ES2262650T5 - Utilizacion de cepas acetogenicas hidrogenotroficas para la prevencion o el tratamiento del sindrome del intestino irritable. - Google Patents

Abstract

Utilización de al menos una cepa bacteriana acetogénica hidrogenotrófica no patógena para la preparación de una composición destinada al tratamiento o la prevención de los trastornos gastrointestinales en un mamífero.

Description

Utilización de cepas acetogénicas hidrogenotróficas para la prevención o el tratamiento del síndrome del intestino irritable.

La presente invención se refiere a la utilización de cepas bacterianas acetogénicas hidrogenotróficas no patógenas autólogas para la preparación de una composición destinada al tratamiento o a la prevención en el ser humano del síndrome del intestino irritable.

La prevalencia de los trastornos digestivos funcionales o colopatías funcionales en la población occidental es muy elevada puesto que se estima que alcanzan aproximadamente 25% a 30% de la población adulta. Además, estos trastornos digestivos representan uno de los factores principales de consulta en gastroenterología (aproximadamente 50% de las consultas). Los síntomas de estos trastornos intestinales son diversos, tales como la modificación del tránsito intestinal, el meteorismo, los dolores abdominales, la hinchazón. El origen de estos trastornos funcionales sigue siendo por el momento mal definido pero se estima que los gases producidos durante la digestión en el colon tienen un papel importante en la génesis de algunos síntomas, tal como el exceso de flatulencias, la distensión abdominal (hinchazón) y los dolores asociados. Se han propuesto algunos tratamientos tal como el carbón activo, la simeticona, la esmectita, los antiespasmódicos, así como algunos complementos alimentarios a base de agentes de fermentación (Saccharomyces cerevisiae, Bifidobacterium, Lactobacillus), de plantas o de fibras (oligofructosa, hinojo, algas, avena, cítricos, etc.) o de estructura mineral (Octalita, etc.). Sin embargo, estos tratamientos presentan una baja eficacia sobre los síntomas relacionados con la formación de los gases a nivel del colon, y no actúan de manera selectiva. La presente invención propone remediar los inconvenientes de la técnica anterior, tanto en el plano del tratamiento como en el plano de la prevención de la molestia digestiva asociada con las producciones de gases cólicos.

Para ello, la invención se basa al mismo tiempo tanto en las características fisiológicas de las bacterias acetogénicas hidrogenotróficas, a saber, su capacidad para reducir el volumen total de los gases de fermentación digestivos (H_{2} y CO_{2}), como sobre su diversidad nutricional que les confiere una ventaja ecológica importante en el ecosistema digestivo, con relación a los otros microorganismos hidrogenotróficos.

En el ser humano, los glúcidos alimentarios que escapan a la digestión y a la absorción en el intestino delgado llegan al colon en el que se fermentan mediante una compleja microflora. Esta degradación anaeróbica de la materia orgánica produce metabolitos terminales en forma de ácidos grasos volátiles que tienen propiedades metabólicas (acetato, propionato) o tróficas (butirato), así como gases (H_{2}, CO_{2} y, en algunas personas, CH_{4}).

Entre estos gases de fermentación, H_{2} tiene un papel importante en el mantenimiento y la eficacia de la degradación de la materia orgánica en el colon humano. Una parte de H_{2} se elimina por vías respiratorias y rectales, pero la parte más importante de este gas se reutiliza in situ por la flora intestinal. Esta última, llamada flora hidrogenotrófica, está compuesta de bacterias acetogénicas, de bacterias reductoras de sulfato y de archaea metanogénicas.

Se encuentran las bacterias reductoras de sulfato en la microflora digestiva de todas las personas (Pochart et al. (1992) FEMS Microbiol. Lett. 98 p. 225). Estas sintetizan H_{2}S que es un producto potencialmente tóxico para las células eucariotas, y que estaría implicado en algunas enfermedades del sistema digestivo, en particular las colitis ulcerosas (Roediger et al. (1993), Gastroenterology, 104, p. 802).

Las archaea metanogénicas producen CH_{4} que es un gas no tóxico. Esta producción de metano se observa solamente en una fracción de la población humana (aproximadamente 21% de los indios adultos, 95% de la población rural de adolescentes del África negra y en 40% de la población occidental), y su eliminación se realiza por vía respiratoria y en las flatulencias (Segal et al. (1988) Gut 29 p. 608; Pochart et al. (1992) FEMS Microbiol. Lett. 98 p. 225). Estas personas llamadas metanoexcretoras, albergan una población de archaea metanogénicas muy importante (>10^{8}/g de extracto fecal seco) (Durand et al. (1996) en: Mälkki Y and Cummings JH (Ed. Official Publication of the European Communities, p. 58). En estos sujetos, la metanogénesis es la vía principal de eliminación del H_{2}.

Las personas no metanoexcretoras reutilizan el H_{2} mediante mecanismos alternativos, entre los cuales está la acetogénesis reductora. Esta vía constituye un proceso metabólico importante de utilización de H_{2} en los no metanoexcretores. En efecto, estudios han demostrado que la microflora fecal de los sujetos no metanoexcretores metaboliza principalmente el H_{2} y el CO_{2} en acetato, mientras que la de los sujetos metanoexcretores utilizan el H_{2} y el CO_{2} para formar metano (Lajoie et al. (1998) Appl. Environ. Microbiol. 54 p. 2733; Bernalier et al. (1996) FEMS Microbiol. Ecol. 19 p. 193). Paralelamente, Doré et al. (1995 FEMS Microbiol. Ecol. 17 p. 279) han mostrado la existencia de una correlación negativa entre el número de archaea metanogénicas y el de las bacterias acetogénicas en el colon humano. Las personas no metanoexcretoras albergan por lo tanto poco o nada de archaea metanogénicas en el colon, lo que permitiría una expresión máxima de su actividad acetogénica (Lajoie et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54 p. 2733; Bernalier et al. (1996) FEMS Microbiol. Ecol. 19 p. 193).

La flora acetogénica hidrogenotrófica se caracteriza por una gran diversidad taxonómica. Esta compuesta de especies bacterianas que pertenecen en particular a los géneros Clostridium, Ruminococcus y Streptococcus (Bernalier et al. (1996) Curr. Microbiol. 33 p. 94), así como de algunas especies del género Eubacterium (Schink (1994) en: Drake HL (ed) Acetogenesis. Nueva York: Chapman y Hall p. 197).

