazolinona 2 200 nM, o DMSO al 25% (vehículo para los compuestos) durante 24 horas. A continuación se aclararon la células de las placas con PBS que contenía EDTA 5 mM, se aglomeraron, se lavaron una vez en PBS que contenía FCS al 1%, y a continuación se fijaron durante toda la noche en etanol al 85% a 4ºC. Se aglomeraron las célula antes del análisis, se lavaron una vez, y se tiñeron en una solución de 10 \mug de ioduro de propidio y 250 \mug de ribonucleasa A (ARNasa) por mililitro a 37ºC durante una hora y media. Se llevó a cabo el análisis de citometría de flujo en un Becton-Dickinson FACScan, y se analizaron los datos de 10.000 células con un software Modfit.

Los compuestos de quinazolinona, así como el conocido agente antimicótico paclitaxel produjeron un cambio en la población de células desde una etapa del ciclo celular G0/G1 (contenido de ADN 2n) a una etapa del ciclo celular G2/M (contenido de ADN 2N), Se encontró que otros compuestos de esta clase tienen efectos similares.

Formación del huso monopolar tras la aplicación de un inhibidor KSP de la quinazolinona

Para determinar la naturaleza de la acumulación G2/M, se plaquearon líneas celulares Skov-3 de tumor humano (ovarios), HeLa (cervical), y A549 (pulmón) en placas con 96 pocillos a densidades de 4.000 células por pocillo (SKOV-3 & HeLa) u 8.000 células por pocillo (A549), y se dejaron adherir durante 24 horas, y se trataron con diversas concentraciones de compuestos de quinazolinona durante 24 horas. Se fijaron las células en formaldehído al 4% y se tiñeron con anticuerpos anti-tubulina (reconocidos de manera subsiguiente usando el anticuerpo secundario tratado fluorescentemente) y el tinte de Hoescht (que tiñe el ADN).

La inspección visual reveló que los compuestos de quinazolinona produjeron el bloqueo del ciclo celular en la etapa de prometafase de la mitosis. Se condensó el ADN y se inició la formación del huso, pero las células bloqueadas desplegaron husos monopolares, indicando que no hubo una inhibición de la separación del cuerpo del polo del huso. La microinyección de anticuerpos anti-KSP produce también el bloqueo mitótico con células bloqueadas que despliegan husos monopolares.

Inhibición de la proliferación celular en líneas celulares tumorales tratadas con inhibidores KSP de la quinazolinona

Se plaquearon las células en placas con 96 pocillos a densidades de 1000-2500 células/pocillo de una placa con 96 pocillos (dependiendo de la línea celular) y se dejaron adherir/crecer durante 24 horas. A continuación se trataron con diversas concentraciones de fármaco durante 48 horas. Se consideró T_{0} el tiempo al cual se añadieron los compuestos. Se usó un ensayo basado en tetrazolio usando el reactivo 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio (MTS) (I.S > Patente Nº 5.185.450) (véase catálogo de productos Promega #G3580, CellTiter 96® AQ_{ueous} Una Solución al Ensayo de Proliferación Celular) para determinar el número de células viables a T_{0} y el número de células restante tras 48 horas de exposición al compuesto. Se comparó el número de células restantes tras 48 horas con el número de células viables en el momento de la adición del fármaco, permitiendo el cálculo de la inhibición del crecimiento.

El crecimiento durante 48 horas de las células en los pocillos de control que se han tratado únicamente con el vehículo (DMSO al 0,25%) se considero un crecimiento del 100% y el crecimiento de las células en los pocillos con compuestos se comparo con este. Los inhibidores KSP de la quinazolina inhibieron la proliferación celular en las líneas celulares de tumores humanos de los siguientes tipos de tumor; pulmón (NCI-H460, A549), senos (MDA-MB-231, MCF7, MCF7/ADR-RES), cólon (HT29, HCT15), ovarios (SKOV-3, OVCAR-3), leucemia (HL-60(TB), K-562), sistema nervioso central (SF-268), renal (A498), osteosarcoma (U2-OS), y cervical (HeLa). De manera adicional, se inhibió también el crecimiento de una línea tumoral de ratón (B16, melanoma) en presencia de compuestos de quinazolina.

