ES2262257T3

ES2262257T3 - Proteina anticongelante.

Info

Publication number: ES2262257T3
Application number: ES98966922T
Authority: ES
Inventors: Christopher Michael Sidebottom; Margaret Felicia Univ. of York SMALLWOOD; Louise Jane University of York BYASS
Original assignee: Unilever NV
Current assignee: Unilever NV
Priority date: 1998-01-22
Filing date: 1998-12-23
Publication date: 2006-11-16
Anticipated expiration: 2018-12-23
Also published as: WO1999037673A2; ATE322503T1; CA2318869A1; AU2614899A; EP1049713B1; US6774210B1; WO1999037673A3; CN1284085A; HUP0100410A3; TR200002105T2; ID25509A; SK10932000A3; GB9801420D0; PL342568A1; JP2002508303A; EP1049713A2; AU753334B2; DE69834136T2; BR9814760A; HUP0100410A2

Abstract

Una proteína anticongelante que se puede obtener de líquenes, teniendo dicha proteína tiene un peso molecular aparente de 20 a 28 KDa y teniendo una secuencia de aminoácidos en el extremo N-terminal que muestra, como mínimo, una coincidencia del 80% con: A-P-A-W-M-D-A-E-S-F-G-A-I-A-H-G-G-L y las versiones glicosiladas de esta proteína.

Description

Proteína anticongelante.

Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere a proteínas anticongelantes (PACs) y a un producto alimenticio congelado que contiene PACs.

Antecedentes de la invención

Las proteínas anticongelantes (PACs) se han propuesto para mejorar la tolerancia a la congelación de los comestibles.

Para los propósitos de la presente invención, el término PAC tiene el significado bien conocido en la técnica, concretamente aquellas proteínas que presentan la actividad de inhibir el crecimiento de cristales de hielo. Véase por ejemplo el documento US 5.118.792.

El documento WO 90/13571 desvela péptidos anticongelantes producidos químicamente o mediante técnicas de ADN recombinante. Las PACs se pueden utilizar de forma adecuada en productos alimenticios.

El documento WO 92/22581 desvela PACs de plantas que se pueden utilizar para controlar la forma de los cristales de hielo en helados. Este documento también describe un proceso para la extracción de una composición de polipéptido de los espacios extracelulares de plantas mediante la infiltración de un medio de extracción en las hojas sin destruir las plantas.

El documento WO 94/03617 desvela la producción de PACs de levadura y su posible uso en helados. El documento WO 96/11586 describe PACs de pescado producidas por microbios.

En varios lugares de la bibliografía también se hace mención al aislamiento y/o uso de proteínas vegetales para la crioprotección. Las proteínas crioprotectoras tienen una función en la protección de las membranas vegetales contra el daño producido por congelación. Sin embargo, estas proteínas no poseen propiedades de inhibición de recristalización y no quedan abarcadas, por lo tanto, en el término de PACs.

En el Journal of Plant Physiology, 1992, 140, 236-240, Hincha describe el aislamiento de proteínas crioprotectoras de col. En Biochimica et Biophysica Acta, 412 (1975), 335-349, Volger describe el aislamiento de proteínas de hoja crioprotectoras de espinaca. En Plant Physiol (1995), 108: 759-803, Boothe describe el aislamiento de proteínas de Brassica napus. Nuevamente, se cree que estas proteínas son proteínas crioprotectoras, en lugar de PACs. En Plant Molecular Biology 21: 291-305, 1993, Neven desvela la caracterización del ADN de una proteína crioprotectora de espinaca. En Abstracts and Reviews of the 18th Annual Meeting of the ASEV/Eastern Section in Am. J. Enol. Vitic., Vol. 44, Nº 4, 1993, Salzman describe la presencia de polipéptidos estables a la ebullición en brotes de Vitis. Aunque las proteínas son análogas a péptidos anticongelantes de pescado, éstas son proteínas crioprotectoras y no PACs. En Biochemical and Biophysical Research Communication, Vol. 183, Nº 3, 1992, páginas 1103-1108 y en Lin, Plant Physiology (1992) 99, 519-525, Lin describe el polipéptido crioprotector de 15 KDa de Arabidopsis Hakaira. En The Plant Journal (1995) 8 (4), 583-593, Houde hace mención a proteínas crioprotectoras de trigo.

