ES2260685T3

ES2260685T3 - Implante metalico recubierto, a una concentracion de oxigeno reducida, con proteina osteoinductora.

Info

Publication number: ES2260685T3
Application number: ES03794834T
Authority: ES
Inventors: Klaus Hellerbrand; Nicola Beaucamp; Ulrich Kohnert
Original assignee: Scil Technology GmbH
Current assignee: Bionet Pharma GmbH
Priority date: 2002-09-10
Filing date: 2003-07-09
Publication date: 2006-11-01
Anticipated expiration: 2023-07-09
Also published as: US7763270B2; ATE322916T1; CA2498512A1; US20060240062A1; US20110020658A1; CA2498512C; PL375794A1; EP1539261A1; US8257728B2; DK1539261T3; PT1539261E; AU2003253049A1; JP4358741B2; JP2006503611A; CN100522241C; PL207552B1; WO2004024199A1; DE60304584T2; CN1681540A; DE60304584D1

Abstract

Un procedimiento para la producción de un dispositivo que comprende las etapas de: (a) proporcionar una disolución que comprende proteína osteoinductora disuelta; (b) poner en contacto la disolución de la etapa (a) con un vehículo que contiene una superficie de metal o una aleación de metal; (c) permitir que se recubra la superficie de dicho vehículo con dicha proteína disuelta; y (d) secar el vehículo recubierto obtenido en la etapa (c), en el que las etapas (b) a (d) se llevan a cabo a una concentración de oxígeno reducida.

Description

Implante metálico recubierto, a una concentración de oxígeno reducida, con proteína osteoinductora.

La presente invención se refiere a un procedimiento para producir un dispositivo que comprende las etapas de (a) proporcionar una disolución que comprende proteína osteoinductora disuelta, (b) poner en contacto la disolución de la etapa precedente con un vehículo que contiene una superficie de metal o una aleación de metal, (c) permitir que se recubra la superficie de dicho vehículo con dicha proteína disuelta y (d) secar el vehículo recubierto obtenido en la etapa (c), en el que las etapas (b) a (d) se llevan a cabo a una concentración de oxígeno reducida. La invención también engloba un dispositivo obtenible mediante el procedimiento de la presente invención. Además, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende dicho dispositivo y al uso del dispositivo para la preparación de una composición farmacéutica para ser usada para una osteointegración acelerada y formación de hueso nuevo. Finalmente, la presente invención se refiere a un kit que comprende el dispositivo de la presente
invención.

Durante las últimas décadas se describieron muchos procedimientos para mejorar la calidad de los implantes con respecto al contacto entre el implante y el hueso y su biocompatibilidad. La demanda de implantes es extrema ya que dichos dispositivos tienen que ser fijados rígidamente al hueso y ser estables ante, por ejemplo, una alta presión (por ejemplo, dientes, articulaciones). La respuesta inicial del tejido tras la implantación depende de la presencia de factores de crecimiento específicos liberados desde los tejidos circundantes que estimulan el crecimiento y la diferenciación celulares.

Aunque hay procedimientos de fijación bien establecidos para implantes dentales, todavía tienen tendencia a aflojarse con el tiempo. Se ha descrito una variedad de metodologías con objeto de mejorar la incorporación de los correspondientes implantes (osteointegración). Estas metodologías incluyen el recubrimiento de implantes de diferente origen (por ejemplo, cerámico, metálico u otros, véase el documento EP-B10657146) con materiales biodegradables (por ejemplo, fosfato tricálcico, hidroxiapatita) y varios procedimientos para el grabado de las superficies metálicas. Se asume que las irregularidades superficiales a escala nanométrica y micrométrica mejoran el crecimiento hacia el interior del colágeno y las células (T. Albrektsson en: Handbook of Biomaterials (Black, J. y Hastings, G. (eds.), Chapman & Hall, Londres, 1998, págs. 500-512).

El recubrimiento de implantes metálicos con superficies cerámicas se describe, por ejemplo, como la mezcla de dos polvos, un polvo metálico y un polvo que contiene fosfato cálcico (documento EP0467948) procesados en un material de implante durante un proceso de sinterización.

Para fabricar un material cerámico compuesto se describe una variedad de otros procedimientos de sinterización (Offenlegungsschrift DE2928007, patente de EE.UU. 4.882.196). Un enfoque principal se centra en el recubrimiento de superficies metálicas con fosfatos de calcio tales como fosfato tricálcico o hidroxiapatita (Y. Tsui, 1998) que permiten una incorporación mejorada de los implantes (patente de EE.UU. 6.312.472; solicitud de EE.UU. A-20020038149). Los fosfatos cálcicos descritos y una variedad de otros materiales inorgánicos biocompatibles tienen la característica de formar poros. Se dice que estos poros mejoran la incorporación del implante en el hueso natural (documento WO00/72776; patente de EE.UU. 4.051.598; documento EP0806211, H. Jennissen, 2001) ya que el hueso natural está creciendo en los poros y al mismo tiempo biodegradando la capa de fosfato cálcico inorgánico del implante (documento WO96/10370; documento WO01/97679). Además del material compuesto, los implantes se describen como constituidos por capas, en los que la capa inferior del implante, que comprende a menudo un metal como titanio, o aleaciones como una aleación de titanio (documento WO98/43550; documento WO00/72777), está recubierta con una capa de fosfatos cálcicos (documento EP0478532). Típicamente, el recubrimiento con fosfatos cálcicos se consigue mediante un tratamiento hidrotérmico (documento EP0548365) o mediante remojo y precipitación (patente de EE.UU. 6.129.928, documento WO97/41273) o pulverización en plasma (patente de EE.UU. 5.697.997, patente de EE.UU. 6.113.993, documento EP0548365, documento EP0739191, Lichtinger, 2001).

La capa de fosfato cálcico del cuerpo principal del implante puede ser parte bien de una mezcla de materiales en una capa (documento WO98/48862, patente de EE.UU. 5.934.287; solicitud de EE.UU. A-20020033548) o bien una formación en multicapa (documento WO02/09788, patente de EE.UU. 6.322.728).

Además de las modificaciones de la superficie, se describen varios procedimientos en los que se recubren proteínas o mezclas de proteínas (principalmente factores de crecimiento) sobre implantes ortopédicos o dentales. Se dice que estas proteínas aceleran significativamente la incorporación de los implantes (Lichtinger, 2001; Shah, 1999). Se describen varios procedimientos para el recubrimiento directo de las proteínas sobre las superficies metálicas. Sin embargo, estos procedimientos tienen varios inconvenientes, especialmente la rápida liberación de las proteínas desde la superficie metálica, que no permite mantener la proteína durante el intervalo de tiempo necesario para la inducción de la formación de hueso (Lichtinger, 2001).

Con objeto de evitar la rápida liberación (estallido espontáneo) de la proteína, K. Endo (1995) y Voggenreiter y col. (2001) describen la inmovilización de las proteínas mediante uniones covalentes a la superficie metálica. La actividad de las correspondientes proteínas se mantiene. Sin embargo, la unión covalente puede inducir cambios estructurales que tengan un impacto sobre la inmunogenicidad de las proteínas.

Muchos investigadores han establecido que la implantación satisfactoria de los factores osteogénicos para la formación de hueso endocondral requiere que las proteínas estén asociadas con un material vehicular o una matriz adecuados, que mantenga las proteínas en la zona de aplicación (documento USP 5.344.654). Con objeto de superar estas dificultades, el documento USP 5.258.029 enseña "la proteína osteogénica de la invención se formulará normalmente en cantidades osteogénicamente eficaces con vehículos sólidos o fluidos farmacéuticamente aceptables. Preferiblemente, las formulaciones incluyen una matriz que es capaz de proporcionar una estructura para el desarrollo del hueso y el cartílago. Las matrices potenciales pueden ser biodegradables o no biodegradables, y pueden estar química o biológicamente definidas". La suspensión de la proteína TGF-\beta y el vehículo se seca y posteriormente se aplica a la prótesis portadora de la carga. Los inconvenientes de estos procedimientos son el uso de colágenos de origen animal o de componentes inorgánicos que pueden ser erosionados durante la implantación.

Un procedimiento adicional para superar la rápida desaparición de la proteína es descrito por Lichtinger y col. (2001), quienes tratan la superficie de la aleación de titanio con ácido cromosulfúrico con objeto de conseguir superficies bioadhesivas ultrahidrófilas. Sin embargo, debería evitarse el ácido cromosulfúrico durante la fabricación de productos medicinales o dispositivos médicos, dado que las cantidades residuales de dicho ácido remanentes sobre la superficie pueden provocar la oxidación de la proteína, con los subsiguientes cambios estructurales y funcionales, y también pueden provocar daño al paciente.

En el documento WO00/72777 y en el documento WO00/72778 se describen procedimientos adicionales que usan un depósito que está formado por una configuración de poros de una gruesa capa de óxido sobre la superficie de titanio o mediante separaciones, canales o recovecos internos. Sin embargo, se sabe que las proteínas tienden a oxidarse en presencia de metales e iones metálicos (Li y col. (1997), Ann. Occup. Hyg. 41, suppl. 1, 379-383). Por lo tanto, una desventaja de los dispositivos mencionados anteriormente puede ser que las proteínas son oxidadas sobre las superficies de los implantes. La oxidación puede dar como resultado cambios estructurales que pueden dar como resultado la formación de reacciones inmunógenas.

Por lo tanto, el problema técnico subyacente en la presente invención es proporcionar un medio para un incremento óseo mejorado.

Este problema técnico es resuelto por las formas de realización caracterizadas en las reivindicaciones.

Consecuentemente, la presente invención se refiere a un procedimiento para la producción de un dispositivo que comprende las etapas de:

(a) proporcionar una disolución que comprende proteína osteoinductora disuelta;

(b) poner en contacto la disolución de la etapa (a) con un vehículo que contiene una superficie de metal o una aleación de metal;

(c) permitir que se recubra la superficie de dicho vehículo con dicha proteína disuelta; y

(d) secar el vehículo recubierto obtenido en la etapa (c),

en el que las etapas (b) a (d) se llevan a cabo a una concentración de oxígeno reducida.

