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DE3834079A1 - Wachstumstimulierendes pdgf-bb und dessen verwendung sowie ein verfahren zu seiner herstellung und der des monomeren - Google Patents

Wachstumstimulierendes pdgf-bb und dessen verwendung sowie ein verfahren zu seiner herstellung und der des monomeren

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Publication number
DE3834079A1
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Authority
DE
Germany
Prior art keywords
amino acid
pdgf
fusion protein
growth
pex
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE3834079A
Other languages
English (en)
Inventor
Juergen Prof Dr Hoppe
Wolfram Eichner
Herbert Weich
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
GESELLSCHAFT fur BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF) 3300 BRAUNSCHWEIG DE
Original Assignee
GESELLSCHAFT fur BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF) 3300 BRAUNSCHWEIG DE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by GESELLSCHAFT fur BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF) 3300 BRAUNSCHWEIG DE filed Critical GESELLSCHAFT fur BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF) 3300 BRAUNSCHWEIG DE
Priority to DE3834079A priority Critical patent/DE3834079A1/de
Priority to CA002000309A priority patent/CA2000309A1/en
Priority to EP19890912539 priority patent/EP0437544A4/en
Priority to AU45086/89A priority patent/AU4508689A/en
Priority to ZA897633A priority patent/ZA897633B/xx
Priority to PCT/US1989/004460 priority patent/WO1990004035A1/en
Publication of DE3834079A1 publication Critical patent/DE3834079A1/de
Priority to US07/675,885 priority patent/US5334532A/en
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/49—Platelet-derived growth factor [PDGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones

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Description

Einleitung
PDGF (Platelet Derived Growth Factor), ein Hauptmitogen im Serum, stimuliert das Wachstum von Fibroblasten und glatten Muskelzellen in vitro (Heldin & Westermark 1984; Deuel et al. 1985; Ross et al. 1986). In vivo wird PDGF in den alpha-Granula der Thrombozyten gespeichert, aus denen es nach Thrombozytenstimulation freigesetzt wird. Gereinigtes PDGF zeigt eine beträchtliche Heterogenität im Molekulargewicht (M r 27 000 bis 31 000), die auf unterschiedliche Glykosylierung, Prozessierung und vornehmlich auf die Existenz zweier Spezies (A- und B-Typ) zurückzuführen ist. Hauptsächlich liegt PDGF aus Thrombozyten als Heterodimer (A-B) vor. Es konnte aber gezeigt werden, daß alle Kombinationen, d. h. Homodimere des Typs A-A und B-B biologisch aktiv sind (Heldin et al. 1986; Betsholtz et al. 1986; Stroobant & Waterfield 1984; Kelly et al. 1985). In allen Fällen sind nur die dimeren Formen mitogen aktiv, die durch Disulfidbrücken miteinander verknüpft sind.
Erfindung
Gemäß einer Ausführungsform betrifft die Erfindung biologisch aktives (wachstumsstimulierendes) PDGF-BB, das durch die folgende Aminosäuresequenz seiner Monomeren gekennzeichnet ist:
wobei bei beiden Monomeren unabhängig voneinander eine beliebige Aminosäure fehlen kann, eine beliebige Aminosäure durch eine beliebige andere Aminosäure ersetzt sein kann und/oder an einer beliebigen Stelle eine weitere beliebige Aminosäure vorgesehen sein kann. Insbesondere können die C-Termini beider Monomeren unabhängig voneinander um bis zu 14 Aminosäuren deletiert oder ergänzt sein.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von PDGF-B der vorstehenden Aminosäuresequenz (Monomeres) und gegebenenfalls zur Herstellung von biologisch aktivem (wachstumstimulierendem) PDGF-BB (als Dimerem) vorgesehen, bei dem man
  • I) mit Hilfe von E. coli, umfassend einen Hybridvektor, der aus pEX und Fremd-DNA gebildet ist, die folgendes Fusionsprotein kodiert:
    • a) ein Fusionsprotein aus β-Galaktosidase und PDGF-B der Aminosäuresequenz I oder
    • b) ein Fusionsprotein gemäß (a), dem eine beliebige Aminosäure fehlt, bei dem eine beliebige Aminosäure durch eine beliebige andere Aminosäure ersetzt ist oder bei dem an einer beliebigen Stelle eine weitere beliebige Aminosäure vorgesehen ist, und/oder
    • c) ein Fusionsprotein, bei dem die C-Termini unabhängig voneinander um bis zu 14 Aminosäuren deletiert oder ergänzt sind,
    • ein Fusionsprotein gemäß (a), (b) oder (c) exprimiert,
  • II) das gebildete Fusionsprotein (gegebenenfalls nach Reduktion) chemisch spaltet und ein Monomeres freisetzt
  • III) die Thiolgruppen durch Sulfonieren schützt,
  • IV) das geschützte Monomere durch Gelpermeations-Chromatographie und/oder Umkehrphase-Chromatographie reinigt,
  • V) die Sulfogruppen des gereinigten und geschützten Monomeren reduziert und gegebenenfalls ferner
  • VI) das entschützte Monomere durch Ausbildung von Disulfidbrücken dimerisiert und danach
  • VII) das gebildete Dimere durch Umkehrphasen-Chromatographie und/oder Ionenaustauscher-Chromatographie reinigt.