Mediante la expresión "bacterias acetogénicas hidrogenotróficas", se entiende las especies bacterianas que utilizan la vía reductora de síntesis del acetato (o vía Wood-Ljungdahl) para producir este metabolito durante su crecimiento autótrofo a partir de H_{2}/CO_{2}, así como durante su crecimiento heterótrofo, a partir de un sustrato orgánico. En efecto, estas bacterias acetogénicas hidrogenotróficas presentan una gran capacidad nutricional, y son capaces, además de utilizar el H_{2}/CO_{2}, de fermentar un número importante de sacáridos y de compuestos orgánicos (Bernalier et al (1996), Curr. Microbiol., 33 p. 94).

Las cepas bacterianas acetogénicas hidrogenotróficas según la invención producen ácidos grasos de cadena corta (AGCC), en particular acetato, a partir de los gases H_{2} y CO_{2}. Esta producción de AGCC presenta una ventaja fisiológica para el hospedante, tal como la prevención (protección) o el tratamiento de patologías diversas (véase aquí abajo).

La presencia simultánea de compuestos orgánicos y de H_{2}/CO_{2} en el medio de cultivo (condiciones equivalentes a las encontradas en el colon humano) puede dar como resultado un uso simultáneo de los dos sustratos mediante la cepa acetogénica hidrogenotrófica (Breznak y Blum (1991), Arch. Microbiol., 156 p. 105). Este fenómeno, denominado mixotrofía, permite a la bacteria tener un rendimiento energético más elevado, y por lo tanto crecer más rápidamente.

Esta aptitud para consumir H_{2}/CO_{2}, asociada con la capacidad de usar un gran número de sustratos orgánicos, así como la capacidad para crecer mediante mixotrofía, confiere por lo tanto una ventaja ecológica importante a las bacterias acetogénicas, con relación a las poblaciones de metanógenos, que utilizan únicamente un número restringido de sustratos (H_{2}, formiato), y poblaciones reductoras de sulfato, que dependen de la presencia de sulfato para su metabolismo de H_{2}.

Se ha demostrado que el uso de algunas preparaciones probióticas, que contienen bacterias tales como bacterias propiónicas, lactobacilos, y/o bifidobacterias, permite modificar la flora cólica de algunos pacientes (Bougle et al. (1999) Scand. J. Gastroenterol. 34 p. 144; Venturi et al. (1999) Aliment. Pharmacol. Ther. 13 p. 1103).

El uso de bacterias acetogénicas como probióticos como se define por Fuller (1989, J. Appl. Bact., 66 p. 365), en preparaciones que se pueden utilizar como alicamentos o como suplementos alimentarios, demuestra ser por lo tanto una vía de interés particularmente innovadora, puesto que su capacidad para metabolizar el H_{2}/CO_{2} permitiría optimizar las fermentaciones cólicas disminuyendo el volumen total de los gases de fermentación y produciendo acetato, una fuente de energía metabolizable por el hospedante. La reducción de los gases digestivos sería así un medio eficaz de prevención y/o de tratamiento de los trastornos digestivos relacionados con la acumulación de estos gases.

El campo de la presente invención es el uso de cepas acetogénicas hidrogenotróficas no patógenas, para regular los susodichos trastornos digestivos y/o modular el equilibrio de la flora microbiana en un mamífero.

Los mamíferos pueden ser los mamíferos monogástricos, frente a los mamíferos poligástricos como los rumiantes. En particular, se entienden los felinos y caninos, en particular los mamíferos domésticos (gatos y perros), así como el ser humano.

Mediante la expresión "no patógeno", se entiende una especie microbiana para la cual no se ha podido demostrar ninguna patología del hospedante asociada con su presencia (cepa GRAS = Reconocida generalmente como segura).

Tal uso se puede prever de distintas maneras. La presente invención se refiere a un uso profiláctico o terapéutico, con el fin de prevenir y/o tratar ciertos trastornos del aparato digestivo. Esta prevención y/o tratamiento se puede efectuar mediante una regulación de los gases producidos en el colon, gracias a la modulación de la flora microbiana. Un uso de este tipo se puede prever bajo la dirección de un médico o de un profesional de la salud. En este caso, el tiempo de tratamiento, así como una asociación eventual de la cepa acetogénica hidrogenotrófica no patógena con otros principios activos eficaces para la prevención y/o el tratamiento de los trastornos digestivos diana, son decididos por el profesional de la salud. Tal uso puede igualmente necesitar un seguimiento de la cepa acetogénica hidrogenotrófica no patógena mediante un procedimiento de análisis, tal como se define más adelante.

En efecto, los trastornos digestivos diana mediante la presente invención afectan a la calidad de vida de los pacientes que los padecen. El grado de molestia digestiva engendrada y/o la capacidad de cada uno para soportar estos trastornos explican que las personas afectadas consulten o no un médico.

En particular, la invención se refiere a la utilización de cepas acetogénicas hidrogenotróficas para la preparación de una composición para las siguientes aplicaciones:

(1)

la prevención y/o el tratamiento de los trastornos funcionales digestivos,

(2)

la modulación del equilibrio de la flora microbiana cólica favoreciendo ventajosamente la actividad de la flora bacteriana acetogénica, en particular en detrimento de las floras bacterianas metanogénicas y sulfatorreductoras.

\newpage

Este último punto tiene como interés:

(1)

disminuir la formación del gas CH_{4},

(2)

disminuir la producción de H_{2}S, producto tóxico, implicado en la iniciación y/o el desarrollo de patologías digestivas,

(3)

favorecer la producción de metabolitos sanos para el hospedante.

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En particular, se utiliza una cepa de tipo Ruminococcus, Clostridium o Streptococcus, preferentemente Ruminococcus hydrogenotrophicus.

Así, la presente invención se refiere a la utilización de al menos una cepa bacteriana acetogénica hidrogenotrófica no patógena autóloga para la preparación de una composición destinada a la prevención y/o al tratamiento del síndrome del intestino irritable reduciendo la formación de gases potencialmente tóxicos en el ser humano.

Dicha reducción se efectúa o efectúan mediante la disminución del porcentaje de hidrógeno gaseoso (H_{2}) y/o de dióxido de carbono gaseoso (CO_{2}) producidos durante fermentaciones digestivas.

Dicha reducción se puede efectuar igualmente mediante aumento de la actividad de la flora cólica acetogénica, en detrimento de la flora metanogénica y/o sulfatorreductora.

Las flatulencias excesivas, el meteorismo, las hinchazones, los dolores abdominales, son criterios importantes que caracterizan el síndrome del intestino irritable.

Se describe asimismo una composición alimentaria susceptible de ser utilizada en la elaboración de nuevos alimentos o ingredientes alimentarios tales como se definen en la regla CE nº 258/97, y especialmente en la fabricación de alimentos funcionales. Un alimento se puede considerar como funcional si se demuestra de manera satisfactoria que ejerce un efecto beneficioso sobre una o varias funciones diana del organismo, más allá de los efectos nutricionales habituales, mejorando el estado de salud y de bien estar y/o reduciendo el riesgo de enfermedad (Diplock et al. Scientific concepts of functional foods in Europ: consensus document, British Journal of Nutrition, 1999, 81, S1-S27).