El término "producir" engloba, además de las etapas mencionadas explícitamente, etapas adicionales de fabricación tales como envasado, etc.. Preferiblemente, el procedimiento de la presente invención se lleva a cabo como un procedimiento de fabricación automatizado ayudado por los robots adecuados. Los términos "producir" y "fabricar" son intercambiables en el sentido de esta invención.

El término "dispositivo" según se usa según la presente invención, se refiere a una entidad que comprende al menos dos componentes. Uno de dichos componentes es un vehículo. Los vehículos que pueden usarse con el significado de la presente invención incluyen vehículos sólidos, tales como vehículos completamente metálicos o aleaciones, y matrices metálicas o de aleaciones. Además, la presente invención engloba vehículos sólidos que comprenden espacios huecos y cavidades. Adicionalmente, dicho vehículo tiene, preferiblemente, una superficie ampliada debido a la formación de macro y microporos. Preferiblemente, dichos macro o microporos están restringidos a la capa superficial del vehículo. También están englobados por la presente invención los vehículos que consisten en al menos dos componentes diferentes, en los que se usa un componente metálico o de aleación como núcleo o capa de núcleo y, por ejemplo, se usa un material cerámico como capa de superficie. La superficie del vehículo tiene una alta afinidad por las proteínas osteoinductoras, pero no obstante permite la liberación de dichas proteínas in vivo. Según la presente invención, dicho vehículo es, preferiblemente, un metal o una aleación descritos más adelante. Al vehículo comprendido por el dispositivo de la invención puede darse una forma adecuada para la administración del dispositivo in vivo. Esto también engloba la formación de implantes o prótesis quirúrgicas completas. Estas prótesis están, preferiblemente, formadas a partir de, o recubiertas con, superficies metálicas, según se describirá más detalladamente a continuación. Las prótesis están fabricadas a partir de titanio o de aleaciones de titanio o de acero inoxidable.

Otro componente de dicho dispositivo es una proteína o un polipéptido que tiene propiedades osteoinductoras, según se explicará detalladamente a continuación. La proteína o el polipéptido están inmovilizados sobre la superficie del vehículo. Es preferible que la unión entre dicha proteína o polipéptido y el vehículo sea reversible. Por lo tanto, está contemplado que la proteína o el polipéptido que tienen propiedades osteoinductoras no estén acoplados a la superficie metálica del vehículo mediante un enlace covalente. Preferiblemente el acoplamiento se produce a través de interacciones electrostáticas, hidrófobas o interacciones no electrostáticas, tales como fuerzas de Van-der-Waals. Debido a la unión reversible de la proteína osteoinductora, se permite la disolución de dicha proteína una vez que el dispositivo ha sido llevado a un entorno adecuado in vivo, tal como una cavidad ósea. Preferiblemente, dicha disolución de las proteínas es una liberación lenta que permite la difusión de la proteína en el tejido que rodea al dispositivo. Por lo tanto, según se demuestra en los ejemplos anexos, el dispositivo permite la presencia local de proteínas osteoinductoras y naturales que aceleran la formación de nuevo hueso y acelerar el crecimiento del hueso hacia el interior en la superficie de la matriz. El dispositivo de la invención puede ser un implante, lo que significa que los términos "dispositivo" e "implante" según se usan en este documento son intercambiables. Se sabe que el término "implante" se refiere a cualquier dispositivo, según proporciona la presente invención, que está diseñado para ser insertado total o parcialmente bajo la superficie epitelial (Koeck, B. y Wagner, W. (Eds.) 1996). El implante puede ser plano, denso o de una forma compleja, es decir, puede usarse cualquier dispositivo usado u operable convencionalmente. Los implantes mencionados anteriormente varían desde una simple forma cilíndrica, según se usa, por ejemplo, para la sustitución de huesos largos o como una base de dientes artificiales, hasta implantes planos, según se usa para la sustitución de huesos planos cefálicos y articulaciones artificiales como la cadera, la rodilla o el codo.

El recubrimiento del dispositivo de la invención con la proteína osteoinductora está destinado a iniciar y estimular la transformación de las células madre mesenquimatosas en osteoblastos y condrocitos, según se describirá a continuación. Consecuentemente, se contempla que sólo requieren ser recubiertas aquellas partes del dispositivo de la invención que están dirigidas hacia el correspondiente tejido óseo. Dicha parte es preferiblemente toda la superficie, o al menos las partes de la misma, que están yuxtapuestas al tejido óseo. Por ejemplo, un implante dental que se usa para sustituir un diente comprende una parte enroscada que está atornillada al hueso maxilar y una parte prolongada (estribo) que se usa para anclar una corona de diente artificial. Consecuentemente, sólo es necesario recubrir la parte enroscada con la proteína osteoinductora. Sin embargo, la parte que no está cubierta con la proteína osteoinductora puede estar recubierta con otros agentes tales como fosfatos cálcicos, colágeno o agentes similares.

El término "osteoinductora" se refiere a la capacidad de transformación de las células madre mesenquimatosas y de los preosteoblastos en osteoblastos. Un requisito previo para la osteoinducción es una señal que es distribuida por el dispositivo en los tejidos circundantes, en los que los anteriormente mencionados precursores de osteoblastos y otras células mesenquimatosas son activados. La osteoinducción, según se usa en este documento, engloba la diferenciación de las células mesenquimatosas en las células precursoras óseas, los osteoblastos. Además, la osteoinducción también comprende la diferenciación de dichos osteoblastos en osteocitos, las células maduras del hueso. Por lo tanto, la osteoinducción requiere la diferenciación de células no diferenciadas o menos diferenciadas en osteocitos que son capaces de formar el hueso. Según se ha descrito anteriormente, las proteínas osteoinductoras usadas según la presente invención son liberadas lentamente desde el dispositivo tras su implantación y distribuidas eficazmente en los tejidos circundantes. Además, las proteínas y los polipéptidos englobados por la presente invención tienen propiedades osteoinductoras in vivo. Por ejemplo, es bien conocido en la materia que la superfamilia del factor de crecimiento transformante \beta (Transforming Growth Factor-\beta, TGF-\beta) engloba miembros que tienen propiedades osteoinductoras. Los miembros individuales de dicha superfamilia del TGF-\beta que tienen unas propiedades osteoinductoras particularmente buenas están enumerados más adelante. En conclusión, las proteínas osteoinductoras del dispositivo de la presente invención, sobre la superficie y después de haber sido liberadas del vehículo, servirán como una señal osteoinductora para los precursores de osteocitos del tejido que rodea la zona de implantación del dispositivo.

El término "proteína osteoinductora" o según se establece anteriormente, se refiere a los miembros de la superfamilia del factor de crecimiento transformante \beta (TGF-\beta) que tienen propiedades osteoinductoras, tales como el factor de crecimiento y diferenciación 5; véase más abajo. Sorprendentemente, estas proteínas osteoinductoras muestran una elevada afinidad por las superficies metálicas, según se demuestra en los ejemplos anexos. Una condición previa importante para dicho proceso de adsorción sobre la superficie metálica es una solubilidad suficiente de las proteínas en la disolución de recubrimiento.

El dispositivo o implante de la invención es, preferiblemente, cualquier tipo de superficie metálica según se describió anteriormente. Antes de poner en contacto la disolución que comprende la proteína osteoinductora disuelta con un vehículo que contiene una superficie de metal o una aleación de metal según se describe en este documento, se contempla que la correspondiente superficie metálica sea preferiblemente limpiada o tratada para eliminar cualquier contaminante de la superficie y potenciar una buena resistencia de adhesión del recubrimiento. Muchos procedimientos que son adecuados para este propósito son conocidos en la materia, y también están ejemplificados en los ejemplos anexos. Por ejemplo, la superficie metálica de los dispositivos de la invención puede enjuagarse con, por ejemplo, acetona, alcoholes alquílicos tales como etanol, y después enjuagarse exhaustivamente con agua destilada o desmineralizada estéril.

El dispositivo de la presente invención tiene, preferiblemente, una superficie ampliada debido a modificaciones porosas, microesferosas o malladas de la superficie. Dichas modificaciones pueden ser introducidas mediante procedimientos conocidos en la materia, incluyendo medios químicos o mecánicos. Además, se ha demostrado que la superficie aumentada con irregularidades a escala manométrica y micrométrica es beneficiosa para la osteointegración.

Hay muchos procedimientos descritos para la estabilización de proteínas en productos farmacéuticos. Sin embargo, los experimentos subyacentes en esta invención demuestran que las conocidas técnicas de estabilización de proteínas en formulaciones proteicas líquidas o liofilizadas no pueden ser adaptadas directamente a la proteína adsorbida sobre una superficie metálica. El recubrimiento de proteínas sobre superficies metálicas, por ejemplo, titanio o aleaciones de titanio, según los procedimientos descritos en el estado de la técnica referidos más arriba provocan la aparición de especies modificadas de la proteína que dan como resultado una agregación o una oxidación de las proteínas (para los detalles, véase el Ejemplo 5). Además, ni siquiera la adición de agentes reductores disminuye la cantidad de proteína oxidada (para los detalles, véase el Ejemplo 10). Gracias al procedimiento de la presente invención es posible fabricar dispositivos que, tras la implantación, aumentarán eficientemente el hueso. Ventajosamente, los efectos secundarios indeseables, tales como una inflamación debida a una inmunogenicidad aumentada de las proteínas oxidadas, pueden ser evitados. Además, el procedimiento de la presente invención permitirá un proceso de fabricación más rápido y rentable para los dispositivos médicos de la presente invención porque no es necesario el recubrimiento del cuerpo de metal o de aleación del implante con una capa de fosfato cálcico o colágeno. Otra ventaja en este contexto es que los materiales potencialmente contaminados, tales como colágenos que pudieran transmitir viruses infecciosos, están excluidos del proceso de fabricación.

En una forma de realización preferida del procedimiento de esta invención, las etapas (b) a (d) se llevan a cabo a una concentración de oxígeno de menos del 10 vol% de oxígeno, preferiblemente de menos del 5% y muy preferiblemente de menos del 2%.