Für die Stufe (I) kann man E. coli mit einem Hybridvektor einsetzen, der unter Verwendung von pEX gebildet ist, wie pEX 1, pEX 2 oder pEX 3; verglichen Stanley & Luzio 1984. Durch die pEX-Plasmide wird die Expression von cro-β-gal-x-Fusionsproteinen stark gefördert. Sie macht etwa 30% des gesamten Zellproteins aus. Um die Ausbeute an PDGF-B zu erhöhen, werden vorzugsweise große Teile der Expression entfernt, ohne daß dadurch die Höhe der Expression beeinträchtigt wird. PDGF-B exprimierende Klone lassen sich leicht durch die Molekulargewichts-Zunahme von etwa 15 kd im Fusionsprotein identifizieren.
Bei der Stufe (II) wird vorzugsweise mit Bromcyanid gespalten. Etwa gebildete Einschlußkörper werden vor der Spaltung solubilisiert, beispielsweise durch Reduktion (bei der etwa vorliegende -S-S-Brücken gespalten werden).
Bei der Stufe (III) kann man in Gegenwart von Sulfit und Dithimonat sulfonieren.
Bei der Stufe (IV) kann man die Gelpermeations-Chromatographie in Gegenwart eines denaturierenden Agens durchführen, beispielsweise Guanidin-Hydrochlorid, beispielsweise einer Molarität im Bereich von 1 bis 6 M.
Vorzugsweise führt man die Stufen (V) und (VI) gemeinsam durch, beispielsweise in Gegenwart
  • a) von Harnstoff (beispielsweise einer Molarität von bis zu 4 M) und
  • b) Thiolreagenzien, wie
    • - 2-Mercaptoethanol (beispielsweise einer Konzentration von bis zu 2%),
    • - Glutathion (beispielsweise einer Molarität von bis zu 100 mM) sowie
    • - Dithiothreitol und Dithioerythiol (beispielsweise einer Molarität von bis zu 100 mM).
Das erfindungsgemäß erhaltene biologisch aktive (wachstumstimulierende) PDGF-BB läßt sich zur Wachstumsstimulierung verwenden, beispielsweise als Bestandteil therapeutischer Zusammensetzungen.
Nachstehend wird die Erfindung an einem Beispiel mit 4 Abbildungen näher erläutert.
Abb. 1: Strategie für die Konstruktion des Plasmids pE-PF 14.
Das aus dem Plasmid pMWV-2 erhaltene 2 kb lange BamHI-Fragment wurde in umgekehrter Orientierung in den Phagen M13mp18 integriert (offene Kästen: c-cis-mRNA-Sequenzen); schraffierte Kästen: Regionen für matures PDGF-B). Der lange 3′-Bereich, der das ursprüngliche Stop-Kodon TAG einschließt, wurde durch SmaI-Verdau entfernt. Ein Stop-Linker wurde in diese Region eingeführt. 5′-Regionen wurden durch Exonuclease-III-Verdau entfernt. Nach einer Passage durch den Vektor pJLA504 wurden PDGF-B kodierende Sequenzen im Leseraster in die SalI/EcoRV-Stellen des Vektors pEX 1 integriert. P R = Bakteriophagen-Promoter; cro′-lacZ = Cro-β-Galactosidase-Fusionsprotein; tfd = Phagen-Transkriptions-Terminator.