Hasta el momento, sin embargo, el uso de PACs no se ha aplicado a productos alimenticios disponibles comercialmente. Un motivo de ello son los elevados costes y el complicado proceso de obtención de las PACs. Otro motivo es que las PACs que se han propuesto hasta el momento para su uso en productos alimenticios congelados no se pueden incorporar en la mezcla de formulación estándar, debido a que tienden a desestabilizarse durante el proceso, especialmente durante la etapa de pasteurización. Se cree que esta desestabilización es debida a la desnaturalización de las PACs; este efecto es bien conocido y se observa de forma habitual en péptidos y proteínas.

En la solicitud de patente de los presentes inventores no prepublicada WO 98/4148 se ha descrito que pueden aislarse PACs particularmente buenas a partir de fuentes naturales, tales como líquenes.

Ahora, los presentes solicitantes han sido capaces de determinar la secuencia parcial de aminoácidos de una PAC de liquen particularmente activa.

Por consiguiente, la presente invención se refiere a una PAC que puede obtenerse a partir de líquenes, teniendo dicha PAC un peso molecular aparente de unos 24 KDa y una secuencia de aminoácidos en el extremo N-terminal de:

A-P-A-W-M-D-A-E-S-F-G-A-I-A-H-G-G-L

Además, en el alcance de la presente invención también quedan abarcadas proteínas con una secuencia que tiene un elevado grado de similitud con la secuencia anterior. Para los propósitos de la invención, todas la proteínas RI activas con una secuencia de aminoácidos coincidente con la secuencia anterior en, como mínimo, el 80%, también se incluyen en el alcance de la presente invención. Más preferente es una coincidencia de, como mínimo el 90%, y la más preferente, superior al 95%, por ejemplo, aquellas secuencias de aminoácidos que difieren de la secuencia anterior en ninguno o en sólo uno o dos aminoácidos.

Para los propósitos de la presente invención, el grado de coincidencia de dos secuencias de aminoácidos (parciales) se puede calcular tal como sigue:

(a) las dos secuencias de aminoácidos se alinean y se cuenta el número de aminoácidos que son idénticos y aparecen en el mismo orden (X)

(b) cada cambio, eliminación o adición de un aminoácido cuenta como 1 punto, y se calcula el total de cambios, eliminaciones y adiciones (Y)

(c) entonces el grado de coincidencia se puede calcular como X*100%/(X+Y).

Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos (parcial) del extremo N-terminal de:

A-P-A-V-V-M-G-D-A-E-S-F-G-A-I-A-H-G-G-L, se puede alinear con el control tal como sigue:

A-P-A-V-V-M-G-D-A-E-S-F-G-A-I-A-H-G-G-L

A-P-A-W-M-D-A-E-S-F-G-A-I-A-H-G-G-L

Esto conduce a un número total de aminoácidos idénticos en el mismo orden de 17. El número de cambios es 1 (W en vez de V en la cuarta posición); el número de adiciones es 2 (V en la quinta posición, G en la séptima posición), mientras que no hay eliminaciones. Por lo tanto, los cambios, adiciones y eliminaciones totales son 3. Esto conduce a un grado de coincidencia de 17*100%/(17+3)=85%.

La proteína que tiene una secuencia de aminoácidos (parcial) en el extremo N-terminal de:

A-P-A-V-V-M-G-D-A-E-S-F-G-A-I-A-H-G-G-L queda abarcada, por lo tanto, en el alcance de la presente invención.

Las versiones glicosiladas de las proteínas descritas anteriormente también quedan abarcadas en el alcance de la presente invención, por lo cual dicha modificación no afecta materialmente a las propiedades de inhibición de la recristalización del hielo.

