CN1052632C - 对胶原组织人工瓣膜材料缓钙化的方法 - Google Patents
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Abstract
对胶原组织人工瓣膜材料缓钙化的方法是用复合环氧交联剂处理天然胶原组织如牛心包，猪主动脉瓣，大动物主动脉血管等，使这类胶原组织的强度，应力松弛、生物相容性、缓钙化和耐酶解等性能均优于戊二醛处理的胶原组织产品，其中用复合环氧胶原组织牛心包和猪主动脉瓣材料缝制的生物瓣膜植入人体后，该生物瓣有明显的缓钙化的功能，使用寿命从7-8年延长至15年以上，病人换瓣后，能恢复健康和延年益寿。
Description
本发明属于对胶原组织人工瓣膜缓钙化的方法，将天然胶原组织经生化方法处理后，可对人体病变心脏瓣膜进行手术置换，使病患者免除痛苦。
人工心瓣有生物瓣、机械瓣和塑料瓣三种。生物瓣具有类似于天然心瓣的中心血液流道。符合病员的生理要求，不需要长期服用抗凝药物，有利于抗凝剂禁忌症患者；心瓣功能的失效过程是逐渐发生的，这就有利于治疗或重新换瓣；不会产生引起病员不适之感的噪声；原料来源丰富，易于制作，成本低等优点。因此，人工心瓣膜的研究和发展很快。
60年代中期对病变心脏瓣的置换，最早是从血管的置换发展起来的。Ross.D.J.，J.Thorac Cardiovasc.Surg 47，713(1964)选用的生物瓣材料有同种心脏瓣膜或经甲醛处理的异种主动脉瓣，经过数年的研究和临床实践，因不能改善生物瓣的功能和对胶原的保护作用而被淘汰。
70年代初期至今由第二代胶原交联剂戊二醛占统治地位。早在1968年A.Carpentier第一次用戊二醛取代甲醛处理猪主动脉瓣，戊二醛在胶原分子键间能形成较稳定的交联键，因而经戊二醛处理的生物瓣的生物学和力学功能远优于甲醛，使用也很方便。但在20多年的长期临床考查中，逐渐发现戊二醛有着如下缺点：(1)戊二醛与胶原的ε-NH2作用生成吡啶鎓键或戊二醛仅有一个醛与胶原作用，剩余的自由醛基和吡啶鎓键能引起内源性的胶原组织钙化；(2)在固定生物瓣材料时，积存在组织中的戊二醇聚合物随着生物瓣植入人体而在体内逐渐解聚，释放出来的戊二醛单体所显示的霉性，使进入瓣叶材料的血细胞和体液细胞失活，因而引起外源性的胶原组织钙化。无论内源性或外源性钙化，都严重地影响着生物瓣的使用寿命，(3)戊二醛在力的作用下不能改善生物瓣的原发性失功；(4)抑制参与胶原钙化的碱性磷酸酶(AP)活性的能力不及Al+++离子强；(5)戊二醛处理的生物瓣材料的亲水性，生物相容性和弹性等还有待提高，加之在贮期中色泽变黄等，充分证明戊二醛不是优良的胶原交联剂。
影响生物瓣发展的致命弱点是生物材料瓣叶的钙化和撕裂而导致瓣膜使用寿命缩短。引起钙化和撕裂的原因是多方面的，其中涉及到各种生化处理对材料组织结构，力学行为等各方面因素。提高生物材料的强度取决于固定天然生物材料的交联剂种类和交联度。由于胶原的交联反应应控制在极为温和的条件进行，能用于高聚物领域的交联剂多数都不能使用，只有蛋白交联剂才有选用的可能性。我国学者乐以伦、万昌秀等于1983年起对四川阿坝的牦牛心包的组织学、生物化学、免疫学、生物力学、物理化学和胶原的化学改性等方面开展了全面的基础研究。与此同时，还对心包的固定工艺、缝瓣技术与保存方法等进行了系列的研究，并与华西医科大学合作将牦牛心包生物瓣成功地用于临床。《YPV-1牦牛心包瓣膜鉴定资料》之一至十二(1986年)，充分肯定了牦牛心包材料是一种很有前途的生物瓣材料，很有发展前景。
为了进一步提高心包材料的耐疲劳性能和防止钙化作用的发生，本发明者还对亲水性双环氧化合物作为牦牛心包材料交联剂的可行性研究。在室温和中性条件下，该双环氧化合物形成的低聚合度自聚物能在胶原分子键间与ε-NH2反应，形成胶原微纤维同桥键，从而提高胶原纤维的力学性能。亲水性环氧交联剂还能与胶原分子链上其它活性基团如