Se calculó una Gi_{50} representando gráficamente la concentración del compuesto en \muM frente al porcentaje de crecimiento celular del crecimiento celular en los pocillos tratados. La Gi_{50} calculada para los compuestos es la concentración estimada a la cual se inhibe el crecimiento un 50% en comparación con el control, es decir, la concentración a la que:

100 x [(Tratadas_{48} -T_{0}) / (Control_{48}-T_{0})] = 50.

Se ensayaron todas las concentraciones de los compuestos en duplicados y se promediaron los controles sobre 12 pocillos. Se usó un modelo de placas con 96 pocillos muy similar y el esquema de cálculo de la Gi_{50} por el Nacional Cancer Institute (véase Monks, y col., J. Natl. Cancer Inst. 83:757-766 (1991)). Sin embargo, el procedimiento por el cual el Nacional Cancer Institute cuantifica el número de células no usa MTS, pero emplea en cambio procedimientos alternativos.

Cálculo de la IC_{50}

La medida de una IC_{50} de la composición para la actividad de la KSP usa un ensayo ATPasa. Se usan las siguientes soluciones: Solución 1, constituida por sal de fosfoenolpiruvato de potasio 3 mM (Sigma P-7127), ATP 2 mM (Sigma A-3377), IDTT 1 mM (Sigma D-9779), paclitaxel 5 \muM (Sigma T-7402), 10 ppm de antiespumante 289 (Sigma A-8436), Pipes/KOH 25 mM pH 6,8 (Sigma P6757), Mg C12 2 mM (VWRJT400301), y EGTA 1 mM (Sigma E3889). La Solución 2 está constituida por NADH 1 mM (Sigma N8129), 0,2 mg/ml de BSA (Sigma A 7906), 7 U/ml de piruvato quinasa, 10U/ml de L-lactato deshidrogenada (Sigma P0294), región motora de la KSP 100 nM, 50 \mug/ml de microtúbulos, DTT 1 mM (Sigma D9779), paclitaxel 5 \muM (Sigma T-7402), 10 ppm de antiespumante 289 (Sigma A-8436), Pipes/KOH 25 mM pH 6,8 (Sigma P6757) MgC12 2 mM (VWR JT4003-01), y EGTA 1 mM (Sigma E3889). Se hicieron diluciones en serie (8-12 diluciones dos veces) de la composición en una placa de microvaloración con 96 pocillos (Corning Costar 3695) usando la Solución1. Tras la dilución en serie cada pocillo tenía 50 \mul de Solución 1. Se comenzó la reacción añadiendo 50 \mul de Solución 2 en cada pocillo. Esto se puede llevar a cabo con un pipeteador multicanal , manualmente o con un dispositivo automatizado de manipulación de líquidos. A continuación se transfirió la placa de microvaloración a una microplaca de lectura de absorbancia y se tomaron lecturas de absorbancia múltiples a 340 nm para cada pocillo en un modo cinético. Se representó gráficamente la velocidad de cambio observada, que es proporcional a la velocidad de la ATPasa, como una función de la concentración del compuesto. Para una determinación de la IC_{50} estándar, se ajustan los datos adquiridos mediante la siguiente ecuación de cuatro parámetros usando un programa de ajuste no lineal (por ejemplo Grafit 4):

y = \frac{Intervalo}{1 + \left(\frac{x}{IC_{50}}\right)^{S}} + Fondo

En la que y es la velocidad observada y x la concentración del compuesto

Los compuestos de quinazolinona inhiben el crecimiento en una variedad de líneas celulares, que incluyen las líneas celulares (MCF-7/ADR-RES, HCT1 5) que expresan la P-glicoproteína (conocida también como Multidrug Resistance, o MDR^{+}), que confiere resistencia a los otros fármacos quimioterapéuticos, tales como paclitaxel. Por tanto, las quinazolinonas son antimicóticos que inhiben la proliferación celular, y no se someten a la resistencia por sobreexpresión de la MDR^{+} mediante líneas tumorales resistentes al fármaco.