La composición así descrita puede, en particular, constituir un probiótico envasado, por ejemplo en forma de cápsula o de cápsula de gelatina.

Se puede utilizar de este modo dicha composición alimentaria que contiene una cepa acetogénica hidrogenotrófica no patógena, y que aporta al usuario un bienestar mediante la reducción de la molestia digestiva.

Se describe asimismo una composición farmacéutica, asociada además con un vehículo farmacéuticamente aceptable, que puede comprender excipientes. Su modo de administración se efectúa preferentemente por vía oral o directamente in situ, en particular mediante coloscopía, o por vía rectal mediante supositorios.

Dicha composición farmacéutica comprende además por lo menos otro agente activo contra por lo menos una de las patologías diana.

Dicha composición farmacéutica o alimentaria se puede administrar por vía oral, en forma de cápsulas de gelatina, de cápsulas, de comprimidos, de polvos, de gránulos o de disoluciones o suspensiones orales. Se puede mezclar al menos una cepa bacteriana con excipientes clásicos tales como la gelatina, almidón, lactosa, estearato de magnesio, talco, goma arábiga, y análogos. Puede ser igualmente ventajoso utilizar excipientes menos clásicos, que permitirían aumentar la capacidad de al menos una cepa bacteriana utilizada para ser activa en el colon. Por ejemplo, se puede añadir celobiosa, maltosa, manosa, salicina, trehalosa, amigdalina, arabinosa, melobiosa, rhamnosa y/o xilosa. Esta lista no es exhaustiva, y los sustratos se seleccionan y se adaptan en función de la cepa considerada. Estos sustratos pueden favorecer el crecimiento heterótrofo y/o mixótrofo de al menos una cepa acetogénica presente en la composición.

Así, preferentemente, la composición preparada en el marco de la invención comprende al menos un aditivo que favorece la actividad de al menos una cepa en el entorno digestivo.

En una forma de realización particular de la invención, al menos una cepa bacteriana acetogénica hidrogenotrófica no patógena, presente en la composición, se administra en una forma que le permite ser activa en el colon. En particular, es necesario que al menos una cepa bacteriana acetogénica hidrogenotrófica no patógena esté viva, o sea viable en el tubo digestivo, y en particular en el colon. Se puede igualmente, después de la producción de al menos una cepa bacteriana acetogénica hidrogenotrófica no patógena, y en función de los procedimientos de producción, mantener ésta en condiciones de envaso anaeróbico, con el fin de permitir que siga siendo viable.

En una forma de realización preferida, al menos una cepa bacteriana acetogénica hidrogenotrófica no patógena se envasa en un entorno anaeróbico, es decir, se envasa en una atmósfera libre de oxígeno.

La por lo menos una cepa bacteriana acetogénica hidrogenotrófica no patógena presente en la composición es una cepa autóloga de dicho mamífero, es decir, que se puede aislar del sistema digestivo, en particular de las heces, de otros mamíferos que pertenecen al mismo género.

Preferentemente, la por lo menos una cepa bacteriana acetogénica hidrogenotrófica no patógena pertenece al género Ruminococcus, más preferentemente a la especie Ruminococcus hydrogenotrophicus. Se pueden asimismo usar otras bacterias acetogénicas hidrogenotróficas, en particular bacterias del género Streptococcus o Clostridium, en particular Clostridium coccoides.

Se describe asimismo un procedimiento de seguimiento específico de la cepa bacteriana acetogénica hidrogenotrófica no patógena en el tubo digestivo de un mamífero, tras su uso tal como se ha definido anteriormente, que comprende las etapas siguientes:

a.

definir una secuencia nucleotídica específica (sonda) de la cepa acetogénica hidrogenotrófica no patógena que se desea detectar;

b.

efectuar la detección y/o cuantificación de dicha cepa mediante hibridación de la sonda con el ácido nucleico total extraído de la flora fecal o mediante las bacterias fecales fijadas en un portaobjetos.

Con el fin de realizar dicho procedimiento de seguimiento, se pueden desarrollar equipos de diagnóstico. Dichos equipos contienen en particular un "patrón" a fin de poder evaluar la cantidad de bacterias en las heces.

El experto en la materia sabe definir una secuencia específica que no se híbrida con el ADN de otras bacterias. Igualmente, el experto en la materia elegirá la hibridación sobre membrana o la hibridación in situ en función de los medios de los cuales dispone, y de la precisión buscada.

Preferentemente, el ácido nucleico detectado es el ADN bacteriano total, pero puede igualmente ser una mezcla de ADN o de ARN, o el ARN bacteriano solo.

Se puede igualmente estudiar la presencia de al menos una cepa bacteriana acetogénica hidrogenotrófica no patógena mediante otros métodos. Una detección de los ácidos nucleicos (ADN y/o ARN) de al menos una cepa bacteriana acetogénica hidrogenotrófica no patógena en las heces del mamífero, en particular mediante PCR, RT-PCR o mediante hibridación con sondas específicas (Transferencia Southern o transferencia Northern), permitirá detectar la presencia de dicha cepa, y eventualmente la expresión de algunos genes. Una secuencia específica ventajosa se puede elegir en la secuencia del gen que codifica el ARNr 16s, en particular una zona que no está presente en las demás especies de la flora cólica.

Se describe asimismo un procedimiento de producción de una cepa bacteriana acetogénica hidrogenotrófica no patógena para su utilización tal como se define en la presente memoria, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

a.

efectuar el crecimiento de la cepa sobre un medio adecuado, en condición de anaerobiosis estricta, en presencia de un sustrato carbonado y/o de H_{2}/CO_{2} como fuente de energía;

b.

recuperar las células bacterianas;

c.

envasar las células bacterianas según la forma galénica elegida.

El crecimiento de la cepa tendrá lugar preferentemente en un medio de AC21 modificado (descrito en el ejemplo 1), a 37ºC, en un fermentador. El sustrato carbonado puede ser glucosa.

Un método preferido de recuperación de las células bacterianas es la centrifugación, por ejemplo entre 10.000 g y 15.000 g, ventajosamente 12.000 g, durante 15 a 20 minutos. El experto en la materia sabe optimizar estos parámetros.

Ventajosamente, las bacterias se pueden lavar entre las etapas b y c, en particular en un tampón de fosfato anaeróbico, resuspendiendo las células, agitando y una nueva etapa de centrifugación.

El pelete bacteriano, lavado o no, se envasa en función de la forma galénica elegida. Un método ventajoso es la liofilización.

