ES2258284T3

ES2258284T3 - Composiciones de cryet29 de bacillus thuringiensis toxicas para insectos coleopteros y la especie ctenocephalides.

Info

Publication number: ES2258284T3
Application number: ES97945353T
Authority: ES
Inventors: Mark J. Rupar; William P. Donovan; Yuping Tan; Annette C. Slaney
Original assignee: Monsanto Technology LLC
Current assignee: Monsanto Technology LLC
Priority date: 1996-09-26
Filing date: 1997-09-25
Publication date: 2006-08-16
Anticipated expiration: 2017-09-25
Also published as: PL332502A1; EP1681351A1; US6686452B2; AU740888B2; KR20000048680A; CA2267667C; IL129189A0; CN1246893A; WO1998013497A1; ATE318313T1; DE69735305T2; EP0932682B1; JP2001506973A; BR9711554B1; PT932682E; DE69735305D1; US7572587B2; BR9711554A; EP0932682A1; TR199900689T2

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UNA NUEVA ENDOTOXINA DE ENDOTOXINA, DENOMINADA CRYET29, QUE PRESENTA UNA ACTIVIDAD INSECTICIDA FRENTE A LOS INSECTOS SIFONOPTEROS, INCLUYENDO LAS LARVAS DEL PIOJO DEL GATO (CTENOCEPHALIDES FELIS), ASI COMO FRENTE A INSECTOS COLEOPTEROS, INCLUYENDO EL GUSANO DE LA RAIZ DE MAIZ DEL SUR (DIABROTICA UNDECIMPUNCTATA), EL GUSANO DE LA RAIZ DE MAIZ DEL ESTE (D. VIRGIFERA), EL ESCARABAJO DE LA PATATA (LEPTINOTARSA DECEMLINEATA), EL ESCARABAJO JAPONES (POPILLIA JAPONICA), Y EL GORGOJO DE LA HARINA (TRIBOLIUM CASTANEUM). ASIMISMO, SE DESCRIBEN SEGMENTOS DE ACIDO NUCLEICO QUE CODIFICAN PARA CRYET29, VECTORES RECOMBINANTES, CELULAS HUESPED Y PLANTAS TRANSGENICAS QUE COMPRENDEN DICHO SEGMENTO DE ADN DE CRYET29. SE DESCRIBEN ASIMISMO PROCEDIMIENTOS PARA OBTENER Y UTILIZAR DICHA PROTEINA Y DICHOS SEGMENTOS DE ACIDOS NUCLEICOS, ASI COMO ENSAYOS Y EQUIPAMIENTOS DIAGNOSTICOS PARA LA DETECCION DE CRYET29 Y SECUENCIAS DE CRYET29 IN VIVO E IN VITRO.

Description

Composiciones de CryET29 de Bacillus thuringiensis tóxicas para insectos insectos coleópteros y la especie
Ctenocephalides.

1. Antecedentes de la invención 1.1 Campo de la invención

La presente invención se refiere, en general, a los campos de la Biología Molecular. Más concretamente, ciertas realizaciones se refieren a procedimientos y composiciones que comprenden segmentos de ADN y proteínas derivados de especies bacterianas. Más concretamente, se refiere a un nuevo gen cryET29 de Bacillus thuringiensis que codifica una proteína de cristal tóxica para la pulga de gato y los coleópteros. Se revelan diversos procedimientos para formar y usar estos segmentos de ADN, los segmentos de ADN que codifican proteínas CryET29 modificadas sintéticamente, y las proteínas de cristal nativas y sintéticas, tal como, por ejemplo, el uso de segmentos de ADN como sondas y moldes de diagnóstico para la producción de proteínas, y el uso de proteínas, vehículos de proteína de fusión y péptidos en diversas aplicaciones inmunológicas y diagnósticas. También se revelan procedimientos para formar y usar segmentos de ácido nucleico en el desarrollo de células de plantas transgénicas que contienen los segmentos de ADN revelados en la presente memoria.

1.2 Descripción de la técnica relacionada 1.2.1 Proteínas de cristal de Bacillus thuringiensis

El Bacillus thuringiensis es una bacteria gram-positiva que produce \delta-endotoxinas conocidas como proteínas de cristal, que son específicamente tóxicas para ciertos órdenes y especies de insectos. Se ha observado que muchas cepas diferentes de B. thuringiensis producen proteínas de cristal insecticidas. Las composiciones que incluyen cepas de B. thuringiensis que producen proteínas insecticidas han estado comercialmente disponibles y han sido usadas como insecticidas ambientalmente aceptables porque son bastante tóxicas para el insecto diana específico, pero inocuas para las plantas y otros organismos no diana.

La proteína de cristal de B. thuringiensis sólo es tóxica en el insecto tras la ingestión, cuando el pH alcalino y las enzimas proteolíticas del intestino medio del insecto disuelven la proteína de cristal y liberan los componentes tóxicos. Estos componentes perturban el desarrollo de las células del intestino medio haciendo que el insecto deje de alimentarse y, finalmente, muera. De hecho, la bacteria B. thuringiensis ha probado ser un insecticida eficaz y seguro para el medio ambiente en el tratamiento de diversas plagas de insectos.

Como fue señalado por Hofte et al., (1989), la mayoría de cepas insecticidas de B. thuringiensis son activas contra los insectos del orden Lepidoptera, i.e., las orugas. Otras cepas de B. thuringiensis tienen actividad insecticida contra los insectos del orden Díptera, i.e., las moscas y los mosquitos, o contra insectos tanto lepidópteros como dípteros. En los últimos años, se ha informado sobre la producción de unas cuantas cepas de B. thuringiensis de proteínas de cristal que son tóxicas para los insectos del orden Coleoptera, i.e., los escarabajos. Hasta la fecha, no se han realizado publicaciones sobre cepas de B. thuringiensis que sean activas contra las pulgas del género Ctenocephalides del orden Siphonaptera.

Las toxinas Cyt activas contra los dípteros difieren de la mayoría del resto de proteínas de cristal insecticidas de B. thuringiensis en que son más pequeñas y no comparten bloques conservados de homología secuencial. Estas proteínas demuestran una amplia actividad citolítica in vitro, siendo, sin embargo, específicamente tóxicas para las larvas de los insectos dípteros in vivo. Estas proteínas han sido descritas en otras publicaciones (Chilcott y Ellar, 1988).

1.2.2 Genética de las proteínas de cristal

Se han clonado un número de genes codificantes de las proteínas de cristal a partir de varias cepas de B. thuringiensis. Una revisión de Höfte et al., (1989) describe el estado general de la técnica con respecto a la mayoría de las cepas insecticidas de B. thuringiensis que han sido identificadas, que son activas contra insectos del orden Lepidoptera, i.e., orugas. Este tratado también describe cepas de B. thuringiensis que tienen actividad insecticida contra los insectos de los órdenes Diptera (i.e., moscas y mosquitos) y Coleoptera (i.e., escarabajos). Se han clonado un número de genes que codifican las proteínas de cristal a partir de varias cepas de B. thuringiensis. Höfte et al. (1989) trata los genes y las proteínas que fueron identificados en B. thuringiensis antes de 1990, y presenta la nomenclatura y el esquema de clasificación que se han aplicado tradicionalmente a los genes y a las proteínas de B. thuringiensis. Los genes cry1 codifican las proteínas Cry1 tóxicas para los lepidópteros. Los genes cry2 codifican las proteínas Cry2, que son tóxicas tanto para los lepidópteros como para los dípteros. Los genes cry3 codifican las proteínas Cry3 tóxicas para los coleópteros, mientras que los genes cry4 codifican proteínas Cry4 tóxicas para los dípteros, etc.

Recientemente, se ha propuesto una nueva nomenclatura que clasifica sistemáticamente las proteínas Cry en base la homología de las secuencias de aminoácidos más que en base a especificidades diana hacia los insectos. En la tabla 1, se resume este esquema de clasificación.

TABLA 1 Nomenclatura revisada de las \delta-endotoxinas de B. thuringiensis^{A}

NUEVA	ANTIGUA	Nº DE ACCESO DEL BANCO DE GENES
Cry1Aa	CryIA(a)	M11250
Cry1Ab	CryIA(b)	M13898
Cry1Ac	CryIA(c)	M11068
Cry1Ad	CryIA(d)	M73250
Cry1Ae	CryIA(e)	M65252
Cry1Ba	CryIB	X06711
Cry1Bb	ET5	L32020
Cry1Bc	PEG5	Z46442
Cry1Bd	CryE1	U70726
Cry1Ca	CryIC	X07518
Cry1Cb	CryIC(b)	M97880
Cry1Da	CryID	X54160
Cry1Db	PrtB	Z22511
Cry1Ea	CryIE	X53985
Cry1Eb	CryIE(b)	M73253
Cry1Fa	CryIF	M63897
Cry1Fb	PrtD	Z22512
Cry1Ga	PrtA	X22510
Cry1Gb	CryH2	U70725
Cry1Ha	PrtC	Z22513
Cry1Hb		U35780
Cry1Ia	CryV	X62821
Cry1Ib	CryV	U07642
Cry1Ja	ET4	L32019
Cry1Jb	ET1	U31527
Cry1K		U28801
Cry2Aa	CryIIA	M31738
Cry2Ab	CryIIB	M23724
Cry2Ac	CryIIC	X57252
Cry3A	CryIIIA	M22472
Cry3Ba	CryIIIB	X17123
Cry3Bb	CryIIIB2	M89794
Cry3C	CryIIID	X59797
Cry4A	CryIVA	Y00423
Cry4B	CryIVB	X07423
Cry5Aa	CryVA(a)	L07025
Cry5Ab	CryVA(b)	L07026
Cry5B		U19725
Cry6A	CryVIA	L07022
Cry6B	CryVIB	L07024
Cry7Aa	CryIIIC	M64478
Cry7Ab	CryIIICb	U04367
Cry8A	CryIIIE	U04364
Cry8B	CryIIIG	U04365
Cry8C	CryIIIF	U04366
Cry9A	CryIG	X58120
Cry9B	CryIX	X75019
Cry9C	CryIH	Z37527
Cry10A	CryIVC	M12662
Cry11A	CryIVD	M31737

TABLA 1 (continuación)

NUEVA	ANTIGUA	Nº DE ACCESO DEL BANCO DE GENES
Cry11B	Jeg80	X86902
Cry12A	CryVB	L07027
Cry13A	CryVC	L07023
Cry14A	CryVD	U13955
Cry15A	34kDa	M76442
Cry16A	cbm71	X94146
Cry17A	cbm71	X99478
Cry18A	CryBP1	X99049
Cry19A	Jeg65	Y08920
Cyt1Aa	CytA	X03182
Cyt1Ab	CytM	X98793
Cyt1B		U37196
Cyt2A	CytB	Z14147
Cyt2B	CytB	U52043
^{a}Adaptado de: \underline{http://epunix.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_{-}Crickmore/Bt/index.html}

1.2.3. Identificación de las proteínas de cristal tóxicas para los insectos coleópteros

Se ha descrito la clonación y la expresión de un gen que codifica una toxina mosquitocida de 26 kDa de la variedad israelensis de B. thuringiensis activa contra los dípteros (Ward et al., 1984), y la secuencia de nucleótidos de este gen fue revelada (Ward y Ellar, 1986). La masa molecular de la proteína toxina, CytA, calculada a partir de la secuencia de aminoácidos deducida fue determinada en 27.340 Da.

Se ha revelado la secuencia de nucleótidos del gen para una proteína Cyt mosquitocida de 27 kDa aislada de la cepa PG14 de la variedad morrisoni de B. thuringiensis (Earp y Ellar, 1987). Se descubrió que la secuencia de esta proteína toxina difiere sólo en un residuo aminoacídico de la proteína CytIA de la variedad israelensis de B. thuringiensis.

Anteriormente, se describió la identificación de una proteína de 25 kDa que muestra actividad citolítica in vitro cuando es activada mediante proteólisis desde la variedad mosquitocida kyushuensis de B. thuringiensis (Knowles et al., 1992), y se informó acerca de la secuencia nucleotídica del gen para esta proteína, CytB (Koni y Ellar, 1993). La masa molecular prevista de la proteína CytB es de 29.236 Da y la secuencia aminoacídica deducida es bastante distinta, aunque comparte una similitud secuencial significativa con la proteína CytA de la variedad israelensis de B. thuringiensis.

Se han descrito la clonación y la caracterización del gen para una proteína toxina de 30 kDa con actividad sobre los insectos coleópteros y dípteros (Solicitud de patente internacional publicada nº WO 95/02693, 1995). Este gen, aislado de PS201T6 de B. thuringiensis, codifica una proteína de 29.906 Da que muestra una identidad secuencial del 64% con la toxina CytA de la variedad Israelensis de B. thuringiensis.

2. Resumen de la invención

La presente invención proporciona una novedosa proteína de cristal insecticida de B. thuringiensis (denominada CryET29) y el gen que la codifica (denominado cryET29) que contienen secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos, respectivamente, que muestran poca homología con las proteínas \delta-endotoxinas y los genes de la técnica anterior. Sorprendentemente, la proteína CryET29 de la presente invención demuestra una notable actividad insecticida no sólo contra los insectos del orden Coleoptera, sino también contra las pulgas, y en concreto, contra las larvas de la pulga del gato, Ctenocephalides felis.

En una realización importante, la invención proporciona un segmento aminoacídico aislado y purificado que comprende una proteína de cristal insecticida CryET29 de B. thuringiensis (SEQ ID Nº: 2) que comprende la secuencia aminoacídica que se ilustra en las figuras 1A y 1B. La región codificante para la proteína CryET29 es la SEQ ID Nº: 1. La proteína CryET29 muestra una actividad insecticida frente a coleópteros tales como el gusano meridional de la raíz del maíz, el gusano occidental de la raíz del maíz, el escarabajo de la patata, el escarabajo japonés y el gorgojo de la harina y el afrecho. En realizaciones relacionadas, también se revelan procedimientos para elaborar y usar esta proteína, los derivados y los mutantes de la misma, así como los anticuerpos dirigidos contra estas proteínas.

En otra realización importante, la invención proporciona un segmento de ácido nucleico aislado y purificado que comprende el gen cryET29 que codifica la proteína de cristal CryET29 revelada en la presente memoria. La secuencia nucleotídica del gen cryET29 se da en la SEQ ID Nº: 1 y es ilustrada en las figuras 1A y 1B. En realizaciones relacionadas, también se revelan los procedimientos para elaborar, usar, modificar, hacer mutar, analizar y cuantificar estos segmentos de ácido nucleico. También se revelan procedimientos de diagnóstico y equipos de análisis para la identificación y la detección de las secuencias de los genes cry relacionadas en una variedad de metodologías in vitro e in vivo.

Otro aspecto de la presente invención es una célula de Bacillus thuringiensis que produce una proteína de cristal CryET29. En una realización preferida, la célula es una cepa bacteriana de Bacillus thuringiensis denominada EG4096 de B. thuringiensis que fue depositada en la Colección de Cultivos de Investigación Agrícola, Northern Regional Research Laboratory (NRRL), el 30 de mayo de 1996, y que recibió el nº de acceso: NRRL B-21582. La EG4096 de B. thuringiensis, descrita a fondo en los ejemplos 1, 2 y 3, es una bacteria natural que comprende un gen cryET29 (SEQ ID Nº: 1) de la presente invención. La EG4096 produce una nueva proteína de cristal insecticida de aproximadamente 26 kDa, que los inventores han denominado CryET29 (SEQ ID Nº: 2). Lo más preferible es que la célula de Bacillus thuringiensis tenga el número de acceso del NRRL: NRRL B-21582.

Otro aspecto de la presente invención es un plásmido, un cósmido o un vector que comprende la secuencia de ácido nucleico de todo o de una parte del gen cryET29 (SEQ ID Nº: 1), una célula huésped transformada que comprende un gen cryET29 nativo o recombinante, un cultivo de una bacteria recombinante transformada con tal plásmido, siendo la bacteria, preferiblemente, B. thuringiensis, tal como las cepas recombinantes EG11494 y EG11502, descritas en el ejemplo 7, y más preferiblemente, un cultivo biológicamente puro de tal cepa bacteriana. La cepa EG11494 fue depositada el 30 de mayo de 1996 bajo los términos del Tratado de Budapest en el NRRL y recibió el número de acceso: NRRL B-21583. Alternativamente, las cepas recombinantes de E. coli EG11513 y EG11514 que comprenden el nuevo gen cryET29 también son huéspedes preferidos para la expresión de la proteína CryET29.

2.1 Segmentos de ADN de cryET29

La presente invención también se refiere a segmentos de ADN, que pueden ser aislados desde casi cualquier fuente, que carecen de ADN genómico total y que codifican todos o una parte de los nuevos péptidos revelados en la presente memoria. El gen cryET29 (SEQ ID Nº: 1; fig. 1A y fig. 1B) codifica la proteína CryET29 de 26 kDa que tiene una secuencia aminoacídica mostrada en las figuras 1A y 1B (SEQ ID Nº: 2). Se puede demostrar que los segmentos de ADN que codifican estas especies de péptidos pueden codificar proteínas, polipéptidos, subunidades, dominios funcionales y similares de productos génicos relacionados con la proteína de cristal u otros productos génicos no relacionados. Además, estos segmentos de ADN pueden ser sintetizados por completo in vitro usando procedimientos que son conocidos por los expertos en la técnica.

Como se usa en la presente memoria, el término "segmento de ADN" se refiere a una molécula de ADN que ha sido aislada libre de ADN genómico total de una determinada especie. Por lo tanto, un segmento de ADN codificante de una proteína o un péptido de cristal se refiere a un segmento de ADN que contiene proteína de cristal codificante de secuencias, aún estando aislado de, o purificado libre de, ADN genómico total de la especie de la que se ha obtenido el segmento de ADN, que en el caso inmediato, es el genoma del género bacteriano gram-positivo Bacillus, y en particular, la especie conocida como B. thuringiensis. Incluidos dentro del término "segmento de ADN", están los segmentos de ADN y los fragmentos de menor tamaño de tales segmentos, y también los vectores recombinantes, incluyendo, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, fagémidos, fagos, virus y similares.

De manera similar, el segmento de ADN que comprende un gen aislado o purificado codificante de una proteína de cristal se refiere a un segmento de ADN que puede incluir, además de secuencias codificantes de péptidos, otros ciertos elementos tales como, secuencias reguladoras, sustancialmente aisladas de otros genes naturales, o secuencias codificantes de proteínas. A este respecto, el término "gen" se usa, con el fin de simplificar, para referirse a una unidad funcional codificante de proteínas, polipéptidos y péptidos. Como los expertos en la técnica entenderán, este término funcional no sólo incluye secuencias genómicas, incluyendo secuencias de ADN extracromosómico, sino también secuencias de operón y/o segmentos génicos transformados que expresan, o que pueden ser adaptados para que expresen, proteínas, polipéptidos o péptidos.

"Sustancialmente aislado de otras secuencias codificantes" significa que el gen de interés, en este caso, un gen codificante de una proteína de cristal bacteriana, forma la parte significativa de la región codificante del segmento de ADN, y que el segmento de ADN no contiene porciones grandes de ADN codificante natural, tales como fragmentos cromosómicos grandes o regiones codificantes de otros genes funcionales u operones. Por supuesto, esto se refiere al segmento de ADN como se aisló originariamente, y no excluye a los genes, genes recombinantes, ligadores sintéticos o regiones codificantes añadidas posteriormente al segmento por la mano del hombre.

En realizaciones concretas, la invención se refiere a segmentos de ADN aislados y a vectores recombinantes que incorporan las secuencias de ADN que codifican una especie de proteína o péptido Cry que incluye en su secuencia aminoacídica una secuencia aminoacídica esencialmente como la expuesta en la SEQ ID Nº: 2. Más preferiblemente, la secuencia de ADN comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una especie de proteína o péptido Cry que incluye en su secuencia aminoacídica una secuencia de al menos diez aminoácidos contiguos de SEQ ID Nº: 2.

El término "una secuencia esencialmente como la expuesta en la SEQ ID Nº: 2" significa que la secuencia corresponde sustancialmente a una porción de la secuencia de SEQ ID Nº: 2 y tiene relativamente pocos aminoácidos que no son idénticos a, o un equivalente biológicamente funcional de, los aminoácidos de cualquiera de estas secuencias. El término "equivalente biológicamente funcional" es un término muy extendido en la técnica y definido más a fondo en la presente memoria (p.ej., véase el apartado de "Realizaciones ilustrativas"). Por consiguiente, las secuencias que tienen entre el aproximadamente 70% y el aproximadamente 80%, o más preferiblemente, entre el aproximadamente 81% y el aproximadamente 90%, o incluso más preferiblemente, entre el aproximadamente 91% y el aproximadamente 99% de identidad o equivalencia funcional entre su secuencia de aminoácidos y los aminoácidos de SEQ ID Nº: 2 serán secuencias que son "esencialmente como la expuesta en la SEQ ID Nº: 2".

También se entenderá que las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos pueden incluir residuos adicionales, tales como aminoácidos N- o C-terminales adicionales, o secuencias de 5' ó 3', y seguir siendo esencialmente como se expone en una de las secuencias reveladas en la presente memoria, siempre y cuando la secuencia cumpla los criterios anteriormente expuestos, incluyendo el mantenimiento de la actividad biológica de las proteínas en lo que concierne a la expresión proteica. La adición de secuencias terminales es particularmente aplicable a secuencias de ácidos nucleicos que pueden, por ejemplo, incluir diversas secuencias no codificantes flanqueantes de cualquiera de las porciones 5' ó 3' de la región codificante o que pueden incluir diversas secuencias internas, i.e., intrones, que se sabe que ocurren dentro de los genes.

Los segmentos de ácido nucleico de la presente invención, independientemente de la longitud de la propia secuencia codificante, pueden estar combinados con otras secuencias de ADN, tales como promotores, señales de poliadenilación, sitios adicionales de enzimas de restricción, sitios de clonación múltiple, otros segmentos codificantes y similares, tal que su longitud total puede variar considerablemente. Se contempla, por lo tanto, el empleo de un fragmento de ácido nucleico de casi cualquier longitud, estando la longitud total preferiblemente limitada por la facilidad de preparación y de uso en el protocolo de ADN recombinante que se pretenda utilizar. Por ejemplo, se pueden preparar fragmentos de ácido nucleico que incluyan un tramo contiguo corto codificante de toda o una parte de la secuencia peptídica revelada en la SEQ ID Nº: 2, o que sean idénticos o complementarios a las secuencias de ADN que codifican el péptido revelado en la SEQ ID Nº: 2, y particularmente, el segmento de ADN revelado en la SEQ ID Nº: 1. Por ejemplo, también se contempla la utilidad de secuencias de ADN tales como de aproximadamente 14 nucleótidos, y que tienen una longitud de hasta aproximadamente 10.000, aproximadamente 5.000, aproximadamente 3.000, aproximadamente 2.000, aproximadamente 1.000, aproximadamente 500, aproximadamente 200, aproximadamente 100, aproximadamente 50 y aproximadamente14 pares de bases (incluyendo todas las longitudes intermedias).

Será fácilmente entendible que las "longitudes intermedias", en estos contextos, significa cualquier longitud que esté entre los intervalos citados, tal como 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, etc; 21, 22, 23, etc; 30, 31, 32, etc; 50, 51, 52, 53, etc; 100, 101, 102, 103, etc; 150, 151, 152, 153, etc.; incluyendo todos lo números enteros del 200-500; 500-1.000; 1.000-2.000; 2.000-3.000; 3.000-5.000; y hasta e incluyendo las secuencias de aproximadamente 10.000 nucleótidos y similares.

También se entenderá que esta invención no se limita a las secuencias de ácidos nucleicos concretas que codifican los péptidos de la presente invención, o que codifican la secuencia aminoacídica SEQ ID Nº: 2, incluyendo la secuencia de ADN que es particularmente revelada en SEQ ID Nº: 1. Por lo tanto, los vectores recombinantes y los segmentos de ADN aislados pueden incluir de forma muy diversa las propias regiones codificantes de péptidos, las regiones codificantes que llevan alteraciones o modificaciones seleccionadas en la región codificante básica, o pueden codificar polipéptidos más largos que, no obstante, incluyen estas regiones codificantes de péptidos, o pueden codificar proteínas o péptidos equivalentes biológicamente funcionales que tengan variantes de las secuencias aminoacídicas.

Los segmentos de ADN de la presente invención engloban péptidos equivalentes biológicamente funcionales. Tales secuencias pueden surgir como consecuencia de la redundancia de codón y la equivalencia funcional que se sabe que tienen lugar de forma natural dentro de las secuencias de ácidos nucleicos y las proteínas así codificadas. Alternativamente, se pueden crear proteínas o péptidos equivalentes funcionalmente mediante la aplicación de la tecnología de ADN recombinante, en la que los cambios en la estructura proteica pueden ser transformados por ingeniería, en base a las consideraciones sobre las propiedades de los aminoácidos que están siendo intercambiados. Los cambios diseñados por el hombre pueden ser introducidos a través de la aplicación de técnicas de mutagénesis de sitio específico dirigida, p.ej., mediante la introducción de mejoras en la antigenicidad de la proteína o en los mutantes de análisis con el fin de examinar la actividad a nivel molecular.

Si se desea, también se pueden preparar proteínas y péptidos de fusión, p.ej., en los que las regiones codificantes de los péptidos están alineadas dentro de la misma unidad de expresión con otras proteínas u otros péptidos que tengan funciones deseadas, tal como con propósitos de purificación o inmunodetección (p.ej., las proteínas que pueden ser purificadas mediante cromatografía de afinidad y las regiones codificantes de etiquetas enzimáticas, respectivamente).