En una forma de realización preferida adicional del procedimiento de esta invención, las etapas (b) a (d) se llevan a cabo a una temperatura menor de 25°C, preferiblemente menor de 15°C y muy preferiblemente menor de 8°C.

En una forma de realización aún más preferida de procedimiento de esta invención, dicho metal o aleación de metal es titanio o una aleación de titanio.

Es preferible que los metales/aleaciones de metales de la invención sean biocompatibles. El término "biocompatible" significa la cualidad de no tener efectos tóxicos o perjudiciales sobre los sistemas biológicos (Williams, D. F. 1999). Dichas propiedades son conocidas para el titanio o las aleaciones de titanio que comprenden, entre otros, los mencionados explícitamente más abajo.

Más preferiblemente, la aleación de titanio es una aleación de titanio que contiene al menos un 50% de titanio. Aún más preferiblemente, dicha aleación de titanio es una aleación de Ti-Al-V, una aleación de Ti-Al-Fe, una aleación de Ti-Al-Nb o una aleación de Ti-Mo-Zr-Al, muy preferiblemente Ti6Al4V.

En una forma de realización aún más preferida de procedimiento de esta invención, el recubrimiento se lleva a cabo sumergiendo la superficie metálica en dicha disolución de proteína.

En otra forma de realización aún más preferida de procedimiento de esta invención, el recubrimiento se lleva a cabo dejando gotear dicha disolución de proteína sobre la superficie metálica.

También está englobado como una forma de realización preferida un procedimiento en el que el recubrimiento se lleva a cabo pulverizando dicha disolución de proteína sobre la superficie metálica.

El término "secado" engloba medios para eliminar líquidos, tales como un exceso de disolución tamponante, que están todavía presentes tras el recubrimiento del vehículo con la proteína osteoinductora. Preferiblemente, el secado se consigue a vacío o mediante liofilización.

En otra forma de realización preferida del procedimiento de esta invención, el secado se consigue mediante evaporación a temperatura ambiente en una corriente de un gas inerte.

En una forma de realización preferida adicional del procedimiento de la invención, dicha proteína osteoinductora es un miembro de la familia del TGF-\beta.

El término "miembro de la familia del TGF-\beta" engloba las especies maduras y biológicamente activas de dichas proteínas, así como sus correspondientes proformas, es decir, las proproteínas, incluyendo los correspondientes prodominios de estos miembros de la familia del TGF-\beta, según se describe más detalladamente a continuación.

Se ha demostrado que la familia del TGF-\beta de factores de crecimiento y diferenciación está implicada en numerosos procesos biológicos que comprenden la formación de hueso. Todos los miembros de dicha familia son polipéptidos secretados que comprenden una estructura de dominio característica. En el propio N terminal, los miembros de la familia del TGF-\beta comprenden un péptido señal o líder de secreción. Esta secuencia está seguida, en el C terminal, por el prodominio y por la secuencia del polipéptido maduro. La secuencia del polipéptido maduro comprende siete cisteínas conservadas, seis de las cuales son necesarias para la formación de los puentes de disulfuro intramoleculares, mientras que una es necesaria para la dimerización de dos polipéptidos. El miembro de la familia del TGF-\beta biológicamente activo es un dímero, preferiblemente compuesto por dos polipéptidos maduros. Los miembros de la familia del TGF-\beta son habitualmente secretados como preproproteínas que comprenden, además de la secuencia madura, la presecuencia (secuencia señal) y la prosecuencia. La secuencia señal y los prodominios son escindidos extracelularmente y no son parte de la molécula de señalización. Sin embargo, se ha informado de que el (los) prodominio(s) pueden ser necesarios para la estabilización extracelular de los polipéptidos maduros. Una visión general de los miembros de la superfamilia del TGF-\beta se da en: Wozney JM, Rosen V (1998): Bone morphogenetic protein and bone morphogenetic protein gene family in bone formation and repair. Clin Orthop 346: 26-37. Las secuencias de aminoácidos de los miembros de la familia del TGF-\beta pueden obtenerse a partir de las bases de datos conocidas, tales como Swiss-Prot a través de Internet (http://www.expasy.ch/sprot/sprot-ton.html). Las secuencias de aminoácidos de las preproformas de BMP-2, BMP-7 y GDF-5, miembros de la familia del TGF-\beta con un potencial osteogénico particularmente alto, también se muestran en las ID. SEC. N^{os}: 1 a 3, respectivamente.

En el contexto de la presente invención, el término "miembro de la familia del TGF-\beta" o las proteínas de dicha familia mencionadas a continuación engloban todas las variantes biológicamente activas de dichas proteínas o miembros, y todas las variantes así como sus precursores inactivos. Por lo tanto, las proteínas que comprenden únicamente la secuencia madura, así como las proteínas comprenden la proteína madura y el prodominio de la proteína madura, el prodominio y la secuencia líder están en el ámbito de la invención, así como los fragmentos biológicamente activos de los mismos. Puede determinarse fácilmente si un fragmento de un miembro del TGF-\beta tienen la actividad biológica mediante los ensayos biológicos descritos en, por ejemplo: Katagiri T, Yamaguchi A, Ikeda T, Yoshiki S, Wozney JM, Rosen V, Wang EA, Tanka H, Omura S, Suda T, (1990): The non-osteogenic mouse pluripotent cell line, C3H10T1/2, is induced to differentiate into osteoblastic cells by recombinant human bone morphogenetic protein-2. Biochem. Biophys. Res. Commun. 172: 295-299 o en Nishitoh H, Ichijo H, Kimura M, Matsumoto T, Makishima F, Yamaguchi A, Yamashita H, Enomoto S, Miyazono K (1996): Identification of type I and type II serine/threonine kinase receptors for growth/differentiation factor-5. J. Biol. Chem. 271: 21345-21352.

Preferiblemente, la actividad biológica según la invención puede determinarse mediante modelos in vivo según se describe en los Ejemplos anexos. Adicionalmente, están englobadas por la presente invención las variantes de los miembros del TGF-\beta que tienen una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% a las secuencias de aminoácidos de los miembros de la familia del TGF-\beta mencionados en este documento, en particular aquellas mostradas en una cualquiera de las ID. SEC. N^{os} 1 a 3.

Más preferiblemente, dicho miembro de la familia del TGF-\beta es un miembro de la subfamilia de la BMP.

Se ha demostrado que los miembros de la subfamilia de la proteína morfogenética ósea (Bone Morphogenetic Protein, BMP) están implicados, entre otros, en la inducción y el remodelado del tejido óseo. Las BMP se aislaron en un principio a partir de la matriz ósea. Estas proteínas se caracterizan por su capacidad para inducir nueva formación ósea en sitios ectópicos. Varios estudios in vivo demostraron la promoción de la osteogénesis y la condrogénesis de células precursoras por las BMP, y plantearon la posibilidad de que cada molécula de BMP tenga un papel distinto durante el desarrollo esquelético. Más detalles sobre las propiedades moleculares ideológicas de las BMPs se

\hbox{describen en:}

Wozney JM, Rosen V (1998): Bone morphogenetic protein and bone morphogenetic protein gene family in bone formation and repair. Clin Orthop 346: 26-27, Schmitt J, Hwang K, Winn, SR, Hollinger J (1999): Bone morphogenetic proteins: an update on basic biology and clinical relevance. J Orthop Res 17: 269-278 y Lind M (1996): Growth factors: possible new clinical tools. A review. Acta Orthop Scand 67: 407-17. Muy preferiblemente, dicho miembro de la familia de la BMP es BMP-2 o BMP-7. La secuencia de aminoácidos de la preproforma de la BMP-2 está depositada con el número de acceso del Swiss-Prot P12643, y se muestra a continuación. Los aminoácidos 1 a 23 corresponden a la secuencia señal, los aminoácidos 24 a 282 corresponden al propéptido y los aminoácidos 283 a 396 corresponden a la proteína madura. La secuencia de aminoácidos de la preproforma de la BMP-7 está depositada con el número de acceso del Swiss-Prot P18075 o se muestra en la ID. SEC. Nº: 2. Los aminoácidos 1 a 29 corresponden a la secuencia líder, los aminoácidos 30 a 292 corresponden a la proforma y los aminoácidos 293 a 431 corresponden a la proteína madura. Preferiblemente, BMP-2 o BMP-7 se refiere a la preproforma, a la proforma o al péptido BMP-2 o BMP-7 maduro, respectivamente. Además, también están englobados los fragmentos de dichas proteínas que tienen esencialmente la misma actividad biológica, preferiblemente propiedades osteoinductoras. A continuación se proporciona más información de las secuencias de BMP-2 y BMP-7. La secuencia de aminoácidos de la proforma de BMP-2, denominada proBMP-2, puede, entre otros, recuperarse del Swiss Prot con el número de acceso Pro BMP2_HUMAN; P12643, y también se muestra en la ID. SEC. Nº: 4. En la ID. SEC. Nº: 5 se muestra la secuencia de aminoácidos de la rhproBMP-2,
incluyendo un His-tag adicional en el N terminal. rhproBMP-2 es la forma recombinante de la proBMP-2 humana.

Tanto la rhproBMP-2, mostrada en la ID. SEC. Nº: 4, como la rhproBMP-2, que incluyen un His-tag N terminal mostrado en la ID. SEC. Nº: 5, pueden usarse, entre otros, en los Ejemplos anexos. Sin embargo, los Ejemplos no se limitan a las ID. SEC. Nº: 4 ó 5, respectivamente. Se contempla que los Ejemplos de este documento, a continuación, también puedan llevarse a cabo con cualquier otra secuencia de aminoácidos descrita en este documento.

También más preferiblemente, dicho miembro de la familia del TGF-\beta es un miembro de la subfamilia del GDF.

