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ES2257734T3 - Activacion de los receptores de oligomerizacion por medio de los ligandos de receptores fusionados. - Google Patents

Activacion de los receptores de oligomerizacion por medio de los ligandos de receptores fusionados.

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ES2257734T3
ES2257734T3 ES93911350T ES93911350T ES2257734T3 ES 2257734 T3 ES2257734 T3 ES 2257734T3 ES 93911350 T ES93911350 T ES 93911350T ES 93911350 T ES93911350 T ES 93911350T ES 2257734 T3 ES2257734 T3 ES 2257734T3
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ES
Spain
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baselineskip
hgf
ligand
receptor
sequence
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Paul J. Godowski
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Genentech Inc
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Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN METODO PARA ACTIVAR RECEPTORES SELECCIONADOS DE QUINASAS DE TIROSINA RECEPTORAS, RECEPTORS DE CITOQUINA Y MIEMBROS DE LA SUPERFAMILIA RECEPTORA DEL FACTOR DE CRECIMIENTO DE LOS NERVIOS. SE CONTACTA UN CONJUGADO, COMPRENDIENDO LA FUSION DIRECTA DE, AL MENOS, DOS LIGANDOS CAPACES DE UNIRSE A LOS RECEPTRES A ACTIVAR, CON RECEPTORES, Y DE ESTA FORMA LOS LIGANDOS UNEN SUS RESPECTIVOS RECEPTORES, INDUCIENDO LA OLIGOMERIZACION RECEPTORA.

Description

Activación de los receptores de oligomerización por medio de los ligandos de receptores fusionados.
Campo de la invención
Esta solicitud se refiere a conjugados para la activación de un receptor. Más particularmente, la invención implica conjugados para la oligomerización inducida por ligando de receptores de superficie celular. La invención se refiere además a procedimientos para realizar variantes de ligando que actúen como agonistas de los ligandos nativos respectivos y a quimeras de ligando-inmunoglobulina.
Antecedentes de la invención
Muchos polipéptidos, como por ejemplo el factor de crecimiento, los factores de diferenciación y las hormonas, median sus acciones uniéndose a receptores de la superficie celular y activándolos. Aunque el mecanismo de la activación del receptor varía según el par receptor-ligando específico y a menudo no se comprende completamente, es una característica común de muchos receptores que necesiten formar oligómeros para activarse, o que su actividad por dicha formación de oligómeros. Los receptores del factor de crecimiento con actividad tirosina quinasa (receptores tirosina quinasa) y determinados receptores de citocinas son representantes típicos de dichos recepto-
res.
Los receptores con actividad tirosina quinasa tienen una topología molecular similar. Todos poseen un dominio de unión a ligando extracelular, un domino transmembrana hidrófobo y un dominio citoplásmico que contiene un dominio catalítico tirosina quinasa y que se puede además clasificar basándose en la similitud de secuencia y en las características estructurales distintivas [Hanks, S.K. y col., Science 241, 42-52 (1988); Yardan, Y. y Ollrich, A., Annu. Rev. Biochem. 57, 443-478 (1988)]. Los receptores monoméricos subclase I tienen dos secuencias de repetición ricas en cisteína en el dominio extracelular; los receptores subclase II tienen estructuras tipo s2b2 heterotetraméricas unidas por enlaces disulfuro con secuencias de repetición ricas en cisteína similares, mientras que los dominios extracelulares de los receptores de subclase III y IV tienen cinco o tres repeticiones tipo inmunoglobulina, respectivamente. Por ejemplo, a esta familia pertenecen los receptores de insulina, de factor de crecimiento epidérmico (EGF), de factor de crecimiento derivado plaquetario (PDGF), de factor de crecimiento tipo insulina (IGF-I), de factor 1 estimulador de colonias (CSF-1), y de factor de crecimiento hepatocítico (HGF).
Debido a su configuración, uno puede imaginarse a los receptores tirosina quinasa como enzimas alostéricos asociados a la membrana. Como en estos receptores, a diferencia de las enzimas hidrosolubles, el dominio de unión al ligando y el dominio catalítico tirosina quinasa (con actividad tirosina quinasa sobre proteínas) están separados por la membrana plasmática; la activación del receptor producida por la unión del ligando extracelular debe traducirse por la barrera que es la membrana, para activar las funciones del dominio intracelular.
Según un modelo de oligomerización de receptores alostéricos, la unión del ligando y la alteración conformacional resultante del domino extracelular inducen la oligomerización del receptor, que a su vez, estabiliza las interacciones entre dominios citoplasmáticos adyacentes y conduce a la activación de la función quinasa por interacción molecular. La oligomerización de receptores permite la transmisión de un cambio conformacional desde el dominio extracelular hasta el dominio citoplasmático sin la necesidad de alterar la posición de los residuos aminoacídicos del dominio transmembrana. Los receptores inactivos monoméricos están en equilibrio con los receptores activados oligoméricos. La unión de los factores de crecimiento a sus receptores correspondientes estabiliza un estado oligomérico que posee una afinidad de unión al ligando potenciada y una actividad tirosina quinasa elevada [Schlessinger, J., J. Cell Biol. 103, 2067-2072 (1986); Yarden, Y. y Schlessinger, J., Biochemistry 26, 1434-1442 (1987); Yarden, Y. y Schlessinger, J., Biochemistry 26, 1443-1451 (1987)]. Se Schlessinger, J., Trends Biochem. Sci. 13, 443-447 (1988) se describe un modelo de oligomerización de receptores alostéricos más general.
La oligomerización de receptores que, por simplicidad, se ilustra comúnmente como una dimerización de receptores, puede inducirse mediante ligandos monoméricos, como el EGF, que induce cambios conformacionales que resultan en interacciones receptor-receptor [Cochet, C. y col., J. Biol. Chem. 263, 3290-3295 (1988)]. Los ligandos bivalentes, como el PDGF y el CSF-1 median la diberización de receptores adyacentes [Heldin, C.H. y col., J. Biol. Chem. 264, 8905-8912 (1989); Hammacher, A. y col., EMBO J. 8, 2489-2495 (1989)].
La universalidad de este modelo de activación de receptores para todos receptores tirosina quinasa está respaldada por informes sobre la construcción de receptores quiméricos funcionales compuestos por los dominios principales de diferentes subclases de receptores tirosina quinasa [Riedel, H. y col., EMBO J. 8, 2943-2954 (1989)]. Aunque en algunos casos también se ha demostrado la formación de heterodímeros entre receptores muy similares estructuralmente [Hammacher, A. y col., citado con anterioridad para los receptores PDGF tipo a y tipo b; Soos, M.A. y Siddle, K., Biochem. J. 263, 553-563 (1989) para los receptores de insulina y IGF-1], aunque no hay una prueba directa disponible de que tales recetores híbridos sean efectivamente funcionales. En general, la complejidad de estos sistemas asociados a membrana y la falta de una cantidad suficiente de receptores naturales o recombinantes altamente purificados han obstaculizado un análisis más detallado de las alteraciones estructurales y de las necesidades de los cambios en los receptores tirosina quinasa inducidos por ligando.
Para una revisión general de la transducción de señales por los receptores con actividad tirosina quinasa, véase Ullrich, A. y Schlessinger, J., Cell 81, 203-212 (1990), y Bormann, B.J. y Engelman, D.M., Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 21, 223-266 (1992), y la bibliografía citada en dichos artículos.
El receptor de HGF (HGFr), es un receptor tirosina quinasa recientemente descubierto, que ha sido identificado como el producto del protooncogén c-MET [Bottaro y col., Science 251, 802-804 (1991); Naldini y col., Oncogene 6, 501-504 (1991)]. MET originalmente fue identificado como un gen transformador en una línea celular de sarcoma osteogénico tratado químicamente que había sufrido una traslocación cromosómica [Park, M. y col., Cell 45, 895-904 (1986)]. El HGFr maduro es un heterodímero unido por puentes disulfuro que procede del procesamiento proteolítico de un precursor de 190 kDa glicosilado en una subunidad a de 50 kDa y una subunidad b de 145 kDa [Giordano, S. y col., Oncogene 4, 1383-1388 (1989)]. La subunidad a es extracelular y la subunidad b contiene una región extracelular, un dominio transmembrana único y un dominio tirosina quinasa. En células normales, la unión de HGF es necesaria para activar la actividad tirosina quinasa de HGFr. La proteína HGFr se fosforila en los residuos de tirosina de la subunidad de 145 kDa al unirse HGF.
La oligomerización de receptores (dimerización) también parece ser crítica para la señalización de ciertos receptores de citocinas particularmente en una superfamilia recientemente descubierta de receptores transmembrana únicos, denominada superfamilia de los receptores hematopoyéticos [Bazan, y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 164, 788-795 (1989); D'Andrea, A.D., y col., Cell 58, 1023-1024 (1989); Gearing, D.P. y col., EMBO J. 8, 3667-3676 (1989); Itoh, N. y col., Science 247, 324-327 (190); Idzerda, R. L. y col., J. Exp. Med. 171, 861-873 (1990); Godwin, R.G. y col., Cell 60, 941-951 (1990); Fukunaga, R. y col., Cell 61, 341-350 (1990); Bazan, J.F. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 87, 6934-6938 (1990); Patthy, L., Cell 61, 13-14 (1990); Abdel-Meguid, S.S. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 84, 6434-6437 (1987); De Vos y col., Science 255, 306-312 (1992); Cosman, D. y co., Trends Biochem. Sci. 15, 265-270 (1990)]. Los miembros de esta superfamilia incluyen a los receptores de la hormona del crecimiento (GH), de la prolactina (PRL), del lactógeno placentario (PL) y de otras citocinas y otros receptores hematopoyéticos, como por ejemplo, los receptores de las interleucinas 1 a 7 (IL-1, IL-2, la subunidad b también se conoce como p75, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7), eritropoyetina (EPO), factor estimulador de colonias granulocíticas (G-CSF), factor estimulador de colonias macrofágicas (M-CSF) y factor estimulador de colonias granulocíticas-macrofágicas (GM-CSF). Estos receptores contienen dominios de unión a ligando extracelulares homólogos y dominios intracelulares altamente variables que no son homólogos con ninguna tirosina quinasa conocida ni ninguna otra proteína.
Recientemente Cunningham, B.C. y col., Science 254, 821-825 (1991) publicaron pruebas de que la dimerización es importante para la activación de hGH y otros receptores de citocinas. Para analizar las necesidades estructurales y el mecanismo de cambios inducidos por hormonas en hGH, los autores usaron el dominio extracelular de un receptor de gGH (proteína de unión a hGH, hGHbp) producida en altas cantidades en E. coli. Los resultados de cristalización, cromatografía de exclusión por tamaño, estudios de calorimetría y ensayos de enfriamiento y fluorescencia mostraron que hGH forma un complejo 1:2 con el dominio extracelular de hGHbp. Basándose en estos y otros estudios se concluyó que hGH contiene dos sitios diferentes funcionales para unirse a dos sitios solapantes en el hGHbp para formar el complejo hGH (hGHbp)^{2}, y que la formación de un complejo receptor dimérico análogo en la superficie celular es crítica para el mecanismo de transducción de la señal de hGH y probablemente receptores de citocinas homólogos. El mecanismo de dimerización de receptores se confirmó al descubrir que un análogo a hGH sin el sitio de unión al segundo receptor (y por lo tanto incapaz de dimerizar hGHbp) tenía una afinidad de unión al receptor reducida y una regulación a la baja hasta saturación también reducida.
Otro ejemplo es la superfamilia de superfamilia de receptores relacionados con el receptor del factor de crecimiento nervioso (NGFR), como los receptores del factor de necrosis tumoral (TNF) TNFR-I y TNFR-II, los productos de los genes Fas y Aps, y varios antígeno de superficie de linfocitos T y B. Actualmente, incluida en esta superfamilia están NGFR, que se encuentra en las neuronas, el antígeno CD40 de los linfocitos B, el antígeno MRC OX-40, que es un marcador de linfocitos T activados de fenotipo CD4, TNFR-I y TNFR-II que se encuentra en una variedad de tipos celulares, un ADNc (4-1BB) que codifica una proteína de función desconocida y se obtiene de clones de linfocitos T, y SFV-T2, una pauta de lectura abierta del virus del fibroma Shope. Los miembros de esta familia se caracterizan por tres o cuatro motivos ricos en cisteína de aproximadamente 40 aminoácidos en el dominio extracelular de la molécula, y en algunos casos por una región tipo bisagra pero sin otros tipos de dominios. Funcionalmente, es normal que los miembros de esta superfamilia de receptores que han caracterizado hace tanto tiempo sean capaces de reaccionar con más de un ligando, y que estos ligandos sean poliméricos por naturaleza. Se ha demostrado que los receptores de TNF se activan por oligomerización porque se descubrió que los anticuerpos anti TNFR bivalentes activaban a los TNFR pero no los fragmentos monovalentes de anticuerpo (fragmentos Fab') [Engelman, H. y col., J. Biol. Chem. 265, 14497-14504 (1990), y la bibliografía que se cita]. Se sugirió que un trímero TNF-a podía activar la transducción de la señal entrecruzando dos moléculas de TNFR de la superficie celular [Ashkenazi, A. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 88 10535-10539 (1991)]. De modo similar, los productos de los genes Fas y Aps se pueden activar con anticuerpos.
Un objeto de la presente invención es proporcionar procedimientos para producir una oligomerización de receptores inducida por ligando.
Es otro objeto proporcionar procedimientos para hacer variantes de ligando que actúen como agonistas competitivos de los ligandos nativos correspondientes.
Es además otro objeto proporcionar procedimientos para recuperar sustancialmente la actividad biológica del ligando perdida como resultado de una mutación.
Es otro objeto adicional proporcionar procedimientos para convertir en agonistas los ligandos que sean antagonistas competitivos de la acción de sus homólogos nativos.
Es otro objeto de la invención el incrementar la semivida de los ligandos.
Descripción de la invención
La presente invención está basada en las observaciones obtenidas con una serie de variantes de huHGF recombinantes (rhuHGF). La forma madura de huHGF, que corresponde con la principal forma purificada a partir de suero humano, es un heterodímero unido por puentes disulfuro derivado de un corte proteolítico de la prohormona humana entre los aminoácidos R494 y V495. Este proceso de corte genera una molécula compuesta por una subunidad a de 440 aminoácidos (Mr 69 kDa) y una subunidad b de 234 aminoácidos (Mr 34 kDa). La secuencia nucleotídica del ADNc de hHGF revela que tanto la cadena \alpha como la cadena \beta están incluidas en una sola pauta abierta de lectura que codifica un preproproteína precursora. En la estructura primaria teórica del hGHF maduro, se forma un puente S-S entre las cadenas entre la Cys 487 de la cadena \alpha y la Cys 604 de la cadena \beta. El extremo N terminal de la cadena \alpha está precedido de 54 aminoácido, que comienzan con un grupo metionina. Este segmento incluye una señal guía hidrófoba característica de 31 residuos y la prosecuencia. La cadena \alpha comienza en el aminoácido (aa) 55, y contiene cuatro dominios Kringle. El dominio 1 Kringle se extiende entre aproximadamente el aa 128 hasta aproximadamente el aa 206, el dominio 2 Kringle está entre aproximadamente el aa 211 y aproximadamente el aa 288, el dominio 3 Kringle se extiende por definición entre aproximadamente el aa 303 hasta aproximadamente el 383, el dominio 4 Kringle se extiende desde aproximadamente el aa 391 hasta aproximadamente el aa 464 de la
cadena \alpha.
Las variantes rhuHGF se produjeron para determinar la importancia estructural y funcional del corte de la prohormona en el dímero a/b y de los dominios Kringle y tipo proteasa. Se realizó una serie de truncamientos en el extremo C terminal de huHGF delecionando la cadena \beta o la cadena \beta además de un número progresivo de dominios Kringle, y se introdujeron mutaciones en el sitio de corte de la cadena uno y de la cadena dos, o en el dominio protea-
sa.
Algunas de las variantes huHGF conservaban la capacidad de unirse a su receptor (HGFr) con alta afinidad, pero no tenían actividad biológica HGF (mitogénica), y mostraron una reducida capacidad de inducir la fosforilación de HGFr.
Se ha descubierto que se pueden hacer proteínas quiméricas con una conformación correcta que comprendan la fusión de dichas moléculas variantes HGF a la secuencia de un dominio constante de una inmunoglobulina y que tales quimeras mantienen la capacidad de unirse al HGFr.
Se ha descubierto además que la actividad biológica de las variantes HGF que antes eran capaces de unirse a su receptor pero que carecían o presentaban una actividad biológica sustancialmente reducida tipo HGF en comparación con la huHGF silvestre, se podría recuperar sustancialmente en forma de quimeras de variante HGF-inmunoglobulina.
Aunque el mecanismo por el que la unión de HGF a HGFr activa la tirosina quinasa intracelular no es del todo comprendido, pero se cree que la activación del receptor por las quimeras de variante HGF-inmunoglobulina probada se debió a la capacidad estructural de los dímeros de la cadena pesada de la inmunoglobulina de inducir la dimerización del receptor. Los ligandos HGF acoplados (oligomerizados) por otros procedimientos, por ejemplo, a través de puentes entre cisteínas, pueden inducir la activación del receptor de forma análoga.
Otros receptores que requieren una oligomerización para obtener una actividad biológica (completa) también se pueden activar a través de secuencias de ligando oligomerizadas (por ejemplo, dimerizadas), como por ejemplo por moléculas quiméricas que comprendan el(los) dominio(s) de unión al receptor de los ligandos nativos correspondientes o de los nativos fusionados a una secuencia del dominio constante de una inmunoglobulina. Tales receptores incluyen otros receptores con actividad tirosina quinasa, como por ejemplo los receptores de insulina, EGF, PDGF, IGF-1, CSF-1; citocinas, por ejemplo, miembros de la superfamilia de receptores hematopoyéticos, como por ejemplo hGH. hPRL, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, eritropoyetina, G-CSF, M-CSF, y GM-CSF; y miembros de la superfamilia NGFR, como por ejemplo GFR, TNFR-I, TNFR-II.
En un aspecto, la presente invención se refiere a un conjugado para su uso en un procedimiento para el tratamiento terapéutico de un paciente, comprendiendo el conjugado un primer ligando unido mediante un enlazador heterólogo a un segundo ligando, en el que el enlazador heterólogo es diferente de cualquier enlazador que conecte los ligandos en su entorno nativo; el ligando no es un anticuerpo contra el receptor del factor de crecimiento hepatocítico ni un conjugado no covalente de un anticuerpo y un antígeno para dicho anticuerpo; el primer y segundo ligando son capaces de unirse a la primera y a la segunda molécula de receptor del factor de crecimiento hepatocítico, respectivamente, en el que la primera y la segunda molécula receptora son capaces de oligomerizar la una con la otra; y en la que el conjugado es capaz de activar un receptor del factor de crecimiento hepatocítico.
El enlazador heterólogo puede comprender, por ejemplo, una secuencia de un dominio constante y/o variable de una inmunoglobulina, un residuo de un agente reticulante no proteináceo, un puente disulfuro entre el primer y el segundo ligando o una secuencia espaciadora polipeptídica.
En otro aspecto adicional, la invención se refiere a un procedimiento para hacer un agonista de un ligando nativo de un receptor del factor de crecimiento hepatocítico que comprende la dimerización de una primera variante de ligando capaz de unirse al receptor o de acoplarse la primera variante con una segunda variante de ligando capaz de unirse al receptor.