Los ejemplos a continuación permiten ilustrar la invención, pero no deben ser considerados sin embargo como limitativos.

Descripción de las figuras

Figura 1: Influencia de un tratamiento de 14 días con Ruminococcus hidrógenotrophicus sobre las cantidades de hidrógeno excretado por ratas con flora humana en situación nutricional normal.

Figura 2: Influencia de un tratamiento de 14 días con Ruminococcus hidrógenotrophicus sobre las cantidades de hidrógeno excretado por ratas con flora humana después de administrar lactulosa.

Ejemplos Ejemplo 1 Aislamiento de los microorganismos

Se usan muestras fecales humanas que proceden de voluntarios sanos, no metano-excretores. Los individuos se consideran como no metano-excretores cuando el porcentaje de metano expirado no exceda más de 1 ppm el porcentaje del aire ambiente, que es de 1,8 ppm (Bond et al. (1970) Gastroenterology 58, p. 1035), y cuando el número de metanógenos contenido en sus extractos fecales es menor que 10^{7}/g de extracto fecal (Bernalier et al. (1996) Arch Microbiol. 166 p. 176). El porcentaje de metano se determina con la ayuda de un cromatógrafo equipado con un detector de ionización por llama. Las muestras fecales recogidas recientemente se conservan a 4ºC bajo anaerobiosis estricta, durante máximo de 10 horas.

El enriquecimiento, el aislamiento y el cultivo de los microorganismos se efectúan sobre un medio semisintético, el medio AC-21 modificado (Breznak et al. (1988) Arch. Microbiol. 150 p. 282) bajo anaerobiosis estricta (Hungate (1969) en: Norris JR y Gibbons DW (eds) Methods in microbiology Vol. 3B, Nueva York; Academic Press p. 117). La composición por litro del medio semisintético es la siguiente:

1

La disolución de oligoelementos se prepara según Widdel et al. (1983, Arch. Microbiol., 134, p. 286), y la disolución de vitaminas se prepara según Greening y Leedle (1989, Arch. Microbiol., 151, p. 399). La disolución de volframato-selenio posee la composición siguiente: 0,1 mM de Na_{2}WO_{4} y 0,1 mM de Na_{2}SeO_{3}, en 20 mM de NaOH.

El medio semisintético se solidifica mediante adición de un agente gelificante (Agar-Agar al 2%). Tras la inoculación, el gas del medio de cultivo se sustituye por H_{2}/CO_{2} o N_{2}/CO_{2}, en función del ensayo previsto.

El medio de dilución es un medio anaeróbico totalmente mineral (Doré et al. (1995) FEMS Microbiol. Lett. 130 p. 7). A partir de una muestra fecal, se prepara una suspensión madre (diluida a la décima parte, p/v). Se efectúa una serie de diluciones decimales a partir de la suspensión madre. Las diluciones así preparadas se inoculan en el medio semisintético líquido que contiene H_{2}/CO_{2} (60:40, v/v, 202 kPa) como única fuente de energía (Doré et al. (1995) FEMS Microbiol. Lett. 130 p. 7; Bernalier et al. (1996) FEMS Microbiol. Ecol. 19 p. 193; Bernalier et al. (1996) Curr. Microbiol. 33 p. 94). Después de incubar a 37ºC durante 20 días, los enriquecimientos se obtienen a partir de los tubos de dilución más elevada y que presentan un crecimiento bacteriano, un consumo de gas y una producción estequiométrica de acetato más elevadas (Bernalier et al (1996) Curr. Microbiol. 33 p. 94). La disminución de la presión de gas en los cultivos se determina mediante medida directa de la presión parcial con un manómetro de tipo Capshuelic (Dwyer, Instruments, Michigan City, Mich., USA). Después de tres transferencias de los cultivos enriquecidos, se aíslan colonias bacterianas mediante el método de los tubos giratorios (Hungate (1969) en: Norris JR y Gibbons DW (eds) Methods in microbiology vol. 3B, Nueva York; Academic Press p. 117) que contienen un medio homólogo agar-agar y H_{2}/CO_{2} como fuente de energía. Después de 20 días de incubación a 39ºC, las colonias se transfirieron a medios líquidos. La purificación de los cultivos se obtiene después de 3 a 5 transferencias sucesivas en tubos giratorios, al final de las cuales la pureza de los cultivos se determina mediante microscopía de contraste de fase, tras tinción Gram.

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El ADN total de las cepas acetogénicas hidrogenotróficas aisladas se extrae mediante el método de Lawson et al. (1989, FEMS Microbiol. Lett. 65 p. 41). Después, el gen que codifica el ARN ribosómico 16S se amplifica mediante PCR con la ayuda de los cebadores universales ARI y pH. Los productos de PCR se purifican y después se secuencian con la ayuda de un kit de secuencia "Dye-Dideoxy Terminator cycle Sequence" y de un secuenciador automático Applied Biosystem modelo 373A. La búsqueda de homología de secuencia ARNr 16S entre las cepas acetogénicas aisladas y las otras especies se efectúa gracias al programa FASTA, siendo las bases de datos de secuencia las del EMBL y del RDP, y utilizando los parámetros de base sugeridos. Los alineamientos de secuencia se verifican manualmente.

Mediante este método, se ha podido aislar una bacteria del género Ruminococcus e identificar a la especie Ruminococcus hydrogenotrophicus. Esta bacteria se depositó en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunscheig, Alemania) con el número DSM 10507, e igualmente con el número DSM 14294, el 10 de mayo de 2001 (Tratado de Budapest).

Ejemplo 2 Estudio de los caracteres generales

1-

El tipo de membrana de las bacterias se determina mediante tinción Gram (método convencional) y mediante el ensayo de KOH según Buck (1982 App. Environ. Microbiol. 44, p. 992).

2-

La actividad de catalasa se mide mezclando 1 ml de suspensión bacteriana con algunas gotas de H_{2}O_{2} (30%). La producción de burbujas de gas que se libera de manera más o menos intensa indica la presencia de una catalasa.

3-

La actividad citocromo oxidasa se estudia colocando una colonia bacteriana sobre un disco de papel de filtro saturado con dimetil-p-fenilendiamina. Una coloración rojo púrpura que aparece inmediatamente sobre el disco indica que el ensayo es positivo.

4-

Las características morfológicas de los cultivos se estudian mediante microscopía de contraste de fase y mediante microscopía electrónica tras tinción negativa con acetato de uranilo al 2%. Las células se prefijan en glutaraldehído al 2% (15 h a 4ºC), y después se fijan con el OsO_{4} al 2% (4ºC, durante 15 horas máximo). Después, las células se embeben en EPPON-812, y los bloques se cortan muy finamente. Estos cortes se contrastan con acetato de uranilo, se bañan en sal de acetato y se observan con la ayuda de un microscopio electrónico de transmisión (Philips 400).

