DE69834136T2

DE69834136T2 - Gefrierschutzprotein

Info

Publication number: DE69834136T2
Application number: DE69834136T
Authority: DE
Inventors: Michael Christopher Sharnbrook SIDEBOTTOM; Felicia Margaret SMALLWOOD; Jane Louise BYASS
Original assignee: Unilever NV
Current assignee: Unilever NV
Priority date: 1998-01-22
Filing date: 1998-12-23
Publication date: 2006-11-09
Anticipated expiration: 2018-12-24
Also published as: WO1999037673A2; ATE322503T1; CA2318869A1; AU2614899A; EP1049713B1; US6774210B1; WO1999037673A3; CN1284085A; HUP0100410A3; TR200002105T2; ID25509A; SK10932000A3; GB9801420D0; PL342568A1; JP2002508303A; EP1049713A2; AU753334B2; BR9814760A; HUP0100410A2; IL136197A0

Description

Technisches Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft Frostschutz-Proteine (anti-freeze proteins, AFPs) und ein AFPs enthaltendes gefrorenes Nahrungsmittelprodukt.
Hintergrund der Erfindung
Frostschutz-Proteine (AFPs) wurden zur Verbesserung der Gefriertoleranz von Nahrungsmitteln vorgeschlagen. Für den Zweck der Erfindung hat der Ausdruck AFP die im Stand der Technik wohlbekannte Bedeutung, nämlich jene Proteine, die die Wirkung haben, das Wachstum von Eiskristallen zu inhibieren. Siehe z.B. US 5,118,792 .
Die WO 90/13571 offenbart Frostschutz-Peptide, die chemisch oder mittels rekobinanter DNA-Techniken erzeugt werden. Die AFPs können zweckmäßig in Nahrungsmittelprodukten verwendet werden.
Die WO 92/22581 offenbart AFPs aus Pflanzen, die zur Steuerung der Eiskristall-Form in Eiscreme verwendet werden können. Dieses Dokument beschreibt auch ein Verfahren zum Extrahieren einer Polypeptid-Zusammensetzung aus extrazellulären Räumen von Pflanzen durch Infiltrieren von Blättern mit einem Extraktionsmedium ohne Aufbrechen der Pflanzen.
Die WO 94/03617 offenbart die Produktion von AFPs aus Hefe und ihre mögliche Verwendung in Eiscreme. Die WO 96/11586 beschreibt durch Mikroben erzeugte Fisch-AFPs.
Mehrere Literaturstellen erwähnen auch die Isolierung und/oder Verwendung von Pflanzen-Proteinen für einen Kälteschutz („cryoprotection"). Kryoprotektive Proteine haben eine Funktion beim Schutz von Pflanzenmembranen gegen Frostschäden. Diese Proteine besitzen jedoch keine Umkristallisations-Hemmungs-Eigenschaften und sind daher nicht vom Ausdruck „AFPs" mit umfasst.
Im Journal of Plant Physiology, 1992, 140, 236–240 beschreibt Hincha die Isolierung von kryoprotektiven Proteinen aus Kohl. Volger beschreibt in Biochimica et Biophysica Acta, 412 (1975), 335–349, die Isolierung von kryoprotektiven Blatt-Proteinen aus Spinat. Boothe beschreibt in Plant Physiol.(1995), 108: 759–803, die Isolierung von Proteinen aus Brassica napus. Wiederum nimmt man an, dass diese Proteine eher kryoprotektive Proteine als AFPs sind. Neven beschreibt in Plant Molecular Biology 21: 291–305, 1993, die DNA-Charakterisierung eines kryoprotektiven Spinat-Proteins. Salzuran beschreibt in Abstracts and Reviews of the 18^th Annual Meeting of the ASEV/Easern Section in Am. J. Enol. Vitic., Bd. 44, Nr. 4, 1993, das Vorhandensein von kochfesten Polypeptiden in Knospen von Vitis. Obwohl diese Proteine analog zu den Fisch-Frostschutz-Peptiden sind, sind sie kryoprotektive Proteine und keine AFPs. Lin beschreibt in Biochemical and Biophysical Research Communication, Bd. 183, Nr. 3, 1992, Seiten 1103–1108 und in Lin, Plant Physiology (1992) 99, 519–525 das kryoprotektive 15 kDa-Polypeptid aus Arabidopsis Hakaira. Houde erwähnt in The Plant Journal (1995) 8(4), 583–593 kryoprotektive Proteine aus Weizen.