，胍基和甲硫基等反应。因而在胶原微纤维之间形成桥键的机会多于戊二醛。低聚合度环氧交联剂自聚物降解后的产物，是无毒或毒性很小的醇类产物。对材料的应力应变，弹性模量和应力松弛行为等力学性能的分析，证明环氧复合交联处理的牦牛心包材料较传统的戊二醛固定心包材料有更好的力学行为，更佳的亲水性与生物相容性，和明显优于戊二醛材料的缓钙化效果。
本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种对胶原组织人工瓣膜材料缓钙化的方法，其特点是在常温条件下，采用亲水性双环氧复合交联剂对生物组织材料，如牦牛心包等进行生化处理，获得的人工生物瓣或缝制成其它器官，植入人体后有明显的缓钙化效果，使用寿命从7-8年延到15年以上，强度、应力松弛，生物相容性，缓钙化和耐酶解等性能，优于戊二醛法处理的胶原组织材料，有利于病患者恢复健康。
本发明提供对胶原组织人工瓣膜材料缓钙化的方法是将天然胶原组织(可用牛心包、猪主动脉瓣、硬脑膜、阔筋膜、大动物动脉血管、蹄筋和羊腹膜等)进行生化处理后用于临床或者缝制成器官植入人体内。
1、粗选：在环境洁净和接触胶原组织的器材、药液均按外科要求灭菌消毒的条件下，在半小时内立即将采集的新鲜胶原组织于室温下去掉其表面的脂肪和网状结缔组织。
2、漂洗：将粗选的新鲜胶原组织用灭菌生理盐水(0.9％NaCl)溶液洗涤多次，直至无血水渗出为止。每次固液比为1∶10～50，即重量与体积之比。
3、浸泡萃取可溶性蛋白质：萃取用不含钙盐的HanKs液，固液比同前(2)，洗至用茚三酮试剂检验无可溶性蛋白质浸出为止。
4、精选：选取胶原组织的均匀部分，裁成一定尺寸的矩形片。
5、抗菌素灭菌：每500毫升生理盐水中加入4～8万单位庆大霉素，固液比同前(2)。
6、交联剂固定：交联剂用1-15％的多官能度的环氧化合物n＝1～10，与0.1N的碳酸盐缓冲液的pH9-12)和5-50％(体积/体积)水溶性有机溶剂(可用乙醇、丙酮、二氧杂环己烷)作为助溶剂，防止胶原肿胀，加速反应进程，pH9-10，对胶原组织进行交联固定，室温下反应96小时以上。
7、储放入保存液中备用：用2％甲醛磷酸缓冲液和0.5-3％水溶性表面活性剂(可用聚乙二醇、聚丙二醇和十二烷基硫酸钠)中灭菌保存。按上述方法制得的胶原组织材料除用于缝制生物心瓣膜外亦可用作心脏修补片、血管或其它医用修复材料。
8、生物瓣的固定成型：用0.05-5％的复合金属盐可用ZrOCl2、Al2(SO4)3、AlCl3、FeCl3、Cr2(SO4)3、CrCl3等一种或一种以上的混合物 于生理盐水溶液中，使缝制好的生物瓣快速固定成型为缓钙化复合环氧交联法产品，然后放入2％的甲醛磷酸缓冲液和表面活性剂中灭菌保存。
本发明的胶原组织材料缓钙化复合环氧交联法处理的牦牛心包与传统的戊二醛法处理的牦牛心包的效果比较如下表1。实践证明本发明克服了传统的戊二醛处理胶原组织后带来的一系列弊端和缺点。
复合环氧法与戊二醛法处理牦牛心包材料的性能测试：
表1两种交联剂处理牦牛心包的效果
| 项 目 | 用复合环氧交联剂处理牦牛心包 | 用戊二醛处理牦牛心包 |
| 色 泽收缩温度(℃)断裂应变(％)定负荷拉伸应力松弛试验(拉伸500秒时的残余应力)柔软性与弹性生物相容性抗原性免疫反应耐酶水解性溶血试验细胞毒性急性毒性皮下刺激热原实验皮下埋植实验抗原性免疫反应钙含量测定微克/毫克干组织 | 白色或绿色82～90℃70±10.687.6±1.8柔软、厚而富有弹性动物组织相容性佳极微优小于5％96级无毒阴性阴性阴性优良极微0.57±0.19 | 浅黄色8549±5.886.5±2.8粗糙感、薄而僵硬细胞不易生长极微良小于5％96级无毒阴性阴性阴性较好极微23.2±4.6 |
