DE68922549T2

DE68922549T2 - Signalpeptid und dafür kodierende DNS-Sequenzen.

Info

Publication number: DE68922549T2
Application number: DE68922549T
Authority: DE
Inventors: Evelyne Joseph-Liauzun; Richard Legoux; Pascal Leplatois; Gerard Loison; Willem Roskam
Original assignee: Sanofi SA
Current assignee: Sanofi Aventis France
Priority date: 1988-08-24
Filing date: 1989-08-23
Publication date: 1996-01-18
Anticipated expiration: 2009-08-24
Also published as: EP0356335B1; CA1334944C; ES2074087T3; JPH02257883A; JP2535076B2; PT91511B; PT91511A; FR2636643A1; FR2636643B1; DE68922549D1; GR3016981T3; EP0356335A1; ATE122398T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Signalpeptid, DNA-Sequenzen, die dieses Signalpeptid codieren, Expressionsvektoren, die eine dieser DNA-Sequenzen enthalten, durch diese Vektoren transformierte Gram-negative Bakterien sowie ein Verfahren zur periplasmatischen Herstellung von Polypeptiden mit Hilfe dieser transformierten Bakterien.
Es ist bekannt, daß die Gram-negativen Bakterien von Natur aus Polypeptide produzieren, die in Form einer Vorläuferverbindung im Cytoplasma synthetisiert und in den periplasmatischen Raum ausgeschleust werden, der sich zwischen der cytoplasmatischen Membran und der Bakterienmembran befindet, wo sie sich in Form eines reifen Polypeptids ansammeln, d.h. eines Polypeptids, das befähigt ist, seine spezielle biologische Funktion zu gewährleisten. Zu diesen Polypeptiden gehören insbesondere Enzyme, wie beispielsweise die alkalische Phosphatase.
Es ist ferner bekannt, daß Gram-negative Bakterien verwendet werden können, um sie zur Erzeugung eines fremden Polypeptids in ihrem periplasmatischen Raum zu veranlassen. Eine derartige Produktion im periplasmatischen Raum genießt ein gewisses Interesse, da die Abtrennung des entsprechenden Polypeptids von den übrigen Bestandteilen des Periplasmas leichter ist als seine Abtrennung von den übrigen Bestandteilen des Cytoplasmas, wie dies im Fall einer Produktion mit Ansammlung im Cytoplasma erforderlich ist. Eine derartige Produktion ist ferner auch deswegen von Interesse, weil sich das Polypeptid in seiner reifen Form ansammelt, ohne daß die Anfügung eines N-terminalen Methionins stattfindet, das sonst anschließend abgetrennt werden müßte, und ohne daß das Protein eine ungünstige Sekundärstruktur annimmt.
Es ist bekannt, daß ein Polypeptid zur Erzeugung im periplasmatischen Raum in Form einer Vorläuferverbindung synthetisiert werden muß, die dem reifen Polypeptid entspricht, das an seinem N-Terminus um ein Peptid verlängert ist, das allgemein 15 bis 30 Aminosäuren aufweist und als Signalpeptid bezeichnet wird. Dieses Signalpeptid, das eine bestimmende Rolle bei der Sekretion des Polypeptids spielt, wird im Laufe dieses Prozesses abgespalten, wodurch so das reife Polypeptid im periplasmatischen Raum freigesetzt wird.
Zur Anpassung von Bakterien an die periplasmatische Erzeugung eines Polypeptids, das für diese Bakterien ein Fremdpeptid darstellt, und insbesondere eines Polypeptids eukaryontischen Ursprungs, bestanden die ersten Arbeiten in der Transformation der Bakterien mit einem Expressionsvektor, der eine DNA-Sequenz aufweist, die eine natürliche Vorläuferverbindung des entsprechenden Polypeptids codiert. Diese Strategie erwies sich allerdings in mehrfach wiederholten Untersuchungen hinsichtlich der Mengen als für eine industrielle Produktion wenig geeignet.
Ein weiterer Versuch zur Erzielung einer zufriedenstellenden Lösung bestand darin, das natürliche Signalpeptid des Polypeptids durch das in Form einer Vorläuferverbindung synthetisierte Bakterien-Polypeptid zu ersetzen. In der europäischen Patentanmeldung EP-A-0 177 343 sind Herstellungsbeispiele für solche Signalpeptide angegeben.
Die Anmelderin stellte nun fest, daß die Wahl eines bakteriellen Signalpeptids für die Vorläuferverbindung eines heterologen Polypeptids (insbesondere eukaryontischen Ursprungs) je nach der Synthese im Bakterium dafür bestimmend sein kann, daß sie eine ungeeignete Sekundärstruktur annimmt; aufgrund dieser Feststellung wurde ein neues Signalpeptid konzipiert, das die Erzielung einer guten Ausbeute an biologisch aktiven, heterologen Polypeptiden bei Produktion im periplasmatischen Raum erlaubt.
Die Erfindung betrifft entsprechend ein neues Signalpeptid der Formel
M X K S T L L L L F L L L C L P S W N A G A,
in der bedeuten:
A = Alanin
C = Cystein
F = Phenylalanin
G = Glycin
K = Lysin
L = Leuin
M = Methionin
N = Asparagin
P = Prolin
S = Serin
T = Threonin
W = Tryptophan
und X eine direkte Bindung zwischen M und K, eine Aminosäure, die aus der Gruppe der 20 Aminosäuren des genetischen Codes ausgewählt ist, oder ein Peptid, das aus 2, 3 oder 4 Aminosäuren besteht, von denen jede unabhängig von den anderen aus der Gruppe der 20 Aminosäuren des genetischen Codes ausgewählt ist.
Besonders geeignet ist ein Signalpeptid, bei dem X eine direkte Bindung zwischen M und K oder das ganze Peptid der Sequenz APSG oder einen Teil des Peptids der Sequenz APSG darstellt.
Nach einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung DNA-Sequenzen, die das erfindungsgemäße Signalpeptid codieren. Dabei können sämtliche Sequenzen verwendet werden, die aufgrund der Degeneration des genetischen Codes möglich sind. Die nachstehenden zwei Sequenzen sind besonders geeignet: die Sequenz
5'-ATG-GCT-CCA-TCT-GGC-AAA-TCC-ACG-CTG CTT-CTC-TTA-TTT-CTG-CTC-CTG-TGC-CTG CCC-TCT-TGG-AAC-GCC-GGC-GCT-3',
die das Signalpeptid der Formel (1) codiert:
M A P S G K S T L L L L F L L L C L P S W N A G A (1)
und die Sequenz
5'-ATG-AAA-TCC-ACG-CTG-CTT-CTC-TTA-TTT-CTG CTC-CTG-TGC-CTG-CCC-TCT-TGG-AAC-GCC-GGC GCT-3',
