ES2250961T3

ES2250961T3 - Mantenimiento de plantas con esterilidad masculina.

Info

Publication number: ES2250961T3
Application number: ES93912959T
Authority: ES
Inventors: Mark Williams; Jan Leemans
Original assignee: Bayer Bioscience NV
Current assignee: Bayer CropScience NV
Priority date: 1992-06-12
Filing date: 1993-06-11
Publication date: 2006-04-16
Anticipated expiration: 2013-06-11
Also published as: EP0644943B1; WO1993025695A1; DE69333880D1; EP0644943A1; ATE305975T1; DE69333880T2

Abstract

NUEVAS PLANTAS TRANSGENICAS QUE TIENEN, ESTABILIDAD INTEGRADA DENTRO DE SU GENOMA NUCLEAR, UN GEN MANTENEDOR QUE COMPRENDE UN GEN RESTAURADOR DE FERTILIDAD Y UN GEN DE LETALIDAD DE POLEN. LAS PLANTAS PUEDEN SER USADAS PARA MANTENER UNA POBLACION HOMOGENEA DE PLANTAS ESTERILES MACHO.

Description

Mantenimiento de plantas con esterilidad masculina.

Esta invención se refiere a un proceso para mantener líneas de plantas con esterilidad masculina que pueden utilizarse para la producción de semillas híbridas de una cosecha, a plantas mantenedoras que pueden utilizarse en un proceso de este tipo, y a genes mantenedores que pueden utilizarse para producir dichas plantas mantenedoras.

Antecedentes de la invención

En muchas, si no en la mayoría, especies de plantas, el desarrollo de variedades cultivadas híbridas es sumamente deseado a causa de su productividad generalmente incrementada debido a la heterosis: la eficiencia superior de los individuos híbridos comparados con sus progenitores (véase, v.g., Fehr (1987) "Principles of Cultivar Development, Volume 1: Theory and Technique", MacMillan Publishing Company, Nueva York; Allard (1960) "Principles of Plant Breeding", John Wiley and Sons, Inc., Nueva York).

El desarrollo de variedades cultivadas híbridas de diversas especies de plantas depende de la capacidad para conseguir una polinización cruzada cuasi-completa entre los progenitores. Esto se consigue de modo muy sencillo haciendo que una de las líneas progenitoras exhiba esterilidad masculina (es decir, en la cual está ausente el polen o no es funcional), por ejemplo, por extirpación manual de las anteras de uno de los progenitores o proporcionando a uno de dichos progenitores genes citoplásmicos o nucleares existentes naturalmente que impiden el desarrollo y/o la función de las anteras y/o el polen, utilizando técnicas clásicas de reproducción (para una revisión de la genética de la esterilidad masculina en las plantas, véase Kaul (1988) "Male Sterility in Higher Plants", Springer Verlag, Nueva York).

Para plantas híbridas en las cuales la semilla es el producto cosechado (v.g. cereales y colza oleaginosa), en la mayoría de los casos es necesario también asegurar que la fertilidad de las plantas híbridas está plenamente restaurada. En plantas en las cuales la esterilidad masculina se halla bajo control genético, esto requiere el uso de genes que puedan restaurar la fertilidad masculina. Por consiguiente, el desarrollo de variedades cultivadas híbridas depende principalmente de la disponibilidad de genes de esterilidad y restauradores adecuados y eficaces.

Se conocen loci nucleares endógenos para la mayoría de las especies de plantas que contienen genotipos que producen esterilidad masculina, y generalmente, dichos loci precisan ser homocigóticos para alelos recesivos particulares a fin de dar como resultado un fenotipo de esterilidad masculina. La presencia de un alelo con fertilidad masculina dominante en dichos loci da como resultado la fertilidad masculina.

Recientemente, se ha demostrado que puede inducirse esterilidad masculina en una planta proporcionando a la planta un genotipo de esterilidad masculina nuclear que incluye un gen quimérico de esterilidad masculina que comprende una secuencia de DNA (o DNA de esterilidad masculina) que codifica, por ejemplo, un producto citotóxico (tal como una RNasa) y bajo el control de un promotor que es predominantemente activo en un tejido seleccionado de los órganos reproductores masculinos de la planta. En este sentido, se ha demostrado que son particularmente útiles para este propósito promotores específicos de tapete, tales como el promotor del gen TA29 de Nicotiana tabacum, (Mariani et al (1990) Nature 347: 737; publicación de Patente Europea ("EP") 0.344.029). Proporcionando al genoma nuclear de la planta dicho gen de esterilidad masculina, se crea un locus de esterilidad masculina nuclear artificial que contiene el genotipo de esterilidad masculina artificial que da como resultado una planta con esterilidad masculina.

Adicionalmente, se ha demostrado en fecha reciente que puede restaurarse la fertilidad masculina a dicha planta con esterilidad masculina nuclear con un gen quimérico restaurador de la fertilidad que comprende otra secuencia de DNA (o DNA restaurador de la fertilidad) que codifica, por ejemplo, una proteína que inhibe la actividad del producto citotóxico o impide de cualquier otro modo que el producto citotóxico sea activo al menos en el tejido seleccionado de los órganos reproductores masculinos de la planta (documento EP 0.412.911). Por ejemplo, el gen de barnasa de Bacillus amyloliquefaciens codifica una RNasa (Barnasa) que puede ser inhibida por una proteína (Barstar) que es codificado por el gen barstar de B. amyloliquefaciens. Por consiguiente, el gen de barnasa puede utilizarse para la construcción de un gen quimérico de esterilidad masculina mientras que el gen barstar puede utilizarse para la construcción de un gen quimérico restaurador de la fertilidad. Experimentos realizados en diferentes especies de plantas (v.g., colza oleaginosa) han demostrado que dicho gen quimérico barstar puede restaurar plenamente la fertilidad masculina de líneas con esterilidad masculina en las cuales la esterilidad masculina se debía a la presencia de un gen de barnasa quimérico (EP 0.412.911: Mariani et al (1991) Proceedings of the CCIRC Rapeseed Congress, 9-11 de julio de 1991, Saskatoon, Saskatchewan, Canadá; Mariani et al (1992) Nature 357: 384). Por acoplamiento de un gen marcador, tal como un gen dominante de resistencia a los herbicidas (por ejemplo, el gen bar codificante de fosfinotricin-acetil-transferasa (PAT) que convierte la fosfinotricina herbicida en un compuesto no tóxico (De Block et al (1987) EMBO J. 6: 2513), al gen quimérico restaurador de la esterilidad y/o fertilidad masculina, pueden implementarse sistemas de reproducción que seleccionan poblaciones uniformes de plantas con esterilidad masculina (documentos EP 0.334.029; EP 0.412.911).

La producción de semillas híbridas de cualquier variedad cultivada particular de una especie de planta requiere: 1) el mantenimiento de pequeñas cantidades de semilla pura de cada progenitor endogámico y 2) la preparación de cantidades mayores de semilla de cada progenitor endogámico. Dichas cantidades mayores de semilla podrían obtenerse normalmente por varias tandas (usualmente dos) de multiplicación de semillas, partiendo de una pequeña cantidad de semilla pura ("semilla básica") y conduciendo, en cada tanda de multiplicación, a una mayor cantidad de semillas del progenitor endogámico y finalmente a un stock de semillas en el progenitor endogámico ("semillas progenitoras" o "semillas base") que se encuentran en una cantidad suficiente para ser plantada a fin de producir las cantidades deseadas de semillas híbridas. Por supuesto, en cada tanda de multiplicación de semillas, se requieren áreas de plantación (campos) mayores.