Los vectores recombinantes forman otros aspectos de la presente invención. Los vectores considerados particularmente útiles son aquellos vectores en los que la porción codificante del segmento de ADN, bien que codifica una proteína de longitud completa o un péptido más pequeño, está colocada bajo el control de un promotor. El promotor puede estar en la forma del promotor que esté asociado de forma natural con un gen codificante de los péptidos de la presente invención, pues puede ser obtenido mediante el aislamiento de secuencias no codificantes de 5' localizadas corriente arriba del segmento o el exón codificante, por ejemplo, usando una clonación recombinante y/o la tecnología PCR®, en conexión con las composiciones reveladas en la presente memoria.

2.2. Segmentos de ADN como sondas y cebadores de hibridación

Además de su uso en la dirección de la expresión de las proteínas o los péptidos de cristal de la presente invención, las secuencias de ácidos nucleicos consideradas en la presente memoria también tienen una variedad de otros usos. Por ejemplo, también tienen son útiles como sondas o cebadores en realizaciones de hibridación de ácidos nucleicos. Como tales, se considera que los segmentos de ácidos nucleicos que comprenden una región secuencial constituida por una secuencia con una longitud de al menos 14 nucleótidos contiguos que tiene la misma secuencia que, o es complementaria a, un segmento de ADN de una longitud de 14 nucleótidos contiguos de SEQ ID Nº. 1 serán particularmente útiles. También serán útiles en ciertas realizaciones, las secuencias idénticas o complementarias contiguas más largas, p.ej., aquéllas de aproximadamente 20, 30, 40, 50, 100, 200, 500, 1.000, 2.000, 5.000, 10.000 etc (incluyendo todas las longitudes intermedias y hasta e incluyendo las secuencias de longitud completa).

La capacidad de tales sondas de ácido nucleico para hibridarse específicamente con secuencias codificantes de proteínas de cristal les permitirán ser útiles en la detección de la presencia de secuencias complementarias en una muestra dada. Sin embargo, se preven otros usos, incluyendo el uso de la información secuencial para la preparación de cebadores de especies mutantes o el uso de los cebadores en la preparación de otras construcciones genéticas.

Las moléculas de ácidos nucleicos que tienen regiones secuenciales constituidas por tramos de nucleótidos contiguos de 10-14, 15-20, 30, 50 o incluso de 100-200 nucleótidos más o menos, idénticas o complementarias a la secuencia de ADN de SEQ ID Nº: 1, son consideradas en particular como sondas de hibridación para su uso en, p. ej., transferencias southern o northern. Los fragmentos más pequeños, generalmente, serán útiles en las realizaciones de hibridación en las que la longitud de la región complementaria contigua puede ser variada, tal como entre aproximadamente 10-14 y aproximadamente 100 ó 200 nucleótidos, pero se pueden usar tramos contiguos de complementariedad más largos, según la longitud de las secuencias complementarias que se desee detectar.

El uso de una sonda de hibridación de una longitud de aproximadamente 14 nucleótidos permite la formación de una molécula dúplex que es tanto estable como selectiva. Aunque, generalmente, se prefieren las moléculas que tienen secuencias complementarias contiguas con respecto a tramos de una longitud de más de 14 bases, con el fin de aumentar la estabilidad y la selectividad del híbrido, y mejorar de ese modo la calidad y el grado de las moléculas híbridas específicas obtenidas. Por lo general, será preferible diseñar moléculas de ácidos nucleicos que tengan tramos complementarios de genes de 15 a 20 nucleótidos contiguos, o incluso mayores si así se desea.

Por supuesto, también se pueden obtener los fragmentos mediante otras técnicas tales como, p.ej., mediante un cizallamiento mecánico o mediante la digestión por enzimas de restricción. Los segmentos o fragmentos pequeños de ácidos nucleicos pueden ser fácilmente preparados mediante, por ejemplo, la síntesis directa del fragmento mediante procedimientos químicos, como se realiza comúnmente por medio de un sintetizador automático de oligonucleótidos. Además, se pueden obtener fragmentos mediante la aplicación de la tecnología de reproducción de ácidos nucleicos, tal como la tecnología PCR® de las patentes estadounidenses 4.683.195 y 4.683.202, introduciendo secuencias seleccionadas en vectores recombinantes para la producción recombinante, y mediante otras técnicas de ADN recombinante generalmente conocidas por los expertos en la técnica de la Biología Molecular.

Por consiguiente, las secuencias de nucleótidos de la invención pueden ser usadas por su capacidad de formar selectivamente moléculas dúplex con tramos complementarios de fragmentos de ADN. En función de la aplicación prevista, será deseable emplear condiciones variables de hibridación para alcanzar grados variables de selectividad de la sonda hacia la secuencia diana. Para las aplicaciones que requieren una selectividad alta, lo normal es que se deseen emplear condiciones relativamente estrictas para formar los híbridos, p.ej., se seleccionarán condiciones salinas relativamente bajas y/o de temperatura elevada, tales como las proporcionadas por NaCl de aproximadamente 0,02 M a aproximadamente 0,15 M a temperaturas de aproximadamente 50ºC a aproximadamente 70ºC. Tales condiciones selectivas toleran poco, si algún, apareamiento erróneo entre la sonda y el molde o la cadena diana, y serían particularmente adecuadas para aislar los segmentos de ADN codificantes de las proteínas de cristal. La detección de segmentos de ADN por hibridación es conocida por los expertos en la técnica, y las enseñanzas de las patentes estadounidenses 4.965.188 y 5.176.995 son ejemplos de los procedimientos de análisis por hibridación. Las enseñanzas como las que se encuentran en los textos de Maloy et al., 1994; Segal 1976; Prokop, 1991; y Kuby, 1994, son particularmente relevantes.

Por supuesto, para algunas aplicaciones, por ejemplo, en las que se desee preparar mutantes empleando una cadena de cebador mutante hibridada con un molde subyacente o en las que se busque el aislamiento de secuencias codificantes de proteínas de cristal de especies relacionadas, equivalentes funcionales o similares, normalmente se necesitarán condiciones de hibridación menos estrictas para permitir la formación del heterodúplex. En tales circunstancias, puede ser deseable emplear condiciones tales como una sal de aproximadamente 0,15 M a aproximadamente 0,9 M, a temperaturas que varían de aproximadamente 20ºC a aproximadamente 55ºC. De ese modo, las especies de hibridación cruzada pueden ser fácilmente identificadas como señales positivamente hibridantes con respecto a las hibridaciones control. En cualquier caso, generalmente se entiende que las condiciones pueden volverse más estrictas mediante la adición de cantidades crecientes de formamida, que sirve para desestabilizar el dúplex híbrido, del mismo modo que mediante una temperatura mayor. De este modo, las condiciones de hibridación pueden ser manipuladas fácilmente, siendo así generalmente un procedimiento de elección en función de los resultados
deseados.

En ciertas realizaciones, será ventajoso emplear secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención en combinación con un medio apropiado, tal como una etiqueta, para determinar la hibridación. En la técnica, se conocen una amplia variedad de medios indicadores apropiados, incluyendo ligandos fluorescentes, radiactivos, enzimáticos o de otro tipo, tales como avidina/biotina, que son capaces de dar una señal detectable. En las realizaciones preferidas, será probable que se desee emplear una etiqueta fluorescente o una etiqueta enzimática, tal como la ureasa, fosfatasa alcalina o peroxidasa, en lugar de reactivos radiactivos u otros reactivos no deseables para el medio ambiente. En el caso de las etiquetas enzimáticas, se sabe que los sustratos de indicadores colorimétricos pueden ser empleados para proporcionar un medio visible por el ojo humano o espectrofotométricamente, para identificar una hibridación específica con muestras que contienen ácidos nucleicos complementarios.

En general, se preve que las sondas de hibridación descritas en la presente memoria sean útiles tanto como reactivos en la hibridación realizada en soluciones como en realizaciones que emplean una fase sólida. En las realizaciones en las que se emplea una fase sólida, el ADN (o ARN) de análisis es adsorbido o fijado de otro modo a una matriz o una superficie seleccionada. Este ácido nucleico monocatenario fijado es luego sometido a una hibridación específica con sondas seleccionadas bajo las condiciones deseadas. Las condiciones seleccionadas dependerán de las circunstancias particulares en base a los criterios particulares requeridos (dependiendo, por ejemplo, del contenido de G+C, del tipo de ácido nucleico diana, de la fuente del ácido nucleico, del tamaño de la sonda de hibridación etc.). Tras el lavado de la superficie hibridada para eliminar las moléculas de sonda unidas inespecíficamente, se detecta la hibridación específica, o incluso, se cuantifica, por medio de la etiqueta.

2.3. Expresión de proteínas y vectores recombinantes

La invención también revela y reivindica una composición que comprende una proteína de cristal CryET29. La composición puede comprender células huésped bacterianas que expresan una proteína de cristal CryET29, cuerpos de inclusión o cristales que contengan la proteína CryET29, sobrenadante de cultivo, células deterioradas, extractos celulares, lisados, tejidos homogeneizados y similares. Las composiciones pueden estar en forma acuosa, o alternativamente, en forma seca, semi-húmeda u otras formas similares tales como en pasta celular, pellas celulares, o alternativamente, en una forma criodesecada, en polvo, liofilizada, evaporada u otra forma seca similarmente preparada. Tales procedimientos para preparar proteínas de cristal son conocidos por los expertos en la técnica del aislamiento y de la purificación de las proteínas bacterianas. En ciertas realizaciones, las proteínas de cristal pueden ser purificadas, concentradas, mezcladas con otros reactivos o procesadas para obtener la forma final deseada. Preferiblemente, la composición comprenderá del aproximadamente 1% al aproximadamente 90% en peso de proteína de cristal, y más preferiblemente, del aproximadamente 5% al aproximadamente 50% en peso.

En una realización preferida, las composiciones de la proteína de cristal de la invención pueden ser preparadas mediante un procedimiento que comprende las etapas de cultivar una célula de Bacillus thuringiensis que exprese una proteína de cristal CryET29 en condiciones eficaces para producir tal proteína y obtener luego la proteína de la célula. La obtención de tal proteína de cristal puede incluir además la purificación, la concentración, el procesamiento o la mezcla de la proteína con uno o más reactivos. Preferiblemente, la proteína de cristal CryET29 se obtiene en una cantidad de entre aproximadamente 1% al aproximadamente 90% en peso, y más preferiblemente, del aproximadamente 5% al aproximadamente 50% en peso.

La invención también se refiere a un procedimiento para preparar una composición de proteína de cristal CryET29. Tal procedimiento supone, en general, las etapas de cultivar una célula de Bacillus thuringiensis que exprese una proteína de cristal CryET29 en condiciones eficaces para producir la proteína, y obtener luego la proteína así producida. En una realización preferida, la célula de Bacillus thuringiensis es una célula NRRL B-21582, o cualquier célula de Bacillus thuringiensis que contenga un segmento de gen cryET29. Alternativamente, los vectores de plásmido recombinante de la invención pueden ser usados para transformar otras células bacterianas o eucariotas adecuadas para producir la proteína de cristal de la invención. En la preparación de las proteínas de cristal de la invención, se consideran útiles las células huésped procariotas que incluyen células gram-negativas tales como E. coli, células de la especie Pseudomonas y enterobacteráceas relacionadas, o células gram-positivas tales como de la especie Bacillus (incluyendo B. megaterium, B. subtilis y B. thuringiensis) y similares.

En tales realizaciones, se considera que se conseguirán ciertas ventajas colocando el segmento de ADN codificante bajo el control de un promotor recombinante o heterólogo. Como se usa en la presente memoria, un promotor recombinante o heterólogo pretende hacer referencia a un promotor que normalmente no está asociado con un segmento de ADN codificante de una proteína o un péptido de cristal en su ambiente natural. Tales promotores pueden incluir promotores que normalmente están asociados con otros genes y/o promotores aislados de cualquier célula bacteriana, viral, eucariota o vegetal. Naturalmente, será importante emplear un promotor que dirija eficazmente la expresión del segmento de ADN en el tipo de célula, el organismo, o incluso el animal, seleccionado para la expresión. El uso del promotor y de combinaciones de distintos tipos de células para la expresión de proteínas es conocido de manera general por los expertos en la técnica de la Biología Molecular. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989. Los promotores empleados pueden ser constitutivos o inducibles, y pueden ser usados bajo las condiciones apropiadas para dirigir una expresión de nivel alto del segmento de ADN introducido, tal que resulte ventajoso en la producción a gran escala de proteínas y péptidos recombinantes. Los sistemas promotores apropiados considerados para su uso en la expresión de nivel alto incluyen, pero no se limitan a, el sistema de vectores de expresión Pichia (Pharmacia LKB
Biotechnology).

En conexión con las realizaciones de expresión para preparar proteínas y péptidos recombinantes, se considera que se usarán más habitualmente segmentos de ADN más largos, siendo los más preferidos los segmentos de ADN codificantes de toda la secuencia peptídica. Sin embargo, se entenderá que el uso de segmentos de ADN más cortos para dirigir la expresión de péptidos de cristal o de regiones centrales epitópicas, tal que puedan ser usados para generar anticuerpos contra las proteínas de cristal, también pertenece al alcance de la invención. Se consideran particularmente útiles los segmentos de ADN que codifican antígenos peptídicos de aproximadamente 8 a aproximadamente 50 aminoácidos de longitud, o más preferiblemente, de aproximadamente 8 a aproximadamente 30 aminoácidos de longitud, o incluso más preferiblemente, de aproximadamente 8 a aproximadamente 20 aminoácidos de longitud. Tales epitopos peptídicos pueden ser secuencias aminoacídicas que comprendan secuencias de aminoácidos contiguos procedentes de SEQ ID Nº: 2.

2.4 Células huésped transgénicas y transgenes de proteínas de cristal

En todavía otro aspecto, la presente invención proporciona procedimientos para producir una célula transgénica, en concreto, una célula animal o vegetal que expresa un segmento de ácido nucleico codificante de la nueva proteína de cristal CryET29 de la presente invención. El procedimiento de producción de células transgénicas es conocido en la técnica. En general, el procedimiento comprende transformar una célula huésped adecuada con un segmento de ADN que contenga un promotor que esté unido operativamente a una región codificante que codifique una proteína de cristal CryET29 de B. thuringiensis. Tal región codificante está generalmente unida operativamente a una región de terminación de la transcripción, por medio de la cual el promotor es capaz de dirigir la transcripción de la región codificante en la célula, dotando así a la célula de la capacidad de producir la proteína recombinante in vivo. Alternativamente, en los casos en los que sea deseable controlar, regular o disminuir la cantidad de una determinada proteína de cristal recombinante expresada en una determinada célula transgénica, la invención también proporciona la expresión del ARNm antisentido de la proteína de cristal. El uso del ARNm antisentido como medio para controlar y disminuir la cantidad de una determinada proteína de interés en una célula es conocido en la técnica.

En una realización preferida, la invención engloba una célula vegetal que ha sido transformada con un segmento de ácido nucleico de la invención, y que expresa un gen o un segmento génico codificante de una o más de las nuevas composiciones polipeptídicas reveladas en la presente memoria. Como se usa en la presente memoria, el término "célula vegetal transgénica" pretende referirse a una célula vegetal que ha incorporado secuencias de ADN, que incluyen pero no se limitan a genes que quizás normalmente no están presentes, secuencias de ADN normalmente no transcritas a ARN o traducidas a una proteína ("expresadas"), o cualquier otro gen o secuencia de ADN que se desee introducir en la planta no transformada, tal como genes que normalmente puedan estar presentes en la planta no transformada, pero que se deseen bien transformar genéticamente o que tengan una expresión modificada.

Se considera que, en algunos casos, el genoma de una planta transgénica de la presente invención habrá sido aumentado a través de la introducción estable de un transgén de cryET29, bien del cryET29 nativo, o del cryET29 modificado o mutado sintéticamente. En algunos casos, se incorporará más de un transgén en el genoma de la célula vegetal huésped transformada. Tal es el caso cuando se incorpora más de un segmento de ADN codificante de la proteína de cristal en el genoma de tal planta. En determinadas situaciones, puede ser deseable tener una, dos, tres, cuatro o incluso más proteínas de cristal de B. thuringiensis (bien nativas o transformadas mediante ingeniería de recombinación) incorporadas y expresadas establemente en la planta transgénica transformada. En las realizaciones preferidas, la introducción del transgén en el genoma de la célula vegetal resulta en una integración estable en la que la descendencia de tales plantas también contiene una copia del transgén en su genoma. La posibilidad de que la progenie de la planta en la que el gen fue introducido originalmente pueda heredar este elemento genético es un aspecto preferido de esta invención.

Un gen preferido que puede ser introducido incluye, por ejemplo, una secuencia de ADN de origen bacteriano codificante de una proteína de cristal, y concretamente una o más de las descritas en la presente memoria que son obtenidas de B. thuringiensis, o cualquiera de las secuencias que hayan sido modificadas mediante ingeniería genética para disminuir o aumentar la actividad insecticida de la proteína de cristal en tal célula huésped transformada.

Los procedimientos para transformar una célula vegetal y la preparación de una línea celular transgénica son conocidos en la técnica (como los que se ejemplifican en las patentes estadounidenses nº: 5.550.318; 5.508.468; 5.482.852; 5.384.253; 5.276.269 y 5.225.341), y son tratados brevemente en la presente memoria. Los vectores, los plásmidos, los cósmidos, los cromosomas artificiales de levadura (YAC, Yeast Artificial Chromosomes) y los segmentos de ADN destinados a ser usados en la transformación de tales células, como es obvio, generalmente comprenderán bien los operones, los genes o las secuencias derivadas de los genes de la presente invención, bien nativos o derivados sintéticamente, en concreto, los que codifican las proteínas de cristal reveladas. Estos constructos de ADN pueden incluir además estructuras tales como promotores, potenciadores, poliligadores o incluso secuencias génicas que tengan una actividad reguladora positiva o negativa sobre genes concretos de interés según lo deseado. El segmento de ADN o el gen puede codificar una proteína de cristal bien nativa o modificada, que será expresada en las células recombinantes resultantes, y/o que conferirá un fenotipo mejorado a la planta regenerada.

Tales plantas transgénicas pueden ser deseables para aumentar la resistencia frente a insecticidas de una planta monocotiledónea o dicotiledónea, mediante la incorporación a tal planta de un segmento de ADN transgénico codificante de una proteína de cristal CryET29 que sea tóxica para los insectos coleópteros. Las plantas particularmente preferidas incluyen el maíz, el trigo, la soja, las gramíneas de césped, las plantas ornamentales, los árboles frutales, los arbustos, las verduras, los granos, las legumbres y similares, o cualquier otra planta en la que se desee introducir una proteína de cristal.

En un aspecto relacionado, la presente invención también contempla una semilla producida por la planta transformada, una progenie de tal semilla y una semilla producida por la progenie de la planta transgénica original, producida según el procedimiento anterior. Tal progenie y tales semillas tendrán un transgén de proteína de cristal incorporado establemente en su genoma, y tales plantas de la progenie heredarán las características proporcionadas por la introducción de un transgén estable de forma mendeliana. La totalidad de tales plantas transgénicas que tienen incorporadas en su genoma segmentos de ADN transgénico codificantes de una proteína o un polipéptido de cristal CryET29 constituye aspectos de esta invención.

2.5 Mutagénesis de sitio específico

En concreto, la mutagénesis de sitio específico es una técnica útil en la preparación de péptidos individuales, o proteínas o péptidos equivalentes biológicamente funcionales, a través de una mutagénesis específica del ADN subyacente. La técnica proporciona además una capacidad para preparar y analizar variantes secuenciales, por ejemplo, incorporando una o más de las consideraciones anteriores, mediante la introducción de un o más cambios de las secuencias nucleotídicas en el ADN. La mutagénesis de sito específico permite la producción de mutantes a través del uso de secuencias específicas de oligonucleótidos que codifican la secuencia de ADN de la mutación deseada, así como un número suficiente de nucleótidos adyacentes, para proporcionar una secuencia cebadora de un tamaño y una complejidad secuencial suficientes para formar un dúplex estable en ambos lados del empalme de deleción que está siendo atravesado. Normalmente, se prefiere un cebador de una longitud de aproximadamente 17 a aproximadamente 75 nucleótidos o más, con aproximadamente 10 a aproximadamente 25 o más residuos en ambos lados del empalme de la secuencia que está siendo modificada.

En general, la técnica de la mutagénesis de sitio específico es conocida en la técnica, como queda ejemplificado en varias publicaciones. Como se entenderá, la técnica normalmente emplea un vector de fagos que existe tanto en una forma monocatenaria como bicatenaria. Los vectores típicamente útiles en la mutagénesis de sitio específico incluyen vectores tales como el fago M13. Estos fagos están fácilmente disponibles comercialmente y su uso es generalmente conocido por los expertos en la técnica. Los plásmidos bicatenarios también son empleados habitualmente en la mutagénesis de sitio específico, lo que elimina la etapa de transferir el gen de interés de un plásmido a un fago.

En general, la mutagénesis de sitio específico de acuerdo con la presente memoria se realiza obteniendo primero un vector monocatenario o fusionando por separado dos cadenas de un vector bicatenario que incluye en su secuencia una secuencia de ADN que codifica el péptido deseado. Se prepara un cebador de oligonucleótido que lleve la secuencia mutada deseada, generalmente, sintéticamente. Este cebador es entonces apareado con el vector monocatenario y sometido a enzimas de polimerización de ADN tales como un fragmento de Klenow de la polimerasa I de E. coli, con el fin de completar la síntesis de la cadena que lleva la mutación. De ese modo, se forma un heterodúplex en el que una cadena codifica la secuencia original no mutada y la segunda cadena lleva la mutación deseada. Este vector heterodúplex es entonces usado para transformar o transfectar células apropiadas, tales como células de E. coli, y se seleccionan clones que incluyen vectores recombinantes que llevan la disposición de la secuencia mutada. Kunkel et al. (1987) crearon un esquema de selección genética para enriquecer los clones que incorporaban el oligonucleótido mutagénico. Alternativamente, el uso de la PCR® con enzimas termoestables comercialmente disponibles tales como la polimerasa Taq puede ser usada para incorporar un cebador de oligonucleótido mutagénico en un fragmento de ADN amplificado que luego pueda ser clonado en un vector de expresión o de clonación apropiado. Los procedimientos de mutagénesis mediados por la PCR® de Tomic et al. (1990) y Upender et al. (1995) proporcionan dos ejemplos de tales protocolos. También se puede usar una PCR® en la que se emplee una ligasa termoestable además de una polimerasa termoestable para incorporar un oligonucleótido mutagénico fosforilado a un fragmento de ADN amplificado que luego pueda ser clonado en un vector de expresión o de clonación apropiado. El procedimiento de mutagénesis descrito por Michael (1994) proporciona un ejemplo de tal protocolo.

La preparación de variantes secuenciales de los segmentos de ADN codificantes del péptido seleccionado usando mutagénesis de sitio es proporcionada como un procedimiento para producir especies potencialmente útiles y no pretende ser restrictiva, pues hay otros modos por medio de los que se pueden obtener variantes secuenciales de péptidos y las secuencias de ADN que los codifican. Por ejemplo, se pueden tratar los vectores recombinantes codificantes de la secuencia peptídica deseada con agentes mutagénicos, tales como hidroxilamina, para obtener variantes
secuenciales.

Como se usa en la presente memoria, el término "procedimiento de mutagénesis dirigida por oligonucleótidos" se refiere a procedimientos dependientes del molde y a la propagación mediada por vectores que resultan en un aumento de la concentración de una determinada molécula de ácido nucleico en relación con su concentración inicial, o en un aumento de la concentración de una señal detectable, tal como la amplificación. Como se usa en la presente memoria, el término "procedimiento de mutagénesis dirigida por oligonucleótidos" pretende referirse a un procedimiento que supone la extensión dependiente del molde de una molécula cebadora. El término "procedimiento dependiente del molde" se refiere a la síntesis de ácidos nucleicos de una molécula de ADN o ARN en la que la secuencia de la cadena de ácido nucleico recién sintetizada es dictada por reglas conocidas de apareamiento de bases complementarias (véase, por ejemplo, Watson, 1987). Normalmente, las metodologías mediadas por vectores suponen la introducción del fragmento de ácido nucleico en un vector de ADN o ARN, la amplificación clónica del vector y la recuperación del fragmento de ácido nucleico amplificado. En la patente estadounidense nº: 4.237.224, se proporcionan ejemplos de tales metodologías.

Hay varios procedimientos dependientes del molde disponibles para amplificar las secuencias diana de interés presentes en una muestra. Uno de los procedimientos de amplificación más conocidos es el de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR®, Polymerase Chain Reaction), que se describe a fondo en las patentes estadounidenses nº: 4.683.195; 4.683.202 y 4.800.159. Brevemente, en la PCR®, se preparan dos secuencias cebadoras que son complementarias a regiones de cadenas opuestamente complementarias de la secuencia diana. Se añade un exceso de trifosfatos de desoxinucleósido a una mezcla de reacción junto con una polimerasa de ADN (p.ej., polimerasa Taq). Si la secuencia diana está presente en una muestra, los cebadores se unirán a la diana, y la polimerasa hará que los cebadores estén extendidos a lo largo de la secuencia diana mediante la adición sobre nucleótidos. Mediante el aumento y la disminución de la temperatura de la mezcla de reacción, los cebadores extendidos se disociarán de la diana para formar productos de reacción, los cebadores en exceso se unirán a la diana y a los productos de reacción, y el procedimiento se repite. Preferiblemente, es posible realizar un procedimiento de amplificación por PCR® con transcriptasa inversa con el fin de cuantificar la cantidad de ARNm amplificado. Las metodologías de la reacción en cadena de la polimerasa son conocidas en la técnica. Otro procedimiento para realizar la amplificación es la reacción en cadena de la ligasa (LCR, Ligase Chain Reaction), que fue revelada en la solicitud de patente europea publicada nº: 320.308. En la LCR, se preparan dos pares de sondas complementarias, y en presencia de las secuencia diana, cada par se unirá a las cadenas opuestamente complementarias de la diana de manera que queden contiguas. En presencia de una ligasa, los dos pares de sondas se enlazarán para formar una única unidad. Mediante una variación cíclica de la temperatura, como en la PCR®, las unidades ligadas enlazadas se disocian de la diana, sirviendo luego como "secuencias diana" para la ligación de los pares de sondas en exceso. La patente estadounidense nº: 4.88.750 describe un procedimiento de amplificación alternativo similar a la LCR para unir pares de sondas a una secuencia diana.