die das Signalpeptid der Formel (2) codiert:
M K S T L L L L F L L L C L P S W N A G A (2).
Die Erfindung betrifft ferner Expressionsvektoren, die eine DNA-Sequenz aufweisen, die eine Vorläuferverbindung eines Polypeptids codiert; sie sind dadurch gekennzeichnet, daß der Teil dieser Sequenz, der das Signalpeptid codiert, eine Sequenz gemäß der Erfindung darstellt.
Das erfindungsgemäße Signalpeptid, die dieses Signalpeptid codierenden DNA-Sequenzen sowie die Expressionsvektoren, die diese Sequenzen aufweisen, sind bei der periplasmatischen Herstellung von Polypeptiden durch Bakterien anwendbar, die durch diese Vektoren transformiert sind und sich im Test der Gram-Färbung negativ verhalten (sogenannte Gram-negative Bakterien).
Die Erfindung betrifft entsprechend ferner auch mit den oben definierten Vektoren transformierte Gram-negative Bakterien. Hierunter sind Bakterien besonders geeignet, die zu der Art Escherichia coli gehören. Diese Bakterien weisen vorzugsweise eine oder mehrere, wenn möglich stabile Mutationen auf, beispielsweise Mutationen durch Deletion, die das cya-Gen und/oder das crp-Gen betreffen.
Die Erfindung betrifft nach einem weiteren Aspekt ein Verfahren zur periplasmatischen Erzeugung von Polypeptiden, das darin besteht, Zellen Gram-negativer Bakterien, wie oben definiert, zu kultivieren, die Zellen einem osmotischen Schock zu unterziehen und das rekombinante Polypeptid aus dem Überstand nach dem osmotischen Schock abzutrennen.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt eine entsprechende Produktion sowohl nach einem Induktionsverfahren, wenn die Expression der die Vorläuferverbindung codierenden DNA-Sequenz unter die Kontrolle eines induzierbaren Promotors gebracht wird, als auch nach einer konstitutiven Verfahrensweise, bei der die Erzeugung des Polypeptids ab der Kultivierung des transformierten Stamms kontinuierlich stattfindet.
Das erfindunsgemäße Verfahren eignet sich zur Herstellung beliebiger Arten von Polypeptiden, die in bezug auf den eingesetzten Stamm heterolog sind. Es eignet sich entsprechend zur Erzeugung von Polypeptiden eukaryontischen Ursprungs. Dabei kann es sich um Proteine, wie insbesondere das menschliche Wachstumshormon (hGH), oder Peptide kleinerer Größe handeln, wie insbesondere eine natürliche oder eine abgewandelte Form des Hirudins, beispielsweise das abgewandelte Hirudin HV2(Lys&sup4;&sup7;).
Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von drei Ausführungsbeispielen näher erläutert, bei denen auf die fünf Figuren der Anlage Bezug genommen wird.
Fig. 1 stellt eine Restriktionskarte des Plasmids p163,1 dar. Die verschiedenen Restriktionssegmente sind in willkürlicher Weise gemäß der nachstehenden Legende markiert:
= Stelle des Replikationsursprungs (ORI)
= vom Plasmid pBR322 stammendes DNA-Segment
= die eine natürliche Vorläuferverbindung von hGH codierende Sequenz enthaltendes DNA- Segment
= vom Phagen fd stammendes DNA-Segment, das einen Transcriptionsterminator enthält
= DNA-Segment, das einen Hybrid-Promotor-Operator Tryptophan-Lactose UVS enthält
= β-Lactamase codierendes DNA-Segment (ApR: Ampicillinresistenz)
Fig. 2 stellt eine Restriktionskarte des Plasmids p160,1 dar, dessen Fragmente PvuI-XhoI-BamHI(1) und PvuI-ORI- bamHI(2) von den Plasmiden P163,1 bzw. pBR327 stammen und dessen kleines Fragment BamHI(2)-BamHI(1) das im nachstehenden Beispiel 1 beschriebene Fragment 3 darstellt.
Fig. 3 zeigt eine den Plasmiden p380,1 und p 373,2 gemeinsame Restriktionskarte. Die verschiedenen Restriktionssegmente sind in willkürlicher Weise entsprechend der nachstehenden Legende bezeichnet:
= vom Plasmid pBR327 stammende Sequenz PvuI- BamHI(2)
= vom Plasmid p163,1 stammende Sequenz PvuI- XhoI
= vom Plasmid p163,1 stammende Sequenz XhoI- HincII
= im nachstehenden Beispiel 1 beschriebenes Fragment 4
= im nachstehenden Beispiel 1 beschriebenes Fragment 3
= vom Phagen fd stammendes DNA-Segment, das einen Transcriptionsterminator enthält
= Fragment Psti-HindIII des DNA-Segments, das die die Vorläuferverbindung von hGH codierende Sequenz enthält.
Fig. 4 stellt die Restriktionskarte des Plasmids p400,18 dar. Die verschiedenen Restriktionsfragmente sind in willkürlicher Weise entsprechend der nachstehenden Legende bezeichnet:
= vom Plasmid pBR327 stammende Sequenz PvuI- BamHI (2)
= vom Plasmid p163,1 stammende Sequenz PvuI- XhoI
= vom Plasmid p163,1 stammende Sequenz XhoI- HincII
= im nachstehenden Beispiel 1 beschriebenes Fragment 3
= vom Phagen fd stammendes DNA-Segment, das einen Transcriptionsterminator enthält
= DNA-Segment, das insbesondere den Promotor der Hirudin-Vorläuferverbindung enthält (Teil HincII-NdeI des Fragments 4)
= die Vorläuferverbindung des Hirudins codierende Sequenz, welche die Sequenz enthält, die das Signalpeptid der Formel (1) codiert, die durch den schwarzen Bereich dieses Symbols dargestellt ist (Vereinigung der Fragmente 5 und 7).
In Fig. 5 ist eine Restriktionskarte des Plasmids p460 dargestellt. Die verschiedenen Restriktionsfragmente sind in willkürlicher Weise entsprechend der nachstehenden Legende bezeichnet:
= vom Plasmid pBR327 stammende Sequenz PvuI- BamHI (2)
= vom Plasmid p163,1 stammende Sequenz PvuI- XhoI
= vom Plasmid p163,1 stammende Sequenz XhoI- HincII
= im nachstehenden Beispiel 1 beschriebenes Fragment 3
= DNA-Segment des Phagen fd, das einen Transcriptionsterminator enthält
= DNA-Segment, das insbesondere den Promotor der Vorläuferverbindung des Hirudins enthält (Teil HincII-NdeI des Fragments 4)
= die Vorläuferverbindung des Hirudins codierende Sequenz, welche die Sequenz enthält, die das Signalpeptid der Formel (2) codiert und durch den schwarzen Teil dieses Symbols veranschaulicht ist.

