NO322825B1 - Kinazolinoner, syntese av slike, anvendelse av slike for fremstilling av medikamenter for behandling av proliferative sykdommer, farmasoytiske preparater inneholdende slike forbindelser samt anvendelse in vitro for a hemme KSP-kinase. - Google Patents

Description

METODER OG PREPARATER VED ANVENDELSE AV KINAZOLINONER

OPPFINNELSENS OMRÅDE

Foreliggende oppfinnelse angår kinazolinoner, syntese av slike, anvendelse av slike for fremstilling av medikamenter for behandling av proliferative sykdommer, farmasøytiske preparater inneholdende slike forbindelser samt anvendelse in vitro for å hemme KSP-kinase.

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

Interesse i den medisinske kjemi for kinazolinderivater ble stimulert i de tidlige 1950-år med oppklaringen av strukturen til et kinazolin-alkaloid, 3-[6-keto-gamma-{3-hydroksy-2-piperidyl)-propyl]-4'kinazolon, fra en asiatisk plante kjent for sine antimalaria-egenskaper. I et forsøk på å finne ytterligere antimalaria-midler er forskjellige substituerte kinazoliner syntetisert. Av spesiell viktighet var syntesen av derivatet 2-metyl-3-o-tolyl-4-(3H)-kinazolinon. Denne forbindelsen, kjent under navnet methaqualon, skjønt det var ineffektivt mot protozoer, ble funnet å være et kraftig hypnotikum.

Siden innføringen av methaqualon og dens oppdagelse som et hypnotikum, er den farmakologiske aktiviteten til kinazolinoner og beslektete forbindelser undersøkt. Kinazolinoner og derivater derav er nå kjent å ha en rekke biologiske egenskaper omfattende hypnotiske, sedative, analgetiske, antikonvulsive, antitussive og anti-inflammatoriske aktiviteter.

Kinazolinon-derivater for hvilke spesifikke biologiske anvendelser er beskrevet omfatter U.S. Patent nr. 5,147,875 som beskriver 2-(substituert fenyl)-4-okso- kinazoliner med bronkodilatorisk aktivitet. U.S. Patent nr. 3,723,432,3,740,442 og 3,925,548 beskriver en klasse av 1-substituerte 4-aryl-2(l H)-kinazolinon-derivater anvendelige som anti-inflammatoriske midler. Europeisk patent publikasjon EP 0 056 637 Bl krever en klasse av 4(3H)-kinazolinon-derivater for behandling av hypertensjon. Europeisk patent publikasjon EP 0 884 319 Al beskriver farmasøytiske preparater av kinazolin-4-on-derivater anvendt for å behandle neurodegenerative, psykotropiske og medikament- og alkohol-fremkalte forstyrrelser i det sentrale og perifere nervesystem.

Kinazolinoner er blant et voksende antall terapeutiske midler anvendt for å behandle celle-proliferative forstyrrelser, omfattende kreft. For eksempel beskriver PCT WO 96/06616 et farmasøytisk preparat inneholdende et kinazolinon-derivat for å hemme vaskulær glattcelleproliferasjon. PCT WO 96/19224 anvender dette samme kinazolinon-derivat til å hemme mesengial celleproliferasjon. U.S. Patent nr. 4,981,856, 5,081,124 og 5,280,027 beskriver anvendelse av kinazolinon-derivater til å hemme thymidylat-syntase, enzymet som katalyserer metyleringen av deoksyuridin-monofosfat for å danne thymidin-monofosfat som er nødvendig for DNA-syntese. U.S. Patent nr. 5,747,498 og 5,773,476 beskriver kinazolinon-derivater anvendt for å behandle kreft karakterisert ved over-aktivitet eller feilaktig aktivitet av tyrosin-reseptor-kinaser. U.S. Patent nr. 5,037,829 krever (lH-azol-l-ylmetyl)-substituerte kinazolin-preparater for å behandle karsinomer som forekommer i epitelceller. PCT WO 98/34613 beskriver et preparat inneholdende et kinazolinon-derivat anvendelig for svekkelse av neovaskularisering og for behandling av maligne tilfeller. U.S. Patent 5,187,167 beskriver farmasøytiske preparater omfattende kinazolin-4-on-derivater som har anti-tumoraktivitet.

Andre terapeutiske midler anvendt for å behandle kreft omfatter taxaner og vinca-alkaloider. Taxaner og vinca-alkaloider virker på mikrotubuler som er til stede i en rekke cellulære strukturer. Mikrotubuler er det primære strukturelle element i den mitotiske spindel. Den mitotiske spindel er ansvarlig for fordeling av replikatkopier av genomet til hver av de to datterceller som følger av celledeling. Det er antatt at brudd på den mitotiske spindel med disse medikamenter resulterer i hemning av kreftcelledeling og induksjon av kreftcelledød. Imidlertid danner mikrotubuler andre typer av cellulære strukturer, omfattende spor for intracellulær transport i nerve- prosesser. Fordi disse midler ikke spesifikt sikter på mitotiske spindler, har de bivirkninger som begrenser deres anvendelighet.

Forbedringer i spesifisiteten av midler anvendt for å behandle kreft er av betraktelig interesse på grunn av de terapeutiske fordeler som ville oppnås hvis bivirkningene forbundet med administreringen av disse midler kunne reduseres. Tradisjonelt er dramatiske forbedringer ved behandling av kreft forbundet med identifikasjon av terapeutiske midler som virker ved nye mekanismer. Eksempler på dette omfatter ikke bare taxanene, men også camptothecin-klassen av topoisomerase-I-inhibitorer. Fra begge disse perspektiver er mitotiske kinesiner attraktive mål for nye anti-kreft- midler. Mitotiske kinesiner er enzymer essensielle for sammensetning og funksjon av den mitotisk spindel, men er ikke generelt en del av andre mikrotubul-strukturer, så som i nerveprosesser. Mitotiske kinesiner spiller essensielle roller under alle faser av mitose. Disse enzymer er "molekylære motorer" som transformerer energi frigjort ved hydrolyse av ATP til mekanisk energi som driver retningsbevegelsen av cellulær last langs mikrotubuler. Det katalytiske domenet tilstrekkelig for denne oppgave er en kompakt struktur på omtrent 340 aminosyrer. Under mitose organiserer kinesiner mikrotubuler i den bipolare struktur som er den mitotiske spindel. Kinesiner medierer bevegelse av kromosomer langs spindel-mikrotubuler, så vel som strukturelle endringer i den mitotiske spindel forbundet med spesifikke faser av mitose. Eksperimentell perturbasjon av mitotisk kinesin-funksjon forårsaker feildannelse eller dysfunksjon av den mitotiske spindel, som ofte resulterer i cellecyklus-stopp og celledød.

Blant de mitotiske kinesiner som er identifisert er KSP. KSP tilhører til en evolusjonær konservert kinesin-undergruppe av pluss-enderettede mikrotubul-motorer som settes sammen til bipolare homotetramere bestående av antiparallelle homodimerer. Under mitose forbindes KSP med mikrotubuler i den mitotiske spindel. Mikroinjeksjon av antistoffer rettet mot KSP i humane celler forhindrer spindel-polseparering under prometafase, hvilket gir opphav til monopolare spindler, og som forårsaker mitotisk stopp og induksjon av programmert celledød. KSP og beslektete kinesiner i andre ikke-humane organismer, bunt-antiparallelle mikrotubuler og forskyver dem i forhold til hverandre, og tvinger således de to spindel-poler fra hverandre. KSP kan også mediere ved anafase-B-spindel- forlengelse og fokusere på mikrotubuler på spindelpolen.

Humant KSP (også betegnet HsEg5) er beskrevet [Blangy, et al., Cell, 83:1159-69 (1995); Whitehead, et al., Artritt Rheum., 39:1635-42 (1996); Galgio et al., J. Cell Biol., 135:339-414 (1996); Blangy, et al., J Biol. Chem., 272:19418-24 (1997); Blangy, et al., Celle Motil Cytoskeleton, 40:174-82 (1998); Hvitthead og Rattner, J. Celle Sei., 111:2551-61 (1998); Kaiser, et al., JBC 274:18925-31 (1999); GenBank tilgangsnummere: X85137, NM004523 og U37426] og et fragment av KSP-genet (TRIP5) er beskrevet [Lee, et al., Mol Endocrinol., 9:243-54 (1995); GenBank aksesjonsnummer L40372]. Xenopus KSP-homologer (Eg5), så vel som Drosophila KLP61 F/KRP1 30 er rapportert.

Mitotiske kinesiner er attraktive mål for oppdagelse og utvikling av nye mitotiske kjemoterapeutica. Følgelig er det et mål med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe forbindelser anvendelige ved hemning av KSP, et mitotisk kinesin.

SAMMENFATNING AV OPPFINNELSEN

I henhold til målene beskrevet ovenfor tilveiebringer foreliggende oppfinnelse forbindelser som kan anvendes for å behandle sykdommer i prolifererende celler. Forbindelsene er KSP-inhibitorer, spesielt humane KSP-inhibitorer.

I ett aspekt ågår oppfinnelsen forbindelser med formelen la

hvor.

(1) Rier benzyl;

R2 er etyl;

R2- er hydrogen;

R3 er 2-fluorfenyl;

R4 er 2-dimetylaminoetyl;

R5-R8 er hydrogen. (2) Ri er benzyl;

R2 er etyl;

Rr er hydrogen;

R3 er 3-fhiorfenyl;

R4 er 2-dimetylaminoetyl;

R5-R8 er hydrogen. (3) Ri er benzyl;

R2 er etyl;

R2- er hydrogen;

R3 er 4-fluorfenyl;

R4 er 2-dimetylaminoetyl;

Rs-Rg er hydrogen. (4) Ri er benzyl;

R2 er etyl;

Rr er hydrogen;

R3 er 3-bromfenyl;

R4 er 2-dimetylaminoetyl;

Rs-Rg er hydrogen. (5) R| er benzyl;

R2 er etyl;

R2- er hydrogen;

R3 er 4-bromfenyl;

R4 er 2-dimetylaminoetyl;

Rs-Rg er hydrogen. (6) Ri er benzyl;

R2 er etyl;

R2- er hydrogen;

R3 er 1-naftyl;

R4 er 2-dimetylaminoetyl;

Rs-R<g> er hydrogen. (7) Ri er benzyl;

R2 er metyl;

R2- er hydrogen;

R3 er 3-bromfenyl;

R4 er 2-dimetylaminoetyl;

R5-R8 er hydrogen. (8) Ri er benzyl;

R2 er metyl;

R2' er hydrogen;

R3 er 4-bromfenyl;

R4 er 2-dimetylaminoetyl;

R5-R8 er hydrogen. (9) Ri er benzyl;

R2 er metyl;

R2- er hydrogen;

R3 er 4-bromfenyl;

R4 er 2-aminoetyl;

R5-R8 er hydrogen. (10) Ri er benzyl;

R2 er etyl;

R2- er hydrogen;

R3 er 4-bromfenyl;

R4 er 2-aminoetyl;

Rs-Rg er hydrogen. (11) R-isomerhvor Ri er benzyl;

R2 er etyl;

R2' er hydrogen;

R3 er 4-bromfenyl;

R4 er 2-dimetylaminoetyl;

R5-R8 er hydrogen.

(12) R-isomer hvor

Ri er benzyl;

R2 er etyl;

R2' er hydrogen;

R3er 1-naftyl;

R4 er 2-dimetylaminoetyl;

Rs-R<g> er hydrogen.

(13) R-isomer hvor

Ri er benzyl;

R2 er etyl;

R2' er hydrogen;

R3 er 4-bromfenyl;

R4 er 2-dimetylaminoetyl;

Rs-Rg er hydrogen.