Abb. 2: Aminosäuresequenzen von PDGF-B und rPDGF-B.
Zu beachten ist, daß die ersten 12 Aminosäuren durch Spaltung mittels CNBr in rPDGF-B entfernt sind. Weiterhin enthält rPDGF-B zusätzlich 5 Aminosäuren am C-Terminus. Drei dieser Aminosäuren unterscheiden sich von PDGF-BB-Sequenzen und stammen aus dem Stop-Linker an der SmaI-Schnittstelle (s. Abb. 1).
A = Alanin, D = Asparaginsäure, E = Glutaminsäure, F = Phenylalanin, G = Glycin, H = Histidin, I = Isoleucin, K = Lysin, L = Leucin, M = Methionin, N = Asparagin, P = Prolin, O = Glutamin, R = Arginin, S = Serin, T = Threonin, V = Valin, W = Tryptophan, Y = Tyrosin.
Abb. 3: SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
A) Lysate aus E. coli-Zellen
B) monomeres S-sulfoniertes rPDGF-B
C) rPDGF-BB nach Denaturierung
D) gereinigtes rPDGF-B (Dimer)
S) Standard
Abb. 4: Stimulation des ³H-Thymidineinbaus in ruhende AKR-2B-Fibroblasten durch rPDGF-BB.
Materialien
E. coli JM103
Pharmacia
E. coli NF1 vgl. EMBO J., 3 (1984) 1429-1434
pEX 1 (Plasmid): Genofit Heidelberg; vgl. auch EMBO J., 3 (1984) 1429-1434
M13mp18 (Vektor): Pharmacia; vgl. auch FEBS Letters, 198 (1986) 344-348, 345
pJLA504 (Plasmid): vgl. Gene, 52 (1987) 279-283, 280
pMVW-2 (Plasmid): vgl. FEBS Letters, 198 (1986) 344-348, 346
Guanidinhydrochlorid und Tris waren von Sigma, Ameisensäure, 2-Propanol, Acetonitril, Trifluoressigsäure von Merck. Sephacryl S-200 von Pharmacia, die Chromatographiesäule Si-300-Polyolbutyl und Ampicillin von Serva, Medium und Supplemente von Gibco und Radiochemikalien von Amersham.
Biologische Systeme
Wachstumsstimulierende Aktivität wurde nach Shipley et al. (1984) bestimmt.
Analytische Methoden
Gelelektrophorese wurde wie beschrieben durchgeführt (Hoppe et al. 1986) (13,5-proz. Gele). Aminosäureanalysen wurden durch den Analysator LC2000 von Biotronic bestimmt. Aminoterminale Sequenzanalysen wurden mittels des Festphasensequenators L12 (Sequemat) durchgeführt. Dazu wurde das Protein über seine Aminogruppe an mit Diisothiocyanat aktiviertes Glas gebunden (Hoppe et al. 1986). Alternativ wurden Sequenzen durch den Gasphasen-Analysator 470A (Applied Biosystems) bestimmt. Der Proteingehalt wurde nach den Methoden von Bradford (1976) oder Redinbaugh & Turley (1986) ermittelt.