1、氨基酸分析
复合环氧法处理样品经四川省农科院中心实验室进行氨基酸分析，戊二醛法处理样品作对比，用日立835-50型高速氨基酸分析仪测定，
表2两种交联剂处理牦牛包后氨基酸含量
| 氨基酸残基 | 氨基酸残基数 | 已反应数 | |||
| 新样 | 复合环氧 | 戊二醛 | 复合环氧 | 戊二醛 | |
| Arg(精氨酸)Lys(赖氨酸)His(组氨酸)Thr(苯氨酸)Met(甲硫氨酸)Ser(丝氨酸)Tyr(酪氨酸)Glu(谷氨酸)Asp(天门冬氨酸) | 350198511622925070576382 | 35023511621325029576382 | 35267511622925270576382 | -175--16-41** | -131-----** |
每1000个总氨基酸中的氨基酸残基
环氧与酸性氨基酸形成的酯键在酸性水解条件下水解破坏。
氨基酸分析表明，经环氧交联处理的材料较戊二醛处理的材料，引入了多种交联键，交联点数也有所增加。
2、力学性能测试
经卫生部药检所采用Shimadzu-AG-5000A生物材料试验机对复合环氧交联处理材料与戊二醛法处理材料对比试验如图1，图2所示。
图1，牦牛心包材料的应力-应变曲线*
1、新鲜样品 2，复合环氧法，3、戊二醛法
*试样周向取向，试样数n＝9，曲线上各点为平均值±标准误差。
图2，牦牛心包材料的应力松弛曲线*
1、新鲜样品，2、复合环氧法，3、戊二醛法
*
时间刻度log(t)，试样数n＝10，曲线上各点为平均±标准误差，载荷在550秒的情况下，复合环氧处理的牦牛心包材料的力学性能优于戊二醛处理牦牛心包材料。
表3两种交联剂处理牦牛心包的抗张强度与断裂伸长率
| 样 品 | 试样数(n) | 抗张强度KN·m-2·103 | 断裂伸长率％ |
| 新 样复合环氧戊 二 醛 | 71410 | 12.5±4.412.3±3.85.0±1.1 | 6.1±6.570±10.649±5.8 |
由于环氧化合物能与胶原分子中多种氨基酸侧基起反应，如ε-NH2，-COOH，-OH等，形成分布较为均匀的交联键。此外，环氧交联剂是带醚键的柔性分子链。因此，在保持材料的抗张强度基础上，环氧处理的断裂伸长率也有显著提高，对于体内受多变应力作用的瓣叶材料，是十分有利的。胶原组织的应力松弛主要来自 纤维束间的滑移和纤维分子本身的粘弹性。经化学改性后，材料的应力松弛速率均有所下降，但以EP心包材料下降率较小。再次说明改性心包材料的应力松弛效应与材料的氨基酸分析结果吻合，即环氧在胶原分子间引入的交联键数较戊二醛的交联键多。
经复合环氧交联剂处理的牦牛心包材料，其柔性较戊二醛处理的好，抗拉强度和断裂伸长率增加，力学性能优于戊二醛处理材料。
3、材料的钙化实验
在生物瓣失效的原因中，无毒退变(主要是组织的退变)占失效原因总数的74％，而组织退变多数与瓣叶的钙化有关。研究缓
钙化材料是解决生物瓣使用寿命的关键问题。
参照Fishbein和Levy的方法，将样品及对照包埋于大鼠背部皮下，21天后取出，烘干至恒重称量，硝化，并用PE3030型原子吸收分光光度仪测定钙含量。
表4 两种交联剂处理牦牛心包后钙化实验
复合环氧处理样品的钙含量与戊二醛样品相比显著下降，复合环氧处理材料具有明显的缓钙化作用。
| 样 品 | 测定次数 | Ca++μg/mg干组织 |
| 戊二醛复合环氧 | 99 | 23.2±4.60.57±0.19 |
4、材料的酶解实验：
酶解法是以胶原组织材料在酶(I型胶原酶Collagenase I，或链蛋白酶Pronase)作用下释放出的羟脯氨酸(Hypro)量来表达的，羟脯氨酸值愈低，则材料的耐酶解能力愈强。