(14) The R-isomer hvor

Ri er benzyl;

R2 er etyl;

R2- er hydrogen;

R3 er 4-bromfenyl;

R4 er 2-aminoetyl;

R5, Ré og Rg er hydrogen og R7 er klor.

eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

I et annet aspekt angår oppfinnelsen forbindelser som definert over til fremstilling av medikamenter for behandling av proliferative sykdommer.

I ytterligere et annet aspekt angår oppfinnelsen en in vitro metode for å hemme KSP-kinase omfattende å bringe KSP i kontakt med en forbindelse som definert over. I ytterligere et askept angår oppfinnelsen en syntesemetode for forbindelsene som definert over.

KORT BESKRIVELSE A V TEGNINGENE

Figur 1 viser et generisk synteseskjema for fremstilling av preparater ifølge foreliggende oppfinnelse.

Figur 2 viser en syntese-vei for syntesen av kinazolinon-KSP-inhibitorer.

Figur 3 viser representative kjemiske strukturer for kinazolinon-KSP-inhibitorer.

Figur 4 viser en syntese-vei til hovedsakelig rene enkelt-enantiomerer.

Figur 5 viser syntese-veier til sulfonamider (5a), karbamater (5b), urinstoffer (5c) og aminer (5d).

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Foreliggende oppfinnelse angår en klasse av nye forbindelser, basert på en kinazolinon kjernestruktur, som er modulatorer for mitotiske kinesiner. Ved å hemme eller modulere mitotiske kinesiner, men ikke andre kinesiner (f.eks. transport- kinesiner), blir spesifikk hemning av cellulær proliferasjon oppnådd. Således utnytter foreliggende oppfinnelse den observasjon at perturbasjon av mitotisk kinesin-funksjon forårsaker misdannelse eller feilfunksjon av mitotiske spindler, hvilket ofte resulterer i cellecyklus-stopp og celledød. Metodene for å hemme et human-KSP-kinesin består i å kontakte en inhibitor ifølge foreliggende oppfinnelse med et KSP-kinesin, spesielt humane KSP-kinesiner, omfattende fragmenter og varianter av KSP. Hemningen kan være av ATP-hydrolyse-aktiviteten til KSP-kinesinet og/eller den mitotiske spindetdannelsesaktivitet, slik at de mitotiske spindler blir avbrutt. Meiotiske spindler kan også avbrytes.

Et mål med foreliggende oppfinnelse er å utvikle inhibitorer og modulatorer for mitotiske kinesiner, spesielt KSP, for behandling av forstyrrelser forbundet med celleproliferasjon. Tradisjonelt er dramatiske forbedringer ved behandling av kreft, én type av celle-proliferativ forstyrrelse, forbundet med identifikasjon av terapeutiske midler som virker ved nye mekanismer. Eksempler på dette omfatter ikke bare taxan- klassen av midler som synes å virke på mikrotubul-dannelse, men også camptothecin-klassen av topoisomerase-I-inhibitorer.

Forbindelsene beskrevet her kan avvike i sin selektivitet og anvendes for å behandle sykdommer i prolifererende celler, omfattende, hyperplasier, restenose, hjerte-hypertrofi, immunforstyrrelser og inflammasjon.

I henhold til målene beskrevet ovenfor tilveiebringer foreliggende oppfinnelse forbindelse med formelen la

hvor:

(1) Ri er benzyl;

R2 er etyl;

Rr er hydrogen;

R3 er 2-fluorfenyl;

R4 er 2-dimetylaminoetyl;

R5-R8 er hydrogen. (2) Ri er benzyl;

R2 er etyl;

R2- er hydrogen;

R3 er 3-fluorfenyl;

R4 er 2-dimetylaminoetyl;

Rs-Rg er hydrogen. (3) Ri er benzyl;

R2 er etyl;

Rr er hydrogen;

R3 er 4-fluorfenyl;

R4 er 2-dimetylaminoetyl;

R5-R8 er hydrogen. (4) R] er benzyl;

R2 er etyl;

R2* er hydrogen;

R3 er 3-bromfenyl;

R4 er 2-dimetylaminoetyl;

Rs-Rg er hydrogen. (5) Ri er benzyl;

R2 er etyl;

R2« er hydrogen;

R3 er 4-bromfenyl;

R4 er 2-dimetylaminoetyl;

Rs-Rg er hydrogen. (6) Ri er benzyl;

R2 er etyl;

R2- er hydrogen;

R3 er 1-naftyl;

R4 er 2-dimetylaminoetyl;

Rs-Rg er hydrogen. (7) Ri er benzyl;

R2 er metyl;

R2* er hydrogen;

R3 er 3-bromfenyl;

R4 er 2-dimetylaminoetyl;

R5-R8 er hydrogen. (8) Ri er benzyl;

R2 er metyl;

R2- er hydrogen;

R3 er 4-bromfenyl;

R4 er 2-dimetylaminoetyl;

Rs- Ri er hydrogen. (9) Ri er benzyl;

R2 er metyl;

R2- er hydrogen;

R3 er 4-bromfenyl;

R4 er 2-aminoetyl;

Rs-Rg er hydrogen. (10) Ri er benzyl;

R2 er etyl;

R2- er hydrogen;

R3 er 4-bromfenyl;

R4 er 2-aminoetyl;

Rs-Rg er hydrogen. (11) R-isomer hvor Ri er benzyl;

R2 er etyl;

R2' er hydrogen;

R3 er 4-bromfenyl;

R4 er 2-dimetylaminoetyl;

R5-R8 er hydrogen. (12) R-isomer hvor Ri er benzyl;

R2 er etyl;

R2- er hydrogen;

R3 er 1-naftyl;

R4 er 2-dimetylaminoetyl;

Rs-Rg er hydrogen. (13) R-isomer hvor Ri er benzyl;

R2 er etyl;

R2' er hydrogen;

R3 er 4-bromfenyl;

R4 er 2-dimetylaminoetyl;

Rs-Rg er hydrogen.

(14) R-isomer hvor

Ri er benzyl;

R2 er etyl;

R2- er hydrogen;

R3 er 4-bromfenyl;

R4 er 2-aminoetyl;

Rs. Re og Rg er hydrogen og R7 er klor.

eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

I et annet aspekt angår oppfinnelsen anvendelse av en forbindelse som beskrevet over ved fremstilling av et medikament for behandling av proliferative sykdommer som omfatter kreft, hyperplasi, restenose, hjertehypertrofi, immunlidelser eller inflammasjon.

I et ytterligere annet aspekt angår oppfinnelsen in vitro metode for å hemme KSP-kinase omfattende å bringe KSP i kontakt med en forbindelse som beskrevet over.

Oppfinnelsen angår videre en metode for syntese av en forbindelse som beskrevet over som omfatter å reagere en tilsvarende forbindelse med formel lc med en tilsvarende forbindelse med formelen R3(CO)Cl og isolering av en forbindelse med formelen la.

Oppfinnelsen angår også farmasøytisk preparat omfattende en forbindelse som beskrevet over sammen med en fysiologisk akseptabel bærer.

Definisjoner

Følgende definisjoner er brukt om de ikke er spesifikt angitt

Alkyl skal omfatte lineære, forgrenete eller cykliske hydrokarbon-strukturer og kombinasjoner derav. Lavere-alkyl angir alkylgrupper med fra 1 til 5 karbonatomer. Eksempler på lavere-alkylgrupper omfatter metyl, etyl, propyl, isopr opyl, butyl, s- og t-butyl og lignende. Foretrukne alkylgrupper er slike med C20 dier lavere. Mer foretrukne alkylgrupper er de med C13 eller lavere. Cykloalkyl er en undergruppe av alkyl og omfatter cykliske hydrokarbongrupper med fra 3 til 13 karbonatomer. Eksempler på cykloalkylgrupper omfatter c-propyl, c-butyl, c-pentyl, norbornyl, adamantyl og lignende. Alkyl angir alkanyl-, alkenyl- og alkynyl- rester; den skal omfatte cykloheksylmetyl, vinyl, allyl, isoprenyl og lignende. Alkylen angir samme rester som alkyl, men som har to bindingspunkter. Eksempler på alkylen omfatter etylen (-CH2CH2-), propylen (-CH2CH2CH2-), dimetylpropylen (-ClrøCrfehCfk-) og cykloheksylpropylen (-CH2CH2CH(C6Hi3)-). Når en alkylrest som har et spesifikt antall karbonatomer er angitt, skal alle geometriske isomerer som har dette antall karbonatomer være omfattet; således skal for eksempel "butyl" omfatte n-butyl, sek-butyl, isobutyl og t-butyl; "propyl" omfatte n-propyl og isopropyl.

Alkoksy eller alkoksyl angir grupper med fra 1 til 8 karbonatomer av en lineær, forgrenet, cyklisk konfigurasjon og kombinasjoner derav bundet til stamstrukturen gjennom et oksygen. Eksempler omfatter metoksy, etoksy, propoksy, isopropoksy, cyklopropyloksy, cykloheksyloksy og lignende. Lavere-alkoksy angir grupper inneholdende ett til fire karbonatomer.

Acyl angir grupper med fra 1 til 8 karbonatomer med en lineær, forgrenet, cyklisk konfigurasjon, mettet, umettet og aromatisk og kombinasjoner derav, bundet til stamstrukturen gjennom en karbonylgruppe. Ett eller flere karbonatomer i acylresten kan være erstattet av nitrogen, oksygen eller svovel så lenge bindingspunktet til hovedgrupper forblir på karbonylen. Eksempler omfatter acetyl, benzoyl, propionyl, isobutyryl, t-butoksykarbonyl, benzyloksykarbonyl og lignende. Lavere-acyl angir grupper inneholdende ett til fire karbonatomer.

Aryl og heteroaryl betyr en 5- eller 6-leddet aromatisk eller heteroaromatisk ring inneholdende 0-3 heteroatomer valgt fra O, N eller S; et bicyklisk 9- eller 10-leddet aromatisk eller heteroaromatisk ringsystem inneholdende 0-3 heteroatomer valgt fra O, N eller S; eller et tricyklisk 13- eller 14-leddet aromatisk eller heteroaromatisk ringsystem inneholdende 0-3 heteroatomer valgt fra O, N eller S. De aromatiske 6- til 14-leddete karbocykliske ringer omfatter, f.eks. benzen, naftalen, indan, tetralin og fluoren, og de 5-til 10-leddete aromatiske heterocykliske ringer omfatter f.eks. imidazol, pyridin, indol, tiofen, benzopyranon, tiazol, furan, benzimidazol, kinolin, isokinolin, kinoksalin, pyrimidin, pyrazin, tetrazol og pyrazol.

Alkylaryl angir en rest hvor en arylgruppe er bundet til stamstrukturen via en alkylrest. Eksempler er benzyl, fenetyl, fenylvinyl, fenylallyl og lignende. Oksaalkyl og oksaalkyl-aryl refererer til alkyl- og alkylarylrester hvor én eller flere metylener er erstattet med oksygen. Eksempler på oksaalkyl- og oksaalkylarylrester er etoksyetoksyetyl (3,6-dioksaoktyl), benzyloksymetyl og fenoksymetyl; generelt, skal glykoletere, så som polyetylenglykol, være omfattet av denne gruppen. Alkylheteroaryl angir en rest hvor en heteroarylgruppe er bundet til stamstrukturen via en alkylrest. Eksempler omfatter furanylmetyl, pyridinylmetyl, pyrimidinyletyl og lignende.