5-

El tipo respiratorio de las bacterias se estudia mediante determinación del crecimiento en presencia o ausencia de O_{2}.

6-

El efecto de las variaciones de pH sobre el crecimiento bacteriano se estudia modificando la relación CO_{2}/NaHCO_{3} del medio semisintético (Costilow (1981) American society for Microbiology, Washington DC p. 66). Las medidas del crecimiento bacteriano (DO600) se realizan tras 24 ó 48 horas de incubación a 37ºC. La búsqueda de la temperatura óptima de crecimiento se efectúa sobre un medio semisintético que contiene glucosa, y el crecimiento se observa a temperaturas que varían de 20 a 45ºC. Cada experimento se realiza por triplicado. El crecimiento bacteriano se monitorizó con la ayuda de un espectrómetro Spectronic 20D (Bioblock Scientific, IIIkirch, Francia).

Se encontró que Ruminococcus hydrogenotrophicus DSM 10507 es un cocobacilo Gram positivo, no esporulado y estrictamente anaeróbico. La tinción negativa revela la ausencia de cilios. Las células bacterianas están aisladas o en pares. La cepa no tiene catalasa ni citocromo oxidasa. La temperatura y el pH de crecimiento óptimos son respectivamente 35-37ºC y 6,6. Las colonias son translúcidas, de color blanco hacía ligeramente marrón, con bordes regulares, circulares y de diámetro que varían de 1 a 2 mm.

Ejemplo 3 Ensayo de crecimiento, determinación de actividades acetogénicas

Se estudió la capacidad de distintas cepas bacterianas para metabolizar H_{2}/CO_{2} y para formar acetato. Las cepas de Ruminococcus hydrogenotrophicus DSM 10507, así como también las taxonómicamente relacionadas Ruminococcus productus DSM 3507, Ruminococcus productus DSM 2950, Ruminococcus hansenii DSM 20583 y Clostridum coccoides DSM 935 (los números DSM corresponden a los números de los organismos depositados en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen), se incuban sobre el medio AC-21 modificado en presencia de H_{2}/CO_{2} (60:40, v/v, 202 kPa) como fuente de energía. Se incuban cultivos testigos en N_{2}/CO_{2} (60:40, v/v, 150 kPa). Se preparan 3 cultivos (1 testigo y 2 ensayos) para cada cepa bacteriana. El crecimiento autótrofo se determina mediante incubación durante 96 horas en presencia de H_{2}/CO_{2} (60:40, v/v, 202 kPa). La producción de acetato se determina mediante un ensayo enzimático (Boehringer Mannheim, Meylan, Francia), después de 6 días de incubación a 37ºC.

El consumo de H_{2}/CO_{2} se mide

1)

mediante determinación del volumen gaseoso consumido

2)

mediante análisis cromatográfico (CPG) de la composición de la fase gaseosa.

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El crecimiento heterótrofo de las cepas acetogénicas (DO_{600}) se estudió mediante la incubación de las bacterias durante 20 horas con glucosa (2 g/l) o con fructosa (2 g/l) como única fuente de energía.

La fermentación de la glucosa se estudió mediante la incubación de las células a 37ºC durante 20 horas en el medio semisintético que contiene 2 g/l de glucosa y una atmósfera compuesta al 100% de CO_{2}. Al final de la incubación, los ácidos grasos volátiles del sobrenadante se determinan mediante cromatografía, tras la conversión en derivados terciarios de butildimetilo (Richardson et al. (1989) Lett. Appl. Microbiol. 9 p. 5).

Se observó que el tiempo de duplicación de R. hydrogenotrophicus a 37ºC en medio AC-21 modificado, en presencia de H_{2}/CO_{2} (60:40, v/v, 202 kPa) como sustrato, es de 26,4 horas. Los tiempos de duplicación de R. hydrogenotrophicus a 37ºC, con glucosa o fructosa como fuente de energía, son de aproximadamente 2 ó 3 horas.

Se observó que la cepa bacteriana estudiada es acetogénica: ésta presenta un crecimiento autótrofo en presencia de H_{2}/CO_{2} y produce acetato como metabolito principal (Tabla I). Entre las especies taxonómicamente próximas, se encuentra actividad acetogénica (es decir, consumo de H_{2}/CO_{2} y producción de acetato) en C. Coccoides y mucho más débilmente en R. hansenii y R. productus.

R. hydrogenotrophicus DM 10507 consume aproximadamente 120 mM de H_{2} tras 96 horas de cultivo a 37ºC (1,25 mM de H_{2} consumido por hora). La producción total de acetato es entonces igual a 30 mM (Estequiometría: 4 H_{2} consumidos por acetato formado).

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TABLA I Características de fermentación de las cepas cultivadas en presencia de H_{2}/CO_{2} o de glucosa como única fuente de energía

2

Ejemplo 4 Estimación de la capacidad acetogénica hidrogenotrófica de R. hydrogenotrophicus mediante medida de la incorporación de ^{13}CO_{2} en acetato (método RMN)

La incorporación de ^{13}CO_{2} en acetato se mide mediante RMN, a partir de suspensiones celulares de R. hydrogenotrophicus incubadas en presencia de H_{2}. Las bacterias se cultivaron en un matraz de 1l que contiene 250 ml de medio AC21 tal como se describe en el ejemplo 1, y H_{2}/CO_{2} como única fuente de energía. Tras el crecimiento a 37ºC, las células bacterianas se recuperaron mediante centrifugación (12.000 g durante 20 minutos) y se resuspenden en un tampón de fosfato que contiene 20 mM de NaH^{13}CO_{3} (Leclerc et al. (1997), Anaerobe, 3, p. 307). Las suspensiones se incubaron durante 20 horas a 37ºC en atmósfera compuesta de 100% de N_{2} (testigo) o de H_{2}/N_{2} (80/20, v/v), a 10,233 MPa (101 atm). Al final de la incubación, las suspensiones se centrifugaron nuevamente a 12.000 g durante 20 minutos, y se recuperaron los sobrenadantes. La producción total de acetato se midió mediante un método enzimático (kit Boehringer-Mannheim). Los metabolitos marcados con ^{13}C se analizaron mediante RMN (Bernalier et al., (1996), FEMS Microbiol. Ecol., 19, p. 193).

Cuando la bacteria se incubó en presencia de H_{2}, el acetato es el único metabolito detectado mediante RMN ^{13}C. El ^{13}C-acetato se marcó de manera equivalente sobre sus grupos metilo y carboxilo. El acetato doblemente marcado representa 72% del acetato marcado total. Esto confirma que la síntesis de acetato a partir de H_{2} y CO_{2} por R. hydrogenotrophicus se efectúa según la vía reductora de la acetogénesis.