Para los propósitos de la presente invención el término peso molecular de, aproximadamente, 24 KDa significa cualquier peso molecular de 20 a 28 KDa, medido en SDS-PAGE mediante marcadores de referencia estándares, más preferentemente el peso molecular de 22 a 26 KDa.

La PAC ventajosa de la presente invención se puede obtener de liquen, especialmente de las especies Umbilicaria antarctica.

También quedan abarcadas en el alcance de la presente invención las proteínas anticongelantes que, aunque derivan originalmente de liquen, se producen mediante otros procedimientos, por ejemplo mediante técnicas de modificación genética por las cuales, por ejemplo, microorganismos o plantas se modifican genéticamente para producir las proteínas descritas anteriormente. Estas proteínas también quedan abarcadas en el término "se pueden obtener de liquen".

También quedan abarcadas en el alcance de la presente invención las secuencias de ácidos nucleicos que son capaces de codificar las PACs descritas anteriormente.

Los vectores que contienen una secuencia de ácidos nucleicos capaz de codificar la PAC de la presente invención también quedan abarcados en el alcance de la presente invención.

Según la información anterior, también es posible modificar genéticamente otras fuentes naturales para que produzcan la PAC ventajosa tal como se ha identificado anteriormente.

Los presentes solicitantes también han encontrado que las PACs de la secuencia anterior tienen propiedades mejoradas de inhibición de la recristalización del hielo. En los ejemplos se describe un ensayo adecuado para determinar las propiedades de inhibición de la recristalización del hielo e implica la congelación rápida hasta, como mínimo -40ºC, por ejemplo, -80ºC, seguida de un almacenamiento durante una hora a -6ºC. Preferentemente, las PACs según la presente invención proporcionan un tamaño de partícula de hielo tras un ensayo de inhibición de la recristalización del hielo -tal como se describe en los ejemplos- de 15 \mum o inferior, más preferentemente de 5 a
15 \mum.

La PAC de la presente invención se puede utilizar de forma conveniente en productos alimenticios, preferentemente en productos alimenticios que están congelados o que van a ser congelados. Es especialmente preferente el uso de PACs en productos que se calientan, por ejemplo, mediante pasteurización o esterilización previamente a la congelación. El uso en productos de repostería congelados es especialmente preferente.

Ejemplos de tales productos son: preparados para repostería congelada, tales como preparados para helados y preparados para sorbetes que van a ser pasteurizados previamente a la congelación. Tales preparados se almacenan habitualmente a temperatura ambiente. Algunas formas de producto adecuadas son, por ejemplo: un preparado en polvo que se empaqueta, por ejemplo, en una bolsa o en sobres. Dicho preparado es capaz de formar la base del producto alimenticio congelado, por ejemplo, tras la adición de agua y, opcionalmente, otros ingredientes y aireación -opcional-.

Otro ejemplo de un preparado adecuado podría ser un preparado líquido (opcionalmente aireado) que puede congelarse, si fuera preciso, tras la adición de otros componentes y posterior aireación opcional.

La clara ventaja de los preparados mencionados anteriormente es que la presencia del ingrediente PAC hace que los preparados puedan congelarse bajo condiciones inactivas, por ejemplo, en un congelador doméstico o de un comercio, sin la formación de formas de cristal de hielo inaceptables y por lo tanto, con una textura diferente a los productos obtenidos habitualmente a través de la congelación inactiva.

De forma muy conveniente, estos preparados se envasan en recipientes cerrados (por ejemplo, vasitos, bolsas, cajas, envases de plástico, etc.). Para porciones individuales el tamaño del envase será generalmente de 10 g a 1000 g. Para porciones múltiples pueden ser adecuados tamaños de envase de hasta 500 kg. Generalmente, el tamaño del envase será de 10 g a 5000 g.

Tal como se ha indicado anteriormente, los productos preferentes en los que se utilizan las PACs son productos de repostería congelados, tales como helados o sorbetes. El nivel de PACs es, preferentemente del 0,00001 al 0,5% en peso en base al producto final. Si se utilizan preparados secos o concentrados, la concentración puede ser superior para asegurar que el nivel en el producto final congelado esté en los rangos anteriores.