Heterocyklisk gruppe betyr en cykloalkyl eller aryl rest hvor ett til fire av karbonatomene blir erstattet med et heteroatom så som oksygen, nitrogen eller svovel. Eksempler på heterocykliske grupper som faller innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse omfatter imidazolin, pyrrolidin, pyrazol, pyrrol, indol, kinolin, isokinolin, tetrahydroisokinolin, benzofuran, benzodioksan, benzodioksole (vanlig referert til som metylendioksyfenyl, når de forekommer som en substituent), tetrazol, morfolin, tiazol, pyridin, pyridazin, pyrimidin, tiofen, furan, oksazol, oksazolin, isoksazol, dioksan, tetrahydrofuran og lignende. "N-heterocyklyl" angir en nitrogen-holdig heterocyklisk gruppe som en substituentrest. Betegnelsen heterocyklyl omfatter heteroaryl, som er en undergruppe av heterocyklyl. Eksempler på N-heterocyklyl- rester omfatter 4-morfolinyl, 4-tiomorfolinyl, 1-pipen dinyl, 1-pyrrolidinyl, 3-tiazolidinyl, piperazinyl og 4-(3,4-dihydrobenzoksazinyl). Eksempler på substituert heterocyklyl omfatter 4-metyl-1-piperazinyl og 4-benzyl-l-piperidinyl.

Substituert alkyl, aryl og heteroaryl refererer til alkyl, aryl eller heteroaryl hvori H- atomer er erstattet med alkyl, halogen, hydroksy, alkoksy, alkylenedioksy (f.eks. metylendioksy) fluoralkyl, karboksy (-COOH), karboalkoksy (dvs. acyloksy RCOO-), karboksyalkyl (-COOR), karboksamido, sulfonamidoalkyl, sulfonamidoaryl, aminokarbonyl, benzyloksy-karbonylamino (CBZ-amino), cyano, karbonyl, ni tro, dialkylamino, alkylamino, amino, alkyltio, alkylsulfinyl, alkylsulfonyl, alkylsulfonamido, aryltio, arylsulfinyl, arylsulfonyl, amidino, fenyl, benzyl, heteroaryl, heterocyklyl, fenoksy, benzyloksy eller heteroaryloksy. Substituert alkyl omfatter også oksaalkylrester, dvs. alkylrester hvor ett eller flere karbonatomer er erstattet med oksygen.

Halogen angir fluor, klor, brom eller jod. Fluor, klor og brom er foretrukket.

Dihalogenaryl, dihalogenalkyl, trihalogenaryl etc. refererer til aryl og atkyl substituert med flere halogenatomer, men ikke nødvendigvis flere av samme halogen; således 4-klor-3-fluorfenyl ligger innenfor omfanget av dihalogenaryl.

Mesteparten av forbindelsene beskrevet her inneholder ett eller flere asymmetriske sentere (f.eks. karbonet hvortil R2 og R2' er tilknyttet) og kan således gi opphav til enantiomere, diastereomere og andre stereoisomere former som kan defineres, ved betegnelser for absolutt stereokjemi, som (R)- eller (S)-. Foreliggende oppfinnelse skal omfatte alle slike mulige isomerer, omfattende racemiske blandinger, optisk rene former og mellomprodukt-blandinger. Optisk aktive (R)- og (S)- isomerer kan fremstilles ved anvendelse av chirale syntoner eller chirale reagenser eller adskilles ved anvendelse av konvensjonelle teknikker. Når forbindelsene beskrevet her inneholder olefiniske dobbeltbindinger eller andre sentere for geometrisk asymmetri, og hvis det ikke er spesifisert på annen måte, er det ment at forbindelsene omfatter både E- og Z-geometriske isomerer. Likeledes er alle tautomere former også ment å være omfattet.

Når det er ønsket, kan R- og S-isomerene spaltes ved metoder kjent for fagfolk på området, for eksempel ved dannelse av diastereoisomere salter eller komplekser som kan separeres, for eksempel ved krystallisasjon; via dannelse av diastereoisomere derivater som kan separeres, for eksempel ved krystallisasjon, gass-væske eller væskekromatografi; selektiv omsetning av én enantiomer med et enantiomer-spesifikt reagens, for eksempel enzymatisk oksidasjon eller reduksjon, fulgt av separering av de modifiserte og umodifiserte enantiomerer; eller gass-væske eller væskekromatografi i et chiralt miljø, foreksempel på en chiral bærer, så som silika med en bundet chiral ligand eller i nærvær av et chiralt løsningsmiddel. Det vil forstås at når den ønskede enantiomer blir omdannet til en annen kjemisk enhet ved én av separasjonsprosedyrene beskrevet ovenfor, kan et ytterligere trinn være nødvendig for å frigjøre den ønskede enantiomere form. Alternativt kan spesifikke enantiomerer syntetiseres ved asymmetrisk syntese under anvendelse av optisk aktive reagenser, substrater, katalysatorer eller løsningsmidler, eller ved omdannelse av én enantiomer til den andre ved asymmetrisk transformasjon. Et eksempel på en syntese ut fra optisk aktive utgangsmaterialer er vist i Figur 4.

Preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse blir syntetisert som beskrevet nedenfor ved anvendelse av teknikker som er velkjente på området. For eksempel som beskrevet i Ager et al., J. of Med. Chem., 20:379-386 (1977), herunder inntatt som referanse, kan kinazolinoner oppnås ved syre-katalysert kondensering av N-acylantranilsyrer med aromatiske primære aminer. Andre fremgangsmåter for fremstilling av kinazolinoner er beskrevet i U.S. Patentsøknader 5.783.577,5.922.866 og 5.187.167, hvilke alle er inntatt som referanse.

Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles som vist i Figur 1,2,4 og 5. Forbindelser med formlene ld fremstilles på analog måte til figur 1, bortsett fra at acylhalogenidet i det siste trinn blir erstattet med et alkylhalogenid.

Når de er fremstilt, finner forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse anvendelse i en rekke applikasjoner. Som det vil være klart for fagfolk på området, kan mitose endres på en rekke måter; det vil si man kan påvirke mitose enten ved å øke eller redusere aktiviteten til en komponent i den mitotiske bane. Med andre ord kan mitose påvirkes (f.eks. avbrytes) ved å forstyrre likevekt, enten ved å hemme eller aktivere visse komponenter. Lignende teknikker kan anvendes for å endre meiose.

I en foretrukket utførelsesform blir forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse anvendt til å modulere mitotisk spindel-dannelse, slik som forårsaker forlenget cellecyklus-stopp i mitose. Med "modulere" menes her endring av mitotisk spindel- dannelse, omfattende økende og avtagende spindel-dannelse. Med "mitotisk spindel- dannelse" her menes organisering av mikrotubuler i bipolare strukturer med mitotiske kinesiner. Med "mitotisk spindel-feilfunksjon" menes her mitotisk stopp og monopolar spindel-dannelse.

Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse er anvendelige for å binde til og/eller modulere aktiviteten til et mitotisk kinesin, KSP. I en foretrukket utførelsesform er KSP'et humant KSP, selv om KSP-kinesiner fra andre organismer også kan anvendes. I denne sammenheng betyr modulere enten å øke eller redusere spindel-pol- separering, som forårsaker feildannelse, dvs. utvidelse av mitotiske spindel-poler eller som på annen måte forårsaker morfologisk perturbasjon av den mitotiske spindel. Også innenfor definisjonen av KSP for disse formål ligger varianter og/eller fragmenter av KSP. Se U.S. Patentsøknad "Methods of Screening for Modulators of Cell Proliferation and Methods of Diagnosing Cell Proliferation States", innlevert Okt. 27,1999 (U.S. Serial Number 09/428.156), herved inntatt som referanse. I tillegg kan andre mitotiske kinesiner anvendes i foreliggende oppfinnelse. Imidlertid er preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse vist å ha spesifisitet for KSP.

For måling av aktivitet blir generelt enten KSP eller en forbindelse ifølge oppfinnelsen ikke-diffunderbart bundet til en uoppløselig bærer med isolerte prøve-mottagelsesområder (f.eks. en mikrotiter-plate, en rekke, etc). Den uoppløselige bærer kan fremstilles av hvilken som helst blanding hvortil preparatene kan bindes, lett separeres fra oppløselig materiale og på annen måte er kompatibel med den hele metoden for screening. Overflaten av slike bærere kan være faste eller porøse og med hvilken som helst hensiktsmessig form. Eksempler på egnede uoppløselig bærere omfatter mikrotiter-plater, oppstillinger, membraner og kuler. Disse er typisk laget av glass, plast (f.eks. polystyren), polysakkarider, nylon eller nitrocellulose, Teflon™, etc. Mikrotiter-plater og oppstillinger er spesielt hensiktsmessige fordi et stort antall målinger kan utføres samtidig ved anvendelse av små mengder av reagenser og prøver. Den spesielle måte for binding av preparatet er ikke viktig så lenge som den er kompatibel med reagensene og hele metodene ifølge foreliggende oppfinnelse, opprettholder aktiviteten til preparatet og ikke kan diffundere. Foretrukne metoder for binding omfatter anvendelse av antistoffer (som ikke sterisk blokkerer hverken ligandbindingsetet eller aktiveringsekvensen når proteinet er bundet til bæreren), dirigerer binding til "klebrige" eller ioniske bærere, kjemisk kryssbinding, syntesen av proteinet eller middelet på overflaten, etc. Etter binding av proteinet eller middelet blir overskudd av ubundet materiale fjernet ved vasking. Prøvemottakområdene kan deretter blokkeres gjennom inkubering med bovint serumalbumin (BSA), casein eller andre uskadelige proteiner eller andre grupper.

De antimitotiske midler ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes alene til å modulere aktiviteten til et mitotisk kinesin, spesielt KSP. I denne utførelsesform kombineres de mitotiske midler ifølge foreliggende oppfinnelse med KSP, og aktiviteten til KSP måles. Kinesin-aktiviteter er kjent på området og omfatter én eller flere kinesin-aktiviteter. Kinesin-aktiviteter omfatter evnen til å påvirke ATP- hydrolyse; mikrotubul-binding; gliding og polymerisasjon/depolymerisasjon (effekter på mikrotubul-dynamikk); binding til andre proteiner i spindelen; binding til proteiner involvert i celle-cyklus-kontroll; tjene som et substrat for andre enzymer, så som kinaser eller proteaser; og spesifikk kinesin-cellulære aktiviteter så som spindel-pol- separering.

Metoder for gjennomføring av motilitetsmåling er velkjent for fagfolk på området. [Se f.eks. Hall, et al. (1996), Biophys. J., 71: 3467-3476, Turner et al., 1996, AnaL Biochem. 242 (l):20-5; Gittes et al., 1996, Biophys. J. 70(1): 418-29; Shirakawa et al., 1995, J. Exp. BioL 198: 1809-15; Winkelmann et al., 1995, Biophys. J. 68: 2444-53; Winkelmann et al., 1995, Biophys. J. 68: 72S.]

Metoder kjent på området for å bestemme ATPase-hydrolyse-aktivitet kan også anvendes. Fortrinnsvis blir løsningsbasert måling anvendt. U.S. søknad 09/314.464, innlevert mai 18, 1999, herved inntatt som referanse, beskriver slik måling. Alternativt blir konvensjonelle metoder anvendt. For eksempel kan Pj frigjøring fra kinesin kvantifiseres. I én foretrukket utførelsesform anvender ATPase- hydrolyseaktivitetsmålingen 0,3 M PCA (perklorsyre) og malachittgrønn-reagens (8,27 mM natrium olybdat H, 0,33 mM malachittgrønnoksalat og 0,8 mM Triton X-l 00). For å utføre målingen blir 10 jol av reaksjon behandliet i 90 ^1 kald 0,3 M PCA. Fosfatstandarder blir anvendt slik at data kan omdannes til frigjort mM uorganisk fosfat. Når alle reaksjoner og standarder er behandlet i PCA, blir 100 uJ malachitt- grønn-reagens satt til de relevante brønner i f.eks. en mikrotiter plate. Blandingen blir utviklet i 10-15 minutter, og platen avleses ved en absorbans på 650 nm. Hvis fosfat- standarder blir anvendt, kan absorbansavlesninger omdannes til mM Pj og plottes over tid. I tillegg omfatter ATPase-måling kjent på området luciferasemåling. ATPase-aktivitet av kinesinmotordomener også kan anvendes til å følge virkningene av modulerende midler. I én utførelsesform blir ATPase-måling av kinesin utført i fravær av mikrotubuler. Ved en annen utførelsesform blir ATPase-målingen utført i nærvær av mikrotubuler. Forskjellig typer av modulerende midler kan detekteres i målingen ovenfor. I en foretrukket utførelsesform er effekten av et modulerende middel uavhengig av konsentrasjonen av mikrotubuler og ATP. I en annen utførelsesform kan effekten av midlene på kinesin-ATPase reduseres ved å øke konsentrasjonene av ATP, mikrotubuler eller begge deler. I enda en annen utførelsesform blir effekten av det modulerende middel øket med økende konsentrasjoner av ATP, mikrotubuler eller begge deler.