表5 两种交联剂处理牦牛心包后酶解实验
| 心包材料 | 牦牛心包 | 黄牛心包 | |||||
| 新鲜 | 环氧 | 锆复合环氧 | 铬复合环氧 | 戊二醛 | 戊二醛(巴西) | 戊二醛(美国) | |
| 收缩温度Ts℃羟脯氨酸含量Hypro值mg/g绝干试样 | 68116.0 | 7952 | 8442.2 | 8350.1 | 8860.3 | 8858.8 | 8860.5 |
实验证明复合环氧交联法处理的牦牛心包材料在收缩温度Ts℃较低的情况下，其羟脯氨酸值仍明显低于戊二醛法处理的牦牛心包材料和巴西、美国的黄牛心包商品试样。
本发明具有如下优点：
经过生化处理的胶原组织材料植入人体后，生物相容性好，排异反应小，在医学外科手术上的应用日渐广泛，其中以人工生物心瓣用量最大，仅以国内外换瓣情况为例，全世界已有100多万人换瓣，美国每年约10000人换瓣，1988年联邦德国换瓣术已达5000多例，国际市场销售量每年约增长6.9％。我国成人风心病患者约140万，其中8万人急需换瓣，根据以上增长率，我国每年还将增加5000急需换瓣者。目前国内已有100多家医院开展换瓣手术，但产量远远满足不了临床需要，据华西医科大学80年代初调查，四川一亿人中0.8％患心瓣病，即80万病员，其中10％应换心瓣，加上愿意或可能换的为应换心瓣的10％，则本省急等换瓣者也在近万人之上。因此，本发明更有利于病患者在于：
1、减小或延缓胶原组织材料在体内的钙化，从而大大延长生物瓣植入人体后的使用寿命，从7-8年提高到15年以上，有利于病患者恢复健康。
2、生物瓣与人工机械瓣相比造价低廉，血动力学功能接近人体生理功能，血液相容性好，不需要服用抗凝药物，适合于我国和发展中国家的国情，本专利的实施将为人类心瓣病患者带来福音。
3、我国具有丰富的生物组织材料资源，尤其四川省每年宰杀数以千万计的生猪和数以万计牦牛，有取之不尽，用之不竭的型号齐全的猪主动脉瓣和优良的牦牛心包材料，为发展生物瓣工业提供了可靠的保证。天然胶原组织材料，在经过交联处理前，一般是屠宰加工厂废弃不用之物，经过生化处理后变废为宝造福人类，不仅可以救死扶伤，还可节汇创汇。例如国内广州太平洋公司每张心包约100元，制成的生物瓣每只为1500元，而且是用传统的戊二醛处理的材料。美国进口的生物瓣每只为1000美元，如果用本发明的方法生产的材料制造缓钙化生物瓣，且质量比美国的好。若年产5000只，并以同样价格销售，则年产值可达750万元，出口可创汇5000美元。
实施例1：
1、粗选：选择3-5岁的健康小牛，宰杀后半小时内采集，要求环境洁净、接触心包的器材药液按外科灭菌消毒，采集的新鲜牦牛心包于室温，最佳温度为4-10℃下去掉表面的脂肪和粗糙结缔组织。
2、漂洗：将粗选的新鲜牦牛心包用灭菌生理盐水(0.9％NaCl)溶液洗涤多次，直至无血水渗出为止，每次固液比为1∶40重量比体积温度为室温，最佳温度为4-10℃。
3、浸泡萃取可溶性蛋白质：灭菌用不含钙盐的HanKs液，固液比同前(2)，洗至用茚三酮试验无可溶性蛋白质浸出为止。
4、精选：选取心前区均匀部分，裁成120×100毫米大小的矩形片。
5、抗菌素灭菌：在500毫升生理盐水中加入4-8万单位庆大霉素，固液比同前(2)，温度为室温，最佳温度4-10℃。
6、交联剂固定：交联剂可用2-3官能度环氧化合物与0.1N的碳酸盐缓冲液和20％乙醇作为助溶剂(pH9-10)对生物材料进行交联固定，反应温度为4-10℃，时间96小时以上。
7、储放入保存液中备用：用2％甲醛磷酸缓冲液和1％聚乙二醇中灭菌保存1个月左右。由此制得的缓钙化胶原组织材料除缝制生物瓣外，亦可用作心脏修补片、血管或其它医用修复材料。