En otro aspecto adicional, la invención se refiere a una molécula quimérica que comprende una fusión de un primer ligando capaz de unirse a un receptor del factor de crecimiento hepatocítico con una primera secuencia de un dominio constante de una inmunoglobulina, y una fusión de un segundo ligando capaz de unirse a dicho receptor con una segunda secuencia de un dominio constante de una inmunoglobulina.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es una representación esquemática de las subunidades a y b de huHGF. En la cadena \alpha se muestra la secuencia de la señal (región con un recuadro) que incluye los aminoácidos 1 - 31, el dedo teórico y cuatro dominios Kringle, cada uno con sus tres puentes disulfuro respectivos. El sitio de corte para la generación de la forma heterodimérica a/b de huHGF está inmediatamente después del residuo R494 de corte P1. Este último residuo se ha sustituido específicamente con otro E. D o A para generar variantes de cadena sencilla HGF. La cadena \beta, después del sitio de corte, tiene homología con las serina proteasas. Se ha propuesto que las cadenas a y b se mantienen juntas con un solo puente disulfuro entre C487(a) y C604(b) (Nakamura y col., 1989, citado con anterioridad). Se han sustituido tres residuos en la cadena \beta individualmente o junto con la reconstitución de residuos auténticos de una serina proteasa. A continuación se describen las representaciones esquemáticas de las formas maduras de las variantes con truncamiento en el extremo C terminal. El N-207, eliminado después del primer Kringle; el N-303, eliminado después del segundo Kringle; N-384, eliminado después del tercer Kringle y la cadena \alpha. Además se muestran las variantes en las que se introdujeron las deleciones de cada uno de los Kringles (\DeltaK1, \DeltaK2, \DeltaK3 y \DeltaK4). En cada caso, las deleciones eliminaron específicamente todo el Kringle de C1 a C6. La figura 2 muestra los resultados de la inmunotransferencia tipo Western del rhuHGF silvestre y las variantes de cadena sencilla. Los medios acondicionados a partir de células 293 con transfección simulada o las células 293 estables que expresan o el rhuHGF silvestre (WT) o las variantes R494E, R494A o R494D se volvieron a fraccionar en condiciones reductoras en un gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio al 8%, y se transfirieron por adsorción. Se hizo reaccionar la transferencia con un antisuero anti-HGF policlonal que reconoce principalmente los epítopos de la cadena \alpha. Las masas moleculares (kilodalton) de los marcadores están indicadas. También se indican las posiciones de la cadena \alpha y de las formas de huHGF de la cadena sencilla sin cortar. Apréciese que el anticuerpo policlonal tiene una reacción cruzada con una banda no identificada (*) presente incluso en las bandas de las células 293 transfectadas como control, que no expresan cantidades detectables de huHGF. Figura 3: Actividad mitogénica (A) y capacidad de unión competitiva al receptor (B) de un rhuHGF silvestre (WT) y variantes de cadena sencilla. (A) La actividad biológica se determinó por la capacidad del rhuHGF WT y de las variantes de inducir la síntesis de ADN en un cultivo de hepatocitos de rata como se describe en el ejemplo 2. Se muestra el rpm promedio por duplicado de un ensayo representativo. El sobrenadante simulado de las células control no estimuló la síntesis de ADN en estas células (no hubo un aumento del rpm sobre los niveles basales). (B) Para realizar la unión competitiva, se incubaron varias diluciones de sobrenadantes de células 293 humanas con un rhuHGF wt o sus variantes con 50 pM de la proteína de fusión receptor de huHGF-IgG como se describe en el ejemplo 2. Los datos representan la inhibición de la unión como el porcentaje de cualquier ligando competidor de un experimento representativo y se corrigieron restando los niveles basales del control de las células 293. Figura 4: Inmunotransferencia tipo Western de la fosforilación de la tirosina inducida por ligando de la subunidad b de 145 kDa del receptor de HGF por un rhuHGF silvestre, o variantes de huHGF de cadena sencilla o de dominio proteasa. Se prepararon lisados de unas células A549 incubadas durante 5 minutos sin (-) o con 200 ng/ml de rhuHGF silvestre purificado (WT), variantes de cadena sencilla (R494E) o dobles proteasas (Y673S, V692S) y se inmunoprecipitaron con un anticuerpo anti receptor de HGF y se revelaron con anticuerpos anti fosfotirosina. Las masas moleculares (kilodalton) son las que se indican. Figura 5: Expresión y estructuras propuestas de las quimeras de HGF-IgG. A. Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE) en condiciones reductoras. B. Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE) en condiciones no reductoras. Calle M: células 293 control (Simuladas); Calle 1: NK2-IgG; Calle 2: HGF-IgG; Calle 3: Y673S,V692S-IgG; Calle 4: R494E HGF-IgG. C. Estructuras propuestas de las quimeras de variante HGF-IgG. Figura 6: Ensayo de unión competitiva. Se analizaron los sobrenadantes del cultivo celular de las células 293 que expresan el rhuHGF silvestre y varias quimeras de variante huHGF-IgG para comprobar su capacidad de bloquear la unión de rhuHGF 125I expresado en células CHO al dominio extracelular del HGFr humano fusionado a la región constante Fc de una IgG1 humana, expresada y secretada a partir de células 293. Figura 7: Ensayo de asimilación de timidina-H^{3}. Se analizaron los medios acondicionados de células 293 que expresan rhuHGF silvestre y varias quimeras de variantes de rhuHGF-IgG para comprobar el efecto mitogénico en un ensayo de asimilación de timidina-H^{3}. Simulada: células 293 de control. Figura 8: Perfil del plásmido de expresión pf-NK1. Para la expresión en bacterias de HGF/NK1, se usó un plásmido de expresión que contiene el promotor de la fosfatasa alcalina (phoA) acoplado a la secuencia codificadora del péptido guía stII para obtener una secreción directa de la proteína expresada en el espacio periplásmico. La secuencia codificadora del epítopo Flag se incluyó para realizar un seguimiento de la expresión y de los pasos de purificación. Esta secuencia Flag está seguida de la secuencia codificadora del HGF/NK1 maduro (segmento sombreado) tal y como se indica. Se muestra el ADN correspondiente y la secuencia aminoacídica del péptido guía stII, el epítopo Flag (cursiva) y las porciones HGF/NK1 (extremo N y C terminal, negrita). Figura 9: Diagrama de flujo de la purificación de HGF/NK1 y del fraccionamiento de la mezcla heparina-sefarosa por cromatografía de intercambio catiónico con el sistema FPLC Mono S. Se dializó la proteína eluida de la columna de heparina-sefarosa con un gradiente de NaCl frente una solución de acetato de sodio 20 mM, pH 6,0, NaCl 0,25 M y se cargó una parte de esta solución en la columna de intercambio catiónico con el sistema FPLC Mono S equilibrada con el mismo tampón. Se usó un gradiente lineal desde 0,25 M hasta 1,5 M de NaCL para eluir la proteína unida, y se recogieron fracciones de aproximadamente 1,5 ml. Se muestra la absorbancia a 280 nM. Las fracciones 6-9 se combinaron y se usaron en otros experimentos. Figura 10: Análisis SDS-PAGE de los extractos bacterianos crudos y muestras purificadas de HGF/NK1. Las masas moleculares (kilodalton, kDa) de los marcadores se indican a la izquierda de cada gel, y la posición de la migración de HGF/NK1 se muestra a la derecha. (A) Se muestras los resultados con lisados celulares totales de células sin inducir (calle 1) y de células en las que se indujo la expresión de HGF/NK1 (calles 2-6) por privación de fosfato. Las calles 2-6 muestran muestras del ciclo de fermentación que se recogieron a una D.O: (550 nm) de 1,0; 7,2; 39; 66 y 72 respectivamente. Se fraccionaron cantidades iguales de extractos proteicos de cada muestra en condiciones reductoras y se detectaron con tinción con coomassie. (B) Los análisis de inmunotransferencia tipo Western de los lisados crudos de células de E. coli 27C7 con el vector de expresión de HGF/NK1 (calles 1 y 3) o células 27C7 control con sólo el pBR322 (calles 2 y 4) se analizaron en condiciones no reductoras y en condiciones reductoras tal y como se indica. Las proteínas que tienen el epítopo FLAG se detectaron como se describe en el ejemplo 7. (C) Se analizaron las fracciones de la cromatografía tipo FPLC Mono S 7-11 mostradas en las calles 1-5, respectivamente, en condiciones reductoras. La proteína se detectó con tinción de plata. (D) Las proteínas con el epítopo Flag presentes en las fracciones FPLC 1, 3, 5, 7, 9, 11, y 13 (calles 1-7) se detectaron como en 10B. Figura 11: Unión competitiva de HGF etiquetado con I^{125} en presencia de rhuHGF o HGF/NK1 al receptor HGF soluble purificado (A) o al receptor HGF de células A549 (B). La unión se realizó en presencia de 50 pM de radioligando y las concentraciones indicadas de competidor sin marcar. Se muestran las curvas de desplazamiento representativas del HGF-I^{125} por los rhuHGF, HGF/NK1, y el Kringle 4 del plasminógeno (K4 plas) purificado sin marcar radiactivamente tal y como se indica. La unión se realizó en presencia de 100 pM de radioligando y las concentraciones indicadas de competidor sin marcar. Las constantes de disociación (kd) determinadas a partir de estos tres experimentos independientes fueron 0,10 +/- 0,02 nM para rhuHGF y 1,10 +/- 0,04 nM para HGF/NK1 al receptor de HGF soluble (A), y 0,21 +/- 0,04 nM para rhuHGF y 1,60 +/- 0,08 nM para HGF/NK1 (B) al receptor de células A549. Figura 12: Inmunotransferencia tipo Western de la fosforilación inducida por ligando de la subunidad b de 145 kDa del receptor de HGF por el rhuHGF silvestre (A) y el HGF/NK1 purificado (B). Se prepararon los lisados de las células inducidas e incubadas durante 15 minutos con los factores anteriormente indicados y se inmunoprecipitaron con un anticuerpo anti receptor. Las inmunotransferencias tipo Western preparadas a partir del gel SDS-PAGE se incubaron con la sonda con los anticuerpo anti fosfotirosina. Las masas moleculares (kDa) son las que se indican. Figura 13: Efecto del HGF/NK1 solo (A) o junto con el rhuHGF (B) sobre la síntesis de ADN en un cultivo primario de hepatocitos. Los hepatocitos se expusieron a concentraciones crecientes de rhuHGF o HGF/NK1 solo (A) o concentraciones crecientes de HGF/NK1 junto con una concentración fija de HGF (0,64 nM que corresponde a la cantidad de HGF requerida para un 50% de incorporación de timidina-H^{3}, B). Se muestran las curvas representativas de tres experimentos independientes. Como control, se probó un Kingle 4 del plasminógeno purificado para neutralizar la actividad de HGF.
Descripción detallada de la invención
Para el propósito de la presente invención, el "receptor" es un receptor del factor de crecimiento hepatocítico, cuya activación o señalización potencial está mediada por oligomerización, con independencia del mecanismo real por el cuál se induce la oligomerización del receptor, en el que "oligomerización" incluye específicamente la dimerización así como la formación de oligómeros mayores.
El término "citocina" es un término genérico para aquellas proteínas, liberadas por una población de células, que actúan sobre otra célula como mediadores intercelulares. Entre las citocinas se incluyen la hormona del crecimiento, los factores de crecimiento tipo insulina, las interleucinas, la hGH, la N-metionil hGH, la hormona de crecimiento bovina, la hormona paratiroidea, la tiroxina, la insulina, la proinsulina, la relaxina, las hormonas glicoproteicas, como por ejemplo, la hormona estimuladora del folículo (FSH), la hormona estimuladora del tiroides (TSH), y la hormona luteinizante (LH), el factor de crecimiento hematopoyético, el HGF, el factor de crecimiento fibroblástico, la prolactina, el lactógeno placentario, el factor de necrosis tumoral a y b (TNF-\alpha y -\beta), la sustancia inhibición muelleriana, el péptido asociado a la gonadotropina de ratón, la inhibina, la activina, el factor de crecimiento del endotelio vascular, la integrina, la trombopoyetina, los factores de crecimiento neuronal, como por ejemplo NGF-\beta, PDGF, factores de crecimiento transformadores TGF) como por ejemplo, TGF-\alpha y TGF-\beta, factor de crecimiento tipo insulina 1 y 2 (IGF-1 y IGF-2), eritropoyetina, factores osteoinductores, interferones (IFN) como, IFN-\alpha, IFN-\beta y IFN-\gamma, factores estimladores de colonias (CSF) como, M-CSF, GM-CSF, y G-CSF, interleucinas (IL), como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 y otros factores polipeptídicos. Los receptores de citocinas son receptores que se unen a las citocinas previamente definidas.
Las expresiones "receptor con actividad tirosina (proteína) quinasa" y "receptor tirosina quinasa" y otras variantes gramaticales, se usan indistintamente y se refieren a receptores que tienen típicamente un gran dominio extracelular de unión al ligando, una sola región transmembrana hidrófoba y un dominio catalítico con actividad tirosina quinasa, que se pueden clasificar en subclases (subclases I-IV según el conocimiento actual) basándose en la similitud de su secuencia y en las características estructurales distintivas como se define en Schlessinger, J. (1988) citado con anterioridad, y Ullrich, A. y Schlessinger, J. (1990), citado con anterioridad. Entre otras secuencias altamente conservadas de función desconocida, el dominio tirosina quinasa de estos recetores contiene una secuencia de consenso Gly-X-Gly-X-X-Gly-X(15-20)Lys que funciona como parte del centro de unión de ATP. Las tirosina quinasas de los receptores catalizan la fosforilación de sustratos exógenos así como residuos de tirosina en sus propias cadenas polipeptídicas. Esta familia incluye el receptor de la insulina (insulina-R), el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF-R), los receptores A y B del factor de crecimiento derivado de plaquetas(PDGF-R-A y -B), el receptor del factor de crecimiento tipo insulina(IGF-1-R), el receptor 1 del factor estimulador de colonias(CSF-1-R), el receptor del factor de crecimiento hepatocítico (HGFr), HER2/neu, HER3/c-erbB-3, IRR, Xmrk y los receptores del factor de crecimiento fibroblástico ácido (FGF) y básico FGF, denominados flg y bek. El mecanismo de oligomerización implica la posible existencia de complejos híbridos entre receptores estructuralmente muy similares como por ejemplo, PGDF-R-A y -B, EGF-R y HER2/neu, o insulina-R y IGF-1-R [Hammacher y col. (1989), citado con anterioridad; Soos, M.A. y Siddle, K., Biochem. J. 263, 553-563 (1989)].
EGF-R puede servir como modelo de receptor de subclase I con la actividad tirosina quinasa activada por un ligando monovalente. EGF-R es un polipéptido de cadena sencilla de aproximadamente 170.000 kDa compuesto por un gran dominio de unión a ligando extracelular, una sola región transmembrana hidrófoba y una región citoplasmática con actividad intrínseca tirosina quinasa sobre proteínas (Ullrich, A. y col., Nature 309, 418-425 (1984)]. Yarden y Schlessinger [Biochemistry 26, 1434-1442 (1987); Biochemistry 24, 1443-1451 (1987)] demostraron que el EGF-R purificado sufre una oligomerización rápida y reversible inducida por EGF y que la oligomerización del receptor es una propiedad intrínseca de EGF-R. Cochet, C. y col obtuvieron resultados similares en células vivas.
[J. Biol. Chem. 263, 3290-3295 (1988)]. Basándose en anteriores estudios sobre la estructura y la función y los datos iniciales de la caracterización por microscopía electrónica del dominio extracelular purificado del receptor de EGF, en Ullrich, A. y Schlessinger, J. (1990), citado con anterioridad, se propuso un modelo de cuatro dominios para la organización de la región extracelular del receptor de EGF. En este modelo, se propone que el "dominio III y el ``dominio I" contribuyen principalmente a los determinantes que hacen que el receptor interacciones específicamente con su ligando (EGF o factor de crecimiento transformador \alpha o TGF-\alpha) y se sugiere que la región de unión a EGF radica en el espacio formado entre los dominios III y I HER2/neu [Lee, J. y col., EMBO J. 8, 167-173 (1989); Hazan, R. y col., Cell. Growth Differ. 1, 3-7 (1990)], HER3/c-erbB-3 [Kraus, M.H. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 86, 9193-9197 (1989)] y Xmrk [Wittbrodt, J. y col., Nature 341, 415-421 (1989)] pertenecen a esta subclase.
Los representantes típicos de receptores con actividad tirosina quinasa de la subclase II son el insulina-R y IGF-1-R [Ullrich y col., Nature 313, 756-761 (1985); Ullrich y col., EMBO J. 5, 2503-2512 (1986); Ebina, Y. y col., Cell 40, 747-758 (1985); Perdue, J.F., Can. J. Biochem. Cell. Biol. 62, 1237-1245 (1984); Rechler, M.M. y Nissley, S.P., Ann. Rev. Physiol. 47, 425-442 (1985), y la bibliografía citada en estos artículos de revisión; Lee y col., Mol. Endocrinol. 2, 404-422 (1988); Wilson y col., Mol. Endocrinol. 2, 1176-1185 (1988); Morgan y col., Nature 329, 3071-3072 (1987)]. La capacidad de unión del ligando a estos receptores, que tienen una estructura heterotetramérica [Lammer, R. y col., EMBO J. 8, 1369-1375 (1989); Czech, M. Cell 59, 235-238 (1989)], induce una interacción alostérica de las dos mitades ab en el complejo receptor estabilizado por el puente disulfuro [Ullrich, A. (1990), citado con anterioridad]. Esta subclase también incluye IRR, un receptor putativo de un ligando de la familia de la insulina [Shier, P. y Watt, V.M., J. Biol. Chem. 264, 14605-14608 (1989)].
Los receptores con actividad tirosina quinasa de subclase III unen ligandos diméricos que median la dimerización con receptores adyacentes. Esta subclase está representada por receptores de PDGF-A y -B, y CSF-1. La PGDF humana aparece bajo tres isoformas que están formadas por cadenas A y B unidas por puentes disulfuro. Las isoformas se unen a dos receptores celulares de superficie diferentes pero estructuralmente relacionados. PGDF-R-A y PGDF-R-B. El receptor de tipo A une las tres isoformas PGDF-AA, PGDF-AB, y PGDF-BB), mientras que el receptor de tipo B une sólo PGDF-BB y PGDF-AB. Se ha sugerido que PDGF es un ligando bivalente que activa a su receptor por dimerización [Hammacher, A. y col., EMBO J. 8, 2489-2495 (1989)], y se ha demostrado que la dimerización se produce después de la unión del ligando y está estrechamente asociada con la activación de la quinasa del receptor [Heldin, C-H y col., J. Biol. Chem. 264, 8905-8912 (1989)].
La subclase IV de los receptores con actividad tirosina quinasa incluye los recientemente descritos receptores de FGF ácido (FGF-R flg) y FGF básico (FGF-R bek) (Ruta, M. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 86, 8722-8726 (1989) y Pasquale, E. B. y Singer, S.J., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 86, 5449-5453 (1989), y la bibliografía citada en dichos artículos]. Estos receptores presentan tres repeticiones de secuencia relacionadas en sus dominios extracelulares, y presentan una débil pero significativa homología con la región correspondiente del receptor de IL-1.
La expresión "la superfamilia del receptor de la hematopoyetina" se usa para definir receptores transmembrana de paso único, con una arquitectura de tres dominios: un dominio extracelular que une el ligando activador, un segmento transmembrana corto y un dominio que reside en el citoplasma. Los dominios extracelulares de estos receptores tienen una baja pero significativa homología con sus dominios extracelulares de unión al ligando que comprenden aproximadamente 200-210 aminoácidos. La región homóloga se caracteriza por cuatro residuos de cisteína localizados en el extremo N terminal de la región, y un motivo Trp-Ser-X-Trp-Ser (WSXWS) localizado justo fuera del dominio transmembrana. En Cosman, D. y col., (1990), citado con anterioridad, se ofrecen detalles estructurales y funcionales adicionales de estos tres receptores. Los receptores de IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, prolactina, lactógeno placentario, hormona del crecimiento GM-CSF, G-CSF, M-CSF y eritropoyetina, por ejemplo, han sido identificados como miembros de esta familia de receptores.
La oligomerización inducida por IL-2 de un receptor de IL-2, se ha descrito, por ejemplo, en Ogura, T. y col., Mol. Biol. Med. 5, 123-13 (1988). Demostraron que la unión con alta afinidad de IL-2 a su receptor da lugar a la formación de un complejo ternario, que comprende la subunidad a del receptor de IL-2 (p55), la subunidad b (p75, también conocida como el "conversor" e IL-2, por un enlace cruzado químico) En Cunningham, B.C. y col., (1991), citado con anterioridad, se propone la dimerización del dominio extracelular de hGH-R por una sola molécula de hGH como un hecho relevante para el mecanismo de transducción de señales del receptor de hGH y otros receptores de citocinas relacionados.
La expresión "superfamilia del receptor del factor de crecimiento nervioso" (NGFR) se usa para describir una familia de proteínas de membrana por la presencia de motivos ricos en cisteína originalmente identificados en el NGFR de baja afinidad. Esta superfamilia, descrita por primera vez en Mallett, S. y Barclay, A. N., citado con anterioridad, incluye dos receptores del factor de necrosis tumoral (TNFR-I y TNFR-II) dos proteínas de linfocitos de función aún sin determinar.
Los términos "primer receptor" y "segundo receptor" se usan en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones para designar receptores capaces de formar heterooligómeros (heterodímeros) in vivo como resultado de la activación del receptor inducida por ligando. Tales receptores normalmente se localizan en tipos celulares similares (preferentemente idénticos), y pueden, pero no es necesario, presentar una homología estructural. En una forma de realización específica, el primer y el segundo receptor presentan al menos aproximadamente un 75% de homología y preferentemente al menos aproximadamente un 80%, más preferentemente al menos un aproximadamente 85% de homología en sus dominios activos, y preferentemente tienen funciones fisiológicas similares. Antes se ha mencionado que entre los receptores podrían existir complejos heterorreceptores como por ejemplo GDF-R-A y -B, EGF-R y HER2/neu, o insulina-R e IGF-1-R. Los receptores de HGF y una proteína tipo HGF codificada por un gen recientemente identificado en el locus DNF15S2 del cromosoma 3 humano 3p21) [Han, S. y col., Biochemistry 30, 9768-9780 (1991)] también son candidatos para formar heterodímeros. La formación de heterodímeros entre dos receptores se puede detectar con procedimientos habituales de química analítica, por ejemplo, electroforesis en gel no desnaturalizante. En un procedimiento preferente, la interacción de los receptores se puede estabilizar usando un agente reticulante covalente, esencialmente como se describe para EGF-R en Cochet, C. y col. (1988), citado con anterioridad, y los receptores entrecruzados y unidos covalentemente se pueden analizar en una electroforesis en gel con SDS.
El término "ligando" se usa para designar una molécula orgánica o un péptido o una secuencia polipeptídica capaz de unirse específicamente a un receptor como previamente se ha definido. La definición incluye cualquier ligando nativo de un receptor o cualquier región o derivado que mantenga al menos una capacidad de unión al receptor cualitativa. Se excluyen específicamente de esta definición (agonista y antagonista) los anticuerpos contra un receptor y los conjugados no covalentes de un anticuerpo y un antígeno de dicho anticuerpo.
En las moléculas usadas según la presente invención, el primer y el segundo ligando pueden ser idénticos o diferentes, e incluyen dos dominios de unión a receptor diferentes de los de un ligando bivalente nativo, o al menos los dominios de unión al receptor de dos ligandos idénticos o diferentes para el mismo receptor o dos diferentes, y derivados de dichas secuencias nativas de unión al receptor. Se ha propuesto que podrían existir complejos híbridos entre receptores estructural y funcionalmente similares como parte del mecanismo de activación de la oligomerización. Dichos receptores son, por ejemplo, los receptores de PDGF tipo A y tipo B, EGF-R y HER2/neu, insulina-R e IGF-1-R. En algunos casos, al formación de heterodímeros ya ha sido demostrada [Hammacher y col. (1989), citado con anterioridad; Soos y Siddle (1989), citado con anterioridad]. Las moléculas que comprenden los dominios de los ligandos de unión al receptor para tales receptores estrechamente relacionados, están específicamente incluidos en el alcance de la presente memoria descriptiva.
El término "derivado" se usa para definir la secuencia aminoacídica y las variantes de glicosilación y las modificaciones covalentes de un ligando nativo.
El término "variante" se usa para definir la secuencia aminoacídica y las variantes de glicosilación de un ligando nativo.
Los términos "ligando nativo" y "ligando silvestre" se usan indistintamente y se refieren a la secuencia aminoacídica del ligando que aparece de modo natural ("ligando de secuencia nativa"), incluyendo las formas maduras, prepro y pro de tales ligandos, purificados a partir de un origen natural, sintetizados químicamente o producidos recombinantemente. Se comprenderá que existen variantes alélicas naturales y que éstas pueden aparecer en los individuos, como se demuestra en una o más diferencias en la secuencia aminoacídica de cada individuo. Estas variaciones alélicas entran específicamente en el alcance de la presente memoria descriptiva.
Los términos "aminoácido" y "aminoácidos" se refieren a todos los L-\alpha-aminoácidos naturales. Los aminoácidos se identifican con una sola letra o con denominaciones de tres letras.
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Asp D ácido aspártico Ile I isoleucina
Thr T treonina Leu L leucina
Ser S serina Tyr Y tirosina
Glu E ácido glutámico Phe F fenilalanina
Pro P prolina His H histidina
Gly G glicina Lys K lisina
Ala A alanina Arg R arginina
Cys C cisteína Trp W triptófano
Val V valina Gln Q glutamina
Met M metionina Asn N asparragina
Estos aminoácidos se pueden clasificar según la composición química y las propiedades de sus cadenas laterales. Se clasifican en dos grandes grupos generales, con carga y sin carga. Cada uno de estos grupos se divide en subgrupos para clasificar los aminoácidos con más precisión:
I. Aminoácidos con carga
Residuos ácidos: ácido aspártico, ácido glutámico
Residuos básicos: lisina, arginina, histidina
II. Aminoácidos sin carga
Residuos hidrófilos: serina, treonina, asparragina, glutamina
Residuos alifáticos: glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina
Residuos apolares: cisteína, metionina, prolina
Residuos aromáticos: fenilalanina, tirosina, triptófano.
El término "variante de secuencia aminoacídica" se refiere a moléculas con diferencias en sus secuencias aminoacídicas en comparación con una secuencia aminoacídica nativa. Normalmente, las variantes de secuencia aminoacídica poseerán al menos aproximadamente un 70% de homología con al menos un dominio de unión al receptor de un ligando nativo, y preferentemente, tendrán al menos aproximadamente un 80%, más preferentemente al menos aproximadamente un 90% de homología con un dominio de unión al receptor de un ligando nativo. Las variantes de secuencia aminoacídica poseen sustituciones, deleciones y/o inserciones en determinadas posiciones dentro de la secuencia aminoacídica del ligando nativo.
Se define "homología" como el porcentaje de residuos en la secuencia aminoacídica candidata que son idénticos a los residuos de la secuencia aminoacídica de un dominio de unión al receptor de un ligando nativo tras alinear las secuencias e introducir espacios, si fuera necesario, para lograr el porcentaje de homología máximo. Los procedimientos y programas informáticos para establecer dicha alineación son bien conocidos en la técnica.
Las variantes por sustitución son en las que al menos se elimina un residuo aminoacídico de una secuencia nativa y se inserta un aminoácido diferente su lugar y en la misma posición. Las sustituciones pueden ser únicas, en las que sólo se sustituye un aminoácido en la molécula, o pueden ser múltiples, en las que se sustituyen dos o más aminoácidos en la misma molécula.