A fin de mantener y aumentar un pequeño stock de semillas de plantas con esterilidad masculina, ha sido necesario cruzar las plantas con esterilidad masculina progenitoras con plantas progenitoras normales productoras de polen. La descendencia de un cruzamiento de este tipo será en todos los casos una mezcla de plantas con esterilidad masculina y con fertilidad masculina, y las últimas tendrán que separarse de las primeras. En el caso de las plantas con esterilidad masculina que contienen un locus artificial de esterilidad masculina como se ha descrito arriba, dicha separación puede verse facilitada enlazando genéticamente el gen quimérico de esterilidad masculina a un gen marcador adecuado, tal como el gen bar, que permite la identificación y separación fácil de las plantas con fertilidad masculina. El documento EP 0.198.288 y la Patente U.S. 4.717.219, por comparación, describen métodos para enlazar tales genes marcadores (que pueden ser marcadores visibles o marcadores condicionales dominantes) a loci nucleares endógenos que contienen genotipos de esterilidad masculina.

Sin embargo, incluso cuando se enlazan genes marcadores adecuados a genotipos de esterilidad masculina, el mantenimiento de las plantas progenitoras con esterilidad masculina requiere todavía la separación del campo de un número sustancial de plantas. Por ejemplo, en los sistemas que utilizan un gen de resistencia a los herbicidas (v.g., el gen bar) enlazado a un gen quimérico de esterilidad masculina, únicamente la mitad del stock progenitor dará como resultado plantas con esterilidad masculina, requiriendo así la separación de las plantas con fertilidad masculina por pulverización de herbicida antes de la floración. En cualquier campo dado, la separación de las plantas con fertilidad masculina reduce eficazmente el rendimiento potencial de semillas híbridas o el rendimiento potencial de plantas con esterilidad masculina durante cada tanda de multiplicación de semillas para la producción de semilla progenitora. Esto no es atractivo económicamente para muchas especies de cosecha importantes tales como maíz y colza oleaginosa. A fin de minimizar el número de plantas con fertilidad masculina que tienen que separarse, se han buscado plantas mantenedoras de la fertilidad masculina que, cuando se cruzan con una planta progenitora que tiene esterilidad masculina, producen un mínimo de descendencia, preferiblemente nula, con fertilidad masculina, minimizando o evitando con ello en conjunto la necesidad de separar dicha descendencia con fertilidad masculina. Para resolver un problema análogo, las Patentes US 3.710.511 y 3.861.079 han descrito procedimientos para producir y mantener una población homogénea de plantas con esterilidad masculina utilizando anormalidades cromosómicas específicas que se transmiten diferencialmente al óvulo y el esperma en las plantas.

Sumario de la invención

De acuerdo con esta invención, se proporciona una célula de una planta transgénica ("la planta mantenedora"), en la cual el genoma nuclear contiene, integrado de manera estable en él: 1) en un primer locus o locus de esterilidad masculina, un genotipo de esterilidad masculina en condición homocigótica; y 2) en un segundo locus o locus mantenedor, un gen mantenedor en condición heterocigótica; estando preferiblemente el locus de esterilidad masculina y el locus mantenedor no enlazados; siendo el gen mantenedor una secuencia de DNA extraña, preferiblemente una secuencia de DNA quimérica extraña, que contiene:

a): un gen restaurador de la fertilidad que comprende al menos:

i): un DNA restaurador de la fertilidad codificante de un RNA y/o proteína o polipéptido restaurador que, cuando se produce o se produce en exceso en algunas o la totalidad de las células, preferiblemente células de los estambres, de la planta, previene la expresión fenotípica de un genotipo con esterilidad masculina nuclear que haría que la planta exhibiera esterilidad masculina en ausencia de expresión del DNA restaurador de la fertilidad en algunas o todas las células de los estambres y

ii): un promotor restaurador capaz de dirigir la expresión del DNA restaurador de la fertilidad en al menos algunas o la totalidad de las células, preferiblemente las células de los estambres, de la planta, de tal modo que se impide la expresión fenotípica del genotipo de esterilidad masculina nuclear, encontrándose el DNA restaurador de la fertilidad en la misma unidad de transcripción que el promotor restaurador, y bajo el control del mismo, y

b): un gen de letalidad del polen que se expresa selectivamente en las microsporas y/o polen de la planta para producir polen no funcional y que comprende al menos:

iii): un DNA con letalidad del polen codificante de un RNA y/o proteína o polipéptido con letalidad del polen que, cuando se produce o se produce en exceso en las microsporas y/o el polen, altera significativamente su metabolismo, funcionamiento y/o desarrollo y

iv): un promotor específico del polen capaz de dirigir la expresión del DNA con letalidad del polen selectivamente en las microsporas y/o el polen de la planta, encontrándose el DNA con letalidad del polen en la misma unidad de transcripción que el promotor de polen, y bajo el control del mismo.

La célula de la planta mantenedora de esta invención comprende también preferiblemente, en especial en el locus mantenedor, al menos un primer gen marcador que comprende al menos:

v): un primer DNA marcador codificante de un primer RNA y/o proteína o polipéptido marcador que, cuando está presente al menos en un primer tejido específico o células específicas de la planta, hace que la planta sea fácilmente separable de otras plantas que no contienen el primer RNA, proteína o polipéptido marcador codificado por el primer DNA marcador al menos en el primer tejido específico o células específicas y

vi): un primer promotor marcador capaz de dirigir la expresión del primer DNA marcador al menos en el primer tejido específico o células específicas, encontrándose el primer DNA marcador en la misma unidad de transcripción que el primer promotor marcador, y bajo el control del mismo.

El genotipo de esterilidad masculina en la célula de la planta mantenedora de esta invención puede ser extraño o endógeno, pero preferiblemente es un gen de esterilidad masculina extraño, especialmente quimérico, que comprende:

1): un DNA de esterilidad masculina codificante de un RNA y/o proteína o polipéptido de esterilidad que, cuando se produce o se produce en exceso en una célula de los estambres de la planta en ausencia del RNA, proteína o polipéptido restaurador, altera significativamente el metabolismo, el funcionamiento y/o el desarrollo de la célula de los estambres y

2): un promotor de esterilidad capaz de dirigir la expresión del DNA de esterilidad masculina selectivamente en las células de los estambres de la planta, encontrándose el DNA de esterilidad masculina en la misma unidad de transcripción que el promotor de esterilidad, y bajo el control del mismo.

El genotipo de esterilidad masculina en la célula de la planta mantenedora de esta invención comprende preferiblemente, en especial en el locus de esterilidad masculina, al menos un segundo gen marcador que comprende al menos:

3): un segundo DNA marcador codificante de un segundo RNA y/o proteína o polipéptido marcador que, cuando está presente al menos en el segundo tejido específico o segundas células específicas de la planta, hace que la planta pueda separarse fácilmente de otras plantas que no contienen el segundo RNA, proteína o polipéptido marcador codificado por el segundo DNA marcador al menos en el segundo tejido específico o segundas células específicas y

4): un segundo promotor marcador capaz de dirigir la expresión del segundo DNA marcador al menos en el segundo tejido específico o segundas células específicas, encontrándose el segundo DNA marcador en la misma unidad de transcripción que el segundo promotor marcador, y bajo el control del mismo.

Asimismo de acuerdo con esta invención se proporcionan las plantas mantenedoras, las semillas de dichas plantas, y cultivos de células vegetales, todos los cuales están constituidos esencialmente por las células de esta invención.

Adicionalmente de acuerdo con esta invención se proporcionan el gen mantenedor y plásmidos que contienen el gen mantenedor, así como células hospedadoras bacterianas (v.g., E. coli o Agrobacterium) que contienen dichos plásmidos.