Konstruktion eines Expressionsvektors
Als Wirt wurde der Stamm NF1 verwandt (K12 delta-H1 delta trp lac Z- am), der den defekten lambda-Prophagen (Nam 7 Nam 53 cI 857 delta-H1) integriert hat (Stanley & Luzio 1984). Als Ausgangsmaterial diente das BamHI-DNA Fragment (2 kb) aus dem Klon pMVW-2 (Weich et al 1986), das die für PDGF-B kodierenden DNA-Sequenzen trägt. Dieses Fragment wurde in umgekehrter Richtung in die BamHI-Schnittstelle des Vektors M13mp18 subkloniert. Durch Verdau mit SmaI (Fig. 1 Zeile b) wurden 3′-Bereiche, die nicht translatiert werden, sowie Bereiche, die für Cterminale Prosequenzen kodieren, entfernt. Danach wurde in diese SmaI-Schnittstelle ein Translationsstop-Linker (PL Biochemicals) integriert (Fig. 1 Zeile C). 5′-Bereiche, die für NH₂-terminale Sequenzen kodieren, wurden nach der Methode von Henikoff (1984) eliminiert. Dazu wurde das Plasmid mit PstI und SalI verdaut (Fig. 1 Zeile e) und der Exonuclease-III-Behandlung unterworfen (Fig. 1 Zelle f). Der verbleibende Zweitstrang wurde mit S₁-Nuklease entfernt (Fig. 1 Zeile f). Durch DNA-Polymerase-I-Klenow-Fragment-Behandlung wurden glatte Enden erzeugt, danach wurde das Plasmid durch Ligasebehandlung recyclisiert. Nach Transformation in den Stamm JM103 wurden Kolonien erhalten. Das Ausmaß der Verkürzung durch Exonuclease-III wurde durch Miniplasmidpräparationen und Sequenzierung der Plasmid-DNA dieser Kolonien bestimmt. Es wurde ein Plasmid erhalten, das ein ATP-Start-Kodon aus der SphI-Schnittstelle aus der "multi cloning site" des M13mp18-Vektors im Leseraster mit der PDGF-B-Sequenz enthielt. Dadurch entstand eine leichte Veränderung des NH₂-Terminus (met-pro-leu-gly anstelle von ser-leu-gly). Die PDGF-B kodierenden Sequenzen wurden durch partiellen SphI/EcoRI-Verdau herausgeschnitten und in das Plasmid pJLA504 (Schauder et al. 1987) integriert (SphI/EcorRI), um ein SalI am 3′-Ende zu erzeugen. Dieses Plasmid wurde wiederum partiell mit SphI verdaut (Fig. 1 Zeile h). Vorstehende 3′-Enden wurden durch T4-Polymerase-Behandlung entfernt (Fig. 1 Zeile i). Ein 390 bp langes Fragment, das die PDGF-B-Sequenzen enthielt, wurde nach SalI-Verdau (Fig. 1 Zeile j) isoliert und in die SalI/EcoRV-Stellen des pEx 1-Vektors integriert (Fig. 1 Mitte unten).
Durch den SalI/EcoRV-Verdau des Plasmids pEX 1 wurden 1097 Nukleotide entfernt, die für etwa 2/3 der β-Galaktosidase kodieren. Diese Deletion änderte die hohe Expression des cro-b-gal-Fusionsproteins nicht.
Zur Identifizierung solcher Klone, die PDGF-B-Sequenzen hochexprimieren, wurden Kolonien, die nach Transformation in den Stamm NF1 erhalten wurden, in LB-Medium bei 30°C bis zu einer optischen Dichte von 0,3 (440 nm) angezogen und danach für 3 Stunden bei 42°C weiterkultiviert, um die Produktion der cro-β-gal-Fusionsproteine zu induzieren. Zellen wurden durch Ultraschallbehandlung lysiert und durch Natriumdodecylsulfat (SDS) und 2-Mercaptoethanol aufgelöst. Nach Polyacrylamidgel-Elektrophorese in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat trat in zahlreichen Präparationen eine intensive Bande mit einem Molekulargewicht von 65 000 d auf, indikativ für die Expression von PDGF-Sequenzen. Das isolierte Plasmid wurde pE-pF14 genannt.