Beispiel 1: Periplasmatische Erzeugung von menschlichem Wachstumshormon mit dem Signalpeptid der Formel (1):

M A P S G K S T L L L L F L L L C L P S W N A G A
Es wird ein Bakterienstamm der Art Escherichia coli eingesetzt, der direkt mit dem Stamm verwandt ist, der in der europäischen Patentanmeldung Ep-A-0 245 138 beschrieben und bei der Collection Nationale de Cultures des Microorganismes (CNCM, Paris, Frankreich) am 17. Februar 1986 unter der Hinterlegungsnummer I-529 hinterlegt wurde. Dieser Stamm weist eine cya-Mutation durch Deletion und eine crp-Mutation durch Deletion auf.
Es wurde ein Plasmid hergestellt, das eine DNA-Sequenz aufweist, die eine Vorläuferverbindung von hGH codiert und dessen Signalpeptid das erfindungsgemäße Signalpeptid der Formel (1) ist:
Dieses Plasmid wurde als p398 bezeichnet.

1. Aufbau des Plasmids p398

1a) Aufbau des Plasmids p373,2

Bei der angewandten Strategie werden Fragmente eingesetzt, die aus bereits existierenden, der Öffentlichkeit zugänglichen Plasmiden hergestellt sind, und Fragmente, die nach jetzt üblicherweise angewandten Verfahren synthetisch hergestellt wurden. Die angewandten Klonierungsverfahren sind in der Publikation von T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook in "Molecular cloning, a laboratory manual" (Cold Spring Harbor Laboratory, 1984) beschrieben. Die Synthese der Oligonucleotide erfolgte mit einer DNA-Synthesevorrichtung Biosearch 4600.
Das Plasmid p163,1 (Fig. 1), das in der europäischen Patentanmeldung EP-A-0 245 138 beschrieben ist (dargestellt in Fig. 2 dieses Dokuments, in der die Restriktions-Schnittstelle BamHI (1) nicht erscheint, die in Fig. 1 der vorliegenden Anmeldung dargestellt ist) und in dem bei CNCM unter der Hinterlegungsnummber 1-530 am 17. Februar 1986 hinterlegten Stamm vorliegt, wurde einem Abbau durch die Enzyme PvuI und BamHI unterzogen. Dieses Plasmid enthält das hGH codierende Gen. Das Fragment PvuI-BamHI (1) - im folgenden als Fragment 1 bezeichnet -, das die Restriktionsschnittstelle des Restriktionsenzyms XhoI enthält, die in Fig. 1 dargestellt ist, wurde gereinigt.
In gleicher Weise wurde das Plasmid pBR327, das dem Fachmann wohl bekannt ist (vgl. X. Soberon et al., Gene 9 (1980) 287- 305), einem Abbau durch die Enzyme PvuI und BamHI unterzogen. Das Fragment PvuI-BamHI (2) - im folgenden als Fragment 2 bezeichnet -, das den Replikationsursprung enthält, wurde gereinigt.
Anschließend wurde das Fragment 3 hergestellt, das ein synthetisches BamHI(1)-BamHI(2)-Fragment darstellt, das das Gen Lac i und seinen Promotor enthält, dessen Sequenz nachstehend angegeben ist und in der die beiden Enden des Stranges durch die Zahlen 1 und 2 bezeichnet sind, um die Orientierung des Fragments in den in den Figuren 2 und 3 dargestellten Plasmiden anzugeben. FRAGMENT 3
Die Fragmente 1, 2 und 3 wurden dann in der Weise ligasiert, daß das in Fig. 2 darstellte Plasmid p160,1 erhalten wurde.
Dieses Plasmid wurde einem partiellen Abbau durch die Restriktionsenzyme HincII und PstI unterzogen. Das große Fragment HincII-PstI, das den Replikationsursprung enthält und in Fig. 2 dargestellt ist, wurde dann mit dem Fragment 4 ligasiert, das nachstehend angegeben ist und ein synthetisches DNA-Fragment darstellt, das eine Sequenz, welche die ersten 44 Aminosäuren einer natürlichen Vorläuferverbindung von hGH codiert, sowie stromaufwärts von dieser Sequenz Regulationssignale enthält. FRAGMENT 4
In diesem Fragment sind die Aminosäuren durch Buchstaben nach folgendem Code bezeichnet:
A = Alanin M = Methionin
C = Cystein N = Asparagin
D = Asparaginsäure P = Prolin
E = Glutaminsäure Q = Glutamin
F = Phenylalanin R = Arginin
G = Glycin S = Serin
H = Histidin T = Threonin
I = Isoleucin V = Valin
K = Lysin W = Tryptophan
L = Leucin Y = Tyrosin
In diesem Fragment sind die Sequenzen -35 (TTGCTT) und -10 (TATAAT) der Promotorsequenz sowie die dem Fachmann geläufige Shine-Dalgarno-Sequenz unterstrichen.
Auf diese Weise wurde das Plasmid p380,1 erhalten.
Das Plasmid p380,1 (Fig. 3) wurde anschließend in der Weise einem Abbau durch die Restriktionsenzyme ClaI und NdeI unterzogen, daß das kleine Fragment ClaI-NdeI des oben genannten Fragments 4 abgespalten und durch das nachstehend angeführte Fragment ClaI-NdeI ersetzt wurde:
Das resultierende Plasmid ist das Plasmid p373,2 (Fig. 3).