Midler som modulerer den biokjemiske aktiviteten til KSP in vitro kan deretter screenes in vivo. Metoder for slik midler omfatter in vivo målinger av cellecyklus- fordeling, celle-levedyktighet eller tilstedeværelse, morfologi, aktivitet, fordeling eller mengde av mitotiske spindler. Metoder for overvåkning av cellecyklus-fordeling av en celle-populasjon, for eksempel ved strømnings-cytometry, er velkjent for fagfolk på området, liksom metoder for å bestemme celle-levedyktighet. Se for eksempel U.S. Patentsøknad "Methods of Screening for Modulators of Cell Proliferation and Methods of Diagnosing Cell Proliferation States," innlevert okt. 22,1999, serial number 09/428.156, herved inntatt som referanse.

I tillegg til målingene beskrevet ovenfor er mikroskopiske metoder for overvåkning av spindel-dannelse og feildannelse velkjente for faagfolk på området (se f.eks. Whitehead and Rattner (1998), J. Celle Sei. 111:2551-61; Galgio et al, (1996) J. Cell Biol., 135:399-414).

Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse hemmer KSP-kinesin. Ett mål for hemning er IC50, definert som konsentrasjonen av preparatet ved hvilket aktiviteten til KSP blir redusert ved femti prosent. Foretrukne forbindelser har ICsoer på mindre enn ca. 1 mM, idet foretrukne utførelsesformer har IC5o'er på mindre enn ca. 100 (JM, idet mer foretrukne utførelsesformer har ICso'er på mindre enn ca. 10 |iM, med spesielt foretrukne utførelses-former som har ICso'er på mindre enn ca. 1 jiM og spesielt foretrukne utførelsesformer som har ICso'er på mindre enn ca. 100 nM og med de mest foretrukne utførelsesformer som har ICso'er på mindre enn ca. 10 nM. Måling av IC30 blir utført ved anvendelse av en ATPase-måling.

Et annet mål for hemning er IQ. For forbindelser med ICso'er mindre enn 1 jtM, er K; eller Kd definert som dissosieringsgradkonstanten for interaksjonen av kinazolinonet med KSP. Foretrukne forbindelser har Kj'er på mindre enn ca. 100 |iM, idet foretrukne utførelses-former har K;'er på mindre enn ca. 10 fiM, og spesielt foretrukne utførelsesformer har Kj'er på mindre enn ca. 1 pM, og spesielt foretrukne utførelsesformer har Kj'er på mindre enn ca. 100 nM, og idet de mest foretrukne utførelsesformer har Ki'er på mindre enn ca. 10 nM. Kj for en forbindelse blir bestemt fra IC50 basert på tre forutsetninger. Først binder bare ett forbindelsesmolekyl til enzymet, og det er ikke noe samvirke. Dernest er konsentrasjonene av aktivt enzym og forbindelsen som blir testet er kjent (dvs. det foreligger ikke noen nevneverdige mengder av urenheter eller inaktiv forme i preparatene). For det tredje er den enzymatiske grad av enzym-inhibitor-komplekset null. Graden (dvs. forbindelseskonsentrasjons) data er tilpasset ligningen:

Når V er den observerte grad, er Vm& s. graden av det fri enzym, Io er inhibitor-konsentrasjonen, Eo er enzymkonsentrasjon en, og Kj er dissosiasjonskonstanten til enzym-inhibitor-komplekset.

Et annet mål for hemning er GI50, definert som konsentrasjonen av forbindelsen som resulterer i en reduksjon i graden av cellevekst med femti prosent. Foretrukne forbindelser har GIso'er på mindre enn ca. 1 mM. Nivået av preferanse av utførelsesformer er en funksjon av deres GI50: de som har GI5o'er på mindre enn ca. 20 [ iM er mer foretrukket; de som har GWer på 10 )iM enda mer; de som har GI50 på mindre enn ca. 1 |xM enda mer; de som har GW er på 100 nM enda so; de som har GI50 på mindre enn ca. 10 nM enda mer. Måling av GI50 blir utført ved anvendelse av en celleproliferasjonsmåling.

Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse blir anvendt for å behandle cellulære proliferasjonsykdornmer. Sykdomstilstander som kan behandles ved forbindelsene tilveiebrakt her omfatter, kreft (videre beskrevet nedenfor), autoimmun sykdom, artritt, transplantatavvisning, inflammatorisk tarmsykdom, proliferasjon fremkalt etter medisinske prosedyrer, omfattende, men ikke begrenset til, kirurgi, angioplasti og lignende. Det er klart at i noen tilfeller behøver cellene ikke være i en hyper- eller hypoproliferasjons-tilstand (unormal tilstand) og likevel kreve behandling. For eksempel under sårheling kan cellene være prolifererende "normalt", men proliferasjonsøkning kan være ønsket. Tilsvarende, som beskrevet ovenfor, på jordbruksområdet, kan celler være i en "normal" tilstand, men proliferasjonsmodulering kan være ønsket for å forbedre en avling ved direkte å øke vekst av en avling eller ved å hemme veksten av en plante eller organisme som negativt påvirker avlingen. Således omfatter i én utførelsesform oppfinnelsen her applikasjon til celler eller individer rammet eller truet av inntreff av hvilken som helst av disse forstyrrelser eller tilstander.

Forbindelsene tilveiebrakt her anses som spesielt anvendelige for behandling av kreft omfattende faste tumorer så som hud, bryst, hjerne, cervikale karsinomer, testikkel-karsinomer, etc. Mer spesielt kan medikamentene som fremstilt med bruk av forbindelsene ifølge oppfinnelsen anvendes i behandling av kreft omfattende Hjerte: sarkom (angiosarkom, fibrosarkom, rhabdomyosarkom, Iiposarkom), myxoma, rhabdomyoma, fibroma, lipoma og teratoma; Lunge: bronkogent karsinom (platecelle, udifferensiert små-celle, udifferensiert stor-celle, adenokarsinom), alveolær (bronchiolar) karsinom, bronkiai adenoma, sarkom, lymfom, chondromatøs hamartoma, mesothelioma; Gastrointestinal: spiserør (platecelle-karsinom, adenokarsinom, leiomyosarkom, lymfom), mage (karsinom, lymfom, leiomyosarkom), bukspyttkjertel (ductal adenokarsinom, insulinoma, glucagonoma, gastrinom, carcinoide tumorer, vipoma), tynntarm (adenokarsinom, lymfom, carcinoide tumorer, Karposi's sarkom, leiomyoma, nemangioma, lipoma, neurofibroma, fibroma), tykktarm (adenokarsinom, tubular adenoma, villous adenoma, hamartoma, leiomyoma); Genitourinkanal: nyre (adenokarsinom, Wiln<V>s tumor [nephroblastoma], lymfom, leukemi), blære og urethra (platecelle karsinom, transisionelt celle-karsinom, adenokarsinom), prostata (adenokarsinom, sarkom), testikkel (seminoma, teratoma, embryonal karsinom, teratokarsinom, choriokarsinom, sarkom, interstisiell celle-karsinom, fibroma, fibroadenoma, adenomatoide tumorer, lipoma); Lever: hepatoma (hepatocellulær karsinom), cholangiokarsinom, hepatoblastoma, angiosarkom, hepatocellulær adenoma. hemangioma; Ben: osteogen sarkom (osteosarkom), fibrosarkom, ondartet fibrøs histiocytoma, chondrosarkom, Ewing's sarkom, ondartet lymfom (reticulum celle-sarkom), multippel myelom, ondartet gigantcelle-tumor chordoma, osteochronfroma (osteocartilaginøs exostoses), godartet chondroma, chondroblastoma, chondromyxofibroma, osteoid osteoma og gigantcelle-tumorer; Nervesystem: skalle (osteoma, hemangioma, granuloma, xanthoma, osteitis deformans), meninges (meningioma, meningiosarkom, gliomatosis), hjerne (astrocytoma, medulloblastoma, glioma, ependymoma, germinoma [pinealoma], glioblastoma multiform, oligodendroglioma, schwannoma, retinoblastoma, congenital tumorer), ryggmarg neurofibroma, meningioma, glioma, sarkom); Gynekologisk: livmor (endometrial karsinom), cervix (cervikal karsinom, pre-tumor cervikal dysplasia), ovarier (eggstokk-karsinom [serøs cystadenokarsinom, mucinøs cystadenokarsinom, uklassifisert karsinom], granulosa-thecal-celle-tumorer, Sertoli-Leydig celle-tumorer, dysgerminoma, ondartet teratoma), vulva (platecelle- karsinom, intraepithelial karsinom, adenokarsinom, fibrosarkom, melanom), vagina (klarcelle-karsinom, platecelle-karsinom, botryoid sarkom (embryonal rhabdomyosarkom], fallopian-rør (karsinom); Hematologisk: blod (myeloid leukemi [akutt og kronisk], akutt lymphoblast-leukemi, kronisk lymfocytisk leukemi, myeloproliferative sykdommer, multippel myelom, myelodysplastic syndrom), Hodgkin's sykdom, ikke-Hodgkin's lymfom [ondartet lymfom]; Hud: ondartet melanom, basalcelle-karsinom, platecelle-karsinom, Karposi's sarkom, mol dysplastisk nevi, lipoma, angioma, dermatofibroma, keloids, psoriasis; og Adrenal kjertler: neuroblastoma. Således omfatter betegnelsen "cancerøs celle" som angitt her en celle rammet av hvilken som helst av de ovenfor nevnte tilstander.

Følgelig blir forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse administrert til celler. Med "administrert" her menes administrering av en terapeutisk effektiv dose av de mitotiske midler ifølge foreliggende oppfinnelse til en celle enten i cellekultur eller hos en pasient. Med "terapeutisk effektive dose" her menes en dose som gir effektene for hvilke den blir administrert. Den nøyaktige dosen vil avhenge av formålet for behandlingen og vil kunne fastslås av fagfolk på området ved anvendelse av kjente teknikker. Som det er kjent på området kan justeringer for systemisk fremfor lokal avgivelse, alder, kroppsvekt, generell helse, kjønn, diett, administreringstid, medikament-interaksjon og alvorlighetsgraden av forstyrrelsen være nødvendig og vil være tilgjengelig ved rutine-eksperimentering av fagfolk på området. Med "celler" menes her nesten hvilken som helst celle hvor mitose eller meiosis kan være endret.

En "pasient" for formålene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter både mennesker og andre dyr, spesielt pattedyr og andre organismer. Således er forbindelsene anvendelige både for human terapi og veterinærformål. I den foretrukne utførelsesform er pasienten et pattedyr, og ved den mest foretrukne utførelsesform er pasienten et menneske.