Ejemplo 5 Determinación de las capacidades nutricionales de las bacterias acetogénicas

Se evaluó el metabolismo de otros sustratos orgánicos mediante las bacterias acetogénicas, utilizando un medio AC-21 modificado que contiene 5 ó 10 mM de sustrato, en una atmósfera compuesta de CO_{2} al 100%. El ensayo se considera como positivo cuando la bacteria mantiene su crecimiento después de tres transferencias sucesivas en un medio que contiene el mismo sustrato, y si la DO_{600} del cultivo es al menos igual al doble de la observada con un medio semisintético basal (libre de sustrato orgánico), después de 24 horas de incubación a 37ºC.

Se observó que numerosos sustratos orgánicos permiten el crecimiento heterótrofo de las bacterias especificadas (Tabla II).

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TABLA II Crecimiento de R. hidrogenotrophicus y de las especies taxonómicamente próximas, en presencia de diversos sustratos orgánicos

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Por otra parte, el crecimiento de distintas cepas acetogénicas hidrogenotróficas aisladas de deposiciones humanas, en presencia de diversos compuestos aromáticos tal como el vanillato, caffeato o siringato, se estima mediante la densidad óptica a 600 nm con la ayuda de un espectrómetro Spectronic 20D (se estudia igualmente el efecto de la adición de H_{2} a la fase gaseosa de estos cultivos). La cantidad de sustrato degradado se determina mediante HPLC, así como la naturaleza de los metabolitos formados.

La capacidad para metabolizar los distintos sustratos aromáticos ensayados depende de la cepa acetogénica hidrogenotrófica especificada. Las especies Clostridium son capaces de crecer y de degradar 20% hasta 30% del caffeato y del siringato, alcanzando esta degradación el 100% cuando se añade H_{2} al cultivo. Una de las cepas de Clostridium degrada vanillato solamente en presencia de H_{2} en la fase gaseosa. En una primera etapa, esta cepa desmetila el vanillato a protocatecuato, y después, gracias a H_{2}, descarboxila este compuesto a catecol. La cepa de R. hydrogenotrophicus presenta sólo una baja actividad frente a vanillato, este metabolismo no parece influido por la presencia de H_{2}.

La capacidad de R. hydrogenotrophicus para utilizar dos sustratos orgánicos no digestibles por las enzimas del hospedante, los fructo-oligosacáridos (FOS) y lactulosa, se determina igualmente según el protocolo descrito en este ejemplo [medición del crecimiento bacteriano (densidad óptica a 600 nm) observado en presencia de 2 g/l de cada uno de los sustratos indigestibles, y mantenimiento de éste tras 3 transferencias sucesivas sobre el mismo sustrato]. R. hydrogenotrophicus se encuentra incapaz de metabolizar estos dos sustratos.

Ejemplo 6 Carácter mixótrofo de la cepa acetogénica hidrogenotrófica, R. hydrogenotrophicus

Con el fin de determinar si R. hydrogenotrophicus es capaz de crecer por mixotrofía (uso simultáneo de un sustrato orgánico y de un sustrato inorgánico), la cepa se cultivó en presencia de dos fuentes de energía, una orgánica, la glucosa, y otra inorgánica, H_{2}/CO_{2}. El medio de cultivo (medio AC21 modificado tal como se describe en el Ejemplo 1) contiene 1,4 mM de glucosa, y se sustituyó la fase gaseosa, tras inoculación, por una mezcla de H_{2}/CO_{2} (60/40 a 156 kPa). Los cultivos se inocularon con 0,3 ml de un precultivo de R. hydrogenotrophicus obtenido con la glucosa o bien con el H_{2}/CO_{2} como única fuente de energía. Durante la incubación a 37ºC, el consumo de gas por la cepa se siguió con la ayuda de sensores de presión fijados a los tapones de los cultivos (Leclerc et al. (1997), Anaerobe 3 p. 307). El crecimiento bacteriano se estimó midiendo la densidad óptica de los cultivos a 600 nm con la ayuda de un espectrofotómetro Spectronic 20D. Se recogieron muestras de sobrenadantes de cultivos cada 2 horas con el fin de estimar el consumo de glucosa (determinación de la glucosa que queda mediante el método enzimático de Boehringer) y la producción de metabolitos que fermentan, mediante determinación cromatográfica (tal como se describe en el Ejemplo 3).

Se encuentra que R. hydrogenotrophicus es capaz de co-utilizar los dos sustratos ensayados. Se observa una sola fase exponencial de crecimiento de la bacteria en presencia de los dos sustratos. Durante esta fase exponencial, se observa un consumo simultáneo de glucosa y de H_{2}/CO_{2}. Esto muestra el carácter mixotrófico de R. hydrogenotrophicus frente a estos dos sustratos (Leclerc y Bernalier, sometido a publicación). Al final de la fase exponencial, la glucosa está totalmente consumida por la bacteria, ésta mantiene entonces su metabolismo en fase estacionaria de crecimiento, mediante el uso de H_{2}/CO_{2} restante.

Se estudió igualmente la capacidad de R. hydrogenotrophicus para co-metabolizar un edulcorante, la fructosa, y el H_{2}/CO_{2}. La cepa se cultivó en medio AC21, tal como se describe en el ejemplo 1, en presencia de estas dos fuentes de energía. Se ensayaron distintas concentraciones de fructosa (2, 1, 0,5 y 0,25 g/l), siendo aún la fase gaseosa H_{2}/CO_{2} (60/40, v/v, 202 kPa). El protocolo experimental utilizado después es el mismo que el descrito más arriba.

R. hydrogenotrophicus demuestra ser capaz de co-metabolizar la fructosa y H_{2}/CO_{2}, siendo el crecimiento de la bacteria caracterizado por una sola fase exponencial de crecimiento en presencia de los dos sustratos. Este crecimiento mixótrofo se observa independientemente de la concentración de fructosa presente en el medio de cultivo, e independientemente del origen del inóculo bacteriano (precultivo realizado sobre fructosa o H_{2}/CO_{2} o fructosa + H_{2}/CO_{2}). En fase estacionaria de crecimiento, la bacteria metaboliza H_{2}/CO_{2} únicamente, siendo consumida la totalidad de la fructosa.

Ejemplo 7 Efecto de la liofilización de los cultivos de Ruminococcus hidrogenotrophicus sobre la expresión de la actividad hidrogenotrófica

Con el fin de determinar si la conservación de R. hydrogenotrophicus en forma liofilizada puede alterar su capacidad para utilizar H_{2}/CO_{2}, se ensayaron distintas condiciones de cultivo, de conservación de los liofilizados, y de la resuspensión de la bacteria.