Aún más, de acuerdo con esta invención se proporciona un proceso para producir, preferiblemente aumentar, una producción homogénea de plantas con esterilidad masculina y sus semillas que contienen un gen de esterilidad masculina nuclear en condición homocigótica, comprendiendo el proceso el paso de cruzar las plantas con esterilidad masculina con las plantas mantenedoras de esta invención. Las semillas de las plantas con esterilidad masculina resultantes pueden cosecharse y cultivarse para producir plantas con esterilidad masculina. Las semillas híbridas pueden producirse luego por cruzamiento de las plantas con esterilidad masculina con plantas con fertilidad masculina de otra línea progenitora endogámica utilizadas como polinizadores.

Todavía adicionalmente de acuerdo con esta invención, se proporciona un proceso para producir, preferiblemente aumentar, una población de las plantas mantenedoras, que comprende el paso de autopolinización de las plantas mantenedoras.

Descripción detallada de la invención

Una planta con esterilidad masculina de esta invención es una planta de una especie dada con un genotipo de esterilidad masculina nuclear.

Una planta restauradora de esta invención es una planta de la misma especie de planta que contiene, dentro de su genoma nuclear, un gen restaurador de la fertilidad que es capaz de restaurar la fertilidad masculina en la descendencia que se obtiene de un cruzamiento entre la planta con esterilidad masculina y la planta restauradora y que contiene a la vez el genotipo de esterilidad masculina y el gen restaurador de la fertilidad.

Una planta restauradora de esta invención es una planta de la misma especie que posee fertilidad masculina y que contiene, dentro de su genoma nuclear, el genotipo de esterilidad masculina y el gen restaurador de la fertilidad.

Una planta progenitora o progenitor de esta invención es una planta que puede utilizarse para la producción de semillas híbridas. La planta hembra o planta progenitora de las semillas es el progenitor a partir del cual se cosechan las semillas híbridas. Para los propósitos de esta invención, el progenitor hembra será siempre una planta con esterilidad masculina. El progenitor macho o progenitor de polen es el progenitor que se utiliza para fertilizar la planta hembra. En muchos casos, el progenitor macho será también una planta restauradora.

Una línea es la progenie de una planta individual dada.

El genotipo de esterilidad masculina de esta invención es el genotipo de al menos un locus, preferiblemente un solo locus, en el genoma nuclear de una planta (a saber, el locus de esterilidad masculina), cuya composición alélica puede dar como resultado esterilidad masculina en la planta. Un genotipo de esterilidad masculina puede ser endógeno a la planta, pero generalmente se prefiere que el mismo sea extraño a la planta. Genotipos de esterilidad masculina extraños preferidos son aquéllos en los cuales el alelo responsable de la esterilidad masculina contiene un gen de esterilidad masculina extraño que comprende:

1): un DNA de esterilidad masculina codificante de un RNA y/o proteína o polipéptido de esterilidad que, cuando se produce o se produce en exceso en una célula de los estambres de la planta, altera significativamente el metabolismo, el funcionamiento y/o el desarrollo de la célula de los estambres y

: Un gen de esterilidad masculina de este tipo es siempre un alelo dominante en un locus extraño de esterilidad masculina. El alelo recesivo corresponde a la ausencia del gen de esterilidad masculina en el genoma nuclear de la planta.

: DNAs de esterilidad masculina extraños y promotores de esterilidad preferidos que pueden utilizarse en los genes de esterilidad masculina en plantas progenitoras hembra y plantas mantenedoras de esta invención han sido descritos en el documento EP 0.344.029. Un DNA de esterilidad masculina particularmente útil codifica Barnasa (Hartley (1988) J. Mol. Biol. 202: 913). Promotores de esterilidad particularmente útiles son promotores específicos de tapete tales como: el promotor del gen TA29 de Nicotiana tabacum (documento EP 0.344.029) que puede utilizarse en tabaco, colza oleaginosa, lechuga, achicoria, maíz y otras especies de plantas; los promotores PT72, PT42 y PE1 del arroz, cuyas secuencias se dan en SEQ ID No: 7, SEQ ID No: 8 y SEQ ID No: 9, del Listado de Secuencias y que pueden utilizarse en arroz y otras especies de plantas (Solicitud PCT PCT/EP 92/00274); y el promotor PCA55 del maíz, cuya secuencia se da en SEQ ID No: 10 que puede utilizarse en maíz y otras especies de plantas (Solicitud PCT PCT/EP 92/00275).

: Un genotipo de esterilidad masculina endógeno preferido es uno en el que un alelo recesivo ("m") en condición homocigótica (m/m) en un locus de esterilidad masculina produce esterilidad masculina. En un locus de esterilidad masculina, podría estar codificada fertilidad masculina en caso contrario por un alelo dominante correspondiente ("M"). Un genotipo de esterilidad masculina de esta clase se conoce en muchas especies de plantas (véase Kaul (1988) supra; y los números de 1992 de Maize Genetics Cooperation Newsletter, publicada por el Departamento de Agronomía y el Departamento de Agricultura U.S., Universidad de Missouri, Columbia, Missouri, EE.UU.). Las secuencias de DNA en el genoma nuclear de una planta correspondiente a los alelos m y M pueden identificarse por marcación de genes, es decir, por mutagénesis de inserción utilizando transposones, o por medio de integración de T-DNA (véase, v.g., Wienand y Saedler (1987) en "Plant DNA Infectious Agents", recopilado por T.H. Hohn y J. Schell, Springer Verlag, Nueva York, p. 205; Shepherd (1988) en "Plant Molecular Biology; A Practial Approach", IRL Press, p. 187; Teeri et al (1986) EMBO J. 5: 1755).

DNAs restauradores de la fertilidad y promotores de restauradores que pueden utilizarse en los genes mantenedores de esta invención con un genotipo de esterilidad masculina han sido descritos en el documento EP 0.412.911. A este respecto, son particularmente útiles genes restauradores de la fertilidad en los cuales el DNA restaurador de la fertilidad codifica Barstar (Hartley (1988) J. Mol. Biol. 202: 913) y se encuentra bajo control de promotores específicos de tapete, tales como los descritos arriba como promotores de esterilidad. En particular, se cree que un DNA restaurador de la fertilidad codificante de un mutante de Barstar, en el cual el residuo cisteína de la posición 40 está reemplazado por serina (Hartley (1989), TIBS 14: 450), funciona mejor en la restauración de la fertilidad en las plantas restauradas de algunas especies.

Cuando un genotipo de esterilidad masculina endógeno es homocigótico para un alelo recesivo m, se prefiere que el gen restaurador de la fertilidad sea el alelo dominante M de dicho genotipo de esterilidad masculina, preferiblemente bajo el control de su propio promotor. El DNA correspondiente a dicho alelo dominante de este tipo, con inclusión de su promotor natural, puede aislarse del genoma nuclear de la planta por medio de marcación de genes como se ha descrito arriba.

Los DNAs de letalidad del polen que se utilizan en los genes de letalidad del polen de esta invención codifican preferiblemente un RNA y/o una proteína o polipéptido que, cuando se expresa en microsporas o polen, altera significativamente su metabolismo, funcionamiento y/o desarrollo. A este respecto, los DNAs de letalidad del polen pueden codificar RNAs, proteínas o polipéptidos tales como los que son codificados por los DNAs de esterilidad masculina descritos en el documento EP 0.344.029. Son particularmente interesantes DNAs de esterilidad masculina que codifican ribonucleasas (documento EP 0.344.029) tales como la RNasa T1 de Aspergillus oryzae (Quaas et al (1988) Eur. J. Biochem. 173: 617) o la Barnasa de Bacillus amyloliquefaciens (Hartley (1988) J. Mol. Biol. 202: 913).