Para los propósitos de la presente invención, el término producto de repostería congelado incluye dulces congelados que contienen leche, tales como helados, yogur helado, sorbetes, batidos y natillas congeladas, sorbetes de agua, granizados y purés de fruta congelados. Para algunas aplicaciones el uso en productos alimenticios fermentados es menos preferente.

El nivel de sólidos en la repostería congelada (por ejemplo, azúcar, grasas, aromas, etc.) es preferentemente superior al 4% en peso, por ejemplo, superior al 30% en peso, más preferentemente del 40 al 70% en peso.

Los productos de repostería congelados según la presente invención se pueden producir mediante cualquier procedimiento adecuado para la producción de repostería congelada. Sin embargo, con una preferencia especial, todos los ingredientes de la formulación se mezclan completamente antes de la pasteurización y antes de que empiece el proceso de congelación. El proceso de congelación puede implicar, de forma ventajosa, una etapa de consolidación, por ejemplo, hasta una temperatura de -30 Fahrenheit (-34,4ºC) o inferior.

Ejemplo I

Las propiedades de las PACs de inhibición de la recristalización del hielo se pueden determinar tal como sigue:

Una muestra de un producto que contenía una PAC se ajustó a un nivel de sacarosa del 30% en peso (si el nivel de partida de la muestra era superior al 30%, este se consiguió por dilución, si el nivel de partida era inferior se añadió sacarosa hasta el nivel del 30%).

Se colocó una gota de 3 \muL de la muestra en un cubreobjetos de 22 mm. A continuación se colocó un cubreobjetos de 16 mm de diámetro en la parte superior y se colocó un peso de 200 g sobre la muestra para asegurar un espesor de portaobjetos uniforme. Los bordes del cubreobjetos se sellaron con esmalte de uñas transparente.

El portaobjetos se colocó sobre la platina de un microscopio Linkham THM 600 de temperatura controlada. La platina se enfrió rápidamente (50ºC por minuto) hasta -40ºC para producir una extensa población de cristales pequeños. A continuación se aumentó rápidamente la temperatura de la platina (50ºC por minuto) hasta -6ºC y se mantuvo a esta temperatura.

La fase de hielo se observó a -6ºC mediante un microscopio Leica Aristoplan. Se utilizaron condiciones de luz polarizada junto con una placa lambda para potenciar el contraste de los cristales de hielo. El estado de la fase de hielo (tamaño de los cristales de hielo) se registró mediante foto micrografía de 35 mm a T=0 y T=1 hora. El tamaño de cristal de hielo (longitud) se determinó dibujando alrededor del perímetro de los cristales. La longitud máxima de cada cristal de hielo individual de un lote de helado se importó a una hoja de cálculo en la que se llevó a cabo el análisis de los datos obtenidos para encontrar la media y la desviación estándar.

Otro procedimiento para evaluar las propiedades de inhibición de la recristalización del hielo es el siguiente:

La actividad anticongelante se midió mediante un ensayo "splat" (enfriamiento por rociado) (Knight y col., 1988). Se transfirieron 2,5 \mul de la solución bajo estudio en sacarosa al 30% (p/p) a un cubreobjetos circular de 16 mm, limpio y etiquetado adecuadamente. Se colocó un segundo cubreobjetos en la parte superior de la gota de solución y el sándwich se presionó a la vez con entre los dedos y el pulgar. El sándwich se sumergió en un baño de hexano mantenido a -80°C en un recipiente de hielo seco. Cuando todos los sándwiches se hubieron preparado, los sándwiches se transfirieron desde el baño de hexano a -80ºC a una cámara de observación con hexano mantenido a -6ºC mediante fórceps preenfriados en el hielo seco. Tras la transferencia a -6ºC, se pudo ver que los sándwiches cambiaban de una apariencia transparente a opaca. Las imágenes se registraron por una cámara de vídeo y se recogieron en un sistema de análisis de imagen (LUCIA, Nikon) utilizando un objetivo x20. Las imágenes de cada "splat" se registraron a tiempo=0 y nuevamente después de 30-60 minutos. Se comparó el tamaño de los cristales de hielo en ambos ensayos. Si el tamaño a los 30-60 minutos es similar o sólo ha aumentado moderadamente (por ejemplo, ha aumentado menos del 20%, más preferentemente ha aumentado menos del 10%, lo más preferente, ha aumentado menos del 5%) comparado con el tamaño a t=0, esto es indicativo de buenas propiedades de inhibición de recristalización de cristal de hielo.