1b) Aufbau des Plasmids p39B

Das Plasmid p373,2 wurde schließlich einem Abbau durch die Restriktionsenzyme NdeI und XbaI in der Weise unterzogen, daß das Fragment NdeI-XbaI des oben angegebenen Fragments 4 abgespalten und durch das nachstehend aufgeführte synthetische Fragment NdeI-XbaI ersetzt wurde:
Das so erhaltenen Plasmid p398 enthält die besonders wichtige DNA-Sequenz, die das Signalpeptid der Formel (1) codiert. Die Grenzen dieser Sequenz sind in der obigen Darstellung durch zwei Pfeile markiert.

2. Allgemeine Methodik

Die Versuche wurden mit sechs Klonen des Plasmids p398 (Klone 2, 3, 5, 6, 7 und 8) durchgeführt. Die Bewertung der Ergebnisse ist auf das Plasmid p373,2 bezogen, das eine DNA- Sequenz enthält, welche die natürliche Vorläuferverbindung von hGH codiert. Bei diesen Versuchen wurden die betreffenden, zuvor hergestellten Wirt-Vektor-Kombinationen (vgl. Abschnitt 2.1) unter solchen Bedingungen kultiviert, daß eine ausreichende Biomasse erhalten wurde (vgl. Abschnitt 2.2) und die einer Induktion unterworfenen Zellen hGH Produzieren (vgl. Abschnitt 2.3); anschließend wurden durch Anwendung eines osmotischen Schocks die im periplasmatischen Raum enthaltenen Proteine gewonnen (vgl. Abschnitt 2.4), worauf die Bakterien in der Weise einer vollständigen Lyse unterworfen wurden, daß der gesamte Proteingehalt gewonnen wurde (vgl. Abschnitt 2.5); danach wurde das in Abschnitt 2.4 aus dem periplasmatischen Raum gewonnene hGH quantitativ bestimmt (vgl. Abschnitt 2.6); die in den Abschnitten 2.4 und 2.5 erhaltenen Überstände wurden nach dem als Western- Blotting bezeichneten Verfahren analysiert (vgl. Abschnitt 2.7).

2.1 Herstellung der Wirt-Vektor-Kombinationen

Die Wirt-Vektor-Kombinationen wurden nach dem Fachmann geläufigen Verfahren zur Bakterientransformation hergestellt, wie sie insbesondere in den nachstehenden Monographien beschrieben sind:
- Molecular cloning - A Laboratory Manual - T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982
- Experiments in Molecular Genetics, J.H. Miller, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972.

2.2 Kultivierung

a) Beimpfung

Eine auffestem Medium (LB-Medium + Agar-Agar) erhaltene isolierte Kolonie wurde in 5 ml eines Mediums (LB-Medium) suspendiert.
Das verwendete LB-Medium besitzt folgende Eigenschaften:
- die vor dem Autoklavieren zugegebenen Komponenten sind:
Bactotrypton 10 g
Hefeextrakt 5 g
Natriumchlorid 5 g
destilliertes Wasser q.s.p. 1 l
- der pH-Wert wird vor dem Autoklavieren auf 7,3 eingestellt
- nach dem Autoklavieren wird Ampicillin in einer Menge von 100 ug/ml zugegeben.

b) Inkubation

Die in Abschnitt a) hergestellte Suspension wurde 18 h auf 37 ºC gehalten, so daß die Kultur in die stationäre Wachstumsphase gelangte. Die erhaltene dichte Suspension wurde derart mit LB-Medium verdünnt, daß der bei 600 nm bestimmte Wert der optischen Dichte, OD bei 600 nm, bei etwa 0,03 lag; anschließend wurden 25 ml dieser Bakteriensuspension unter Rühren bei 37 ºC inkubiert, bis eine OD bei 600 nm von etwa 0,3 erhalten wurde.

2.3 Induktion

Die gemäß 2.2 b) erhaltene Bakteriensuspension wurde mit Isopropyl-β-D-thiogalactose (IPTG) in einer solchen Menge versetzt, daß die Endkonzentration 1 mM betrug; das IPTG wurde hier eingesetzt, um die Triggerung und Aufrechterhaltung der Synthese der Vorläuferverbindung des hGH unter Neutralisation des Repressors zu erzielen, der normalerweise am Lactose-Operator gebunden wird.
Die mit IPTG versetzte Suspension wurde 2,5 h bei 37 ºC gerührt.

2.4 Osmotischer Schock

Es wurde nach dem Protokoll verfahren, das von N.G. Nossal und L.A. Heppel in The Journal of Biological Chemistry 241 (1966) 3055-3063 beschrieben wurde.

a) Waschen mit Tris und EDTA

Eine Probe der in 2.3 nach Induktion erhaltenen Suspension wurde entnommen und 5 min bei einer relativen Zentrifugalbeschleunigung von 6000 zentrifugiert.
Der Zentrifugenrückstand wurde in einem solchen Volumen eines Puffers von pH 7 (Lösung A) (vgl. oben) aufgenommen, daß die erhaltene Suspension eine OD bei 600 nm von etwa 10 aufwies.
Der verwendete Puffer wurde durch Zugabe folgender Substanzen zu destilliertem Wasser hergestellt:
Zusatz von Tris(hydroxymethyl)aminomethan HCL (Tris HCl) zur Erzielung einer Endkonzentration von 30 mM.
Zusatz von Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) zur Erzielung einer Endkonzentration von 1 mM.