La replicasa q-beta, descrita en la solicitud de patente internacional publicada vía PCT nº: WO 87/06270, también puede ser usada como todavía otro procedimiento de amplificación en la presente invención. En este procedimiento, se añade una secuencia replicativa de ARN, que tiene una región complementaria a la de una diana, a una muestra en presencia de una polimerasa de ARN. La polimerasa copiará la secuencia replicativa que luego podrá ser detectada.

También puede resultar útil en la amplificación de ácidos nucleicos de la presente invención una procedimiento de amplificación isotérmica, en el que se usan endonucleasas y ligasas de restricción para conseguir la amplificación de las moléculas diana que contienen nucleótido 5'-[\alpha-tio]trifosfatos en una cadena de un sitio de restricción (Walker et al., 1992).

La amplificación por desplazamiento de la cadena (SDA, Strand Displacement Amplification) es otro procedimiento utilizado para llevar a cabo la amplificación isotérmica de ácidos nucleicos, que supone múltiples vueltas de desplazamiento y síntesis de la cadena, i.e., traslado de mellas. Un procedimiento similar, denominado reacción de reparación de la cadena (RCR, Repair Chain Reaction) es otro procedimiento de amplificación que puede ser útil en la presente invención, y supone el apareamiento de varias sondas a lo largo de una región diana para la amplificación, seguido de una reacción de reparación en la que sólo están presentes dos de las cuatro bases. Las otras dos bases pueden ser añadidas como derivados biotinilados para una detección fácil. En la SDA, se usa un enfoque similar.

También es posible detectar secuencias usando una reacción de sonda cíclica (CPR, Cyclic Probé Reaction). En la CPR, se híbrida una sonda que tiene secuencias 3' y 5' de ADN específico que no es de CryET29 y una secuencia media de ARN específico de la proteína CryET29 con ADN que está presente en una muestra. Al realizarse la hibridación, se trata la reacción con Rnasa H, y los productos de la sonda son identificados como productos distintivos que generan una señal que son liberados tras la digestión. El molde original es apareado con otra sonda cíclica y se repite la reacción. De este modo, la CPR supone la amplificación de una señal generada por la hibridación de una sonda con un ácido nucleico expresado específico de cryET29.

Todavía se pueden usar según la presente invención otros procedimientos de amplificación descritos en la solicitud de patente británica nº: 2.202.328 y en la solicitud de patente internacional publicada vía PCT nº WO 89/09284. En la primera solicitud, se usan cebadores "modificados" en una síntesis dependiente del molde y de la enzima de tipo PCR. Los cebadores pueden ser modificados mediante el marcado con un resto de captura (p.ej., biotina) y/o un resto detector (p.ej., enzima). En la segunda solicitud, se añade un exceso de sondas marcadas a la muestra. En presencia de la secuencia diana, la sonda se une y es clivada catalíticamente. Tras el clivaje, la secuencia diana es liberada intacta para ser unida por la sonda en exceso. El clivaje de la sonda marcada señala la presencia de la secuencia diana.

Otros procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos incluyen los sistemas de amplificación basados en la transcripción (TAS, Transcription-based Amplification Systems) (Kwoh et al., 1989; solicitud de patente internacional publicada vía PCT nº: WO 88/10315), incluyendo la amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA, Nucleic Acid Sequence Based Amplification) y 3SR. En la NASBA, los ácidos nucleicos pueden ser preparados para la amplificación mediante una extracción estándar con fenol/cloroformo, la desnaturalización por calor de una muestra, el tratamiento con un tampón de lisis y columnas de mini espines para el aislamiento de ADN y ARN o la extracción de ARN con cloruro de guanidinio. Estas técnicas de amplificación suponen el apareamiento de un cebador que tiene secuencias específicas de la proteína de cristal. Tras la polimerización, los híbridos de ADN/ARN son digeridos con la RNasa H, mientras que las moléculas de ADN bicatenario se vuelven a desnaturalizar mediante calor. En cualquier caso, el ADN monocatenario es convertido totalmente en bicatenario mediante la adición de un segundo cebador específico de la proteína de cristal, seguida por la polimerización. Las moléculas de ADN bicatenario son entonces transcritas múltiplemente por una polimerasa tal como la T7 o la SP6. En una reacción cíclica isotérmica, los ARN son transcritos inversamente a ADN bicatenario, y transcritos una vez más con una polimerasa tal como la T7 o la SP6. Los productos resultantes, bien truncados o completos, indican las secuencias específicas de la proteína de cristal.

La solicitud de patente europea publicada nº: 329.822 revela un procedimiento de amplificación de ácidos nucleicos que supone la síntesis cíclica de ARN monocatenario (ARNmc), ADNmc y ADN bicatenario (ADNbc), que puede ser usado según la presente invención. El ARNmc es un primer molde para un primer cebador de oligonucleótido, que es alargado mediante transcriptasa inversa (polimerasa de ADN dependiente del ARN). El ARN es entonces separado del dúplex ADN:ARN resultante mediante la acción de la ribonucleasa H (Rnasa H y Rnasa específica del ARN en un dúplex bien con ADN o con ARN). El ADNmc resultante es un segundo molde para un segundo cebador, que también incluye las secuencias de un promotor de la polimerasa de ARN (ejemplificada por la polimerasa de ARN T7) 5' con respecto a su homología con su molde. Este cebador es luego extendido por la polimerasa de ADN (ejemplificada por el fragmento largo de Klenow de la polimerasa I de ADN de E. coli), resultando en una molécula de ADN bicatenario ("ADNbc"), que tiene una secuencia idéntica a la del ARN original entre los cebadores, y que tiene además, en un extremo, una secuencia promotora. Esta secuencia promotora puede ser usada por la polimerasa de ARN apropiada para hacer muchas copias de ARN del ADN. Estas copias pueden entonces volver a entrar en el ciclo conduciendo a una amplificación muy rápida. Con la selección adecuada de las enzimas, se puede realizar esta amplificación isotérmicamente sin la adición de enzimas en cada ciclo. Debido a la naturaleza cíclica de este procedimiento, se puede elegir que la secuencia de inicio esté bien en forma de ADN o en forma de ARN.

La solicitud de patente internacional publicada vía PCT nº: WO 89/06700 revela un esquema de amplificación de una secuencia de ácidos nucleicos basado en la hibridación de una secuencia promotora/cebadora con un ADN monocatenario diana (ADNmc) seguida por la transcripción de muchas copias de ARN de la secuencia. Este esquema no es cíclico; i.e., no se producen nuevos moldes a partir de los transcriptos de ARN resultantes. Hay otros procedimientos de amplificación, que incluyen el "RACE" (Frohman, 1990) y la "PCR monolateral" (Ohara, 1989), que son conocidos por los expertos en la técnica.

Los procedimientos basados en la ligación de dos (o más) oligonucleótidos en presencia de ácido nucleico que tiene la secuencia del "di-oligonucleótido" resultante, amplificando de ese modo el di-oligonucleótido (Wu y Dean, 1996) también pueden ser usados en la amplificación de las secuencias de ADN de la presente invención.

2.6 Composiciones y procedimientos de producción de anticuerpos

En realizaciones concretas, los inventores contemplan el uso de anticuerpos, bien monoclonales o policlonales, que se unen a las proteínas de cristal reveladas en la presente memoria. Los procedimientos para preparar y caracterizar anticuerpos son conocidos en la técnica (véase, p.ej., Harlow y Lane, 1988). Los procedimientos para generar anticuerpos monoclonales, generalmente, comienzan en las mismas líneas que los destinados a preparar anticuerpos policlonales. Brevemente, un anticuerpo policlonal se prepara inmunizando un animal con una composición inmunogénica según la presente invención y recogiendo antisuero de ese animal inmunizado. Se puede usar una gran variedad de especies animales para la producción del antisuero. Normalmente, el animal usado para la producción del anti-antisuero es un conejo, un ratón, una rata, un hámster, un conejillo de Indias o una cabra. Debido al volumen de sangre relativamente elevado de los conejos, éstos constituyen la elección preferida para la producción de anticuerpos policlonales.

Como se sabe en la técnica, una composición dada puede variar en cuanto a su inmunogenicidad. Por lo tanto, suele ser necesario estimular el sistema inmunitario huésped, y puede lograrse acoplando un inmunógeno de péptido o polipéptido a un vehículo. Los ejemplos de vehículos preferidos son la hemocianina extraída de la lapa californiana (KLH, Keyhole Limpet Hemocyanin) y la albúmina de suero bovino (ASB). También se pueden usar como vehículos otras albúminas tales como la ovalbúmina, la albúmina de suero de ratón o la albúmina de suero de conejo. Los medios para conjugar un polipéptido con una proteína vehículo son conocidos en la técnica, e incluyen el glutaraldehído, el éster de m-maleimidobencoil-N-hidroxisuccinimida, la carbodiimida y la bencidina bis-biazotizada.

Como también se sabe en la técnica, la inmunogenicidad de una determinada composición de inmunógeno puede ser aumentada mediante el uso de estimuladores no específicos de la respuesta inmune, conocidos como adyuvantes. Los ejemplos de adyuvantes preferidos incluyen el adyuvante completo de Freund (un estimulador inespecífico de la respuesta inmune que contiene Mycobacterium tuberculosis muerta), adyuvantes incompletos de Freund y adyuvante de hidróxido de aluminio.

La cantidad de composición de inmunógeno usada en la producción de anticuerpos policlonales varía según la naturaleza del inmunógeno, así como según el animal usado para la inmunización. Se puede usar una variedad de vías para administrar el inmunógeno (subcutánea, intramuscular, intradérmica, intravenosa e intraperitoneal). La producción de anticuerpos policlonales puede ser controlada mediante un muestreo de sangre del animal inmunizado en diversos momentos posteriores a la inmunización. También se puede aplicar una segunda inyección estimulante. El procedimiento de estimulación y valoración se repite hasta que se alcanza un valor adecuado. Cuando se obtiene un nivel deseado de inmunogenicidad, se puede sangrar al animal inmunizado, y aislar y almacenar el suero, y/o se puede usar el animal para generar anticuerpos monoclonales.

Los anticuerpos monoclonales pueden ser fácilmente preparados a través del uso de técnicas conocidas, tales como las que se ejemplifican en la patente estadounidense 4.196.265. Normalmente, esta técnica supone la inmunización de un animal adecuado con una composición de inmunógeno seleccionada, p.ej., una proteína, un polipéptido o un péptido de cristal purificado o parcialmente purificado. La composición inmunizante es administrada de una manera eficaz para estimular a las células productoras de anticuerpos. Los roedores tales como los ratones y las ratas son los animales preferidos, sin embargo, también es posible el uso de células de conejo y de rana oveja. El uso de ratas puede proporcionar ciertas ventajas (Goding, 1986, pp. 60-61), pero se prefieren los ratones, siendo el ratón BALB/c el preferido, pues es el que se usa más habitualmente y generalmente proporciona un porcentaje elevado de fusiones estables. Tras la inmunización, se seleccionan células somáticas con el potencial de producir anticuerpos, especialmente, linfocitos B (células B), para su uso en el protocolo de generación de anticuerpos monoclonales. Estas células pueden ser obtenidas de bazos, amígdalas y nodos linfáticos extraídos mediante biopsia, o de una muestra de sangre periférica. Se prefieren las células de bazo y las células de sangre periférica, las primeras porque son una fuente rica de células productoras de anticuerpos que se encuentran en la etapa de división de los plasmablastos, y las segunda porque la sangre periférica es fácilmente obtenible. Lo habitual es haber inmunizado a un grupo de animales y extraer el bazo del animal con el valor más alto de anticuerpos, para obtener los linfocitos del bazo mediante la homogenización del bazo con una jeringa. Normalmente, un bazo procedente de un ratón inmunizado contiene aproximadamente de 5 x 10^{7} d 2 x 10^{8} linfocitos.

Entonces se fusionan los linfocitos B productores de anticuerpos del animal inmunizado con células de una célula de mieloma inmortal, generalmente una de la misma especie que el animal que fue inmunizado. Las líneas celulares de mieloma adecuadas para su uso en los procedimientos de fusión mediante la producción de hibridomas son preferiblemente no productoras de anticuerpos, tienen una alta eficacia de fusión y deficiencias enzimáticas que las vuelven incapaces de crecer en ciertos medios selectivos que mantienen únicamente el crecimiento de las células fusionadas deseadas (hibridomas).

Se puede usar una cualquiera de una serie de células de mieloma, como es sabido por los expertos en la técnica (Goding, pp. 65-66, 1986; Campbell, pp. 75-83, 1984). Por ejemplo, cuando el animal inmunizado es un ratón, se pueden usar P3-X63/Ag8, X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 y S194/5XX0 Bul; para ratas, se pueden usar R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F y 4B210; y U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 y UC729-6 también son útiles en relación con las fusiones de células humanas.

Una célula de mieloma murino preferida es la línea celular de mieloma NS-1 (también denominada P3-NS-1-Ag4-1), que está fácilmente disponible en el depósito de células mutantes de genética humana del NIGMS mediante la solicitud del número del depósito de líneas celulares GM3573. Otra línea celular de mieloma de ratón que puede ser usada es la línea celular no productora de SP2/0 de mieloma murino de ratón resistente a la 8-azaguanina.

Los procedimientos para generar híbridos de células de bazo o de nodos linfáticos productoras de anticuerpos y células de mieloma normalmente comprenden mezclar células somáticas con células de mieloma en una proporción de 2:1, aunque la proporción puede variar de aproximadamente 20:1 a aproximadamente 1:1, respectivamente, en presencia de un agente o unos agentes (químicos o eléctricos) que promuevan la fusión de las membranas celulares. Se han descrito procedimientos de fusión en los que se usa el virus Sendai (Kohler y Milstein, 1975; 1976), y aquéllos en los que se usa polietilenglicol (PEG), tal como PEG (v/v) al 37%, (Gefter et al., 1977). También resulta apropiado el uso de procedimientos de fusión inducida eléctricamente (Goding, 1986, pp. 71-74).

Los procedimientos de fusión normalmente producen híbridos viables a bajas frecuencias, aproximadamente de 1 x 10^{-6} a 1 x 10^{-8}. Sin embargo, esto no plantea un problema, pues los híbridos fusionados viables son diferenciados de las células parenterales no fusionadas (particularmente, de las células no fusionadas de mieloma que, normalmente, continuarían dividiéndose indefinidamente) mediante su cultivo en un medio selectivo. El medio selectivo es, por lo general, un medio que contiene un agente que bloquea la síntesis de novo de los nucleótidos en el medio de cultivo tisular. Los ejemplos de agentes preferidos son la aminopterina, el metotrexato y la azaserina. La aminopterina y el metotrexato bloquean la síntesis de novo tanto de las purinas como de las pirimidinas, mientras que la azaserina sólo bloquea la síntesis de purinas. Cuando se usa aminopterina o metotrexato, el medio es complementado con hipoxantina y timidina como una fuente de nucleótidos (medio HAT). Cuando se usa azaserina, el medio es complementado con hipoxantina.

El medio de selección preferido es el medio HAT. En estos medios sólo son capaces de sobrevivir las células con rutas de rescate de nucleótidos en funcionamiento. Las células del mieloma son defectuosas en las enzimas clave de la ruta de rescate, p. ej., la hipoxantina fosforibosil transferasa (PRET), y no pueden sobrevivir. Las células B pueden manejar esta ruta, pero la duración de su vida es limitada en cultivo y, generalmente, mueren en el transcurso de aproximadamente dos semanas. Por lo tanto, las únicas células que pueden sobrevivir en el medio selectivo son aquellos híbridos formados a partir de mieloma y células B.

Este cultivo proporciona una población de hibridomas a partir de la cual se seleccionan hibridomas específicos. Normalmente, la selección de los hibridomas es realizada mediante el cultivo de las células por la dilución de un clon sencillo en placas de microvaloración, seguida por el análisis de los sobrenadantes clónicos individuales (tras aproximadamente dos o tres semanas) para la radiactividad deseada. El análisis debería ser sensible, simple y rápido, tal como los radioinmunoanálisis, los inmunoanálisis enzimáticos, los análisis de citotoxicidad, los análisis de placas, los análisis de inmunounión de puntos y similares.

Los hibridomas serían luego diluidos en serie y clonados en líneas celulares individuales productoras de anticuerpos, cuyos clones pueden ser luego propagados indefinidamente hasta proporcionar anticuerpos monoclonales. Las líneas celulares pueden ser explotadas para la producción de anticuerpos monoclonales de dos modos básicos. Se puede inyectar una muestra del hibridoma (normalmente, en la cavidad peritoneal) en un animal histocompatible del tipo que fue usado para proporcionar las células somáticas y de mieloma para la fusión original. El animal inyectado desarrolla tumores que segregan el anticuerpo monoclonal específico producido por el híbrido celular fusionado. Los fluidos corporales del animal, tales como el suero o el líquido ascítico, pueden ser luego aprovechados para producir anticuerpos monoclonales a una concentración elevada. Las líneas celulares individuales también podrían ser cultivadas in vitro, donde los anticuerpos monoclonales son segregados de forma natural en el medio de cultivo del que pueden ser fácilmente obtenidos a concentraciones elevadas. Los anticuerpos monoclonales producidos por cualquiera de los procedimientos pueden ser purificados adicionalmente, si se desea, usando procedimientos de filtración, de centrifugación o diversos procedimientos cromatográficos tales como la CLAR o la cromatografía de afinidad.

2.7 Rastreo de proteínas de cristal y equipos de inmunodetección

La presente invención también proporciona composiciones, procedimientos y equipos para el rastreo de muestras que se sospecha que contienen una \delta-endotoxina CryET29 o un gen codificante de tal proteína de cristal. Tal rastreo puede ser realizado sobre muestras tales como de células huésped transformadas, plantas transgénicas, la progenie o la semilla de las mismas, o sobre muestras de laboratorio que se sospecha que contienen o producen tal segmento de ácido nucleico o polipéptido. Un equipo puede contener reactivos para detectar una interacción entre una muestra y un ácido nucleico o un anticuerpo de la presente invención. El reactivo proporcionado puede estar radio-, fluorescentemente- o enzimáticamente marcado. El equipo puede contener un agente radiomarcado conocido capaz de unirse o interactuar con un ácido nucleico o un anticuerpo de la presente invención.

El reactivo del equipo puede ser proporcionado como una solución líquida, unido a un soporte sólido o como un polvo seco. Preferiblemente, cuando el reactivo es proporcionado en una solución líquida, la solución líquida es una solución acuosa. Preferiblemente, cuando el reactivo proporcionado está unido a un soporte sólido, el soporte sólido puede ser un medio cromatográfico, una placa de análisis con una pluralidad de pozos o un portaobjetos de microscopio. Cuando el reactivo proporcionado es un polvo seco, el polvo puede ser reconstituido mediante la adición de un disolvente adecuado, que puede ser proporcionado.

En todavía otras realizaciones, la presente invención se refiere a procedimientos de inmunodetección y a sus equipos asociados. Se propone que las proteínas o los péptidos de cristal de la presente invención puedan ser empleados para detectar anticuerpos que tienen reactividad con los mismos o, alternativamente, se pueden emplear anticuerpos preparados según la presente invención para detectar proteínas de cristal o péptidos que contienen epitopos relacionados con las proteínas de cristal. En general, estos procedimientos incluirán primero la obtención de una muestra que se sospecha que contiene tal proteína, péptido o anticuerpo, la puesta en contacto de la muestra con un anticuerpo o un péptido según la presente invención, como puede ser el caso, en condiciones eficaces para permitir la formación de un inmunocomplejo, y luego la detección de la presencia del inmunocomplejo.

En general, la detección de la formación del inmunocomplejo es bastante conocida en la técnica y puede conseguirse a través de la aplicación de numerosos enfoques. Por ejemplo, la presente invención contempla la aplicación de ELISA, RIA, inmunotransferencia (p.ej., transferencia de puntos), técnicas de inmunofluorescencia indirecta y similares. Generalmente, la formación de inmunocomplejos será detectada a través del uso de una etiqueta, tal como una radioetiqueta o una etiqueta enzimática (tal como fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante o similares). Por supuesto, se pueden encontrar ventajas adicionales en el uso de un ligando secundario de unión tal como un anticuerpo secundario o la disposición de unión de un ligando de biotina/avidina, como se sabe en la técnica.

Por motivos de análisis, se propone que se puede emplear casi cualquier muestra que se sospecha que contiene bien una proteína o un péptido de cristal, o un péptido o anticuerpo relacionado con la proteína de cristal que se pretenda detectar, como puede ser el caso. Se considera que tales realizaciones pueden tener una aplicación en la valoración de las muestras de antígenos o anticuerpos, en la selección de hibridomas y similares. En las realizaciones relacionadas, la presente invención contempla la preparación de equipos que pueden ser empleados para detectar la presencia de las proteínas de cristal o los péptidos y/o anticuerpos relacionados en una muestra. Las muestras pueden incluir células, sobrenadantes celulares, suspensiones celulares, extractos celulares, fracciones enzimáticas, extractos proteicos u otras composiciones libres de células que se sospecha que contienen proteínas o péptidos de cristal. Hablando en términos generales, los equipos según la presente invención incluirán una proteína de cristal, un péptido de cristal o un anticuerpo dirigido contra tal proteína o péptido, junto con un reactivo de inmunodetección y un medio para contener el anticuerpo o el antígeno y el reactivo. El reactivo de inmunodetección normalmente comprenderá una etiqueta asociada con el anticuerpo o el antígeno, o asociada con un ligando secundario de unión. Los ejemplos de ligandos pueden incluir un anticuerpo secundario dirigido contra el primer anticuerpo o antígeno, o un ligando de biotina o avidina (o estreptavidina) que tenga una etiqueta asociada. Por supuesto, como se indica anteriormente, se conoce un número de ejemplos de etiquetas en la técnica, pudiéndose emplear todas ellas en relación con la presente invención.

Generalmente, el recipiente incluirá un vial dentro del cual se puede colocar el anticuerpo, el antígeno o el reactivo de detección, y, preferiblemente, adecuadamente repartido en partes alícuotas. Los equipos de la presente invención también incluirán, normalmente, un medio para contener los recipientes del anticuerpo, del antígeno y del reactivo en un confinamiento cerrado para la distribución comercial. Tales recipientes pueden incluir recipientes de plástico moldeados por soplado o inyección dentro de los que se conservan los viales deseados.

2.8 ELISA e inmunoprecipitación

Los ensayos ELISA pueden ser usados en conjunción con la invención. En un análisis ELISA, las proteínas o los péptidos que incorporan secuencias antigénicas de proteína de cristal son inmovilizados sobre una superficie seleccionada, preferiblemente, una superficie que muestre una afinidad proteica tal como los pozos de una placa de microvaloración de poliestireno. Tras un lavado para eliminar el material adsorbido de forma incompleta, es deseable unir o cubrir los pozos de la placa de análisis con una proteína inespecífica que se sepa que es antigénicamente neutra con respecto al antisuero de análisis tal como albúmina de suero bovino (ASB), caseína o soluciones de polvo de leche. Esto permite el bloqueo de los sitios de adsorción inespecífica sobre la superficie inmovilizante, reduciendo así el fondo causado por la unión inespecífica del antisuero sobre la superficie.

Tras la unión del material antigénico con el pozo, el revestimiento con un material no reactivo para reducir el fondo y el lavado para eliminar el material no enlazado, se pone en contacto la superficie inmovilizante con el antisuero o el extracto clínico o biológico por analizar de una manera propicia para la formación de complejo inmune (antígeno/anticuerpo). Preferiblemente, tales condiciones incluyen diluir el antisuero con diluyentes tales como ASB, gamma globulina bovina (GGB) y solución salina con tampón de fosfato (PBS)/Tween®. Estos agentes añadidos también tienden a ayudar en la reducción del fondo inespecífico. Se deja entonces el antisuero distribuido en capas en incubación durante de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 horas, a una temperatura preferiblemente en el orden de aproximadamente 25º a aproximadamente 27ºC. Tras la incubación, se lava la superficie en contacto con el antisuero con el fin de eliminar el material no inmunocomplejado. Un procedimiento de lavado preferido incluye lavar con una solución tal como PBS/Tween®, o un tampón de borato.

Tras la formación de inmunocomplejos específicos entre la muestra de análisis y el antígeno unido, y su posterior lavado, es posible determinar la ocurrencia e incluso la cantidad de formación de inmunocomplejo, sometiendo los mismos a un segundo anticuerpo que tenga especificidad por el primero. Para proporcionar un medio de detección, el segundo anticuerpo tendrá, preferiblemente, una enzima asociada que generará la coloración al incubar con un sustrato cromogénico apropiado. De ese modo, por ejemplo, puede ser deseable poner en contacto e incubar la superficie unida al antisuero con una ureasa o IgG anti-humano conjugado con peroxidasa durante un período de tiempo y en unas condiciones que favorezcan el desarrollo de la formación de inmunocomplejos (p. ej., la incubación durante 2 horas a temperatura ambiente en una solución que contenga PBS tal como PBS Tween®).

Tras incubar con un segundo anticuerpo marcado enzimáticamente, y posteriormente al lavado para eliminar el material no enlazado, la cantidad de etiqueta es cuantificada mediante la incubación con un sustrato cromogénico tal como urea y púrpura de bromocresol o ácido 2,2'-azino-di-(3-etil-benztiazolin)-6-sulfónico (ABTS) y H_{2}O_{2}, en el caso de la peroxidasa como etiqueta enzimática. La cuantificación se consigue entonces midiendo el grado de coloración, p.ej., usando un espectrofotómetro en el espectro visible.