Bisher wurde jedoch die Verwendung von AFPs nicht auf im Handel erhältliche Nahrungsmittel angewendet. Ein Grund dafür sind die hohen Kosten und das komplizierte Verfahren zum Erhalt von AFPs. Ein anderer Grund ist, dass die AFPs, die bisher für die Verwendung in gefrorenen Nahrungsmitteln vorgeschlagen wurden, nicht in die Mischung der Standard-Formulierung eingearbeitet werden können, weil sie zur Destabilisierung während der Verarbeitung, insbesondere während des Pasteurisierungsschrittes, neigen. Man nimmt an, dass diese Destabilisierung durch die Denaturierung der AFPs verursacht wird; dies ist ein wohl bekannter Effekt, der bei Peptiden und Proteinen allgemein beobachtet wird.
In unserer nicht vorveröffentlichten Patentanmeldung WO 98/4148 wurde beschrieben, dass besonders gute AFPs aus natürlichen Quellen, wie Flechten, isoliert werden können.
Die Anmelder konnten nun die teilweise Aminosäure-Sequenz eines besonders aktiven AFP aus Flechten bestimmen.
Demgemäß betrifft die Erfindung ein AFP, das aus Flechten erhältlich ist, wobei das AFP ein apparentes Molekulargewicht von etwa 24 kDa und eine Aminosäure-Sequenz ab dem N-Terminus von
A-P-A-W-M-D-A-E-S-F-G-A-I-A-H-G-G-L hat.
Ebenfalls im Bereich unserer Erfindung mit eingeschlossen sind Proteine mit einer Sequenz, die eine hochgradige Ähnlichkeit mit der obigen Sequenz hat. Für den Zweck der Erfindung sind alle RI-aktiven Proteine, die eine Aminosäure-Sequenz mit einer mindestens 80% Überlappung mit der obigen Sequenz aufweisen, ebenfalls im Bereich der Erfindung mit eingeschlossen. Mehr bevorzugt ist eine Überlappung von mindestens 90%, am meisten bevorzugt mehr als 95%, z.B. jene Aminosäure-Sequenzen, die sich von der obigen Sequenz in keiner oder nur in einer oder zwei Aminosäuren unterscheiden.
Für den Zweck der Erfindung kann der Grad der Überlappung von zwei (teilweisen) Aminosäure-Sequenzen wie folgt berechnet werden:

(a) die beiden Aminosäure-Sequenzen werden ausgerichtet („aligned"), und die Anzahl der Aminosäuren, die identisch sind und in derselben Reihenfolge aufscheinen, wird gezählt (X)
(b) jede Veränderung, Deletion oder Addition einer Aminosäure wird als 1 Punkt gezählt, und die Gesamtheit Veränderungen, Deletionen und Additionen wird gezählt (Y)
(c) der Grad der Überlappung kann nun berechnet werden als X·100%/(X + Y).

Beispielsweise kann die (teilweise) Aminosäure-Sequenz, ab dem N-Terminus, von:
A-P-A-V-V-M-G-D-A-E-S-F-G-A-I-A-H-G-G-L
wie folgt mit der Kontrolle ausgerichtet:
A-P-A-V-V-M-G-D-A-E-S-F-G-A-I-A-H-G-G-L
A-P-A-W -M- D-A-E-S-F-G-A-I-A-H-G-G-L.
Dies ergibt eine Gesamtzahl identischer Aminosäuren in derselben Reihenfolge von 17. Die Anzahl der Veränderungen ist 1 (W zu V an der vierten Position); die Anzahl der Additionen ist 2 (V an der fünften Position, G an der 7. Position), während es keine Deletionen gibt. Die Gesamtheit der Veränderungen, Additionen und Deletionen ist daher 3. Dies führt zu einem Überlappungsgrad von 17·100%/(17 + 3) = 85%.