Anzucht von Zellen und Präparation von Einschlußkörpern
E.-coli-Zellen wurden in LB-Medium mit 50 bis 100 µm/ml Ampicillin in 1-l-Kulturen bei 30°C bis zu einer optischen Dichte von 0,2 (440 nm) angezogen und dann bei 42°C weitere 3 Stunden geschüttelt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (5000 × g, 10 min) geerntet und in 10 ml Tris-HCl (20 mM) und EDTA (0,5 mM) vom pH 7,8 suspendiert. Für eine typische Präparation wurden 20 bis 30 l Kultur angezogen. Die Zellen wurden durch zwei Passagen durch eine Ribi-Press (Sorvall) bei 20 000 psi aufgeschlossen. Das aus Teilen des cro-Repressors und der β-Galaktosidase sowie PDGF-B (rekombinanter, monomerer Wachstumsfaktor aus Thrombozyten vom Typ B) bestehende Fusionsprotein bildete Einschlußkörper, die man nach Zugabe von 2-proz. Triton X100 (Endkonzentration) durch Zentrifugation (6000 × g, 10 min) erhielt.
Reduktion und CNBr-Spaltung
Einschlußkörper aus 20 bis 30 l Kultur wurden in 100 ml Tris-HCl (50 mM; pH 7,8) mit 2% SDS (Natriumdodecylsulfat) und 2% 2-Mercaptoethanol gelöst (ca. 1 h, 37°C). Geringe Mengen unlöslichen Materials wurden durch Zentrifugation bei 20 000 × g in 30 min entfernt. Zum Überstand wurden 2 Volumina Aceton bei 0°C gegeben. Nach 15 min bei 0°C wurde ein voluminöses Präzipitat abzentrifugiert (6000 × g, 10 min), das in 80 ml Ameisensäure (100%) gelöst wurde. Danach wurden 20 ml H₂O hinzugefügt und unlösliches Material bei 50 000 × g in 1 h entfernt. Zum Überstand wurden 1 g CNBr und 200 µl 2 Mercaptoethanol hinzugefügt. Die Reaktion wurde über Nacht bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Lösung wurde am Rotationsverdampfer eingetrocknet. Der Rückstand wurde in 80 ml 6 M Guanidinhydrochlorid aufgenommen, der pH durch Zugabe von 30% NaOH auf 7,5 eingestellt.
Es sei darauf hingewiesen, daß PDGF-B nur einen Methioninrest an Position 12 im NH₂-terminalen Teil der maturen Sequenz aufweist. Die Spaltung des cro-β-gal-PDGF-B-Fusionsproteins nach Methioninen durch CNBr ergab daher Fragmente, die um 12 Aminosäuren verkürzt waren. Ferner ergab die Einführung des Stopsignals Änderungen des Proteins am C-Terminus (Abb. 2).
S-Sulfonierung
Zu der erhaltenen Lösung wurden 1 g Na₂SO₃ und 0,25 g Na₂S₂O₆ hinzugefügt. Die Mischung wurde 5 h lang bei Raumtemperatur belassen. Unlösliches Material wurde durch Zentrifugation entfernt (50 000 × g, 1 h).
Reinigung von S-sulfoniertem monomeren rPDGF-B
Die oben erhaltene Lösung wurde zur Gelfiltration auf eine Säule (Dimension 5 cm ⌀ × 100 cm) aufgetragen, die mit Sephacryl S200 gefüllt war. Als Elutionsmittel diente 4 M Guanidinhydrochlorid mit 50 mM Tris-HCl vom pH 7,4. Die Flußrate war 160 ml/h. Es wurden Fraktionen von 15 ml gesammelt. Aliquots der Fraktionen wurden mittels SDS-Gelelektrophorese analysiert, und solche Fraktionen, die Proteine mit einem Molekulargewicht von ca. 14 kd aufweisen, wurden vereinigt und über Nacht gegen 5 l H₂O dialysiert. Während der Dialyse bildete sich ein Präzipitat, das durch Zugabe von Ameisensäure zu einer Endkonzentration von 10% weitgehend gelöst werden konnte. Unlösliches Material wurde durch Zentrifugation entfernt (20 000 × g, 20 min). Der Überstand (ca. 150 ml) wurde auf eine HPLC-Säule (2 cm ⌀ × 25 cm; Umkehrphase: Si-300-Polyolbutyl, 5 µm, Serva) bei einer Flußrate von 2,5 ml/min aufgetragen. Nach Auftrag der Probe wurde mit ca. 2 Säulenvolumina gewaschen. rPDGF-B-Monomer wurde durch einen linearen Gradienten von 10% Ameisensäure/H₂O gegen 10% Ameisensäure, 60% 2-Propanol und 30% H₂O während 180 min bei einer Flußrate von 2,5 ml/min eluiert. rPDGF-B eluierte früh nach 40 bis 60 min. Entsprechende Fraktionen wurden vereinigt und gegen 5 l H₂O dialysiert.