Mitotiske midler som har den ønskede farmakologiske aktivitet kan administreres i en fysiologisk akseptabel bærer til en pasient som beskrevet her. Avhengig av innføringsmåten kan forbindelsene formuleres på en rekke måter som er beskrevet nedenfor. Konsentrasjonen av terapeutisk aktiv forbindelse i preparatet kan variere fra ca. 0,1-100 vekt.%. Midlene kan administreres alene eller i kombinasjon med andre behandlinger, dvs. stråling eller andre kjemoterapeutiske midler.

I en foretrukket utførelsesform foreligger de farmasøytiske preparater i en vannoppløselig form, så som farmasøytisk akseptable salter, som skal omfatte både syre- og base-addisjonssalter. "Farmasøytisk akseptabelt syre-addisjonssalt" angir de salter som beholder den biologiske effektiviteten til de frie basene, og som ikke er biologisk eller på annen måte uønskede, dannet med uorganiske syrer så som saltsyre, bromhydrogensyre, svovelsyre, salpetersyre, fosforsyre og lignende og organiske syrer så som eddiksyre, propionsyre, glykolsyre, pyrodruesyre, oksalsyre, maleinsyre, malonsyre, ravsyre, fumarsyre, vinsyre, sitronsyre, benzosyre, kanelsyre, mandelsyre, metansulfonsyre, etansulfonsyre, p-toluensulfonsyre, salisylsyre og lignende. "Farmasøytisk akseptable base-addisjonssalter" omfatter de som er avledet fra uorganiske baser så som natrium-, kalium-, litium-, ammonium-, kalsium-, magnesium-, jern-, sink-, kobber-, mangan-, aluminiumsalter og lignende. Spesielt foretrukket er ammonium-, kalium-, natrium-, kalsium- og magnesiumsaltene. Salter avledet fra farmasøytisk akseptable organiske, ikke-toksiske baser omfatter salter av primære, sekundære og tertiære aminer, substituerte aminer omfattende naturlig forekommende substituerte aminer, cykliske aminer og basiske ionebytterharpikser, så som isopropylamin, trimetylamin, dietylamin, trietylamin, tripropylamin og etanolamin.

De farmasøytiske preparater kan fremstilles i forskjellige former, så som granulater,

tabletter, piller, suppositorier, kapsler, suspensjoner, salver, losjoner og lignende. Organiske eller uorganiske bærere og/eller fortynningsmidler av farmasøytisk kvalitet egnet for oral og topisk anvendelse kan anvendes til å ferdigstille preparater inneholdende de terapeutisk aktive forbindelser. Fortynningsmidler kjent på området omfatter vandige medier, vegetabilske og animalske oljer og fett. Stabiliserende midler, fukte- og emulgeringsmidler, salter for å variere det osmotiske trykket eller buffere for å sikre en tilstrekkelig pH-verdi og hudpenetreringsøkningsmidler kan anvendes som hjelpemidler. De farmasøytiske preparater kan også omfatte én eller flere av de følgende: bærerproteiner så som serum albumin; buffere; fyllmidler så som mikrokrystallinsk cellulose, laktose, mais og andre stivelser; bindemidler; søtningsmidler og andre smaksgivende midler; fargemidler; og polyetylenglykol. Additiver er velkjente på området og blir anvendt i en rekke formuleringer.

Administreringen av de mitotiske midler ifølge foreliggende oppfinnelse kan foretas på en rekke måter som beskrevet ovenfor, omfattende, men ikke begrenset til, oralt, subkutant, intravenøst, intranasalt, transdermalt, intrapeirtonealt, intramuskulært, intrapulmonalt, vaginalt, rektalt eller intraokulært. I noen tilfeller, for eksempel ved behandling av sår og inflammasjon, kan de anti-mitotiske midler appliseres som en løsning eller spray.

For å anvende forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse i en metode for screening av forbindelser som binder til KSP-kinesin, blir KSP'et bundet til en bærer, og en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse (som er et mitotisk middel) blir satt til målingen. Alternativt blir forbindelsen ifølge foreliggende oppfinnelse bundet til bæreren, og KSP blir tilsatt. Klasser av forbindelser hvoriblant nye bindemidler kan søkes omfatter spesifikke antistoffer, ikke-naturlige bindemidler identifisert i screens av kjemiske biblioteker, peptid-analoger, etc. Av spesiell interesse er screenings for kandidat-midler som har en lav toksisitet for humane celler. En rekke målinger kan anvendes for dette formål, omfattende merket in vitro protein-protein-bindingsmåling, elektroforetisk mobilitets-shift-måling, immunoanalyser for proteinbinding, funksjonell måling (fosforyleringsmåling, etc.) og lignende.

Bestemmelsen av bindingen av det mitotiske middel til KSP kan foretas på flere måter. I en foretrukket utførelsesform blir det mitotiske middel (forbindelsen ifølge foreliggende oppfinnelse) merket, for eksempel med en fluorescerende eller radioaktiv gruppe og binding bestemt direkte. For eksempel kan dette foretas ved å knytte alt eller en del av KSP til en fast bærer, tilsetning av et merket mitotisk middel (for eksempel en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse hvor minst ett atom er erstattet av en detekterbar isotop), vaske av overskudd av reagens og bestemmelse av hvorvidt mengden av markøren er den som foreligger på den faste bæreren. Forskjellige blokkerings- og vasketrinn som er kjent på området kan anvendes.

Med "merket" menes her at forbindelsen er enten direkte eller indirekte merket med en markør som gir et detekterbart signal, f.eks. radioisotop, fluorescerende tag, enzym, antistoffer, partikler så som magnetisk partikler, chemiluminescent tag eller spesifikke bindingsmolekyler, etc. Spesifikke bindingsmolekyler omfatter par, så som biotin og streptavidin, digoxin og antidigoxin etc. For de spesifikke bindingselemter vil det komplementære element normalt være merket med et molekyl som gir mulighet for deteksjon i henhold til kjente prosedyrer som beskrevet ovenfor. Markøren kan direkte eller indirekte gi et detekterbart signal.

I noen utførelsesformer er bare én av komponentene merket. For eksempel kan kinesin-proteiner være merket i tyrosin-seter ved anvendelse av I eller med fluorforer. Alternativt kan mer enn én komponent være merket med forskjellige markører; ved anvendelse av <125>I for proteinene, for eksempel og en fluorfor for de mitotiske midler. Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også anvendes som konkurrenter for å screene etter ytterligere medikament-kandidater. " Bioaktivt kandidat-middel" eller "medikament-kandidat" eller grammatikalske ekvivalenter som blir anvendt her beskriver hvilket som helst molekyl, f.eks. protein, oligopeptid, lite organisk molekyl, polysakkarid, polynukleotid, etc, som skal testes for bioaktivitet. De kan være slike som direkte eller indirekte kan endre den cellulære proliferasjonsfenotypen eller ekspresjonen av en cellulær proliferasjonsekvens, omfattende både nukleinsyresekvenser og proteinsekvenser. I andre tilfeller blir endring av cellulær proliferasjon-proteinbinding og/eller aktivitet screenet. Screening av denne sort kan utføres enten i nærvær eller fravær av mikrotubuler. I tilfellet hvor proteinbinding eller aktivitet blir screenet, utelukker foretrukne utførelsesformer molekyler allerede kjent for å binde til dette spesielle protein, for eksempel polymer-strukturer så som mikrotubuler og energikilder så som ATP. Foretrukne utførelsesformer for måling her omfatter kandidat-midler som ikke binder det cellulære proliferasjons-protein i dets endogene naturlige tilstand betegnet her som "eksogene" midler. I en annen foretrukket utførelsesform utelukker eksogene midler videre antistoffer mot KSP.

Kandidatmidler kan omfatte en rekke kjemiske klasser, selv om de typisk er organiske molekyler, fortrinnsvis små organiske forbindelser som har en molekylvekt på mer enn 100 og mindre enn ca. 2500 dalton. Kandidat-midler omfatter funksjonelle grupper som er nødvendig for strukturell interaksjon med proteiner, spesielt hydrogenbinding og Hpofil binding og omfatter typisk minst en amin-, karbonyl, hydroksyl, eter- eller karboksyl-gruppe, fortrinnsvis minst to av de funksjonell kjemiske grupper. Kandidatmidlene omfatter ofte cykliske karbon- eller heterocykliske strukturer og/eller aromatiske eller polyaromatiske strukturer substituert med én eller flere av de funksjonelle grupper ovenfor. Kandidat-midler blir også funnet blant biomolekyler omfattende peptider, sakkarider, fettsyrer, steroider, puriner, pyrimidiner, derivater, strukturelle analoger eller kombinasjoner derav. Spesielt foretrukket er peptider.

Kandidatmidler blir oppnådd fra en rekke kilder omfattende biblioteker av syntetiske eller naturlige forbindelser. For eksempel er en rekke midler tilgjengelige for randomisert og rettet syntese av en rekke organiske forbindelser og biomolekyler, omfattende ekspresjon av randomiserte oligonukleotider. Alternativt er biblioteker av naturlige forbindelser i form av bakterielle, sopp-, plante- og dyre-ekstrakter tilgjengelige eller lett å produsere. I tillegg blir naturlige eller syntetisk produserte biblioteker og forbindelser lett modifisert ved konvensjonelle kjemiske, fysiske og biokjemiske midler. Kjente farmakologiske midler kan underkastes rettete eller randomiserte kjemiske modifikasjoner, så som acylering, alkylering, forestring, amidering for å fremstille strukturelle analoger. Kompetitive screeningsmålinger kan foretas ved å kombinere KSP og en medikament-kandidat i en første prøve. En andre prøve omfatter en mitotisk middel, KSP og en medikamentkandidat. Dette kan utføres enten i nærvær eller fravær av mikrotubuler. Bindingen av medikamentkandidaten blir bestemt for begge prøver, og en forandring eller forskjell i binding mellom de to prøver indikerer tilstedeværelsen av et middel som er i stand til å binde til KSP og potensielt modulere dens aktivitet. Det betyr at hvis bindingen av medikamentkandidaten er forskjellig i den andre prøve i forhold til den første prøve, er medikamentkandidaten i stand til å binde til KSP.

I en foretrukket utførelsesform blir bindingen av kandidatmiddelet bestemt gjennom anvendelse av kompetitiv bindingsmåling. I denne utførelsesform er konkurrenten en bindingsgruppe kjent for å binde til KSP, så som et antistoff, peptid, bindingspartner, ligand, etc. Under visse omstendigheter kan det være konkurrerende binding så som mellom kandidatmiddelet og bindingsgruppen, idet bindingsgruppen fortrenger kandidatmiddelet.

I én utførelsesform er kandidatmiddelet merket. Enten kandidatmiddelet eller konkurrenten eller begge blir tilsatt først til KSP i en tilstrekkelig tid til å muliggjøre binding hvis den er til stede. Inkuberinger kan utføres ved hvilken som helst temperatur som fremmer optimal aktivitet, typisk mellom 4 og 40°C.

Inkuberingsperioder velges for optimum aktivitet, men kan også optimaliseres for å lette raskt høyt screening-gjennomløp. Typisk vil mellom 0,1 og 1 time være tilstrekkelig. Overskudd av reagens blir generelt fjernet eller vasket vekk. Den andre komponent blir deretter tilsatt, og nærvær eller fravær av den merkete komponent følges for å vise binding. I en foretrukket utførelsesform blir konkurrenten tilsatt først, fulgt av kandidat- middelet. Fortrengning av konkurrenten er en indikasjon på at kandidatmiddelet bindes til KSP og således er i stand til å binde til og potensielt modulere aktiviteten til KSP. I denne utførelsesform kan hver komponent være merket. Således for eksempel hvis konkurrenten er merket, viser tilstedeværelsen av markør i vaske- løsningen fortrengning med midlet. Alternativt, hvis kandidatmiddelet er merket, viser tilstedeværelsen av markøren på bæreren fortrengning.