Das Protein mit einer (teilweisen) Aminosäure-Sequenz, ab dem N-Terminus, von:
A-P-A-V-V-M-G-D-A-E-S-F-G-A-I-A-H-G-G-L
ist folglich auch von der Erfindung mit umfasst.
Ebenso im Rahmen der vorliegenden Erfindung mit umfasst sind glykosylierte Versionen der oben beschriebenen Proteine, wobei diese Modifikation die Eis-Umkristallisationshemmungseigenschaften nicht wesentlich beeinflusst.
Für den Zweck der Erfindung bedeutet der Ausdruck „etwa 24 kDa Molekulargewicht" jedes Molekulargewicht von 20 bis 28 kDa, wie auf SDA-PAGE unter Verwendung von Standard-Referenz-Markern gemessen, mehr bevorzugt ist das Molekulargewicht von 22 bis 26 kDa.
Das vorteilhafte AFP der vorliegenden Erfindung ist von Flechten ableitbar, insbesondere von der Spezies Umbilicaria antarctica.
Ebenfalls im Rahmen der vorliegenden Erfindung mit umfasst sind Frostschutz-Proteine, welche, obwohl sie ursprünglich von Flechten abgeleitet sind, mittels anderer Methoden erzeugt werden, beispielsweise mittels genetischer Modifikationstechniken, wobei beispielsweise Mikroorganismen oder Pflanzen genetisch modifiziert werden, um die oben beschriebenen Proteine zu erzeugen. Diese Proteine sind ebenfalls vom Ausdruck „von Flechten ableitbar" mit umfasst.
Ebenfalls im Rahmen der vorliegenden Erfindung mit umfasst sind Nukleinsäure-Sequenzen, die für die oben beschriebenen AFPs codieren können.
Vektoren, die eine Nukleinsäure-Sequenz enthalten, die für das AFP der Erfindung codieren können, sind auch vom Bereich der Erfindung mit umfasst.
Aufgrund der obigen Information ist es auch möglich, andere natürliche Quellen genetisch so zu modifizieren, dass sie das vorteilhafte AFP, wie hier oben beschrieben, erzeugen.
Die Anmelder stellten nun fest, dass AFPs mit der obigen Sequenz verbesserte Eis-Umkristallisationshemmungseigenschaften aufweisen. Ein geeigneter Test zum Bestimmen der Eis-Umkristallisationshemmungseigenschaften ist in den Beispielen beschrieben und beinhaltet das rasche Gefrieren auf mindestens –40°C, beispielsweise –80°C, gefolgt von einer einstündigen Lagerung bei –6°C. Vorzugsweise sehen die erfindungsgemäßen AFPs eine Eispartikelgröße nach einem Eis-Umkristallisationshemmungs-Test – wie in den Beispielen beschrieben – von 15 μM oder weniger, mehr bevorzugt von 5 bis 15 μm, vor.
Das AFP der Erfindung kann zweckmäßig in Nahrungsmittelprodukten verwendet werden, vorzugsweise in Nahrungsmittelprodukten, die gefroren sind oder gefroren werden sollen. Besonders bevorzugt ist die Verwendung von AFPs in Produkten, die erhitzt werden, z.B. durch Pasteurisieren oder Sterilisieren vor dem Gefrieren. Besonders bevorzugt ist die Verwendung in gefrorenen Konfekt-Produkten.
Beispiele für solche Nahrungsmittelprodukte sind: gefrorene Konfekt-Mischungen, wie Eiscreme-Mischungen und Wassereis-Mischungen, die vor dem Gefrieren pasteurisiert werden sollen. Solche Mischungen werden gewöhnlich bei Umgebungstemperatur ge lagert. Geeignete Produktformen sind z.B.: eine Pulver-Mischung, die z.B. in einem Sack oder in Sachets verpackt ist; wobei diese Mischung die Basis des gefrorenen Nahrungsmittelprodukts bilden kann, z.B. nach Zugabe von Wasser und gegebenenfalls anderen Ingredienzien und – gegebenenfalls – Versetzen mit Luft.