Nach den genannten Reinigungen durch Gelfiltration und HPLC an umgekehrter Phase erhielt man ca. 2 mg rPDGF-Monomer/l Kultur, das hinsichtlich SDS-Gelelektrophorese, Aminosäure-Analyse und NH₂-terminaler Sequenzanalyse einheitlich war (Abb. 3).
Dimerisierung und Reinigung
S-sulfoniertes monomeres rPDGF-B wurde auf eine Konzentration von 0,4 mg/ml eingestellt. Danach wurde Harnstoff zu einer Endkonzentration von 1 M hinzugefügt, danach Glutathion (5 mM) und oxidiertes Glutathion (0,5 mM). Der pH wurde durch Zugabe von Tris-HCl (gegebenenfalls Tris-Base) auf 7,8 eingestellt (Endkonzentration ca. 50 mM), und die Reaktionsmischung wurde 2 Tage lang bei Raumtemperatur belassen. Dimeres rPDGF-BB wurde durch Ionenaustauscher-Chromatographie gereinigt. Dazu wurden ca. 20 mg Protein über eine 1 ml Säule von S-Sepharose in 20 mM Tris-HCl (pH 7,4) gegeben. Monomeres rPDGF wurde durch Waschen mit 20 mM Tris-HCl (pH 7,4) entfernt. Nach einem weiteren Waschvorgang mit 20 mM Tris-HCl und 0,3 M NaCl (pH 7,4) wurde dimeres rPDGF-B mittels 20 mM Tris-HCl und 0,7 M NaCl (pH 7,4) eluiert.
Die Ausbeute nach Dimerisierung betrug 0,5 bis 0,7 mg Protein aus 1 l Kultur. Das Protein war (nach SDS-Gelelektrophorese) hochrein und stimulierte den 3H-Thymidineinbau in Maus-AKR-2B-Fibroblasten halbmaximal bei einer Konzentration von 1 bis 2 ng/ml (Abb. 3 und 4).
Literatur
Betsholtz, C., Johnsson, A., Heldin, C.-H. Westermark, B., Lind, P., Urdea, M. S., Eddy, R., Shows, T. B., Philpott, K., Mellor, P. L., Knott, T. J. and Scott, J. (1986) Nature, 320, 695-699.
Bradford, M. B. (1976) Anal. Biochem. 72, 248-253.
Deuel, T. F., Tong, B. D. and Huang, J. S. (1985) Current Topics in Cellular Regulation, 26, 51-61.
Heldin, C.-H. and Westermark, B. (1984) Cell, 37, 9-20.
Heldin, C.-H., Johnsson, A., Wennergren, S., Wernstedt, C., Betsholtz, C. and Westermark, B. (1986) Nature, 319, 511-514.
Henikoff, S. (1984) Gene, 28, 351-359.
Hoppe, J., Gatti, D., Weber, H. and Sebald, W. (1986) Eur. J. Biochem., 155, 259-264.
Kelly, J. D., Raines, E. W., Ross, R. and Murray, M. J. (1985) EMBO J., 4, 3399-3405.
Redinbaugh, M. G., Turley, R. B. (1986) Analyt. Biochem. 153, 267-271.
Ross, R., Raines, E. W. and Bowen-Pope, D. F. (1986) Cell, 46, 155-169.
Schauder, B., Blöcker, H., Frank R. and McCarthy, J. E. G. (1987) Gene 52, 279-283).
Shipley, G. D., Childs, C. B., Volkenant, M. E. and Moses, H. L. (1984) Cancer Res., 44. 710-716.
Stanley, K. K. and Luzio, J. P. (1984) EMBO J., 3, 1429-1434.