I en alternativ utførelsesform blir kandidatmiddelet tilsatt først med inkubering og vasking fulgt av konkurrenten. Fravær av binding til konkurrenten kan vise at kandidatmiddelet bindes til KSP med en høyere affinitet. Således, hvis kandidat- middelet er merket, kan tilstedeværelsen av markøren på bæreren, koblet med en mangel på konkurrentbinding, indikere at kandidatmiddelet er i stand til å binde til KSP.

Det kan være verdifullt å identifisere bindingssetet for KSP. Dette kan gjøres på en rekke måter. I én utførelsesform, så snart KSP er identifisert å binde til det mitotiske middel, blir KSP fragmentert eller modifisert og målingene gjentatt for å identifisere de nødvendige komponenter for binding.

Modulering blir testet ved å screene etter kandidat-midler som kan modulere aktiviteten til KSP omfattende trinnene å kombinere et kandidat-middel med KSP som ovenfor og bestemme en endring i den biologiske aktiviteten til KSP. Således skulle i denne utførelsesform kandidatmiddelet både binde til KSP (selv om dette ikke må være nødvendig) og endre dens biologiske eller biokjemiske aktivitet som definert her. Metoden omfatter en in vitro screeningsmetode for screening for endringer i cellecyklus-fordeling, celle-levedyktighet eller for tilstedeværelse, morfologi, aktivitet, fordeling eller mengde av mitotisk spindler, som er generelt beskrevet ovenfor.

Alternativt kan differensiell screening anvendes for å identifisere medikament- kandidater som binder til det naturlige KSP, men ikke kan binde til modifisert KSP.

Positive kontroller og negative kontroller kan anvendes i målingene. Fortrinnsvis blir alle kontroll- og testprøver utført minst tre ganger for å oppnå statistisk signifikante resultater. Inkubering av alle prøver gjøres i en tid som er tilstrekkelig for bindingen av midlet til proteinet. Etter inkubering blir alle prøver vasket fri for ikke-spesifikt bundet materiale og mengden av bundet, generelt merket middel bestemt. For eksempel når en radioaktiv markør anvendes, kan prøvene telles i en scintillasjonsteller for å bestemme mengden av bundet forbindelse.

En rekke andre reagenser kan inngå i screeningmålingene. Disse omfatter reagenser som salter, nøytrale proteiner, f.eks. albumin, rensemidler, etc. som kan anvendes for å hjelpe optimal protein-protein-binding og/eller redusere ikke-speslfikke eller bakgrunns-interaksjoner. Også reagenser som på annen måte forbedrer effektiviteten av målingen, så som protease-inhibitorer, nuklease-inhibitorer, anti-mikrobiell midler, etc, kan anvendes. Blandingen av komponenter kan tilsettes i hvilken som helst rekkefølge som gir den ønskede binding.

De følgende eksempler tjener til mer fullstendig å beskrive anvendelsesmåten av den ovenfor beskrevne oppfinnelse, så vel som å angi de beste former som kan tenkes for å utføre forskjellige aspekter ved foreliggende oppfinnelse.

EKSEMPLER

Forkortelser og definisjoner De følgende forkortelser og betegnelser har de angitte betydninger hele veien:

Ac = acetyl

BNB = 4-brommetyl-3-nitrobenzosyre

Boe = t-butyloksy karbonyl

Bu = butyl

c- = cyklo

CBZ = karbobenzoksy = benzyloksykarbonyl DBU = diazabicyklo[5,4,0]undec-7-en DCM = diklormetan = metylenklorid = CH2CI2 DCE dikloretylen

DØDE = dietyl-azodikarboksylat

DIC = diisopropylkarbodiimid

DIEA = N,N-diisopropyletylamin

DMAP = 4-N,N-dimetylaminopyridin

DMF = N,N-dimetylformamid

DMSO = dimetylsulfoksyd

DVB = 1,4-divinylbenzen

EEDQ = 2-etoksy-l-etoksykarbonyl-l,2-dihydrokinolin Et = etyl

Fmoc = 9-fluorenylmetoksykarbonyl

GC = gasskromatografi

HATU = 0-(7-Azabenzotriazol-l-yl)-l,l,3,3-tetrametyluronium

heksafluorfosfat

HMDS = heksametyldisilazan

HOAc = eddiksyre

HOBt = hydroksybenzotriazol

Me = metyl

mesyl = metansulfonyl MTBE = metyl-t-butyleter

NMO = N-metylmorfolinoksyd

PEG = polyetylenglykol

Ph = fenyl

PhOH = fenol

PfP = pentafluorfenol

PPTS = pyridinium-p-toluensulfonat

Py = pyridin

PyBroP = brom-tris-pyrrolidino-fosfoniumheksafluorfosfat rt = romtemperatur sat=d = mettet

s- = sekundær

t- = tertiær

TBDMS = t-butyldimetylsilyl TES = trietylsilan

TFA = trifluoreddiksyre THF = tetrahydrofuran TMOF = trimetyl ortoformiat

TMS = trimetylsilyl

tosyl = p-toluensulfonyl

Trt = trifenylmetyl

Eksempel 1

Syntese av forbindelser

Den generelle syntese er vist i Figur 1 og 2.

Trinn 1: N-butyryl-antranilsyre.

Til en 500 ml rundbunnet trehalskolbe utstyrt med et termometer, dråpetrakt og en effektiv magnetisk rørestav sattes antranilsyre (1) (0,5 mol, 68,5 g) og dimetylformamid (250 ml). Til denne løsningen sattes butyrylklorid (0,55 mol, 57,1 ml) dråpevis ved slik hastighet at temperaturen i blandingen ikke steg over 40°C. Suspensjonen ble rørt kraftig ved romtemperatur i minst ytterligere 3 timer. Blandingen ble hellet i vann (2000 ml) og rørt i 1 time til. Det utfelte produktet ble oppsamlet ved filtrering, vasket med kaldt vann og tørket under redusert trykk over P2O5, hvilket ga forbindelse 2 (67,3 g, 65%).

Trinn 2: 2-Propy 1-3,1 - [4H]benzoksazin-4-on.

Forbindelse 2 (51,8 g, 0,25 mol) ble oppløst i eddiksyreanhydrid (180 ml) i en 500 ml rundkolbe utstyrt med en magnetisk rørestav, et Claisen-destillasjonshode (med vakuum innløp) og et termometer. Kolben ble plassert i et oljebad og langsomt oppvarmet til 170-180°C under kraftig røring. Eddiksyren som ble dannet ble langsomt avdestillert under atmosfærisk trykk. Overvåkning av utløpstemperaturen på destillasjonsenheten ble anvendt for å følge fremgangen av transformasjonen. Reaksjonsblandingen ble deretter avkjølt til 60 °C og overskudd av eddiksyreanhydrid fjernet ved destillasjon under redusert trykk (ca. 20 mm Hg). Residuet ble etterpå avkjølt og produktet krystallisert. Produktet ble gnidd ut med n-heksan (75 ml) og isolert ved filtrering, hvilket ga 2-propyl-3,l-[4H]benzoksazin-4-on (3) (29,3 g, 62%). Prosedyren ovenfor ga forbindelse 3 tilstrekkelig ren til å anvende direkte i neste trinn.

Trinn 3: 2-Propyl-3-benzylkinazolin-4-on.

Forbindelse 3 (28,4 g, 0,15 mol) og benzylamin (17,5 ml, 0,16 mol) ble tilbakeløpskokt i kloroform (50 ml) i en énhalset 250 ml rundkolbe i 6 timer. Etter fullstendig forbruk av forbindelse 3 ble kloroformen inndampet under redusert trykk. Etylenglykol (100 ml) og NaOH pellets (0,60 g) ble satt til residuet og kolben utstyrt med et Claisen-destillasjonshode og en magnetisk rørestav. Kolben ble nedsenket i et oljebad og gjenoppvarmet til 130-140 °C badtemperatur under kraftig røring og holdt der i 5 timer mens vannet som ble dannet ble fjernet ved destillasjon. Etter fullføring av reaksjonen fikk den klare løsningen avkjøles til romtemperatur og ble holdt natten over for å utfelle produktet. pH i suspensjonen ble regulert til 7-8 ved tilsetning av 3% vandig HC1, krystallene ble filtrert fra og vasket med kaldt vann og deretter omkrystallisert fra isopropanol (eller alternativt fra aceton) for å gi forbindelsen, 2-propyl-3-benzylkinazolin-4-on (forbindelse 4) (28,0 g, 67%).

Trinn 4: 2-(r-brompropyl)-3-benzylkinazolin-4-on.

Til en tre-halset 250 ml rundkolbe utstyrt med et termometer, dråpetrakt og effektiv magnetisk rørestav sattes forbindelse 4 (27,8 g, 0.10 mol), vannfritt natriumacetat (10,0 g) og iseddik (130 ml). Brom (16,0 g, 0,10 mol) oppløst i eddiksyre (10 ml) ble satt dråpevis til løsningen ovenfor ved 40 °C i 1-2 timer. Etter at tilsetningen var ferdig ble blandingen hellet i vann (1500 ml) og rørt i 1-2 timer ved romtemperatur. Det utfelte produktet, 2-0'-brompropyl)-3-benzylkinazolin-4-on (5) ble isolert ved filtrering, vasket med varmt vann for å fjerne spor av eddiksyre og skyllet med en liten mengde av isopropanol. Tørking ga forbindelse 5 (33,0 g, 92%).

Trinn 5: 2- [r-(N,N-dimetyletylendiamino)propyl]-3-benzylkinazolin-4-on.

Forbindelse 5 (10,7 g, 0,03 mol) og N,N-dimetyletylendiamin (6,6 ml, 0,06 mol) ble oppløst i abs. etanol (60 ml) og oppvarmet ved tilbakeløp i 6 timer. Etter fullføring av reaksjonen ble løsningsmidlet avdampet under redusert trykk. Residuet ble oppløst i diklormetan (150 ml) og vasket med 3% vandig NaOH-løsning (ca. 10-20 ml). Det organiske sjiktet ble tørket over MgSO* og inndampet til tørrhet under redusert trykk. Det gjenværende oljeaktige produkt ble renset ved flashkromatografi på et kort silikagelsjikt ved anvendelse av et elueringsmiddel av CHCl3-MeOH-vandig NH3,90:10:0,1, hvilket ga den ønskede forbindelse (5), 2-[r-(N,N-dimetyletylendiamino)propyl]-3-benzylkinazolin-4-on (6) (6,0 g, 55%).

Trinn 6: 2-[r-(N-4-fluorbenzoyl)-(N,N-dimetyletylendiamino)propyl]-3-benzylkinazolin-4-on.

En stamløsning av forbindelse 5 (1,822 g, 5,0 mmol) ble fremstilt i HPLC-kvalitet CHCI3 (0,5 ml). En stamløsning av p-flurobenzoylklorid (160,2 mg, 1 mmol) i HPLC-kvalitet 1,2-dikloretan (2,0 ml) ble fremstilt i en 2,0 ml volumetrisk kolbe. En tredje løsning av

trietylamin (2,0 ml 0,5 M) ble fremstilt i HPLC-kvalitet 1,2-dikloretan. En 100 pl alikvot av hver løsning ble pipettert i et glass-reaksjonkar ved anvendelse av en Beckman Biomet 2000 automatisert væskedispenser. Reaksjonsblandingen ble ristet ved anvendelse av en mekanisk ryster, ultralydbehandlet i et ultralydvannbad og deretter inkubert natten over ved romtemperatur. Blandingen ble fortynnet i CHC13 (300 JJ.1) og vasket med 5% vandig NaHC03 og vann. Løsningsmidlet ble fjernet i vakuum for å gi forbindelse 6 (65%). Renheten av forbindelsen ble analysert ved TLC eluert med CHjCk-etanol-konsentrert vandig NH3,100:10:1.