Ein weiteres Beispiel für eine geeignete Mischung könnte eine flüssige Mischung (gegebenenfalls mit Luft versetzt) sein, die, erforderlichenfalls nach Zusatz weiterer Komponenten und gegebenenfalls weiterem Versetzen mit Luft, gefroren werden kann.
Der klare Vorteil der oben erwähnten Mischungen ist, dass das Vorhandensein des AFP-Ingrediens bewirkt, dass die Mischungen unter ruhigen Bedingungen gefroren werden können, beispielsweise im Gefriergerät eines Geschäftes oder eines Haushalts, ohne die Bildung inakzeptabler Eiskristallformen und folglich mit einer Textur, die anders ist als bei Produkten, die normalerweise durch ruhiges Gefrieren erhalten werden.
Sehr praktisch sind diese Mischungen in geschlossenen Behältern verpackt (z.B. in Kartons, Beuteln, Schachteln, Plastikbehältern usw.). Für Einzelportionen ist die Packungsgröße im Allgemeinen von 10 bis 1000 g. Für Mehrfach-Portionen können Packungsgrößen von bis zu 500 kg geeignet sein. Im Allgemeinen ist die Packungsgröße von 10 g bis 5000 g.
Wie oben angegeben, sind die bevorzugten Produkte, in welchen die AFPs verwendet werden, gefrorene Konfekt-Produkte, wie Eiscreme oder Wassereis. Vorzugsweise beträgt die Menge der AFPs von 0,00001 bis 0,5 Gew.-%, bezogen auf das Endprodukt. Wenn Trockenmischungen oder Konzentrate verwendet werden, kann die Konzentration höher sein, um zu gewährleisten, dass die Menge im endgültigen gefrorenen Produkt innerhalb der obigen Bereiche liegt.
Für die Zwecke der Erfindung inkludiert der Ausdruck „gefrorenes Konfekt-Produkt" Milch-hältige gefrorene Konfektzubereitungen, wie Eiscreme, gefrorenes Jogurt, Sorbet („sherbet"), Fruchteis („sorbet"), Milcheis und gefrorenen Pudding, Wassereissorten, Granitas und gefrorene Fruchtpürees. Für einige Anwendungen ist die Verwendung in fermentierten Nahrungsmittelprodukten weniger bevorzugt.
Vorzugsweise ist die Menge der Feststoffe im gefrorenen Konfekt (z.B. Zucker, Fett, Geschmacksstoff usw.) mehr als 4 Gew.-%, z.B. mehr als 30 Gew.%, mehr bevorzugt von 40 bis 70 Gew.-%. Gefrorene erfindungsgemäße Konfekt-Produkte können mit jedem für die Produktion von gefrorenem Konfekt geeigneten Verfahren hergestellt werden. Insbesondere bevorzugt werden jedoch alle Ingredienzien der Formulierung vor dem Pasteurisieren, und bevor der Gefrierprozess beginnt, vollständig gemischt. Der Gefrierprozess kann vorteilhaft einen Härtungsschritt beinhalten, beispielsweise auf eine Temperatur von –30°Fahrenheit (–34,4°C) oder darunter.
Beispiel I
Die Eis-Umkristallisationshemmungseigenschaften der AFPs können wie folgt bestimmt werden:
Eine Probe eines AFP enthaltenden Produkts wurde auf einen Saccharose-Gehalt von 30 Gew.-% eingestellt. (Wenn der Ausgangsgehalt der Probe mehr als 30% war, geschah dies durch Verdünnen, wenn der Ausgangsgehalt geringer war, wurde Saccharose auf den Gehalt von 30% zugegeben.)
Ein 3 μl-Tropfen der Probe wurde auf ein 22 mm-Deckglas gegeben. Ein Deckglas mit einem Durchmesser von 16 mm wurde dann oben darauf platziert, und ein 200 g-Gewicht wurde auf der Probe platziert, um eine gleichmäßige Dicke des Objektträgers zu gewährleisten. Die Ränder des Deckglases wurden mit durchsichtigem Nagellack dicht verschlossen.
Der Objektträger wurde auf einen Linkham THM 600 Mikroskop-Tisch mit Temperatursteuerung gegeben. Der Tisch wurde rasch (50°C pro Minute) auf –40°C gekühlt, um eine große Population kleiner Kristalle zu erzeugen. Die Tisch-Temperatur wurde dann rasch (50°C pro Minute) auf –6°C erhöht und auf dieser Temperatur gehalten.