También se ha demostrado que el factor de crecimiento y diferenciación (Growth and Differentiation Factor, GDF) está implicado, entre otros, en la inducción y el remodelado del tejido óseo. El factor de crecimiento y diferenciación 5 (GDF-5), también conocido como proteína morfogenética derivada de cartílago 1 (cartilage-derived morphogenetic protein, CDMP-1) es un miembro del subgrupo de la familia de la BMP, que también incluye otras proteínas relacionadas, preferiblemente el GDF-6 y el GDF-7. La forma madura de la proteína es un homodímero de 27 kDa. Varios estudios in vivo e in vitro demuestran el papel del GDF-5 durante la formación de las diferentes características morfológicas del esqueleto del mamífero. Las mutaciones del GDF-5 son responsables de anomalías esqueléticas, incluyendo una disminución en la longitud de los huesos largos de las extremidades, un desarrollo anormal de las articulaciones de las extremidades y el esternón (Storm & Kingsley (1999), Development Biology, 209, 11-27). La secuencia de aminoácidos está altamente conservada entre el ratón y el ser humano.

Preferiblemente, dicho miembro de la subfamilia del GDF es el GDF-5. En una forma de realización muy preferida, dicho GDF-5 es GDF-5 recombinante humano (rhGDF-5) según se describe más detalladamente a continuación.

La secuencia de aminoácidos de la preproforma del GDF-5 está depositada con el número de acceso del Swiss-Prot P43026 o se muestra en la ID. SEC. Nº: 3. Los aminoácidos 1 a 27 corresponden a la secuencia líder, los aminoácidos 28 a 381 corresponden a la proforma y los aminoácidos 382 a 501 corresponden a la proteína madura. Preferiblemente, GDF-5 se refiere a la preproforma, a la proforma o al péptido GDF-5 maduro. Además, también están englobados los fragmentos del GDF-5 que tienen esencialmente la misma actividad biológica, preferiblemente propiedades osteoinductoras. En una forma de realización más preferida, dicho fragmento comprende los aminoácidos 383 a 501 de la secuencia mostrada en la ID. SEC. Nº: 3. También se contempla que cualquier combinación de los miembros mencionados anteriormente de la familia del TGF-\beta pueda usarse en la disolución que se emplea en el procedimiento de la inven-
ción. Las siguientes tablas muestran las secuencias de aminoácidos de las preproformas de BMP-2, BMP-7 y GDF-5:

1

Referencias

[1] SECUENCIA DE UN ÁCIDO NUCLEICO.

MEDLINE=89072730; PubMed=3201241;

Wozney J. M., Rosen V., Celeste A. J., Mitsock L. M., Whitters M. J., Kriz R. W., Hewick R. M., Wang E. A.;

"Novel regulators of bone formation: molecular clones and activities.";

Science 242: 1528-1534 (1988).

[2] CRISTALOGRAFÍA POR RAYOS X (2,7 ANGSTROMS) DE 292-396.

MEDLINE=99175323; PubMed=10074410;

Scheufler C., Sebald W., Huelsmeyer M.;

"Crystal structure of human bone morphogenetic protein-2 at 2.7 A resolution.";

J. Mol. Biol. 287:103-115(1999).

4

Referencias

[1] SECUENCIA DE UN ÁCIDO NUCLEICO, Y SECUENCIA PARCIAL.

TEJIDO=Placenta;

MEDLINE=90291971; PubMed=2357959;

Oezkaynak E., Rueger D. C., Drier E. A., Corbett C., Ridge R. J., Sampath T. K., Oppermann H.; "OP-1 cDNA encodes an osteogenic protein in the TGF-beta family.";

EMBO J. 9: 2085-2093 (1990).

[2] SECUENCIA DE UN ÁCIDO NUCLEICO.

MEDLINE=91088608; PubMed=2263636;

Celeste A. J., Iannazzi J. A., Taylor R. C., Hewick R. M., Rosen V., Wang E. A., Wozney J. M.; "Identification of transforming growth factor beta family members present in bone-inductive protein purified from bovine bone.";

Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 87: 9843-9847 (1990).

[3] CRISTALOGRAFÍA POR RAYOS X (2,8 ANGSTROMS) DE 293-431.

MEDLINE=96149402; PubMed=8570652;

Griffith D. L., Keck P.C., Sampath T. K., Rueger D. C., Carlson W. D.;

"Three-dimensional structure of recombinant human osteogenic protein 1: structural paradigm for the transforming growth factor beta superfamily.";

Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 93: 878-883 (1996).

5

Referencias

[1] SECUENCIA DE UN ÁCIDO NUCLEICO.

TEJIDO=Placenta;

MEDLINE=95071375; PubMed=7980526;

Hoetten G., Neidhardt H., Jacobowsky B., Pohl J.;

"Cloning and expression of recombinant human growth/differentiation factor 5.";

Biochem. Biophys. Res. Commun. 204: 646-652 (1994).

[2] SECUENCIA DE UN ÁCIDO NUCLEICO.

TEJIDO = cartílago articular;

MEDLINE=95050604; PubMed=7961761;

Chang S., Hoang B., Thomas J. T., Vukicevic S., Luyten F. P., Ryba N. J. P., Kozak C. A., Reddi A. H., Moos M.;

"Cartilage-derived morphogenetic proteins. New members of the transforming growth factor-beta superfamily predominantly expressed in long bones during human embryonic development.";

J. Biol. Chem. 269: 28227-28234 (1994).

Podría ser que las secuencias publicadas mostradas anteriormente, cuando se recuperaron del Swiss-Prot, contuvieran (un) error(es), por ejemplo, provocado por imprecisiones durante la secuenciación. Como consecuencia, dichos errores en la secuenciación pueden dar lugar a una(s) mutación(es) silenciosa(s) o a una alteración de un(os)
codón(es) que, por lo tanto, codificaría(n) otro(s) aminoácido(s) como se publicó previamente. Sin embargo, dado que el Swiss-Prot está actualizado, en el caso de que se asuma que se hayan producido errores de secuenciación,
puede(n) recuperarse la(s) secuencia(s) más reciente(s) del Swiss-Prot con el número de referencia o con el correspondiente nombre de los polipéptidos indicados más arriba.

Por ejemplo, la ID. SEC. Nº: 3 puede comprender las siguientes sustituciones de aminoácidos en la proforma de la preproforma del GDF-5 humano: en la posición 38 el aminoácido serina (S) está sustituido por el aminoácido treonina (T), en la posición 254 de la ID. SEC. Nº: 3 el aminoácido valina (V) está sustituido por el aminoácido alanina (A), en la posición 256 de la ID. SEC. Nº: 3 el aminoácido arginina (R) está sustituido por el aminoácido glicina (G), en la posición 257 de la ID. SEC. Nº: 3 el aminoácido serina (S) está sustituido por el aminoácido glicina (G), en la posición 258 de la ID. SEC. Nº: 3 el aminoácido arginina (R) está sustituido por el aminoácido glicina (G), en la posición 276 el aminoácido alanina (A) está sustituido por el aminoácido (S) y en la posición 321 de la ID. SEC. Nº: 3 el aminoácido treonina (T) está sustituido por el aminoácido alanina (A). La secuencia de aminoácidos resultante en la que pueden producirse en las sustituciones de aminoácidos mencionadas anteriormente se muestra en la ID. SEC. Nº: 6. Debe entenderse que una(s) sustitución(es) de aminoácidos en la proforma de la secuencia de aminoácidos de la preproforma del GDF-5 mostrada en la ID. SEC. Nº: 3 no altera(n), cambia(n) ni anula(n) la(s) función(es) fisiológica(s)
del GDF-5. En el contexto de la presente solicitud se contempla que la ID. SEC. Nº: 6 también pueda usarse en relación con los medios y procedimientos de la presente invención.

En una forma de realización adicional preferida del procedimiento de la invención, dicho dispositivo está exento de sustancias tóxicas.

El término "sustancias tóxicas", engloba preferiblemente aquellos disolventes y aditivos orgánicos tóxicos que se usan en los procedimientos descritos en la materia, por ejemplo, actetonitrilo o ácido cromosúlfurico. Dichas sustancias pueden provocar una inflamación y otras reacciones tras la implantación de dispositivos que contienen dichas sustancias. Dichos dispositivos son terapéuticamente menos aceptables debido a dichos efectos secundarios indeseables, que no pueden ser evitados mediante los procedimientos de recubrimiento y algunos de los procedimientos de tratamientos de superficie según se describe en la materia. Además, la guía internacional para el desarrollo de proteínas terapéuticas requiere que en el proceso de elaboración se eviten sustancias perjudiciales y tóxicas (para los detalles véase: Conferencia Internacional sobre Armonización, CIA (International Conference on Harmonisation, ICH), Tema Q3C; www.emea.eu.int/). Sin embargo, el dispositivo de la presente invención o un dispositivo que es obtenible mediante el procedimiento de la presente invención está, ventajosamente, exento de dichas sustancias tóxicas y, por lo tanto, es terapéuticamente bien aceptado y cumple los requisitos de las autoridades
sanitarias.

\newpage

En una forma de realización preferida adicional del procedimiento de la invención, dicha disolución permite la disolución de dicha proteína durante un tiempo suficiente para un recubrimiento homogéneo de dicha superficie metálica del vehículo.

El término "disolución que permite la disolución de dicha proteína durante un tiempo suficiente para un recubrimiento homogéneo de dicha superficie metálica del vehículo" se refiere a una disolución en la que las proteínas osteoinductoras pueden ser eficazmente disueltas. Un recubrimiento homogéneo significa que la superficie del vehículo está completamente recubierta con dicha proteína osteoinductora tras el tratamiento con dicha disolución. Un recubrimiento homogéneo se caracteriza porque hay presentes cantidades esencialmente idénticas de proteína en todas y cada una de las áreas de la superficie de dicho vehículo. Un recubrimiento homogéneo es un requisito previo para la liberación eficaz y la distribución y actividad homogéneas de la proteína osteoinductora en el tejido que rodea a la zona de implantación. Además, debe entenderse que las proteínas osteoinductoras no están agregadas, y mediante el recubrimiento homogéneo deben conseguirse unas proteínas parcial o completamente inactivadas debido a la precipitación o microprecipitación, más bien que la unión de proteínas biológicamente activas no agregadas. Dicho recubrimiento homogéneo puede conseguirse mediante procedimientos de la presente invención y según se describe en los Ejemplos anexos. Además, los medios y los procedimientos para controlar el recubrimiento homogéneo, la cuantificación y la caracterización de la proteína inmovilizada se describen en los Ejemplos anexos. La disolución puede ser realizada por la persona experta en la materia basándose en la solubilidad de la proteína osteoinductora, que depende del pH, la fuerza iónica y la influencia del vehículo sobre dichos parámetros tras el contacto del vehículo con dicha disolución. Según la presente invención, se ha averiguado que una disolución adecuada para el procedimiento de la presente invención comprende únicamente componentes que no afectan al estado de oxidación de la proteína osteoinductora. Por ejemplo, sacáridos tales como sacarosa o trealosa (para los detalles véase el ejemplo 9) que se usan a menudo como excipientes en las formulaciones de proteínas (estabilizante y agente de volumen) no pueden usarse en el proceso de recubrimiento porque reducen la unión de la proteína a la superficie metálica. Otros componentes adicionales que deberían evitarse se describen en los Ejemplos anexos, a continuación.