Se prepararon cultivos de R. hydrogenotrophicus en matraces de 1l que contienen 250 ml de medio AC21, tal como se describe en el Ejemplo 1, con fructosa (2 g/l), H_{2}/CO_{2} (60/40, v/v, 100 kPa), o los dos sustratos, como fuente de energía. Estos cultivos se incubaron a 37ºC durante 24 horas, 48 horas o 72 horas según el(los) sustrato(s) utilizado(s). Entonces, se obtienen peletes bacterianos de los cultivos mediante centrifugación (15.300 x g, 30 min., 4ºC), y se recogieron en 10 ml de tampón anaeróbico. Las suspensiones así obtenidas se alicuotaron mediante 2 ml, y después se centrifugaron 5 min. a 14.000 x g. Entonces, los peletes bacterianos se congelaron a -80ºC antes de ser liofilizados durante la noche. Los liofilizados se conservaron a 4ºC en una atmósfera aeróbica o anaeróbica (100% de CO_{2}). Después de 15 a 30 días de conservación, los liofilizados de R. hydrogenotrophicus se recogieron en 5 ml de tampón de dilución anaeróbico. Entonces, estas suspensiones bacterianas se mantuvieron en un medio AC21 que contiene H_{2}/CO_{2} (60/40, v/v, 200 kPa) como única fuente de energía, bien directamente o bien después del enriquecimiento durante 48 horas a 37ºC en un medio de cultivo complejo que contiene diversas fuentes de carbono. Después de 72 horas de incubación a 37ºC en presencia de H_{2}/CO_{2}, se determinó el consumo de H_{2} y la cantidad de acetato producido para cada cultivo.

La liofilización de R. hydrogenotrophicus no parece afectar su potencial hidrogenótrofo. En efecto, cualquiera que sea el sustrato utilizado para precultivar la cepa (fructosa, H_{2}/CO_{2} o los dos sustratos simultáneamente), la actividad hidrogenotrófica de R. hydrogenotrophicus se restituye durante el cultivo de los liofilizados. Igualmente, el modo de conservación aeróbico o anaeróbico del liofilizado influye poco sobre la expresión del potencial hidrogenotrófico de la bacteria. Sin embrago, se observa una actividad hidrogenotrófica máxima cuando R. hydrogenotrophicus se precultiva en presencia de fructosa y cuando el liofilizado se conserva en una atmósfera anaeróbica. Igualmente, el cultivo previo de las bacterias liofilizadas en un medio rico en sustratos orgánicos aumenta sensiblemente la expresión de su potencial hidrogenotrófico, cualquiera que sea el sustrato utilizado para precultivar la cepa, y cualquiera sea el modo de conservación del liofilizado. Este efecto se explica probablemente por el aumento de la densidad bacteriana generada por el enriquecimiento de los cultivos liofilizados en medio complejo.

El conjunto de los resultados obtenidos muestran que la cepa de R. hydrogenotrophicus se puede cultivar en presencia de un sustrato orgánico y después conservar a 4ºC en forma liofilizada en una atmósfera aeróbica o anaeróbica, sin que afecte sensiblemente la expresión posterior de su potencial hidrogenotrófico.

Ejemplo 8 Transferencia inter-especies de H_{2}, in vitro, entre bacterias fibrolíticas productoras de H_{2} y R. hydrogenotrophicus

Se estudió in vitro la capacidad de R. hydrogenotrophicus para utilizar el H_{2} producido por especies bacterianas fibrolíticas, en co-cultivos, asociando la cepa acetogénica con una bacteria celulolítica. Las dos especies celulolíticas estudiadas se aislaron en el laboratorio a partir de heces humanos. Los co-cultivos se prepararon en un medio semisintético, realizado en el laboratorio, que contiene una cinta de celulosa de papel de filtro Whatman nº 1 como única fuente de carbono y de energía. Cada una de las especies celulolíticas se sembró a razón de 0,5 ml de inóculo por tubo de cultivo. Después de 48 horas de incubación a 37ºC, se añaden 0,5 ml de inóculo de R. hydrogenotrophicus a cada uno de estos cultivos de bacterias celulolíticas. Paralelamente, se prepararon monocultivos testigo de cada especie celulolítica.

Se realizó una cinética mediante incubación de los cultivos a 37ºC durante 12 días. Después de la incubación, se analizó mediante cromatografía la cantidad de H_{2} en la fase gaseosa, la cantidad de celulosa degradada se estimó midiendo la materia seca restante, y los productos finales de fermentación de la celulosa se determinaron mediante cromatografía de fase gaseosa y/o mediante vías enzimáticas (kit Roche).

La adición de R. hydrogenotrophicus a una u otra de las especies celulolíticas productoras de H_{2} se traduce en una fuerte disminución de este gas en los co-cultivos mientras que se acumula en la fase gaseosa de los monocultivos.

Por lo tanto, R. hydrogenotrophicus es capaz de reutilizar eficazmente el H_{2} producido in vitro por una especie fibrolítica durante la fermentación de la celulosa. Esta transferencia de H_{2} entre R. hydrogenotrophicus y las especies celulolíticas conlleva poca o ninguna modificación de la actividad celulolítica de las especies fibrolíticas estudiadas. Por lo contrario, la celulosa es mayoritariamente fermentada en acetato en los co-cultivos mientras que es más bien de tipo ácido-mixto en los monocultivos (producciones de acetato, de succinato o de etanol y de lactato).

Ejemplo 9 Capacidad de la cepa acetogénica hidrogenotrófica Ruminococcus hydrogenotrophicus para reducir el volumen de los gases cólicos in vivo, en ratas con flora humana

Con el fin de determinar si R. hydrogenotrophicus es capaz de reducir el volumen de los gases en el colon en presencia de una flora digestiva compleja, R. hydrogenotrophicus se administró por vía oral a ratas con flora humana, y se siguió la evolución del volumen de gas cólico midiendo el hidrógeno excretado por las vías respiratoria y rectal.

El efecto de R. hydrogenotrophicus se estudió en situación nutricional normal y tras la administración de un sustrato fermentable (lactulosa) que provoca un aumento brutal del volumen de gas en el colon.