Se encontraron que otros compuestos de esta clase inhiben la proliferación celular aunque los valores de la GI_{50} variaron. Los valores de GI_{50} para los compuestos de quinazolinona ensayados oscilaron entre 200 nM a mayores de los ensayados con concentraciones más altas. Por esto decimos que aunque la mayor parte de los compuestos que inhibieron bioquímicamente la actividad de la KSP no inhibieron la proliferación celular, por algunas, a la concentración ensayada más alta (general mente aproximadamente 20 \muM) , se inhibió el crecimiento celular menos del 50%. Muchos de los compuestos tienen valores de la GI_{50} menores de 10 \muM, y algunos tienen valores de GI_{50} menores de 1 \muM. Los compuestos antiproliferativos que se han aplicado satisfactoriamente n la clínica del tratamiento del cáncer (quimioterapéuticos del cáncer) tiene Gi_{50} que varían mucho. Por ejemplo, en las células A549, la GI_{50} de paclitaxel es de 4 nm, dexorubicin es 63 nM, 5-fluoracil es 1 \muM, y la hidroxiurea es 500 \muM (datos proporcionados por el Nacional Cancer Institute, Developmental Therapeutic Program, http://dtp.nci.nih.gov/). Por tanto, pueden ser útiles los compuestos que inhiben la proliferación celular en virtualmente cualquier concentración. Sin embargo, de manera preferible, los compuestos tendrán valores de GI_{50} menores de 10 \muM. Puede ser también deseable la reducción adicional en los valores de Gi_{50}, que incluyen los compuestos con valores de GI_{50} menores de 1 \muM. Algunos de los compuestos de quinazolinona de la invención inhiben la proliferación celular con valores de GI_{50} desde por debajo de 200 nm a por debajo de 10 nM.

Claims (7)

1. Un compuesto de fórmula 1a

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12

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en la que:

(1)

R_{1} es bencilo;

\quad

R_{2} es etilo;

\quad

R_{2}' es hidrógeno;

\quad

R_{3} es 2-fluorofenilo;

\quad

R_{4} es 2-dimetilaminoetilo;

\quad

R_{5}-R_{8} son hidrógeno.

\vskip1.000000\baselineskip

(2)

R_{1} es bencilo;

\quad

R_{2} es etilo;

\quad

R_{2}' es hidrógeno;

\quad

R_{3} es 3-fluorofenilo;

\quad

R_{4} es 2-dimetilaminoetilo;

\quad

R_{5}-R_{8} son hidrógeno.

\vskip1.000000\baselineskip

(3)

R_{1} es bencilo;

\quad

R_{2} es etilo;

\quad

R_{2}' es hidrógeno;

\quad

R_{3} es 4-fluorofenilo;

\quad

R_{4} es 2-dimetilaminoetilo;

\quad

R_{5}-R_{8} son hidrógeno.

\newpage

(4)

R_{1} es bencilo;

\quad

R_{2} es etilo;

\quad

R_{2}' es hidrógeno;

\quad

R_{3} es 3-bromofenilo;

\quad

R_{4} es 2-dimetilaminoetilo;

\quad

R_{5}-R_{8} son hidrógeno.

\vskip1.000000\baselineskip

(5)

R_{1} es bencilo;

\quad

R_{2} es etilo;

\quad

R_{2}' es hidrógeno;

\quad

R_{3} es 4-bromofenilo;

\quad

R_{4} es 2-dimetilaminoetilo;

\quad

R_{5}-R_{8} son hidrógeno.

\vskip1.000000\baselineskip

(6)

R_{1} es bencilo;

\quad

R_{2} es etilo;

\quad

R_{2}' es hidrógeno;

\quad

R_{3} es 1-naftilo;

\quad

R_{4} es 2-dimetilaminoetilo;

\quad

R_{5}-R_{8} son hidrógeno.