Stroobant, P. and Waterfield, M. D. (1984) EMBO J., 3, 2963-2967.
Weich, H. A., Sebald, W., Schairer, H. U. and Hoppe, J. (1986) FEBS Lett., 198, 344-348.

Claims (9)

1. Biologisch aktives (wachstumstimulierendes) PDGF-BB gekennzeichnet durch folgende Aminosäuresequenz seiner Monomeren: wobei bei beiden Monomeren unabhängig voneinander eine beliebige Aminosäure fehlen kann, eine beliebige Aminosäure durch eine beliebige andere Aminosäure ersetzt sein kann oder an einer beliebigen Stelle eine weitere beliebige Aminosäure vorgesehen sein kann.
2. Biologisch aktives (wachstumstimulierendes) PDGF-BB insbesondere nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die C-Termini beider Monomeren unabhängig voneinander um bis zu 14 Aminosäuren deletiert oder ergänzt sein können.
3. Verfahren zur Herstellung von PDGF-B der Aminosäuresequenz gemäß Anspruch 1 (Monomeres) und gegebenenfalls biologisch aktives (wachstumstimulierendes) PDGF-BB (als seinem Dimeren), dadurch gekennzeichnet, daß man
  • I) mit Hilfe von E. coli, umfassend einen Hybridvektor, der aus pEX und Fremd-DNA gebildet ist, die folgendes Fusionsprotein kodiert:
    • a) ein Fusionsprotein aus β-Galaktosidase und PDGF-B der Aminosäuresequenz I oder
    • b) ein Fusionsprotein gemäß (a), dem eine beliebige Aminosäure fehlt, bei dem eine beliebige Aminosäure durch eine beliebige andere Aminosäure ersetzt ist oder bei dem an einer beliebigen Stelle eine weitere beliebige Aminosäure vorgesehen ist, oder
    • c) ein Fusionsprotein, bei dem die C-Termini unabhängig voneinander um bis zu 14 Aminosäuren deletiert oder ergänzt sind,
    • ein Fusionsprotein gemäß (a), (b) oder (c) exprimiert,
  • II) das gebildete Fusionsprotein (gegebenenfalls nach Reduktion) chemisch spaltet und ein Monomeres gemäß Anspruch 1 oder 2 freisetzt
  • III) die Thiolgruppen durch Sulfonieren schützt,
  • IV) das geschützte Monomere durch Gelpermeations-Chromatographie und/oder Umkehrphase-Chromatographie reinigt,
  • V) die Sulfogruppen des gereinigten und geschützten Monomeren reduziert und gegebenenfalls ferner
  • VI) das entschützte Monomere durch Ausbildung von Disulfidbrücken dimerisiert und danach
  • VII) das gebildete Dimere durch Umkehrphasen-Chromatographie und/oder Ionenaustauscher-Chromatographie reinigt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man für die Stufe (I) E. coli mit einem Hybridvektor verwendet, der unter Verwendung von pEX, beispielsweise pEX 1, pEX 2 oder pEX 3 gebildet ist.
5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man bei der Stufe (II) mit Bromcyanid spaltet.
6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man der Stufe (III) in Gegenwart von Sulfit und Dithionat sulfoniert.
7. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man bei der Stufe (IV) die Gelpermeations-Chromatographie in Gegenwart eines denaturierenden Agens durchführt, beispielsweise Guanidin-Hydrochlorid, beispielsweise einer Molarität im Bereich von 1 bis 6 M.
8. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stufen (V) und (VI) gemeinsam durchführt, beispielsweise in Gegenwart
  • a) von Harnstoff (beispielsweise einer Molarität von bis zu 4 M) und
  • b) Thiolreagenzien, wie
    • - 2-Mercaptoethanol (beispielsweise einer Konzentration von bis zu 2%),
    • - Glutathion (beispielsweise einer Molarität von bis zu 100 mM) sowie
    • - Dithiothreitol und Dithioerythiol (beispielsweise einer Molarität von bis zu 100 mM).
9. Verwendung des biologisch aktiven (wachstumstimulierenden) PDGF-BB gemäß Anspruch 1 oder 2 zur Wachstumsstimulierung.
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