Los anticuerpos de proteína de cristal de la presente invención son particularmente útiles para el aislamiento de otros antígenos de proteína de cristal mediante inmunoprecipitación. La inmunoprecipitación supone la separación del componente antigénico diana de una mezcla compleja, y se usa para diferenciar o aislar cantidades mínimas de proteína. Para el aislamiento de células proteicas de membrana, se deben disolver las células en micelas de detergente. Se prefieren las sales no iónicas, ya que otros agentes tales como las sales biliares precipitan a un pH ácido o en presencia de cationes bivalentes.

En una realización alternativa, los anticuerpos de la presente invención son útiles para la yuxtaposición próxima de dos antígenos. Esto es particularmente útil para aumentar la concentración localizada de antígenos, p.ej., de pares de enzima-sustrato.

2.9 Transferencias western

Las composiciones de la presente invención serán de gran utilidad en los análisis de transferencia western o inmunotransferencia. Se pueden usar los anticuerpos anti-peptídicos como reactivos primarios de afinidad elevada para la identificación de las proteínas inmovilizadas sobre una matriz de soporte sólido, tal como nitrocelulosa, nylon o combinaciones de los mismos. En conjunción con la inmunoprecipitación, seguida por una electroforesis en gel, éstos pueden ser usados como un reactivo de una única etapa para detectar los antígenos contra los que los reactivos secundarios usados en la detección del antígeno causan un fondo negativo. Esto es especialmente útil cuando los antígenos estudiados son inmunoglobulinas (excluyendo el uso de las inmunoglobulinas que se unen a los componentes de la pared celular bacteriana), cuando los antígenos estudiados reaccionan de forma cruzada con el agente de detección o éstos emigran al mismo peso molecular relativo como una señal de reacción cruzada.

Los procedimientos de detección con base inmunológica para ser usados en conjunción con la transferencia western que incluyen anticuerpos secundarios marcados enzimáticamente, mediante radioetiqueta o fluorescentemente contra el resto de toxina, son considerados de particular uso a este respecto.

2.10 Secuencias centrales epitópicas

La presente invención también está dirigida a composiciones proteicas o peptídicas, libres de células totales y otros péptidos, que comprenden una proteína o un péptido purificado que incorpora un epitopo que es inmunológicamente de reacción cruzada con uno o más anticuerpos contra las proteínas de cristal. En concreto, la invención se refiere a secuencias centrales epitópicas derivadas de las proteínas o los péptidos Cys.

Como se usa en la presente memoria, el término "que incorpora un epitopo o epitopos que son inmunológicamente de reacción cruzada con uno o más anticuerpos contra las proteínas de cristal" pretende referirse a un antígeno proteico o peptídico que incluye una estructura primaria, secundaria o terciaria similar a un epitopo localizado en una proteína o un polipéptido de cristal. El nivel de similitud será generalmente de un grado tal que los anticuerpos monoclonales o policlonales dirigidos contra la proteína o el polipéptido de cristal también se unan al, o reaccionen con el, o reconozcan de otro modo al, antígeno proteico o peptídico de reacción cruzada. Se pueden emplear diversos procedimientos de inmunoanálisis en conjunción con tales anticuerpos, tales como, por ejemplo, transferencia western, ELISA, RIA y similares, todos ellos conocidos por los expertos en la técnica.

La identificación de los epitopos inmunodominantes de Cry, y/o sus equivalentes funcionales, adecuados para ser usados en vacunas es algo relativamente sencillo. Por ejemplo, se pueden emplear los procedimientos de Hopp, como se enseña en la patente estadounidense 4.554.101, que muestra la identificación y la preparación de epitopos de secuencias aminoacídicas en base a la hidrofilidad. Los procedimientos descritos en otras varias publicaciones, y los programas informáticos basados en los mismos, también pueden ser usados para identificar secuencias centrales epitópicas (véase, p.ej., Jameson y Wolf, 1988; Wolf et al., 1988; patente estadounidense nº: 4.554.101). La secuencia aminoacídica de estas "secuencias centrales epitópicas" puede entonces ser fácilmente incorporada a los péptidos, bien a través de la aplicación de la síntesis de péptidos o de la tecnología de recombinación.

Los péptidos preferidos para ser usados según la presente invención estarán, generalmente, en el orden de aproximadamente 8 a aproximadamente 20 aminoácidos de longitud, y más preferiblemente, de aproximadamente 8 a aproximadamente 15 aminoácidos de longitud. Se propone que péptidos antigénicos más cortos derivados de proteínas de cristal proporcionarán ventajas en determinadas circunstancias, por ejemplo, en la preparación de ensayos de detección inmunológica. Los ejemplos de tales ventajas incluyen la facilidad de preparación y purificación, el coste relativamente bajo y la mejora en la reproducibilidad de la producción, así como ventajas de biodistribución.

Se propone la posibilidad de realizar determinadas ventajas de la presente invención a través de la preparación de péptidos sintéticos que incluyen secuencias centrales epitópicas/inmunogénicas modificadas y/o extendidas que dé como resultado un péptido epitópico "universal" dirigido a las proteínas de cristal, y en concreto, a las secuencias Cry y secuencias relacionadas con Cry. Estas secuencias centrales epitópicas son identificadas en la presente memoria en determinados aspectos como regiones hidrófilas del antígeno polipeptídico concreto. Se propone que estas regiones representan a aquéllas que son más propicias a promover la estimulación de células T y células B y, por consiguiente, a provocar la producción de anticuerpos específicos.

Una secuencia central epitópica, como se usa en la presente memoria, es un tramo relativamente corto de aminoácidos que es "complementario", y por lo tanto se unirá, a los sitios de unión a los antígenos de los anticuerpos dirigidos a proteínas de cristal revelados en la presente memoria. Adicional o alternativamente, una secuencia central específica es una secuencia que generará anticuerpos de reacción cruzada con los anticuerpos dirigidos contra las composiciones peptídicas de la presente invención. Se entenderá que en el contexto de la presente revelación, el término "complementario" se refiere a aminoácidos o péptidos que muestran una fuerza de atracción entre sí. De ese modo, ciertas secuencias centrales epitópicas de la presente invención pueden ser operativamente definidas en términos de su capacidad para competir con o, quizás, para desplazar la unión del antígeno proteico deseado con el correspondiente antisuero dirigido a la proteína.

En general, el tamaño del antígeno polipeptídico no se considera particularmente relevante, siempre y cuando sea al menos lo suficientemente largo para transportar la secuencia o las secuencias centrales identificadas. La secuencia central útil más pequeña anticipada por la presente revelación sería, generalmente, del orden de aproximadamente 8 aminoácidos de longitud, prefiriéndose las secuencias del orden de 10 a 20 aminoácidos. De ese modo, este tamaño corresponderá, en general, a los antígenos peptídicos más pequeños preparados según la invención. Sin embargo, el tamaño del antígeno puede ser mayor si se desea, siempre que contenga una secuencia central epitópica básica.

La identificación de las secuencias centrales epitópicas es conocida por los expertos en la técnica, por ejemplo, como se describe en la patente estadounidense 4.554.101, que enseña la identificación y la preparación de epitopos de secuencias aminoacídicas en base a la hidrofilidad. Además, hay numerosos programas informáticos disponibles para su uso en la predicción de porciones antigénicas de proteínas (véase, p.ej., Jameson y Wolf, 1988; Wolf et al., 1988). Los programas informáticos de análisis de secuencias peptídicas (p.ej., el programa DNAStar®, DNAStar, Inc., Madison, WI) también pueden ser útiles en el diseño de péptidos sintéticos según la presente revelación.

Las síntesis de secuencias epitópicas, o de péptidos que incluyan un epitopo antigénico dentro de su secuencia, se consigue fácilmente usando técnicas sintéticas convencionales tales como el procedimiento en fase sólida (p. ej., a través del uso de un sintetizador de péptidos comercialmente disponible tal como un Sintetizador de Péptidos Modelo 430A de Applied Biosystems). Los antígenos peptídicos sintetizados de esta manera pueden ser luego distribuidos en alícuotas de cantidades predeterminadas y almacenados mediante procedimientos convencionales, tales como en soluciones acuosas o, incluso más preferiblemente, en un polvo o un estado liofilizado en espera de ser usados.

En general, debido a la relativa estabilidad de los péptidos, éstos pueden ser fácilmente almacenados en soluciones acuosas durante períodos de tiempo bastante prolongados si se desea, p.ej., de hasta seis meses o más, en casi cualquier solución acuosa sin que se aprecie una degradación o una pérdida de la actividad antigénica. Sin embargo, cuando se contemple un almacenamiento acuoso prolongado, por lo general, será deseable incluir agentes que incluyan tampones tales como tampones de Tris o de fosfato para mantener un pH de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 7,5. Además, puede ser deseable incluir agentes que inhiban el crecimiento microbiano, tales como la azida de sodio o el mertiolato. Para un almacenamiento prolongado en un estado acuoso, será deseable almacenar las soluciones a aproximadamente 4ºC, o más preferiblemente, congeladas. Por supuesto, cuando los péptidos sean almacenados en un estado liofilizado o en polvo, éstos pueden ser almacenados casi indefinidamente, p.ej., en alícuotas medidas que puedan ser rehidratadas con una cantidad predeterminada de agua (preferiblemente destilada) o de tampón antes de su uso.

2.11 Composiciones de proteínas de cristal como insecticidas y procedimientos para su uso

Los inventores consideran que las composiciones de proteína de cristal reveladas en la presente memoria serán de particular utilidad como insecticidas para una aplicación tópica y/o sistémica en cultivos silvo-agrícolas, incluyendo pero no limitándose a arroz, trigo, maíz, soja, tabaco, patata, cebada, canola, centeno, avena, algodón, girasol; gramíneas, tales como pastos y gramíneas de césped; frutas, cítricos, frutos secos, árboles, arbustos y verduras; así como plantas ornamentales, cactus, suculentas y similares.

Se revela y se reivindica una composición que comprende una cantidad con actividad insecticida eficaz de una composición de proteína de cristal. La composición comprende preferiblemente la secuencia aminoacídica de CryET29 como se revela en la presente memoria o equivalentes biológicamente funcionales de la misma.

La composición insecticida también puede comprender una o más proteínas de cristal adicionales conocidas por los expertos en la técnica, tales como las descritas en las tablas 1 y 4 de la presente memoria.

El insecticida comprende una célula de B. thuringiensis, o un cultivo de estas células, o una mezcla de una o más células de B. thuringiensis que expresan una o más de las novedosas proteínas de cristal de la invención. En ciertos aspectos, puede ser deseable preparar composiciones que contengan una pluralidad de proteínas de cristal, bien nativas o modificadas, para el tratamiento de uno o más tipos de insectos susceptibles.

Los inventores consideran que se puede emplear cualquier procedimiento de formulación conocido por los expertos en la técnica, usando las proteínas reveladas en la presente memoria para preparar tales composiciones bioinsecticidas. Puede ser deseable formular preparaciones de células enteras, extractos celulares, suspensiones celulares, tejidos celulares homogeneizados, lisados celulares, sobrenadantes celulares, filtrados celulares o pellas celulares de un cultivo celular (preferiblemente, un cultivo celular bacteriano tal como un cultivo celular de B. thuringiensis descrito en la presente memoria) que exprese uno o más segmentos de ADN de cryET29 para producir la proteína o las proteínas o el péptido o los péptidos CryET29 codificados. Los procedimientos para preparar tales formulaciones son conocidos por los expertos en la técnica, y pueden incluir, p.ej., la desecación, liofilización, homogeneización, extracción, filtración, centrifugación, sedimentación o concentración de uno o más cultivos de células bacterianas, tales como las células de B. thuringiensis descritas en la tabla 3, que expresan el péptido o los péptidos CryET29 de interés.

En una realización preferida, la composición bioinsecticida comprende una suspensión fluible de aceite que comprende células bacterianas lisadas o sin lisar, esporas o cristales que contienen una o más de las novedosas proteínas de cristal reveladas en la presente memoria. Preferiblemente, las células son células de B. thuringiensis, sin embargo, se considera útil cualquiera de tales células huésped bacterianas que exprese los nuevos segmentos de ácido nucleico revelados en la presente memoria y que produzca una proteína de cristal, tal como de la especie Bacillus, incluyendo B. megaterium, B. subtilis; B. cereus; de la especie Escherichia, incluyendo E. coli y/o de la especie Pseudomonas, incluyendo P. cepacia, P. aeruginosa y P. fluorescens. Alternativamente, la suspensión fluible de aceite puede estar constituida por una combinación de una o más de las siguientes composiciones: células bacterianas lisadas o no lisadas, esporas, cristales y/o proteínas de cristal purificadas.

En una segunda realización preferida, la composición bioinsecticida comprende un gránulo o polvo dispersable en agua. Este gránulo o polvo puede comprender células bacterianas lisadas o sin lisar, esporas o cristales que contengan una o más de las novedosas proteínas de cristal reveladas en la presente memoria. Las fuentes preferidas de estas composiciones incluyen células bacterianas tales como células de B. thuringiensis. Sin embargo, también se consideran útiles las bacterias de los géneros Bacillus, Escherichia y Pseudomonas que hayan sido transformadas con un segmento de ADN revelado en la presente memoria y que expresen la proteína de cristal. Alternativamente, el gránulo o el polvo puede estar constituido por una combinación de una o más de las siguientes composiciones: células bacterianas lisadas o no lisadas, esporas, cristales y/o proteínas de cristal purificadas.

En una tercera realización importante, la composición bioinsecticida comprende un polvo humectante, un pulverizado, una emulsión, un coloide, una solución acuosa u orgánica, un polvo, un pella o un concentrado coloidal. Tal composición puede contener células bacterianas bien lisadas o sin lisar, esporas, cristales o extractos celulares como los descritos anteriormente que contengan una o más de las novedosas proteínas de cristal reveladas en la presente memoria. Las células bacterianas preferidas son células de B. thuringiensis, sin embargo, se consideran útiles bacterias tales como B. megaterium, B. subtilis, B. cereus, E. coli o células de la especie Pseudomonas transformadas con un segmento de ADN revelado en la presente memoria y que expresan la proteína de cristal. Tales formas secas de las composiciones insecticidas pueden ser formuladas para que se disuelvan inmediatamente al humedecerse, o alternativamente, para que se disuelvan con una liberación controlada, una liberación sostenida o de otra manera dependiente del tiempo. Alternativamente, tal composición puede estar constituida por una combinación de una o más de las siguientes composiciones: células bacterianas lisadas o no lisadas, esporas, cristales y/o proteínas de cristal purificadas.

En una cuarta realización importante, la composición bioinsecticida comprende una solución o una suspensión acuosa, o un cultivo celular de células bacterianas lisadas o no lisadas, esporas, cristales o una mezcla de células bacterianas lisadas o no lisadas, esporas y/o cristales tales como las descritas anteriormente que contienen una o más de las novedosas proteínas de cristal reveladas en la presente memoria. Tales soluciones o suspensiones acuosas pueden ser proporcionadas como una solución madre concentrada que sea diluida antes de su aplicación, o alternativamente, como una solución diluida lista para ser aplicada.

Para estos procedimientos que suponen la aplicación de células bacterianas, el huésped celular que contiene el gen o los genes de proteína de cristal puede ser cultivado en cualquier medio de nutrientes conveniente, en el que el constructo de ADN proporcione una ventaja selectiva, proporcionando un medio selectivo de manera que sustancialmente todas o todas las células conserven el gen de B. thuringiensis. Estas células pueden ser luego cosechadas según los procedimientos convencionales. Alternativamente, las células pueden ser tratadas antes de su cosecha.

Cuando las composiciones insecticidas comprenden células de B. thuringiensis, esporas y/o cristales que contienen la proteína o las proteínas de cristal modificadas de interés, tales composiciones pueden ser formuladas en una variedad de modos. Pueden ser empleadas como polvos humectantes, gránulos o polvos, mezclando con diversos materiales inertes, tales como minerales inorgánicos (filosilicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos y similares) o materiales botánicos (mazorcas de maíz en polvo, cáscaras de arroz, cáscaras de nuez y similares). Las formulaciones pueden incluir adyuvantes extendedores-adhesivos, agentes estabilizadores, otros aditivos pesticidas o tensioactivos. Las formulaciones líquidas pueden tener una base acuosa o no acuosa, y ser empleadas como espumas, suspensiones, concentrados emulsionantes o similares. Los ingredientes pueden incluir agentes reológicos, tensioactivos, emulsionantes, dispersantes o polímeros.

Alternativamente, las proteínas de cristal mutadas derivadas de la nueva CryET29 pueden ser preparadas mediante sistemas de expresión bacteriana nativa o recombinante in vitro y pueden ser aisladas para una posterior aplicación en el campo. Tal proteína puede estar bien en lisados celulares crudos, suspensiones crudas, coloides crudos, etc., o alternativamente, pueden ser purificadas, refinadas, tamponadas y/o procesadas más a fondo, antes de ser formuladas en una formulación biocida activa. Asimismo, en determinadas circunstancias, puede ser deseable aislar cristales y/o esporas de los cultivos bacterianos que expresan la proteína de cristal, y aplicar soluciones, suspensiones o preparaciones coloidales de tales cristales y/o esporas como la composición bioinsecticida activa.

Otro aspecto importante de la invención es un procedimiento para controlar los insectos coleópteros que son susceptibles a las nuevas composiciones reveladas en la presente memoria. Tal procedimiento comprende, en general, poner en contacto el insecto o la población de insectos, la colonia, etc. con una cantidad insecticidamente eficaz de una composición de proteína de cristal CryET29. El procedimiento puede utilizar proteínas de cristal CryET29 tales como las reveladas en SEQ ID Nº: 2 o equivalentes biológicamente funcionales de las mismas.

Alternativamente, el procedimiento puede utilizar una o más de las proteínas de cristal CryET29 que son codificadas por la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID Nº: 1, o por una o más secuencias de ácidos nucleicos que se hibridan con la secuencia de SEQ ID Nº: 1, en condiciones de un rigor moderado o más elevado. Los procedimientos para identificar las secuencias que se hibridan con las reveladas en condiciones de rigor moderado o más elevado son conocidos por los expertos en la técnica, y se tratan en la presente memoria.

Independientemente del procedimiento de aplicación, la cantidad de componente o componentes activos es aplicada en una cantidad insecticidamente eficaz que variará en función de factores tales como, por ejemplo, los insectos coleópteros específicos por ser controlados, la planta o el cultivo específico por ser tratado, las condiciones medioambientales, y el procedimiento, la velocidad y la cantidad de aplicación de la composición con actividad insecticida.

Las composiciones insecticidas descritas pueden ser elaboradas mediante la formulación de una suspensión de bien células bacterianas, cristal y/o esporas, o de un componente proteico aislado con el vehículo agrícolamente aceptable deseado. Las composiciones pueden ser formuladas antes de su administración en un medio apropiado tal como un medio liofilizado, criodesecado o disecado, o en un vehículo acuoso, un diluyente medio o adecuado, tal como una solución salina u otro tampón. Las composiciones formuladas pueden estar en la forma de un material en polvo o granular, o de una suspensión en aceite (vegetal o mineral), o en emulsiones de agua o aceite/agua, o como un polvo humectante o en combinación con cualquier otro material vehículo adecuado para una aplicación agrícola. Los vehículos adecuados agrícolamente pueden ser sólidos o líquidos, y son conocidos en la técnica. El término "vehículo agrícolamente aceptable" cubre todos los adyuvantes, p.ej., componentes inertes, dispersantes, tensioactivos, agentes de pegajosidad, aglutinantes, etc que son comúnmente usados en la tecnología de las formulaciones insecticidas; éstos son conocidos por los expertos en la formulación de insecticidas. Las formulaciones pueden ser mezcladas con uno o más adyuvantes sólidos o líquidos, y preparadas mediante diversos procedimientos, p.ej., mezclando o combinando y/o triturando homogéneamente la composición insecticida con los adyuvantes adecuados usando las técnicas de formulación convencionales.

Las composiciones insecticidas de esta invención son aplicadas en el entorno del insecto coleóptero diana, normalmente, sobre el follaje de la planta o del cultivo por proteger, mediante procedimientos convencionales, preferiblemente, mediante pulverización. La fuerza y la duración de la aplicación insecticida será establecida en función de las condiciones específicas de la plaga o las plagas particulares, del cultivo o de los cultivos por tratar y de las condiciones medioambientales concretas. La proporción entre el ingrediente activo y el vehículo dependerá, naturalmente, de la naturaleza química, de la solubilidad y de la estabilidad de la composición insecticida, así como de la formulación que se considere en concreto.

Hay otras técnicas de aplicación, p.ej., el espolvoreo, la aspersión, la humectación, la inyección en el suelo, el laboreo del suelo, el revestimiento de las semillas, el revestimiento de la planta de semillero, la pulverización, la aireación, la nebulización, la atomización y similares, que también son viables y pueden ser requeridas en determinadas circunstancias tales como, p.ej., contra insectos que causan la infección de la raíz o del tallo, o para la aplicación sobre vegetación delicada o plantas ornamentales. Estos procedimientos de aplicación son conocidos por los expertos en la técnica.

Las composiciones insecticidas de la invención pueden ser empleadas en el procedimiento de la invención individualmente o en combinación con otros compuestos, que incluyen pero no se limitan a, otros pesticidas. El procedimiento de la invención también puede ser usado en conjunción con otros tratamientos tales como con tensioactivos, detergentes, polímeros o formulaciones con liberación temporal. Las composiciones insecticidas de la presente invención pueden ser formuladas para un uso bien sistémico o tópico.

La concentración de composición insecticida que se usa para una aplicación ambiental, sistémica o foliar variará en función de la naturaleza de la formulación en particular, del medio de aplicación, de las condiciones medioambientales y del grado de actividad biocida. Normalmente, la composición bioinsecticida estará presente en la formulación aplicada a una concentración de al menos aproximadamente 1% en peso, y puede estar en una concentración de hasta aproximadamente el 99% en peso inclusive. Las formulaciones secas de las composiciones pueden ser del aproximadamente 1% al aproximadamente 99% o más en peso de la composición, mientras que las formulaciones líquidas pueden comprender, por lo general, del aproximadamente 1% al aproximadamente 99% o más de ingrediente activo en peso. Las formulaciones que comprenden células bacterianas intactas, generalmente, contendrán de aproximadamente 10^{4} a aproximadamente 10^{12} células/mg.

La formulación insecticida puede ser administrada en una planta en concreto o en una zona diana en una o más aplicaciones, según sea lo necesario, con una tasa típica de aplicación en campo por hectárea que varía en el orden de aproximadamente 1 g a aproximadamente 1 kg, 2 kg, 5 kg o más kg de ingrediente activo.

2.12 Composiciones farmacéuticas y procedimientos para el tratamiento contra las pulgas

Como la nueva proteína de cristal de la presente invención es la primera \delta-endotoxina de B. thuringiensis identificada que tiene actividad insecticida contra las pulgas, los inventores también consideran la formulación de composiciones farmacéuticas que puedan ser administradas a animales como profilaxis y/o tratamiento de la infección causada por las pulgas y, en concreto, de la infección causada por miembros del género Ctenocephalides, tales como Ctenocephalides felis (nombre común: pulga del gato) y C. canis (nombre común, pulga del perro). Aunque éstos son sólo dos de los miembros del orden Siphoneptera para los que las composiciones de la presente invención demuestran una actividad insecticida, se considera que las composiciones pueden ser útiles en el tratamiento de otros insectos relacionados que comúnmente atacan a animales, que también pueden ser controlados por las composiciones novedosas reveladas en la presente memoria. Tales insectos están descritos en la patente estadounidense nº: 5.449.681, e incluyen miembros del género Culex, Culiseta, Bovicola, Callitroga, Chrysops, Cimes, Ctenocephalis, Dermatophilus, Dermatobia y Damalinia entre otros.

Como tal, un aspecto de la invención comprende una composición farmacéutica que comprende una composición de proteína de cristal revelada en la presente memoria para su administración a un animal con el fin de evitar o reducir la infección producida por pulgas u otros insectos relacionados. En la presente memoria, también se revela y se reivindica un procedimiento para reducir tal infección de pulgas en un animal. En general, el procedimiento comprende administrar a un animal una cantidad insecticidamente eficaz de una composición de CryET29. Los procedimientos para administrar tales composiciones insecticidas a un animal son conocidos en la técnica. La patente estadounidense nº: 5.416.102 proporciona la enseñanza de procedimientos y formulaciones para evitar la infección por pulgas usando una composición insecticida.

Tales composiciones veterinarias contra los sifonápteros pueden ser administradas en una variedad de procedimientos en función de la aplicación concreta. Los ejemplos de los procedimientos para administrar las composiciones insecticidas a un animal son conocidos por los expertos en la técnica, e incluyen, p.ej., collares anti-pulgas, pulverizados anti-pulgas, baños desinfectantes, polvos y similares. Los procedimientos para proporcionar tales formulaciones a un animal son conocidos por los expertos en la técnica, e incluyen la aplicación directa o la aplicación pasiva tal como el dispositivo descrito en la patente estadounidense nº: 4.008.688 para la aplicación de insecticidas mediante un dispositivo de lecho para animales domésticos. El animal por ser tratado puede ser cualquier animal que sea sensible o susceptible al ataque o a la infección producida por una pulga, que es matada o inhibida mediante una composición de CryET29 como la revelada en la presente memoria. Tales animales pueden ser felinos, caninos, equinos, porcinos, lupinos, bovinos, murinos, etc y similares, aunque los inventores consideran que los animales felinos y caninos serán particularmente preferidos como los animales por ser tratados por las nuevas composiciones reveladas en la presente memoria.