Die Eisphase wurde bei –6°C unter Verwendung eines Leica Aristoplan-Mikroskops beobachtet. Polarisierte Lichtbedingungen in Verbindung mit einer Lambda-Platte wurden verwendet, um den Kontrast der Eiskristalle zu verstärken. Der Zustand der Eisphase (Größe der Eiskristalle) wurde mittels 35 mm-Photomikrographie zum Zeitpunkt T = 0 und T = 1 Stunde aufgezeichnet. Die Eiskristallgröße (Länge) wurde bestimmt, indem der Umfang des Kristalls umzeichnet wurde. Die maximale Länge für jeden einzelnen Eiskristall einer Charge Eiscreme wurde auf ein Arbeitsblatt eingetragen, wo eine Analyse des Datensatzes durchgeführt wurde, um den Mittelwert und die Standardabweichung herauszufinden.
Eine andere Methode zum Testen der Eis-Umkristallisationshemmungseigenschaften ist wie folgt:
Die Frostschutz-Aktivität wurde unter Verwendung eines modifizierten „Splat-Tests" (Knight et al., 1988) gemessen. 2,5 μl der zu untersuchenden Lösung in 30% (Gew./Gew.) Saccharose wurden auf ein reines, entsprechend markiertes, kreisförmiges 16 mm Deckglas transferiert. Ein zweites Deckglas wurde oben auf den Tropfen der Lösung gegeben, und das „Sandwich" wurde zwischen Finger und Daumen zusammengedrückt. Das „Sandwich" wurde in ein Hexan-Bad fallen lassen, das auf –80°C in einer Trockeneis-Box gehalten wurde. Sobald alle „Sandwiches" hergestellt worden waren, wurden die „Sandwiches" aus dem –80°C Hexan-Bad in die Ansichtskammer transferiert, die auf –6°C gehaltenes Hexan enthielt, wobei eine in dem Trockeneis vorgekühlte Zange verwendet wurde. Nach dem Transfer auf –6°C konnte man sehen, wie sich die „Sandwiches" von einem transparenten zu einem opaken Aussehen veränderten. Bilder wurden mit einer Videokamera aufgezeichnet und in ein Bildanalysesystem (LUCIA, Nikon) unter Verwendung eines 20x-Objektivs gebracht. Bilder jedes Splats wurden zur Zeit = 0 und wiederum nach 30–60 Minuten aufgezeichnet. Die Größe der Eiskristalle in beiden Tests wurde verglichen. Wenn die Größe zur Zeit 30–60 Minuten ähnlich oder nur moderat erhöht ist (z.B. um weniger als 20% erhöht, mehr bevorzugt weniger als 10% erhöht, am meisten bevorzugt weniger als 5% erhöht) im Vergleich zur Größe zur Zeit t = 0, so ist dies ein Anzeichen für gute Eis-Umkristallisationshemmungseigenschaften.
Im Allgemeinen können diese Tests für jede geeignete Zusammensetzung, die AFP und Wasser aufweist, angewendet werden. Im Allgemeinen ist der Gehalt an AFP in einer solchen Test-Zusammensetzung nicht sehr kritisch und kann beispielsweise von 0,0001 bis 0,5 Gew.-%, mehr bevorzugt 0,0005 bis 0,1 Gew.-%, am meisten bevorzugt 0,001 bis 0,05 Gew.-%, z.B. 0,01 Gew.-%, betragen.
Jede geeignete Zusammensetzung, die AFP und Wasser aufweist, kann zur Durchführung des Tests verwendet werden. Im Allgemeinen ist es jedoch nicht notwendig, das AFP in gereinigter Form zu erhalten. Für praktische Anwendungen würde es normalerweise ausreichen, einen flüssigen Extrakt oder Saft eines natürlichen Materials herzustellen, wobei dieser Extrakt oder Saft dann getestet werden kann.