Generalmente, estos ensayos se pueden aplicar a cualquier composición adecuada que comprenda PAC y agua. Generalmente el nivel de PAC en dicha composición de ensayo no es muy crítico y puede ser, por ejemplo, del 0,0001 al 0,5% en peso, más preferentemente del 0,0005 al 0,1% en peso, y lo más preferente del 0,001 al 0,05% en peso, por ejemplo del 0,01% en peso.

Cualquier composición adecuada que comprenda PAC y agua se puede utilizar para llevar a cabo el examen. Sin embargo, generalmente no será necesario obtener la PAC en forma purificada. Normalmente, para aplicaciones prácticas será suficiente con preparar un extracto líquido o jugo de material natural, en las que este extracto o jugo se pueden examinar a continuación.

Ejemplo II

9,5 g de Umbilicaria antarctica recogidos durante la primavera de 1996 procedentes de la región antártica y almacenados a -20ºC se homogeneizaron en nitrógeno líquido en un mortero hasta un polvo fino. Este polvo se transfirió a un mortero nuevo y se mantuvo a temperatura ambiente. Después de la adición de 10 ml de EDTA 10 mM con Tris HCl 0,2 M, el polvo se siguió triturando en el mortero y el homogenizado se filtró a través de 2 capas de muselina. El retenido se recolocó en el mortero y se añadieron otros 10 ml de tampón y el retenido se siguió moliendo. Este material se filtró tal como se hizo anteriormente y el filtrado se reservó con el filtrado de la primera etapa de homogeneización. El filtrado se centrifugó a 30.000 G durante 15 minutos y el sobrenadante se recogió y congeló en alícuotas.

Se disolvieron 0,15 g de NH_{4}SO_{4} en 1 ml de sobrenadante y la solución se incubó durante 30 minutos a 4ºC. Después de la centrifugación a 30.000 G durante 10 minutos se disolvieron 0,3 g de NH_{4}SO_{4} en el sobrenadante de esta etapa y la solución se incubó a 4ºC durante 30 minutos. La solución se centrifugó a 30.000 G durante 10 minutos y el sobrenadante se rechazó. La pastilla se resuspendió en 0,2 ml de agua y se prepararon series de diluciones de esta solución y del extracto original en sacarosa en agua al 30% (p/p) para análisis "splat" semicuantitativo. La actividad "splat" podía detectarse (mediante el procedimiento anterior) en el extracto original hasta una dilución de más de 200 veces y en la pastilla resuspendida hasta una dilución de 800 veces indicando que más de la mitad de la actividad "splat" total presente en el extracto original había sido recogida en la pastilla de NH_{4}SO_{4}.

Se añadieron 200 microlitros de Tris HCl 0,1 de M pH 7,5 a la pastilla resuspendida y la solución se concentró en un microcon de corte 10 KDa (Amicon) hasta 150 microlitros. Se aplicaron 100 microlitros de esta solución a una columna de Q-Sefarosa preequilibrada en Tris HCl 50 mM pH 7,5 mediante un sistema de cromatografía SMART (Pharmacia) a una velocidad de flujo de 100 microlitros por minuto y se recogieron fracciones de 100 microlitros. Después de obtener 800 microlitros en Tris HCl 50 mM pH 7,5, se aplicó a la columna un gradiente de NaCl 0-0,5 M durante 1,5 ml y el eluido se monitorizó a 280 nm. Tras diluirlas 50 veces en sacarosa 30% (p/p), se ensayó la actividad "splat" de las fracciones como en el ejemplo I. Se encontró que la actividad tenía correlación con un pico de OD 280 que eluyó aproximadamente a NaCl 0,1 M que fue recogido en su mayoría en la fracción 14.