A fin de que el DNA de letalidad del polen se exprese selectivamente en las microsporas o en el polen de la planta mantenedora, se prefiere que el promotor específico del polen, que controla el DNA de letalidad del polen en el gen de letalidad del polen, sea un promotor capaz de dirigir la expresión génica selectivamente en las microsporas y/o el polen de la planta. Un promotor específico del polen de este tipo puede ser un promotor endógeno o un promotor extraño y puede ser del genoma nuclear o del genoma mitocondrial o de los cloroplastos de una célula vegetal, pero en cualquier caso, el promotor específico del polen es extraño en el genoma nuclear de la planta que se transforma. Preferiblemente, el promotor específico del polen hace que el DNA de letalidad del polen se exprese únicamente en las microsporas y/o el polen, es decir, después de la meiosis de los microsporocitos en las anteras. El promotor específico del polen puede seleccionarse y aislarse de una manera bien conocida a partir de una especie de planta, preferiblemente la especie de planta que se desea exhiba esterilidad masculina, de tal modo que el promotor específico del polen dirija la expresión del DNA de letalidad del polen selectivamente en las microsporas y/o el polen a fin de destruir o discapacitar las microsporas y/o el polen en los que se expresa el gen de letalidad del polen. El promotor específico del polen se selecciona y aísla también preferiblemente de tal modo que el mismo sea eficaz para prevenir la expresión del DNA de letalidad del polen en otros tejidos de la planta. Por ejemplo, un promotor específico del polen endógeno adecuado puede identificarse y aislarse en una planta, que se desea dotar de esterilidad masculina, por:

1.: búsqueda de un mRNA que está presente únicamente en la planta durante el desarrollo de sus microsporas y/o polen;

2.: opcionalmente, aislamiento del mRNA específico de las microsporas y/o el polen;

3.: preparación y aislamiento de un cDNA a partir del mRNA específico de las microsporas y/o el polen;

4.: utilización de este cDNA como sonda para identificar regiones en el genoma de la planta que contienen DNA codificante del DNA específico de microsporas y/o polen correspondiente o, alternativamente, utilización de reacciones en cadena de polimerasa inversas para la amplificación geométrica de las secuencias de DNA que flanquean, aguas arriba y aguas abajo, una región central seleccionada del DNA genómico correspondiente a la secuencia del cDNA específico de microsporas y/o polen; y

5.: identificación de la porción del genoma de la planta que se encuentra aguas arriba (es decir 5') del DNA codificante del mRNA específico de microsporas y/o polen y que contiene el promotor de este DNA.

Ejemplos de tales promotores específicos de polen son bien conocidos (véase MacCormick (1991) TIG 7: 298). A este respecto, Hamilton et al (1989) Sex. Plant Reprod. 2: 208 describe un clon específico del polen ("Zmg13") de la línea endogámica W22 del maíz, y el uso de las secuencias promotoras del clon para dirigir la expresión específica de polen en el tabaco ha sido descrito por Guerrero et al (1990) Mol. Gen. Genet. 224: 161). Otros promotores específicos de polen que se cree análogamente que son útiles son: el promotor del gen correspondiente al cDNA NTPc303 específico del polen de Nicotiana tabacum, descrito por Weterings et al (1992) Plant Mol. Biol. 18: 1101; y el promotor del gen correspondiente al cDNA B54 específico del polen de Brassica napus, descrito por Shen y Hsu (1992) Mol. Gen. Genet. 234: 379.

Sí el DNA restaurador de la fertilidad en el gen restaurador de la fertilidad del gen mantenedor se expresa también en microsporas y/o polen al mismo tiempo que se expresa el DNA de letalidad del polen (debido por ejemplo a la actividad del promotor restaurador en las microsporas y/o el polen), se prefiere que el DNA de letalidad del polen sea diferente del DNA de esterilidad masculina (cuya expresión se desea prevenir por expresión del DNA restaurador de la fertilidad del gen mantenedor). Por ejemplo, si el DNA de la esterilidad masculina codifica Barnasa en las plantas con esterilidad masculina que se desea mantener, el DNA restaurador de la fertilidad en el gen mantenedor debería codificar Barstar. Así, si el promotor restaurador en el gen mantenedor dirige también la expresión del DNA restaurador de la fertilidad en las microsporas y/o el polen y al mismo tiempo que se expresa el DNA de letalidad del polen, el DNA de letalidad del polen no debería, preferiblemente, codificar barnasa sino más bien, por ejemplo, otra RNAsa tal como la RNAsa T1.

DNAs marcadores primero y segundo y promotores marcadores primero y segundo que pueden utilizarse en los genes marcadores primero y segundo de esta invención son también bien conocidos (documento EP 0.344.029; documento EP 0.412.911). A este respecto, se prefiere que los DNAs marcadores primero y segundo sean diferentes, aunque los promotores marcadores primero y segundo pueden ser iguales.

El gen restaurador de la fertilidad, el gen de esterilidad masculina, el gen de letalidad del polen, y los genes marcadores primero y segundo de acuerdo con esta invención son generalmente secuencias de DNA extraño, preferiblemente secuencias de DNA extraño quiméricas. Tales secuencias de DNA extraño están provistas preferiblemente de secuencias de regulación de la transcripción 3' y señales de poliadenilación adecuadas, aguas abajo (es decir 3') de sus respectivos DNA restaurador de la fertilidad respectivo, DNA de esterilidad masculina, DNA de letalidad del polen, y DNAs marcadores primero y segundo. A este respecto, pueden utilizarse señales de terminación de la transcripción y poliadenilación extrañas o endógenas, adecuadas para obtener la expresión de dichas secuencias de DNA. Por ejemplo, pueden utilizarse los extremos 3' extraños no traducidos de los genes, tales como el gen 7 (Velten y Schell (1985) Nucl. Acids Res. 13: 6698), el gen de la octopina-sintasa (De Greve et al (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1: 499; Gielen et al (1983) EMBO J. 3: 835; Ingelbrecht et al (1989) The Plant Cell 1: 671), el gen de la nopalina-sintasa de la región T-DNA del plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens (De Picker et al (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1: 561), el gen de la calcona-sintasa (Sommer y Saedler (1986) Mol. Gen. Genet. 202: 429-434), y la unidad de transcripción 19S/35S de CaMV (Mogen et al (1990) The Plant Cell 2: 1261-1272).