Beispiel II
9,5 g Umbilicaria antarctica, die im Frühjahr 1996 aus der Antarktis gesammelt und bei –20°C gelagert worden war, wurden in flüssigem Stickstoff in einem Mörser mit Stößel zu feinem Pulver homogenisiert. Dieses Pulver wurde in einen auf Raumtemperatur gehaltenen frischen Mörser und Stößel transferiert. Nach Zugabe von 10 ml 0,2 M Tris HCl, enthaltend 10 mM EDTA, wurde das Pulver im Mörser und Stößel weiter gemahlen, und das Homogenat wurde durch 2 Lagen Musselin gefiltert. Der Rückstand wurde wieder in den Mörser und Stößel gegeben, und weitere 10 ml Puffer wurden zugegeben und der Rückstand wurde weiter gemahlen. Dieses Material wurde wie oben filtriert, und das Filtrat wurde mit dem Filtrat aus dem ersten Homogenisierungsschritt gepoolt. Das Filtrat wurde bei 30.000 g 15 min lang zentrifugiert, und der Überstand wurde gesammelt und in Aliquots eingefroren.
0,15 g NH₄SO₄ wurden in 1 ml Überstand gelöst, und die Lösung wurde 30 min lang bei 4°C inkubiert. Nach 10-minütigem Zentrifugieren bei 30.000 g wurden 0,3 g NH₄SO₄ im Überstand aus diesem Schritt gelöst, und die Lösung wurde 30 min lang bei 4°C inkubiert. Die Lösung wurde 10 min lang bei 30.000 g zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde in 0,2 ml Wasser resuspendiert, und serielle Verdünnungen dieser Lösung und des ursprünglichen Extrakts wurden in 30% (Gew./Gew.) Saccharose in Wasser für eine halb-quantitative Splat-Analyse hergestellt. Die Splat-Aktivität konnte (mit dem obigen Verfahren) im ursprünglichen Extrakt bis zu einer Verdünnung von mehr als 200-fach, und im resuspendierten Pellet bis zu einer Verdünnung von 800-fach nachgewiesen werden, was anzeigt, dass mehr als die Hälfte der gesamten, im ursprünglichen Extrakt vorhandenen Splat-Aktivität im NH₄SO₄-Pellet geerntet worden war.
200 Mikroliter 0,1 M Tris HCl, pH 7,5, wurden zum resuspendierten Pellet zugegeben, und die Lösung wurde in einem „Microcon" (Amicon) mit einer Ausschlussgrenze von 10 kDa auf 150 Mikroliter konzentriert. 100 Mikroliter dieser Lösung wurden auf eine Q-Sepharose-Säule, vor-äquilibriert in 50 mM Tris HCl, pH 7,5, unter Verwendung eines SMART-Chromatographie-Systems (Pharmacia) mit einer Fließgeschwindigkeit von 100 Mikroliter pro Minute aufgetragen, und 100-Mikroliter-Fraktionen wurden gesammelt. Nach 800 Mikroliter wurde in 50 mM Tris HCl, pH 7,5, ein 0–0,5 M NaCl-Gradient auf die Säule über 1,5 ml aufgetragen, und das Eluat wurde bei 280 nm überwacht. Nach einer 50-fachen Verdünnung in 20 Gew./Gew.-% Saccharose wurden Fraktionen wie in Beispiel 1 auf Splat-Aktivität getestet. Es zeigte sich, dass die Aktivität mit einem Peak von OD 280 korrelierte, welcher bei etwa 0,1 M NaCl eluierte, was hauptsächlich in Fraktion 14 gesammelt wurde.