Según el procedimiento de la presente invención, dicha resolución permite una concentración de dicha proteína osteoinductora de más de 0,5 mg/ml, preferiblemente de más de 2 mg/ml y muy preferiblemnte más de 3 mg/ml.

También es preferible un procedimiento en el que dicha disolución tenga un pH ácido.

El término "ácido débil" se refiere a compuestos orgánicos o inorgánicos que contienen al menos un átomo de hidrógeno unido ionogénicamente. Los ácidos débiles son conocidos en la materia y están escritos en libros de texto estándar, tales como Römpp, diccionario de química. Preferiblemente, dichos ácidos débiles tienen unos grados de disociación bajos y están descritos por valores de pK de entre 3 y 7, preferiblemente entre 4 y 6.

Muy preferiblemente, dicha disolución ácida contiene HCl, ácido acético, ácido cítrico y/o ácido succínico.

En otra forma de realización muy preferida del procedimiento de esta invención, la concentración del ácido es menor o igual a 100 mmol/l, preferiblemente menor de 50 mmol/l y más preferiblemente menor de 25 mmol/l y muy preferiblemente menor de 15 mmol/l.

En otra forma de realización muy preferida del procedimiento de esta invención, la disolución está saturada con un gas inerte, muy preferiblemente con nitrógeno, argón o helio. En su forma de realización más preferida, el procedimiento de esta invención se lleva a cabo en un compartimento con una atmósfera, humedad y temperaturas controladas de una tasa de intercambio atmosférico definida.

La presente invención se refiere además a un dispositivo que es obtenible mediante el procedimiento de la presente invención.

Las definiciones y explicaciones de los términos realizadas anteriormente en el contexto de los procedimientos de la presente invención se aplican mutates mutandis para los dispositivos descritos más abajo.

Dicho dispositivo está caracterizado por las características que son aportadas por los procedimientos mencionados anteriormente. En particular, el dispositivo comprende una proteína osteoinductora que está recubierta homogéneamente sobre una superficie de metal o de aleación porosa o no porosa del dispositivo, mediante lo cual el estado de oxidación de la proteína osteoinductora no está aumentado significativamente en comparación con la proteína osteoinductora que no ha sido recubierta sobre dicha superficie de metal o de aleación. Los dispositivos preferidos se describen en los Ejemplos anexos con detalle.

La invención engloba una composición farmacéutica que comprende el dispositivo de la invención o un dispositivo que es obtenible mediante el procedimiento de la invención.

Las definiciones y explicaciones de los términos realizadas anteriormente en el contexto de los procedimientos y dispositivos de la presente invención se aplican mutatis mutandis para las composiciones farmacéuticas descritas en este documento.

\newpage

La invención también engloba el uso del dispositivo de la invención o de un dispositivo que es obtenible mediante el procedimiento de la invención para la preparación de una composición farmacéutica para usarse para una osteointegración acelerada y nueva formación de hueso. Las definiciones de los términos mencionados anteriormente se aplican mutatis mutandis al anteriormente mencionado uso de la presente invención y a aquellos descritos más abajo.

El término "osteointegración y nueva formación de hueso" describe que el hueso tiene la capacidad de formar nuevo hueso alrededor del implante y de integrarse con el implante. Integración significa la fijación de células óseas a la superficie del implante, dando como resultado un anclaje firme y permanente de la reconstrucción protésica bajo una carga funcional sin dolor, inflamación o aflojamiento.

Más preferiblemente, dicha osteointegración acelerada y nueva formación de hueso va a llevarse a cabo para el tratamiento de defectos traumáticos, cancerosos o artificiales, para el tratamiento de defectos dentales o para el tratamiento de articulaciones de la cadera, el codo, la columna vertebral, la rodilla, el dedo o el tobillo. Los síntomas de las enfermedades y alteraciones mencionadas anteriormente se describen con detalle en libros de texto estándar de medicina, tales como Pschyrembel y Stedman.

También está en el ámbito de la presente invención un procedimiento para tratar una o más de las enfermedades mencionadas según los usos de la presente invención, en el que dicho procedimiento comprende al menos la etapa de administrar el dispositivo de la invención, o un dispositivo que puede obtenerse mediante el procedimiento de la invención, en una forma farmacéuticamente aceptable, a un sujeto. Preferiblemente, dicho sujeto es un ser humano.

Finalmente, la invención se refiere a un kit que comprende el dispositivo de la invención o un dispositivo que es obtenible mediante el procedimiento de la invención.

Las definiciones y explicaciones de los términos realizadas anteriormente en el contexto de los procedimientos, dispositivos, composiciones farmacéuticas y usos de la presente invención se aplican mutatis mutandis para el kit descrito en este documento.

Las partes del kit de la invención pueden envasarse individualmente en frascos u otros medios apropiados, dependiendo del correspondiente ingrediente, o combinadas en recipientes adecuados o unidades multirrecipiente. La fabricación del kit se realiza preferiblemente cumpliendo con procedimientos estándar que son conocidos por la persona experta en la materia. Preferiblemente, el dispositivo se envasa en un recipiente o frasco en una atmósfera exenta de oxígeno, tal como una atmósfera de un gas inerte, preferiblemente formada por nitrógeno.

Las figuras muestran:

Figura 1: porcentaje de rhGDF-5 oxidado tras la extracción con 10 mmol/l de HCl.

Figura 2: tinción de fluorescencia de una lámina de metal recubierta con rhGDF-5 en HCl 10 mM.

Figura 3: tinción de fluorescencia de una lámina de metal recubierta con rhGDF-5 en PBS.

Figura 4: tinción de fluorescencia de una lámina de metal recubierta con 10 mmol/l de HCl.

Figura 5: tinción de fluorescencia de una lámina de metal de blanco.

Figura 6: liberación del rhGDF-5 desde superficies de titanio pretratadas. Resumen de los resultados determinados mediante ELISA.

Figura 7: recubrimiento de superficies de titanio con una disolución de rhGDF-5 con y sin sacarosa.

Figura 8: porcentaje de rhGDF-5 oxidado tras la extracción desde láminas pretratadas a temperatura ambiente.

Figura 9: porcentaje de rhGDF-5 oxidado tras la extracción desde láminas pretratadas a 4°C.

Figura 10: aumento de la rhproBMP-2 modificada tras el recubrimiento/extracción en comparación con la disolución de recubrimiento.

La invención se describirá ahora en relación con los siguientes ejemplos biológicos, que son meramente ilustrativos y no son interpretados como una limitación del ámbito de la presente invención.

Ejemplo 1 Cuantificación del rhGDF-5 mediante RP-HPLC

La cantidad de rhGDF-5 se determina mediante un análisis por HPLC en fase inversa. La muestra se aplica a una columna Poros C8-18 (R2/10, 21 x 30 mm) que ha sido equilibrada con ácido fórmico al 0,1%, acetonitrilo al 21%. Tras el lavado de la columna, la elución tiene lugar con ácido fórmico al 0,1%, y un gradiente de acetonitrilo al 21-84% (flujo: 0,4 ml/min). La elución se observa midiendo la absorbancia a 220 nm. La cuantificación tiene lugar a través del pico y el uso de una curva estándar recién tomada.

Ejemplo 2 Extracción y cuantificación de la proteína unida

La proteína fue extraída mediante incubación del primer cuerpo recubierto en PBS durante 1 h a temperatura ambiente. Posteriormente el cuerpo recubierto se incubó en 10 mmol/l de HCl durante 3 h a temperatura ambiente. Después de ajustar la muestra de PBS a pH 2, las disoluciones de PBS y HCl que contenían el factor de crecimiento óseo extraído fueron analizadas mediante RP-HPLC según se describe en el ejemplo 1.

Ejemplo 3 Cuantificación de agregados solubles en disoluciones que contienen la proteína extraída

La cantidad de agregados solubles en las muestras que contienen la proteína extraída se determinó mediante HPLC de exclusión por tamaños. La columna (TSK 3000) se equilibró con 50 mmol/l de ácido acético, 50 mmol/l de ácido fosfórico, NaOH, pH 3,0.

La elución se observa mediante detección UV a 220 nm. La cuantificación tiene lugar a través de la proporción entre el área del pico de agregados con respecto al área total del pico.

Ejemplo 4 Determinación de las modificaciones químicas de la proteína extraída

La cantidad de modificaciones químicas, es decir, la oxidación del factor de crecimiento óseo en las disoluciones que contienen la proteína extraída, se determina mediante RP-HPLC. La muestra se aplica a una columna Vydak C8-18 (2 x 250 mm) que ha sido equilibrada con TFA al 0,15%, acetonitrilo al 20%. Tras el lavado de la columna, la elución del factor de crecimiento óseo tiene lugar con TFA al 0,1%, y un gradiente progresivo del 20%-84% de acetonitrilo (flujo: 0,3 ml/min). La elución se observa midiendo la absorbancia a 220 nm. La cuantificación tiene lugar a través de la proporción entre el área del pico de las especies modificadas con respecto al área total del pico.

Ejemplo 5 Recubrimiento y liberación de Ti6AI4V con factor de crecimiento óseo

El rhGDF-5 puede ser oxidado en una magnitud significativa tras el ciclo de recubrimiento-liberación usando láminas de titanio como superficie. Aquí describimos un procedimiento y un dispositivo de recubrimiento evitando la oxidación de la proteína durante el procedimiento de recubrimiento.