8、生物瓣的固定成型：用0.2％的ZrOCl2于生理盐水溶液中，使缝制好的生物瓣快速固定成型。然后放入2％的甲醛磷酸缓冲液和表面活性剂聚乙二醇中灭菌保存。
实施例2：
1、粗选：选取新鲜的狗动脉血管于室温下去掉血管表面的肌肉和要求，同实施1的(1)。
2、漂洗：将粗选的新鲜狗动脉血管用灭菌生理盐水(0.9％NaCl)溶液洗涤多次，直至无血水渗出为止，每次固液比为1∶30重量比体积比，温度为室温。
4、浸泡萃取可溶性蛋白质，同实施例1的(3)。
4、精选：选取均匀部分，切取一定长度的血管。
5、抗菌素灭菌：同实施1的(5)。
6、交联剂固定：交联剂可用2％双官能度环氧化合物
，n＝3与0.1N的碳酸盐缓冲液和20％丙酮作为助溶剂，pH9-10，对血管进行交联固定，室温下反应96小时。
7、储放入保存液中备用：用2％甲醛磷酸缓冲液和0.5％聚丙二醇中灭菌保存，即可直接用于置换病变的血管。
实施例3：
1、粗选：选取新鲜的猪主动脉瓣于室温下去掉脂肪和不均匀部分，要求同实施例1的(1)。
2、漂洗：3、浸泡萃取可溶性蛋白质，4、精选和5抗菌素灭菌皆同实施例2的(2)(3)(4)(5)。
6、交联固定：交联剂可用2％的双官能度的环氧化合物
n＝10与0.1N的碳酸盐缓冲液和10％二氧环己烷作为助溶剂，pH9-10，对该主动脉瓣进行交联固定，室温下反应96小时。
7、储放入保存液中备用：用2％甲醛磷酸缓冲液和0.5％十二烷基硫酸钠中灭菌保存。
Claims (6)
1.对胶原组织人工瓣膜材料缓钙化的方法，其特征在于：
(1)粗选：在环境洁净和接触胶原组织的器材、药液均按外科要求灭菌消毒的条件下，在半小时内立即将采集到的新鲜胶原组织于室温下去掉其表面的脂肪和网状结缔组织，
(2)漂洗：将粗选的新鲜胶原组织用灭菌生理盐水溶液洗涤多次，直至无血水渗出为止，每次固液比为1∶10～50，即重量与体积之比，
(3)浸泡萃取可溶性蛋白质：萃取用不含钙盐的HanKs液，固液比同前(2)，洗至用茚三酮试剂检验无可溶性蛋白质浸出为止，
(4)精选：选取胶原组织的均匀部分，裁成一定尺寸的矩形片，
(5)抗菌素灭菌：每500毫升生理盐水中加入4～8万单位庆大霉素，固液比同前(2)，
(6)交联剂固定：交联剂用1～15％的多官能度的环氧化合物与0.1N的碳酸盐缓冲液和5～50％水溶性有机溶剂作为助溶剂，对胶原组织进行第一次交联固定，室温下反应96个小时以上，
(7)储放于保存液中备用：用2％甲醛磷酸缓冲液和0.5～3％水溶性表面活性剂中灭菌保存，
(8)生物瓣的固定成型：用0.05～5％的复合金属盐于生理盐水溶液中，使缝制好的牛心包或猪主动脉瓣进行第二次固定成型为缓钙化复合环氧交联法产品，然后放入2％甲醛磷酸缓冲液和表面活性剂中灭菌保存。
2.按照权利要求1所述对胶原组织人工瓣膜材料缓钙化的方法，其特征在于胶原组织材料为牛心包，猪主动脉瓣，人体硬脑膜，阔筋膜、大动物动脉血管、蹄筋和羊腹膜。
3.按照权利要求1所述对胶原组织人工瓣膜材料缓钙化的方法，其特征在于多官能度环氧交联剂为
n＝1～10同系化合物。
4.按照权利要求1所述对胶原组织人工瓣膜材料缓钙化的方法，其特征在于水溶性有机助溶剂为乙醇、丙酮和二氧杂环己烷。
5.按照权利要求1所述对胶原组织人工瓣膜材料缓钙化的方法，其特征在于水溶性表面活性剂为聚乙二醇、聚丙二醇和十二烷基硫酸钠。
6.按照权利要求1所述对胶原组织人工瓣膜材料缓钙化的方法，其特征在于复合金属盐为ZrOCl2、Al2(SO4)3、AlCl2、FeCl3、Cr2(SO4)3、CrCl3的一种或一种以上的混合物。
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