Las variantes por inserción son aquellas en las que se inserta uno o más aminoácidos inmediatamente después de un aminoácido en una posición particular de la secuencia nativa de un ligando. Inmediatamente después de un aminoácido significa conectado al grupo funcional \alpha-carboxi o \alpha-amino del aminoácido.
Las variantes por deleción son aquellas en las que se elimina uno o más aminoácidos de la secuencia aminoacídica nativa del ligando. Normalmente, las variantes por deleción tendrán uno o dos aminoácidos eliminados en una región particular de la molécula.
El término "variante por glicosilación" se usa para referirse a un ligando con un perfil de glicosilación distinto del ligando nativo. La glicosilación de polipéptidos es generalmente por enlace tipo N o tipo O. Por enlace tipo N se refiere al anclaje del residuo glucídico en la cadena lateral de un residuo de asparragina. Las secuencias de tripéptidos asparragina-X-serina y asparragina-X-treonina, en las que X es cualquier aminoácido excepto la prolina, son las secuencias de reconocimiento para las uniones enzimáticas del residuo glucídico a la cadena lateral de asparragina. La glicosilación por enlace tipo O se refiere al anclaje de uno de los azúcares: N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, aunque también se puede utilizar 5-hidroxiprolina y 5-hidroxilisina. Cualquier diferencia en la localización y/o naturaleza de los residuos glucídicos presentes en un ligando en comparación con su homólogo nativo está incluida en el alcance de la presente memoria descriptiva.
El patrón de glicosilación de los ligandos nativos se puede determinar por técnicas muy conocidas de química analítica, incluyendo la cromatografía HPAE [Hardy, M.R. y col., Anal. Biochem. 170, 54-62 (1988)], methylation analysis to determine glycosyl-linkage composition [Lindberg, B., Meth. Enzymol. 28, 178-195 (1972); Waeghe, T.J. y col., Carbohydr. Res. 123, 281-304 (1983)), espectroscopía por RMN, espectrometría de masas, etc.
Por comodidad, los cambios en el patrón de glicosilación de un ligando nativo por lo general se realizan a nivel del ADN, esencialmente usando las técnicas abordadas previamente con respecto a las variantes de secuencia aminoacídica.
La adición química o enzimática de glicósidos a los ligandos de la presente invención también puede usarse para modificar o incrementar el número o el perfil de los grupos glucídicos. Estos procedimientos tiene la ventaja de que no necesitan producir el polipéptido que sea capaz de glicosilarse por enlace tipo O (o tipo N). Dependiendo del modo de adición usado, el(los) glúcido(s) se puede enlazar a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c), grupos hidroxilo libres como por ejemplo, de cisteína, (d) grupos sulfidrilo libres como los de la serina, treonina, o la hidroxiprolina, (e) residuos aromáticos como los de la fenilalanina, tirosina o triptófano o (f) el grupo amida de la glutamina. Estos procedimientos se describen en el documento 87/05330 (publicado el 11 de septiembre de 1987), y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., págs. 259-306
Los residuos glucídicos presentes en un ligando también se puede eliminar química o enzimáticamente. La desglicosilación química requiere la exposición al ácido trifluorometansulfónico o a un compuesto equivalente. Este tratamiento produce la escisión de la mayoría o de todos los glúcidos, salvo el glúcido de enlace, mientras que el polipéptido queda intacto. La desglicosilación química se describe en Hakimuddin y col., Arch. Biochem. Biophys. 259, 52 (1987) y en Edge y col., Anal. Biochem. 118, 131 (1981). Los residuos glucídicos se pueden eliminar usando varias endo y exoglicosidasas como se describe en Thotakura y col., Meth. Enzymol. 138, 350 (1987). La glicosilación se suprime con tunicamicina como se describe en Duskin y col., J. Biol. Chem. 257, 3105 (1982). La tunicamicina bloquea la formación de los enlaces N-glicosídicos de las proteínas.
Las variantes por glicosilación de los ligandos de la presente memoria descriptiva también se pueden producir seleccionando las células hospedadoras apropiadas. La levadura, por ejemplo, introduce una glicosilación que varía significativamente de la de los sistemas de mamíferos. De modo similar, habitualmente se analizan células de mamífero con un origen diferente de la fuente del ligando, ya sea de especie (por ejemplo, hámster, murino, insecto, porcino, bovino u ovino) o de tejido (por ejemplo, pulmón, hígado, linfático, mesenquimal o epidérmico), para comprobar su capacidad de introducir un patrón de glicosilación variante.
Los términos "variante de ligando" y "ligando variante", que se usan indistintamente, incluyen tanto variantes de secuencia aminoacídica como variantes de glicosilación de un ligando nativo.
Los "derivados covalentes" incluyen modificaciones de un ligando nativo con un agente derivatizante orgánico proteináceo o no proteináceo, y modificaciones postraduccionales. Las modificaciones covalentes tradicionalmente se introducen haciendo reaccionar los residuos aminoacídicos diana del ligando con un agente derivatizante orgánico que sea capaz de reaccionar con las cadenas laterales seleccionadas o con los residuos terminales, o por mecanismos tipo arnés de modificaciones postraduccionales que funcionan en las células hospedadoras recombinantes seleccionadas. Los derivados covalentes resultantes son útiles en los programas dirigidos a la identificación de residuos importantes para la actividad biológica, para inmunoanálisis, o para la preparación de anticuerpo anti ligando para purificar por inmunoafinidad la glicoproteína recombinante. Tales modificaciones son conocidas por cualquier experto en la materia y para su realización no es necesaria mucha experiencia. Determinadas modificaciones postraduccionales son el resultado de la acción de las células hospedadoras recombinantes sobre el polipéptido expresado. Los residuos glutaminilo y asparraginilo frecuentemente se desamidan tras la traducción a los residuos glutamilo y aspartilo correspondientes. Alternativamente, estos residuos se desamidan en condiciones levemente ácidas. Cualquier forma de estos residuos puede estar presente en los ligandos usados según la presente invención. Otras modificaciones postraduccionales incluyen la hidroxilación de la prolina y la lisina, fosforilación de los grupos hidroxilo de los residuos serilo o treonilo, la metilación de los grupos \alpha-amino de las cadenas laterales de la lisina, la arginina y la histidina [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, págs. 79-86 (1983)].
Los derivados covalentes específicamente incluyen las moléculas de fusión en las que los ligandos de la invención se unen covalentemente a polímeros no proteináceos. El polímero no proteináceo normalmente es un polímero hidrófilo sintético, es decir un polímero que no se encontraría en la naturaleza. Sin embargo, son útiles los polímeros que existen en la naturaleza y se producen por procedimientos recombinantes o in vitro, ya que son polímeros que se aíslan de la naturaleza. Los polímeros de polivinilo hidrófilos están incluidos en el alcance de esta invención, por ejemplo alcohol polivinílico y polivinilpirrolidona. Son particularmente útiles los éteres de polivinilalquileno como por ejemplo, el polietilenglicol (macrogol) o polipropilenglicol.
Los ligandos se pueden unir a varios polímeros no proteináceos, como por ejemplo polietilenglicol, polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la manera expuesta en las patentes de EE.UU. Nº 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 ó 4.179.337.
Los ligandos nativos y los derivados que pueden activar receptores según la presente invención son muy conocidos en la técnica o se pueden preparar con procedimientos muy conocidos en la técnica.
La operabilidad de la presente invención se demostró primero con los pares receptor/ligando HGFr/HGF o HGF variante. Inicialmente se identificó a HGF como un mitógeno en hepatocitos [Michalopoulos y col., Cancer Res. 44, 4414-4419 (1984); Russel y col., J. Cell. Physiol. 119, 183-192 (1984) y Nakamura y col., Biochem. Biophys. Res. Comm. 122: 1450-1459 (1984)]. En Nakamura y col., citado con anterioridad, se describió la purificación de HGF a partir de suero de ratas parcialmente hepatectomizadas. Posteriormente, HGF se purificó a partir de plaquetas de rata, y se determinaron sus subunidades estructurales [Nakamura y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 83, 6489-6493 (1986); y Nakamura y col., FEBS Letters 224, 311-316 (1987)]. La purificación de HGF humana (huHGF) a partir de plasma humano se describió por primera vez en Gohda y col., J. Clin. Invest. 81, 414-419 (1988).
Se ha subclonado tanto la HGF de rata como la huHGF, incluyendo la clonación y secuenciación de una variante natural que carece de 5 aminoácidos denominada "\Delta5 HGF" [Miyazawa y col., Biochem. Biophys. Res. Comm. 163, 967-973 (1989); Nakamura y col., Nature 342, 440-443 (1989), Seki y col, Biochem. y Biophys. Res. Commun. 172, 321-327 (1990); Tashiro y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 87, 3200-3204 (1990); Okajima y col., Eur. J. Biochem. 193, 375-381 (1990)].
La forma madura de huHGF, que corresponde con la principal forma purificada a partir de suero humano, es un heterodímero unido por puentes disulfuro derivado de un corte proteolítico de la prohormona humana entre los aminoácidos R494 y V495. Este proceso de corte genera una molécula compuesta por una subunidad a de 440 aminoácidos (Mr 69 kDa) y una subunidad b de 234 aminoácidos (Mr 34 kDa). La secuencia nucleotídica del ADNc de hHGF revela que tanto la cadena \alpha como la cadena \beta están incluidas en una sola pauta abierta de lectura que codifica un preproproteína precursora. En la estructura primaria teórica del hGHF maduro, se forma un puente S-S entre las cadenas entre la Cys 487 de la cadena \alpha y la Cys 604 de la cadena \beta (véase Nakamura y col., Nature, citado con anterioridad). El extremo N terminal de la cadena \alpha está precedido de 54 aminoácidos, comenzado con un grupo metionina. Este segmento incluye una señal guía hidrófoba característica de 31 residuos y la prosecuencia. La cadena \alpha comienza en el aminoácido (aa) 55, y contiene cuatro dominios Kringle. El dominio 1 Kringle se extiende entre aproximadamente el aa 128 hasta aproximadamente el aa 206, el dominio 2 Kringle está entre aproximadamente el aa 211 y aproximadamente el aa 288, el dominio 3 Kringle se extiende por definición entre aproximadamente el aa 303 hasta aproximadamente el 383, el dominio 4 Kringle se extiende desde aproximadamente el aa 391 hasta aproximadamente el aa 464 de la cadena \alpha. Se comprenderá que la definición de los varios dominios Kringle está basada en su homología con los dominios tipo Kringle de otras proteínas (protrombina, plasminógeno), por lo tanto, los límites anteriores son sólo aproximaciones. Por ahora, no se ha determinado la función de estos dominios Kringle. La cadena \beta de huHGF tiene una alta homología con el dominio catalítico de las serina proteasas (38% de homología con el dominio serina proteasa del plasminógeno). Sin embargo, dos de los tres residuos que forma la tríada catalítica de serina proteasas no están conservadas en HGF. Por lo tanto, a pesar de su dominio tipo serina proteasa, hHGF no parece tener actividad proteolítica y todavía se desconoce el papel preciso de la cadena \beta. HGF contiene cuatro sitios de glicosilación putativos, que se localizan en las posiciones 294 y 402 de la cadena \alpha y en las posiciones 566 y 653 de la cadena \beta.
En una porción de ADNc aislado a partir de leucocitos humanos se observó una deleción de 15 pares de bases en pauta de lectura. La expresión temporal de la secuencia de ADNc en células COS-1 reveló que la molécula HGF codificada (\DeltaHGF) que carecía de 5 aminoácidos en el dominio 1 Kringle era totalmente funcional (Seki y col., citado con anterioridad).
Recientemente se ha identificado una variante natural de huHGF que corresponde al transcrito de huHGF de ayuste alternativo que contiene las secuencias codificadoras del dedo N terminal y los dos primeros dominios Kringle del huHGF maduro [Chan y col., Science 254, 1382-1385 (1991); Miyazawa y col., Eur. J. Biochem. 197, 15-22 (1991)]. Esta variante, denominada HGF/NK2, ha sido propuesta como un antagonista competitivo del huHGF humano.
La comparación de la secuencia aminoacídica del HGF de rata con la de huHGF reveló que las dos secuencias están muy conservadas y que tienen las mismas características estructurales. La longitud de los cuatro dominios Kringle del HGF de rata es exactamente la misma en huHGF. Además, los residuos de cisteína se localizan exactamente en las mismas posiciones; como una indicación de estructuras tridimensionales similares (Okajima y col., supra; Tashiro y col., citado con anterioridad).
Como se usa en la presente memoria descriptiva, los términos "factor de crecimiento hepatocítico", "HGF" y "huHGF" se refieren a un factor de crecimiento (humano) capaz de unirse específicamente al receptor de un HGF silvestre (humano), teniendo típicamente dicho factor de crecimiento una estructura con seis dominios (dominios dedo, Kringle 1, Kringle 2, Kringle 3, Kringle 4 y serina proteasa), pero, sin embargo, puede tener un menor número de dominios o puede tener alguno de sus dominios repetido si mantiene su cualitativa capacidad de unión de unión al receptor de HGF. Esta definición incluye específicamente el \Delta5 huHGF como se desvela en Seki y col., citado con anterioridad. Los términos "factor de crecimiento hepatocítico" y "HGF" incluyen además el factor de crecimiento hepatocítico de cualquier especie animal no humana, y en particular el HGF de rata.
Los términos "factor de crecimiento hepatocítico humano silvestre", "factor de crecimiento hepatocítico humano nativo", "huHGF silvestre (wt)", y "huHGF nativo" se refiere a la secuencia nativa humana de HGF, es decir, el codificado por la secuencia de ADNc publicada en Miyazawa, y col. 1989, citado con anterioridad, o Nakamura y col., 1989, citado con anterioridad, incluyendo sus formas madura, pre, pre-pro, y pro, purificado a partir de un origen natural, sintetizado químicamente o producido recombinantemente. Las secuencias descritas en Miyazawa y col. y Nakamura y col. difieren en 14 aminoácidos. La razón para las diferencias no es del todo clara; entre las posibilidades se encuentran el polimorfismo, o los artefactos de clonación. Ambas secuencias se incluyen específicamente en los términos anteriores como se define para el propósito de la presente invención. Se comprenderá que existen variantes alélicas naturales y que éstas pueden aparecer en los individuos, como se demuestra en una o más diferencias en la secuencia aminoacídica de cada individuo. Las posiciones aminoacídicas en las moléculas de huHGF variantes de la presente memoria descriptiva están indicadas según la numeración de Miyazawa y col. 1989, citado con anterioridad.
Durante el transcurso de un reciente estudio de la relación estructura-actividad y estructura-capacidad de unión al receptor en variantes de secuencia aminoacídica de HGF, cuyos resultados se desvelan en los ejemplos siguientes, en la secuencia aminoacídica de HGF silvestre se han identificado dominios críticos para la capacidad de unión del ligando y/o de la activación. Se realizaron varios truncamientos del extremo C terminal de HGF delecionando la cadena \beta o la cadena \beta junto con un número progresivo de dominios Kringle. La deleción del primer dominio Kringle (variante \DeltaK1) de HGF afectó principalmente a la actividad biológica, mostrando al menos una reducción de 100 veces (SA< 0,2% de rhuHGF wt). De modo similar, la capacidad de unión de esta variante también se vio afectada ya que no es capaz de competir por la unión con rhuHGF wt. La deleción del resto de dominios Kringle (variantes \DeltaK2, \DeltaK3 o \DeltaK4) también induce una drástica reducción de la actividad mitogénica. Sin embargo, las afinidades de unión al receptor (Kd) de estas variantes por deleción fueron próximas a las observadas con el rhuHGF wt. Estos datos mostraron que los dominios Kringle K3 y K4 no son necesarios para la capacidad de unión al receptor y concordaban con las observaciones previas de Miyazawa y col., 1991 citado con anterioridad, Chan y col., 1991 citado con anterioridad, en el sentido de que la variante N- 303, cuya secuencia aminoacídica es muy similar a HGF/NK2, conserva la capacidad de competir eficientemente por la unión al receptor de HGF (Kd-280 pM). Además, las observaciones de que N-303 es suficiente para la unión al receptor y que el segundo dominio kringle no es necesario para la unión al receptor de HGF (en el contexto del resto de la molécula) sugieren que el dominio de unión al receptor está contenido en el dominio del dedo y el primer dominio Kringle de huHGF.
Para elucidar la importancia funcional del dominio proteasa de HGF, se realizaron varias mutaciones sencillas, dobles y triples para reconstituir un sitio potencial serina proteasa. Las sustituciones de aminoácidos se realizaron en las posiciones 534, 673 y 692 de la secuencia aminoacídica de hHGF silvestre. En la mayoría de los casos, la actividad biológica se redujo sustancialmente sin una sustancial disminución de la afinidad de unión del ligando. La actividad biológica de las variantes dobles Q534H, Y673S y Y673S, V692S y de la triple variante Q534H, Y673S, V692S fue menor del 3% en comparación con el rhuHGF WT. Sin embargo, la Kd de estas variantes no fue significativamente diferente de la Kd de la molécula de HGF humana silvestre. Estos resultados indican que ciertas mutaciones en la cadena \beta de HGF bloquean la actividad mitogénica pero no tienen un efecto significativo sobre la afinidad de unión al receptor de HGF. De este modo, parece que estos mutantes carecen de una actividad posterior a la unión al receptor.
Las alteraciones que aumentan potencialmente la capacidad de unión al receptor de HGF, de dan, por ejemplo, en la región aminoacídica que corresponde al sitio activo potencial serina proteasa. Esta región incluye los aminoácidos Q534, Y673 y V692 en la secuencia aminoacídica del huHGF silvestre. Se cree que la sustitución de estos aminoácidos por otro aminoácido, y preferentemente por aminoácidos con un tamaño o una polaridad diferente mejora adicionalmente las propiedades de unión al receptor de la variante de HFG.
Puede haber alteraciones adicionales en el extremo C terminal y/o en los dominios Kringle de la molécula de HGF. Además de los mutantes por deleción antes mencionados, son de gran interés las variantes de HGF con alteraciones en el dominio kringle. Como hemos descubierto que el dominio de unión al receptor está contenido en las regiones dedo y Kringle 1 de la molécula de HGF, se espera que las alteraciones de aminoácidos en estos dominios alteren significativamente las propiedades de unión al receptor (y la actividad biológica) de las variantes de la presente invención. Es particularmente probable que las alteraciones en los residuos que están más expuestos hacia el interior de la estructura kringle (residuos con carga principalmente) provoquen cambios profundos en las propiedades de unión receptor y/o en la actividad biológica de las variantes de HGF.
Hay comercialmente disponibles otros ligandos para receptores con actividad tirosina quinasa (por ejemplo, insulina) y/o están caracterizados por sus secuencias nucleotídicas las aminoacídicas deducidas. También se conocen sus actividades biológicas.
Se conoce a EGF y a proteínas relacionadas [Carpenter, G. y Cohen, S. Ann. Rev. Biochem. 48, 193-216 (1979); Massanque, J., J. Biol. Chem. 255, 21393-21396 (1990); Gray, A. y col., Nature 303, 722-725 (1983); Bell, G. I. y col., Nucl. Acid. Res. 14, 8427-8446 (1986)].
La secuencias aminoacídicas y la preparación de factores de crecimiento humano tipo insulina 1 y 2 (IGF-I e IGF-II) se describe, por ejemplo en el documento EP128.733 (publicado el 19 de diciembre de 1984).
Los ligandos para HER2/neu (p185HER2) se han denominado polipéptidos "herregulina-2" (HRG2), e incluyen HRG2-\alpha y HRG2-\beta1, -\beta2 y -\beta3. La estructura, preparación y uso de estos ligandos y sus derivados, incluyendo las variantes de secuencias aminoacídicas se desvelan en las solicitudes de EE.UU. copendientes con Nº de serie: 07/705.256 (depositada el 24 de mayo de 1991); 07/790.801 (depositada el 8 de noviembre de 1991) y 07/880.917 (depositada el 11 de mayo de 1992). La secuencia aminoacídica de HRG comparte varias características con la familia de factores de crecimiento transmembrana de EGF. La alineación de las secuencias aminoacídicas en la región del motivo EGF y el dominio transmembrana flanqueante de varias proteínas relacionadas con el EGF humano presentan un grado de homología relativamente grande con el factor de crecimiento tipo EGF de unión a la heparina (HB-EGF) [Higashiyama y col., Science 251, 936-939 (1991); amphiregulin (AR) [Plowman, G.D. y col., Mol. Cell. Biol. 10. 1969-1981 (1990)]; factor alfa de crecimiento transformador (TGF-\alpha); EGF [Bell, G.I. y col. (1986), citado con anterioridad] y el factor de crecimiento derivado de schwanoma [Kimura, H. y col., 348, 257-260 (1990)].
Un representante típico de ligandos bivalentes para receptores con actividad tirosina quinasa es el factor de crecimiento plaquetario (PDGF). El PDGF es un mitógeno principal del suero para el cultivo de células derivadas de tejido conectivo [véase Ross, R. y col., Cell 46, 155-169 (1986) para una revisión]. Es un dímero de 30 kDa compuesto por cadenas polipeptídicas A y B unidas por puentes disulfuro. Se han identificado y purificado las tres isoformas posibles de las dos cadenas, PDGF-AA, PDGF-AB, y PDGF-BB a partir de de fuentes naturales [Heldin, C.-H. y col., Nature 319, 511-514 (1986); Hammacher, A. y col., Eur. J. Biochem. 176, 1790186 (1988); Stroobant, P. y Waterfield, M.D., EMBO J. 3, 2963-2967 (1984)]. Se ha descubierto que las diferentes isoformas difieren en las actividades funcionales, muy probablemente debido a diferentes especifidades de unión para dos clases diferentes de receptores [Nister, M. y col., Cell 52, 791-799 (1988); Heldin, C.-H. y col., EMBO J. 7, 1387-1393 (1988); Hart, C.E. y col., Science 240, 1529-1531 (1988)]. El receptor de PDGF tipo A une las tres isoformas de PDGF, mientras que el receptor tipo B une PDGF-BB con mayor afinidad y PDGF-AB con menor afinidad pero no une PDGF-AA con ninguna afinidad apreciable.
Otro ligando bivalente es la hormona del crecimiento humana (hGH). La hGH es un miembro de una familia de hormonas homólogas que incluye los lactógenos placentarios, las prolactinas y otras variantes específicas y genéticas de la hormona del crecimiento, y normalmente se denomina familia de las hematopoyetinas, incluyendo las hormonas hipofisarias y hematopoyéticas [Nicoll, C.S. y col., Endocrine Reviews 7, 169 (1986)]. Se ha expresado el gen de hGH clonado en una forma de secreción en E. coli [Chang, C.N. y col., Gene 55, 189 (1987)], y se han descrito sus secuencias nucleotídica y aminoacídica [Goeddel y col., Nature 281, 544 (1979); Gray y col., Gene 39, 247 (1985)]. Se ha descrito el patrón de plegamiento tridimensional de la hormona del crecimiento porcina (pGH) [Abdel-Meguid, S.S. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 84 6434 (1987)]. Se ha identificado el receptor de hGH y los centros de unión a anticuerpo con mutagénesis de exploración de homología [Cunningham, B. y col., Science 243, 1330 (1989)]. Se conocen variantes de GH con truncamientos en el extremo N terminal o con mutaciones en la región N terminal [Gertler y col., Endocrinology 118, 720 (1986); Ashkenazi, A. y col., Endocrinology 121, 414 (1987); y Binder, Mol. Endo. 7, 1060-1068 (1990)]. Las variantes antagonistas de hGH se describieron en Chan y col., Mol. Endo. 5, 1845 (1991) y en la bibliografía citada en dicho artículo, y en el documento WO 91/05853. Las variantes de hGH también se desvelan en Cunningham y col., Science 244, 1081 (1989); y Science 243, 1330-1336 (1989).