Dispositivo para recubrir titanio o una aleación de titanio con factor de crecimiento óseo

El proceso de recubrimiento se realiza en una atmósfera de un gas inerte para excluir el oxígeno. Para mantener estas condiciones se usa una cámara. La cámara consiste en un recinto cerrado herméticamente con una corriente continua de un gas inerte, por ejemplo, gas N_{2}. Dentro de la cámara se mantiene un leve exceso de presión. Los materiales necesarios para el proceso de recubrimientos son transportados a la cámara a través de una llave de gas hermética. La cámara permite un proceso de recubrimiento tanto manual como automático. Para la definición y la estandarización del proceso de recubrimiento, la humedad relativa de la cámara es monitorizada y ajustada.

Recubrimiento

Las láminas de titanio se limpiaron, se lavaron con agua desmineralizada y se secaron. Las láminas de titanio se recubrieron con 60 \mug de rhGDF-5. Cada lámina se dejó reposar extendida en un plato y se recubrió con una disolución de rhGDF-5 en un lado de la lámina metálica. El recubrimiento se realizó en una atmósfera de gas N_{2} en una cámara según se describió anteriormente y a una temperatura de 0°C a 4°C. Después del recubrimiento, la lámina se secó en las correspondientes condiciones durante 30 min a vacío.

Extracción

El rhGDF-5 se incubó en primer lugar en PBS para simular unas condiciones próximas a las fisiológicas. Para mantener las muestras prácticamente exentas de oxígeno, la disolución de PBS se saturó con gas N_{2} para las correspondientes nuestras.

Tras la incubación en PBS las láminas se incubaron en 10 mmol/l de HCl durante 3 h a la temperatura correspondiente. El rhGDF-5 en las disoluciones de extracción se cuantificó mediante RP-HPLC (véase el ejemplo 1). La cantidad de rh-GDF-5 oxidado también fue determinada mediante RP-HPLC (véase el ejemplo 4).

Para ser capaces de comparar las muestras recubiertas extraídas según se describió anteriormente, se llevó a cabo el mismo procedimiento a temperatura ambiente y en una atmósfera con oxígeno.

TABLA 1

Muestra	Atmósfera	Temperatura	% de proteína oxidada	DT
			tras la extracción (media)
Implante	aire	TA	10,0	1,6
Implante	N_{2}	4°C	5,6	0,6
A granel	aire	TA	4,7	0,0

Los parámetros comprobados en estos experimentos tienen un influencia sobre la cantidad de rhGDF-5 oxidado tras la extracción desde las láminas de titanio: las muestras recubiertas en presencia de oxígeno en aire a temperatura ambiente revelan una cantidad de rhGDF-5 oxidado del 10,0% \pm 1,6% según se muestra en la tabla 1 y en la figura 1.

Las muestras procesadas a 4°C y con gas N_{2} muestran un 5,6% \pm 0,6% de rhGDF-5 oxidado tras la extracción. En comparación con la disolución a granel de rhGDF-5, las muestras procesadas a 4°C y con gas N_{2} no revelan diferencias significativas en la cantidad de rhGDF-5 oxidado (4,7% \pm 0%).

Ejemplo 6 Determinación de la homogeneidad del recubrimiento del factor de crecimiento óseo sobre superficies de titanio mediante microscopía de fluorescencia

Investigamos la densidad del recubrimiento del factor de crecimiento óseo sobre el cuerpo de titanio usando un marcador de fluorescencia para las proteínas. La determinación se realizó mediante microscopía de fluorescencia.

Recubrimiento

Se dejó reposar extendida una lámina en un plato y se recubrió con 10 \mul de una disolución de rhGDF-5 de 6,18 mg/ml, 10 mmol/l de HCl, en un lado de la lámina metálica. Se recubrió una segunda lámina con 10 \mul de HCl de 10 mmol/l. Las láminas se secaron durante 30 min a vacío. Una tercera lámina no se recubrió y se usó como blanco. Adicionalmente se recubrió una lámina con una disolución de 6,0 mg/ml de rhGDF-5 en PBS.

Tinción fluorescente de la proteína

Se añadieron 2,3 \mul de una disolución de 10 mmol/l de Alexa Fluor^{TM} 488 a 1 ml de una disolución de NaHCO_{3} 0,15 M. Las 3 láminas metálicas se incubaron en 1 ml de la mezcla de pigmentos fluorescentes en la oscuridad durante 4 h a temperatura ambiente. La proporción proteína:fluoróforo es de 1:10. La lámina usada como blanco se incubó sólo durante 20 min. Después del período de incubación las láminas se lavaron extensamente con agua desmineralizada y se secaron durante 15 min a vacío en la oscuridad.

La señal de fluorescencia fue detectada mediante microscopía de fluorescencia indocumentada mediante un programa informático de imágenes.

En la figura 2 puede determinarse claramente el área recubierta con rhGDF-5 mediante microscopía de fluorescencia. Significativo el marcador de fluorescencia unido a la proteína. Por el contrario, la figura 3 muestra la importancia del disolvente del rhGDF-5, ya que una disolución de recubrimiento que contiene PBS da lugar a una distribución no homogénea de la proteína y a puntos de proteína.

Para excluir artefactos, en la figura 4 se muestra la lámina recubierta con 10 mmol/l de HCl. HCl de 10 mmol/l es el disolvente del rhGDF-5 en la disolución.

Para excluir cualquier efecto del disolvente, también preparamos una lámina de blanco que no se recubrió con rhGDF-5 ni HCl de 10 mmol/l, pero que también se incubó con el marcador de fluorescencia Alexa Fluor^{TM} 488 (figura 5).

Las imágenes muestran claramente que sólo el rhGDF-5 está coloreado con el marcador de fluorescencia. Adicionalmente, la distribución de la proteína sobre la superficie es regular cuando el disolvente usado es HCl de 10 mmol/l.

Ejemplo 7 Liberación in vitro a largo plazo del factor de crecimiento óseo desde superficies de titanio pretratadas

Desarrollamos un procedimiento para recubrir factor de crecimiento óseo sobre superficies de titanio. Tras una extracción estandarizada fuimos capaces de analizar la proteína para comprobar los agregados, (Ejemplo 3), la cantidad de factor de crecimiento óseo oxidado (Ejemplo 4) y ser capaces de cuantificar la proteína extraída (Ejemplo 1). En el experimento aquí descrito determinamos la cinética de liberación del factor de crecimiento óseo mediante la incubación de láminas de titanio recubiertas en medio de cultivo celular durante 30 días. Para simular las condiciones fisiológicas y la actividad metabólica, cambiamos el medio cada 48h y cuantificamos la cantidad de proteína liberada mediante ELISA.

Recubrimiento

La muestra fue recubierta según se describe en el ejemplo 5.

Liberación a 30 días

La lámina se incubó en 6 ml de medio de liberación: \alphaMEM al 89%, penicilina al 1%, estreptomicina, FCS al 10% durante 30 días a 4°C. Las muestras se rotaron permanentemente en una mezcladora. Después de cada 48 h de incubación se tomó el sobrenadante y se almacenó congelado a -70°C. Se añadió un volumen de 6 ml de medio nuevo a las muestras liberadas.

La proteína liberada en las muestras se cuantificó mediante un ELISA del factor de crecimiento óseo. Los pocillos de las placas de 96 pocillos se recubren con un anticuerpo monoclonal contra el rhGDF-5. Después de lavar la placa con PBS que contenía Tween 20 al 0,05% y bloquear con disolución SuperBloc (Pierce, nº de cat. 37515), se añaden las muestras que contienen el rhGDF-5 y la placa se incuba durante 60 min a temperatura ambiente. Después de lavar las muestras (véase anteriormente) se añade un segundo anticuerpo biotinilado contra rhGDF-5, y las muestras se incuban durante 60 min a temperatura ambiente. Después de la etapa de lavado se añade un complejo de estrepavidina peroxidasa y las muestras se incuban durante 60 min a temperatura ambiente. Posteriormente los pocillos se lavaron con PBS, que contenía Tween 20 al 0,05% y la cantidad de peroxidasa unida se cuantificó usando un sustrato BM Blue-POD (Roche Diagnostics, nº de Cat.: 1 484 28). La longitud de onda de detección es de 450 nm, la longitud de onda de referencia es de 630 nm. La cantidad de rhGDF-5 se calcula usando una curva estándar de rhGDF-5.

Los resultados de liberación del factor de crecimiento óseo determinados mediante ELISA se resumen en la tabla 2 y en la figura 6. La cantidad de proteína liberada después de 30 días determinada mediante ELISA es de 100,4 \pm 0,8.

TABLA 2

Día	ELISA: % de proteína extraída
2	37,1
5	68,7
7	87,0
9	94,0
12	98,0
14	99,1
16	99,7
19	100,4

Ejemplo 8 Recubrimiento y extracción de titanio o de una aleación de titanio con rhBMP-2

Aquí investigamos el comportamiento de la rhBMP-2 durante el proceso de recubrimiento-extracción: la rhBMP-2 es, como el rhGDF-5, un miembro adicional de la familia de proteínas del TGF-\beta.

Recubrimiento

Las láminas se dejaron reposar extendidas en un plato y se recubrieron, bien con 10 \mul de una disolución de factor de crecimiento óseo de 6,0 mg/ml o bien con una disolución de rhBMP-2, por un lado de la lámina. Todas las láminas se secaron durante 30 min a vacío.

Extracción

Todas las láminas se extrajeron con PBS durante 1 h a temperatura ambiente. Entonces las láminas recubiertas con factor de crecimiento óseo y rhBMP-2 se incubaron en 10 mmol/l de HCl durante 3h. Los resultados de los experimentos descritos anteriormente se resumen en la tabla 3.

TABLA 3

Nº de muestra	Proteína	% de proteína	% de proteína	Recuperación
		extraída en PBS	extraída en 10 mmol/l de HCl	total de proteína, en %
1	rhGDF-5	8,8	83,2	92,0
2	rhBMP-2	0	111,3	111,3
3	rhBMP-2	0	105,1	105,1

No hubo rhBMP-2 extraída durante la incubación en PBS al 8,8% del rhGDF-5 extraído en PBS.