Eksempler 2 og 3

Syntese av forbindelser med generell struktur ld

Alle vannfri løsningsmidler ble anskaffet fra Aldrich Chemical Company i SureSeal® beholdere. De fleste reagenser ble innkjøp fra Aldrich Chemical Company. Forkortelser: DCM, diklormetan; DIEA, N,N-diisopropyletylamin; DMF, N,N-dimetylformamid; TES, trietylsilan; TFA, trifluoreddiksyre. Rekkesyntese ble utført i 15 x 75 mm rundbunnet skrue-lokk medisinglass i en 4 x 6 rekkers aluminiumsyntese- blokk, forseglet med en Teflon-kledd gummi-membran. Reagenser ble tilsatt og vandige ekstraksjoner utført med enkel- eller flerkanalspipetter. Filtreringer ble utført ved anvendelse av Whatman/- Polyfiltronics 24 brønn, 10 ml filtrerblokker. Inndampning av flyktige materialer fra rekken ble utført med en Labconco Vortex-Evaporator eller ved blåsing med en 4 x 6 nitrogenfordeler.

Eksempel 2 (fastfase-syntese av en enkel forbindelse)

TRINN 1) 1,3-diaminopropan-tritylharpiks (Novabiochem, 1,2 mmol/g) (0,20 g, 0,24 mmol) ble veiet i et skrue-lokk-medisinglass, og 3 ml av en 1:1 blanding av DMF og kloroform ble tilsatt. DIEA (0,130 ml, 0,72 mmol) og 2-(l'-brompropyl)-3-benzylkinazolin-4-on (fra Eksempel 1) (0,188 g, 0,48 mmol) ble tilsatt. Medisinglasset ble forseglet, oppvarmet til 70 <e>C og ristet natten over. Harpiksen ble filtrert og vasket (3 x DCM, 2 x MeOH, 1 x DCM, 2 x eter) og tørket under vakuum. En 27 mg alikvot av harpiks ble behandlet med 5:5:90 TFA:TES:DCM i 15 miri, og blandingen ble filtrert og inndampet, hvilket førte til 8 mg (64% utbytte) av kinazolinon-diamin-mellomproduktet. LCMS-analyse viste >80 % renhet.

TRINN 2) Harpiksen fra Trinn 1 ble svellet i 3 ml DCM. DIEA (0,130 ml, 0,72 mmol) og 4-brombenzylbromid (0,12 g, 0,48 mmol) ble tilsatt. Medisinglasset ble forseglet og ristet natten over. LCMS-analyse av en spaltet alikvot viste en omtrent 1:1 blanding av utgangsmateriale og produkt. Ytterligere 0,130 ml DIEA og 0,12 g 4-brombenzylbromid ble tilsatt, og blandingen ble ristet ved 70 °C i 8 timer. Harpiksen ble filtrert, vasket (som ovenfor) og tørket under vakuum.

TRINN 3) Harpiksen fra Trinn 2 ble to ganger ristet i 30 min med 5:5:90 TFA:TES:DCM og filtrert. Filtratene ble samlet og inndampet, hvilket ga 140 mg av en oransje olje. Dette materialet ble renset ved reversfase preparativ HPLC (acetonitirl-vann-gradient) og ga 27 mg (17% i 3 trinn) av mono-TFA-saltet.

Eksempel 3 (kombinatorisk syntese av multiple forbindelser)

TRINN 1) 1,2-diaminoetan-tritylharpiks (Novabiochem, 0,95 mmol/g) (200 g, 1,9 mmol) og 1,3-diaminopropan-tritylharpiks (Novabiochem, 1,14 mmol/g) (2,0 g, 2,28 mmol) ble hver plassert i forskjellige 10 ml polypropylenfritterør (Bio-Rad). Til hvert

sattes tilsatt 4 ml DMF, 4 ml kloroform, 3 ekv. DIEA (1,0 ml og 1,2 ml, henholdsvis) og 2 ekv. 2-(l'-brompropyl)-3-benzylkinazolin-4-on (fra Eksempel 1) (henholdsvis 1,5 g og 1,8

g). Blandingene ble ristet ved 70 °C natten over. Hver blanding ble vasket (3 x DCM, 2 x

MeOH, 1 x DCM, 2 x eter) og tørket under vakuum. Analyse av en spaltet alikvot viste tilstedeværelsen av det riktige kinazolinon-diamin for hver i >90 % renhet.

TRINN 2) Kinazolinon-etyl-diamin-harpiksen (105 mg, 0,10 mmol) ble plassert i hvert av glassene i de først 2 rekker av oppstillingen, og kinazolinon-propyl-diamin-harpiksen (88 mg, 0,10 mmol) ble plassert i hvert medisinglass av siste 2 rekker i oppstillingen. Til hvert glass sattes DIEA (0,131 ml, 0,75 mmol). Til hvert glass i de første 2 rekker i oppstillingen sattes et forskjellig amin, og tilsetningene ble gjentatt for siste to rekker i oppstillingen. Reaksjonsblokkene ble ristet ved 70 °C natten over. Væske ble fjernet fra hvert glass med flerkanalpipette under anvendelse av fin-spissete gel-brønntupper, og harpiksene ble vasket (2 x DCM, 1 x MeOH, 1 x DCM) og tørket under vakuum.

TRINN 3) Til hvert glass i oppstillingen sattes 2 ml av en 10:5:85 TFA:TES:DCM-løsning. Reaksjonsblokkene ble ristet i 45 min, og blandingene ble overført til en filterblokker, filtrert og vasket to ganger med 0,75 ml DCM. Løsningene ble inndampet, hvilket ga gule-til-røde oljer. Disse tykke oljer ble gnidd ut to ganger med eter, oppløst i DCM og behandlet med 4 M HC1 i dioksan for å oppnå HCl-saltene (ukjent antall salter pr. forbindelse) som gyldenbrune-til-hvite pulverformige eller amorfe faste stoffer. Analyse med LCMS viste at alle var >75 % rene.

Eksempler 4-6

Seks racemiske kinazolinoner ble separert i sine enantiomere ved chiral kromatografi. Den chirale kromatografi av tre av disse forbindelser er beskrevet nedenfor:

Eksempel 4:

Kolonne - Chiralpak AD, 250 x 4,6 mm (Diacel Inc.). Prøve - 0,5 mg/ml i EtOH. Betingelser - 15 min ved 60% EtOH i heksan, enantiomer 1 eluerer ved 4,5 min, enantiomer 2 eluerer ved 4,9 min.

Eksempel 5:

Kolonne - Chiralcel OJ, 250 x 4,6 mm (Diacel Inc.). Prøve - 0,5 mg/ml i EtOH. Betingelser -15 min ved 10% EtOH i heksan, (R)-enantiomer eluerer ved 8,4 min, (S)-enantiomer eluerer ved 9,6 min.

Eksempel 6:

Kolonne - Chiralpak AD, 250 x 4,6 mm (Diacel Inc.). Prøve - 0,5 mg/ml i EtOH. Betingelser -15 min ved 70% EtOH i Heksan, enantiomer 1 eluerer ved 6,5 min, enantiomer 2 eluerer ved 8,8 min.

Tabellen nedenfor viser IC50 aktiviteten til racematet og enantiomerene av tre andre forbindelser separert som ovenfor. I alle tre tilfeller var én enantiomer betydelig sterkere enn den andre. Ved uavhengig chiral syntese vises det at den mer aktive enantiomer er R-enantiomeren.

Eksempler 7 og 8

De følgende to forbindelser ble syntetisert som enkelt-enantiomerer ad veien som er vist på Figur 4. Dataene indikerer at den mer aktive enantiomer er R- enantiomeren.

Eksempel 9

Chiral spaltning ved omkrystallisering med vinsyre

Mellomprodukt A, fremstilt i Eksempel 1, kan omdannes til et mellomprodukt B, som, etter spaltning, gir et alternativ til de første fem trinn vist på Figur 4. Fremgangsmåten er vist i skjemaet nedenfor:

Æ-enantiomeren av B kan krystalliseres selektivt ved oppvarmning en blanding av B med 1,1 ekvivalenter av D-vinsyre i en blanding av isopropanol og metanol og deretter la blandingen vende tilbake til romtemperatur.

Eksempel 9: X = Cl, R = H

Racemisk mellomprodukt B (1,5 g), oppløst i 100 ml kokende isopropanol, ble blandet med 0,8 g D-vinsyre i 100 ml kokende metanol. Blandingen fikk langsomt nå romtemperatur. Etter henstand natten over ble det faste stoffet fjernet ved filtrering og skyllet med etylacetat og heksaner og fikk lufttørke. Det tørkede, faste stoffet (0,8 g) ble deretter oppløst i en kokende blanding av 50 ml isopropanol og 50 ml metanol og fikk langsomt avkjøles til romtemperatur. Etter henstand natten over ble det resulterende faste stoffet fjernet ved filtrering og skyllet med etylacetat og heksaner og fikk lufttørke. Det tørkede, faste stoffet ble deretter rørt med mettet natriumbikarbonat i 30 min og ekstrahert med etylacetat. De organiske faser ble tørket (MgS04), filtrert og inndampet til tørrhet. Den resulterende klare olje veiet 345 mg. Chiral renhet av >95% ble bestemt ved omdannelse av en del til S-Mosher-amid og undersøkelse av produktet med <*>HNMR. Enantiomert rene forbindelser nedenfor ble fremstilt i henhold til de gjenværende trinn i Figur 4, fra materiale som er et resultat av metoden beskrevet ovenfor ved anvendelse av både D- og L-vinsyre.

Induksjon av mitotisk stopp i cellepopulasjoner behandlet med en kinazolinon KSP

inhibitor

FACS analyse for å bestemme cellecyklustrinn ved å måle DNA-innhold ble utført som følger. Skov-3 celler (human eggstokk-kreft) ble splittet 1:10 for plating i 10 cm skåler og dyrket til sammenflyting med RPMI1640 medium inneholdende 5% føtalt bovint serum (FBS). Cellene ble deretter behandlet med enten 10 nM paclitaxel, 400 nM kinazolinon 1, 200 nM kinazolinon 2 eller 0,25% DMSO (konstituent for forbindelser) i 24 timer. Celler ble deretter skyllet av platene med PBS inneholdende 5mM EDTA, pelletert, vasket én gang i PBS inneholdende 1% FCS og deretter fiksert natten over i 85% etanol ved 4°C. Før analyse ble cellene pelletert, vasket én gang og merket i en løsning av 10 u.g propidiumjodid og 250 u.g ribonuclease (RNAse) A pr. milliliter ved 3TC i en halv time. Strømningscytometri-analyse ble utført på en Becton-Dickinson FACScan og data fra 10000 celler pr. prøve ble analysert med Modfit software.

Kinazolinonforbindelsene så vel som det kjente anti-mitotisk middel paclitaxel, forårsaket en forskyvning i populasjonen av celler fra et G0/G1 cellecyklustrinn (2n DNA innhold) til et G2/M cellecyklustrinn (4n DNA innhold). Andre forbindelser fra denne klassen ble funnet å ha lignende effekter.

Monopolar spindeldannelse etter applikasjon av en kinazolinon KSP-inhibitor

For å bestemme typen av G2/M akkumulering ble humane tumorcellelinjer Skov-3 (eggstokk-), HeLa (cervikal) og A549 (lunge) ble platet i 96-brønner plater i densiteter på 4000 celler pr. brønn (SKOV-3 & HeLa) eller 8000 celler pr. brønn (A549), fikk hefte i 24 timer og behandlet med forskjellige konsentrasjoner av kinazolinonforbindelsene i 24 timer. Celler ble fiksert i 4% formaldehyd og merket med antitubulin-antistoffer (deretter gjenkjent ved anvendelse av fluorescens-merket sekundært antistoff) og Hoechst fargestoff (som farger DNA).