Recientemente se han determinado las estructuras de otros varios ligandos hematopoyéticos. El factor estimulador de colonias granulocíticas-macrofágicas (GM-CSF) e IL-4 tienen aproximadamente 60 residuos menos que la hormona del crecimiento. Tanto la estructura cristalizada de GM-CSF [Diederichs, K. y col., Science 254, 1779-1782 (1991); Walter, M. R. y co., J. Mol. Biol. 224, 1075-1085 (1992)], y la estructura por RMN de IL-4 [Powers, R. y col., Science 256, 1673-1677 (1992); Smith, L. J. y col., J. Mol. Biol. 224, 899-904 (1992)] revelan la misma topoligía que GH, pero con un motivo estructural adicional no visto antes: un segmento corto en lámina \beta formado por residuos con largas conexiones entrecruzadas. A partir de esta evidencia, parece que existen dos sitios de unión al receptor convervados topológicamente comunes en todas las hematopoyetinas. Mientras que hGH usa estos dos sitios para unirse a dos copias del mismo receptor, en muchos otros casos como IL-2, IL-3, GM-CSF y otros, los segmentos equivalentes pueden formar puntos de contacto y unión para dos subunidades de receptores diferentes.
Los dominios de unión al receptor en una secuencia de un ligando nativo se pueden determinar con procedimientos conocidos en la técnica, incluyendo estudios de rayos X, análisis mutacionales y estudios de unión a anticuerpos. Los enfoques mutacionales incluyen técnicas de mutagénesis por saturación aleatoria acoplada a la selección de mutantes de escape, mutagénesis por inserción, y mutagénesis por exploración de homología (sustitución de secuencias de ligandos humanos, que se unen a los receptores correspondientes, con secuencias no conservadas de un ligando correspondiente de otra especie animal, por ejemplo, el ratón, que no se una al receptor humano). Otra estrategia adecuada para identificar dominios de unión a receptor en ligandos se conoce como mutagénesis por barrido de alanina [ALA-scan, Cunningham y wells, Science 244, 1081-1985 (1989)]. Este procedimiento implica la identificación de regiones que contengan cadenas laterales con aminoácidos con carga. Los residuos con carga de cada región identificada (es decir, Arg, Asp, His, Lys, y Glu) se reemplazan (una región por por molécula mutante) por alanina y se estudia la capacidad de unión al receptor de los ligandos obtenidos, para valorar la importancia de una región particular en la unión al receptor. Otro procedimiento para identificar dominios activos en los polipéptidos entre varias variantes de hGH se desvela en el documento WO90/04788 (publicado el 3 de mayo de 1990). Según este procedimiento, se determinan los dominios activos (por ejemplo, dominios de unión al receptor) en un polipéptido sustituyendo segmentos de aminoácidos seleccionados del polipéptido con un segmento polipeptídico análogo de un análogo del polipéptido que tenga una actividad diferente con la sustancia diana (por ejemplo, un receptor) en comparación con el polipéptido parental. Un potente procedimiento adicional para la localización de dominios de unión a un receptor en un ligando se realiza mediante el uso de anticuerpos monoclonales (mAbs) neutralizantes (bloqueantes). Normalmente, se usa una combi-
nación de estos procedimientos y otros similares para localizar los dominios importantes para la unión a un receptor.
Los derivados, como por ejemplo las variantes de secuencia aminoacídica, de los anteriores y otros ligandos para receptores que requieren una oligomerización para la activación de la función del receptor también son conocidos o se pueden preparar fácilmente empleando procedimientos conocidos en la técnica, como por ejemplo la mutagénesis dirigida del ADN que codifica el precursor o el ligando parental, produciendo así el ADN que codifica la variante. Las modificaciones del ADN que codifica las moléculas de ligando variantes no se deben situar en la secuencia fuera de pauta de lectura, y preferentemente no crearán regiones complementarias que pudieran producir estructuras secundarias en el ARNm. El ADN que codifica el ligando variante se inserta en un vector de expresión apropiado, y se transfectan células hospedadoras adecuadas con dicho ADN. El cultivo de las células hospedadoras en un medio apropiado tendrá como resultado la producción de los polipéptidos codificados por el ADN, y la secreción de los polipéptidos
en el medio de cultivo de las células hospedadoras. Estas técnicas se describen con más detalle en lo sucesivo.
Alternativamente, las variantes aminoacídicas de las moléculas del ligando nativo se preparan por síntesis in vitro usando procedimientos de síntesis peptídica en fase sólida habituales como se describe en (J. Am. Chem. Soc. 85:2149 [1963]), aunque se pueden emplear otros procedimientos de síntesis química conocidos en la técnica. La síntesis en fase sólida se inicia a partir del extremo C terminal del péptido uniendo un \alpha-aminoácido protegido a una resina adecuada. Los aminoácidos se unen a la cadena peptídica usando técnicas muy conocidas en la técnica para la formación de puentes peptídicos.
Las variantes por glicosilación de las moléculas del ligando nativo se pueden preparar mediante técnicas conocidas en la técnica. La adición de glicósidos química y enzimática a proteínas se puede realizar usando una variedad de grupos activados, por ejemplo, como describieron Alpin y Wriston en CRC Crit. Rev. Biochem. págs. 259-306 (1981). Las ventajas de las técnicas de adición química son que son relativamente simples y que no necesitan la complicada maquinaria enzimática necesaria para la glicosilación natural por enlaces tipo O y N. Dependiendo del modo de adición usado, el(los) glúcido(s) se puede enlazar a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, como los del ácido glutámico y el ácido aspártico (c), grupos sulfidrilo libres como los de la cisteína, (e) residuos aromáticos como los de la fenilalanina, tirosina o triptófano o (f) el grupo amida de la glutamina. Estos procedimientos están descritos en el documento WO87/05330 (publicado el 11 de septiembre de 1987). Los carbohidratos presentes en una molécula de un ligando nativo se pueden eliminar, por ejemplo, usando una endoglicosidasa, como por ejemplo la endoglicosidasa H (Endo-H), que es capaz de eliminar (parcialmente) oligosacáridos ricos en manosa e híbridos. Este tratamiento se realiza mediante técnicas conocidas per se, por ejemplo, según el procedimiento de Tarentino y col., J. Biol. Chem. 249, 811 (1974), Trimble y col., Anal. Biochem. 141, 515 (1984) y Little y col., Biochem. 23, 6191 (1984). Más preferentemente, las variantes por glicosilación de ligandos se realizan con mutaciones apropiadas a nivel del ADN, para proporcionar una proteína con el patrón de glicosilación alterado deseado.
Según la presente invención, se puede fusionar directamente uno con otro un primer y un segundo ligando (que pueden ser iguales o diferentes). Dichas moléculas de fusión se pueden preparar mediante la expresión de la secuencia codificadora de ADN en un microorganismo adecuado o en un cultivo celular, empleando técnicas habituales en la tecnología del ADN recombinante. Alternativamente, se pueden obtener por síntesis química.
El término "enlazador heterólogo" se usa para referirse a cualquier molécula enlazadora orgánica o inorgánica que unan dos ligandos (como se definió anteriormente), siempre que sean diferentes de un enlazador que conecte los ligandos en su entorno nativo, por ejemplo un ligando bivalente. Si los dos ligandos se conectan en su entorno nativo con una secuencia aminoacídica, las variantes codificadas por una secuencia de ADN capaces de hibridar en condiciones restrictivas con la secuencia de ADN que codifica dicha secuencia aminoacídica conectora se excluyen específicamente del término "enlazador heterólogo". Se entiende por "condiciones restrictivas" la incubación durante la noche a 37ºC en una solución que comprende: 40% de formamida, SSC 5X (NaCl 150 mM, citrato de trisodio 15 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 7,6), solución de Denhardt 5X, 10% de sulfato de dextrano y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado, seguida de un lavado de los filtros con SSC 1X aproximadamente a 50ºC.
En una forma de realización preferente, el enlazador comprende una secuencia de inmunoglobulina.
El término "inmunoglobulina" generalmente se refiere a polipéptidos que comprenden una cadena ligera o una cadena pesada unidas normalmente por puentes disulfuro en la configuración nativa tipo "Y", aunque en el alcance de la presente memoria descriptiva se incluyen otro tipo de enlaces, incluyendo tetrámeros o sus agregados.
Se conocen inmunoglobulinas (Ig) y determinadas variantes de las mismas y se han preparado en cultivo celular recombinantes. Por ejemplo, véase la patente de EE.UU. Nº 4.745.055; el documento EP256.654; Faulkner y col., Nature 298:286 (1982); los documentos EP120.694; EP125.023; Morrison, J. Immun. 123:793 (1979); Köhler y col., Proc. Nat'l. Acad. Sci. EE.UU 77:2197 (1980); Raso y col., Cancer Res. 41:2073 (1981); Morrison y col., Ann. Rev. Immunol. 2:239 (1984); Morrison, Science 229:1202 (1985); Morrison y col., Proc. Nat'l. Acad. Sci. EE.UU. 81:6851 (1984); los documentos EP255.694; EP266.663; y WO88/03559. También se conocen cadenas de inmunoglobulina reiterativas. Véase por ejemplo la patente de EE.UU. Nº 4.444.878, el documento WO88/68.763 y la bibliografía citada en dichos documentos. El residuo de inmunoglobulina en las quimeras de la presente invención se puede obtener a partir de IgG-1, IgG-2, IgG-3 or IgG-4 subtipos, IgA, IgE, IgD o IgM, pero preferentemente IgG-1 o IgG-3.
En la técnica se conocen las quimeras construidas a partir de una secuencia de receptor enlazada a una secuencia de un dominio constante de una inmunoglobulina apropiado (inmunoadhesinas). Las inmunoadhesinas descritas en la bibliografía incluyen fusiones de receptores* de linfocitos T [Gascoigne y col., Proc. Natl.Acad. Sci. EE.UU. 84, 2936-2940 (1987)]; CD4* [Capon y col., Nature 337, 525-531 (1989); Traunecker y col., Nature 339, 68-70 (1989); Zettmeissl y col., DNA Cell Biol. EE.UU. 9, 347-353 (1990); Byrn y col., Nature 344, 667-670 (1990)]; L-selectina (receptor de migración celular) [Watson y col., J. Cell. Biol. 110, 2221-2229 (1990); Watson y col., Nature 349, 164-167 (1991)]; CD44* [Aruffo y col., Cell 61, 1303-1313 (1990)]; CD28* y B7* [Linsley y col., J. Exp. Med. 173, 721-730 (1991)]; CTLA-4* [Lisley y col., J. Exp. Med. 174, 561-569 (1991)]; CD22* [Stamenkovic y col., Cell 66. 1133-1144 (1991)]; receptor de TNF [Ashkenazi y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 88, 10535-10539 (1991); Lesslauer y col., Eur. J. Immunol. 27, 2883-2886 (1991); Peppel y col., J. Exp. Med. 174, 1483-1489 (1991)]; receptores de NP [Bennett y col., J. Biol. Chem. 266, 23060-23067 (1991)]; cadena* a del receptor de IgE [Ridgway y Gorman, J. Cell. Biol. 115, resumen. 1448 (1991)]; receptor de HGF [Mark, M.R. y col., 1992, J. Biol. Chem. enviado], en los que el (*) indica que el receptor es miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas. Estas inmunoadhesinas se fabricaron con diferentes propósitos, sin embargo, todas tienen en común que pueden poseer muchas de las propiedades químicas y biológicas de los anticuerpos humanos.
Las quimeras ligando-inmunoglobulina se desvelan en las solicitudes copendientes con Nº de serie: 07/834.902 depositada el 13 de febrero de 1992 (para ligandos L-selectina); 07/884.811 y 07/885,971 ambas depositadas el 18 de mayo de 1992 (para variantes de HGF). Estas quimeras se pueden realizar de modo similar a la construcción de las quimeras receptor-inmunoglobulina.
Normalmente, el extremo C terminal del ligando se fusiona al extremo N terminal de la región constante de una inmunoglobulina en lugar de la región variable, sin embargo también son deseables las fusiones de variantes de selectina al extremo N terminal.
Típicamente, tales fusiones conservan al menos una región bisagra funcionalmente activa y los dominios CH2 y CH3 de la región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina. Las fusiones también se realizan al extremo C terminal de la porción Fc de un dominio constante, o inmediatamente después del extremo N terminal del CH1 de la cadena pesada o a la región correspondiente de la cadena ligera. Normalmente esto se realiza construyendo la secuencia de ADN apropiada y expresándola en el cultivo celular recombinante. Alternativamente, sin embargo, las quimeras ligando-inmunoglobulina de esta invención se pueden sintetizar siguiendo procedimientos conocidos.
El sitio preciso en el que se realiza la fusión no es crítico; hay sitios particulares muy conocidos y se pueden seleccionar para optimizar la actividad biológica, la secreción o las características de unión de las quimeras ligando-inmunoglobulina.
En algunas formas de realización, las inmunoglobulina híbridas se ensamblan como monómeros, o hetero/homo multímeros y particularmente como dímeros o tetrámeros, esencialmente como se ilustra en el documento WO91/
08298.
En una forma de realización preferente, el extremo C terminal de la secuencia de un ligando que contiene el(los) sitio(s) de unión para un receptor, se fusiona al extremo N terminal de la porción C terminal de un anticuerpo (en particular el dominio Fc), con las funciones efectoras de una inmunoglobulina, por ejemplo, la inmunoglobulina G1 (IgG-1). Es posible fusionar toda la región constante de la cadena pesada a la secuencia con el(los) sitio(s) de unión al receptor. Sin embargo, más preferentemente, para la fusión se usa una secuencia que comience en la región bisagra justo antes de la región de corte por papaína (que define químicamente el Fc de una IgG; residuo 216, tomando el primer residuo de la región constante de la cadena pesada al 114 [Kobet y col., citado con anterioridad], u otros sitios análogos de otras inmunoglobulinas). En una forma de realización particularmente preferente, se fusiona la secuencia aminoacídica que contiene el(los) sitio(s) de unión al receptor a la región bisagra y CH2 y CH3 o CH1, la región bisagra, los dominios CH2 y CH3 de la cadena pesada de una IgG-1, una IgG-2, o una IgG-3. El sitio preciso en el que se realiza la fusión no es crítico, y el sitio óptimo se puede determinar con una experimentación habitual.
En algunas formas de realización, las quimeras ligando-inmunoglobulina se ensamblan como heteromultímeros, y particularmente como heterodímero o heterotetrámeros. Generalmente, estas inmunoglobulinas ensambladas se conocerán como unidades estructurales. Una unidad estructural de cuatro cadenas básica es la forma en la que encuentran IgG, IgD, e IgE. En las inmunoglobulinas de mayor peso molecular se repite una unidad de cuatro cadenas; IgM generalmente existe como un pentámero de unidades básicas de cuatro cadenas unidas por puentes disulfuro. La globulina IgA y ocasionalmente la globulina IgG, también pueden aparecer en formas multiméricas en el suero. En el caso de un multímero, cada unidad de cuatro cadenas puede ser igual o diferente.
A continuación se representan esquematizados varios ejemplos de quimeras ligando-inmunoglobulina ensambladas.
(a)
AC_{L}-AC_{L};
(b)
AC_{H}-[AC_{H}, AC_{L}-AC_{H}, AC_{L}-V_{H}C_{H}, o V_{L}C_{L}-AC_{H}];
(c)
AC_{L}-AC_{H}-[AC_{L}-AC_{H}, AC_{L}-V_{H}C_{H}, V_{L}C_{L}-AC_{H}, o V_{L}C_{L}-V_{H}C_{H}];
(d)
AC_{L}-V_{H}C_{H}-[AC_{H}, o AC_{L}-V_{H}C_{H}, o V_{L}CL-AC_{H}];
(e)
V_{L}C_{L}-AC_{H}-[AC_{L}-V_{H}C_{H}, o V_{L}C_{L}-AC_{H}]; y
(f)
[A-Y]n-[V_{L}C_{L}-V_{H}C_{H}]_{2},
en donde
cada A representa secuencias aminoacídicas idénticas o diferentes capaces de unirse selectivamente a dicho receptor;
V_{L} es un dominio variable de la cadena ligera de una inmunoglobulina
V_{H} es un dominio variable de la cadena pesada de una inmunoglobulina
C_{L} es un dominio constante de la cadena ligera de una inmunoglobulina
C_{H} es un dominio constante de la cadena pesada de una inmunoglobulina
n es un número entero mayor que 1;
Y designa el residuo de un agente reticulante covalente.
Para mayor brevedad, las anteriores estructuras solo presentan rasgos clave, no indican puntos de unión (J) u otros dominios de las inmunoglobulinas, ni se muestran los puentes disulfuro. Sin embargo, cuando dichos dominios sean necesarios para la actividad de unión, se construirán como se presentan en las posiciones habituales que ocupan en las moléculas de inmunoglobulina.
Alternativamente, las secuencias de ligando de la presente invención se pueden insertar entre las secuencias de la cadena pesada y de la cadena ligera de la inmunoglobulina de modo que se obtenga una inmunoglobulina que comprenda una cadena pesada quimérica. En esta forma de realización, las secuencias del ligando se fusionan al extremo 3' de la cadena pesada de una inmunoglobulina en cada brazo de una inmunoglobulina, o entre la región bisagra y el dominio CH2, o entre los dominios CH2 y CH3. Se han descrito construcciones similares en Hoogenboom, H. R. y col., Mol. Immunol. 28, 1027-1037 (1991).
Las quimeras ligando-inmunoglobulina de la presente invención se construyen de modo similar a la construcción de anticuerpos biespecíficos, como por ejemplo, lo desvelado en los documentos EP125.023 (publicado el 14 de noviembre de 1984); US4.444.878 (concedida el 24 de abril de 1984); Munro, A,, Nature 312, 597 (1984); Morrison, y col., Science 229, 1202-1207 (1985); Berg y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 88, 4723-4727 (1991)].
El ADN que codifica un ligando nativo de la presente memoria descriptiva se puede obtener a partir de una genoteca de ADNc preparada a partir de un tejido que se crea posee el ARNm del ligando deseado y que lo exprese a un nivel detectable. Las genotecas se estudian con sondas designadas para identificar el gen de interés o la proteína por él codificada. Para las genotecas de expresión de ADNc, las sondas idóneas normalmente incluyen anticuerpos mono clonales y policlonales que reconozcan y se unan específicamente a la proteína deseada; oligonucleótidos de aproximadamente 20-80 bases que codifiquen porciones conocidas o teóricas del ADNc del ligando de la misma o distinta especie; y/o ADNc complementarios u homólogos de sus fragmentos que codifiquen el mismo gen o uno similar.
Un medio alternativo para aislar el gen que codifica un ligando activo deseado es usar la metodología de la reacción en cadena por la polimerasa (PCR) como se describe en la patente de EE.UU. Nº 4.683.195, concedida el 28 de julio de 1987, en el apartado 14 de Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, 1989, o en el capítulo 15 de Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel y col. eds., Greene Publishing Associates y Wiley- Interscience 1991.
Otra alternativa es sintetizar químicamente el gen que codifica el ligando deseado (nativo o variante) usando uno de los procedimientos descritos en Engels y col., Agnew. Chem. Int. Ed. Engl. 28, 716 (1989). Estos procedimientos incluyen procedimientos con triéster, fosfito, fosforamidita y H-fosfonato, PCR y otros procedimientos con autocebadores, y la síntesis de oligonucleótidos en fase sólida. Estos procedimientos se pueden usar si se conoce toda la secuencia del ácido nucleico del gen, o si hay disponible la secuencia nucleotídica complementaria a la hebra codificadora, o alternativamente, si se conoce la secuencia aminoacídica diana, se pueden inferir los residuos codificadores preferentes para cada residuo de aminoácido.
Las variantes de la secuencia aminoacídica de los ligandos de esta invención se construyen preferentemente mutando la secuencia de ADN que codifica la proteína central de un ligando silvestre. Generalmente, las regiones o sitios particulares del ADN identificados por los procedimientos abordados anteriormente, serán el objetivo de la mutagénesis, y así la metodología general empleada para esto se denomina mutagénesis dirigida. Las mutaciones se realizan usando enzimas modificadores del ADN como por ejemplo endonucleasas de restricción (que cortan el ADN en posiciones particulares), nucleasas (que degradan el ADN) y/o polimerasas (que sintetizan ADN).
A continuación se presenta una breve discusión de ciertas técnicas de la tecnología del ADN recombinante comúnmente usadas que se pueden usar para hacer dímeros del ligando de la presente invención. Éstas y otras técnicas similares son igualmente adecuadas par hacer variantes de los dominios de unión al receptor de los ligandos nativos, fusiones de ligandos nativos o variantes, con o sin un enlazador, incluyendo enlazadores que proceden de una inmunoglobulina. Hay más detalles de éstas y otras técnicas similares en libros de texto generales, como por ejemplo, Sambrook y col., citado con anterioridad, y Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel y col. eds., citado con anterioridad.
Mutagénesis dirigida
La preparación de variantes y de dímeros de ligandos que incluyen dichas variantes de ligando de esta manera preferentemente se logra por mutagénesis dirigida del ADN que codifica una variante previamente preparada o una versión no variante de la proteína. La mutagénesis dirigida permite la producción de variantes con el uso de secuencias oligonucleotídicas que codifican la secuencia de ADN de la mutación deseada, así como un número suficiente de nucleótidos adyacentes para proporcionar una secuencia de cebador de un tamaño y una complejidad de secuencia suficientes para formar un dúplex estable en ambos lados de la unión que se está explorando. Típicamente, se prefiere un cebador de aproximadamente 20 a 25 nucleótidos, con aproximadamente 5 a 10 residuos en ambos lados de la unión de la secuencia que se está alterando. En general, la técnica de la mutagénesis dirigida es muy conocida en la técnica como muestran los ejemplos de publicaciones como Adelman y col., DNA, 2: 183 (1983).
Como podrá apreciarse, la mutagénesis dirigida emplea típicamente un vector fágico que existe tanto en forma de cadena simple y de cadena doble. Los vectores típicamente útiles en la mutagénesis dirigida incluyen vectores como por ejemplo el fago M13, por ejemplo, como se desvela en Messing y col., Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA, Editor A.Walton, Blsevier, Amsterdam (1981). Estos fagos están comercialmente disponibles y su uso es muy conocido entre los expertos en la materia. Alternativamente, los vectores plasmídicos que contienen un origen de replicación fágico de cadena sencilla (Veira y col., Meth. Enzymol., 153: 3 (1987)) se pueden emplear para obtener un ADN de cadena sencilla.
En general, la mutagénesis dirigida puede realizarse, por ejemplo, obteniendo primero un vector de cadena sencilla que incluya en su secuencia una secuencia de ADN que codifique la selectina relevante. Un cebador oligonucleotídico con la secuencia mutada deseada se prepara, generalmente sintéticamente, por ejemplo, con el procedimiento de Crea y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.), 75: 5765 (1978). Después el cebador se hibrida con el vector que contiene la secuencia del ligando de cadena sencilla, y se trata con enzimas de polimerización del ADN como por ejemplo el fragmento Klenow de la polimerasa I de E. coli, para completar la síntesis de la cadena con la mutación. De este modo, se forma un heterodúplex en el que una cadena codifica la secuencia no mutada original y la segunda cadena lleva la mutación deseada. Este vector heterodúplex se usa después para transformar las células apropiadas, como las células JM101 y se seleccionan los clones, por hibridación a una sonda radiactiva compuesta por el cebador de la mutagénesis etiquetado con P^{32}, que incluye vectores recombinantes con la secuencia mutada introducida.