b) Einwirkung von Saccharose

Die in 2.4 a) erhaltene Suspension wurde 5 min bei einer relativen Zentrifugalbeschleunigung von 6000 zentrifugiert.
Der Zentrifugenrückstand wurde vorsichtig bei konstantem Volumen in einer zuvor hergestellten Lösung B aufgenommen, die der Lösung A entsprach, die mit Saccharose in einer Menge von 15 g/100 ml versetzt wurde.
Die Suspension wurde 10 min bei 20 ºC belassen. Sie wurde danach 5 min bei einer relativen Zentrifugalbeschleunigung von 6000 zentrifugiert. Die Zentrifugenröhrchen wurden dann in ein Eisbad eingesetzt.
Der Überstand wurde sorgfältig entfernt und durch ein gleiches Volumen entionisierten Wassers ersetzt, das zuvor auf die Temperatur des schmelzenden Eises gebracht worden war.
Die so hergestellte Suspension (deren OD bei 600 nm etwa 10 betrug) wurde 5 min bei 0 ºC belassen.

c) Gewinnung der Proteine aus dem periplasmatischen Raum

Die in 2.4 b) erhaltene Suspension wurde 10 min bei einer relativen Zentrifugalbeschleunigung von 18000 zentrifugiert.
Der Überstand, der die im periplasmatischen Raum befindlichen Proteine enthielt, wurde gewonnen.

2.5 Vollständige Lyse

Eine Probe der in 2.3 nach Induktion erhaltenen Suspension wurde entnommen und in einem Eppendorf-Röhrchen 5 min bei einer relativen Zentrifugalbeschleunigung von 6000 zentrifugiert.
Der Zentrifugenrückstand wurde in einem solchen Volumen Puffer wieder suspendiert, daß 1 ml der Suspension eine OD bei 600 nm von 0,2 aufwies.
Der Puffer wurde aus einem zweifach konzentrierten Puffer hergestellt, der eine Lösung folgender Bestandteile in destilliertem Wasser darstellte:
- Tris-HCl 0,125 M, pH 6,8;
- Natriumdodecylsulfat (4 % (G/V) );
- Glycerin (20 % (G/V);
- β-Mercaptoethanol (10 % (G/V) );
- Bromphenolblau (0,02 % (V/V) ).
Das Röhrchen wurde 10 min in ein auf 100 ºC geregeltes Wasserbad eingesetzt, worauf die Suspension 5 min bei einer relativen Zentrifugalbeschleunigung von 6000 zentrifugiert und der Rückstand gewonnen wurde.

2.6 Bestimmung des periplasmatischen hGH

Der in 2.4 c) erhaltene Überstand wurde einer Hochdruckflüssigkeitschromatographie unterzogen, wobei eine mit einem geeichten Einspritzsystem versehene und mit einem auf 220 nm eingestellten Detektor ausgerüstete Einrichtung verwendet wurde.
Es wurden verwendet:
Eine Inversphasensäule C 8-300 Å, Stahl, Länge 10 cm, Innendurchmesser 4,6 mm (Synchrom, Referenz-Nr. C 8 R103-10),
eine mobile Phase, die aus einem linearen Gradienten bestand, bei dem in 20 min ein Übergang von 70 Volumenteilen Lösung S1 und 30 Volumenteilen Lösung S2 auf 40 Volumenteile Lösung S1 und 60 Volumenteile Lösung 52 vorlag.
Die Lösungen S1 und S2 besaßen folgende Eigenschaften:
S1: Gereinigtes Wasser mit einem Gehalt von 0,1 % (V/V) Trifluoressigsäure,
S2: Acetonitril für HPLC mit einem Gehalt von 0,08 % (V/V) Trifluoressigsäure.
Der Durchsatz betrug 1 ml/min.
Die optische Dichte der Fraktionen wurde gemessen; die in Mikrogramm pro Milliliter Überstand ausgedrückte Menge an periplasmatischem hGH wurde durch Vergleich mit einer zuvor ermittelten Eichkurve bestimmt.

2.7 Analyse durch Western-Blotting

Dabei wurden nacheinander folgende Verfahrensschritte vorgenommen:
- Gelelektrophoretische Trennung (nach dem von U.K. Lämmli,
Nature 227 (1970) 680-685 beschriebenen Protokoll) der verschiedenen in den jeweiligen gemäß 2.4 c) und 2.5 erhaltenen Überständen enthaltenen Proteine; das verwendete Gel war ein Polyacrylamidgel (15 % G/V), das 0,5 % Natriumdodecylsulfat enthielt;
- Übertragung der im Gel enthaltenen Proteine auf ein Nitrocellulosefilter (nach dem Verfahren von H. Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979) 4350-4354);
- Immundetektion nach dem Verfahren von Burnette (W.W. Burnette, Anal. Biochem. 112 (1981) 195-203); dabei wurden nacheinander folgende Schritte durchgeführt:
10 min Waschen des Nitrocellulosefilters mit Puffer A (Tris HCl 10 mM, NaCl 170 mM, KI 1 mM);
Inkontaktbringen des Nitrocellulosefilters während 30 min bei 37 ºC mit einem Puffer B (Puffer A versetzt mit Rinderserumalbumin in einer Menge von 3 g/100 ml);
Inkontaktbringen des Nitrocellulosefilters während 18 h bei 20 ºC mit einem Immunserum (polyklonaler Antikörper, der reifes hGH und seine Vorläuferverbindung erkennt); Waschen des Nitrocellulosefilters mit Puffer B;
Inkontaktbringen des Nitrocellulosefilters während 6 h bei 20 ºC mit einer Proteinlösung A, die mit 0,1 uCi/ml ¹²&sup5;I markiert ist;
Waschen des Filters mit Puffer A;
Trocknen des Filters zwischen zwei Löschpapierblättern;
Inkontaktbringen mit einem autoradiographischen Film;
Entwicklung des Films.