Visuell inspeksjon viste at kinazolinon-forbindelsene forårsaket cellecyklus-stopp i prometafasetrinnet av mitose. DNA ble kondensert og spindeldannelse hadde begynt, men stoppete celler viste jevnt monopolare spindler, hvilket indikerer at det var en hemning av spindelpol-legemeseparering. Mikroinjeksjon av anti-KSP-antistoffer forårsaker også mitotisk stopp idet stoppete celler viste monopolare spindler.

Hemning av cellulær proliferasjon i tumorcellelinjer behandlet med kinazolinon KSP

inhibitorer.

Celler ble platet i 96-brønner plater i densiteter fra 1000-2500 celler/brønn i en 96-brønners plate (avhengig av cellelinjen) og fikk hefte/vokse i 24 timer. De ble deretter behandlet med forskjellige konsentrasjoner av medikament i 48 timer. Den tid da forbindelser tilsettes blir ansett som To. En tetrazohum-basert måling ved anvendelse av reagenset 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-5-(3-karboksymetoksyfenyl)-2-(4-sulfofenyl)-2H-tetrazolium (MTS) (I.S> Patent nr. 5.185.450) (se Promega produkt catalog ÆG3580, CeBTiter 96® Aquewis One Solution Cell Proliferation Assay) ble anvendt for å bestemme antallet levedyktige celler på To og antallet celler gjenværende etter 48 timers forbindelse-eksponering. Antallet celler tilbake etter 48 timer ble sammenlignet med antallet levedyktige celler på tidspunktet for medikament-tilsetning som muliggjorde beregning av veksthemning.

Veksten over 48 timer av celler i kontrollbrønner som var behandlet med bare konstituent (0,25% DMSO) blir betraktet som 100% vekst, og veksten av celler i brønner med forbindelser blir sammenlignet med dette. Kinazolinon KSP-inhibitorer hemmet celleproliferasjon i humane tumorcellelinjer av de følgende tumortyper: lunge (NCI-H460, A549), bryst (MDA-MB-231, MCF-7, MCF-7/ADR-RES), kolon (HT29,

HCT15), eggstokk- (SKOV-3, OVCAR-3), leukemi (HL-60(TB), K-562), sentralnervesystem (SF-268), nyre- (A498), osteosarkom (U2-OS) og cervikal (HeLa). I tillegg ble en muse-tumorlinje (Bl6, melanom) også vekst-hemmet i nærvær av kinazolinon-forbindelsene.

En Gisoble beregnet ved å plotte konsentrasjonen av forbindelse i uM mot prosentdelen av cellevekst i behandlete brønner. Giso beregnet for forbindelsene er den beregnede konsentrasjon ved hvilken vekst hemmes med 50% sammenlignet med kontroll, dvs. konsentrasjonen ved hvilken:

Alle konsentrasjoner av forbindelser blir testet i dobbelt og kontroller over 12 brønner tatt gjennomsnitt av. En meget lignende 96-brønners plate-oppstilling og Giso beregningskjema blir anvendt av The National Cancer Institute (se Monks, et al., J. Nati. Cancer Inst. 83:757-766 (1991)). Imidlertid anvender ikke metoden ved hvilket The National Cancer Institute kvantifiserer celle-antallet MTS, men anvender istedet alternative metoder.

Beregning av IC50:

Måling av et preparat's IC50 for KSP-aktivitet anvender en ATPase-måling. De følgende løsninger blir anvendt: Løsning 1 består av 3 mM fosfoenolpyruvat- kaliumsalt (Sigma P-7127), 2 mM ATP (Sigma A-3377), 1 mM IDTT (Sigma D-9779), 5 |iM paclitaxel (Sigma T-7402), 10 ppm antiskum 289 (Sigma A-8436), 25 mM Pipes/KOH pH 6,8 (Sigma P6757), 2 mM MgC12 (VWR JT400301) og 1 mM EGTA (Sigma E3889). Løsning 2 består av 1 mM NADH (Sigma N8129), 0,2 mg/ml BSA (Sigma A7906), pyruvatkinase 7U/ml, L-laktatdehydrogenase 10 U/ml (Sigma P0294), 100 nM KSP motor-domene, 50 ug/ml mikrotubuler, 1 mM DTT (Sigma D9779), 5 |JM paclitaxel (Sigma T-7402), 10 ppm antiskum 289 (Sigma A-8436), 25 mM Pipes/KOH pH 6,8 (Sigma P6757), 2 mM MgC12 (VWR JT4003-01) og 1 mM EGTA (Sigma E3889). Serie-fortynninger (8-12 to-gangers fortynninger) av preparatet tillages i en 96-brønners mikrotiterplate (Corning Costar 3695) ved anvendelse av Løsning 1. Etter seriefortynning har hver brønn 50 |il av Løsning 1. Reaksjonen startes ved tilsetning av 50 uU av løsning 2 til hver brønn. Dette kan være gjøres med en flerkanalspipette enten manuelt eller med automatisert væske-behandlingsanordninger. Mikrotiterplaten blir deretter overført til en mikroplate-absorbansleser og multiple absorbansavlesninger ved 340 nm blir tatt for hver brønn på en kinetisk måte. Den observerte grad av forandring som er proporsjonal med ATPase-mengden, blir deretter plottet som en funksjon av forbindelses-konsentrasjonen. For en standard IC50 bestemmelse tilpasses de oppnådde data med den følgende fire-parameters ligning ved anvendelse av et ikke-lineært tilpasnings- program (f.eks. Grafit 4):

hvor y er den observerte grad og x forbindelseskonsentrasjonen.

Kinazolinonforbindelsene hemmer vekst hos en rekke cellelinjer, omfattende cellelinjer (MCF-7/ADR-RES, HCT1 5) som uttrykker P-glykoprotein (også kjent som Multidrug Resistance eller MDR<+>), som overfører resistens mot andre kjemoterapeutiske medikamenter så som pacilitaxel. Derfor er kinazolinonene anti-mitotika som hemmer celleproliferasjon og er ikke gjenstand for resistens ved overekspresjon av MDR<+> ved medikament-resistente tumorlinjer.

Andre forbindelser i denne klassen ble funnet å hemme celleproliferasjon, selv om GI50 verdier varierte. GI50 verdier for kinazolinonforbindelsene som ble testet varierte fra 200 nM til mer enn den høyeste konsentrasjon som ble testet. Med dette mener vi at selv om mesteparten av forbindelsene som hemmet KSP-aktivitet biokjemisk hemmet celleproliferasjon, ble for noen i den høyeste konsentrasjon som var testet (generelt ca. 20 jiM), cellevekst hemmet mindre enn 50%. Mange av forbindelsene har GIso-verdier mindre enn 10 |iM, og mange har GIso-verdier mindre enn 1 pJM. Anti-proliferative forbindelser som med hell anvendes ved klinisk behandling av kreft (kreftkjemoterapeutika) har GIso<*>er som varierer sterkt. For eksempel i A549 celler er paclitaxel GIso 4 nM, doxorubicin er 63 nM, 5-fluoruracil er 1 uM og hydroksyurea er 500 jLiM (data gitt av National Cancer Institute, Developmental Therapeutic Program, http://dtp.nci.nih.gov/). Derfor kan forbindelser som hemmer cellulær proliferasjon i praktisk talt hvilken som helst konsentrasjon være anvendelige. Imidlertid vil fortrinnsvis forbindelser ha GIso-verdier på mindre enn 1 mM. Mer foretrukket vil forbindelser ha GIso-verdier på mindre enn 20 JiM. Enda mer foretrukket vil forbindelser ha GIso-verdier på mindre enn 10 uM. Videre reduksjon i GIso-verdier kan også være ønskelig, omfattende forbindelser med GIso verdier på mindre enn 1 jxM. Noen av kinazolinonforbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse hemmer celleproliferasjon med GIso-verdier fra under 200 nM til under 10 nM.

Claims (7)

1. Forbindelse med formelen la hvor:

(1) Ri er benzyl; R2 er etyl; R2' er hydrogen; R3 er 2-fluorfenyl; R4 er 2-dimetylaminoetyl; R5-Rg er hydrogen.

(2) Ri er benzyl; R2 er etyl; R2« er hydrogen; R3 er 3-fluorfenyl; R4 er 2-dimetylaminoetyl; Rs-Rs er hydrogen.

(3) Ri er benzyl; R2 er etyl; R2* er hydrogen; R3 er 4-fluorfenyl; R» er 2-dimetylaminoetyl; Rs-R<g> er hydrogen.

(4) Ri er benzyl; R2 er etyl; R2- er hydrogen; R3 er 3-bromfenyl; R4 er 2-dimetylaminoetyl; Rs-R<g> er hydrogen.

(5) Ri er benzyl; R2 er etyl; Rr er hydrogen; R3 er 4-bromfenyl; R4 er 2-dimetylaminoetyl; R5-R8 er hydrogen.

(6) Ri er benzyl; R2 er etyl; R2- er hydrogen; R3 er 1-naftyl; R4 er 2-dimetylaminoetyl; Rs-Rg er hydrogen.

(7) Ri er benzyl; R2 er metyl; R2- er hydrogen; R3 er 3-bromfenyl; R4 er 2-dimetylaminoetyl; R5-R8 er hydrogen.

(8) Ri er benzyl; R2 er metyl; R2- er hydrogen; R3 er 4-bromfenyl; R4 er 2-dimetylaminoetyl; R5-R8 er hydrogen.

(9) Ri er benzyl; R2 er metyl; R2- er hydrogen; R3 er 4-bromfenyl; R4 er 2-aminoetyl; Rs-Rg er hydrogen.

(10) Ri er benzyl; R2 er etyl; R2- er hydrogen; R3 er 4-bromfenyl; R4 er 2-aminoetyl; Rs-R<g> er hydrogen.

(11) R-isomer hvor Ri er benzyl; R2 er etyl; R2- er hydrogen; R3 er 4-bromfenyl; R4 er 2-dimetylaminoetyl; Rs-Rg er hydrogen.

(12) R-isomer hvor Ri er benzyl; R2 er etyl; R2- er hydrogen; R3 er 1-naftyl; R4 er 2-dimetylaminoetyl; Rs-Rg er hydrogen.

(13) R-isomer hvor Ri er benzyl; R2 er etyl; Ry er hydrogen; R3 er 4-bromfenyl; R4 er 2-dimetylaminoetyl; Rj-Rs er hydrogen.

(14) R-isomer hvor Ri er benzyl; R2 er etyl; Rr er hydrogen; R3 er 4-bromfenyl; R4 er 2-aminoetyl; Rs, Re og Rg er hydrogen og R7 er klor. eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

2. Farmasøytisk preparat omfattende en forbindelse ifølge krav 1, sammen med en fysiologisk akseptabel bærer.

3. Anvendelse av en forbindelse ifølge krav 1, ved fremstilling av et medikament for behandling av proliferative sykdommer.

4. Anvendelse ifølge krav 3, hvor den proliferative sykdom er hyperplasi, restenose, hjertehypertrofi, immunlidelser eller inflammasjon.

5. Anvendelse ifølge krav 3, hvor den proliferative sykdom er kreft.

6. In vitro metode for å hemme KSP-kinase omfattende å bringe KSP i kontakt med en forbindelse ifølge krav 1.

7. Metode for syntese av en forbindelse ifølge krav 1, som omfatter å reagere en tilsvarende forbindelse med formel lc med en tilsvarende forbindelse med formelen R3(CO)Cl og isolering av en forbindelse med formelen la.