\vskip1.000000\baselineskip

(7)

R_{1} es bencilo;

\quad

R_{2} es metilo;

\quad

R_{2}' es hidrógeno;

\quad

R_{3} es 3-bromofenilo;

\quad

R_{4} es 2-dimetilaminoetilo;

\quad

R_{5}-R_{8} son hidrógeno.

\vskip1.000000\baselineskip

(8)

R_{1} es bencilo;

\quad

R_{2} es metilo;

\quad

R_{2}' es hidrógeno;

\quad

R_{3} es 4-bromofenilo;

\quad

R_{4} es 2-dimetilaminoetilo;

\quad

R_{5}-R_{8} son hidrógeno.

\vskip1.000000\baselineskip

(9)

R_{1} es bencilo;

\quad

R_{2} es metilo;

\quad

R_{2}' es hidrógeno;

\quad

R_{3} es 4-bromofenilo;

\quad

R_{4} es 2-aminoetilo;

\quad

R_{5}-R_{8} son hidrógeno.

\vskip1.000000\baselineskip

(10)

R_{1} es bencilo;

\quad

R_{2} es etilo;

\quad

R_{2}' es hidrógeno;

\quad

R_{3} es 4-bromofenilo;

\quad

R_{4} es 2-aminoetilo;

\quad

R_{5}-R_{8} son hidrógeno.

\vskip1.000000\baselineskip

(11)

El isómero R en el que

\quad

R_{1} es bencilo;

\quad

R_{2} es metilo;

\quad

R_{2}' es hidrógeno;

\quad

R_{3} es 4-bromofenilo;

\quad

R_{4} es 2-dimetilaminoetilo;

\quad

R_{5}-R_{8} son hidrógeno.

\vskip1.000000\baselineskip

(12)

El isómero R en el que

\quad

R_{1} es bencilo;

\quad

R_{2} es etilo;

\quad

R_{2}' es hidrógeno;

\quad

R_{3} es 1-naftilo;

\quad

R_{4} es 2-dimetilaminoetilo;

\quad

R_{5}-R_{8} son hidrógeno.

\vskip1.000000\baselineskip

(13)

El isómero R en el que

\quad

R_{1} es bencilo;

\quad

R_{2} es etilo;

\quad

R_{2}' es hidrógeno;

\quad

R_{3} es 4-bromofenilo;

\quad

R_{4} es 2-dimetilaminoetilo;

\quad

R_{5}-R_{8} son hidrógeno.

\vskip1.000000\baselineskip

(14)

El isómero R en el que

\quad

R_{1} es bencilo;

\quad

R_{2} es etilo;

\quad

R_{2}' es hidrógeno;

\quad

R_{3} es 4-bromofenilo;

\quad

R_{4} es 2-aminoetilo;

\quad

R_{5}-R_{8} son hidrógeno.

\vskip1.000000\baselineskip

o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.

2. El uso de un compuesto tal como el que se reivindica en la reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para tratar las enfermedades proliferativas.

3. El uso tal como se reivindica en la reivindicación 2 en el que la enfermedad proliferativa es hiperplasia, restenosis, hipertrofia cardíaca, trastornos inmunes o inflamación.

4. Un procedimiento in vitro para inhibir la quinasa KSP que comprende poner en contacto la KSP con un compuesto tal como se reivindica en la reivindicación 1.

5. Un procedimiento de síntesis de un compuesto tal como se reivindica en la reivindicación 1 que comprende poner en contacto un compuesto correspondiente de fórmula 1c

13

con un compuesto correspondiente de fórmula R_{3}(CO)Cl y aislar un compuesto de fórmula I.

6. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto tal como se reivindica en la reivindicación 1 junto con un vehículo fisiológicamente aceptable.

7. El uso tal como se reivindica en la reivindicación 2 en el que el trastorno proliferativo es cáncer.