3. Ergebnisse

3.1 Bestimmung des periplasmatischen hGH

Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle aufgeführt: Getestetes Plasmid Vergleich PLASMID 398 periplasmatisches hGH, ausgedrückt in ug/ml nach osmotischern Schockgewonnenem Überstand und Einstellung der Trübung auf DO bei 600 nm = 1
Es ist klar ersichtlich, daß das Plasmid 398 eine periplasmatische Produktion von hGH erlaubt, die im Vergleich zur Verwendung des Plasmids 373,2 um etwa den Faktor 2 höher ist.

3.2 Analyse durch Western-Blotting

Die Analyse der autoradiographischen Filme ergibt, daß die Vorläuferverbindung in den nach der vollständigen Lyse der mit dem Plasmid p398 transformierten Bakterien erhaltenen Extrakten nicht erfaßt wurde, während sie in den Extrakten erfaßt wurde, die nach vollständiger Lyse der mit dem Klon p373,2 transformierten Bakterien erhalten wurde. Dies zeigt, daß es das erfindungsgemäße Signalpeptid ist, das die Freisetzung der Vorläuferverbindung von der cytoplasmatischen Membran und ihre begleitende Reifung mit großer Wirksamkeit erlaubt.
Diese Ergebnisse unterstreichen die große Bedeutung der Verwendung des Signalpeptids der Formel (1) gemäß der Erfindung zur periplasmatischen Erzeugung von Proteinen, wie etwa dem menschlichen Wachstumshormon.

Beispiel 2

Periplasmatische Erzeugung einer abgewandelten Form des Hirudins mit dem Signalpeptid der Formel (1):

M A P S G K S T L L L L F L L L C L P S W N A G A

1. Stamm und Plasmid

Es wurde der in Beispiel 1 beschriebene Stamm herangezogen.
Ein als p400 bezeichnetes Plasmid wurde aus dem Plasmid p373,2 aufgebaut. Es weist eine DNA-Sequenz auf, welche die abgewandelte Form HV2(Lys&sup4;&sup7;) codiert, die in EP-A-0 273 800 beschrieben und deren Formel nachstehend angegeben ist.
Vor dieser Sequenz befindet sich eine Sequenz, die das erfindungsgemäße Signalpeptid der Formel (1) codiert.

Aufbau des Plasmids p400

Es wurde ein synthetisches Fragment AccI-HindIII (Fragment 5) hergestellt, das eine Sequenz enthält, welche diese abgewandelte Form (außer den ersten drei Aminosäuren) codiert. Die Sequenz dieses Fragments ist nachstehend angegeben, wobei ein Pfeil das der letzten Aminosäure entsprechende Codon bezeichnet: FRAGMENT 5
Das Plasmid p373,2 wurde einem Abbau durch die Restriktionsenzyme NdeI und HINDIII unterzogen; das Fragment NdeI- HINDIII (Fragment 6), das den Replikationsursprung enthält, wie in Fig. 3 dargestellt ist, wurde gereinigt.
Ferner wurde ein synthetisches Fragment NdeI-AccI (Fragment 7) hergestellt, dessen Sequenz nachstehend angegeben ist. FRAGMENT 7
Dieses Fragment enthält eine bevorzugte DNA-Sequenz, die das Signalpeptid der Formel (1) codiert und deren Grenzen durch zwei Pfeile angegeben sind; daran schließen sich den drei ersten Codons der abgewandelten Form des Hirudins HV2 (Lys&sup4;&sup7;) entsprechende Nucleotide an.
Die Fragmente 5, 6 und 7 wurden ligasiert; das erhaltene Plasmid ist das in Fig. 4 dargestellte Plasmid p400.

2. Allgemeine Methodik

Das Plasmid p400 wurde durch Transformation in den Bakterienstamm eingeführt.
Die Versuche wurden parallel an zwei unterschiedlichen Klonen (Klone p400,18 und p400,24) sowie nach der in den Abschnitten 2.1 und 2.2 von Beispiel 1 beschriebenen Verfahrensweise durchgeführt. Die Kulturen wurden nach der in Abschnitt 2.3 von Beispiel 1 angegebenen Verfahrensweise einer Induktion unterzogen, wobei jedoch zwei Abweichungen vorgenommen wurden: Die Induktion wurde durch Zusatz von IPTG getriggert, wenn die Kultur eine OD bei 600 nm von etwa 0,5 erreicht hatte, und wurde 3,5 h bei einem ersten Versuch und 17 h bei einem zweiten Versuch aufrechterhalten.
Nach der Induktion wurden die Zellen einem osmotischen Schock unterworfen (vgl. Abschnitt 2.4, Beispiel 1), worauf die Antithrombin-Aktivität des Hirudins des gewonnenen Überstands gemessen wurde.
Die Bestimmung dieser Aktivität erfolgte nach dem von F. Markwardt et al. (Thromb. Haemostas. 52 (19) 160-163) beschriebenen und von R.P. Harvey et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 1084-1088) präzisierten Verfahren.
Die aus dem einen der Klone erhaltene abgewandelte Form des Hirudins wurde durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie gereinigt; ferner wurde ihre NH&sub2;-terminale Sequenz bestimmt.

3. Ergebnisse

Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle aufgeführt.
Sie sind in Antithrombineinheiten pro ml gewonnenen Überstands nach osmotischem Schock angegeben und auf eine Trübung mit OD bei 600 nm = 10 bezogen. Plasmid p400 Klon Dauer der Induktion
Da die bekannten Werte der spezifischen Antithrombinaktivität des Hirudins zwischen 13 000 und 17 700 Antithrombineinheiten Pro mg Hirudin liegen (G. Loison et al., Bio/Technology 6 (1988) 72-77), kann daraus gefolgert werden, daß nach 17 h Induktion 5 bis 10 mg Hirudin pro Liter Überstand bei OD bei 600 nm = 1 gewonnen wurden.
Eine derartige Menge ist erheblich höher als die Menge, die von J. Dodt et al. in FEBS 202 (1986) 373-377 unter Bezug auf die abgewandelte Form HV1 des Hirudins beschrieben wurde, wobei diese abgewandelte Form des Hirudins aus dem periplasmatischen Raum bei einem E. coli-Stamm gewonnen war, der mit einem Plasmid transformiert war, das eine Sequenz enthielt, die einen Hybridvorläufer des Hirudins codiert, dessen Signalpeptid das der alkalischen Phosphatase ist.
Auf der anderen Seite wurde festgestellt, daß das durch den Klon p400,18 erzeugte Hirudin das NH&sub2;-terminale Ende sehr wohl aufweist, das für die abgewandelte Form HV2(Lys&sup4;&sup7;) charakteristisch ist.
Diese Ergebnisse zeigen, daß das erfindungsgemäße Signalpeptid der Formel (1) für eine wirksame periplasmatische Erzeugung von Peptiden wie etwa der abgewandelten Hirudinform HV2(Lys&sup4;&sup7;) geeignet ist.