Los animales utilizados son ratas de Fisher 344 machos, que tienen 3 meses al comienzo del experimento. Nacidos sin gérmenes, se inoculan per os con 1 ml de una suspensión centesimal de materias fecales humanas frescas que proceden de un donante adulto, no metanogénico y que tiene una dieta alimentaria de tipo occidental. La inoculación se realizó 2 semanas antes de empezar el experimento. Las ratas se enjaularon en unos aisladores y recibieron una alimentación semisintética "de tipo humana" (proteínas y grasas de orígenes animal y vegetal; glúcidos simples y complejos crudos y cocinados), esterilizada mediante irradiación \gamma al 45 kGy. El alimento y el agua de bebida se distribuyeron ad limitum.

a) Situación nutricional normal

El experimento se realizó con 16 ratas con flora humana divididas en 2 grupos de 8, un grupo testigo y un grupo tratado. Las ratas del grupo tratado recibieron cada mañana durante 28 días, mediante incubación gástrica, una dosis de 10^{8} a 10^{9} bacterias en forma de 1 ml de un cultivo de R. hydrogenotrophicus, cultivado durante 18 horas en medio AC21 (tal como se describe en el Ejemplo 1), glucosilado (2 g/l). El grupo testigo recibió, en las mismas condiciones, 1 ml de medio AC21 glucosilado estéril.

Después de 1, 14 y 28 días de tratamiento, las ratas de los 2 grupos se colocaron durante 12 horas en cámaras respiratorias individuales que permiten medir el hidrógeno excretado por vías respiratoria y rectal (véase la descripción de las cámaras respiratorias a continuación). Se recogieron muestras de aire por duplicado de las cámaras respiratorias entre 0 hora y 12 horas. La concentración de hidrógeno se determinó inmediatamente mediante cromatografía de fase gaseosa. Los resultados de los grupos testigo y tratado se compararon con la ayuda de un ANOVA para medidas repetidas.

Cualquiera que sea el tiempo de duración del tratamiento, la administración de R. hydrogenotrophicus disminuye significativamente la cantidad máxima de hidrógeno excretado (-50% hasta -80%) y la velocidad de excreción (-60% hasta -80%), con relación al grupo testigo (P<0,01). El tratamiento demuestra igual de eficaz después de 1, 14 ó 28 días (figura 1).

La flora acetogénica hidrogenotrófica se contó (Doré et al, 1995) en las heces de las ratas de los dos grupos, a distintos tiempos durante el experimento. En el grupo testigo que no recibe R. hydrogenotrophicus, el nivel de población acetogénica es estable a lo largo del tiempo y comparable al del donante, o sea, aproximadamente log 6.8 acetógenos por g de heces.

El tratamiento con R. hydrogenotrophicus lleva a un aumento del nivel de la flora acetogénica, que llega entonces a log 7,5/g de heces a partir de 24 h de tratamiento. Este nivel se mantiene hasta el final del experimento. El aumento de la flora acetogénica en las ratas tratadas coincide por lo tanto con la disminución de las cantidades de H_{2} excretadas por estos animales.

Al final del experimento, las ratas se eutanasiaron y se autopsiaron. La administración de R. hydrogenotrophicus no tiene efecto significativo ni sobre el peso corporal, ni sobre el peso del hígado, de los riñones y del intestino ciego, ni sobre el pH cecal (P>0,05). Igualmente, el aspecto macroscópico del hígado y de los riñones de las ratas tratadas con R. hydrogenotrophicus es normal e idéntico al de las ratas testigo.

b) Después de la administración de lactulosa

Este experimento se realiza según el mismo protocolo que anteriormente. La lactulosa (4-O-\beta-D-galactopiranosil-D-fructosa), cuya fermentación en el colon lleva a un aumento brutal del volumen de gas, se administró por intubación gástrica, a razón de 500 mg por rata, justo antes de su colocación en la cámara respiratoria. El efecto de R. hydrogenotrophicus sobre este aumento se examinó después de 1 y 14 días de tratamiento con la cepa acetogénica.

En estas condiciones de producción excesiva de gases cólicos, la administración de R. hydrogenotrophicus disminuye significativamente la cantidad máxima de hidrógeno excretado (-40% hasta -50%) y la velocidad de excreción (-40% hasta -50%) con relación al grupo testigo (P>0,05). El tratamiento sigue siendo eficaz después de 1 ó 14 días (figura 2).

En los dos experimentos, las ratas tratadas con R. hydrogenotrophicus no han manifestado ninguna anomalía de comportamiento, y el aspecto y la consistencia de las heces eran idénticas a las de las ratas testigo.

Las cámaras respiratorias utilizadas son recintos autónomos impermeables de polivinilo rígido transparente, de un volumen de 30 litros, que permiten contener una jaula que contiene un animal de pequeño tamaño. Están provistas de una doble puerta de transferencia impermeable (DPTE) que permiten conectarles con los aisladores experimentales.

Con el fin de preservar el estatuto bacteriano de los animales, se esterilizan antes de la conexión. Después de una transferencia del animal del aislador hacia la cámara respiratoria, ésta se separa del aislador y se conecta a un circuito cerrado en el que se empuja aire con la ayuda de una bomba peristáltica a través de los filtros antibacterianos, y sistemas de eliminación del CO_{2} (absorbedores que contienen una disolución de hidróxido de potasio al 40%) y vapor de agua (absorbedor que contiene cristales de gel de sílice). El contenido de O_{2} del aire se mide mediante una sonda, y se mantiene constante a 21% con la ayuda de un electrodo amperométrico, un regulador y una electroválvula.

Este dispositivo permite la acumulación de los gases específicos de las fermentaciones cólicas (hidrógeno y, llegado el caso, metano), excretados por vías respiratoria y rectal.

Claims (10)

1. Utilización de al menos una cepa bacteriana acetogénica hidrogenotrófica no patógena autóloga para la preparación de una composición destinada al tratamiento o la prevención de en el ser humano del síndrome del intestino irritable.

2. Utilización según la reivindicación 1, caracterizada porque al menos una cepa bacteriana acetogénica hidrogenotrófica no patógena es viable en el tubo digestivo.

3. Utilización según la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque al menos una cepa bacteriana acetogénica hidrogenotrófica no patógena pertenece al género Ruminococcus, Clostridium, o Streptococcus.

4. Utilización según la reivindicación 3, caracterizada porque al menos una cepa bacteriana acetogénica hidrogenotrófica no patógena pertenece a la especie Ruminococcus hydrogenotrophicus.

5. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque al menos una cepa bacteriana acetogénica hidrogenotrófica no patógena se administra en una forma que le permite ser activa en el colon.

6. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque dicha composición que comprende al menos una cepa bacteriana acetogénica hidrogenotrófica no patógena está destinada a ser administrada por vía oral o rectal.

7. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque al menos una cepa bacteriana acetogénica hidrogenotrófica no patógena se envasa en un entorno anaeróbico.

8. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque la composición comprende al menos un aditivo que favorece la actividad de al menos una cepa en el entorno digestivo.

9. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque la composición comprende además al menos un agente activo contra al menos una la patología diana.

10. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque la composición comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.