Por "extraño" con relación a un gen o genotipo de esta invención se entiende que el gen o genotipo contiene una secuencia de DNA extraño tal como un DNA de esterilidad masculina, un DNA restaurador de la fertilidad, un DNA de letalidad del polen, o un DNA marcador y/o un promotor extraño tal como un promotor de esterilidad, un promotor restaurador, un promotor específico del polen o un promotor marcador. Por "extraño" con relación a cualquier secuencia de DNA, tal como una secuencia codificante o un promotor, en un gen o genotipo de esta invención se entiende que dicho DNA no se encuentra en el mismo entorno genómico en una célula vegetal, transformada con un DNA de este tipo de acuerdo con esta invención, que dicho DNA cuando el mismo se encuentra naturalmente en la célula de la planta, bacteria, animal, hongo, virus o análogo, del que se origina dicho DNA. Esto significa, por ejemplo, que un DNA restaurador de la fertilidad, DNA de esterilidad masculina, DNA de letalidad del polen, o DNA marcador extraño puede ser: 1) un DNA nuclear en una planta de origen; 2) endógeno a la célula de la planta transformada (es decir, procedente de una planta de origen que tiene el mismo genotipo que la planta que se transforma); y 3) dentro de la misma unidad transcripcional como su propio promotor endógeno y señales de regulación de la transcripción del extremo 3' (de la planta de origen) en el gen o genotipo extraño en la célula de la planta transformada; pero 4) estar insertado en el genoma nuclear de la célula de la planta transformada en un lugar diferente del lugar en que se encontraba en la planta de origen de tal modo que ya no está rodeado en la célula de la planta transformada por los genes que lo rodeaban naturalmente en la planta de origen. Análogamente, un DNA restaurador de la fertilidad, DNA de esterilidad masculina, DNA de letalidad del polen, o DNA marcador extraño puede ser también, por ejemplo: 1) un DNA nuclear en una planta de origen; y 2) endógeno para la célula de la planta transformada; pero 3) encontrarse en la misma unidad de transcripción que un promotor endógeno diferente (es decir, no propio) y/o señales de regulación de la transcripción del extremo 3' en un gen quimérico o genotipo de esta invención en una célula de la planta transformada. Un DNA restaurador de la fertilidad, DNA de esterilidad masculina, DNA de letalidad del polen o DNA marcador extraño puede ser también, por ejemplo: 1) un DNA nuclear en una planta de origen; y 2) endógeno a la célula de la planta transformada; pero 3) que se encuentra en la misma unidad de transcripción que un promotor heterólogo y/o señales de regulación de la transcripción del extremo 3' en un gen o genotipo quimérico extraño de esta invención en una célula de la planta transformada. Un DNA restaurador de la fertilidad, un DNa de esterilidad masculina, DNA de letalidad del polen, o DNA marcador extraño puede ser también, por ejemplo, heterólogo a la célula de la planta transformada y encontrarse de la misma unidad de transcripción que un promotor endógeno y/o señales de regulación de la transcripción 3' (v.g., procedentes del genoma nuclear de una planta con el mismo genotipo que la planta que se transforma) en una secuencia de DNA quimérico extraña de esta invención en una célula de la planta transformada. Preferiblemente, cada DNA restaurador de la fertilidad, DNA de esterilidad masculina, DNA de letalidad del polen, y DNA marcador de esta invención es heterólogo a la célula de la planta que se transforma.

Por "heterólogo" con relación a un DNA, tal como un DNA restaurador de la fertilidad, un DNA de esterilidad masculina, un DNA de letalidad del polen, un DNA marcador, un promotor restaurador de la fertilidad, un promotor de esterilidad, un promotor específico del polen o un promotor marcador o cualquier otra secuencia de DNA en un gen o un genotipo de esta invención debe entenderse que dicho DNA no se encuentra naturalmente en el genoma nuclear de las células de una planta con el mismo genotipo que la planta que se transforma. Ejemplos de DNAs heterólogos incluyen DNAs de cloroplastos y mitocondriales obtenidos a partir de una planta que tiene el mismo genotipo que la planta que se transforma, pero ejemplos preferidos son DNAs de cloroplastos, mitocondriales, y nucleares de plantas que tienen un genotipo diferente que la planta que se transforma, DNAs de genomas animales y bacterianos, y DNAs cromosómicos y plasmídicos de genomas fúngicos, bacterianos y víricos.

Por "quimérico" con relación a una secuencia de DNA extraña de esta invención se entiende que al menos una de sus secuencias codificantes: 1) no se encuentra naturalmente bajo el control del promotor presente en la secuencia de DNA extraña; y/o 2) no se encuentra naturalmente en el mismo locus genético que al menos uno de sus DNAs marcadores asociados. Ejemplos de secuencias de DNA quiméricas extrañas de esta invención comprenden: un DNA de letalidad del polen de origen bacteriano bajo el control de un promotor específico del polen de origen vegetal; y un DNA de letalidad del polen de origen vegetal bajo el control de un promotor específico del polen de origen vegetal y en el mismo locus genético que un DNA marcador de origen bacteriano.

Por "endógeno" con respecto a un gen o genotipo de esta invención se entiende que el mismo no es extraño.

Los genes y genotipos extraños de esta invención, tales como el gen y genotipo de esterilidad masculina, el gen restaurador de la fertilidad y el gen de letalidad del polen, pueden describirse como cualquier otro genotipo: las letras mayúsculas denotan la presencia de los genes y genotipos extraños (el alelo dominante) mientras que las letras minúsculas denotan su ausencia (el alelo recesivo). Por consiguiente, en esta descripción de la invención, "S" y "s" denotarán la presencia y ausencia respectivas del gen de esterilidad masculina, "R" y "r" denotarán la presencia y ausencia respectivas del gen restaurador de la fertilidad, y "P" y "p" denotarán la presencia y ausencia respectivas del gen mantenedor.

Para un genotipo de esterilidad masculina endógeno de esta invención, "m" denotará el alelo recesivo, y "M" denotará el alelo dominante. Así, el alelo recesivo m en condición homocigótica (m/m) en un locus de esterilidad masculina daría como resultado esterilidad masculina, y el alelo dominante M, cuando está presente en un locus de esterilidad masculina sea en condición homocigótica o heterocigótica, da como resultado fertilidad masculina.

La célula de una planta, particularmente una planta susceptible de ser infectada con Agrobacterium tal como la mayoría de las plantas dicotiledóneas (v.g. Brassica napus), puede transformarse utilizando un vector que es un plásmido Ti desactivado que contiene el gen de esterilidad masculina y/o el gen restaurador de la fertilidad y/o el gen de letalidad del polen y/o el gen mantenedor y/o el o los genes marcadores de esta invención y soportados por Agrobacterium. Esta transformación puede llevarse a cabo utilizando los procedimientos descritos, por ejemplo, en los documentos EP 0.116.718 y EP 0.270.822. Vectores preferidos del plásmido Ti contienen una secuencia de DNA extraña de esta invención entre las secuencias límite, o al menos localizadas a la izquierda de la secuencia límite derecha, del T-DNA del plásmido Ti. Por supuesto, pueden utilizarse otros tipos de vectores para transformar la célula de la planta, utilizando procedimientos tales como transferencia directa de genes (como se describe, por ejemplo, en el documento EP 0.233.247), transformación mediada por polen (como se describe, por ejemplo, en el documento EP 0.270.356, la publicación PCT WO 85/01856, y la Patente U.S. 4.684.611), transformación mediada por virus de RNA vegetal (como se describe, por ejemplo, en el documento EP 0.067.553 y la Patente U.S. 4.407.956) y transformación mediada por liposomas (como se describe, por ejemplo, en la Patente U.S. 4.536.475). Células de plantas monocotiledóneas, tales como los cereales principales que incluyen maíz, arroz, trigo, cebada y centeno, pueden transformarse como se describe en la Solicitud PCT PCT/EP 91/02198. En el caso en que la planta a transformar es el maíz, pueden utilizarse también otros métodos desarrollados recientemente tales como, por ejemplo, los métodos descritos para ciertas líneas de maíz por Fromm et al (1990) Bio/Technology 8: 833, Gordon-Kamm et al (1990) Bio/Technology 2: 603 y Gould et al (1991) Plant Physiol. 95: 426. En el caso en que la planta a transformar es el arroz, pueden utilizarse también métodos desarrollados recientemente tales como, por ejemplo, el método descrito para ciertas líneas de arroz por Shimamoto et al (1990) Nature 338: 274, Datta et al (1990) Bio/Technology 8: 736 y Hayashimoto et al (1990) Plant Physiol. 93: 857.

La célula así transformada puede regenerarse en una planta madura, y la planta transformada resultante puede utilizarse en un esquema de reproducción convencional para producir más plantas transformadas con las mismas características o para introducir el gen de esterilidad masculina, el gen restaurador de la fertilidad, el gen de letalidad del polen, los genes marcadores y/o el gen mantenedor de esta invención en otras variedades de la misma especie o especies de plantas afines. Las semillas obtenidas a partir de dichas plantas contienen el o los genes de esta invención como una inserción genómica estable.