Los resultados indican que las proteínas procedentes de la familia de proteínas del TBG-\beta se unen a las superficies metálicas y pueden ser (casi) completamente extraídas en HCl de 10 mmol/l tras su incubación en PBS.

Ejemplo 9 Recubrimiento de titanio o de una aleación de titanio con factor de crecimiento óseo en presencia de sacarosa

Aquí describimos el recubrimiento de superficies de titanio con una disolución de rhGDF-5 con sacarosa al 10%. Como comparación, recubrimos superficies de titanio con factor de crecimiento óseo en HCl de 10 mmol/l.

Las láminas de titanio se lavaron con agua desmineralizada, se secaron y se recubrieron con 40 \mug de factor de crecimiento óseo en HCl de 10 mmol/l o con 40 \mug de factor de crecimiento óseo en sacarosa al 10%, 10 mmol/l de HAc y 5 mmol/l de HCl, respectivamente.

Posteriormente el material de titanio se lavó con PBS durante 1 h a temperatura ambiente. Entonces la proteína se extrajo mediante incubación en 100 mmol/l de HCl durante 3 h a temperatura ambiente. El contenido proteico de todas las resoluciones se determinó mediante una cuantificación por RP-HPLC. Antes de la cuantificación la disolución de PBS se ajustó a pH 2 para aumentar la solubilidad del factor de crecimiento óseo.

En los experimentos descritos en este documento se prepararon dos piezas de metal recubiertas diferentes:

Láminas de titanio recubiertas con disoluciones de factor de crecimiento óseo con o sin sacarosa al 10%. Los resultados del procedimiento de recubrimiento y extracción se resumen en la Tabla 4:

TABLA 4

Nº de muestra:	Sin sacarosa	Con sacarosa
		al 10%
Masa de proteína sobre el cuerpo de titanio después del recubrimiento (\mug)	4,5	4,5
Factor de crecimiento óseo extraído en PBS (%)	0	0
Factor de crecimiento óseo extraído en (%) 100 mmol/l de Hcl	70,3	32,5
Recuperación total de proteína (%)	70,3	32,5

\newpage

Hay una diferencia significativa en el recubrimiento de las láminas de titanio con disoluciones de factor de crecimiento óseo con o sin sacarosa al 10%. A partir de la muestra que contiene sacarosa se recuperó el 32,5% de la proteína, a partir de la muestra sin sacarosa se recuperó en 70,3% de factor de crecimiento óseo (véase la figura 7).

En los experimentos descritos anteriormente queríamos evaluar la presencia de la sacarosa en las disoluciones de recubrimiento sobre la unión del factor de crecimiento óseo sobre superficies metálicas. Los resultados demuestran que la recuperación total es significativamente menor que la recuperación de factor de crecimiento óseo tras el recubrimiento sin sacarosa.

Ejemplo 10 Recubrimiento y liberación de factor de crecimiento óseo Ti6Al4V - influencia de los agentes reductores A) Influencia de los agentes reductores en la disolución de recubrimiento

Para evitar la oxidación proteica de la proteína durante el ciclo de recubrimiento y extracción, incluimos agentes reductores en la disolución de recubrimiento: añadimos 10 mmol/l de los siguientes compuestos a la disolución de recubrimiento de factor de crecimiento óseo o una combinación de los mismos:

10 \mul de Muestra 1 (blanco): 5,04 mg/ml de factor de crecimiento óseo en 10 mmol/l de HCl

12 \mul de Muestra 2: 10 mmol/l de EDTA + 3,94 mg/ml de factor de crecimiento óseo

10 \mul de Muestra 3: 10 mmol/l de Met + 4,54 mg/ml de factor de crecimiento óseo

10 \mul de Muestra 4: 10 mmol/l de Na_{2}SO_{3} + 4,54 mg/ml de factor de crecimiento óseo

11 \mul de Muestra 5: 10 mmol/l de Met + 10 mmol/l de EDTA + 3,84 mg/ml de factor de crecimiento óseo

11 \mul de Muestra 6: 10 mmol/l de EDTA + 10 mmol/l de Na_{2}SO_{3} + 3,84 mg/ml de factor de crecimiento óseo; y se realizó el recubrimiento según se describe en el ejemplo 5.

Extracción

En primer lugar se extrajo el factor de crecimiento óseo con PBS durante 1 h a temperatura ambiente (la incubación en PBS representa una simulación de la situación fisiológica en el cuerpo). Posteriormente las láminas se extrajeron con 10 mmol/l de HCl durante 3 h. El factor de crecimiento óseo en las disoluciones de extracción de cada muestra se cuantificó mediante RP-HPLC según se describe en el ejemplo 1. La cantidad de proteína oxidada se determinó según se describe en el ejemplo 4. Los resultados de los experimentos descritos anteriormente se resumen en la
tabla 5:

TABLA 5

Nº de muestra	1	2	3	4	5	6	7
Agente reductor	Ninguno	EDTA	Met	Na_{2}SO_{3}	EDTA/	EDTA/	A granel
	(blanco)				Met	Na_{2}SO_{3}
Factor de crecimiento óseo extraído	13	78	41	- -	53	50	- -
en PBS (%)
Extracción de factor de crecimiento	69	- -	32	76	- -	- -	- -
óseo en 10 mmol/l de HCl (%)
Recuperación total de proteína	82	78	73	76	53	50	- -
Cantidad de especies oxidadas tras	- -	13	8	- -	9	14
la extracción con PBS (%)
Cantidad de especies oxidadas tras	10	*)	12	23	*)	*)	5 en Hcl
la extracción con HCl							(sin extracción)
*) No se detectó proteína tras la extracción con HCl mediante cuantificación por HPLC.

\newpage

La recuperación de todas las muestras está entre el 50% y el 82%. La proteína es extraída en PBS en todas las muestras excepto en la que contiene Na_{2}SO_{3}. La cantidad de especies oxidadas se determinó en las muestras extraídas en PBS, así como las muestras extraídas en HCl. La cantidad de especies oxidadas está entre el 8% y el 23%.

En conclusión, el procedimiento que usa agentes reductores en la disolución de recubrimiento no es el procedimiento de elección para evitar la oxidación del factor de crecimiento óseo. Bien la recuperación total es baja o la proteína ya ha sido extraída en PBS en gran proporción o bien la cantidad de factor de crecimiento óseo oxidado es significativamente alta. Por lo tanto, son necesarios otros procedimientos para evitar la oxidación de factor de crecimiento óseo durante el ciclo de recubrimiento y extracción.

B) Remojo de la superficie con agentes reductores antes de comenzar el proceso de recubrimiento

Describimos la influencia de los agentes reductores en la disolución de recubrimiento. Aquí comparamos el efecto de diferentes agentes reductores tras incubar láminas metálicas pretratadas durante 24 h en una disolución que contiene el correspondiente agente reductor. Posteriormente se realizó el procedimiento de recubrimiento y extracción a dos temperaturas diferentes.

Todas las muestras se incubaron en una disolución de 10 mmol/l de los siguientes agentes reductores: tiocarbamida, ácido ascórbico, sulfito sódico, cisteína, metionina, mercaptoetanol.

Después de una incubación durante 24 h las láminas se lavaron con agua desmineralizada y se secaron durante 15 min a vacío a temperatura ambiente.

Todas las láminas se dejaron reposar extendidas en un plato y se recubrieron con 10 \mul de una disolución de rhGDF-5 de 6,95 mg/ml por un lado de la lámina metálica. La mitad de las láminas se secaron a vacío a 4°C, la otra mitad de las láminas se secó a vacío a temperatura ambiente.

El procedimiento de recubrimiento y extracción se realizó a 4°C y a temperatura ambiente. En primer lugar se extrajo el rhGDF-5 con PBS durante 1 h a temperatura ambiente. Entonces las láminas se incubaron en 10 mmol/l de HCl durante 3 h. El rhGDF-5 en las disoluciones de extracción de cada muestra se cuantificó mediante RP-HPLC (Ejemplo 1). Posteriormente se determinó la cantidad de especies oxidadas mediante RP-HPLC (Ejemplo 4).

En la tabla 6 están enumeradas las muestras según su modo de pretratamiento.

TABLA 6

Nº de muestra	Pretratamiento II	Temperatura de R/E	% de rhGDF-5 oxidado
1	tiocarbamida	4°C	12,2
2	ácido ascórbico	4°C	12,6
3	sulfito sódico	4°C	9
4	cisteína	4°C	9,7
5	metionina	4°C	11,1
6	mercaptoetanol	4°C	11,3
7	tiocarbamida	TA	15,0
8	ácido ascórbico	TA	15,1
9	sulfito sódico	TA	17,3
10	cisteína	TA	17,8
11	metionina	TA	16,1
12	mercaptoetanol	TA	14,7
A granel	ninguno	TA	5,0

\newpage

La cantidad de rhGDF-5 oxidado en todas las muestras está entre el 9,0% y el 12,6%, mientras que la disolución de proteína usada como material de partida tenía un contenido en especies oxidadas del 5%. En las muestras incubadas a 4°C la cantidad de proteína oxidada es menor que en las correspondientes muestras tratadas a temperatura ambiente. A partir de los resultados se concluye que ninguno de los excipientes usados es capaz de evitar significativamente la oxidación.

La cantidad de proteína oxidada se muestra en las figuras 8 y 9.