40 Mikroliter der Fraktion 14 wurden auf eine Superdex 75 Gel-Permeations-Säule, voräquilibriert in 50 mM Tris HCl, pH 7,5, bei einer Fließgeschwindigkeit von 40 Mikroliter pro Minute unter Verwendung eines SMART-Chromatographie-Systems (Pharmacia) aufgetragen. Das Eluat wurde bei OD 280 und OD 215 überwacht, und die 80-Mikroliter-Fraktionen wurden von 0,6 ml nach dem Auftragen der Probe gesammelt, 50-Mikroliter-Fraktionen zwischen 1,1 und 1,6 ml und 100-Mikroliter-Fraktionen zwischen 1,6 und 3 ml. 1 Mikroliter aus jeder Fraktion wurde 25 Mal in 30 Gew./Gew.-% Saccharose verdünnt und auf Splat-Aktivität untersucht. Es zeigte sich, dass die Aktivität mit einem Peak von OD 280 und OD 215 korrelierte, welcher mit einer Retention von 1,2 ml in den Fraktionen 9 und 10 eluierte. Die Superdex-Säule wurde durch Bestimmung des Retentionsvolumens (Ve) von Standard-Protein-Molekulargewichts-Markern (Sigma) kalibriert und das Leervolumen (Vo) als 0,91 ml durch Aufbringen von Dextran-Blau bestimmt. Eine Standard-Kurve von log10 Mr gegen Ve/Vo wurde aufgetragen, und das apparente Molekulargewicht des OD 280 Peak, das mit der Flechten-Splat-Aktivität korrelierte, als 30 kDa bestimmt.
32 Mikroliter von den Fraktionen 9 und 10, die aus der Superdex-Säule eluierten, wurden gepoolt und auf 10 Mikroliter in einem Microcom (Amicon) mit einer Ausschlussgrenze von 10 kDa konzentriert, und 3,5 Mikroliter 4x SDS-PAGE Proben-Puffer wurden zu den 10 Mikroliter-Fraktionen 9 und 10, die aus der Superdex-Säule eluierten, und zu den Fraktionen 12–16, die aus der Q-Sepharose-Säule eluierten, zugegeben. Nach 5-minütigem Erhitzen auf 95°C und 3-minütigem Zentrifugieren bei 10.000 g wurden 10 Mikroliter jeder Probe in Vertiefungen in einem 4% Stapel-Gel („stacking gel") geladen, und die Polypeptide wurden mittels Elektrophorese durch ein 12%, 0,75 mm dickes SDS-PAGE Mini-Gel (Biorad) separiert. Nach der Elektrophorese wurde das Gel gefärbt und in Coomassie Brilliant Blue fixiert und in Methanol: Essigsäure:Wasser (1:4:5) Gew./Gew. entfärbt. Dies offenbarte ein Polypeptid mit apparentem Mr 24 kDa in den konzentrierten gepoolten Fraktionen 9 und 10, die von der Superdex-Säule eluierten. Als das Gel unter Verwendung des Biorad-Silberfärbungs-Sets gemäß der Instruktionen des Herstellers einer Silberfärbung unterzogen wurde, war ein Polypeptid mit demselben apparenten Mr in Fraktion 14, die von der Q-Sepharose-Säule eluierte, und in den Fraktionen 9 und 10, die von der Superdex-Säule eluierten, nachweisbar.
Nach Reinigung von weiterem Protein unter Verwendung von im Wesentlichen derselben Methodik wie oben beschrieben, wurde die folgende N-terminale Aminosäure-Sequenz vom 24 kDa-Polypeptid erhalten:
A-P-A-V-V-M-G-D-A-E-S-F-G-A-I-A-H-G-G-L.
Beispiel III
Rohes Flechten-Filtrat gemäß Beispiel II wurde einer Ammoniumsulfat-Fällung unterzogen und in 0,2 M Tris/HCl, pH 7,5, wie oben beschrieben resuspendiert und danach 1/10 in einem der folgenden Puffer verdünnt: 0,2 M Natriumcitrat pH 3,0, 0,2 M Natriumacetat pH 4,0, 0,2 M Piperazin pH 5,0, 0,2 M bisTris pH 6,0, 0,2 M Triethanolamin pH 7,0, 0,2 M Tris pH 8,0, 0,2 M CHES pH 9,0, 0,2 M CAPS pH 10,0. Diese Proben wurden danach seriell 1/2 im relevanten Puffer verdünnt, und die Verdünnungen wurden vor der Splat-Analyse gemäß dem zweiten Test, wie in Beispiel I beschrieben, 1:1 mit 60% Saccharose gemischt. Zwischen pH 10 und pH 6,0 konnte die Umkristallisationshemmungsaktivität deutlich bis zu einer Verdünnung von 1/320 nachgewiesen werden. Zwischen pH 3,0 – 5,0 konnte die Aktivität deutlich bis zu einer Verdünnung von 1/80 nachgewiesen werden, was anzeigt, dass, obwohl das Protein bei niedrigem pH eine gewisse Aktivität beibehält, seine Aktivität um einen Faktor 4 bei einem pH-Wert von 5,0 oder darunter verringert wird.