Beispiel 3:

Periplasmatische Erzeugung einer abgewandelten Form des Hirudins mit dem Signalpeptid der Formel:

M K S T L L L L F L L L C L P S W N A G A

1. Stamm und Plasmid

Es wurde der in Beispiel 1 beschriebene Stamm herangezogen.
Bei der angewandten Strategie zum Aufbau des Plasmids p460, das eine Sequenz enthält, welche die abgewandelte Form HV2(Lys&sup4;&sup7;) des Hirudins codiert, die in EP-A-0 273 800 beschrieben ist und vor der sich eine Sequenz befindet, die das erfindungsgemäße Signalpeptid der Formel (2):
M K S T L L L L F L L L C L P S W N A G A
codiert, werden die aus dem in Beispiel 2 beschriebenen Plasmid p400,18 erhaltenen DNA-Fragmente sowie ein nach gerichteter Mutagenese im Phagen M13mp19, der von der Fa. AMERSHAM im Handel ist, erhaltenes Fragment eingesetzt.

Aufbau des Plasmids p460

1a) Aus dem Plasmid p400,18 erhaltene Fragmente.

α) Das Plasmid p400,18 wurde einem Abbau durch die Enzyme Pst und EcoRI unterzogen. Das Fragment Pst-EcoRI, das 3868 Basenpaare aufweist und den Replikationsursprung enthält und das im folgenden als Fragment 8 bezeichnet ist (in Fig. 5 mit F8 abgekürzt), wurde gereinigt.
β) Das Plasmid p400,l8 wurde einem Abbau durch die Enzyme NruI und Psti unterzogen. Das kleine Fragment NruI-Psti, das 1062 Basenpaare aufweist und den Promotor enthält und das im folgenden als Fragment 9 bezeichnet ist (in Fig. 5 durch F9 abgekürzt), wurde gereinigt.

1b) Aus dem Phagen M13mp19 erhaltenes Fragment NruI-EcoRI

α) Das aus dem Plasmid 400,18 durch Abbau mit den Enzymen XhoI und EcoRI und Reinigung erhaltene Fragment XhoI-EcoRI, das 650 Basenpaare aufweist und die das Signalpeptid der Formel (1) codierende Sequenz enthält, wurde an den Restriktionsstellen SalI/EcoRI in den Polylinker (Klonierungs-Polysite) des Phagen M13mp19 (AMERSHAM) eingeführt. Die Ligasierung der Stellen XhoI und SalI führte zum Verschwinden dieser beiden Stellen.
β) Es wurde ein Oligonucleotid aus 63 Nucleotiden der Sequenz:
synthetisiert. Diese Sequenz codiert das Signalpeptid der Formel (2).
Zum Aufbau eines Fragments, das bezüglich der das Signalpeptid codierenden Sequenz gegenüber dem in α) erhaltenen Fragment mutierten Fragments wurde das Verfahren der gerichteten Mutagenese in vitro unter Verwendung des Kits AMERSHAM 1523 angewandt. Dieses Verfahren, das im einzelnen in der beigepackten Beschreibung dieses Kits erläutert ist, besteht in der Einführung eines Fragments XhoI-EcoRI von 650 Basenpaaren (vgl. den obigen Abschnitt α)) in die doppelsträngige Form des Phagen M13mp19, der Reinigung der einzelsträngigen Form dieses rekombinanten Phagen, der Hybridisierung des aus 63 Nucleotiden bestehenden Oligonucleotids, das oben erwähnt ist, und der Einwirkung von Klenow-DNA-Polymerase und anschließend von T4-Ligase, wobei so eine doppelsträngige, cyclische Form des rekombinanten Phagen erhalten wird, von dem ein Strang die gewünschte Mutation trägt.
γ) Der das mutierte DNA-Fragment enthaltende Phage wurde einem Abbau durch die Enzyme NruI und EcoRI unterzogen. Das Fragment NruI-EcoRI, das die das Signalpeptid der Formel (2) codierende Sequenz und die die abgewandelte Form HV2(Lys&sup4;&sup7;) des Hirudins codierende Sequenz enthält und im folgenden als Fragment 10 bezeichnet ist (in Fig. 5 mit F10 abgekürzt), wurde gereinigt.
Die Fragmente 8, 9 und 10 wurden ligasiert; das erhaltene Plasmid ist das Plasmid p460, das in Fig. 5 dargestellt ist.

2. Allgemeine Methodik

Das Plasmid p460 wurde durch Transformation in den in Beispiel 1 beschriebenen Bakterienstamm eingeführt.
Die Versuche wurden parallel an zwei unterschiedlichen Klonen (Klone p460,2 und p460,4), bei denen das Vorliegen der oben erwähnten Sequenz von 63 Nucleotiden nachgewiesen worden war, sowie am Vergleichsklon p400,18 nach der in den Abschnitten 2.1 und 2.2 von Beispiel 1 beschriebenen Verfahrensweise durchgeführt. Die Kulturen wurden nach dem in Abschnitt 2.3 von Beispiel 1 angegebenen Verfahren einer Induktion unterzogen, wobei jedoch zwei Änderungen vorgenommen wurden: Die Induktion wurde durch Zusatz von IPTG initiiert, wenn die Kultur eine optische Dichte OD bei 600 nm von etwa 0,5 erreicht hatte, und 2 h aufrechterhalten.
Nach der Induktion wurden die Zellen einem osmotischen Schock unterzogen (vgl. Abschnitt 2.4, Beispiel 1), wonach die so im Überstand der Kultur freigesetzte abgewandelte Form des Hirudins HV2(Lys&sup4;&sup7;) durch HPLC quantitativ bestimmt wurde.