Se considera también que, además de la administración tópica de las composiciones farmacéuticas reveladas, en algunos casos, puede ser preferible o deseable una administración sistémica. Para una administración oral, las composiciones pueden ser formuladas con un diluyente inerte o con un vehículo comestible asimilable, o pueden estar metidas en una cápsula de gelatina dura o de cubierta blanda, o pueden estar comprimidas en comprimidos, o pueden ser incorporadas directamente en los alimentos de la dieta. Para una administración terapéutica oral, los compuestos activos pueden ser incorporados con excipientes y usados en forma de comprimidos digestibles, comprimidos bucales, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares. Tales composiciones y preparaciones deberían contener al menos un 0,1% de compuesto activo. El porcentaje de las composiciones y las preparaciones puede, por supuesto, ser variado y puede estar convenientemente entre el aproximadamente 2 y el aproximadamente 6% del peso de la unidad. La cantidad de compuestos activos en tales composiciones terapéuticamente útiles es tal que se obtenga una dosificación adecuada.

Para la profilaxis oral contra las pulgas, la proteína de cristal puede ser incorporada con excipientes y usada en forma de gel, pasta, polvo, píldora, comprimido, cápsula o suspensión, que puede ser administrada al animal por ingestión. Alternativamente, las composiciones pueden ser formuladas como un aditivo de la comida, golosinas u otras formulaciones comestibles para animales domésticos. Cuando se formulan como un comprimido o una cápsula, o similares, la composición también puede contener lo siguiente: un aglutinante, tal como goma tragacant, acacia, maicena o gelatina; excipientes, tales como fosfato de dicalcio; un agente desintegrante, tal como almidón de maíz, almidón de patata, ácido algínico y similares; un lubricante, tal como estearato de magnesio; y un agente edulcorante, tal como sacarosa, lactosa o sacarina, o un agente aromatizante para hacer la composición más agradable para el animal que esté siendo tratado. Uno de tales medios para administrar los profilácticos contra las pulgas a un animal es una salsa como la descrita en la patente estadounidense nº: 4.702.914.

Cuando la forma de dosificación unitaria es una cápsula, ésta puede contener, además de los materiales del tipo anterior, un vehículo líquido. Pueden estar presentes otros diversos materiales como cubiertas o para modificar de otro modo la forma física de la unidad de dosificación. Por ejemplo, los comprimidos, las píldoras y las cápsulas pueden estar revestidas de laca, azúcar o ambas. Por supuesto, cualquier material usado en la preparación de cualquier forma unitaria de dosificación debería ser farmacéuticamente pura y sustancialmente no tóxica en las cantidades empleadas. Además, los compuestos activos pueden ser incorporados en preparaciones y formulaciones con liberación sostenida.

Alternativamente, las composiciones farmacéuticas reveladas en la presente memoria pueden ser administradas parenteral, intramuscular e incluso intraperitonealmente. Las soluciones de los compuestos activos como base libre o sales farmacéuticamente aceptables pueden ser preparadas en agua adecuadamente mezclada con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones también pueden ser preparadas en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos, y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos. Las formas farmacéuticas adecuadas para un uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas inyectables y polvos estériles para la preparación extemporánea de las soluciones o las dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida hasta el grado de que pueda ser fácilmente introducida en una jeringa. Debe ser estable en condiciones de fabricación y almacenamiento, y debe ser conservada contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o un medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (p.ej., glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares), mezclas adecuadas de los mismos y/o aceites vegetales. Es posible mantener una fluidez adecuada, por ejemplo, mediante el uso de una cubierta, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño requerido de partícula en el caso de las dispersiones y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos se puede conseguir mediante diversos agentes antibacterianos y fungicidas, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. Es posible conseguir la absorción prolongada de las composiciones inyectables mediante el uso en las composiciones de agentes retardadores de la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Cuando se desee una administración sistémica, p.ej., una administración parenteral en una solución acuosa, la solución debería ser adecuadamente tamponada si fuera necesario y el diluyente líquido primero convertido en isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas determinadas soluciones acuosas son especialmente adecuadas para una administración intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. A este respecto, los medios acuosos estériles que pueden ser empleados serán conocidos por los expertos en la técnica a la luz de la presente revelación. Se producirán necesariamente algunas variaciones en la dosificación en función del estado, el tamaño y el tipo del animal que esté siendo tratado. La persona responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la dosis apropiada para el sujeto en concreto. Además, para una administración humana, las preparaciones deberían cumplir las normas de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza según lo exigido por los principios biológicos de la FDA.

Las soluciones inyectables estériles son preparadas mediante la incorporación de los compuestos activos en la cantidad requerida a un disolvente apropiado con varios de los restantes ingredientes enumerados anteriormente, según lo requerido, seguida por una esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones se preparan mediante la incorporación de varios ingredientes activos esterilizados a un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y el resto de ingredientes requeridos entre los enumerados anteriormente. En el caso de los polvos estériles para la preparación de las soluciones inyectables estériles, los procedimientos preferidos de preparación son las técnicas de secado al vacío y de criodesecación que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier otro ingrediente deseado procedente de una solución anteriormente filtrada estéril del mismo.

Las composiciones reveladas en la presente invención pueden ser formuladas en una forma neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición ácida (formadas con grupos amino libres de la proteína) y que son formadas con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como ácido acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con grupos carboxilo libres también pueden estar derivadas de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, de potasio, de amonio, de calcio o férrico, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares. Al realizar la formulación, las soluciones serán administradas de una manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad tal que sea terapéuticamente eficaz. Las formulaciones son fácilmente administradas en una variedad de formas de dosificación tales como cremas, lociones, pulverizados, baños desinfectantes, emulsiones, coloides, o alternativamente, cuando se desee una administración sistémica, soluciones inyectables, cápsulas de liberación de fármacos y similares.

Como se usa en la presente memoria, "vehículo" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, vehículos, cubiertas, diluyentes, agentes antibacterianos y fungicidas, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, tampones, soluciones vehículo, suspensiones, coloides y similares. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional es incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. También se pueden incorporar a las composiciones ingredientes activos complementarios.

El término "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción alérgica o similarmente perjudicial cuando son administradas a un animal. La preparación de una composición acuosa que contenga una proteína como ingrediente activo es muy conocida en la técnica. Normalmente, tales composiciones son preparadas como inyectables, bien como soluciones o suspensiones líquidas; también se pueden preparar formas sólidas adecuadas para la disolución en, o la suspensión en, un líquido antes de su inyección. La preparación también puede estar emulsionada.

Otro aspecto de la invención engloba procedimientos y composiciones para ser usados en el control y la erradicación de insectos sifonápteros procedentes de zonas ambientales en las que se sospeche una infección por parte de tales insectos. El procedimiento supone, en general, la aplicación en una zona sospechosa de contener tales insectos de una cantidad insecticidamente eficaz de una composición de CryET29 como la revelada en la presente memoria. Los inventores consideran además el uso de la proteína de la presente invención como un ingrediente activo en una composición farmacéutica para ser administrada al cuerpo de o a las zonas y los lugares en los que habita un animal para evitar, atenuar o reducir la infección causada por pulgas e insectos relacionados en tales zonas. La composición de proteína de cristal puede ser formulada en forma de polvo, pulverizado, niebla, gránulo, enjuague, champú, collar anti-pulgas, baño, etc adecuada para ser administrada al cuerpo del animal o las dependencias en las que habita, los materiales de sus lechos, las casas, los jardines, las casetas de perros, las residencias para animales domésticos etc de tal animal usando técnicas que son conocidas por los expertos en la técnica de las formulaciones insecticidas veterinarias. En las enseñanzas de la patente estadounidense nº: 5.416.102, se encuentra un ejemplo de formulación oral de insecticidas veterinarios. Los inventores contemplan que el uso de tales composiciones en la prevención o la erradicación de pulgas en animales domésticos tales como perros, gatos y otros animales de pelo puede representar una avance significativo en el estado de la técnica considerando que las composiciones novedosas reveladas en la presente memoria son las primeras proteínas de cristal identificadas que tienen tal actividad insecticida deseable contra los sifonápteros.

2.12 Equivalentes biológicamente funcionales

Se pueden hacer modificaciones y cambios en la estructura de los péptidos de la presente invención y en los segmentos de ADN que los codifican, y seguir obteniendo una molécula funcional que codifique una proteína o un péptido con las características deseables. A continuación se trata la posibilidad de cambiar los aminoácidos de una proteína para crear una molécula de segunda generación, o incluso mejor, equivalente. En realizaciones particulares de la invención, se considera que las proteínas de cristal mutadas son útiles para aumentar la actividad insecticida de la proteína, aumentando, por consiguiente, la actividad insecticida y/o la expresión del transgén recombinante de una célula vegetal. Los cambios de los aminoácidos pueden lograrse cambiando los codones de la secuencia de ADN, según los codones ofrecidos en la tabla 2.

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Aminoácido	Codones
Alanina	Ala	A	GCA	GCC	GCG	GCU
Cisteína	Cys	C	UGC	UGU
Ácido aspártico	Asp	D	GAC	GAU
Ácido glutámico	Glu	E	GAA	GAG
Fenilalanina	Phe	F	UUC	UUU
Glicina	Gly	G	GGA	GGC	GGG	GGU
Histidina	His	H	CAC	CAU
Isoleucina	Ile	I	AUA	AUC	AUU
Lisina	Lys	K	AAA	AAG
Leucina	Leu	L	UUA	UUG	CUA	CUC	CUG	CUU
Metionina	Met	M	AUG
Asparagina	Asn	N	AAC	AAU
Prolina	Pro	P	CCA	CCC	CCG	CCU
Glutamina	Gln	Q	CAA	CAG
Arginina	Arg	R	AGA	AGG	CGA	CGC	CGG	CGU
Serina	Ser	S	AGC	AGU	UCA	UCC	UCG	UCU
Treonina	Thr	T	ACA	ACC	ACG	ACU
Valina	Val	V	GUA	GUC	GUG	GUU
Triptofano	Trp	W	UGG
Tirosina	Tyr	Y	UAC	UAU

Por ejemplo, ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos en una estructura proteica sin una pérdida apreciable de capacidad de unión interactiva con estructuras tales como, por ejemplo, las regiones de unión a antígenos de los anticuerpos o los sitios de unión sobre las moléculas del sustrato. Como es la capacidad interactiva y la naturaleza de una proteína lo que define esa actividad biológica funcional de la misma, se pueden hacer ciertas sustituciones en la secuencia aminoacídica de una secuencia proteica y, por supuesto, en su secuencia codificante de ADN subyacente, y obtener, sin embargo, una proteína con propiedades similares. De ese modo, los inventores consideran que es posible hacer diversos cambios en las secuencias peptídicas de las composiciones reveladas, o en las correspondientes secuencias de ADN que codifican dichos péptidos, sin que se produzca una pérdida apreciable de su utilidad o actividad biológica.

Al hacer tales cambios, se puede tener en cuenta el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice hidropático de los aminoácidos en la conferencia de una función biológica interactiva sobre una proteína es conocida en general en la técnica (Kyte y Doolittle, 1982). Se acepta que el carácter relativamente hidropático del aminoácido contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultante, que a su vez define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo, con enzimas, sustratos, receptores, ADN, anticuerpos, antígenos y similares.

Cada aminoácido tiene asignado un índice hidropático en base a su hidrofobicidad y sus características de carga (Kyte y Doolitle, 1982), y estos son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptofano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5).

Se sabe en la técnica que ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos que tengan un índice hidropático similar y seguir dando como resultado una proteína con una actividad biológica similar, i.e., seguir obteniendo una proteína con una funcionalidad biológica equivalente. Al hacer tales cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos son \pm2, siendo particularmente preferidos los que son \pm1, e incluso más particularmente preferidos, los que son \pm0,5.

También se conoce en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares puede hacerse eficazmente en base a la hidrofilidad. La patente estadounidense 4.554.101 expone que la hidrofilidad media local más grande de una proteína, determinada por la hidrofilidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con una propiedad biológica de la proteína.

Como se detalla en la patente estadounidense nº: 4.554.101, se han asignado los siguientes valores de hidrofilidad a los residuos de aminoácido: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (\pm 3,0 \pm 1); glutamato (\pm 3,0 \pm 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 \pm 1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptofano (-3,4).

Se entiende que un aminoácido puede ser sustituido por otro que tenga un valor de hidrofilidad similar, y seguir obteniendo una proteína biológicamente equivalente, y en concreto, una proteína inmunológicamente equivalente. En tales cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilidad son de \pm2, siendo particularmente preferida la sustitución de los de \pm1 e, incluso particularmente más preferida la de los de \pm0,5.

Como se esboza anteriormente, las sustituciones de aminoácidos se basan, por lo tanto, en general, en la similitud relativa de los sustituyentes de la cadena lateral de aminoácidos, por ejemplo, en cuanto a su hidrofobicidad, hidrofilidad, carga, tamaño y similares. Los ejemplos de sustituciones que tienen diversas de las características anteriores en consideración son conocidos por los expertos en la técnica e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina.

3. Breve descripción de las figuras

Las siguientes figuras forman parte de la presente memoria y se incluyen con el fin de demostrar a fondo ciertos aspectos de la presente invención. La invención puede comprenderse mejor refiriéndose a una o más de estas figuras en combinación con la descripción detallada de las realizaciones específicas presentadas en la presente memoria.

La fig. 1A y la fig. 1B muestran la secuencia de ácidos nucleicos del gen cryET29 (SEQ ID Nº: 1) y la correspondiente secuencia aminoacídica deducida de la proteína CryET29 (SEQ ID Nº: 2).

4. Descripción de las realizaciones ilustrativas

La presente invención proporciona una novedosa \delta-endotoxina, denominada CryET29, que es tóxica para las larvas de la pulga del gato, Ctenocephalides felis, así como contra insectos coleópteros tales como el gusano meridional y occidental de la raíz del maíz, el escarabajo de la patata, el escarabajo japonés y el gorgojo de la harina y el afrecho. Es importante destacar que el nombre trivial de Ctenocephalides felis es algo engañoso, pues el organismo no sólo es parásito de los felinos, sino que también es la principal pulga parasitaria de los caninos (véase, p.ej., la patente estadounidense nº: 4.547.360, incorporada específicamente en la presente memoria por referencia).

4.1 Sondas y cebadores de ADN de cryET29

En otro aspecto, la información de la secuencia de ADN proporcionada por los inventores permite la preparación de secuencias de ADN (o ARN) relativamente cortas que tienen la capacidad de hibridarse específicamente con secuencias génicas de los polinucleótidos seleccionados revelados en la presente memoria. En estos aspectos, las sondas de ácido nucleico de una longitud apropiada son preparadas en base a una consideración de una secuencia génica de proteína de cristal seleccionada, p.ej., una secuencia tal como la mostrada en SEQ ID Nº: 1. La capacidad de tales sondas de ácido nucleico para hibridarse específicamente con una secuencia génica codificante de las proteínas de cristal las confiere una particular utilidad en una variedad de realizaciones. Lo más importante es que las sondas pueden ser usadas en una variedad de análisis para la detección de la presencia de secuencias complementarias en una muestra dada.

En ciertas realizaciones, resulta ventajoso usar cebadores de oligonucleótido. La secuencia de tales cebadores se diseña usando un polinucleótido de la presente invención destinado a ser usado para detectar, amplificar o mutar un segmento definido de un gen de proteína de cristal de B. thuringiensis usando la tecnología PCR®. También es posible amplificar segmentos de genes relacionados de proteína de cristal de otras especies por PCR® usando tales cebadores.

4.2 Vectores de expresión

La presente invención contempla un vector de expresión que comprende un polinucleótido de la presente invención. De ese modo, en una realización, un vector de expresión es una molécula de ADN aislada y purificada que comprende un promotor operativamente ligado a una región codificante que codifica un polipéptido de la presente invención, cuya región codificante está operativamente ligada a una región de terminación de la transcripción, mediante la que el promotor conduce la transcripción de la región codificante.

Como se usa en la presente memoria, el término "operativamente ligado" significa que un promotor está conectado a una región codificante de un modo tal que la transcripción de esa región codificante es controlada y regulada por ese promotor. Los procedimientos para ligar operativamente un promotor a una región codificante son conocidos en la técnica.

En una realización preferida, la expresión recombinante de los ADN codificantes de las proteínas de cristal de la presente invención se produce, preferiblemente, en una célula huésped de Bacillus. Las células huésped preferidas incluyen B. thuringiensis, B. megaterium, B. subtilis, siendo muy preferidos los bacilos relacionados con células huésped de B. thuringiensis. Los promotores que funcionan en bacterias son conocidos en la técnica. Un ejemplo de promotor preferido para las proteínas de cristal de Bacillus incluye cualquiera de los promotores génicos conocidos de las proteínas de cristal, incluyendo el promotor del gen cryET29 y los promotores específicos para los factores sigma de B. thuringiensis, tales como \delta^{E} y \delta^{K} (para una revisión, véase Baum y Malvar, 1995). Alternativamente, se pueden modificar promotores génicos codificantes de proteínas de cristal mutagenizadas o recombinantes por la mano del hombre y usarlos para promover la expresión de los nuevos segmentos génicos revelados en la presente memoria.

En una realización alternativa, la expresión recombinante de los ADN codificantes de las proteínas de cristal de la presente invención se realiza usando una bacteria gram-negativa transformada tal como una célula huésped de E. coli o de la especie Pseudomonas. Los promotores que funcionan en una expresión de alto nivel de los polipéptidos diana en E. coli y otras células huésped gram-negativas también son conocidos en la técnica.

Cuando se vaya a usar un vector de expresión de la presente invención para transformar una planta, se selecciona un promotor que tenga la capacidad de conducir la expresión en plantas. Los promotores que funcionan en plantas también son conocidos en la técnica. Los promotores útiles en expresar el polipéptido en plantas son aquéllos que son inducibles, virales, sintéticos, constitutivos según se describe (Poszkowski et al., 1989; Odell et al., 1985) y temporalmente regulados, espacialmente regulados y espacio-temporalmente regulados (Chau et al., 1989).

Un promotor también es seleccionado por su capacidad para dirigir la actividad transcripcional de las células de la planta transformada o de la planta transgénica a la región codificante. Los genes estructurales pueden ser dirigidos por una variedad de promotores en los tejidos vegetales. Los promotores pueden ser casi constitutivos, tales como el promotor CaMV 35S, o promotores específicos del tejido o específicos del desarrollo que afecten a dicotiledóneas o monocotiledóneas.

Cuando el promotor es un promotor casi constitutivo tal como el CaMV 35S, se encuentran aumentos en la expresión polipeptídica en una variedad de tejidos de plantas transformadas (p.ej., callos, hoja, semilla y raíz). Alternativamente, los efectos de la transformación pueden ser dirigidos a tejidos vegetales específicos usando vectores de integración vegetales que contienen un promotor específico del tejido.

Un ejemplo de promotor específico del tejido es el promotor de la lectina, que es específico del tejido de las semillas. La proteína lectina de las semillas de soja está codificada por un único gen (Le1) que sólo se expresa durante la maduración de la semilla y representa del aproximadamente 2 al aproximadamente 5% del ARNm total de la semilla. El gen lectina y el promotor específico de la semilla han sido completamente caracterizados y usados para dirigir la expresión específica de la semilla en las plantas transgénicas de tabaco (Vodkin et al., 1983; Lindstrom et al.,
1990).

Un vector de expresión que contiene una región codificante que codifica un polipéptido de interés es modificado para que esté bajo el control del promotor de la lectina, y ese vector es introducido en plantas usando, por ejemplo, un procedimiento de transformación de protoplastos (Dhir et al., 1991). La expresión del polipéptido está específicamente dirigida a las semillas de la planta transgénica.

Una planta transgénica de la presente invención producida a partir de una célula vegetal transformada con un promotor específico del tejido puede ser cruzada con una segunda planta transgénica desarrollada a partir de una célula vegetal transformada con un promotor específico del tejido diferente para producir una planta transgénica híbrida que muestre los efectos de la transformación en más de un tejido específico.

Los ejemplos de promotores específicos del tejido son la sintetasa 1 de la sacarosa del maíz (Yang et al., 1990), la deshidrogenasa 1 del alcohol del maíz (Vogel et al., 1989), el complejo de recolección ligera del maíz (Simpson, 1986), la proteína de choque térmico del maíz (Odell et al., 1985), la carboxilasa de la subunidad pequeña RuBP del guisante (Poulsen et al., 1986; Cashmore et al., 1983), la manopina sintasa del plásmido Ti (Langridge et al., 1989), la nopalina sintasa del plásmido Ti (Langridge et al., 1989), la chalcona isomerasa de la petunia (Van Tunen et al., 1988), la proteína I rica en glicina de la alubia (Keller et al., 1989), el transcripto de CaMV 35s (Odell et al., 1985) y la patatina de la patata (Wenzler et al., 1989). Los promotores preferidos son el promotor del virus del mosaico de la coliflor (CaMV 35S) y el promotor de la carboxilasa de la subunidad pequeña RuBP de S-E9.

La elección de qué vector de expresión y, en última instancia, de a qué promotor se liga operativamente una región codificante del polipéptido depende directamente de las propiedades funcionales deseadas, p.ej., de la localización y la planificación de la expresión proteica, y de la célula huésped por trasformar. Éstas son limitaciones conocidas inherentes a la técnica de construir moléculas de ADN recombinante. Sin embargo, un vector útil en poner en práctica la presente invención es capaz de dirigir la expresión de la región codificante del polipéptido al que está ligado operativamente.

Los vectores típicamente útiles para la expresión de los genes en plantas superiores son conocidos en la técnica e incluyen los vectores derivados del plásmido inductor de tumores (Ti) de Agrobaterium tumefaciens descrito (Rogers et al., 1987). Sin embargo, se conocen otros varios sistemas de vectores de integración de plantas para funcionar en plantas que incluyen el vector de control de la transferencia pCaMVCN descrito (Fromm et al., 1985). El plásmido pCaMVCN (disponible en Pharmacia. Piscataway, NJ) incluye el promotor del virus del mosaico de la coliflor CaMV 35S.

En realizaciones preferidas, el vector usado para expresar el polipéptido incluye un marcador de selección que es eficaz en una célula vegetal, preferiblemente, un marcador de selección de la resistencia a fármacos. Un marcador de la resistencia a fármacos preferido es el gen cuya expresión da como resultado una resistencia a la kanamicina, i.e., el gen quimérico que contiene el promotor de la nopalina sintasa, la fosfotransferasa II de la neomicina Tn5 (nptII) y la región no traducida 3' de la nopalina sintasa (Rogers et al.,1988).

La polimerasa de ARN transcribe una secuencia de ADN codificante a través de un sito en el que ocurre la poliadenilación. Normalmente, las secuencias de ADN localizadas a unos cuantos ciento de pares de bases corriente abajo del sitio de poliadenilación sirven para terminar la transcripción. Esas secuencias de ADN son denominadas en la presente memoria regiones de terminación de la transcripción. Esas regiones son necesarias para una poliadenilación eficaz del ARN mensajero transcrito (ARNm).

Los procedimientos para preparar vectores de expresión son conocidos en la técnica. La expresión (los vectores de transformación) usada para transformar plantas y los procedimientos para elaborar esos vectores son descritos en las patentes estadounidenses nº: 4.971.908; 4.940.835; 4.769.061 y 4.757.011. Esos vectores pueden ser modificados para que incluyan una secuencia codificante según la presente invención.

Se ha desarrollado una variedad de procedimientos para enlazar operativamente ADN a los vectores mediante terminales cohesivos complementarios o extremos romos. Por ejemplo, se puede añadir tractos de homopolímeros complementarios a un segmento de ADN que vaya a ser insertado y al ADN del vector. Entonces se unen el vector y el segmento de ADN mediante enlace por puente de hidrógeno entre las colas homopoliméricas complementarias para formar las moléculas de ADN recombinante.

Una región codificante que codifique un polipéptido que tenga la capacidad de conferir actividad insecticida a una célula es, preferiblemente, un gen codificante de la proteína de cristal de B. thuringiensis CryET29. En realizaciones preferidas, tal polipéptido tiene la secuencia de residuos aminoacídicos de SEQ ID Nº: 2, o un equivalente funcional de esta secuencia. Según tales realizaciones, también se prefiere una región codificante que comprenda la secuencia de ADN de la SEQ ID Nº: 1.

4.3 Características de la proteína de cristal CryET29

La presente invención proporciona nuevos polipéptidos que definen toda o una parte de una proteína de cristal CryET29 de B. thuringiensis.

En una realización preferida, la invención revela y reivindica una proteína CryET29 aislada y purificada. La proteína CryET29 comprende una secuencia aminoacídica como la revelada en SEQ ID Nº: 2. La CryET29 tiene una constante isoeléctrica calculada (pI) igual a 5,88. En la tabla 3, se ofrece la composición aminoacídica de la proteína CryET29.

TABLA 3 Composición aminoacídica de CryET29

Aminoácido	# residuos	% total	Aminoácido	# residuos	% total
Ala	18	7,7	Leu	13	5,6
Arg	7	3,0	Lys	16	6,9
Asn	15	6,4	Met	4	1,7
Asp	15	6,4	Phe	12	5,1
Cys	1	0,4	Pro	6	2,5
Gln	15	6,4	Ser	16	6,9
Glu	10	4,3	Thr	17	7,3
Gly	5	2,1	Trp	2	0,8
His	3	1,2	Tyr	10	4,3
Ile	20	8,6	Val	26	11,2

Ácido	(Asp + Glu)	25	10,7
Básico	(Arg + Lys)	23	9,9
Aromático	(Phe + Trp +Tyr)	24	10,2
Hidrófobo	(Aromático + Ile +Leu +Met + Val)	87	37,3

4.4 Células vegetales transformadas o transgénicas

También se contempla una bacteria, una célula de levadura, una célula vegetal o una planta transformada con un vector de expresión de la presente invención. Además se contempla una bacteria, una célula de levadura, una célula vegetal o una planta transgénica derivada de tal célula transformada o transgénica. Los procedimientos para transformar bacterias y células de levadura son conocidos en la técnica. Normalmente, los procedimientos de transformación son similares a aquéllos procedimientos conocidos para transformar otras bacterias o levadura tales como E. coli o Saccharomyces cerevisiae.