Después de seleccionar dicho clon, se puede sacar la región mutada y colocarla en un vector apropiado para la producción de la variante deseada, generalmente un vector de expresión del tipo que típicamente se emplean para la transformación de un hospedador eucariota apropiado. En el contexto de la presente invención, se prefieren células de ovario de hámster chino (CHO) o células 293 (células de riñón humano descritas en Graham y col., J. Gen. Virol., 36: 59 (1977)) para la preparación de productores a largo plazo de polipéptidos estables. Sin embargo, la invención no se limita a la producción en células CHO, y se conocen muchos otros tipos celulares que pueden usarse igualmente, particularmente si se desea sólo una producción temporal del enzima con fines analíticos. Por ejemplo, a continuación se describe un sistema de expresión temporal que emplea células 293 que ofrece un sistema conveniente para producir variantes del ligando o dímeros del ligando, por ejemplo, quimeras ligando-inmunoglobulina con fines analíticos.
Otro procedimiento para hacer mutaciones en la secuencia de ADN que codifica un ligando incluye el corte del ADN en la posición correspondiente por digestión con enzimas de restricción, recuperando el ADN propiamente cortado, sintetizando un oligonucleótido que codifica el aminoácido deseado y regiones flanqueantes como por ejemplo sitios de clonación múltiple con extremos romos (o, en lugar de usar sitios de clonación múltiple, digiriendo el oligonucleótido sintético con las enzimas de restricción también usadas para cortar el ADN que codifica el ligando, creando así un extremo cohesivo, y ligando el ADN sintético en el resto del gen estructural que codifica el ligando.
Mutagénesis por PCR
La mutagénesis por PCR es además adecuada para hacer ligandos incluyendo dímeros del ligando para la práctica de la presente invención. Aunque la siguiente discusión se refiere a ADN, se entiende que la técnica también tiene aplicación con ARN. La técnica de la PCR generalmente se refiere al siguiente procedimiento. Cuando se usan cantidades pequeñas de ADN molde como material de inicio en una PCR, se pueden usar cebadores que difieren ligeramente de la secuencia correspondiente en un ADN molde para generar cantidades relativamente grandes de un fragmento de ADN específico que difiera de la secuencia del molde sólo en las posiciones en las que los cebadores se diferencien del molde. Para la introducción de una mutación en un ADN plasmídico, uno de los cebadores está diseñado que modo que solape la posición de la mutación y para que contenga la mutación; la secuencia del otro cebador debe ser idéntica a un fragmento de la secuencia de la cadena complementaria del plásmido, pero esta secuencia se puede colocar en cualquier sitio del plásmido. Es preferente, sin embargo, que la secuencia del segundo cebador se localice a menos de 200 nucleótidos de la de la primera, de modo que en el extremo toda la región amplificada del ADN unido por los cebadores se pueda secuenciar fácilmente. La amplificación por PCR usando un par de cebadores como lo descrito produce una población de fragmentos de ADN que difieren en la posición de la mutación determinada por el cebador, y posiblemente en otras posiciones, ya que la copia del molde es propensa a introducir errores.
Si la relación entre el molde y el producto es extremadamente baja, la gran mayoría del producto de los fragmentos de ADN incorporarán la mutación deseada. Este producto se usa para reemplazar la región correspondiente del plásmido que sirvió como molde para la PCR usando la tecnología del ADN habitual. Se pueden introducir mutaciones en posiciones diferentes simultáneamente usando un segundo cebador mutante o realizando una segunda PCR con dos cebadores mutantes diferentes y ligando los dos fragmentos de la PCR simultáneamente al fragmento del vector en una tercera (u otra) ligación.
Cultivo de las células hospedadoras y vectores
Aunque en última instancia se prefiere la expresión en células de ovario de hámster chino (CHO) y en la línea celular 293 de células renales embrionarias humanas [Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 77, 4216 (1980); Graham y col., J. Gen. Virol., 36, 59 (1977)], los vectores y procedimientos desvelados en la presente memoria descriptiva son adecuados para su uso en las células hospedadoras de una gran gama de organismo eucariotas.
En general, se prefieren a los procariotas para la clonación inicial de la secuencia de ADN y para la construcción de vectores útiles para la invención. Por ejemplo, so particularmente útiles la cepa de E. coli K12 294 (ATCC Nº 31.446) y la cepa de E. coli (ATCC Nº 27.325) Otras cepas microbianas adecuadas incluyen las cepas de E. coli como E. coli B, y E. coli X1776 (ATCC Nº 31.537). Estos ejemplos pretenden, por su puesto ser ilustrativos y no limitantes.
Los procariotas además son útiles para la expresión. Las cepas antes mencionadas, así como bacilos como por ejemplo, Bacillus subtilis, y otras enterobacteriáceas como por ejemplo, Salmonella typhimurium o Serratia marcesans, y varias especies de Pseudomonas son ejemplos de células hospedadoras útiles para la expresión.
En general, se usan vectores plasmídicos con un replicón y secuenciase de control que proceden de especies compatibles con la célula hospedadora junto con ésta. El vector normalmente tiene un sitio de replicación, así como secuencias marcadoras que son capaces de ofrecer una selección fenotípica de las células transformadas. Por ejemplo, E. coli normalmente se transforma con pBR322, un plásmido que procede de una especie de E. coli (véase por ejemplo, Bolivar y col., Gene, 2: 95 (1977)). pBR322 contiene genes de resistencia a la ampicilina y a la tetraciclina y ofrece así un medio sencillo de identificar las células transformadas. El plásmido pBR322, u otros plásmidos microbianos o fágicos, además debe contener, o modificarse para que contengan, promotores usados por el organismo para la expresión de sus propias proteínas.
Los promotores más comúnmente usados en la construcción de ADN recombinante incluyen los sistemas promotores de la b-lactamasa (penicilinasa) y de la lactasa (Chang y col., Nature, 375: 615 (1978); Itakura y col., Science, 198: 1056 (1977); Goeddel y col., Nature, 281: 544 (1979)) y un sistema promotor del triptófano (trp) (Goeddel y col., Nucl. Acids Res., 8: 4057 (1980); Nº publicación de la solicitud EPO 36.776), y los sistemas de la fosfatasa alcalina. Mientras que éstos son los más comúnmente usados, se han descubierto y usado otros promotores microbianos, y se han publicado detalles relacionados con sus secuencias nucleotídicas, posibilitando a un experto la ligación funcional de los mismos con vectores plasmídicos (véase, por ejemplo, Siebenlist y col., Cell, 20: 269 (1980)).
Además de los microorganismos procariotas, los eucariotas, como las levaduras, son idóneamente usados en la presente memoria descriptiva. Saccharomyces cerevisiae, o levadura del pan común, es el más comúnmente usado entre los microorganismos eucariotas, aunque hay varias cepas diferentes comúnmente disponibles. Por ejemplo, para la expresión en Saccharomyces, el plásmido YRp7 (Stinchcomb y col., Nature, 282: 39 (1979); Kingsman y col., Gene, 7: 141 (1979); Tschemper y col., Gene, 10: 157 (1980)) es comúnmente usado. Este plásmido ya contiene el gen TRP1 que proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en un medio sin triptófano, por ejemplo, Nº ATCC 44.076 o PEP4-1 (Jones, Genetics, 85: 12 (1977)). La presencia de la alteración trp1 como una característica del genoma de la célula hospedadora de levadura proporciona un entorno eficaz para detectar la transformación por el crecimiento en ausencia de triptófano.
Las secuencias promotoras adecuadas en los vectores de levadura incluyen los promotores de la 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman y col., J. Biol. Chem., 255: 2073 (1980)) u otras enzimas glicolíticas (Hess y col., J. Adv. Enzyme Reg., 7: 149 (1968); Holland y col., Biochemistry, 17: 4900 (1978)), como por ejemplo la enolasa, la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, la hexoquinasa, la piruvato descarboxilasa, la fosfofructoquinasa, la glucosa-6-fosfato isomerasa, la fosfoglicerato mutasa, la piruvato quinasa, la triosa-fosfato isomerasa, la fosfoglucosa isomerasa y la glucoquinasa. En la construcción de plásmidos de expresión adecuados, las secuencias de terminación asociadas a estos genes están ligadas además al vector de expresión en el extremo 3' de la secuencia que se desea expresar para proporcionar la poliadenilación del ARNm y la terminación. Otros promotores que tienen la ventaja adicional de estar transcripcionalmente controlados por las condiciones de crecimiento son la región promotora de la alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradadoras asociadas al metabolismo del nitrógeno y la ya mencionada gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa y otras enzimas responsables del uso de la maltosa y la galactosa. Cualquier vector plasmídico con un promotor compatible con levadura, origen de replicación, y secuencias de terminación es adecuado.
Además de los microorganismos, también se usan cultivos de células derivadas de organismos multicelulares como células hospedadoras. En principio, cualquier cultivo celular es válido, tanto un cultivo de células de vertebrado, como de invertebrado. Sin embargo, hay mucho más interés en las células de vertebrados y la propagación de las células de vertebrado en cultivo (cultivo de tejidos) es actualmente un procedimiento habitual en los últimos años [Tissue Culture, Academic Press, Kruse y Patterson, editores (1973)]. Los ejemplos de dichas líneas celulares hospedadoras útiles son las células VERO y HeLa, líneas celulares CHO y líneas celulares W138, BHK, COS-7, (ATCC CRL 1651), 293, y MDCK (ATCC CCL 34). Los vectores de expresión para tales células incluyen normalmente (si fuera necesario) un origen de replicación, un promotor localizado delante del gen que se va a expresar, junto con cualquier sitio de unión a ribosomas necesario, sitios de ayuste del ARN, sitios de poliadenilación y secuencias de terminación de la transcripción.
Para usar en células de mamífero, las funciones de control de los vectores de expresión a menudo se suministran en material vírico. Por ejemplo, los promotores comúnmente usados proceden de polioma, Adenovirus 2, y más frecuentemente del virus simio 40 (SV40). Los promotores tempranos y tardíos del virus SV40 son particularmente útiles porque ambos se obtienen fácilmente a partir de virus como un fragmento que además contiene el origen de replicación vírico del SV40 (Fiers y col., Nature, 273: 113 (1978)). También son adecuados fragmentos del SV40 más pequeños o más grandes, siempre que incluyan la secuencia de aproximadamente 250 pb que va desde el sitio HindIII hasta el sitio BglI localizado en el origen de replicación vírico. Además, también es posible, y a menudo deseable, usar promotores o secuencias de control asociadas normalmente con la secuencia del gen deseado, siempre que las secuencias de control sean compatibles con los sistemas de la célula hospedadora.
Un origen de replicación se suministra típicamente construyendo el vector para que incluya un origen exógeno, como por ejemplo derivado del SV40 u otro origen vírico (por ejemplo Polioma, Adeno, VSV, BPV), o por el mecanismo de replicación cromosómica de la célula hospedadora. Si el vector se integra en el cromosoma de la célula hospedadora, esto último es suficiente.
Se producen cantidades satisfactorias de variantes o dímeros del ligando en cultivos celulares, sin embargo, se puede refinar, usando una secuencia codificadora secundaria, que sirva para aumentar aún más los niveles de producción. La secuencia codificadora secundaria comprende la dihidrofolato reductasa (DHFR) que se ve afectada por un parámetro controlado externamente, como por ejemplo metotrexato (MTX), permitiendo así el control de la expresión controlado la concentración de MTX.
En la elección de una célula hospedadora preferente para la transfección con los vectores de la invención que comprenda secuencias de ADN que codifican tanto la selectina variante como la proteína DHFR, es apropiado considerar el tipo de proteína DHFR empleado. Si se emplea una proteína DHFR silvestre, es preferible seleccionar una célula hospedadora que sea deficiente en DHFR, permitiendo así el uso de la secuencia que codifica la DHFR como un marcador para una correcta transfección en un medio selectivo que carece de hipoxantina, glicina y timidina. Una célula hospedadora apropiada en este caso en la línea celular CHO, deficiente en actividad DHFR, preparada y propagada, como se describe en Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 77: 4216 (1980).
Por otro lado, si se usa una proteína DHFR con una afinidad de unión baja al MTX como la secuencia de control, no es necesario usar células deficientes en DHFR. Porque el mutante DHFR es resistente al MTX, se pueden usar medios con MTX como un medio de selección, siempre que las células hospedadoras sean sensibles al MTX. La mayoría de las células eucariotas que son capaces de absorber MTX parecen se sensibles al MTX. Una de esas líneas celulares válidas es la línea CHO, CHO-K1 (ATCC Nº CCL 61).
Metodologías de clonación y expresión típicas disponibles
Se usan células de mamífero como células hospedadoras, la transfección generalmente se realiza con el procedimiento de precipitación con fosfato de calcio como se describe en Graham y Van der Eb, Virology, 52: 546 (1978). Sin embargo, se pueden usar otros procedimientos para introducir el ADN en las células, como por ejemplo la inyección nuclear, la electroporación o la fusión con protoplastos.
Si se usa una levadura como célula hospedadora, la transfección se realiza generalmente usando polietilenglicol, como se muestra en Hinnen, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 75: 1929-1933 (1978).
Si se usan células procariotas o células con una pared celular considerable, el procedimiento de transfección preferente es el tratamiento con calcio usando el calcio como se describe en Cohen y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 69: 2110 (1972), o más recientemente por electroporación.
La construcción de vectores adecuados con las secuencias codificadoras y de control deseadas, se basa en las técnicas de ligación habituales. Los plásmidos o los fragmentos de ADN aislados se cortan, se rellenan y se religan de la forma deseada para formar los plásmidos necesarios.
El corte se realiza tratando con un enzima de restricción (o varios) en un tampón adecuado. En general, se usa aproximadamente 1 mg de plásmido o de fragmento de ADN con aproximadamente 1 unidad de enzima en unos 20 ml de tampón y sustrato para enzimas de restricción particulares, según lo especifique el fabricante. Los tiempos de incubación de aproximadamente una hora a 37 ºC son válidos. Después de la incubación, se elimina la proteína con una extracción de fenol y cloroformo, y el ácido nucleico se recupera de la fase acuosa precipitando con
etanol.
Si se necesitan extremos romos, la preparación se puede tratar durante 15 minutos a 15ºC con 10 unidades del fragmento Klenow de la ADN polimerasa I (Klenow), se extrae con fenol-cloroformo y se precipita con etanol.
Para separar los fragmentos cortados según el tamaño se emplea un gel de poliacrilamida al seis por ciento como se describe en Goeddel y col., Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980).
Para la ligación, se tratan cantidades aproximadamente equimolares de los componentes deseados, con los extremos rellenados correctamente, para facilitar un emparejamiento correcto, con aproximadamente 10 unidades de la ADN ligasa del T4 por cada 0,5 mg de ADN. (Cuando se usan los vectores cortados como componentes, puede ser útil evitar la religación del vector cortado con un tratamiento previo con una fosfatasa alcalina bacteriana).
Como ya se ha comentado anteriormente, las variantes del ligando se producen preferentemente mediante mutación dirigida, las variantes útiles en la práctica de la presente invención se originan más fácilmente mediante el uso de una secuencia oligonucleotídica específica que codifique la secuencia de ADN de la mutación deseada, así como un número suficiente de nucleótidos adyacentes, para proporcionar una secuencia con un tamaño y complejidad suficiente para formar un dúplex estable en ambos extremos de la mutación que se está explorando.
Para analizar y confirmar las secuencias correctas en los plásmidos construidos, las mezclas de ligación se usan típicamente para transformar E. coli K12 (ATCC 31.446) u otras cepas adecuadas de E. coli, y se selecciona a los transformantes correctos por su resistencia en medios con ampicilina o tetraciclina cuando sea apropiado. Los plásmidos de los transformantes se prepararán y analizan mediante mapas de restricción y/o secuenciación del ADN con el método de Messing y col., Nucleic Acids Res., 9: 309 (1981) o con el método de Maxam y col., Methods of Enzymology, 65: 499 (1980).
Después de la introducción del ADN en la célula hospedadora de mamífero y de la selección en un medio para los transformantes estables, se efectúa una amplificación de la secuencia que codifica la proteína DHFR creciendo los cultivos celulares en presencia de aproximadamente concentraciones de MTX de 20.000 a 500.000 nM, un inhibidor competitivo de la actividad DHFR. El intervalo efectivo de concentración depende mucho, por supuesto, de la naturaleza del gen DHFR y de la proteína y de las características de la célula hospedadora. Claramente, los límites superior e inferior generalmente no pueden precisarse con exactitud. También se pueden usar concentraciones adecuadas de otros análogos del ácido fólico u otros compuestos que inhiban la DHFR. Sin embargo, MTX es conveniente, fácilmente disponible y eficaz.
En una forma de realización particular, las moléculas quiméricas ligando-inmunoglobulina se usan según la presente invención. Las quimeras ligando-inmunoglobulina preferentemente se recuperan a partir del medio de cultivo como proteínas de secreción, aunque también se pueden recuperar a partir de lisados celulares cuando se expresan directamente sin una señal de secreción. Cuando la quimera se expresa en una célula recombinante que no tenga origen humano, la variante queda así completamente libre de proteínas de origen humano. Sin embargo, es necesario purificar la variante a partir de las proteínas de la célula recombinante para obtener preparaciones que sean sustancialmente homogéneas en relación a la proteína. Como primer paso, se centrifuga el medio de cultivo o el lisado para eliminar partículas de restos celulares.
La quimera se purifica después a partir de las proteínas solubles contaminantes, por ejemplo, con una combinación apropiada de procedimientos de cromatografía convencionales, por ejemplo, filtración en gel, intercambio iónico, interacciones hidrófobas, afinidad, cromatografía de inmunoafinidad, HPLC en fase reversa, precipitación, por ejemplo, precipitación con etanol, precipitación con sulfato de amonio, o preferentemente, inmunoprecipitación con anticuerpos anti HGF (policlonales o monoclonales) unidos covalentemente a Sefarosa. Debido a su gran afinidad por la heparina, HGF se puede purificar convencionalmente con heparina, como por ejemplo, una columna de sefarosa con heparina. Un experto en la materia comprenderá que los procedimientos de purificación adecuados de una HGF nativa pueden requerir alguna modificación para tener en cuenta los cambios en las características de HGF o de sus variantes una vez expresadas en el cultivo celular recombinante.
En una forma de realización adicional, los dos ligandos (idénticos o diferentes) se unen con un enlazador que no sea una inmunoglobulina. El enlazador puede ser el residuo de un agente reticulante covalente capaz de enlazar los dos ligandos sin dañar a la función de unión al receptor o un enlace cuya formación se induce por dichos agentes reticulantes. En Tae, H. Jr. in Meth. Enzymol. 580-609 (1983) y en la bibliografía citada en dicho artículo se ofrece una concisa revisión de los agentes reticulantes incluyendo una guía para seleccionar dichos agentes y procedimientos para su preparación. La selección del reactivo más apropiado para un propósito específico a partir de la amplia variedad de agentes reticulantes disponible, depende del criterio del experto.
En general, se prefieren los agentes reticulantes de longitud cero, homofuncionales o heterofuncionales para el propósito de la presente invención. Los reactivos reticulantes de longitud cero inducen la conjugación directa de los ligandos sin la introducción de ningún material extrínseco. Los agentes que catalizan la formación de puentes disulfuro pertenecen a esta categoría. Otro ejemplo son los reactivos que inducen la condensación de los grupos carboxi y amino primarios para formar un puente amida, como por ejemplo, carbodiimidas, etilcloroformato, reactivo de Woodward K1, carbonildiimidazol, etc. Los reactivos homobifuncionales incluyen dos grupos funcionales idénticos, mientras que los reactivos heterofuncionales contienen grupos funcionales distintos. Una gran mayoría de los agentes reticulantes heterobifuncionales contiene un grupo reactivo amina y un grupo reactivo tiol. En Heindel, N.D. y col., Bioconjugate Chem. 2, 427-430 (1991)] se desveló un novedoso enlazador heterofuncional para enlaces formilo-tiol.En una forma de realización preferida, los agentes reticulantes covalentes se seleccionan de reactivos capaces de formar puentes disulfuro (-S-S-), glicol (-CH[OH]-CH[OH]-), azo (-N=N-), sulfona (-S[=O2]-), o éster (-C[=O]-O-).
En un enfoque diferente, los ligandos se enlazan a través de oligosacáridos. La oxidación química o enzimática de oligosacáridos en ligandos polipeptídicos con aldehídos produce grupos funcionales únicos en la molécula, que pueden reaccionar con compuestos que contengan, por ejemplo, aminas, hidrazinas, hidrazidas o semicarbazidas. Ya que los sitios de glicosilación están bien definidos en las moléculas polipeptídicas, los enlaces selectivos a través de residuos de oligosacáridos oxidados producirán un producto más uniforme que otros procedimientos de enlace, y se espera que tengan menos efectos secundarios en las propiedades de unión al receptor de los ligandos. Los agentes reticulantes heterobifuncionales dirigidos por carbohidratos se desvelan por ejemplo, en la solicitud de patente copendiente con Nº de serie 07/926.077 depositada el 5 de agosto de 1992.
Se entenderá que es posible el enlace de más de dos secuencias de ligando con varias secuencias unidas, por ejemplo, reactivos reticulantes, y está incluido en el alcance de la presente invención.
En una forma de realización adicional, dos o más ligandos se conectan a través de secuencias enlazadoras polipeptídicas, y por consiguiente, se presentan a su receptor como una molécula polipeptídica multifuncional. Las funciones del enlazador polipeptídico como un "espaciador" cuya función es separar los dominios del ligando funcionales de modo que puedan asumir independientemente su correcta conformación terciaria. El enlazador polipeptídico normalmente comprende entre aproximadamente 5 y aproximadamente 25 residuos, y contiene preferentemente al menos aproximadamente 10, más preferentemente al menos aproximadamente 15 aminoácidos, y está compuesto por residuos aminoacídicos que juntos confieren una región relativamente desestructurada hidrófila. Las secuencias aminoacídicas de enlace con pocas o sin estructuras secundarias funcionan bien. Si lo desea, en el enlazador polipeptídico se puede incluir uno o más sitios de corte reconocibles por un agente de corte específico (por ejemplo una proteasa). Los aminoácidos específicos del espaciador pueden variar, sin embargo, se deben evitar las cisteínas. La secuencia espaciadora puede mimetizar la estructura terciaria de una secuencia aminoacídica normalmente enlazada a dos dominios de unión a receptor en un ligando bifuncional nativo. Esto se puede designar para asumir una estructura deseada, como por ejemplo una estructura helicoidal. Los enlazadores polipeptídicos adecuados se desvelan, por ejemplo, en el documento WO88/09344 (publicado el 1 de diciembre de 1988), como son los procedimientos para la producción de proteínas multifuncionales que comprendan dichos enlazadores.