El principal aspecto del experimento aquí descrito es la incubación de las láminas pretratadas con diferentes agentes reductores. Concluimos que la incubación de las láminas metálicas durante 24 h en disoluciones de agentes reductores no es el procedimiento de elección para evitar la oxidación de la proteína.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 11 Cuantificación de rhproBMP-2 y de rhBMP-2 mediante RP-HPLC

La cantidad de rhproBMP-2/rhBMP-2 se determinó mediante un análisis por HPLC en fase inversa. La muestra se aplica a una columna Poros C4 (20 x 2 mm) que ha sido equilibrada con TFA al 0,045%. Después de lavar la columna, la elución tiene lugar con TFA al 0,025%, acetonitrilo al 84% y un gradiente de acetonitrilo al 21-84% (flujo: 0,4 ml/min). La elución se observa midiendo la absorción a 220 nm. La cuantificación tiene lugar a través del pico y el uso de una curva estándar.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 12 Determinación de las modificaciones químicas de la rhproBMP-2 extraída

Se determinó la cantidad de formas modificadas del factor de crecimiento óseo en las disoluciones que contenían la proteína extraída mediante RP-HPLC. La muestra se aplica a una columna YMC C4 (4,6 x 250 mm) que ha sido equilibrada con TFA al 0,1%. Después de lavar la columna, la elución tiene lugar con una mezcla de acetonitrilo al 100%, TFA al 0,1% y un gradiente progresivo de acetonitrilo al 25%-100% (flujo: 0,8 ml/min). La elución se observa midiendo la absorbancia a 220 nm. La cantidad relativa de especies modificadas se calcula a partir de la proporción entre el área del correspondiente pico y el área total de pico.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 13 Determinación de la cantidad de rhproBMP-2 modificada después de la extracción

En este ejemplo se investigó el comportamiento de la rhproBMP-2 durante el proceso de recubrimiento-extracción en unas condiciones optimizadas: la rhproBMP-2 es la forma recombinante de la pro-BMP-2. La secuencia de aminoácidos de dicha rhproBMP-2 se muestra en la ID. SEC. Nº: 4. Tras la extracción se determinó la cantidad de especies modificadas.

Recubrimiento

Se recubrieron láminas de titanio con rhproBMP-2 según se describe en el Ejemplo 5, más arriba. Un conjunto de láminas se recubrió en unas condiciones estándar (al aire, temperatura ambiente) (conjunto 1); otro conjunto de láminas se recubrió en una atmósfera de N_{2} (conjunto 2).

Cada lámina se dejó reposar extendida en un plato y se recubrió con 10 \mul de una disolución de 1,9 mg/ml rhproBMP-2 por un lado de la lámina metálica, respectivamente.

Extracción

La extracción se realizó según se describe en el Ejemplo 5, más arriba. La cantidad de rhproBMP-2 modificada también se determinó mediante RP-HPLC; véase el Ejemplo 12, más arriba.

La caracterización de la proteína extraída se realizó mediante la cuantificación de las especies modificadas. Consecuentemente, los cambios en la cantidad de rhproBMP-2 modificada se compararon con la disolución a granel de rhproBMP-2. Estos datos se muestran en la tabla 7, que muestra la cantidad de rhproBMP-2 modificada químicamente después de la extracción:

TABLA 7

Nº de muestra	Atmósfera	% de proteína modificada comparada	PM	1 x DT
		con la disolución de recubrimiento
1	aire	6,3
2	aire	4,1	4,9	1,2
3	aire	4,2
4	N_{2}	1,9	1,5	0,6
5	N_{2}	1,8
6	N_{2}	0,9
rhBMP-2 estándar	aire	0	-	-

\vskip1.000000\baselineskip

Los parámetros probados en estos experimentos tienen una influencia sobre la cantidad de rhproBMP-2 modificada tras la extracción a partir de láminas de titanio: las muestras recubiertas en una atmósfera con aire revelan una cantidad de rhproBMP-2 modificada del 4,9% \pm 1,2% en comparación con la disolución de recubrimiento mostrada en la tabla 2, más arriba.

Las muestras procesadas a temperatura ambiente y en gas N2 muestran un aumento del 1,5% \pm 0,6% de rhproBMP-2 modificada tras la extracción.

Las muestras tratadas en aire revelan un aumento del +4,9% (véase la figura 10, más abajo) en comparación con la disolución a granel de proteína. La Figura 10 muestra el aumento de rhproBMP-2 modificada tras el recubrimiento/extracción en comparación con la disolución de recubrimiento. En la Figura 10, más abajo, las barras de error de las correspondientes muestras no se superponen. Por lo tanto, se concluyó que la atmósfera del gas circundante tiene una influencia significativa sobre la cantidad de modificaciones en la rhproBMP-2 tras la extracción a partir de las láminas de titanio.

\vskip1.000000\baselineskip

Referencias

\sqbullet: Albrektsson, T., en: Handbook of Biomaterials (Black, J y Hastings, G (eds.), Chapman & Hall, Londres, 1998, págs. 500-512).

\sqbullet: Endo, K. Dental Materials Journal 14 (2): 185-198, 1995

\sqbullet: Jennissen, H. y col., Biomaterialien (2001), 2, 45-53

\sqbullet: Kim, H. y col., J Biomed Mater Res, 45, 100-107, 1999

\sqbullet: Koeck, B. y Wagner, W. Implantologie, Urban & Schwarzenberg 1. Auflage, 1996.

\sqbullet: Lichtinger, T. K. y col., Mat.-wiss. u. Werkstofftech, 32 (2001) 937-941

\sqbullet: Shah, A. y col., Biology of the cell 91, 131-142 (1999)

\sqbullet: Stmad, Z. y col., Int J Oral Maxillofac Implants 2000; 15: 483-490

\sqbullet: Tsui, Y. y col., Biomaterials, 19 (1998) 2031-2043

\sqbullet: Voggenreiter G, Hartl H, Assenmacher S, Chatzinikolaidou M, Rumpf HM, Jennissen HP. (2001), Assessment of the Biological Activity of Chemically Immobilized rhBMP-2 on Titanium surfaces in vivo

\sqbullet: Materialwiss. Werkstofftech. 32, 942-948

\sqbullet: Wen, H. y col., Journal of Material Science: Materials in Medicine 9 (1998) 121-128

\sqbullet: Williams, D. F. Proceedings of a Consensus Conference of the European Society for Biomaterials (ESB) Elsevier, Ámsterdam, pág. 60.

\sqbullet: Williams, D. F. The Williams Dictionary of Biomaterials (Liverpool, Reino Unido: Liverpool University Press (1999) 40.

<110> SCIL Biomedicals GmbH

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Implante metálico recubierto con proteínas osteoinductoras

\vskip0.400000\baselineskip

<130> G 2534 PCT

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn versión 3.1

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 396

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

6

7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 431

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

8

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 501

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

10

11

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 373

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

13

14

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 398

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

16

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 501

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

18

19

20

Claims

1. Un procedimiento para la producción de un dispositivo que comprende las etapas de:

(a): proporcionar una disolución que comprende proteína osteoinductora disuelta;

(b): poner en contacto la disolución de la etapa (a) con un vehículo que contiene una superficie de metal o una aleación de metal;

(c): permitir que se recubra la superficie de dicho vehículo con dicha proteína disuelta; y

(d): secar el vehículo recubierto obtenido en la etapa (c),

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las etapas (b) a (d) se llevan a cabo a una concentración de oxígeno de menos del 10 vol% de oxígeno.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en el que las etapas (b) a (d) se llevan a cabo a una temperatura menor de 25°C.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho metal o aleación de metal es titanio o una aleación de titanio.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que la aleación de titanio es una aleación de titanio que contiene al menos un 50% de titanio.

6. El procedimiento de la reivindicación 4 ó 5, en el que la aleación de titanio es una aleación Ti-Al-V, una aleación Ti-Al-Fe, una aleación Ti-Al-Nb o una aleación Ti-Mo-Zr-Al.

7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que la aleación Ti-Al-V es Ti6Al4V.

8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el recubrimiento se lleva a cabo sumergiendo la superficie metálica en dicha disolución de proteína.

9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el recubrimiento se lleva a cabo dejando gotear dicha disolución de proteína sobre la superficie metálica.

10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el recubrimiento se lleva a cabo pulverizando dicha disolución de proteína sobre la superficie metálica.

11. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el secado se consigue mediante secado a vacío.

12. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el secado se consigue mediante liofilización.

13. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el secado se consigue mediante evaporación a temperatura ambiente en una corriente de un gas inerte.

14. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que dicha proteína osteoinductora es un miembro de la familia del TGF-\beta.

15. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que dicho miembro de la familia del TGF-\beta es un miembro de la subfamilia de la BMP.

16. El procedimiento de la reivindicación 15, en el que dicho miembro de la familia de la BMP es BMP-2 o
BMP-7.

17. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que dicho miembro de la familia del TGF-\beta es un miembro de la subfamilia del GDF.

18. El procedimiento de la reivindicación 17, en el que dicho miembro de la subfamilia del GDF es GDF-5.

19. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en el que dicho dispositivo está exento de sustancias tóxicas.

20. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en el que dicha disolución permite la disolución de dicha proteína durante un tiempo suficiente para un recubrimiento homogéneo de dicha superficie metálica del vehículo.

21. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en el que dicha disolución permite una concentración de dicha proteína osteoinductora de más de 0,5 mg/ml.

22. El procedimiento de la reivindicación 21, en el que dicha disolución tiene un pH ácido.

23. El procedimiento de la reivindicación 22, en el que dicha disolución ácida contiene HCl, ácido acético, ácido cítrico o ácido succínico.

24. El procedimiento de las reivindicaciones 22 ó 23, en el que la concentración del ácido es menor o igual a 100 mmol/l.

25. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, en el que la disolución está saturada con un gas inerte.

26. El procedimiento de la reivindicación 25, en el que el gas inerte es nitrógeno, argón o helio.

27. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, que se lleva a cabo en un compartimento con una atmósfera y una humedad controladas.

28. Un dispositivo que es obtenible mediante el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27.

29. Una composición farmacéutica que comprende el dispositivo que es obtenible mediante el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27.

30. Uso del dispositivo que es obtenible mediante el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27 para la preparación de una composición farmacéutica para ser usada para una osteointegración acelerada y formación de hueso nuevo.

31. El uso de la reivindicación 30, en el que la osteointegración acelerada y la formación de hueso nuevo se van a usar para el tratamiento de defectos traumáticos, cancerosos o artificiales.

32. El uso de la reivindicación 30, en el que la osteointegración acelerada y la formación de hueso nuevo se van a usar para el tratamiento de defectos dentales.

33. El uso de la reivindicación 30, en el que la osteointegración acelerada y la formación de hueso nuevo se van a usar para el tratamiento de articulaciones de cadera, codo, columna vertebral, rodilla, dedo o tobillo.

34. Un kit que comprende el dispositivo que es obtenible mediante el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27.