La planta mantenedora de esta invención es de la misma especie que una línea de plantas con esterilidad masculina y puede utilizarse para el mantenimiento de la línea de esterilidad masculina, es decir para mantener una población homogénea de plantas con esterilidad masculina y un stock de semillas puras del progenitor femenino. La planta mantenedora de esta invención es en sí misma una planta en la cual se ha restaurado la fertilidad masculina y cuyo genoma contiene a la vez un genotipo de esterilidad masculina y, en el locus mantenedor, un gen restaurador de la fertilidad de esta invención.

Si se dispone de una línea de plantas con un genotipo homocigótico de esterilidad masculina (A^{m/m} o A^{S/S}), puede obtenerse directamente una planta mantenedora para la línea de esterilidad masculina por transformación de una planta de la línea con esterilidad masculina con el gen mantenedor de esta invención y selección posterior de aquellas plantas transgénicas que son plantas en las que se ha restablecido la fertilidad masculina y en las cuales el gen mantenedor está integrado de manera estable en el genoma nuclear de tal modo que el locus genético del genotipo de esterilidad masculina y del gen mantenedor no están enlazados y se segregan independientemente.

Si el genotipo de esterilidad masculina es extraño a la línea de la planta, pueden seguirse estrategias alternativas. Por ejemplo, la planta mantenedora de la presente invención puede obtenerse por: transformación de una célula vegetal de la línea de la planta (A) con el gen mantenedor de esta invención (P); seguido por regeneración, a partir de la célula vegetal así transformada, de una planta transgénica que contiene, integrado de manera estable en su genoma, el gen mantenedor. Una planta transgénica (A)^{P/p}) de este tipo puede cruzarse luego como planta hembra con una planta A^{S/s, \ R/r} de la misma línea, que contiene en loci separados en su genoma un gen de esterilidad masculina (S) y un gen restaurador de la fertilidad correspondiente (R), ambos en condición hetero-cigótica, pero que carece del gen mantenedor. Así, el cruzamiento es de hecho: A^{S/s,R/r,p/p} (masculino) x A^{s/s,r/r,P/p} (femenino), y los descendientes que tienen con el genotipo A^{S/s,r/r,P/p} (o, en lo sucesivo, "A^{S/s,P/p}" por conveniencia) se seleccionan y se autopolinizan. Una octava parte de los descendientes que tienen el genotipo deseado (A^{S/S,p/p}) pueden utilizarse como plantas con esterilidad masculina a mantener.

El aislamiento de plantas con genotipos deseados puede realizarse por medio de ensayos de cruzamiento convencionales (véase, v.g., Fehr (1987) supra), preferiblemente complementados por detección de la presencia de genes específicos al nivel del DNA, v.g., por medio de amplificación de fragmentos de DNA por la reacción en cadena de la polimerasa, por análisis de transferencia Southern y/o por análisis fenotípico respecto a la presencia y expresión de los genes marcadores primero o segundo de esta invención.

El cruzamiento de una planta con esterilidad masculina que contiene un genotipo de esterilidad masculina en condición homocigótica (A^{S/S} o A^{m/m}) con una planta mantenedora de esta invención (A^{S/S,P/p} o A^{m/m,P/p}, respectivamente) da como resultado una población de semillas que contienen todas ellas el genotipo de esterilidad masculina en condición homocigótica (A^{S/S} o A^{m/m}, respectivamente) dado que el gen mantenedor no es transmitido por el polen. Esta propiedad puede utilizarse ventajosamente en el mantenimiento de la semilla básica y en la multiplicación de semillas básicas para la producción final de las semillas progenitoras.

Las plantas mantenedoras de esta invención (A^{S/S,P/p} o A^{m/m,P/p}) pueden mantenerse por sí mismas por autopolinización. Los descendientes de dicha autopolinización estarán constituidos en un 50% por plantas mantenedoras con fertilidad masculina (A^{S/S,P/p} o A^{m/m,P/p}, respectivamente) y en un 50% por plantas con esterilidad masculina que contienen el genotipo de esterilidad masculina en condición homocigótica (A^{S/S} o A^{m/m}, respectivamente). Si se desea, las plantas con esterilidad masculina pueden separarse manualmente sobre la base del fenotipo de esterilidad masculina o, si el gen mantenedor comprende un primer gen marcador adecuado, preferiblemente un primer gen marcador cuya expresión confiere a la planta resistencia a los herbicidas, por utilización de la expresión fenotípica del primer gen marcador (v.g. por aplicación de herbicida a la descendencia de tal modo que las plantas con esterilidad masculina que carecen del gen de resistencia a los herbicidas son destruidas mientras que las plantas mantenedoras que tienen el gen resistente a los herbicidas sobreviven).

Así, la planta mantenedora de esta invención puede utilizarse fácilmente para mantener una población homogénea de plantas con esterilidad masculina. A este respecto, las semillas básicas de un progenitor femenino de una especie de planta dada pueden cruzarse con un progenitor masculino apropiado para producir semillas híbridas. Asimismo, la planta mantenedora de esta invención puede utilizarse económicamente para multiplicar las semillas básicas de un progenitor femenino de una especie de planta dada, a fin de obtener cantidades suficientes de semillas progenitoras femeninas que pueden cruzarse con un progenitor masculino apropiado para producir cantidades deseadas de semillas híbridas.

Una línea de esterilidad masculina, que se mantiene y multiplica por el uso de las plantas mantenedoras de esta invención, puede utilizarse para la producción de semillas híbridas. En principio, la línea con esterilidad masculina (A^{S/S}) puede cruzarse directamente con otra línea progenitora masculina (B^{S/S}) para producir semillas híbridas (AB^{S/s}). Sin embargo, dado que todas las plantas híbridas presentan esterilidad masculina, no tendrá lugar reproducción ni producción alguna de semillas. Esto no constituye un problema si la semilla no es el producto cosechado (v.g., en el caso de la lechuga) pero en los casos en que la semilla es el producto cosechado (v.g., como sucede en el maíz y la colza oleaginosa), debería restaurarse al menos parcialmente la fertilidad masculina en las plantas híbridas. Esto puede realizarse por cruzamiento de la línea con esterilidad masculina con una línea progenitora con fertilidad masculina (v.g., B^{R/R}) que es también una línea restauradora, es decir que contiene también un gen restaurador de la fertilidad (R). Los híbridos producidos (AB^{S/s,R/r}) exhibirán fertilidad masculina en su totalidad. En una alternativa, la línea con esterilidad masculina (A^{S/S}) puede cruzarse primeramente con la línea de fertilidad masculina (A^{S/S}) inmediatamente antes de las producciones de semillas híbridas. Esto presenta la ventaja de proporcionar una multiplicación adicional de la línea progenitora femenina. La descendencia (A^{S/s}) puede cruzarse luego con una línea progenitora con fertilidad masculina adecuada (B^{s/s,r/r}) para producir semillas híbridas que exhiben en un 50% fertilidad masculina. Si se desean semillas híbridas con 100% de fertilidad masculina, la descendencia puede cruzarse con una línea progenitora masculina restauradora adecuada (B^{s/s,R/R}).

En el caso de una línea con esterilidad masculina en la cual la esterilidad masculina es debida a un genotipo de esterilidad masculina endógeno (A^{m/m}) en un locus de esterilidad masculina, pueden producirse fácilmente semillas híbridas por cruzamiento de la línea con esterilidad masculina (A^{m/m}) con una línea que es homocigótica con respecto al alelo dominante (de fertilidad masculina) endógeno en dicho locus de esterilidad masculina (B^{M/M}). Todos los descendientes híbridos de este cruzamiento tendrán el genotipo AB^{M/m} y serán fértiles.