En una forma de realización específica, los ligandos se dimerizan a través de hélices anfífilas. Se sabe que las copias recurrentes del aminoácido leucina (Leu) en las proteínas reguladoras de genes pueden servir como dientes para "alinearse como en una cremallera" dos moléculas de proteínas para formar un dímero. La cremallera de leucina se descubrió en primer lugar cuando se ajustó un pequeño segmento de la proteína C/EBP en una hélice alfa hipotética. Sorprendentemente, las leucinas, que se pueden ensamblar cada siete aminoácidos de la proteína, alineados en una columna. Posteriormente, se identificaron dos proteínas asociadas a C/EBP adicionales y demostraron que tenían una función similar. Una de ellas, GCN4 es un gen regulador de proteínas de levadura, la otra, es el producto de un protooncogen jun. Se ha descubierto que las regiones cremallera se asocian en paralelo cuando se combinan, es decir, las leucinas de moléculas opuestas se alinean lado a lado. También se ha demostrado que las proteínas no idénticas pueden "alinearse como en una cremallera" para formar heterodímeros. Dichas cremalleras de leucina son particularmente adecuadas para preparar dímero de ligando incluidos en el alcance de la invención. Alternativamente, se puede tomar la secuencia de la hélice anfipática a partir de un diseño en haz de cuatro hélices, esencialmente como se describe en Pack P. y Pluckthun, A., Biochemistry 31, 1579-1584 (1992). Para más detalles a nivel molecular, por ejemplo, las cremalleras de leucina, que pueden servir de enlazadores heterólogos para el propósito de la presente invención, véase por ejemplo: Landshculz, W.H., y col. Science 240, 1759-1764 (1988); O'Shea, E.K. y col., Science 243, 538-542 (1989); McKnight, S.L., Scientific American 54-64, Abril de 1991; Schmidt-Dorr. T. y col., Biochemistry 30, 9657-9664 (1991); Blondel, A. y Bedouelle, H. Protein Engineering 4, 457-461 (1991), Pack, P. y Pluckthun, A., citado con anterioridad, y la bibliografía citada en estos artículos.
En una forma de realización específica, la presente invención ofrece procedimientos para la conversión de variantes del ligando capaces de unirse a sus receptores pero que carecen o tienen un capacidad de activación del receptor reducida frente al potente agonista de los respectivos ligandos nativos. Los ligandos diana conservan preferentemente sustancialmente toda la afinidad de unión al receptor del ligando nativo.
La expresión "conservar sustancialmente toda la afinidad de unión al receptor del ligando nativo" y las variantes gramaticales se usan en la presente memoria descriptiva para indicar que la afinidad de unión al receptor de la variante del ligando no inferior a aproximadamente el 70%, preferentemente no inferior a aproximadamente el 80%, más preferentemente no inferior a aproximadamente el 90%, más preferentemente no inferior a aproximadamente el 95% de la afinidad con la que el ligando nativo correspondiente se une a su receptor.
La capacidad de unión al receptor se puede determinar en ensayos habituales, como por ejemplo, los ensayos de unión competitiva desvelados en los ejemplos:
Los términos "sustancialmente incapaz de activar el receptor", y "sustancialmente desprovisto de actividad biológica" indican que la actividad de un ligando variante es inferior a aproximadamente el 20%, preferentemente, inferior a aproximadamente el 15%, más preferentemente inferior a aproximadamente el 10%, más preferentemente inferior a aproximadamente el 5% de la actividad respectiva del ligando nativo correspondiente en un ensayo realizado de activación del receptor o de actividad biológica del ligando.
La operabilidad de la presente invención se demostró en primer lugar activando el receptor del factor de crecimiento hepatocítico (HGFr) con moléculas quiméricas formadas por la fusión de los ligandos HGF silvestres y sus secuencias aminoacídicas variantes frente a las secuencias del dominio constante de la inmunoglobulina.
La actividad biológica de HGF puede, por ejemplo, determinarse en un ensayo in vitro o in vivo de estimulación del crecimiento hepatocítico. Se han usado extensamente cultivos primarios de hepatocitos de ratas adultas para buscar factores que regulasen la proliferación de hepatocitos. Por consiguiente, el efecto mitogénico de una variante de HGF se puede determinar convenientemente en un ensayo adecuado para probar la capacidad de inducción de la síntesis de ADN en cultivos primarios de hepatocitos de rata de una molécula de HGF, como se describe, por ejemplo, en el ejemplo 2. Los hepatocitos humanos se pueden obtener también a partir de perfusión hepática total de órganos que no se puedan transplantar, disminuciones de hígados adultos usados en transplantes en niños, restos de hígados e hígados fetales extirpados quirúrgicamente para otras indicaciones. Los hepatocitos humanos se pueden cultivar de modo similar a los procedimientos establecidos para preparar cultivos primarios de hepatocitos normales de rata. La síntesis de ADN en hepatocitos puede analizarse, por ejemplo midiendo la incorporación de timidina[H^{3}] al ADN, con controles de hidroxiurea apropiados para la síntesis replicativa.
El efecto de las variantes de HGF sobre el crecimiento de los hepatocitos también se puede analizar in vivo, en modelos animales de alteraciones hepáticas y regeneración, como por ejemplo, en ratas que han sido sometidas a una hepatectomía parcial, o lesiones hepáticas provocadas con tetracloruro de carbono, en modelos de fallos hepáticos agudos inducidos por D-galactosamina, etc. Según un protocolo adecuado, se administra a las ratas un veneno hepático, por ejemplo, \alpha-naftilisotiocianato (ANIT) en una concentración predeterminada capaz de provocar un aumento significativamente reproducible de las enzimas hepáticas y de los niveles de bilirrubina. Las ratas se tratan después con la variante de HGF para después estudiarlas. Se sacrifican y se determinan los niveles de enzimas hepáticas y de bilirrubina. Se realiza una observación adicional en busca de lesiones hepáticas.
La actividad biológica de otros ligandos y variantes de ligando se puede ensayar por procedimientos conocidos en la técnica.
Los compuestos de la presente invención son capaces de activar a sus respectivos receptores y mimetizar de este modo la actividad biológica de los ligandos nativos correspondientes. Se pueden formular según procedimientos conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles, a través de las cuales las variantes de ligando unidas se combinan en una mezcla con un vehículo farmacéuticamente aceptable. En Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª ed., 1980, Mack Publishing Co., editado por Oslo y col. se describen vehículos adecuados para estas formulaciones. Estas composiciones contendrán típicamente una cantidad eficaz del compuesto, por ejemplo, del orden de aproximadamente 0,5 a 10 mg/ml, junto con una cantidad suficiente de vehículo para preparar composiciones farmacéuticamente aceptables adecuadas para la administración eficaz al paciente. Los compuestos se pueden administrar vía parenteral o por otros procedimientos para garantizar su llegada al torrente sanguíneo de forma eficaz, siguiendo esencialmente las vías de administración conocidas para los ligandos nativos correspondientes.
Las composiciones particularmente idóneas para la administración clínica de los compuestos de la presente invención son los mismos, o que se pueden desarrollar basándose en, las formulaciones conocidas para los ligandos nativos correspondientes.
La dosificación y las concentraciones de fármaco deseadas de las composiciones farmacéuticas pueden variar dependiendo del uso particular potencial. Las dosis preliminares se pueden determinar en pruebas con animales, y se puede llevar a cabo una extrapolación interespecífica de las dosis de maneras conocidas en la técnica, por ejemplo, como se desvela en Mordenti y col., Pharmaceut. Res. 8, 1351 (1991) y en la bibliografía citada en dicho artículo.
Los siguientes ejemplos meramente ilustran el mejor modo actualmente contemplado para la práctica de la invención, pero no se deben interpretar como una limitación de la invención.
Ejemplo 1 Producción recombinante de las variantes de huHGF A. Mutagénesis dirigida
El aislamiento de ADN plasmídico, se usó electroforesis en gel de poliacrialmida como se desvela en Sambrook y col., citado con anterioridad.
Para la mutagénesis de huHGF se usó el plásmido de expresión en mamíferos pRK5.1 con un promotor CMV Genentech, Inc.) que permite la secreción de las variantes de HGF en el medio de cultivo y ensayar directamente la actividad biológica y la capacidad de unión. Este vector de expresión es un derivado del pRK5, cuya construcción se desvela en el documento EP307.247 publicado el 15 de marzo de 1989. pRK5.1 deriva del RK5 por inserción del oligonucleótido autocomplementario 5'-AGCTTGCCTCGAGGCA- 3' (Identificador de secuencia Nº: 14). La secuencia nucleotídica que codifica este vector pRK5.1 se desvela en la solicitud copendiente con Nº de serie 07/885.971 depositada el 18 de mayo de 1992.
El ADNc de huHGF usado corresponde a la forma de 728 aminoácidos como ya se ha publicado antes (Miyazawa y col., 1989, citado con anterioridad).
La mutagénesis se realizó según el método de Kunkel que usa la cepa de E. coli dut ung [Kunkel y col., Method. Enzymol. 154, 367-382 (1987)]. Los oligonucleótidos sintéticos usados para la mutagénesis in vitro y los cebadores para la secuenciación se prepararon usando el sintetizador de ADN 380A de Applied Biosystem como se describe en Matteucci y col., J. Am. Chem. Soc. 103, 3185-3191 (1981). Para la generación de los mutantes deseados, se sintetizaron los oligonucleótidos de las secuencias que codifican las sustituciones aminoacídicas deseadas y se usaron como cebadores. Se hibridaron los oligonucleótidos con un pRK 5.1-huHSA de cadena sencilla que ha sido preparada por procedimientos habituales [Viera y col., Method. Enzymol. 142, 3 (1987)].
Se combinó una mezcla de tres desoxirribonucleótidos, desoxirriboadenosina (dATP), deoxirriboguanosina
(dGTP), y deoxirribotimidina (dTTP), con tiodesoxirribonuleosina llamada dCTP(aS) incluida en el kit del fabricante, y se añadió al pRK 5.1-huHGF de cadena sencilla al que se hibridó el oligonucleótido.
Tras la adición de la ADN polimerasa a esta mezcla, se generó una cadena de ADN idéntica a pRK 5.1-huHGF salvo en las bases mutadas. Además, esta nueva cadena de ADN contiene dCTP(aS) en lugar de dCTP, que sirvió para protegerla de la digestión por endonucleasas de restricción. Después de cortar la cadena molde del heterodúplex de cadena doble con un enzima de restricción adecuado, se digirió la cadena molde con la nucleasa ExoIII en la región anterior al oligómero mutagénico. Se detuvo la reacción para permitir que una caperuza molecular fuera sólo parcialmente de cadena sencilla. Después, se formó un homodúplex de ADN de cadena doble con una ADN polimerasa en presencia de los cuatro desoxirribonucleótidos trifosfato, ATP, y una ADN ligasa.
Se prepararon los siguientes oligonucleótidos para usarlo como cebadores para generar moléculas variantes de pRK 5.1-huHGF.
100
La variante de huHGF Y673S, V692S se obtuvo a partir de un huHGF silvestre como molde, usando los oligonucleótidos usados para generar ambas mutaciones.
Se transformó la cepa MM294tonA de E. coli con las construcciones de huHGF mutantes generadas usando el anterior protocolo, usando el procedimiento de cloruro de calcio habitual (Sambrook y col., citado con anterioridad) para la preparación y transformación de las células competentes. MM294tonA (que es resistente al fago T1) se preparó por la inserción y posterior escisión imprecisa de un transposón Tn10 en el gen TonA. Este gen se insertó después, usando mutagénesis por inserto de transposón [Kleckner y col., J. Mol. Biol. 116, 125-159 (1977)], en la célula hospedadora E. coli MM294 (ATCC 31.446).
La extracción del ADN de las colonias individuales de los transformantes bacterianos usando el procedimiento habitual de miniprep de Sambrook y col, citado con anterioridad. Los plásmidos se purificaron adicionalmente pasándolos a través de una columna de centrifugación Sephacryl CL6B y después analizándolos por secuenciación y por digestión con endonucelasas de restricción y electroforesis en gel de agarosa.
B. Transfección de células 293 renales embrionarias humanas
Los plásmidos con la secuencia correcta se usaron para transfectar células 293 renales embrionarias humanas con el procedimiento del fosfato de calcio. Las células 293 crecieron hasta un 70% de confluencia en placas de 6 pocillos. Se disolvieron 2,5 mg de la variante de ADN plasmídico de huHGF en 150 ml de Tris-HCl 1 mM, EDTA 0,1 mM, CaCl_{2} 0,227 M. Se añadió (gota gota con agitación) 150 ml de tampón HEPES 50 mM (pH 7,35), NaCl 280 mM, NaPO_{4} 1,5 mM y se dejo que se formara un precipitado durante diez minutos a 25ºC. El precipitado resuspendido se añadió a las células en los pocillos individuales de la una placa de 6 pocillos. Las monocapas celulares se incubaron durante 4 horas en presencia del precipitado de ADN, se lavaron una vez con PBS y se cultivaron en medio sin suero durante 72 horas. Cuando se obtuvieron poblaciones estables, se subclonó el ADN de HGF en un plásmido episomal bajo el control del promotor CMV, el pCisEBON (G. Cachianes, C, Ho, R. Weber, S. Williams, D. Goeddel, y D. Lueng, en preparación). pCisEBON es un derivado del pRK5 que incluye secuencias que codifican un marcador de selección que codifica la neomicina fosfotransferasa (NEO), un origen de replicación derivado del origen del virus de Epstein Barr (ori P) y el gen vírico EBNA-1. El producto del gen EBNA-1 promueve la replicación estable y episomal de los plásmidos con la secuencia ori P [véase Cachianes, G. y col., Technique, in press (1992)]. La secuencia nucleotídica que codifica el pCisEBON se desvela en la solicitud copendiente con Nº de serie 07/885.971 depositada del 18 de mayo de 1992. Las poblaciones se seleccionaron directamente en un medio selectivo con neomicina.
Ejemplo 2 Procedimientos de ensayo
En vista de las actividades pleiotrópicas de HGF, una molécula con una estructura diferente de cualquier otro factor de crecimiento, es importante comprender la interacción molecular de este factor con su receptor. Las variantes de huHGF producidas como se describe en el ejemplo 1 se analizaron para estudiar su capacidad para inducir la síntesis de ADN en cultivos primarios de hepatocitos y para competir en la unión con una forma soluble del receptor de huHGF.
A. Cuantificación de proteína de huHGF silvestre y de las variantes de huHGF
Se usó un ELISA tipo sándwich de huHGF bilateral específico usando dos anticuerpos monoclonales para cuantificar el huHGF recombinante silvestre (rhuHGF WT), de cadena sencilla y variantes por sustitución por proteasas. Las placas de microtitulación (Maxisorb. Nunc) se revistieron con 10 mg/ml de un anticuerpo A 3.1.2 anti rhuHGF monoclonal (fenotipo IgG2a, afinidad): 3,2 x 10^{-8} mol) en un tampón carbonato 50 mM, pH 9,6, durante la noche a 4ºC. Después de bloquear las placas con BSA (seroalbúmina bovina de Sigma) al 0,5%, 0,01% de timerosal en PBS, pH 7,4 y posteriores lavados, se prepararon diluciones en serie por duplicado de las muestras de HGF y se expresaron en paralelo en células CHO rhuHGF (40-0,1 ng/ml) y se usaron como un estándar. Se incubaron simultáneamente cincuenta microlitros de estas diluciones con 50 ml de una dilución 1:1500 de peroxidasa de rábano picante conjugada con el anticuerpo B 4.3 anti rhuHGF (fenotipo IgG1, afinidad: 1,3 x 10^{-8} mol) durante 2 horas a temperatura ambiente (TA). Se preparó el sustrato añadiendo 0,04% de dihidrocloruro de o-fenilenediamina (Sigma) y 0,012% (v/v) de hidrogenperoxido (Sigma) a PBS y se añadieron 100 ml a las placas lavadas durante 15 minutos a TA. Se detuvo la reacción añadiendo 50 ml de ácido sulfúrico 2,25 M a cada pocillo. La absorbancia a 490 nm, restando la absorbancia a 405 nm como ruido, se determinó en un lector de placas de microtitulación (Vmax, Molecular Devices, Menlo Park, CA). Los datos se redujeron usando un programa de ajuste a una curva según cuatro parámetros desarrollado por Genentech, Inc.
Se usó un ELISA tipo sándwich policlonal de HGF para cuantificar todas las variantes por deleción de dominios kringle y por truncamientos del extremo C terminal. Brevemente, se revistieron las placas de microtitulación (Nunc) con 5 mg/ml de una preparación de anticuerpos IgG (anti rhuHGF expresado en células CHO) policlonal de cobaya (Genentech, Inc.) como se describe anteriormente. Este anticuerpo reconoce a rhuHGF así como a las formas truncadas de HGF cuando se comparan en una inspección visual de inmunotransferencias tipo Western, haciéndolo idea para estudiar las variantes HGF. Se bloquearon las placas y se añadieron diluciones enserie por duplicado de los sobrenadantes de las células (1:103-6,106) y se incubaron durante la noche a 4ºC. Se usó un rhuHGF (100-0,78 ng/ml) expresado en células CHO y purificado como estándar y se incubó en paralelo. Se lavaron las placas y se incubaron con una dilución de 1:500 del mismo anticuerpo policlonal (aprox. 400 ng/ml) pero en este caso con el conjugado de peroxidasa de rábano picante para la detección de las variantes (véase con anterioridad). Se realizó una transferencia por adsorción tipo Western para determinar el tamaño de las variantes de HGF expresadas. Para esto, se realizaron electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS e inmunotransferencias tipo Western usando procedimientos habituales con la preparación de anticuerpos IgG policlonales (500 ng/ml). Se usó un procedimiento de detección por quimioluminiscencia (Amersham) y un conjugado de IgG-peroxidasa de rábano picante anti cobaya (1:5000) para el desarrollo de una inmunotransferencia como describe el fabricante.
B. Ensayo de unión a un receptor de HGF soluble
Los estudios previos sobre la capacidad de unión a un HGF han demostrado que huHGF podría unirse a su receptor de superficie celular con una alta afinidad (Kd-24-32 pM; Higuchi and Nakamura, Biochem. Biophys. Res. Comm. 174, 831-838 (1991)). Preferimos examinar la capacidad de unión de HGF usando una forma soluble del receptor debido a la unión inespecífica de HGF a los proteoglicanos de sulfato de heparina de la superficie celular [Naldini y col., EMBO J. 10, 2867-2878 (1991)].
Se analizaron los sobrenadantes celulares (concentrados con filtros Amicon si la concentración era inferior a 600 ng/ml) para estudiar su capacidad de bloquear en solución la unión de rhuHGF I^{125} expresado en células CHO (2-5 x 10^{3} Ci/mmol, amablemente facilitado por T. Zioncheck, Genentech, Inc.) al dominio extracelular del receptor de HGF humano (huHGFr) fusionado a la región constante Fc de una IgG humana, expresada y secretada en células 293.
1. Construcción de quimeras huHGFr-IgG
Se construyó un clon de ADNc de longitud completa que codifica el huHGFr uniendo ADNC parciales aislados de genotecas de ADNc y por amplificación con PCR. Las secuencias codificadoras de los aminoácidos 1-270 se aislaron de una genoteca de ADNc de placenta (facilitado por T. Mason, Genentech) analizada con un oligonucleótido de 50 mer 5'-ATGAAGGCCCCCGCTGTGCTTGCACCTGGCATCCTCGTGCTCCTGTTTACC-3') (Identificador de secuencia Nº: 15). Las secuencias que codifican los aminoácidos 809-1390 se aislaron de una genoteca de hígado humano (Stragagen) analizada con la sonda oligonucleotídica (5'-CACTAGTTAGGATGGGGGACATGTCTGTCA
GAGGATACTGCACTTGTCGGCATGAACCGT-3'). (Identificador de secuencia Nº: 16).
Las condiciones para la siembra en placas de las genotecas, y para la hibridación y los lavados de los filtros fueron como ya se ha descrito [Godowski y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 86, 8083-8087 (1989)]. Se uso la PCR para aislar un clon de ADNc con los residuos 271-808 del HGFr (c-met) a partir de células A549. Se usaron diez mg de ARN total para la transcripción reversa usando un cebador específico para el HGFr (5'-TAGTACTAGCACTATGATGTCT-3') (Identificador de secuencia Nº: 17) en una reacción de 100 ml usando la transcriptasa reversa del virus de la leucemia murina Moloney y los tampones suministrados por Bethesda Research Laboratories. Una décima parte de las mezclas de reacción se usaron para la amplificación por PCR. La reacción de PCR se llevó a cabo en un volumen de 100 ml con 10 ml de la reacción de la transcriptasa reversa, KCl 10 mM, Tris-HCl 20 mM (pH 8,8), (NH_{4})SO_{4} 10 mM, MgSO_{4}, 6 mM, 0,1% de Trition X-100, 1 U de ADN polimerasa Vent (New England Biolabs) y 50 pmol del cebador directo (5'-TTTACTTCTTGACGGTCCAAAG-3' (Identificador de secuencia Nº: 18) y el cebador reverso (5'-CAGGGGGAGTTGCAGATTCAGCTGT-3') (Identificador de secuencia Nº: 19). Después de treinta ciclo de desnaturalización (95 ºC, 1 m), hibridación (55ºC, 45 s) y elongación (72ºC, 2 m), se recuperó el producto de la PCR a partir de geles de agarosa de baja temperatura de fusión. Se subclonó el ADNc de HGFr de longitud completa en el vector pRK7 (véase el documento WO90/02798, publicado el 22 de marzo de 1990) y la secuenciación de la cadena doble se realizó con el procedimiento del didesoxinucleótido.
Se fusionó la secuencia codificadora del dominio extracelular de huHGFr con la de la cadena pesada de una IgG1 humana en un proceso de dos pasos. Se uso una PCR para generar fragmento con un sitio único BstEII en 3' de las secuencias que codifican el aminoácido 929 de HGFr. Se usó el cebador 5' (localizado en el vector en dirección 5' de las secuencias codificadoras) y el cebador 3' (5'-AGTTTTGTCGGTGACCTGATCATTCTGATCTGGTTGAAC
TATTAC-3') (Identificador de secuencia Nº: 20) en una reacción de 100 ml como se describe con anterioridad salvo que el tiempo de elongación a 72ºC fueron 3 minutos y como molde se usaron 40 ng del vector de expresión de HGFr. En la siguiente amplificación, el producto de la PCR se unió al ADNc de la cadena pesada de la IgG1 \gamma1 humana a través del sitio BstEII en esa construcción [Bennett y col., J. Biol. Chem. 266, 23060-23067 (1991)]. La construcción resultante contiene las secuencias codificadoras de los aminoácidos 1-929 de huHGFr fusionados a través del sitio BstEII (añadiendo las secuencias codificadoras para los aminoácidos V y T) para las secuencias que codifican los aminoácidos 216-443 de la cadena pesada de una IgG1 \gamma1 humana. La secuenciación de la construcción se llevó a cabo como se describe anteriormente.
2. Ensayo de unión
El ensayo de unión se realizó en placas de microtitulación (Nunc) desechables revestidas durante la noche a 4ºC con 1 mg/ml de un anticuerpo específico anti Fc de IgG humana (Jackson Immunoresearch) y se lavaron plas placas cuidadosamente con PBS con un 0,05% de Tween 20 (Biorad). Después de bloquear con PBS con 0,1% de BSA, se añadió en el mismo tampón rhuHGF-I^{125} 50pM a razón de 25 ml por pocillo. A cada pocillo se añadió y por duplicado 50 ml de diluciones seriadas (1:25-1:6000) de sobrenadantes celulares, rhuHGF expresado en células CHO purificado (25.000-0,064 pM) o medio selectivo. Posteriormente, se añadieron 25 ml de la proteína de fusión receptor de HGF:IgG 50 pM y se incubaron las placas con una ligera agitación. Después de 4 horas, cuando se alcanzó el equilibrio, se lavaron las placas y los pocillos, se realizaron recuentos individuales en un contador gamma. La cantidad de radiactividad unida inespecíficamente se estimó incubando la proteína de fusión receptor de HGF:IgG con un exceso de rhuHGF sin marcar. La constante de disociación (Kd) de cada análogo se calculó a la CI50 a partir de las curvas de inhibición ajustadas usando la concentración determinada por el ELISA.