Se aplicó la fracción 14 de 40 microlitros a una columna de filtración sobre gel Superdex 75 preequilibrada en Tris HCl 50 mM pH 7,5 a una velocidad de flujo de 40 microlitros por minuto mediante el sistema de cromatografía SMART (Pharmacia). El eluido se monitorizó a OD 280 y OD 215 y las fracciones de 80 microlitros se recogieron desde los 0,6 ml después de la aplicación de la muestra, fracciones de 50 microlitros entre 1,1 y 1,6 ml y fracciones de 100 microlitros entre 1,6 y 3 ml. Se diluyó 1 microlitro de cada fracción 25 veces en sacarosa al 30% p/p y se ensayó su actividad "splat". Se encontró que la actividad tenía correlación con un pico de OD 280 y OD 215 que eluyó con una retención de 1,2 ml en las fracciones 9 y 10. La columna Superdex se calibró mediante la determinación del volumen de retención (Ve) de marcadores estándar de peso molecular de proteína (Sigma) y el volumen vacío (Vo) se determinó como 0,91 ml mediante la aplicación de azul dextrano. Se trazó una curva estándar de log10 Mr frente a Ve/Vo y el peso molecular aparente del pico de OD 280 que se correlacionaba con la actividad "splat" del liquen se determinó como 30 KDa.

Se reservaron 32 microlitros de las fracciones 9 y 10 eluidas de la columna Superdex y se concentraron a 10 microlitros en un microcon de corte 10 KDa (Amicon) y se añadieron 3,5 microlitros x4 de tampón de la muestra SDS-PAGE a las fracciones 9 y 10 de 10 microlitros eluidas de la columna Superdex y a las fracciones 12-16 eluidas de la columna de Q-sefarosa. Después de calentar a 95°C durante cinco minutos y centrifugar a 10.000 G durante 3 minutos se cargaron 10 microlitros de cada muestra en pocillos en un gel concentrador al 4% y los polipéptidos se separaron mediante electroforesis a través de un minigel SDS-PAGE de 0,75 mm de espesor al 12% (Biorad). Tras la electroforesis el gel se tiñó y fijó en Azul Brillante de Coomassie y se destiñó en metanol:ácido acético:agua (1:4:5) p/p. Esto reveló un polipéptido de Mr aparente 24 KDa en las fracciones 9 y 10 eluidas de la columna Superdex, reservadas y concentradas. Cuando el gel se tiñó con plata con el kit de tinción de plata de Biorad según las instrucciones del fabricante, fue detectable un polipéptido con el mismo Mr aparente en la fracción 14 eluida de la columna de Q-sefarosa y en las fracciones 9 y 10 eluidas de la columna Superdex.

Después de la purificación de proteína adicional, utilizando esencialmente la misma metodología descrita anteriormente, se obtuvo la siguiente secuencia de aminoácidos en el extremo N-terminal del polipéptido de 24 KDa:

A-P-A-V-V-M-G-D-A-E-S-F-G-A-I-A-H-G-G-L

Ejemplo III

Se precipitó con sulfato de amonio un filtrado de liquen crudo según el ejemplo II y se resuspendió en Tris/HCl 0,2 M de pH 7,5 tal como se ha descrito anteriormente y se diluyó 1/10 en uno de los siguientes tampones: citrato sódico 0,2 M pH 3.0, acetato sódico 0,2 M de pH 4,0, Piperacina 0,2 M de pH 5,0, bisTris 0,2 M de pH 6,0, trietanolamina 0,2 M de pH 7,0, Tris 0,2 M de pH 8,0, CHES 0,2 M de pH 9,0, CAPS 0,2 M de pH 10,0. Estas muestras se diluyeron 1/2 en serie en el tampón pertinente y las diluciones se mezclaron 1:1 con sacarosa al 60% previamente al análisis "splat" según el segundo ensayo tal como se describe en el ejemplo I. Entre pH 10 y pH 6,0 se pudo detectar actividad de inhibición de recristalización claramente hasta una dilución de 1/320. Entre pH 3,0 - 5,0 se pudo detectar actividad claramente hasta una dilución de 1/80, indicando que aunque la proteína retiene algo de actividad a un pH bajo, su actividad se ve reducida por un factor de 4 a un pH igual o inferior a 5,0.