Las plantas mantenedoras de esta invención pueden utilizarse también como plantas polinizadoras (es decir, con fertilidad masculina) en un cruzamiento con plantas de tipo salvaje (A^{s/s,p/p}) de la misma línea endogámica. La progenie de este cruzamiento presentará en su totalidad esterilidad masculina y será heterocigótica par el genotipo de esterilidad masculina (A^{S/s,p/p}). La progenie puede utilizarse por tanto directamente para la producción de semillas híbridas por cruzamiento con una línea de planta polinizadora B (B^{s/s,p/p}). Este esquema requiere únicamente una esterilización masculina de las plantas de tipo salvaje, por ejemplo por eliminación manual de las anteras (v.g., en el maíz) o por utilización de un gametocida masculino.

Por supuesto, por utilización de las plantas mantenedoras de esta invención para mantener una población homogénea de plantas que son homocigóticas con respecto a un alelo de esterilidad masculina (sea dominante o recesivo) que está codificado en el genoma nuclear, las plantas mantenedoras adquieren muchas de las características de las plantas de una línea con esterilidad masculina citoplásmica. Sin embargo, dichas plantas no presentan una de las desventajas principales de las plantas con esterilidad masculina citoplásmicas, a saber la uniformidad citoplásmica de las diversas líneas de esterilidad masculina que ha conducido a problemas graves en el maíz (véase Craig (1977) en "Corn and Corn Improvement", G.F. Sprague, compilador, American Society of Agronomy, Inc., Editor, p. 671).

Así, el gen mantenedor de esta invención, una vez introducido en una línea particular de una especie de planta, puede introducirse siempre en cualquier otra línea por retrocruzamiento, pero dado que el gen mantenedor puede transmitirse únicamente a través de un óvulo, el mismo estará siempre asociado con el citoplasma de la línea en la que se introdujo inicialmente. Sin embargo, dado que una línea de plantas mantenedora se utiliza solamente para mantenimiento de una línea con esterilidad masculina y no como progenitor femenino para la producción de semillas híbridas, la semillas híbridas contendrá siempre el citoplasma del progenitor femenino, como se desea.

Los ejemplos siguientes ilustran esta invención. A no ser que se indique otra cosa, todos los procedimientos experimentales para manipulación de DNA recombinante se llevaron a cabo por los procedimientos estandarizados descritos en Sambrook et al (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., Estados Unidos. Todas las regiones en cadena de la polimerasa ("PCR") se realizaron en condiciones convencionales, utilizando la polimerasa Vent^{TM} (Cat. No. 254L - Biolabs New England, Beverley, MA 01915, Estados Unidos) aislada de Thermococcus litoralis (Neuner et al (1990) Arch. Microbiol. 153: 205-207). Se diseñaron los oligonucleótidos por los métodos descritos por Kramer y Fritz (1968) Methods in Enzymology 154: 350 y se sintetizaron por el método del fosforamidito (Beaucage y Caruthers (1981) Tetrahedron Letters 22: 1859) en un sintetizador de DNA Biosystems 380A (Applied Biosystems B.V., Maarssen, Países Bajos).

Las cepas bacterianas y plásmidos siguientes, utilizados en los ejemplos, están disponibles de la Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen ("DSM"), Mascheroder Weg 1B, Braunschweig, Alemania:

Cepa bacteriana	Plásmido	DSM No.	Fecha de Depósito
E. coli WK6	pMa5-8	DSM 4567	3 de mayo de 1988
E. coli WK6	PMc5-8	DMS 4566	3 de mayo de 1988

En los ejemplos, se hará referencia a la Figura y Listado de Secuencias siguientes:

Figura

Figura 1: Procedimiento en diez pasos para obtener plantas mantenedoras de maíz (v.g. H99) de la invención

Listado de secuencias

SEQ ID No: 1	DNA genómico que comprende el promotor del gen Zml3 de Zea mays
SEQ ID No: 2	Secuencia del plásmido "pVE144"
SEQ ID No: 3	Secuencia del plásmido "pVE108"
SEQ ID No: 4	Secuencia del oligonucleótido "MDB80"
SEQ ID No: 5	Secuencia del oligonucleótido "MDB81"
SEQ ID No: 6	Secuencia del oligonucleótido "MDB82"
SEQ ID No: 7	DNA genómico que comprende el promotor específico de las anteras "PT72" del arroz
SEQ ID No: 8	DNA genómico que comprende el promotor específico de las anteras "PT42" del arroz
SEQ ID No: 9	DNA genómico que comprende el promotor específico de las anteras "PE1" del arroz
SEQ ID No: 10	DNA genómico que comprende el promotor específico de las anteras "PCA55" del maíz
SEQ ID No: 11	Oligonucleótido Zm13OLI2
SEQ ID No: 12	Oligonucleótido Zm13OLI1
SEQ ID No: 13	Oligonucleótido Zm13OLI5
SEQ ID No: 14	Oligonucleótido BXOL2
SEQ ID No: 15	Oligonucleótido TA29SBXOL2
SEQ ID No: 16	Oligonucleótido PTA29OL5
SEQ ID No: 17	Fragmento EcoRI-HindIII de pTS218 que lleva el gen mantenedor.

Ejemplos Ejemplo 1 Aislamiento del promotor específico del polen del gen Zm13 del maíz

Un cDNA específico del polen de la línea endogámica W-22 de Zea mays, designado como "Zmc13" ha sido aislado y caracterizado por Hanson et al (1989) The Plant Cell 1: 173. El clon genómico correspondiente, designado como "Zmg13", que contiene porciones sustanciales de la región flanqueante 5' ha sido aislado y caracterizado por Hamilton et al (1989) Sex. Plant Reprod. 2: 208 (véase también Hamilton et al (1992) Plant Mol. Biol. 18: 211). La secuencia completa de Zmg13 se muestra en SEQ ID No: 1, y en lo sucesivo se hará referencia en esta memoria a su región promotora como el "Promotor Zm13".

Se aisló una región promotora correspondiente a partir de la línea endogámica H99 del maíz como sigue. Se preparó DNA genómico de la línea endogámica H99 como ha sido descrito por Dellaporta et al (1983) Plant Mol. Biol. Reports 1: 19-21. Utilizando el genoma como sustrato, se amplificó por PCR un fragmento de 1471 pb utilizando los oligonucleótidos MDB80 y MDB82, cuyas secuencias se muestran en SEQ ID No: 4 y SEQ ID No: 6, respectivamente. MDB80 corresponde a los nucleótidos 8 a 28 de Zmg13, mientras que MDB82 es complementario a los nucleótidos 1458 a 1478 de Zmg13. A continuación, el fragmento amplificado y purificado de 1471 pb se utilizó como sustrato para la amplificación por PCR de un fragmento de 1422 pb, utilizando los oligonucleótidos MDB80 y MDB81. MDB81 es complementario a los nucleótidos 1409 a 1429 de Zmg13, y su secuencia se muestra en SEQ ID No: 5. Utilizando DMB81, se crea un sitio NcoI en el fragmento amplificado de 1422 pb en el codón ATG de iniciación de la traducción.

El fragmento de 1422 pb se liga luego en un sitio SmaI de pGEM2 (Promega Corporation, Madison, Wisconsin 53711, EE.UU.), produciendo el plásmido pMDB13, y se secuencia el fragmento (Maxam y Gilbert (1980) Meth. Enzymol. 65: 499). El promotor específico del polen del gen Zm13 de la línea H99 endogámica del maíz se obtiene a partir de pMDB13 como un fragmento EcoRV-NcoI.