Los procedimientos para la transformación del ADN de células vegetales incluyen la transformación de plantas mediada por el género Agrobacterium, la transformación de protoplastos, la transferencia de genes al polen, la inyección en órganos reproductores, la inyección en embriones inmaduros y el bombardeo de partículas. Cada uno de estos procedimientos tiene distintas ventajas y desventajas. De ese modo, un determinado procedimiento para introducir genes en una determinada cepa vegetal puede que no sea necesariamente el más eficaz para otra cepa vegetal, pero sí se conocen cuáles son los procedimientos útiles para una determinada cepa vegetal.

Por ejemplo, las patentes estadounidenses nº: 5.538.880 y 5.538.877, concedidas a Lundquist y Walters, revelan procedimientos basados en microproyectiles para preparar maíz transgénico fértil. La patente estadounidense 5.530.193 concedida a Clark et al. revela un procedimiento para producir maíz transgénico resistente a los virus. En la patente estadounidense nº: 5.633.435 concedida a Barry et al., se revelan procedimientos para hacer plantas transgénicas que contienen ADN exógenos (tales como genes resistentes a herbicidas). La patente estadounidense nº: 5.563.055 concedida a Thomas y Townsend revela un procedimiento para fabricar soja transgénica usando la transformación mediada por el género Agrobacterium. La solicitud de patente internacional publicada nº: WO 9527068 de Beach et al. revela procedimientos para fabricar semillas de plantas que han sido genéticamente modificadas para expresar una proteína preseleccionada. La generación de plantas de soja transgénicas mediante electroporación de protoplastos derivados de cotiledones se describe en Dhir y Widholm en la solicitud de patente internacional publicada nº: WO 9217598.

El género Agrobacterium también ha sido usado por Chee et al. para transformar con éxito células meristemáticas o de mesocotilo que germinan indiferenciadamente (las patentes estadounidenses nº: 5.169.770 y 5.376.543; y el documento WO 8905859). La patente estadounidense nº: 5.597.718 concedida a Brill et al., la patente estadounidense nº: 5.521.078 concedida a Maliyakal, y la patente estadounidense nº: 5.474.925 concedida a Barton y Maliyakal revelan diversos procedimientos para la producción de algodón transgénico. La solicitud de patente internacional publicada nº: WO 9640924 de McBride et al. describe constructos de ADN que son útiles en la preparación de algodón transgénico. Se han descrito factores de transcripción de tejido específico de ovario para la transformación de plantas con el fin de dirigir la producción específica de tejidos de proteínas heterológas en algodón transgénico (solicitud de patente internacional publicada nº: WO 9626639 de Martineau y Martineau, 1996).

La patente estadounidense nº: 5.349.126 concedida a Chappell et al. describe procedimientos para producir plantas transgénicas tales como tomate, alfalfa, cebada, zanahoria y tabaco que tienen una mayor resistencia a los insectos. Fry y Zhou (patente estadounidense nº: 5.631.152) revelan un sistema rápido de regeneración por transformación para obtener trigo transformado fértil. Fry y Zhou (solicitud de patente europea publicada nº: EP 709462; 1996) describen la producción de plantas monocotiledóneas transgénicas tales como el trigo mediante la trasformación de tejido regenerable o callos embriogénicos con un ADN foráneo. La patente estadounidense nº: 5.612.487, concedida a Arntzen y Larn, describe la producción de tabaco transgénico anti-viral. Merikke et al (patente estadounidense nº: 5.589.625) describe la producción de plantas transgénicas (tales como el tabaco y la patata) que expresan la resistencia a múltiples virus. El procedimiento supone la producción de plantas transgénicas que comprenden la actividad de la 2,5 alfa sintetasa recombinante. La patente estadounidense nº: 5.422.108, concedida a Fitzmaurice y Mirkov, describe la producción de plantas (incluyendo el tabaco transgénico) resistentes a patógenos bacterianos del género Agrobacterium, Pseudomonas, Xanthomonas, Erwinia y Clavibacter.

Kauppinen et al. (solicitud de patente internacional publicada nº: WO 9526628, 1995) revela un procedimiento de generación de plantas de cebada transgénicas fértiles usando protoplastos aislados de microesporas. Chang et al. (solicitud de patente internacional publicada nº: WO 9413822, 1994) describen la producción de plantas de trigo fértiles establemente transformadas mediante el bombardeo de tejido de trigo con ADN para desarrollar variedades de trigo de alta productividad, alto valor nutricional y resistentes a enfermedades. La solicitud de patente internacional publicada nº: WO 9318168 de Eyal et al. (1993) revela la producción de trigo transgénico que contiene ADN foráneo usando soluciones de ADN acuosas aplicadas a estigmas polinizados de flósculos de plantas emasculadas antes de la fertilización. La patente estadounidense nº: 5.405.765 y la solicitud de patente internacional publicada nº: WO 9304178 de Vasil y Vasil (1992) revelan la producción de plantas de trigo transgénico usando la administración de ADN a callos embrionarios de tipo C para permitir la expresión de genes clonados (p.ej., resistencia a herbicidas) en la planta transformada.

Mientras que hay muchos procedimientos para introducir los segmentos de ADN transformado en las células, no todos ellos han demostrado ser adecuados para la administración de ADN a células vegetales. Sin embargo, se cree que los procedimientos adecuados incluyen casi cualquier procedimiento mediante el que se puede introducir ADN en una célula, tal como por infección por Agrobacterium, la administración directa del ADN tal como, por ejemplo, mediante la transformación mediada por PEG de protoplastos (Omirulleh et al., 1993), mediante la reabsorción de ADN mediada por desecación/inhibición, mediante electroporación, mediante agitación con fibras de carburo de silicio, mediante la aceleración de partícula cubiertas con ADN, etc. En ciertas realizaciones, se prefieren los procedimientos de aceleración e incluyen, por ejemplo, el bombardeo de microproyectiles y similares.

La tecnología para introducir ADN en las células es conocida por los expertos en la técnica. Se han descrito cuatro procedimientos generales para administrar un gen a las células: (1) procedimientos químicos (Graham y van der Eb, 1973; Zatloukal et al., 1992); (2) procedimientos físicos tales como la microinyección (Capecchi, 1980), la electroporación (Wong y Neumann, 1982: Fromm et al., 1985) y el acelerador de partículas (Johnston y Tang, 1994; Fynan et al., 1993); (3) vectores virales (Clapp, 1993); Lu et al., 1993; Eglitis y Anderson, 1988a; 1988b); y (4) mecanismos mediados por receptores (Curiel et al., 1991; 1992; Wagner et al., 1992).

4.4.1 Electroporación

La aplicación de breves pulsos eléctricos de alto voltaje a una variedad de células animales y vegetales conduce a la formación de poros de tamaño nanométrico en la membrana plasmática. El ADN es llevado directamente al interior del citoplasma celular bien a través de estos poros o como consecuencia de la redistribución de los componentes de la membrana que acompaña al cierre de los poros. La electroporación puede ser extremadamente eficaz y puede ser usada tanto para una expresión transitoria de genes clónicos como para el establecimiento de líneas celulares que transporten copias integradas del gen de interés. La electroporación, en contraste con la trasfección mediada por el fosfato de calcio y la fusión de protoplastos, habitualmente da origen a líneas celulares que llevan una, o a lo sumo unas cuantas, copias integradas del ADN foráneo.

La introducción de ADN mediante la electroporación es conocida por los expertos en la técnica. En este procedimiento, se emplean ciertas enzimas degradantes de la pared celular, tales como las enzimas degradantes de la pectina, para volver las células receptoras diana más susceptibles a ser transformadas por electroporación que las células sin tratar. Alternativamente, las células receptoras se hacen más susceptibles a la transformación, por heridas mecánicas. Para efectuar la transformación por electroporación se pueden emplear bien tejidos friables tales como un cultivo de células en suspensión o callos embrionarios, o alternativamente, se pueden transformar directamente embriones inmaduros u otros tejidos organizados. Se degradarían parcialmente las paredes celulares de las células seleccionadas exponiéndolas a enzimas degradantes de la pectina (pectoliasas) o mediante heridas mecánicas de una manera controlada. Tales células serían entonces receptoras del ADN transferido por electroporación, que puede llevarse a cabo en esta etapa, y las células transformadas pueden ser entonces identificadas mediante un protocolo de selección o rastreo adecuado en función de la naturaleza del ADN recién incorporado.

4.4.2 Bombardeo de microproyectiles

Otro procedimiento ventajoso para administrar segmentos de ADN transformantes a células vegetales es el bombardeo de microproyectiles. En este procedimiento, las partículas pueden ser revestidas con ácidos nucleicos y administradas a las células mediante una fuerza de propulsión. Los ejemplos de partículas incluyen las comprendidas por tungsteno, oro, platino y similares.

Una de las ventajas del bombardeo de microproyectiles, además de ser un procedimiento eficaz de transformación reproduciblemente estable de monocotiledóneas, es que no se requiere ni el aislamiento de los protoplastos (Cristou, et al., 1988) ni la susceptibilidad a la infección por Agrobacterium. Una realización ilustrativa de un procedimiento para la administración de ADN en células de maíz mediante aceleración es un Sistema de Administración de Partículas Biolistics, que puede ser usado para propulsar partículas revestidas con ADN o células a través de una criba, tal como una criba de acero inoxidable o Nytex, sobre una superficie filtrante cubierta con células de maíz cultivadas en suspensión. Esta criba dispersa las partículas de manera que no son administradas a las células receptoras en grandes agregados. Se cree que la colocación de una criba entre el aparato de proyectiles y las células por ser bombardeadas reduce el tamaño del agregado de proyectiles y puede contribuir a una mayor frecuencia de transformación mediante la reducción del daño producido en las células receptoras por los proyectiles que son demasiado grandes.

Para el bombardeo, las células en suspensión son preferiblemente concentradas sobre filtros o un medio de cultivo sólido. Alternativamente, los embriones inmaduros u otras células diana pueden ser dispuestos sobre el medio de cultivo sólido. Las células por ser bombardeadas son colocadas a una distancia apropiada por debajo de la placa que detiene los proyectiles. Si se desea, también se pueden colocar una o más cribas entre el dispositivo de aceleración y la células por ser bombardeadas. A través del uso de técnicas expuestas en la presente memoria, se pueden obtener hasta 1.000 o más focos de células que expresen transitoriamente un gen marcador. El número de células de un foco que expresa el producto génico exógeno 48 horas después del bombardeo habitualmente varía de 1 a 10 y una media de 1 a 3.

En la transformación por bombardeo, se pueden optimizar las condiciones de cultivo anteriores al bombardeo y los parámetros del bombardeo para producir los máximos números de transformantes estables. Tanto los parámetros físicos como biológicos del bombardeo son importantes en esta tecnología. Los factores físicos son aquéllos que participan en la manipulación del precipitado de ADN/microproyectiles o aquéllos que afectan a la trayectoria y la velocidad bien de los macroproyectiles o de los microproyectiles. Los factores biológicos incluyen todas las etapas implicadas en la manipulación de las células antes e inmediatamente después del bombardeo, el ajuste osmótico de las células diana para ayudar a calmar los traumas asociados con el bombardeo y también la naturaleza del ADN transformante, tal como ADN linealizado o plásmidos de supercoloides intactos. Se cree que las manipulaciones anteriores al bombardeo son especialmente importantes para una correcta transformación de los embriones inmaduros.

Por consiguiente, está contemplado que es posible desear ajustar diversos parámetros del bombardeo en estudios a pequeña escala para optimizar las condiciones por completo. Se puede desear en concreto ajustar los parámetros físicos tales como la distancia entre huecos, la distancia de la trayectoria, la distancia entre tejidos y la presión del helio. También se pueden minimizar los factores de reducción de traumas (TRF, Trauma Reduction Factors) modificando las condiciones que influyen en el estado fisiológico de las células receptoras y que, por lo tanto, pueden influir en la eficacia de la transformación y de la integración. Por ejemplo, el estado osmótico, la hidratación de tejido y la etapa de subcultivo o el ciclo celular de las células receptoras pueden ser ajustados para conseguir una transformación óptima. La ejecución del resto de parámetros rutinarios será conocida por los expertos en la técnica a la luz de la presente revelación.

4.4.3 Transferencia mediada por el género Agrobacterium

La transferencia mediada por el género Agrobacterium es un sistema ampliamente aplicable para introducir genes en células vegetales, porque el ADN puede ser introducido en los tejidos de plantas enteras, evitando así la necesidad de regenerar una planta intacta desde un protoplasto. El uso de vectores de integración vegetal mediada por el género Agrobacterium para introducir ADN en células vegetales es conocido en la técnica. Véanse, por ejemplo, los procedimientos descritos (Fraley et al., 1985; Rogers et al., 1987). Además, la integración del ADN de Ti es un procedimiento relativamente preciso que resulta en unas cuantas redisposiciones. La región de ADN por transferir está definida por las secuencias limitantes, y el ADN intercalado es normalmente insertado en el genoma de la planta como se describe (Spielmann et al., 1986; Jorgensen et al., 1987).

Los vectores modernos de transformación de Agrobacterium son capaces de replicarse en E. coli, así como en Agrobacterium, permitiendo las manipulaciones convenientes según lo descrito (Klee et al., 1985). Además, los avances tecnológicos recientes en vectores destinados a la transferencia de genes mediados por Agrobacterium han mejorado la disposición de los genes y los sitios de restricción en los vectores para facilitar la construcción de vectores capaces de expresar diversos genes codificantes de polipéptidos. Los vectores descritos (Rogers et al., 1987) tienen regiones multi-ligadoras convenientes flanqueadas por un promotor y un sitio de poliadenilación para la expresión directa de los genes codificantes de polipéptidos insertados y son adecuados para los presentes objetivos. Además, el género Agrobacterium, que contiene genes de Ti tanto armados como desarmados, puede ser usado para las transformaciones. En aquellas cepas vegetales en las que la transformación mediada por Agrobacterium sea eficaz, es el procedimiento de elección, debido a la naturaleza simplista y definida de la transferencia de genes.

La transformación mediada por Agrobacterium de discos de hoja y otros tejidos tales como cotiledones e hipocotilos parece limitarse a las plantas que el género Agrobacterium infecta de manera natural. La transformación medida por Agrobacterium es más eficaz en plantas dicotiledóneas. Pocas son las monocotiledóneas que parecen ser huéspedes naturales de Agrobacterium, aunque se han producido plantas transgénicas de espárrago usando vectores de Agrobacterium según lo descrito (Bytebier et al., 1987). Por lo tanto, los granos de cereales de importancia comercial tales como el arroz, el maíz y el trigo habitualmente deben ser transformados usando procedimientos alternativos. Sin embargo, como se menciona anteriormente, también se puede lograr la transformación del espárrago usando el género Agrobacterium (véase, por ejemplo, Bytebier et al., 1987).

Una planta transgénica formada usando procedimientos de transformación con Agrobacterium normalmente contiene un único gen o un cromosoma. Tales plantas transgénicas pueden ser denominadas heterocigóticas para el gen añadido. Sin embargo, dado que el uso de la palabra "heterocigótico" normalmente implica la presencia de un gen complementario en el mismo locus del segundo cromosoma de un par de cromosomas, y que tal gen no está en una planta que contiene un gen añadido como aquí, se cree que sería más exacto denominar a tal planta "segregante independiente", porque el gen exógeno añadido se segrega independientemente durante la mitosis y la meiosis.

Lo más preferible es una planta transgénica que sea homocigótica para el gen estructural añadido; i.e., una planta transgénica que contenga dos genes añadidos, un gen en el mismo locus de cada cromosoma de un par de cromosomas. Una planta transgénica homocigótica puede ser obtenida apareando sexualmente (autofecundando) una planta transgénica segregante independiente que contenga un único gen añadido, germinando algunas de las semillas producidas y analizando las plantas resultantes producidas en cuanto al aumento de la actividad de la carboxilasa en relación con un control (nativo, no transgénico) o una planta transgénica segregante independiente.

También se entenderá que es posible aparear dos plantas transgénicas diferentes para producir vástagos que contengan dos genes exógenos añadidos segregantes independientes. La autofecundación de la progenie apropiada puede producir plantas que son homocigóticas para ambos genes exógenos añadidos que codifican un polipéptido de interés. También se consideran el retrocruzamiento con una planta parental y el intercruzamiento con una planta no transgénica.

Se puede conseguir la transformación de protoplastos vegetales usando procedimientos basados en la precipitación del fosfato de calcio, el tratamiento con polietilenglicol, la electroporación y las combinaciones de estos tratamientos (véase, p.ej., Potrykus et al., 1985; Lorz et al., 1985; Fromm et al., 1985; Uchimiya et al., 1986; Callis et al., 1987; Marcotte et al., 1988).

La aplicación de estos sistemas a distintas cepas vegetales depende de la capacidad de regeneración de esa determinada cepa vegetal a partir de protoplastos. Hay procedimientos ilustrativos para la regeneración de cereales a partir de protoplastos según lo descrito (Fujimura et al., 1985; Toriyama et al., 1986; Yamada et al., 1986; Abdullah et al., 1986).

Para transformar cepas vegetales que no pueden ser regeneradas satisfactoriamente desde protoplastos, se pueden utilizar otros procedimientos para introducir el ADN en las células o los tejidos intactos. Por ejemplo, se puede efectuar la regeneración de cereales a partir de embriones inmaduros o explantos según lo descrito (Vasil, 1988). Además, se puede utilizar la tecnología de "acelerador de partículas" o la de microproyectiles a alta velocidad (Vasil, 1992).

Usando esta tecnología, el ADN es llevado a través de la pared celular y dentro del citoplasma sobre la superficie de pequeñas partículas metálicas según lo descrito (Klein et al., 1987; Klein et al., 1988; McCabe et al., 1988). Las partículas metálicas penetran a través de varias capas de células, permitiendo así la transformación de las células de los explantos tisulares.

4.5 Procedimientos para producir plantas transgénicas resistentes a insectos

Al transformar una célula huésped adecuada, tal como una célula vegetal, con un segmento que contiene el gen cryET29 recombinante, la expresión de la proteína de cristal codificada (i.e., una proteína o un polipéptido de cristal bacteriano que tiene una actividad insecticida contra los coleópteros) puede resultar en la formación de plantas resistentes a insectos.

A modo de ejemplo, se puede utilizar un vector de expresión que contenga una región codificante para una proteína de cristal de B. thuringiensis y un marcador seleccionable apropiado para transformar una suspensión de células vegetales embrionarias, tales como células de trigo o de maíz, usando un procedimiento tal como el bombardeo de partículas (Maddock et al., 1991; Vasil et al., 1992) con el fin de administrar ADN revestido sobre microproyectiles a las células receptoras. Las plantas transgénicas son entonces regeneradas a partir de callos embrionarios transformados que expresan las proteínas insecticidas.

La formación de plantas transgénicas también puede conseguirse usando otros procedimientos de transformación de células que son conocidos en la técnica tales como la transferencia de ADN mediada por Agrobacterium (Fraley et al., 1983). Alternativamente, se puede introducir el ADN en plantas mediante la transferencia directa del ADN al polen (Zhou et al., 1983; Hess, 1987; Luo et al., 1988), mediante la inyección del ADN en los órganos reproductores de una planta (Pena et al., 1987) o mediante la inyección directa del ADN en las células de embriones inmaduros seguida por la rehidratación de embriones disecados (Neuhaus et al., 1987; Benbrook et al., 1986).

La regeneración, el desarrollo y el cultivo de plantas a partir de transformantes sencillos de protoplastos vegetales o de diversos explantos transformados son conocidos en la técnica (Weissbach y Weissbach, 1988). Esta regeneración y este proceso de crecimiento normalmente incluyen las etapas de seleccionar las células transformadas, cultivar esas células individualizadas a lo largo de las etapas habituales del desarrollo embrionario mediante la etapa de plántula arraigada. Los embriones y las semillas transgénicos se regeneran de forma similar. Después de ello, los brotes arraigados transgénicos resultantes son plantados en un medio de crecimiento vegetal adecuado tal como el suelo.

Se puede lograr el desarrollo o la regeneración de plantas que contengan el gen exógeno foráneo que codifique un polipéptido de interés introducido por Agrobacterium desde explantos de hoja a través de procedimientos conocidos en la técnica tales como los descritos (Horsch et al., 1985). En este procedimiento, los transformantes son cultivados en presencia de una agente de selección y en un medio que induzca a la regeneración de los brotes en la cepa vegetal que está siendo transformada, según lo descrito (Fraley et al., 1983).

Este procedimiento normalmente produce brotes en dos a cuatro meses, y esos brotes son luego transferidos a un medio inductor de raíces apropiado que contenga el agente selectivo y un antibiótico para evitar el crecimiento bacteriano. Los brotes que arraigan en presencia del agente selectivo para formar plántulas son luego transplantados al suelo o a otros medios para permitir la producción de raíces. Estos procedimientos varían en función de la cepa vegetal empleada en concreto, siendo tales variaciones conocidas en la técnica.

Preferiblemente, las plantas regeneradas son auto-polinizadas para proporcionar plantas transgénicas homocigóticas, como se trata anteriormente. Aparte de eso, el polen obtenido de las plantas regeneradas es cruzado con plantas cultivadas a partir de semilla de líneas preferiblemente endogámicas agronómicamente importantes. A la inversa, el polen procedente de las plantas de esas líneas importantes es usado para polinizar plantas regeneradas. Una planta transgénica de la presente invención que contiene un polipéptido deseado es cultivada usando los procedimientos conocidos por los expertos en la técnica.

Una planta transgénica de esta invención tiene, de ese modo, una mayor cantidad de una región codificante (p.ej., un gen cry) que codifica el polipéptido Cry de interés. Una planta transgénica preferida es un segregante independiente y puede transmitir ese gen y su actividad a su progenie. Una planta transgénica más preferida es homocigótica para ese gen y transmite ese gen a todos sus vástagos mediante un apareamiento sexual. La semilla de una planta transgénica puede ser cultivada en el campo o en un invernadero, y las plantas transgénicas sexualmente maduras resultantes son auto-polinizadas para generar plantas genéticamente puras. La progenie de estas plantas se convierte en líneas genéticamente puras que son evaluadas en cuanto, a modo de ejemplo, a su capacidad insecticida mejorada contra los insectos coleópteros y las larvas de la pulga del gato, preferiblemente en el campo, en una variedad de condiciones ambientales. Los inventores contemplan que la presente invención será de particular utilidad en la creación de plantas transgénicas de interés comercial incluyendo diversas gramíneas de césped, trigo, maíz, arroz, cebada, avena, una variedad de plantas ornamentales y de verduras, así como un número de árboles y plantas frutales y de frutos secos.

4.6. Nomenclatura de la proteína CryET29

Los inventores han asignado arbitrariamente la denominación de CryET29 a la nueva proteína de la invención. Asimismo, la denominación arbitraria de cryET29 ha sido asignada a la nueva secuencia aminoacídica que codifica este polipéptido. La asignación formal de las denominaciones del gen y de la proteína en base a la nomenclatura revisada de las endotoxinas de las proteínas de cristal (Tabla 1) será realizada por un comité encargado de la nomenclatura de B. thuringiensis formado para clasificar sistemáticamente las proteínas de cristal de B. thuringiensis. Los inventores consideran que las denominaciones asignadas arbitrariamente de la presente invención serán reemplazadas por la nomenclatura oficial asignada a estas secuencias.

4.7 Definiciones

Los siguientes términos y palabras tienen los significados expuestos a continuación:

Un, uno, una: según la convención sobre la legislación de patentes vigente desde hace tiempo, los artículos indefinidos "un, uno, una", cuando se usan en esta solicitud, incluyendo las reivindicaciones, significan "uno, una o más".

Amplio espectro: se refiere a una amplia variedad de especies de insectos.

Actividad insecticida de amplio espectro: toxicidad hacia una amplia variedad de especies de insectos.

Expresión: la combinación de procesos intracelulares, incluyendo la transcripción y la traducción, sufrida por una molécula de ADN codificante tal como un gen estructural para producir un polipéptido.

Actividad insecticida: toxicidad hacia insectos.

Especificidad insecticida: la toxicidad mostrada por una proteína de cristal hacia múltiples especies de insectos.

Especificidad de intraorden: la toxicidad de una determinada proteína de cristal hacia especies de insectos pertenecientes a un determinado orden de insectos (p.ej., orden Lepidoptera).

Especificidad de interorden: la toxicidad de una determinad proteína de cristal hacia especies de insectos pertenecientes a diferentes órdenes (p. ej., los órdenes Lepidoptera y Diptera).

CL_{50}: la concentración letal de proteína de cristal que causa una mortalidad del 50% de los insectos tratados.

CL_{95}: la concentración letal de proteína de cristal que causa una mortalidad del 95% de los insectos tratados.

Promotor: un sitio de reconocimiento de una secuencia de ADN o de un grupo de secuencias de ADN que proporciona un elemento de control de la expresión para un gen estructural y al que la polimerasa de ARN se une específicamente, iniciando la síntesis del ARN (transcripción) de ese gen.

Regeneración: el proceso de crecimiento de una planta a partir de una célula vegetal (p.ej., protoplasto vegetal o explanto).

Gen estructural: un gen que es expresado para producir un polipéptido.

Transformación: un procedimiento de introducción de una secuencia de ADN exógeno (p.ej., un vector, una molécula de ADN recombinante) en una célula o un protoplasto en el que ese ADN exógeno es incorporado a un cromosoma o es capaz de replicarse de forma autónoma.

Célula transformada: un célula cuyo ADN ha sido modificado mediante la introducción de una molécula de ADN exógeno en esa célula.