Beispiel IV
Gereinigter Flechten-Frostschutz gemäß Beispiel II wurde mittels 2-dimensionaler Elektrophorese getrennt. Gel enthaltend 9,2 M Harnstoff, 4% Acrylamid (2,66 ml 30% Acrylamid 0,8% Bisacrylamid), 2% entionisiertes Triton X 100, 1% 4–7 Bio-lyte-Ampholyte (Biorad), 1% 3,5-10 Bio-lyte Ampholyte, 0,1% TEMED, 0,01 Ammoniumpersulfat wurde in Glasröhrchen polymerisiert (Biorad). Die Röhrchen wurden in destilliertem Wasser gespült und in ein Mini-Gel-System, das sie aufnehmen konnte, insertiert, und die obere Kammer mit 20 mM NaOH und die untere Kammer mit 10 mM H₃PO₄ gefüllt. Die gereinigte Flechten-Probe wurde 1:1 mit Proben-Puffer der ersten Dimension (9,2 M Harnstoff, 2,0% Triton X-100, 5% Betamercaptoethanol, 1% 4–7 Bio-lyte Ampholyte., 0,25 3–10 Bio-lyte Ampholyte) gemischt und vor dem Auftragen auf eines der Röhrchen-Gele auf 37°C erwärmt. Auf einen zweiten Stab wurden 2-dimensionale Marker-Proteine (Biorad) aufgetragen, und auf einen dritten Stab wurde eine Mischung aus 2-dimensionalen Marker-Proteinen und der Flechten-Probe aufgetragen. Nach einer Elektrophorese von 10 min bei 500 V und 4 h bei 750 V wurden die Stäbe aus den Röhrchen herausgezogen und auf 3 separate 1 mm dicke 12% SDS-PAGE Mini-Gele (Biorad) geladen und mit SDS-PAGE-Proben-Puffer überschichtet. Nach Elektrophorese wurden die Gele unter Verwendung des Biorad-Sets gemäß den Instruktionen des Herstellers einer Silberfärbung unterzogen. Die Trennung offenbarte 3 Spots am Gel in der Flechten-Probe, alle mit einem apparenten Mr von etwa 24 kDa und einem PI von weniger als 4,5.
1-Dimensionales isoelektrisches Fokussieren des gereinigten Flechten-Frostschutz-Proteins unter Verwendung eines Slab-Gels bestehend aus denselben Komponenten wie beim Gel der ersten Dimension in der 2-dimensionalen Trennung, außer dass Biolyte 3–5 Ampholyte anstelle von Biolyte 4–7-Ampholyten verwendet wurden, offenbarten eine Bande mit einem isoelektrischen Punkt von weniger als 3,6 nach Silberfärbung.

Claims

Frostschutz-Protein, das von Flechten ableitbar ist, wobei das Protein ein apparentes Molekulargewicht von 20 bis 28 kDa hat und eine N-terminale Aminosäure-Sequenz aufweist, die eine mindestens 80% Überlappung mit A-P-A-W-M-D-A-E-S-F-G-A-I-A-H-G-G-L zeigt, und glykosylierte Versionen dieses Proteins.
Frostschutz-Protein nach Anspruch 1 mit einem Molekulargewicht von 22 bis 26 kDa.
Frostschutz-Protein nach Anspruch 1 oder 2, welches eine mindestens 90% Überlappung mit der Teilsequenz von Anspruch 1 aufweist.
Frostschutz-Protein nach Anspruch 1 oder 2, welches eine 100 Überlappung mit der Teilsequenz von Anspruch 1 aufweist.
Nukleinsäure-Sequenz, die für das Frostschutz-Protein eines der vorhergehenden Ansprüche codiert.
Nahrungsmittelprodukt, welches ein Frostschutz-Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 4 aufweist.
Nahrungsmittelprodukt nach Anspruch 6, welches ein gefrorenes Konfekt-Produkt ist.