C. Ensayo biológico
La actividad biológica de huHGF WT y de las variantes se midió en función de su capacidad de inducir la síntesis de ADN en cultivos primarios de hepatocitos de rata. Los hepatocitos se aislaron según las técnicas de perfusión publicadas con ligeras modificaciones [Garrison y Haynes, J. Biol. Chem. 150, 2269-277 (1975)]. Brevemente, se realizó una perfusión en hígados de ratas hembras Sprague Dawley (160-180 g) a través de la vena portal con 100 ml de una solución salina tamponada con HEPES sin Ca^{++} con un 0,02% de colagenasa tipo IV Sigma). Después de 20 minutos se extirparon los hígados, se colocaron en un tampón y se agitaron suavemente para separar los hepatocitos del tejido conectivo y de los vasos sanguíneos, y se filtraron por una malla de nailon. Se lavaron las células por centrifugación, se resuspendieron a razón de 1x10^{5} células/ml en medio Williams E (Gibco) con penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 mg/ml), L-glutamina (2 mM), oligoelementos (0,01%), transferrina (10 mg/ml) y aprotinina (1 mg/ml). Se incubaron los hepatocitos en placa de microtitulación de 96 pocillos (Falcon) en presencia de diluciones seriadas de rhuHGF expresado en células CHO y purificado, (1-0,031 mg/ml), sobrenadantes de células 293 (1:4-1:256) o medio. Después de 48 horas de incubación a 37ºC, se añadió TdR-H^{3} 0,5 mCi (15 Ci/mmole, Amersham) a cada pocillo y se incubaron durante 16 horas adicionales. Se recogieron las células en papel de filtro, que se lavaron a continuación, se secaron y se recontaron en un contador Beckman tras la adición de un líquido de centelleo. Para cada variante huHGF, la actividad específica (AE) expresada en unidades/mg se calculó a la proliferación semimáxima (definida como 1 unidad/ml) usando la concentración de HGF obtenida en el ELISA.
D. Inducción de la fosforilación de tirosinas en células A549
Se cultivaron monocapas de células de carcinoma de pulmón humano (A549) en un medio RPMI 1640 con un 10% de suero fetal bovino y se mantuvieron a 37ºC en una atmósfera húmeda con un 5% de CO_{2}. Las células sin suero se incubaron con o sin 200 ng/ml de rhuHGF durante 5 minutos a 37ºC y se extrajeron con tampón de lisis con HEPES 50 mM, NACl 150 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, EGTA 1 mM; glicerol al 10%, Triton X-100 al 1% y una combinación de inhibidores de proteasas. Se inmunoprecipitaron los lisados con anticuerpos anti Met COOH y se transfirieron por adsorción y se revelaron con anticuerpos anti fosfotirosina (véase la transferencia por adsorción tipo Western, en los apartados anteriores).
Ejemplo 3 Análisis de sitios de corte en mutantes
Los sitios de corte de proteasas normalmente contienen un residuo básico en la posición P1 y dos residuos de aminoácidos hidrófobos rn las posiciones P'1 y P'2, que están después del enlace peptídico cortado. El sitio de corte propuesto para huHGF (P1 R494, P'1 V495, P'2 V496) se ajusta a este consenso. Decidimos intentar bloquear el corte de huHGF reemplazando el P1 R494 con D, E, o A. La forma principal de rhuHGF expresada en estas células se corta en dos cadenas como se deduce de la presencia de la cadena \alpha con una masa molecular aparente de 69 kDa (fig. 2). Cada una de estas mutaciones parecía bloquear el procesamiento de rhuHGF ya que en condiciones reductoras estas variantes miigraban como una sola banda a 94 kDa, el tamaño teórico de una cadena sencilla de HGF. Estas variantes carecían totalmente de la capacidad de inducir la proliferación de hepatocitos en cultivos primarios (fig. 3A). Sin embargo, cuando se analizaron estas variantes para estudiar su capacidad de competir con el rhuHGF WT en la unión a la proteína de fusión receptor de HGF:IgG, sus curvas de inhibición eran aproximadamente similares a las del rhuHGF WT (fig. 3B). La Kd determinada a partir de estas curvas mostró que rhuHGF WT se une a la proteína de fusión con una gran afinidad (50-70 pM) mientras que todas las variantes de cadena sencilla mostraron aproximadamente un Kd de 2 a 10 veces superior (100-500 pM) en comparación con el rhuHGF WT. Los resultados a partir de al menos tres ensayos independientes se resumen en la tabla I como actividad proliferativa de los hepatocitos y capacidad de unión al receptor en comparación con el rhuHGF WT.
Nuestros estudios de unión demostraron que rhuHGF WT se unía a la proteína de fusión del receptor soluble con una sola clase de sitios de unión de alta afinidad (50-70 pM), similares a los descubiertos en hepatocitos por Higushi y Nakamura (1991). Sin embargo, la capacidad de unión de HGF en células puede ser ligeramente diferente ya que el receptor soluble es realmente un dímero unido el puente disulfuro de la región bisagra de la región constante Fc de la IgGA.
La comparación directa de la actividad específica (AE) frente a los cocientes de Kd de todas las variantes de cadena sencilla demostró que eran inactivas a las concentraciones mayores probadas (AE<3%) mientras que las afinidades de unión al receptor sólo disminuyeron en un factor de 2-3.
Estos resultados justifican fuertemente que el corte de HGF en la forma de dos cadenas es necesario para la actividad mitogénica, es decir, que el HGF de cadena sencilla es un promitógeno y que la forma sin cortar de HGF se une al receptor de HGF, aunque con una afinidad reducida.
La forma principal de HGF aislada de placenta [Hernandez y col., (1992) J. Cell Physiol., en prensa] o expresada en células CHO transfectadas [Rubin y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 88, 415-419 (1991)] se encuentra en forma de cadena sencilla. Cuando se analizó en ensayos mitogénicos, esta forma de HGF de cadena sencilla se biológicamente activa. Esto sugiere, junto con nuestros datos, que este HGF de cadena sencilla se activa en la forma de doble cadena durante el ensayo mitogénico.
Una segunda observación es que las variantes de cadena sencilla conservan una capacidad sustancial de unirse al receptor de HGF, como lo sugieren nuestros ensayos de unión competitiva. Esto ofrece la interesante posibilidad de que un HGF de cadena sencilla se pueda unir a un receptor de HGF de la superficie celular in vivo en un estado inactivo y que posteriormente se puede cortar en la forma activa de cadena doble con la proteasa apropiada.
Ejemplo 4 Los efectos de las mutaciones en el dominio de la proteasa
Para elucidar la importancia funcional del dominio proteasa de HGF, se realizaron varias mutaciones sencillas, dobles y triples para reconstituir un sitio potencial serina proteasa. La construcción de estas variantes se describe en el ejemplo 1.
Reemplazamos los residuos de HGF Q534 con H, Y673 con S, o V692 con S como mutaciones simples, dobles o triples. El análisis de sus efectos sobre la actividad mitogénica y la capacidad de unión al receptor demostró que la mutación simple Q534H no alteraba significativamente ni la AE (5,2 x 10^{4} unidades/mg) ni la Kd (60 pM) en comparación con el rhuHGF WT (respectivamente 3,3 10^{4} unidades/mg y 70 pM) mientras que Y673S y V692S mostraron una AE reducida aproximadamente 5 y 10 veces, respectivamente. De hecho, estas dos variantes nunca alcanzaron el nivel estable máximo visto en el rhuHGF WT (aproximadamente 50% del nivel estable de rhuHGF WT). Curiosamente, estas variantes mostraron una Kd similar a la de rhuHGF WT. El resto de variantes doble y triple mutantes también conservaron la capacidad de unirse al receptor de HGF pero mostraron una AE claramente reducida (tabla I). La AE residual de las variantes dobles Q534H, Y673S y Y673S, V692S y de la triple variante Q534H, Y673S, V692S fue menor del 3% en comparación con el rhuHGF WT. Sin embargo, la Kd de estas variantes no fue significativamente diferente de la de rhuHGF WT (tabla I). Estas variantes indican que las mutaciones en la cadena \beta de HGF bloquean la actividad mitogénica pero son capaces de unirse al receptor de HGF. De este modo, parece que estos mutantes carecen de una actividad posterior a la unión al receptor.
Estos resultados muestran que aunque la cadena \beta no sea necesaria para la unión al receptor, determinados residuos (por ejemplo, Y673 y V692) son críticos para la estructura y/o la actividad de HGF. La sustitución del residuo apolar V692 con el residuo polar S podría haber causado una transición estructural si se hubieran introducido nuevos puentes de hidrógeno en el sitio activo del residuo D594, como el que se encuentra en las serina proteasas. La sustitución de Y673 con el residuo más pequeño S podría además introducir alguna modificación estructural local. Por otro lado, la sustitución del residuo polar Q534 con otro residuo polar H de amaño similar probablemente no causaría ninguna diferencia drástica en la conformación de HGF ya que este residuo estaría expuesto; de hecho la variante Q534H fue similar a rhuHGF (tabla I).
Ejemplo 5 El efecto de las deleciones del extremo C terminal y del dominio kringle
Para afirmar si la cadena \alpha es necesaria para la unión o para la actividad de HGF, se realizaron truncamientos en el extremo C terminal como se describe en el ejemplo 1, produciendo variantes con la cadena \alpha sola, o variantes truncadas después del tercer (N-384) o el segundo (N-303) dominio Kringle.
Se realizaron varios truncamientos en el extremo C terminal delecionando la cadena \beta o la cadena \beta y un número progresivo de dominios kringle como se ilustra en la fig. 1. Una variante (N-207) correspondiente al dominio N terminal con el primer dominio kringle no expresó la proteína a niveles detectables ni por transferencia por adsorción tipo Western ni por ELISA usando una preparación de anticuerpos policlonales y no se continuó con su investigación. La expresión de las variantes con los dos primeros dominios kringle (N-303), tres dominios Kringles (N-384) o la cadena \alpha completa de HGF fue de 250-600 ng/ml. En la tabla I se presenta un resumen de la AE residual y de la Kd de estas variantes en comparación con rhuHGF WT. A la concentración probada no se observó actividad por encima de los niveles basales lo que indica que estas variantes han perdido su actividad biológica. Sin embargo, los estudios de competición por la unión demostró que las variantes N-303, N-384 o la cadena \alpha conservaban una sustancial capacidad de unión (hasta un 23% en comparación con el rhuHGF WT). De este modo, los residuos 272 del extremo N terminal de HGF (la forma madura de la variante N-303) son suficientes para la una alta afinidad de unión al receptor de HGF.
Los resultados de la deleción de cada dominio Kringle se muestran en la tabla I. La deleción del primer dominio Kringle (variante \DeltaK1) de HGF afectó principalmente a la actividad biológica, mostrando al menos una reducción de 100 veces (SA< 0,2% de rhuHGF wt).
De modo similar, la capacidad de unión de esta variante también se vio afectada ya que no fue capaz de competir por la unión con rhuHGF wt hasta una concentración de 2 mg/ml. La deleción del resto de dominios Kringle (variantes \DeltaK2, \DeltaK3 o \DeltaK4) también induce una drástica reducción de la actividad mitogénica (tabla I). Sin embargo, las Kd de estas variantes por deleción fueron próximas a las observadas con el rhuHGF wt.
Estos datos demuestran que los dominios kringle K3 y K4 no son necesarios para la unión al receptor. Nuestros datos apoyan las observaciones previas realizadas por Miyazawa y col., 1991 citado con anterioridad, y Chan y col., 1991 citado con anterioridad, en el sentido de que la variante N-303, cuya secuencia aminoacídica es muy similar a la de HGF/NK2, conserva la capacidad de competir eficazmente por la unión al receptor de HGF Kd~280 pM). Además, las observaciones de que N-303 es suficiente para la unión al receptor y que el segundo dominio kringle no es necesario para la unión al receptor de HGF (en el contexto del resto de la molécula) sugieren que el dominio de unión al receptor está contenido en el dominio del dedo y el primer dominio Kringle de huHGF. Desafortunadamente, no hemos sido capaces de detectar la expresión de esta variante usando nuestro antisuero policlonal lo que sugiere que la variante N-207 (la deleción tras el segundo dominio Kringle) no se expresó en las células 293.
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TABLA I
Variantes (var) AE var/AE wt +/- D.T. Kdwt/Kdvar +/- D.T.
Cadena sencilla
R494A <0,03 0,32 +/- 0,18
R494D <0,03 0,51 +/- 0,21
R494E <0,02 0,31 +/- 0,13
Proteasa
Q534H 1,19 +/- 0,44 1,48 +/-0,85
Y673S 0,27 +/- 0,07* 1,35 +/- 0,72
V692S 0,08 +/- 0,04 1,02 +/- 0,13
Q534H,Y673S <0,03 2,24 +/- 1,11
Y673S,V692S <0,02 1,76 +/- 0,63
Q534H, Y673S, <0,02 1,91 +/- 1,28
V692S
Truncamiento del extremo C terminal
N-303 <0,05 0,23 +/- 0,03
N-384 <0,05 0,25 +/- 0,02
cadena á <0,04 0,25 +/- 0,03
Deleción de dominios kringle
ÄK1 <0,002 <0,03
ÄK2 <0,05 0,41 +/- 0,18
ÄK3 <0,03 0,56 +/- 0,36
ÄK4 <0,07 0,86 +/- 0,46
Ejemplo 6 Inducción de la fosforliación de tirosinas del receptor de huHGF
Determinamos si las variantes R494E o Y673S, V692S, que se unen al receptor de HGF in vitro pero carecen de actividad mitogénica, podían estimular la fosforilación de las tirosinas del receptor de HGF en células A549. Se trataron células sin suero con rhuHGF WT purificado o con variantes y los inmunoprecipitados de receptor de HGF se inmunotrasfirieron y revelaron con anticuerpos anti fosfotirosina. La estimulación con rhuHGF wt condujo a la fosforilación de la tirosina de la subunidad \beta de 145 kDa del receptor de HGF (fig. 4). Ambas variantes presentaron una reducida capacidad para inducir la fosforilación del receptor de HGF.
La estimulación de la fosforilación de la tirosina de la subunidad \beta del receptor de HGF ya había sido previamente descrita [Bottaro y col., Science 251, 802-804 (1991), Naldini y col., 1991 citado con anterioridad]. Los presentes datos muestran que las variantes R494E y Y673S, V692S se puede unir a proteína receptor soluble de HGF: IgG in vitro pero no son eficaces a la hora de estimular la fosforilación de la tirosina en células A549. Una interpretación de este resultado es que estas variantes son capaces de unirse al receptor de HGF en células A549, pero carecen de la función necesaria para inducir una fosforilación eficaz, por ejemplo, dimerización del receptor. Se ha demostrado para otras proteínas receptoras con una actividad intrínseca tirosina quinasa como por ejemplo, el factor de crecimiento derivados de plaquetas epitelial, que las interacciones receptor-receptor o la dimerización es necesaria para la activación de la función quinasa [para un revisión véase Ulrich y Schlessinger, Cell 61 203-212 (1990)]. Alternativamente, puede que estas variantes no sean capaces de unirse al receptor de HGF asociado a la superficie celular.
La estructura única de HGF sugiere que hay múltiples factores que regulan la actividad biológica de esta molécula. Una etapa temprana de regulación puede ser el paso de corte para generar la forma de dos cadenas biológicamente activa. Curiosamente, el corte no simplemente regula la unión al receptor sino un posterior control necesario para activar al receptor de HGF. Nuestros datos también sugieren que la cadena \beta, que no es requerida en absoluto para la unión al receptor, contribuye en la etapa de activación del receptor. Estas variantes pueden ser útiles para diseccionar los eventos en la señalización del receptor de HGF.
Ejemplo 7 Generación y caracterización de HGF/NK1 A. Procedimientos experimentales
Materiales. Heparina-sefarosa comprada a Bio-Rad. Columnas de intercambio catiónico Mono S y equipamiento para HPLC de Pharmacia. Tubo de diálisis SpectraPor/10 (peso molecular de corte: 10.000) de Spectrum. Todas las enzimas de restricción fueron obtenidas de New England Biolabs y usadas según las instrucciones del fabricante.
Los anticuerpos monoclonales M2 anti Flag fueron de IBI, Kodak. El HGF recombinante humano se fabricó en Genentech, Inc., South San Francisco. El dominio kringle 4 purificado del plasminógeno fue cedido amablemente por Frank Castellino.
Cepas bacterianas. La cepa 294 de E. coli (end A1 thi-1 hsdR F-supE44; ATCC 31446) se empleó para las transformaciones rutinarias y preparaciones plasmídicas. La cepa de E. coli 27C7 carente de proteasas (tonAD phoADE15 D(argF-lac)169 ptr3 degP41 anR ompTD) se usó para la expresión de HGF/NK1 bajo el control del promotor phoA.
Construcción de plásmidos y expresión de NK1. El aislamiento del ADN plasmídico y las electroforesis de geles del poliacrilamida y agarosa como se ha descrito Maniatis y col., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1982). La expresión en bacterias se realizó usando el plásmido de expresión pb0720 [Chang y col., Gene 55, 189-196 (1987)] en el que se subclonó, en 3' la secuencia señal de la enterotoxina termoestable (stII), una secuencia modificada del epítopo Flag de 10 residuos aminoacídicos (S-D-Y-K-D-D-D-D-K-L) (Identificador de secuencia Nº: 26) y la secuencia madura [Yoshiyama y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 175, 660-667 (1991)] de HGF/NK1 humana (residuos 32-210 del extremo N terminal de HGF humano que contienen la horquilla completa del extremo N terminal) y los dominios kringle 1) como se resume en la fig. 8 (a las secuencias mostradas en la figura 8 se les han asignado los Identificador de secuencia Nº: 27, 28 y 29, respectivamente). El epítopo Flag [Hopp y col., Biotechnology 6, 1205-1210 (1988)] se usó para seguir la secreción y secreción de la HGF/NK1. La inducción de la expresión de HGF/NK1 se realizó por privación de fosfato como se ha descrito (Chang y col., citado con anterioridad). Para la subclonación, se digirió el plásmido pb0720 con NsiI y BamHI y se trató con fosfatasa de intestino de ternera. El fragmento de HGF/NK1 se aisló por PCR usando un cebador 5' específico (5'-CCCGGGATGCATCA
GACTACAAGGACGACGATGACAAGCTTCAAAGGARAAGRAGRAAT-3') (Identificador de secuencia Nº: 30) que codifica un sitio de restricción para la endonucleasa NsiI junto a la secuencia del epítopo Flag y los primeros seis residuos del HGF maduro. El cebador 3' reverso (5'-CCCGGGAGGCCTCTATTCAACTTCTGAACACTG-3') (Identificador de secuencia Nº: 31) codifica los últimos residuos de la secuencia HGF/NK1 (incluyendo los 4 residuos posteriores a la última cisteína del dominio kringle 1 adyacente a un codón de parada y a un sitio de restricción para la endonucleasa StuI, fig. 8). El plásmido pRK.huHGF con la secuencia completa del ADNc de HGF se usó como molde [Lokker y col, EMBO J. 11, 2403-2510 (1992)]. El producto de PCR Flag-NK1 aislado se digirió posteriormente con NsiI y StuI, y se ligó con un fragmento terminador StuI-BamHI (414 pb; Scholtissek y Grosse, Nucl. Acids Res. 15, 318 (1987) en el plásmido de expresión pb0720 antes descrito. El plásmido pf-NK1 generado se secuenció después para verificar la autenticidad de la secuencia de HGF/NK1 usando el equipo de la secuenasa (United States Biochemical Corporation). Las secuencias de ADN y las secuencias aminoacídicas deducidas del plásmido de expresión pf-NK1 generado se representan en la fig. 8.
Purificación de NK1. El plásmido de expresión pf-NK1 resumido en la fig. 8 se usó para transformar la cepa 27C7 de E. coli carente de proteasas. La cepa transformada creció en 10 l de medio con baja cantidad de fosfato a 37ºC en un fermentador. Las células se recogieron 36 horas después de la inoculación y se almacenaron sedimentadas a -20ºC. Se obtuvo aproximadamente 1 kg de sedimendo celular a partir de los 10 l del fermentador. Una purificación típica se inició a partir de 100 g de sedimento celular en peso húmedo y se resume en la fig. 9. Se descongeló el sedimento celular y se resuspendió en 1 l de tampón enfriado nn hielo (Tris-HCl 10 mM, pH 7,6, EDTA 5 mM, NaCl 0,5 M). Se homogenizó la suspensión tissumizer, Tekmar) y se agitó en hielo durante 1 hora. La solución se centrifugó a 13.000 rpm durante 30 minutos en un rotor Sorvall GSA. Se lavó el sobrenadante con un filtro Nalgene 0,2 mM (con prefiltro) y se diluyó con Tris- HCl 10 mM pH 7,6, EDTA 5 mM hasta NaCl 0,15 M. La fracción soluble se cargó en una columna de afinidad (2,5 x 10 cm) de heparina-sefarosa equilibrada a 4ºC a una velocidad de flujo de 20 ml/h. La columna se lavó con Tris- HCl 10 mM pH 7,6, EDTA 5 mM, NaCl 0,15 M, hasta que la absorbancia a 280 nm alcanzó valores basales. El material unido se eluyó con Tris-HCl 10 mM, pH 7,6, EDTA 5 mM, NaCl 2 M. Las fracciones que contenían la HGF/NK1 se identificaron por transferencia por adsorción tipo Western usando el anticuerpo monoclonal M2 anti Flag (IBI/Kodak). Se combinaron las fracciones positivas, y se dializaron frente a Tris- HCl 10 mM pH 7,6, EDTA 5 mM, NaCl 0,15 M y se cargaron en una segunda columna de heparina (1 x 5 cm). Las proteínas unidas se eluyeron con un gradiente lineal de NaCl desde 0,15 M hasta 2,0 M en Tris-HCl 10 mM pH 7,6, EDTA 5 mM. En esta etapa, se estimó que la preparación de HGF/NK1 era aproximadamente un 80% pura en una electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (PAGE) seguida de tinción con Coomassie y plata. Se combinaron las fracciones con HGF/NK1, se dializaron en acetato de sodio 20 mM, pH 6,0, NaCl 0,25 M (tampón de carga) y se cromatografiaron en una columna de intercambio catiónico FPLC Mono S de Pharmacia (tamao 5/5). La proteína se eluyó con un gradiente lineal de NaCl desde 0,25 M hasta 1,5 M a una velocidad de flujo de 0,6 ml/m. Se recogieron fracciones entre 1 y 1,5 ml. Las fracciones positivas para HGF/NK1, se combinaron y dializaron frente a Tris-HCl 10 mM pH 7,6, EDTA 5 mM, NaCl 0,25 M. La tinción con plata de la muestra final de HGF/NK1 indicó al menos un 95% de pureza. La concentración de proteína se determinó por el método de Bradford con HGF como estándar y un análisis de la composición aminoacídica como se describe a continuación.