Transgén: un gen exógeno que cuando es introducido en el genoma de una célula huésped a través de un procedimiento tal como la transformación, la electroporación, el bombardeo de partículas y similares, es expresado por la célula huésped e integrado en el genoma celular tal que el carácter o los caracteres producidos por la expresión del transgén son heredados por la progenie de la célula transformada.

Célula transgénica: cualquier célula derivada de o regenerada a partir de una célula transformada o derivada de una célula transgénica. Los ejemplos de células transgénicas incluyen callos de plantas derivados de una célula vegetal transformada y células concretas tales como células de hoja, raíz, tallo, p.ej., las células somáticas o reproductoras (germen) obtenidas de una planta transgénica.

Planta transgénica: un planta o una progenie de la misma derivada de una célula o un protoplasto vegetal transformado, en la que el ADN de la planta contiene una molécula de ADN exógeno introducida que no estaba originariamente presente en una planta nativa no transgénica de la misma cepa. Los términos "planta transgénica" y "planta transformada", algunas veces, se han usado en la técnica como términos sinónimos para definir una planta cuyo ADN contiene una molécula de ADN exógeno. Sin embargo, se considera más científicamente correcto referirse a una planta o un callo regenerado obtenido de una célula o de un protoplasto vegetal transformado cuando se utiliza el término planta transgénica, y tal uso es el que se seguirá en la presente memoria.

Vector: una molécula de ADN capaz de replicarse en una célula huésped y/o a la que se puede ligar operativamente otro segmento de ADN para llevar a cabo la replicación del segmento unido. Un plásmido es un ejemplo de vector.

5. Ejemplos

Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar las realizaciones preferidas de la invención. Los expertos en la técnica deberían entender que las técnicas reveladas en los ejemplos que se presentan a continuación representan técnicas que el inventor ha descubierto que funcionan bien en la práctica de la invención, y de ese modo puede considerarse que constituyen los modos preferidos para su práctica.

5.1 Ejemplo 1

Aislamiento de EG4096 de B. thuringiensis

Se obtuvieron muestras de polvo de cultivo de diversas fuentes estadounidenses y del extranjero, normalmente, de instalaciones de almacenamiento de grano. Las muestras de polvo de cultivo fueron tratadas y esparcidas sobre placas de agar para aislar colonias individuales de tipo Bacillus según lo descrito (Donovan et al., 1993). La EG4096 es una cepa de B. thuringiensis de tipo salvaje aislada de una muestra de polvo de cultivo procedente de Tailandia. Se usó una microscopía de contraste de fase para examinar visualmente la morfología del cristal de las colonias bacterianas de este polvo de cultivo. La colonia denominada EG4096 contenía endoesporas e inclusiones cristalinas de una morfología singular que se asemeja a agujas cortas. El alineamiento de los plásmidos nativos con respecto a la cepa EG4096 también es singular.

El bioanálisis contra insectos de esta cepa de B. thuringiensis de tipo salvaje determinó que tenía actividad insecticida contra las larvas de los insectos coleópteros, incluyendo el gusano meridional de la raíz del maíz, el gusano occidental de la raíz del maíz, el escarabajo de la patata, el gorgojo de la harina y el afrecho, y el escarabajo japonés. La cepa EG4096 también muestra actividad insecticida frente a las larvas de la pulga del gato.

La caracterización de EG4096 incluyó el análisis de la proteína de cristal producida por la cepa durante la esporulación, y la clonación y la expresión del gen codificante de la proteína de cristal, que ha sido denominado cryET29. Se determinó la actividad insecticida tanto de la cepa de tipo salvaje como de un B. thuringiensis recombinante que expresaba el gen clonado de la toxina cryET29.

5.2 Ejemplo 2

Plásmidos nativos de la cepa EG4096 de B. thuringiensis

Se determinó el complemento de los plásmidos nativos contenidos en la EG4096 de B. thuringiensis aislada mediante electroforesis en gel de agarosa de Eckhardt descrita por González et al. (1982). El patrón de los plásmidos nativos no correspondía con los patrones de los serovares comúnmente conocidos (Carlton y González, 1985). Los tamaños de los plásmidos son de 5.0; 7,2; 6,0 (circular abierto); 39; 80 y 100 MDa.

5.3 Ejemplo 3

Proteína de cristal de la EG4096 de B. thuringiensis

Se cultivó la cepa EG4096 en un medio de esporulación de glucosa DSM+ [caldo nutriente Difco (p/v) al 0,8%; glucosa (p/v) al 0,5%; K_{2}HPO_{4} 10 Mm; KH_{2}PO_{4} 10 Mm; Ca(NO_{3})_{2} 1 mM; MgSO_{4} 0,5 mM; MnCl_{2} 10 \muM; FeSO_{4} 10 \muM] durante tres días a 30ºC, período durante el cual el cultivo creció hasta una fase estacionaria, difundió esporas y se lisó, liberando así las inclusiones proteicas en el medio. Se cosecharon los cultivos mediante centrifugación que formó una pella de esporas y cristales. Se lavó la pella en una solución de Tritón X-100® al 0,005%, EDTA 2 Mm y se centrífugo. Se volvió a suspender la pella lavada a una décima parte del volumen original de Tritón X-100® al 0,005%, EDTA 2 mM.

Se disolvió la proteína de cristal de la suspensión de esporas y cristales incubando la suspensión en un tampón de solubilización [Tris-HCl 0,14 M; pH 8,0; dodecil sulfato de sodio (SDS) (p/v) al 2%; 2-mercaptoetanol (v/v) al 5%; glicerol (v/v) al 10% y azul de bromfenol al 0,1%] a 100ºC durante 5 min. La proteína de cristal disuelta fue fraccionada por SDS-PAGE. Tras el fraccionamiento del tamaño, las proteínas fueron visualizadas mediante una tinción con azul brillante de Coomassie R-250. Este análisis mostró que la proteína de cristal principal presente en los cultivos esporulados de EG4096 es de un tamaño aproximado de 25 kDa. Esta nueva proteína fue denominada CryET29.

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Para caracterizar más a fondo CryET29, se determinó la secuencia aminoacídica NH_{2}-terminal de la proteína. Se lavó y se volvió a suspender un cultivo esporulado de EG4096. Se disolvió la suspensión y se goteó sobre un gel de acrilamida siguiendo los procedimientos para el análisis por SDS-PAGE. Tras la electroforesis, las proteínas fueron transferidas a una membrana de PVDF de BioRad siguiendo con los procedimientos estándar de transferencia western. Tras la transferencia, se enjuagó la membrana 3 veces en H_{2}Od y se lavó en tinte negro de amido 1013 durante 1 min (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Se destiñó el filtro 1 min en ácido acético al 5% y luego se aclaró en 3 cambios de H_{2}Od. La parte del filtro que contenía la banda proteica de aproximadamente 25 kDa fue extirpada con una hoja de afeitar. Este procedimiento dio como resultado la obtención de una forma pura de CryET29 como una proteína transferida sobre una membrana de PVDF (BioRad, Hércules, CA).

La determinación de la secuencia aminoacídica NH_{2}-terminal de la proteína CryET29 purificada inmovilizada sobre la membrana fue realizada en el Departamento de Fisiología de la Facultad de Medicina Tufts, Boston, MA, usando procedimientos estándar automáticos de degradación de Edman. La secuencia NH_{2}-terminal fue determinada como:

100

Se usaron algoritmos informáticos (Korn y Queen, 1984) para comparar la secuencia N-terminal de la proteína CryET29 con las secuencias aminoacídicas de todas las proteínas de cristal de B. thuringiensis de las que los inventores tienen conocimiento incluyendo las secuencias de todas las proteínas de cristal de B. thuringiensis que han sido publicadas en el material publicado científico, en solicitudes de patente internacional o en patentes concedidas. En la tabla 4, se muestra una lista de las proteínas de cristal cuyas secuencias han sido publicadas junto con la fuente de publicación.

TABLA 4 Proteínas de cristal de B. thuringiensis descritas en el material publicado

Proteína de cristal	Fuente de referencia
Cry1A(a)	J. Bio. Chem., 260: 6264-6272
Cry1A(b)	DNA, 5: 305-314
Cry1A(c)	Gene, 36: 289-300
Cry1B	Nucl. Acids. Res., 16: 4168-4169
Cry1C	Nucl. Acids. Res., 16: 6240
Cry1Cb	Appl. Environ. Micro., 59: 1131-1137
Cry1C(b)	Nucl. Acids. Res., 18: 7443
Cry1D	Nucl. Acids. Res., 18:5545
Cry1E	EPO 358 557 A2
Cry1F	J. Bacteriol., 173: 3966-3976
Cry1G	FEBS, 293, 25-28
CryV	WO 90/13651
Cry2A	J. Biol. Chem., 263: 561-567
Cry2B	J. Bacteriol., 171: 965-974
Cry2C	FEMS Microbiol. Lett., 81: 31-36
Cry3A	Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 84:7036-7040
Cry3B	Nucl. Acids. Res., 18: 1305
Cry3B2	Appl. Environ. Microbiol., 58: 3921-3927
Cry3B3	U.S. 5.378.625
Cry3C	Appl. Environ. Microbiol., 58: 2536-2542
Cry3D	Gene, 110: 131-132
Cry4A	Nucl. Acids. Res., 15: 719
Cry4B	EPO 308.1995
Cry4C	J. Bacteriol., 170: 4732, 1988
Cry4D	J. Bacteriol., 166: 801-811
Cry5	Molec. Micro., 6: 1211-1217
Cry33AkD	WO 94/13785
Cry33BkD	WO 94/13785

TABLA 4 (continuación)

Proteína de cristal	Fuente de referencia
Cry34kD	J. Bacteriol., 174: 549-557
Cry40kD	J. Bacteriol., 174: 549-557
Cry201T635	WO 95/02693
Cry517	J. Gen. Micro., 138: 55-62
Crya7A021	EPO 256.553 B1
CryAB78ORF1	WO 94/21795
CryAB780RF2	WO 94/21795
CryAB78100kD	WO 94/21795
Crybtpgs1208	EPO 382 990
Crybtpgs1245	EPO 382 990
Crybts02618A	WO 94/05771
CryBuibui	WO 93/03154
CryET4	U.S. 5.322.687
CryET5	U.S. 5.322.687
CryGei87	EPO 238.441
CryHD511	U.S. 5.286.486
CryHD867	U.S. 6.286.486
CryIPL	U.S. 5.231.008
CryMITS	JP 6000084
CryPS17A	WO 92/1973
CryPS17B	U.S. 5.350.576 y 5.424.4109
CryP16	WO 95/00639
CryP18	WO 95/00639
CryP66	WO 95/00639
CryPS33F2	WO 92/19739 y U.S. 5.424.410
CryPS40D1	U.S. 5.273.746
CryPS43F	WO 93/04587
CryPS 50Ca	WO 93/04587 y EPO 498.537 A2
CryPS 50Cb	WO 93/15206
Cryps52A1	U.S. 4.849.217
CryPS63B	WO 92/19739
CryPS69D1	U.S. 5.424.410
Cryps71M3	WO 95/02694
CryPS80JJ1	WO 94/16079
CryPS81IA	U.S. 5.273.746
CryPS81IA2	EPO 405 810
Cryps81A2	EPO 401 979
CryPS81IB	WO 93/14641
CryPS81IB2	U.S. 5.273.746
Cryps81f	U.S. 5.045.469
Cryps81gg	U.S. 5.273.746
Cryps81rr1	EPO 401 979
Cryps86A1	U.S. 5.468.636
CryX	FEBS Lett., 336: 79-82
CryXenA24	WO 95/00647
CrycytA	Nucl. Acids. Res., 13: 8207-8217

\vskip1.000000\baselineskip

La secuencia N-terminal de la proteína CryET29 no se encontró homóloga a ninguna de las proteínas de cristal de B. thuringiensis identificadas en la tabla 4.

\newpage

5.4 Ejemplo 4

Aislamiento de un fragmento de ADN que comprende el gen cryET29 de EG4096 de B. thuringiensis

Para identificar el gen codificante de la proteína CryET29, se diseñó una sonda de oligonucleótido específica de la secuencia aminoacídica NH_{2}-terminal de la proteína. Usando codones típicamente encontrados en los genes de la toxina de B. thuringiensis, se sintetizó un oligo de 35 nucleótidos mediante tecnologías de ADN integrado, Inc. (Coralville, IA) y se denominó wd270. La secuencia de wd270 es:

5'-ATGTTTTTTAGAGTAATTACATTAACAGTACC-3'

\hskip0.5cm

(SEQ ID NO:4)

Se usó wd270 marcado radiactivamente como una sonda en los estudios de transferencia southern según lo descrito a continuación para identificar un fragmento de restricción de ADN que contuviera el gen cryET29. El ADN total fue extraído de EG4096 mediante el siguiente procedimiento. Se volvieron a suspender células vegetativas en un tampón de lisis que contenía glucosa 50 mM; Tris-HCl 25 mM (pH 8,0); EDTA 10 mM y 4 mg/ml de lisozima. Se incubó la suspensión a 37ºC durante una hora. Tras la incubación, se extrajo la suspensión con un volumen igual de fenol, una vez con un volumen igual de fenol: cloroformo: alcohol de isoamilo (50:48:2) y una vez con un volumen igual de cloroformo:alcohol de isoamilo (24:1). Se hizo precipitar el ADN de la fase acuosa mediante la adición de un décimo del volumen de acetato de sodio 3 M, y luego de dos volúmenes de etanol al 100%. Se recogió el ADN precipitado mediante centrifugación, se lavó con etanol al 70% y se volvió a suspender en H_{2}Od.

Entonces se digirió el ADN extraído, en reacciones por separado, con diversas endonucleasas de restricción, incluyendo EcoRI. El ADN digerido fue fraccionado mediante electroforesis a través un gel de agarosa al 0,8% en 1 x TBE durante toda la noche a 2 V/cm. Los fragmentos de ADN fraccionado fueron transferidos a un filtro de nitrocelulosa Immobilon-NC (Millipore Corp., Bedford, MA) según el procedimiento de Southern (1975). Se fijó el ADN al filtro horneándolo a 80ºC en un horno de vacío.

Para identificar el fragmento o los fragmentos de ADN que contenían la secuencia codificante del terminal NH2 de la proteína CryET29 (véase Ejemplo 3), el oligonucleótido wd270 fue marcado radiactivamente en los extremos 5' y usado como una sonda de hibridación. Para marcar radiactivamente la sonda, se añadieron de 1 a 5 pmoles de wd270 a una reacción que contenía [\gamma^{-32}P]ATP (3 \mul de 3.000 Ci/mmol a 10 mCi/ml en un volumen de reacción de 20 \mul), un tampón de reacción x 10 (Tris-HCl 700 mM, pH 7,8; MgCl_{2} 100 Mm; DTT 50 mM) y 10 unidades de polinucleótido quinasa de T4 (Promega Corporation, Madison, WI). Se incubó la reacción 20 minutos a 37ºC para permitir la transferencia del fosfato radiactivo al extremo 5' del oligonucleótido, haciéndolo así útil como sonda de hibridación.

La sonda marcada fue luego incubada con el filtro de nitrocelulosa durante toda la noche a 45ºC en 3 x SSC; SDS al 0,1%; 10 x reactivo de Denhardt (BSA al 0,2%; polivinilpirrolidona al 0,2%; ficoll al 0,2%); 0,2 mg/ml de heparina. Tras la incubación, el filtro fue lavado en varios cambios de 3 x SSC; SDS al 0,1% a 45ºC. El filtro fue transferido seco y expuesto a un película de rayos X X-OMAT AR de Kodak (Eastman Kodak Company, Rochester, NY) durante toda la noche a -70ºC con una pantalla intensificadora Cronex Lighting Plus de Dupont.

La sonda marcada fue entonces incubada con el filtro de nitrocelulosa que luego fue lavado y expuesto a una película de rayos X para obtener un autorradiograma.

El examen del autorradiograma identificó dos fragmentos de restricción EcoRI distintos de aproximadamente 5,0 kb y 7,0 kb, que se hibridaron específicamente con la sonda de wd270 marcada. Este resultado indicó que la cepa EG4096 contenía dos copias bien estrechamente relacionadas o idénticas del gen cryET29, hibridándose ambas con el oligonucleótido wd270.

5.5 Ejemplo 5

Clonación del gen cryET29 de EG4096 de B. thuringiensis

Para aislar los fragmentos de restricción EcoRI de 5,0 y 7,0 kilobases (kb) que contenían el gen cryET29, se aisló el ADN genómico total de la cepa EG4096 como se describe en el ejemplo 4. El ADN fue digerido con EcoRI y sometido a electroforesis a través de una agarosa al 0,8%, 1 x gel TBE, durante toda la noche a 2 V/cm de longitud de gel. Se tiñó el gel con bromuro de etidio para que se pudiera visualizar el ADN digerido al exponerlo a luz UV de onda larga. Se extirparon porciones de gel que contenían fragmentos de ADN de aproximadamente 5,0 y 7,0 kb con una hoja de afeitar y se colocaron en bolsas de diálisis separadas que contenían un volumen pequeño (1 ml) de Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM (TE). Los fragmentos de ADN fueron eluidos desde las porciones de gel en el tampón de TE colocando las bolsas de diálisis en un aparato de electroforesis horizontal relleno con 1 x TBE y aplicando 100 V durante 2 h. Esto resultó en la emigración de los fragmentos de ADN de la porción de gel al tampón de TE. El tampón de TE que contenía los fragmentos eluidos fue luego extraído con fenol:cloroformo y precipitado con
etanol.

Para crear una genoteca en E. coli de los dos conjuntos de fragmentos de restricción EcoRI seleccionados según el tamaño (aproximadamente 5,0 y 7,0 kb), se ligaron los fragmentos en el vector de clonación pUC18 (Yanisch-Perron, et al., 1985). El vector de ADN plasmídico pUC18 puede replicarse en un número elevado de copias en E. coli y transporta el gen para la resistencia al antibiótico ampicilina, que puede ser usado como un marcador seleccionable. Los dos conjuntos de fragmentos fueron mezclados, en reacciones separadas, con pUC18 digerido por EcoRI que había sido tratado con fosfatasa alcalina bacteriana (GibcoBRL, Gaithersburg, MD) para eliminar los fosfatos de 5' del plásmido digerido y prevenir así la religación del vector consigo mismo. Se añadieron ligasa T4 y un tampón de ligación (Promega Corporation. Madison, WI) a la reacción que contenía el pUC18 digerido y los fragmentos de EcoRI seleccionados según el tamaño. Estos fueron incubados a temperatura ambiente durante 1 hora para permitir la inserción y la ligación de los fragmentos de EcoRI en el ADN del vector pUC18.

Las mezclas de ligación descritas anteriormente fueron introducidas, por separado, en células DH5\alpha^{TM} de E. coli competentes en transformación (adquiridas en GibcoBRL, Gaithersburg, MD) siguiendo los procedimientos descritos por el fabricante. Las células de E. coli transformadas fueron colocadas sobre placas de agar LB que contenían 50 \mug/ml de ampicilina e incubadas durante toda la noche a 37ºC. Ambas transformaciones produjeron aproximadamente 300 colonias resistentes a la ampicilina que indicaban la presencia de un plásmido recombinante en las células de cada colonia.

Para aislar las colonias que albergaban los fragmentos de EcoRI de 5,0 y 7,0 kb clonados que contenían las secuencias génicas de cryET29, primero se transfirieron las colonias de E. coli transformadas a filtros de nitrocelulosa. Esto se realizó simplemente colocando un filtro circular (Millipore HATF 085 25, Millipore Corp., Bedford, MA) directamente sobre las placas de agar con medio LB + ampicilina que contenían las colonias transformadas. Cuando el filtro es despegado lentamente de la placa, las colonias se pegan al filtro proporcionando una réplica exacta del patrón de las colonias de la placa original. Se dejan suficientes células de cada colonia sobre la placa, de manera que tras 5 ó 6 horas de cultivo a 37ºC se hayan restaurado las colonias. Entonces se almacenan las placas a 4ºC hasta que se necesiten. Los filtros de nitrocelulosa con las colonias transferidas fueron luego colocados, con la colonia hacia arriba, sobre placas de agar fresco con medio LB + ampicilina y se dejaron en cultivo a 37ºC hasta que alcanzaron un tamaño de aproximadamente 1 mm de diámetro.

Para liberar el ADN de las células de E. coli recombinantes sobre el filtro de nitrocelulosa, se colocaron los filtros, con las colonias hacia arriba, sobre 2 hojas de papel Whatman 3 MM Chr. (Whatman International LTD., Maidstone, Inglaterra) empapadas con NaOH 0,5N; NaCl 1,5 M durante 15 min. Este tratamiento produce el lisado de las células y desnaturaliza el ADN liberado permitiendo que se pegue al filtro de nitrocelulosa. Los filtros fueron luego neutralizados colocándolos, con las colonias hacia arriba, sobre dos hojas de papel Whatman empapadas con NH_{4}-acetato 1 M; NaOH 0,02 M durante 10 min. Luego se enjuagaron los filtros en 3 x SSC, se secaron al aire y se hornearon durante 1 h a 80ºC en un horno de vacío para prepararlos para la hibridación.

Se marcó el oligonucleótido NH_{2}-terminal específico del gen cryET29, wd270, en el extremo 5' con \gamma^{-32}P y polinucleótido quinasa de T4 como se describe anteriormente. La sonda marcada fue añadida a los filtros en 3 x SSC; SDS al 0,1%; 10 x reactivo de Denhardt (BSA al 0,2%; polivinilpirrolidona al 0,2%; ficoll al 0,2%); 0,2 mg/ml de heparina, e incubada durante toda la noche a 45ºC. Estas condiciones fueron seleccionadas para permitir la hibridación del oligonucleótido marcado con las secuencias relacionadas presentes en las transferencias de nitrocelulosa de las colonias de E. coli transformadas. Tras la incubación, los filtros fueron lavados en varios cambios de 3 x SSC; SDS al 1% a 45ºC. Los filtros fueron transferidos secos y expuestos a un película de rayos X X-OMAT AR de Kodak (Eastman Kodak Company, Rochester, NY) durante toda la noche a -70ºC con una pantalla intensificadora Cronex Lighting Plus de Dupont.

Varias colonias de cada transformación (las mezclas de ligación de 5,0 y 7,0 kb descritas anteriormente) se hibridaron con wd270. Estas colonias fueron identificadas alineando las señales del autorradiograma con las colonias de las placas de transformación originales. Las colonias aisladas fueron luego cultivadas en un medio líquido con LB + ampicilina del que se pudieron cosechar las células y el plásmido recombinante preparado mediante el procedimiento Miniprep de lisis alcalina estándar (descrito en Maniatis et al., 1982). Los plásmidos aislados fueron digeridos con la enzima de restricción EcoRI para determinar si los fragmentos clonados del ADN de EG4096 eran del tamaño esperado. Todos los plásmidos hibridantes procedentes tanto de las construcciones de 5,0 kb como de las de 7,0 kb tenían el fragmento de inserto del tamaño esperado. El ADN de estos digestos de plásmido fue sometido a electroforesis a través de un gel de agarosa y transferido a nitrocelulosa como se describe anteriormente. Entonces se hibridó la transferencia con el oligonucleótido, wd270, que había sido marcado radiactivamente en el extremo 5' con \gamma^{-32}P y polinucleótido quinasa de T4. Los fragmentos de EcoRI de dos de los cinco plásmidos que contenían insertos de 5,0 kb se hibridaron con la sonda, confirmando la presencia del gen cryET29 en esos fragmentos. Uno de los plásmidos con el inserto de 5,0 kb que contenía el gen cryET29 fue denominado pEG1298. Los fragmentos de EcoRI de cinco de los seis plásmidos que contenían insertos de 7,0 kb se hibridaron con la sonda, confirmando la presencia del gen cryET29 en esos fragmentos. Uno de los plásmidos con el inserto de 7,0 kb que contenía el gen cryET29 fue denominado
pEG1299.

La cepa de E. coli que contenía el pEG1298 fue denominada EG11513. La cepa EG11513 fue depositada en la colección de cultivos de investigación agrícola, del NRRL (Northern Regional Research Laboratory) el 18 de septiembre de 1996, recibiendo el nº. de acceso: NRRL B-21624. La cepa de E. coli que contenía el pEG1299 fue denominada EG11514.

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5.6 Ejemplo 6

Determinación de la secuencia de ADN del gen cryET29

Se determinó una secuencia de ADN parcial de los genes clonados en pEG1298 y pEG1299 siguiendo los procedimientos establecidos de secuenciación de ADN con terminación en cadena dideoxi (Sanger et al., 1977). La preparación del ADN bicatenario del molde del plásmido se realizó usando un equipo de plásmidos Qiagen (Qiagen Inc., Chatsworth, CA) siguiendo los procedimientos del fabricante. Las reacciones de secuenciación fueron realizadas usando el equipo de secuenciación de ADN, versión 2.0, de Sequenase^{TM} (United States Biochemical/Amersham Life Science Inc., Cleveland, OH) siguiendo los procedimientos del fabricante y usando ^{35}S-dATP como isótopo marcador (obtenido en Du Pont NEN® Research Products, Boston, MA). La electroforesis con gel desnaturalizante de las reacciones fue realizada sobre acrilamida (p/v) al 6%; gel de secuenciación de urea (p/v) al 42%. El gel secado fue expuesto a una película de rayos X X-OMAT AR de Kodak (Eastman Kodak Company, Rochester, NY) durante toda la noche a temperatura ambiente.

Se usó el oligonucleótido específico NH_{2}-terminal, wd270, como el cebador de secuenciación inicial. Las secuencias de ADN parciales indicaron que los plásmidos pEG1298 y pEG1299 contenían copias bien idénticas o casi idénticas del gen cryET29 de la cepa EG4096 de B. thuringiensis. La secuencia completa de ADN para las copias del gen cryET29 en los dos plásmidos fue completada usando los procedimientos anteriormente descritos. Los oligonucleótidos sucesivos por usar para las reacciones de secuenciación por cebado fueron diseñados a partir de los datos de secuenciación del conjunto previo de reacciones. De este modo, la secuenciación del ADN progresó junto con la cadena tanto superior como inferior del gen cryET29 de una forma distribuida en etapas.