Ejemplo IV

Se separó anticongelante de liquen purificada según la proteína del ejemplo II mediante electroforesis en 2 dimensiones. Se polimerizó un gel con urea 9,2 M, acrilamida al 4% (2,66 ml de acrilamida al 30% bisacrilamida al 0,8% ), Triton x 100 desionizado al 2%, anfolito 4-7 Byolite al 1% (Biorad), anfolito 3,5-10 Bio-lyte al 1% (Biorad), TEMED al 0,1%, persulfato de amonio al 0,01% en tubos de vidrio pequeños (Biorad). Los tubos se enjuagaron con agua destilada y se introdujeron en un sistema de minigel capaz de acomodarlos y la cámara superior se llenó con NaOH 20 mM y la cámara inferior con H_{3}PO_{4} 10 mM. La muestra de liquen purificado se mezcló 1:1 con el tampón de muestra de la primera dimensión (urea 9,2 M, Triton x-100 al 2,0%, beta-mercaptoetanol al 5%, anfolito 4-7 Bio-lyte al 1%, anfolito 3-10 Bio-lyte al 0,25%) y se calentó a 37°C previamente a la aplicación a uno de los geles de los tubos. En una segunda varilla, se aplicaron proteínas marcadoras en 2 dimensiones (Biorad) y en una tercera varilla se aplicó una mezcla de proteínas marcadoras en 2 dimensiones y la muestra de liquen. Tras la electroforesis a 500 V durante 10 minutos y a 750 V durante 4 horas las varillas se extrusionaron de los tubos y se cargaron en 3 minigeles SDS-PAGE al 12% separados de 1 mm de grosor (Biorad) y se cubrieron con tampón de muestra SDS-PAGE. Tras la electroforesis los geles se tiñeron de plata con el kit de Biorad según las instrucciones del fabricante. La separación reveló 3 manchas en el gel en la muestra de liquen todas con un Mr aparente de, aproximadamente, 24 KDa y un PI inferior a 4,5.

El enfoque isoeléctrico en 1 dimensión de proteína anticongelante de liquen purificada mediante un gel laminado compuesto de los mismos componentes que el gel de la primera dimensión en la separación en 2 dimensiones excepto en que se utilizaron los anfolitos Biolyte 3-5 en lugar de los anfolitos Biolyte 4-7, reveló una banda con un punto isoeléctrico inferior a 3,6 tras la tinción con plata.

Claims

1. Una proteína anticongelante que se puede obtener de líquenes, teniendo dicha proteína tiene un peso molecular aparente de 20 a 28 KDa y teniendo una secuencia de aminoácidos en el extremo N-terminal que muestra, como mínimo, una coincidencia del 80% con:

A-P-A-W-M-D-A-E-S-F-G-A-I-A-H-G-G-L

y las versiones glicosiladas de esta proteína.

2. Una proteína anticongelante, según la reivindicación 1, que tiene un peso molecular de 22 a 26 KDa.

3. Una proteína anticongelante, según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que muestra, como mínimo, un 90% de coincidencia con la secuencia parcial de la reivindicación 1.

4. Una proteína anticongelante, según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que muestra una coincidencia del 100% con la secuencia parcial de la reivindicación 1.

5. Una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína anticongelante de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

6. Un producto alimenticio que comprende una proteína anticongelante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

7. Un producto alimenticio, según la reivindicación 6, que es un producto de repostería congelado.