Bestimmung der abgewandelten Hirudinform HV2(Lvs&sup4;&sup7;)

Der nach der osmotischen Schockbehandlung erhaltene Überstand wurde einer Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) unterzogen, wobei eine mit einem geeichten Einspritz- System versehene und mit einem auf 220 nm eingestellten Detektor ausgerüstete Einrichtung verwendet wurde.
Es wurden verwendet:
eine Inversphasensäule C8-300 Å, Stahl, Länge 7,5 cm, Innendurchmesser 4,6 mm (BECKMANN Ultrapore, Referenz-Nr. 238 771),
eine mobile Phase, die aus einem linearen Gradienten bestand, bei dem in 10 min ein Übergang von 85 Volumenteilen Lösung S1 und 15 Volumenteilen Lösung S2 auf 50 Volumenteile Lösung S1 und 50 Volumenteile Lösung S2 vorlag.
Die Lösungen S1 und S2 besaßen folgende Eigenschaften:
S1: gereinigtes Wasser mit einem Gehalt von 0,1 % (V/V) Trifluoressigsäure,
S2: Acetonitril für HPLC mit einem Gehalt von 0,08 % (V/V) Trifluoressigsäure.
Der Durchsatz betrug 2 ml/min.
Die optische Dichte der Fraktionen wurde gemessen; die in Milligramm pro Milliliter Überstand ausgedrückte Menge an periplasmatischer abgewandelter Hirudinform HV2(Lys&sup4;&sup7;) wurde durch Vergleich mit einer Eichlösung der abgewandelten Hirudinform HV2(Lys&sup4;&sup7;) bestimmt.

3. Ergebnisse

Die Ergebnisse sind in den nachstehenden Tabellen aufgeführt. Sie sind in Milligramm pro Liter nach der osmotischen Schockbehandlung gewonnenem Uberstand ausgedrückt und auf eine optische Dichte OD bei 600 nm von 1 bezogen. GETESTETES PLASMID Vergleich abgewandelte Hirudinform HV2(Lys&sup4;&sup7;)in mg/l nach der osmotischen Schockbehandlung gewonnenem Uberstand und bezogen auf OD bei 600 nm = 1 GETESTETES PLASMID Vergleich abgewandelte Hirudinform HV2(Lys&sup4;&sup7;)in mg/l nach der osmotischen Schockbehandlung gewonnenem Uberstand und bezogen auf OD bei 600 nm = 1
Die Ergebnisse der obigen Tabellen zeigen, daß die Plasmide 460,2 und 460,4 eine periplasmatische Produktion der abgewandelten Hirudinform HV2(Lys&sup4;&sup7;) erlauben, die im Vergleich zur Verwendung des Plasmids 400,18 deutlich erhöht ist.
Diese Ergebnisse zeigen, daß das erfindungsgemäße Signalpeptid der Formel (2) für eine wirksame periplasmatische Produktion von Peptiden, wie der abgewandelten Hirudinform HV2 (Lys&sup4;&sup7;), besonders geeignet ist.

Claims

1. Signalpeptid der Formel

M X K S T L L L L F L L L C L P S W N A G A,

in der bedeuten:

A = Alanin

C = Cystein

F = Phenylalanin

G = Glycin

K = Lysin

L = Leucin

M = Methionin

N = Asparagin

P = Prolin

S = Serin

T = Threonin

W = Tryptophan

und X eine direkte Bindung zwischen M und K, eine Aminosäure, die aus der Gruppe der 20 Aminosäuren des genetischen Codes ausgewählt ist, oder ein Peptid, das aus 2, 3 oder 4 Aminosäuren besteht, von denen jede unabhängig von den anderen aus der Gruppe der 20 Aminosäuren des genetischen Codes ausgewählt ist.

2. Signalpeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß X eine direkte Bindung zwischen M und K oder das ganze Peptid der Sequenz APSG oder einen Teil des Peptids der Sequenz APSG darstellt.

3. Signalpeptid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß X eine direkte Bindung ist.

4. Signalpeptid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß X das Peptid der Sequenz APSG ist.

5. DNA-Sequenz, die das Signalpeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 codiert.

6. Sequenz nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Formel

hat.

7. Sequenz nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Formel

hat.

8. Expressionsvektor, der eine DNA-Sequenz aufweist, die eine Vorläuferverbindung eines Polypeptids codiert, dadurch gekennzeichnet, daß der Teil dieser Sequenz, der das Signalpeptid codiert, eine Sequenz nach einem der Ansprüche 5 bis 7 ist.

9. Gramnegative Bakterien, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch einen Vektor nach Anspruch 8 transformiert sind.

10. Bakterien nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie zu der Art Escherichia coli gehören.

11. Bakterien nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine cya-Mutation durch Deletion und eine crp-Mutation durch Deletion aufweisen.

12. Bakterien nach einem der Ansprüche 9 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid eine natürliche oder eine abgewandelte Form des Hirudins ist.

13. Bakterien nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die abgewandelte Form des Hirudins HV2 (Lys&sup4;&sup7;) ist.

14. Bakterien nach einem der Ansprüche 9 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid das Wachstumshormon des Menschen ist.

15. Verfahren zur periplasmatischen Herstellung eines Polypeptids, das folgende Schritte umfaßt:

- Kultivierung gramnegativer Bakterienzellen, die durch einen Expressionsvektor einer Vorläuferverbindung eines Polypeptids transformiert sind,

- Anwendung eines osmotischen Schocks auf die Zellen,

- Abtrennung des rekombinanten Polypeptids aus dem Überstand des osmotischen Schocks,

dadurch gekennzeichnet, daß die gramnegativen Bakterien Bakterien nach einem der Ansprüche 9 bis 14 sind.