La secuencia de ADN de ambas copias del gen cryET29 (SEQ ID Nº: 1) es idéntica, y se muestra en la fig. 1. La porción codificante proteica del gen cryET29 está compuesta por 696 nucleótidos, incluyendo un codón de terminación. La proteína CryET29 (SEQ ID Nº: 2), según se deduce de la secuencia de ADN, está constituida por 231 aminoácidos con una masa molecular predicha de 26.194 daltons.

Entonces se emprendieron búsquedas en las bases de datos para determinar si la secuencia aminoacídica deducida de la proteína CryET29 compartía identidad con otras proteínas caracterizadas, especialmente, con otras proteínas toxinas insecticidas. Las búsquedas en las bases de datos usando servidores en línea fueron realizadas con el programa BLASTP (Altschul, et al., 1990) proporcionado por el Centro Estadounidense para la Información Biotecnológica (Bethesda, MD). Las búsquedas mediante el programa BLASTP fueron ejecutadas con la matriz BLOSUM62. Las bases de datos examinadas estaban constituidas por traducciones no redundantes CDS del banco de genes + PDB +SwissProt + SPupdate + PIR.

Sólo se identificaron cuatro proteínas es estas bases de datos con una identidad significativa con la proteína CryET29. Estas incluyeron la toxina para dípteros CytB (identidad del 55%; Koni y Ellar, 1993); la toxina para coleópteros/dípteros CytA (identidad del 44,2%; Ward et al., 1984); la toxina para dípteros PS201T6 (identidad del 41,1%; solicitud de patente internacional publicada nº: WO 95/02693) y la toxina para dípteros Bacillus thuringiensis morrissoni de 27 kDa (identidad del 44,2%; Earp y Ellar, 1987).

5.7 Ejemplo 7

Expresión del gen cryET29 clonado

Para caracterizar las propiedades de la proteína CryET29, fue necesario expresar el gen cryET29 clonado en células de B. thuringiensis que son negativas para las proteínas de cristal (Cry^{-}). Se insertaron los fragmentos de EcoRI clonados en pEG1298 y pEG1299 en un vector plasmídico capaz de replicarse en B. thuringiensis, permitiendo así la expresión de los genes clonados.

pEG1298 y pEG1299 fueron digeridos con EcoRI para eliminar los fragmentos clonados de 5 kb y 7 kb, respectivamente. Los plásmidos digeridos fueron resueltos sobre un gel de agarosa y los fragmentos deseados fueron purificados desde porciones de gel usando el procedimiento GeneClean® de Bio101, Inc (Vista, CA). Los fragmentos fueron ligados, por separado, en un vector lanzadera de B. thuringiensis/E. coli que había sido digerido con EcoRI y tratado con fosfatasa alcalina bacteriana. El vector lanzadera pEG1297 había sido construido ligando el fragmento EcoRI de 3,1 kb de pNN101 de Bacillus (Norton et al., 1985) en el pUC18 digerido por NdeI. pEG1297 es capaz de replicarse tanto en E. coli como en B. thuringiensis, y confiere AMP^{R} a E. coli, y resistencia a la tetraciclina (Tet) (Tet^{R}) a B. thuringiensis. Las dos mezclas de ligación fueron primero introducidas en células DH5\alpha^{TM} de E. coli mediante los procedimientos de transformación descritos por los fabricantes (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD). El ADN plasmídico fue preparado a partir de transformantes Amp^{R}, y se realizó un análisis con enzimas de restricción para confirmar la correcta construcción. El plásmido constituido por el fragmento EcoRI de 5 kb del pEG1298 insertado en pEG1297 fue denominado pEG1302. El plásmido constituido por el fragmento EcoRI de 7 kb del pEG1299 insertado en pEG1297 fue denominado pEG1303.

Los plásmidos pEG1302 y pEG1303 fueron introducidos por separado en una cepa de B. thuringiensis Cry^{-}, EG10369, por electroporación (Macaluso y Mettus, 1991). Se seleccionaron células transformadas para tener resistencia a la tetraciclina mediante la incubación durante toda la noche en placas de agar LB que contenían 10 \mug/ml de Tet. Se seleccionó una colonia Tet^{R} de cada transformación para un análisis posterior. La cepa recombinante EG11494 contiene pEG1302 (NRRL B-21583) y la cepa recombinante EG11502 contiene pEG1303.

Las cepas EG11494 y EG11502 fueron cultivadas en un medio de esporulación C2 que contenía 10 \mug/ml de tetraciclina durante 3 días a 30ºC hasta que se produjo la esporulación y la lisis celular. Un examen microscópico de los cultivos esporulados demostró que las cepas recombinantes estaban produciendo pequeñas inclusiones cristalinas. Estos cristales se parecían a los cristales producidos por la cepa de tipo salvaje EG4096, lo que indicaba que el gen cryET29 de cada recombinante era un gen funcional capaz de dirigir la expresión de la proteína CryET29.

Los cultivos esporulados de EG11494 y EG11502 fueron cosechados mediante centrifugación, lavados y vueltos a suspender en Tritón X-100® al 0,005% en un décimo del volumen original. La proteína de cristal de las suspensiones fue caracterizada por análisis SDS-PAGE que reveló la producción de una proteína de aproximadamente 25 kDa tanto por parte de EG11494 como por parte de EG11502. Las proteínas de 25 kDa producidas por las cepas recombinantes tienen un tamaño idéntico al determinado por emigración sobre gel de SDS para la proteína de cristal de EG4096.

La cantidad de proteína toxina contenida en una determinada muestra fue cuantificada para el bioanálisis con insectos mediante SDS-PAGE. Se escaneó el gel SDS-PAGE teñido con Coomassie en un densitómetro y se comparó con una curva patrón generada por cantidades conocidas de carga de una proteína, tales como la albúmina de suero bovino, en el mismo gel.

5.8 Ejemplo 8

Toxicidad de CryET29 en las larvas del gusano meridional de la raíz del maíz

Se determinó la toxicidad hacia las larvas del gusano meridional de la raíz del maíz (Diabrotica undecimpunctata howardi) de la cepa EG4096 de B. thuringiensis de tipo salvaje y de las dos cepas recombinantes que expresan la proteína CryET29, la EG11494 y la EG11502.

EG4096, EG11494 y EG11502 fueron cultivadas en medio C2 a 30ºC durante 3 días hasta que se produjo la esporulación y la lisis celular. Se cosecharon los cultivos por centrifugación, se lavaron dos veces en 1 volumen original de Tritón X-100® al 0,005% y se volvieron a suspender en 1/10 del volumen original de cultivo en Tritón X-100® al 0,005%. A modo de comparación, se cultivó y se cosechó de la misma manera una cepa recombinante de B. thuringiensis, la EG11535, que expresaba la proteína tóxica para los coleópteros Cry3Bb (Donovan et al., 1992).

Las larvas del gusano meridional de la raíz del maíz fueron sometidas a un bioanálisis a través de la contaminación superficial de una dieta artificial similar a la de Marrone et al. (1985), pero sin formalina. Cada bioanálisis consistió en ocho diluciones acuosas en serie con alícuotas aplicadas a la superficie de la dieta. Una vez seco el diluyente (una solución acuosa de Tritón X-100® al 0,005%), se colocaron las larvas de la primera fase en la dieta y se incubaron a 28ºC. Se analizaron treinta y dos larvas por dosis. Se midió la mortalidad tras 7 días. Los datos de los bioanálisis replicados fueron interconectados para un método de los probit (Daum, 1970) corrigiendo la mortalidad para la muerte del control, siendo el control únicamente diluyente (Abbot, 1925). Los resultados son presentados como la cantidad de proteína de cristal CryET29 por pozo (175 mm^{2} de superficie de dieta) que resulta en una CL50, la concentración que mata al 50% de los insectos analizados. También se presentan intervalos de confianza del 95%
(Tabla 5).

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TABLA 5 Actividad insecticida de la proteína CryET29 hacia las larvas del gusano meridional de la raíz del maíz

Muestra	CL_{50} (\mug de proteína/pozo)	I.C. del 95%
EG4096	35,3	29-43
EG11494	24,3	20-30
EG11502	26,7	22-32
EG11535 (Cry3Bb)	17,8	14-23

Los resultados mostrados en la tabla 5 demuestran que la proteína CryET29 tiene una actividad significativa sobre las larvas del gusano meridional de la raíz del maíz. La CryET29 producida por las dos cepas recombinantes, EG11494 y EG11502, también muestra una toxicidad significativa. La actividad sobre el gusano meridional de la raíz del maíz de la proteína CryET29 producida por EG11494 y EG11502 es algo menor que la observada para la proteína Cry3Bb, aunque los intervalos de confianza del 95% se solapan ligeramente, lo que indica que la diferencia puede no ser significativa.

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5.9 Ejemplo 9

Toxicidad de CryET29 sobre el gusano occidental de la raíz del maíz

La toxicidad hacia las larvas del gusano occidental de la raíz del maíz (Diabrotica virgifera virgifera) fue determinada para la EG4096 de B. thuringiensis de tipo salvaje y para dos cepas recombinantes que expresaban la proteína CryET29, la EG11494 y la EG11502.

Las muestras fueron preparadas y los bioanálisis realizados esencialmente como se describe para los análisis del gusano meridional de la raíz del maíz del ejemplo 8. Se incluyó en el análisis la cepa de B. thuringiensis de tipo salvaje EG4961, que produce la proteína Cry3Bb de actividad contra los coleópteros, como un control positivo (tabla 6).

TABLA 6 Actividad insecticida de la proteína CryET29 hacia las larvas del gusano occidental de la raíz del maíz

Muestra	CL_{50} (\mug de proteína/pozo)	I.C. del 95%
EG4961 (Cry3Bb)	73,8	44-211
EG4096	12,9	7-110
EG11494	8,7	4-19
EG11502	13,9 9-29

Los resultados de la tabla 6 demuestran que la proteína CryET29 tiene una actividad significativa sobre las larvas del gusano occidental de la raíz del maíz. Además, la actividad de la CryET29 producida por las cepas recombinantes EG11494 y EG11502 es significativamente superior (i.e., menores CL_{50}) que la actividad de la proteína producida por la cepa de B. thuringiensis activa contra los coleópteros EG4096961.

5.10 Ejemplo 10

Toxicidad de la CryET29 contra las larvas del escarabajo de la patata

La toxicidad contra las larvas del escarabajo de la patata (Leptinotarsa decemlineata) fue determinada par la cepa de B. thuringiensis de tipo salvaje EG4096 y para la cepa recombinante que expresaba la proteína CryET29, EG11494. La cepa recombinante EG7231, que expresa la proteína Cry3Bb, fue cultivada a modo de comparación.

El análisis sobre las larvas del escarabajo de la patata fue realizado usando técnicas similares a las empleadas en el análisis del gusano meridional de la raíz del maíz, a excepción de la sustitución de la dieta para insectos nº: 9380 de BioServe (con copos de patata añadidos) por la dieta artificial. Se midió la mortalidad a los tres días en lugar de a los siete días. Para este análisis, se usaron 16 insectos por dosis (Tabla 7).

TABLA 7 Porcentaje de mortalidad de las larvas del escarabajo de la patata tratadas con cepas productoras de la CryET29

Dosis en \mug/pozo	EG4096	EG11494	EG7231 (Cry3Bb)
4,375	100	68,75
8,75	100	75
9,375			100
17,5	100	75
35	100	93

Los resultados mostrados en la tabla 7 demuestran la actividad insecticida de la proteína CryET29 sobre las larvas del escarabajo de la patata.

5.11 Ejemplo 11

Toxicidad de EG4096 de B. thuringiensis contra las larvas del gorgojo de la harina y el afrecho

La toxicidad de EG4096 contra las larvas del gorgojo de la harina y el afrecho (Tribolium castaneum) fue determinada aplicando un cultivo esporulado lavado y concentrado de EG4096 a una dieta artificial y dejando que las larvas de alimentaran con la dieta. Se trataron dieciséis larvas de esta manera y se midió el porcentaje de mortalidad tras dos semanas. Las larvas tratadas con la suspensión de EG4096 mostraron una mortalidad del 44% en comparación con la mortalidad del 13% del control sin tratar. Además, las larvas supervivientes tratadas con EG4096 mostraron una detención significativa en su crecimiento, lo que es indicativo de una dosis subletal de una toxina activa. Las larvas del control sin tratar no mostraron tal detención. Estos resultados demuestran que la EG4096, que produce la proteína CryET29, es tóxica para el gorgojo de la harina y el afrecho.

5.12 Ejemplo 12

Toxicidad de la EG4096 de B. thuringiensis en las larvas del escarabajo japonés

La toxicidad contra las larvas del escarabajo japonés (Popillia japonica) fue determinada para la EG4096 de B. thuringiensis, que produce la proteína CryET29. Se prepararon polvos criodesecados procedentes de cultivos lavados y esporulados de EG4096. La cantidad de proteína CryET29 presente en la muestra fue determinada mediante SDS-PAGE y una densitometría cuantitativa de los geles teñidos con Coomassie.

Se volvieron a suspender los polvos criodesecados en un diluyente que contenía Tritón X-100® al 0,005% y fueron incorporados en 100 ml de una dieta artificial líquida caliente (50-60ºC) (basada en la dieta para insectos descrita por Ladd (1986)). Se dejaron solidificar las muestras en placas Petri y se colocaron tapones de 19 mm de la dieta solidificada en tazas de plástico de 17,72 g (5/8 de onza). Se introdujo una larva de escarabajo japonés por taza, que luego fueron tapadas y mantenidas a 25ºC durante catorce días antes de medir la mortalidad de las larvas.

La tabla 8 muestra la media de los resultados de dos replicaciones del bioanálisis usando 20 larvas por replicación. Las dosis se basaron en la cantidad de proteína CryET29 de la muestra. El porcentaje de mortalidad fue corregido según Abbott (1925).

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TABLA 8 Toxicidad de EG4096 hacia las larvas del escarabajo japonés

Cantidad de CryET29 (ppm)	% de mortalidad
250 ppm	9
500 ppm	69
1.000 ppm	92
2.000 ppm	96

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Los resultados mostrados en la tabla 8 demuestran que la proteína CryET29 producida por EG4096 tiene una actividad insecticida significativa sobre las larvas del escarabajo japonés.

5.13 Ejemplo 13

Toxicidad de EG4096 de B. thuringiensis contra las larvas de la pulga del gato

Se determinó la toxicidad hacia las larvas de la pulga del gato (Ctenocephalides felis) de EG4096 de B. thuringiensis, que produce la proteína CryET29. Se prepararon polvos criodesecados procedentes de cultivos lavados y esporulados de EG4096. La cantidad de proteína CryET29 presente en la muestra fue determinada mediante SDS-PAGE.

Para realizar el bioanálisis, se mezcló una cantidad de polvo criodesecado que contenía 1 mg de proteína CryET29 con 1 gramo de sangre bovina seca resultando en una concentración de 1.000 ppm. Se suspendió la mezcla en Tritón X-100® al 0,1% y se vertió en una placa Petri de vidrio hasta secarse. La muestra seca fue luego molida en un polvo fino y distribuida uniformemente en 32 pozos de bioanálisis. Se añadió una larva de pulga de gato en cada pozo, que luego fueron tapados y mantenidos a una humedad elevada. Los análisis fueron medidos tras siete días.

El análisis es realizado de esta manera, usando un polvo de EG4096 como muestra, y en la tabla 9, se muestran los resultados. Se analizaron treinta y dos larvas por dosis. Se midió el porcentaje de mortalidad tras 1, 4 y 7 días. La cepa de B. thuringiensis que no produce una proteína toxina, la EG2205, fue usada para medir la mortalidad control.

TABLA 9 Toxicidad de EG4096 hacia las larvas de la pulga del gato de la primera fase

% de mortalidad
Cepa	CryET29 (ppm)	Día 1	Día 4	Día 7
EG4096	500	6,25	15,60	15,60
EG4096	1.000	9,40	34,40	43,75
EG4096	5.000	46,90	78,10	87,50
EG4096	10.000	84,40	93,75	100,00
EG2205	No toxina	3,10	15,60	15,60

Los resultados mostrados en la tabla 9 demuestran que la proteína CryET29 producida por la cepa EG4096 de Bacillus thuringiensis tiene una actividad insecticida significativa sobre las larvas de la pulga del gato, Ctenocephalides felis.

La singularidad de la actividad de la toxina CryET29 sobre las larvas de la pulga del gato fue demostrada mediante el análisis de otras proteína de cristal insecticidas de Bacillus thuringiensis de la manera anteriormente descrita. Se analizaron muestras que contenían esporas y cristales procedentes de cepas de B. thuringiensis que expresaban las siguientes proteínas toxinas: Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry2S, Cry3A, Cry3B, Cry3B2 y Cry3B3. Las características de estas otras clases de genes de proteínas de cristal insecticidas son descrias por Hofte et al., (1989). Para una descripción detallada de las toxinas Cry3, véase la patente estadounidense nº: 5.187.091 y la patente estadounidense nº: 5.264.364. Ninguna de estas toxinas mostró toxicidad hacia las larvas de la pulga del gato, lo que indica que la proteína toxina CryET29 es singular entre las proteínas insecticidas de B. thuringiensis aisladas hasta la fecha en cuanto a su toxicidad hacia las larvas de la pulga del gato.

6. Referencias

A continuación, se presentan las referencias citadas a lo largo de la presente memoria:

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Patente estadounidense nº: 4.769.061, concedida el 6 de septiembre de 1988.

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Patente estadounidense nº: 4.965.188, concedida el 23 de octubre de 1990.

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Patente estadounidense nº: 5.169.770.

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Patente estadounidense nº: 5.225.341, concedida el 6 de julio de 1993.

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Patente estadounidense nº: 5.349.126.

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Patente estadounidense nº: 5.612.487.

Patente estadounidense nº: 5.631.152.

Patente estadounidense nº: 5.633.435.

Solicitud de patente europea publicada nº: 320.308

Solicitud de patente europea publicada nº: 329.822

Solicitud de patente europea publicada nº: 709.462

Solicitud de patente británica nº: 2.202.328

Solicitud de patente internacional publicada nº: WO 88/10315

Solicitud de patente internacional publicada nº: WO 89/05859

Solicitud de patente internacional publicada nº: WO 89/06700

Solicitud de patente internacional publicada nº: WO 92/17598

Solicitud de patente internacional publicada nº: WO 94/13822

Solicitud de patente internacional publicada nº: WO 95/02693, publicada el 26 de enero de 1995.

Solicitud de patente internacional publicada nº: WO 95/26628

Solicitud de patente internacional publicada nº: WO 95/27068

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(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: ECOGEN, INC.

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: 2005 Cabot Boulevard West

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: Langhorne

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: Pensilvania

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: EE.UU.

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL: 19047-3023

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: Mark J. Rupar

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: 42 Sturbridge Drive

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: Wilmington

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: DE

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: EE.UU.

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL: 19810

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: William P. Donovan

\vskip0.500000\baselineskip

(G): CALLE: 36 Calicobush Rd.

\vskip0.500000\baselineskip

(H): CIUDAD: Levittown

\vskip0.500000\baselineskip

(I): ESTADO: PA

\vskip0.500000\baselineskip

(J): PAÍS: EE.UU.

\vskip0.500000\baselineskip

(K): CÓDIGO POSTAL: 19057

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: Tan Yuping

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: 34188 O'Neil Terrace

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: Fremont

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: CA

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: EE.UU.

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL: 94555

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: Annette C. Slaney

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: 4 Donmoore Court South

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: Hamilton Square

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: NJ

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: EE.UU.

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL: 08690

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Composiciones de cryet29 de Bacillus thuringiensis tóxicas para los insectos coleópteros y la especie Ctenocephalides

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 4

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: disco flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: PC compatible de IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): SOFTWARE: PatentIn versión 1.0, versión 1.30 (EPO)

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/721.259

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 9 de septiembre de 1996

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 1

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 693 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..693

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 1

1

2

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 2

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 231 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 2

\vskip1.000000\baselineskip

3

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 3

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENCADENAMIENTO:

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Phe Phe Asn Arg Val Ile Thr Leu Thr Val Pro Ser Ser Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID Nº: 4

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(E): LONGITUD: 34 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(F): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(G): ENCADENAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(H): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº: 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATGTTTTTTA ATAGAGTAAT TACATTAACA GTAC

\hfill

34

Claims

1. Un polipéptido aislado que comprende la secuencia aminoacídica de SEQ ID Nº: 2.

2. El polipéptido de la reivindicación 1 codificado por un polinucleótido que comprende la secuencia de SEQ ID Nº: 1.

3. El polipéptido de la reivindicación 1 ó 2, que muestra actividad insecticida contra insectos seleccionados de los órdenes de insectos Coleoptera y Siphonaptera.

4. Una composición que comprende el polipéptido de cualquier reivindicación anterior.

5. La composición de la reivindicación 4, que comprende un extracto celular, una suspensión celular, tejidos celulares homogeneizados, un lisado celular, un sobrenadante celular, un filtrado celular o una pella celular de células NRRL B-21582 o NRRL B-21583 de Bacillus thuringiensis, que han sido depositadas en la colección de cultivos de investigación agrícola, Northern Regional Research Laboratory.

6. la composición de la reivindicación 4 ó 5, en la que dicha composición es un polvo, una pella, un gránulo, un pulverizado, una emulsión, un coloide o una solución.

7. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en la que dicha composición es preparada mediante la desecación, liofilización, homogenización, extracción, filtración, centrifugación, sedimentación o concentración de un cultivo de células de Bacillus thuringiensis.

8. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, que comprende dicho polipéptido en una cantidad del aproximadamente 1% al aproximadamente 50% en peso.

9. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, formulada como un polvo, un pulverizado, una niebla, un gránulo, un enjuague, un champú o un baño.

10. Un dispositivo de collar anti-pulgas que comprende el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8.

11. Un anticuerpo purificado que se une específicamente al polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

12. El anticuerpo de la reivindicación 11, unido operativamente a una etiqueta detectable.

13. Un equipo de inmunodetección que comprende, en un medio de recipiente adecuado, un anticuerpo según la reivindicación 11 ó 12, y un reactivo de inmunodetección.

14. Un segmento de ácido nucleico aislado que codifica la secuencia aminoacídica según lo definido en las reivindicaciones 1 a 3, o el complemento de la misma.

15. El segmento de ácido nucleico de la reivindicación 14, en el que dicha región secuencial está ligada operativamente a un promotor que expresa dicha secuencia en una célula huésped transformada.

16. El segmento de ácido nucleico de la reivindicación 14, caracterizado como:

un segmento de ácido nucleico que tiene la misma secuencia que, o es complementario a, la SEQ ID Nº: 1.

17. Un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para su uso en la preparación de un medicamento destinado a matar una pulga del gato.

18. Un segmento de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16 para su uso en la preparación de una planta transgénica.

19. Un vector que comprende el segmento de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16.

20. El vector de la reivindicación 19, caracterizado como un plásmido, un cósmido, un baculovirus, un cromosoma artificial bacteriano, un cromosoma artificial de levadura o un vector viral.

21. El vector de la reivindicación 19 ó 20, caracterizado como un virus recombinante, un fago o un fagémido.

22. Una célula huésped transformada que comprende el segmento de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, o el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21.

23. La célula huésped de la reivindicación 22, caracterizada como una célula procariota.

24. La célula huésped de la reivindicación 23, caracterizada como una célula de la especie Agrobacterium, una célula de la especie Escherichia, una célula de la especie Bacillus o una célula de la especie Pseudomonas.

25. La célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, caracterizada como una célula de A. tumefaciens, una célula de E. coli, una célula de B. subtilis, una célula de B. megaterium o una célula de B. thuringiensis, tal como una célula NRRL B-21582 de B. thuringiensis o una célula NRRL B-21583 de B. thuringiensis.

26. La célula huésped de la reivindicación 22, caracterizada como una célula eucariota.

27. La célula huésped de la reivindicación 26, caracterizada como una célula vegetal.

28. La célula huésped de la reivindicación 27, caracterizada como una célula de maíz, cebada, alfalfa, avena, centeno, soja, trigo, canola, algodón, tabaco, tomate, patata, gramínea de pasto, gramínea de césped, verdura, árbol ornamental, de frutos secos, de bayas, cítrico o frutal.

29. La célula huésped de la reivindicación 27, caracterizada como una célula de maíz, algodón, soja, trigo o gramínea.

30. La célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 29, en la que dicha célula huésped expresa dicho segmento de ácido nucleico para producir un polipéptido insecticida.

31. Un procedimiento de preparación de un polipéptido, que comprende las etapas de:

(a) introducir en una célula huésped un vector que comprende un segmento de ácido nucleico codificante de un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de SEQ ID Nº: 2 ligada operativamente a un promotor;

(b) cultivar dicha célula huésped en condiciones eficaces para permitir la expresión del polipéptido codificado; y

(c) recoger de dicha célula el polipéptido expresado.

32. El procedimiento de la reivindicación 31, en el que dicho polipéptido es codificado por un polinucleótido que comprende la secuencia de SEQ ID Nº: 1.

33. Uso de un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, opcionalmente, en un excipiente farmacéuticamente aceptable, para preparar un medicamento destinado al tratamiento de una infección causada por pulgas en un animal.

34. Una célula de Bacillus thuringiensis que tiene el número de acceso del NRRL NRRL B-21582.

35. Un procedimiento de preparación de un polipéptido insecticida que comprende:

a) cultivar una célula NRRL B-21582 de Bacillus thuringiensis en condiciones eficaces para producir un polipéptido insecticida; y

b) obtener de dicha célula el polipéptido insecticida producido.