Capacidad de unión al receptor, la autofosforilación del receptor de HGF y ensayos biológicos. Los ensayos de unión al receptor soluble y al A549, la inducción de fosforilación de tirosina sobre células A549 y la proliferación estimulada por HGF un cultivo primario de hepatocitos se realizó exactamente como se describe en los anteriores ejemplos y en Lokker y col., citado con anterioridad (1992) y Mark y col., J. Biol. Chem. 267, 26166-26171 (1992). A partir de los ensayos de unión, la constante de disociación aparente del competidor sin marcar (kd) se determinó usando la ecuación Kd=IC50/(1 + [L]/Kd) para la inhibición competitiva entre dos ligandos de un tipo de receptor [Cheng y Prusoff, Biochem. Pharmacol. 22, 3099 (1973)) en la que CI50 es la concentración de competidor sin marcar necesaria para un desplazamiento del 50% de la unión de HGF marcado con I^{125}. [L] es la concentración de HG marcado radiactivamente, y la Kd es la constante de disociación aparente para HGF-I^{125}.
Isoelectroenfoque (IEF) de NK1. El patrón de IEF de HGF/NK1 se examinó en un gel de poliacrilamida de EIF (pH 3-10) usando el sistema de gel Novex según el procedimiento del proveedor.
Análisis de proteínas por SDS-PAGE. El fraccionamiento de las muestras de HGF/NK1 se realizó por electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE) con geles con un gradiente de glicina de 8-16% (Novex) en un aparato para minigeles Novex y las proteínas. Para la transferencia por adsorción tipo Western, se transfirieron las proteínas a un papel de nitrocelulosa con un aparato Novablot de Pharmacia LKB Biotechnology Inc. La transferencia se bloqueó con una solución salina con tampón Tris y un 3% de leche desnatada en polvo durante la noche a temperatura ambiente. Para la detección de la proteína de fusión Flag-HGF/NKl se usó el anticuerpo M2 monoclonal (1 mg/ml, IBI/Kodak) 2 horas a temperatura ambiente. Después de tres lavados en esta solución salina con tampón Tris, se incubó la transferencia con un anticuerpo anti IgG de ratón conjugado a la peroxidasa de rábano picante (1: 5000, Amersham) durante 20 minutos a temperatura ambiente y se lavó cuatro veces. La inmunotransferencia tipo Western se desarrolló con un sistema de detección quimioluminiscente como se describe en las instrucciones del fabricante (Amersham).
Secuenciación del extremo N terminal de la proteína. La secuenciación automática de la proteína se realizó en los modelos 470A y 477A de secuenciadores de Applied Biosystems equipados con analizadores PTH en línea. Se secuenciaron las proteínas transferidas por adsorción en el cartucho para inmunotransferencias. Se integraron los picos con el programa Justice Innovation usando los interfaces Nelson analytical 760. La interpretación de la secuenciación se realizó en un cromatógrafo VAX 8650 J. 404, 41-52 [Henzel y col., (1987)].
Análisis de aminoácidos. Se hidrolizaron los péptidos durante 24 horas con HCl 6 N en ebullición constante a 110ºC en condiciones de vacío usando una estación de trabajo Millipore Picotag. Se secaron los hidrolizados en un concentrador Savant Speed-Vac y se analizaron en un analizador de aminoácidos Beckman modelo 6300 equipado con un detector de ninhidrina usando un programa automatizado de 45 minutos.
Cromatografía de líquidos/Espectrometría de masas (LC-MS). Las muestras se inyectaron en un sistema de cromatografía de líquidos capilar [Henzel y co., Anal. Biochem. 187, 228 (1990)] y se analizaron directamente usando un espectrómetro de masas triple cuádruple Sciex API III. Para la calibración del equipo se usaron múltiples iones cargados de mioglobina de caballo (PM = 16951 kDa).
Resultados
Caracterización de la HGF/NK1 expresada en E. coli - Para seguir la expresión y la purificación de HGF/ NK1 en E. coli, construimos un gen que contiene las secuencias codificadoras del epítopo "Flag" inmunorreactivo fusionado en dirección 5' de los residuos 32-210 del HGF humano como se describe en la fig. 8. Ya que HGF/NK1 contiene 10 residuos de cisteína, usamos una secuencia guía stII para dirigir la secreción de la proteína al espacio periplásmico y para purificar la forma soluble a partir de la fracción sometida a un choque térmico (fig. 9). La tinción con Coomassie y el análisis de inmunotransferencia tipo Western usando un anticuerpo monoclonal anti Flag sugirió que se logró una inducción eficaz de HGF/NK1 creciendo la cepa transformada en un medio con poco fosfato (fig. 10A y 10B). El nivel de expresión de HGF/NK1 se estimó entre 100-500 mg/l. Usando el protocolo resumido en la fig. 9, se purificaron aproximadamente 500 mg de HGF/NK1 a partir de de la fracción soluble sometida a choque osmótico de 100 g de sedimento celular. La HGF/NK1 purificada a partir del paso de cromatografía de intercambio catiónico FPLC Mono S tiene un peso molecular aparente de 22 kDa según se determinó en una electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (SDS- PAGE) y se estimó que al menos pura en un 95% (fig. 10C). HGF/NK1 migra como un monómero según indica la electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) en condiciones no reductoras (fig. 10B). La proteína purificada también fue inmunorreactiva con un anticuerpo monoclonal contra la secuencia Flag que confirma su identidad como HGF/NK1 (fig. 10D).
Caracterización bioquímica de la HGF/NK1 purificada - El punto isoeléctrico (pI) de HGF/NK1 oscila entre 8,2 y 8,6 como se estima a partir del gel IEF (datos no presentados). La proteína aislada tiene la composición aminoacídica prevista y la secuencia aminoacídica en el extremo N terminal de la HGF/NK1 correctamente procesada (fig. 8). La masa molecular se estimó en 21.872 Da por espectrometría de masas con electronebulización. Esta cifra es idéntica a la masa molecular calculada del fragmento de 32-210 de HGF humano unido al aminoácido 10 epítopo Flag.
Capacidad de unión al receptor de of HGF/NK1 - Analizamos la preparación de HGF/NK1 para un estudio de unión competitiva a una forma soluble del receptor de HGF así como para estudiar la unión a los receptores de HGF de la superficie celular de células A549. Las curvas de inhibición a partir de experimentos representativos se muestran en la fig. 11A y 11B e indican que HGF/NK1 es capaz de competir por la unión al receptor de HGF con el HGF silvestre marcado radiactivamente, aunque con afinidad reducida (de 8 a 11 veces en comparación con el HGF silvestre). Como se esperaba, un dominio kringle 4 purificado a partir de plasminógeno humano no compitió por la unión al receptor de HGF soluble o al asociado a la célula. Las constantes de disociación (Kd) estimadas a partir de estas curvas en al menos tres ensayos independientes indican que en solución, HGF/NK1 se une con un Kd de 1,10 +/- 0,04 nM frente a 0,10 +/- 0,02 nM del HGF silvestre. De modo similar, en células A549, HGF/NK1 se une con un Kd de 1,6 +/- 0,08 nM frente a 0,21 +/- 0,04 nM del HGF silvestre. Estos datos demuestran que la región NK1 de HGF es suficiente para mediar la unión al receptor de HGF.
Autofosforilación inducida por ligando del receptor de HGF - El receptor de HGF sufre autofosforilación en la subunidad \beta de 145 kDa tras la unión del ligando. En células A549, la respuesta máxima se observó a una concentración de 1-4 nM (fig. 12). A estas concentraciones de HGF/NK1 la autofosforilación del receptor de HGF no fue detectable. Sin embargo, a concentraciones mayores (20 y 100 nM; fig. 12) se detecta algo de autofosforilación.
Propiedades biológicas de HGF/NK1 - Mientras que HGF estimula la incorporación de timidina-H^{3} en un cultivo primario de hepatocitos con un efecto semimáximo (IB_{50}) a 0,64 nM, HGF/NK1 en condiciones idénticas no causa un aumento de la síntesis de ADN a concentraciones del orden de 110 nM (fig. 13A). Posteriormente analizamos HGF/NK1 para estudiar la actividad antagonista usando cultivos primarios de hepatocitos (fig. 13B). HGF/NK1 antagoniza completamente la actividad mitogénica inducida por HGF con un IB_{50} de 6 nM, correspondiente a un exceso 10 veces molar de HGF/NK1 sobre HGF para neutralizar el 50% de la síntesis de ADN en hepatocitos. Como control, mostramos que el dominio kringle 4 purificado a partir de plasminógeno humano no antagonizó la mitogénesis inducida por HGF. Además, el efecto de HGF/NK1 fue específico ya que no neutralizó la mitogénesis inducida por HGF (datos no presentados). De este modo, HGF/NK1 es un potente y específico antagonista de la actividad de HGF.
Ejemplo 8 Construcción y expresión de quimeras HGF-IgG
El sitio único KpnI en la secuencia codificadora del huHGF silvestre se enlazó al sitio único BstEII del ADNc de la cadena pesada de una IgG-\gamma1 humana a través de un enlazador de cadena doble sintético 5'-CACAGTCG-3' (Identificador de secuencia Nº: 21) y 5'-GTGACCGACTGTGGTAC-3' (Identificador de secuencia Nº: 22)]. La construcción resultante contenía las secuencias codificadoras de los 728 aminoácidos de HGF fusionados por dos aminoácidos (V y T) a los aminoácidos 216-443 de la cadena pesada de la IgG-\gamma1.
Las secuencias codificadoras de las variantes de HGF R494E, y Y673S,V692S (preparadas como se describe en el ejemplo 1) se fusionaron de modo idéntico a la IgG-\gamma1.
Para construir NK2 HGF-IgG (para abreviar también denominada NK2-IgG), se uso un enlazador sintético de cadena doble 5'-ACTGTGCAATTAAAACATGCGAGACG-3' (Identificador de secuencia Nº: 23) 5'-GTGACCGTCTCG
CATGTTTTAATTGCACAGT-3' (Identificador de secuencia Nº: 24) para unir el sitio único ScaI de IGF al sitio
BstEII del ADNc de la cadena pesada de la construcción IgG-\gamma1 descritas anteriormente. Esto reconstituye la secuencia codificadora de la variante HGF/NK2 natural descrita por Miyazawa y col., citado con anterioridad.
NK1 HGF-IgG (también denominada NK1-IgG), se construyó por mutagénesis por deleción tipo "fuera de bucle" usando un molde HGF-NK2 de cadena sencilla. El oligonucleótido mutagénico usado fue 5'-GTCGGTGACCGTCTC
TTCAACTTCTGAACA-3' (Identificador de secuencia Nº: 25). El ADNc resultante contenía las secuencias codificadoras de los aminoácidos 1-210 de HGF unidos a las que codifican los aminoácidos 216-443 de la IgG-\gamma1 a través de secuencias enlazadoras que codifican los aminoácidos E, T, V y T.
La expresión en células 293 se realizó como se describe con anterioridad.
Las células 293 control y las que expresaban las quimeras HGF-IgG se analizaron por electroforesis en un gel SDS PAGE del 8% en condiciones reductoras (figura 5A) y no reductoras (figura 5B). La calle M (Mock -simulado-) demuestra que no se detectó expresión en las células control. Las otras calles representan las siguientes quimeras:
Calle 1: N-303-IgG
Calle 2: HGF-IgG
Calle 3: Y673S,V692S HGF-IgG
Calle 4: R494E HGF-IgG.
Los resultados de la electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE) indican claramente que las quimeras se expresaron como dímeros.
Las estructuras propuestas para algunas de estas quimeras de HGF variante-inmunoglobulina se muestran en la figura 5C.
Ejemplo 9 Unión de las quimeras HGF-IgG a un HGFr endógeno en células A549
Se estudió la capacidad de unión del HGF humano recombinante silvestre (rhuHGF wt) o de las quimeras variante de HGF-IgG de competir por la unión de un rhuHGF marcado con I^{125} en células A549 esencialmente como se describe en Naldini, L. y col., EMBO J. 10, 2867-2878 (1991) con pequeñas modificaciones. Se cultivaron células A549, inoculadas en placas de 24 pocillos a una densidad de 104 células/pocillo, durante la noche en DMEM y después se transfirieron a medios sin suero durante 2 horas. La unión se realizó en ligera agitación a 4 ºC durante 3 horas en medio Hanks con HEPES 20 mM, 0,2% de BSA y 0,02% de NaN_{3} pH 7,0. Cada pocillo recibió 50 pM de rhuHGF-I^{125} o variante HGF y las concentraciones indicadas de competidor. Las extracciones y lavados se realizaron como se describe en Naldini y col., citado con anterioridad.
Los resultados que aparecen en las figuras 6ª y 6B demuestran que las quimeras HGF-IgG probadas se unen a HGFr endógeno en células A549 de modo similar al HGF humano silvestre (rhuHGF wt).
Ejemplo 10 Efecto mitogénico en cultivos primarios de hepatocitos de rata
Se cuantificaron las moléculas de HGF variantes y las quimeras HGF variante-IgG en un ensayo de ELISA bilateral tipo sándwich de huHGF coom se describe en el ejemplo ``a. Se analizaron los medios condicionados de las células 293 que expresaban rhuHGF wt, las variantes HGF indicadas, y las quimeras HGF variante-IgG para estudiar los efectos mitogénicos en cultivos primarios de hepatocitos de rata en ensayos de incorporación de timidina H^{3} como se describe en el ejemplo 2C. Los resultados se muestran en las figuras 7ª, 7B y 7C.
Como se demostró en la figura 7ª, los medios condicionados de células trasformadas con un plásmido que codifica un huHGF silvestre estimuló la incorporación de H^{3} en cultivos primarios de hepatocitos de rata. Como se muestra con anterioridad, la variante de HGF de cadena sencilla R494E HGF y la variante de dominio proteasa Y673S,V692S HGF carecían de actividad mitogénica (figura 7B). Sin embargo, curiosamente, la actividad mitogénica de estas variantes se recuperó completamente cuando se expresaron como una proteína de fusión con IgG. Similarmente, los medios condicionados de las células que expresaban la variante NK2-IgG (figuras 7A y 7C), la variante NK1-IgG (figura 7C), pero no NK2 o NK1 solas (véase ejemplo 7 para HGF/NK1), también presentaron una actividad mitogénica sustancial. Los experimentos además muestran que no todas las proteínas de fusión con IgG actúan como mitógenos hepáticos debido a que el control CD4-IgG no indujo proliferación hepática. Se cree que estos datos indican que la fusión de la región de la cadena pesada de la IgG a las variantes de HGF restaura la actividad mitogénica haciendo que estas variantes se expresen como dímeros.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
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(i)
SOLICITANTE: Genentech, Inc., Paul J. Godowski
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(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Activación de receptores
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(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 31
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(iv)
DIRECCIÓN DE CONTACTO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DIRECCIÓN: Genentech, Inc.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 460 Point San Bruno Blvd
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: San Francisco Sur
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: California
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CP: 94080
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMULARIO LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disquete de 5,25 pulgadas y 360 Kb
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: patin (Genentech)
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE SOLICITUD ACTUALES:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE DEPÓSITO:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE SOLICITUD ANTERIORES:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: 07/884811
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE DEPÓSITO: 18/05/1992
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE SOLICITUD ANTERIORES:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: 07/885971
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE DEPÓSITO: 18/05/1992
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE SOLICITUD ANTERIORES:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: 07/950572
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE DEPÓSITO: 21/09/1992
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Dreger, Ginger R.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 33.055
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 773P1
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: 415/225-3216
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TELEFAX: 415/952-9881
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TELEX: 910/371-7168
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia Nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 47 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTGGAATCCC ATTTACAACC TCGAGTTGTT TCGTTTTGGC ACAAGAT 
\hfill
47 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia Nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAATCCCATT TACGACGTCC AATTGTTTCG 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia Nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCCATTTACA ACTGCCAATT GTTTCG 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia Nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGAAGGGAAA CAGTGTCGTG CA 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia Nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGTGGGCCAC CCAGAATCCCC CT 
\hfill
22 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia Nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCCACGACCA GGAGAAATGA CAC 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia Nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCATTCAAACT TCTGAGTTTC TAATGTAGTC 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia Nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CATAGTATTG TCAGCTTCAA CTTCTGAACA 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia Nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCCATGTGAC ATATCTTCAG TTGTTTCCAA 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia Nº 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGTGGTATCA CCTTCATCTT GTCCATGTGA 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia Nº 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACCTTGGATG CATTAAGTTG TTTC 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia Nº 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTGTCCATGT GATTAATCAC AGT 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia Nº 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 35 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTTCGTGTTG GGATCCCATT TACCTATCGC AATTG 
\hfill
35 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia Nº 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 16 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGCTTGCCTC GAGGCA 
\hfill
16 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia Nº 15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 51 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATGAAGGCCC CCGCTGTGCT TGCACCTGGC ATCCTCGTGC TCCTGTTTAC 
\hfill
50 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia Nº 16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 60 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CACTAGTTAG GATGGGGGAC ATGTCTGTCA GAGGATACTG CACTTGTCGG 
\hfill
50 
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CATGAACCGT 
\hfill
60 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia Nº 17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TAGTACTAGC ACTATGATGT CT 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia Nº 18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTTACTTCTT GACGGTCCAA AG 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia Nº 19:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAGGGGGAGT TGCAGATTCA GCTGT 
\hfill
25 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia Nº 20:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 45 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGTTTTGTCG GTGACCTGAT CATTCTGATC TGGTTGAACT ATTAC 
\hfill
45 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia Nº 21:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 8 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CACAGTCG 
\hfill
8 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia Nº 22:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTGACCGACT GTGGTAC 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia Nº 23:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACTGTGCAAT TAAAACATGC GAGACG 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia Nº 24:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTGACCGTCT CGCATGTTTT AATTGCACAG T 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia Nº 25:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTCGGTGACC GTCTCTTCAA CTTCTGAACA 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia Nº 26:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia Nº 27:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 69 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATCAAAAAGA ATATCGCATT TCTTCTTGCA TCTATGTTCG TTTTTTCTAT 
\hfill
50 
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TGCTACAAAT GCCTATGCA 
\hfill
69 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia Nº 28:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 42 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCAGACTACA AGGACGACGA TGACAAGCTT CAAAGGAAAA GA 
\hfill
42 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia Nº 29:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCAGAAGTTG AATAGAGGTT C 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia Nº 30:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 59 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCCGGGATGC ATCAGACTAC AAGGACGACG ATGACAAGCT TCAAAGGAAA 
\hfill
50 
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGAAGAAAT 
\hfill
59 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA Identificador de secuencia Nº 31:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: Identificador de secuencia Nº 31:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCCGGGAGGC CTCTATTCAA CTTCTGAACA CTG 
\hfill
33

Claims (17)

1. Un conjugado para su uso en un procedimiento para el tratamiento terapéutico de un paciente, comprendiendo el conjugado un primer ligando unido mediante un enlazador heterólogo a un segundo ligando, en el que el enlazador heterólogo es diferente de cualquier enlazador que conecte los ligandos en su entorno nativo; el ligando no es un anticuerpo contra el receptor del factor de crecimiento hepatocítico ni un conjugado no covalente de un anticuerpo y un antígeno para dicho anticuerpo; el primer y segundo ligando son capaces de unirse a la primera y a la segunda molécula de receptor del factor de crecimiento hepatocítico, respectivamente, en el que la primera y la segunda molécula receptora son capaces de oligomerizar la una con la otra; y en la que el conjugado es capaz de activar un receptor del factor de crecimiento hepatocítico.
2. Un conjugado según la reivindicación 1, en el que al menos uno de los ligandos carece sustancialmente de actividad biológica en la forma monomérica.
3. Un conjugado según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicho enlazador comprende la secuencia del dominio variable o del dominio constante de un inmunoglobulina.
4. Un conjugado según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicho enlazador comprende un puente disulfuro entre dichos primer y segundo ligando.
5. Un conjugado según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicho enlazador es un espaciador polipeptídico.
6. Un conjugado según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dichos primer y segundo ligando son derivados o variantes del factor de crecimiento hepatocítico.
7. Un conjugado según la reivindicación 3, en el que dicho conjugado se selecciona del grupo formado por:
(a)
AC_{L}-AC_{L};
(b)
AC_{H}-[AC_{H}, AC_{L}-AC_{H}, AC_{L}-V_{H}C_{H}, o V_{L}C_{L}-AC_{H}];
(c)
AC_{L}-AC_{H}-[AC_{L}-AC_{H}, AC_{L}-V_{H}C_{H}, V_{L}C_{L}-AC_{H}, o V_{L}C_{L}-V_{H}C_{H}];
(d)
AC_{L}-V_{H}C_{H}-[AC_{H}, o AC_{L}-V_{H}C_{H}];
(e)
V_{L}C_{L}-AC_{H}-[AC_{L}-V_{H}C_{H}, o V_{L}C_{L}-AC_{H}]; y
(f)
[A-Y]n-[V_{L}C_{L}-V_{H}C_{H}]_{2},
en donde
cada A representa secuencias aminoacídicas del ligando idénticas o diferentes;
V_{L} es un dominio variable de la cadena ligera de una inmunoglobulina
V_{H} es un dominio variable de la cadena pesada de una inmunoglobulina
C_{L} es un dominio constante de la cadena ligera de una inmunoglobulina
C_{H} es un dominio constante de la cadena pesada de una inmunoglobulina
n es un número entero mayor que 1;
Y designa el residuo de un agente reticulante covalente.
8. Una composición farmacéutica que comprende un conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
9. Una molécula quimérica que comprende una fusión de un primer ligando capaz de unirse a una primera molécula de un receptor del factor de crecimiento hepatocítico con una primera secuencia de un dominio constante de una inmunoglobulina, y una fusión de un segundo ligando capaz de unirse a una segunda molécula de dicho receptor con una segunda secuencia de un dominio constante de una inmunoglobulina, uniéndose los dos ligandos a través de sus secuencias de inmunoglobulina, en el que el ligando no es un anticuerpo contra el receptor del factor de crecimiento hepatocítico ni un conjugado no covalente de un anticuerpo y un antígeno para dicho anticuerpo; y en el que el primer y segundo ligando son moléculas capaces de de oligomerizar la una con la otra.
10. La molécula quimérica de la reivindicación 9, en la que al menos uno de dichos primer y segundo ligando carecen sustancialmente de actividad biológica en la forma monomérica.
11. La molécula quimérica de la reivindicación 9 o de la reivindicación 10 seleccionada del grupo formado por HGF-IgG; NK2-IgG; NK1-IgG; \DeltaK2-IgG; Y673S, V692S HGF-IgG; y R494E HGF-IgG.
12. Una molécula quimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11 para su uso en un procedimiento para el tratamiento terapéutico de un paciente.
13. Una composición farmacéutica que comprende una molécula quimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
14. Un procedimiento para hacer un agonista de un ligando nativo de los receptores del factor de crecimiento hepatocítico que comprende la dimerización de una primera variante o el enlace de dicha primera variante con una segunda variante de ligando; en el que las variantes de ligando dimerizadas son capaces de unirse a la primera y segunda molécula de receptor del factor de crecimiento hepatocítico, respectivamente; la primer y segunda molécula de receptor son capaces de oligomerizar la una con la otra; conectándose dichas variantes de ligando con un enlazador heterólogo, en el que el enlazador heterólogo es diferente de cualquier enlazador que conecte los ligandos en su entorno nativo; y en el que el ligando no es un anticuerpo contra el receptor del factor de crecimiento hepatocítico ni un conjugado no covalente de un anticuerpo y un antígeno para dicho anticuerpo.
15. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que al menos una de dichas primera y segunda variantes de ligando carecen sustancialmente de actividad biológica en la forma monomérica.
16. El procedimiento de la reivindicación 14 o de la reivindicación 15, en el que dicho ligando es una variante de hHGF.
17. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en el que el enlazador heterólogo comprende una secuencia de inmunoglobulina.
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