El promotor Zm13 se somete también a clonación como sigue. Se prepara DNA genómico de la línea H99 de Zea mays como se ha descrito arriba. Utilizando el DNA genómico como sustrato, se amplifican los dos fragmentos siguientes por medio de PCR: 1) se amplifica un fragmento de 875 pb utilizando los oligonucleótidos MDB80 (SEQ ID No: 4) y Zm130LI2 (que es complementario a los nucleótidos 859 a 882 de Zmg13 y cuya secuencia se da en SEQ ID No: 11); y 2) se amplifica un fragmento de 661 pb utilizando los oligonucleótidos Zm13OLI1 (que corresponde a los nucleótidos 767 a 791 de Zmg13 y cuya secuencia se da en SEQ ID No: 12) y Zm13OLI5 (que es parcialmente complementario a los nucleótidos 1397 a 1493 de Zmg13 y cuya secuencia se da en SEQ ID No: 13). El fragmento de 875 pb, correspondiente a la región del promotor Zm13 situada aguas arriba, se clona en el sitio SmaI de pGEM2, produciendo el plásmido pTS204. El fragmento de 661 pb, correspondiente a la región de aguas abajo del promotor Zm13, se digiere con NcoI y se clona en el plásmido pJB66 (Botterman y Zabeau (1987) DNA 6: 583) digerido con EcoRV y NcoI, produciendo el plásmido pTS203. Ambos fragmentos se superponen parcialmente y comparten un sitio BstXI en la región de superposición. La ligación del fragmento EcoRV-BstXI de 567 pb de pTS204 y el fragmento BstXI-NcoI de 638 pb de pTS203 da como resultado un fragmento de 1205 pb correspondiente al promotor Zm13. Este fragmento de 1205 pb, tal como se obtiene por clonación a partir de la línea H99, se secuencia, y se encuentra que su secuencia es idéntica al fragmento correspondiente de Zmg13 de la línea W-22 como se da en SEQ ID NO. 1 excepto en la posición 276 (G en W-22 es T en H99), 410 (G en W-22 es A en H99) y 1205-1206 (GC en W-22 es GGC en H99, correspondiendo así a la inserción de un nucleótido), siendo la numeración como en SEQ ID NO. 1.

Ejemplo 2 Construcción de vectores de transformación de plantas que comprenden un gen mantenedor que contiene DNA codificante de Barstar bajo el control del promotor TA29 y DNA codificante de Barnasa bajo el control del promotor Zm13

El fragmento EcoRV-NcoI de 1205 pb de pMDB13 se liga al fragmento grande EcoRI-SmaI del plásmido pVE144 y al fragmento EcoRI-NcoI de 739 pb de pVE108, produciendo el plásmido pGSJVR1. El plásmido pVE144, cuya secuencia se muestra en SEQ ID NO. 2, es un plásmido derivado del plásmido pUC18 (Yanisch-Perron et al (1985) Gene 33: 103) y que contiene DNA codificante de la neomicin-fosfotransferasa (neo) bajo el control del promotor 35S3 (documento EP 0.359.617) del material aislado CabbB-JI del Virus del Mosaico de la Coliflor (Hull y Howell (1978) Virology 86: 482) y DNA codificante de Barstar (Hartley (1988) J. Mol. Biol. 202: 913) bajo el control del promotor específico de tapete del gen TA29 de Nicotiana tabacum (documento EP 0.344.029; Seurinck et al (1990) Nucleic Acids Res. 18: 3403). El plásmido pVE108, cuya secuencia se muestra en SEQ ID NO. 3, es un plásmido derivado de pUC18 y que contiene DNA codificante de fosfinotricin-acetil-transferasa (bar) (documento EP 0.242.236) bajo el control del promotor 35S3 y DNA codificante de Barnasa (Hartley (1980) supra) bajo el control del promotor TA29. El plásmido resultante, pGSJVR1 (que se redenomina subsiguientemente "pTS210"), es un plásmido derivado de pUC18 que contiene un gen mantenedor de esta invención que comprende: DNA codificante de Barnasa como el DNA de letalidad del polen, el promotor Zm13 como el promotor específico del polen, DNA codificante de Barstar como el DNA restaurador de la fertilidad, el promotor TA29 como promotor restaurador, neo como el primer DNA marcador y el promotor 35S3 como el primer promotor marcador.

pTS210 se obtiene también como sigue. El fragmento BstXI-SacI de 0,9 kb de pTS204 se liga al fragmento grande BstXI-SacI de pTS203, produciendo el plásmido pTS206. Se liga luego el fragmento BgIII-NcoI de 1,47 kb de pTS206 al fragmento grande NcoI-BgIII de pVE108, produciendo el plásmido pTS207. Finalmente, el fragmento EcoRV-Eco-RI de 1,9 kb de pTS207 se liga al fragmento grande Eco-RI-SmaI de pVE144, produciéndose el plásmido pTS210.

Se obtiene también un plásmido pTS218, que difiere de pTS210 por llevar el gen bar como gen marcador seleccionable, como sigue:

-: se obtiene un fragmento de DNA de 255 pb, designado como bxx y que lleva el sitio de iniciación de la traducción del gen PTA29-barstar, por PCR utilizando pVE144 como molde y los oligonucleótidos BXOL2 (SEQ ID NO. 14) y TA29SBXOL2 (SEQ ID NO. 15) como iniciadores.

-: se prepara un fragmento de DNA de 492 pb por PCR utilizando pVE108 y bxx como molde y los oligonucleótidos PTA29OL5 (SEQ ID NO. 16) y BXOL2 como iniciadores. Este fragmento de 492 pb se digiere con AsnI y BspEI, y un fragmento de 274 pb se purifica en gel y se liga al fragmento de 6,28 kb de pVE144 que se digirió con BspEI y se digirió parcialmente con AsnI. El plásmido resultante se designa como pVEK144 y lleva el gen quimérico PTA29-barstar-3'nos con un contexto de iniciación de la traducción optimizado.

-: se digiere pVEK144 con MunI y KndIII, y el fragmento de 3,7 kpb se aísla y se liga al fragmento MunI-HindIII de 1,7 kpb de pVE108, obteniéndose el plásmido pVEB144 que lleva los genes quiméricos PTA29-barstar-3'nos y P35S-bar-3'nos.

-: el fragmento EcoRI-HindIII de pVEC144, que contiene los dos genes quiméricos, se liga al fragmento grande EcoRI-HindIII de pUCNew2, obteniéndose el plásmido pVEC144. pUCNew2 se deriva de pUC19 como se describe en el documento WO 92/13956.

-: finalmente, el fragmento grande EcoRI-SmaI de pVEC144 se liga al fragmento EcoRV-EcoRI de 1,9 pb de pTS207, obteniéndose el plásmido pTS218.

El plásmido pTS218 lleva tres genes quiméricos, a saber, PTA29-barstar-3'nos (con contexto de iniciación de la traducción optimizado), P35S-bar-3'nos, y PZM13-barnasa-3'nos. El fragmento EcoRI-HindIII de pTS218 que lleva estos tres genes quiméricos se presenta en el Listado de Secuencias como SEQ ID NO. 17.

Todos los pasos de construcción de vectores que implican fragmentos del DNA de barnasa, tales como pVE108, pVE144, y pTS210, se llevan a cabo en la cepa MC1061 de E. coli que contiene el plásmido cointegrado R702::pMc5
BS que se obtiene como sigue. El plásmido pMc5BS, que contiene el gen barstar (que codifica un inhibidor de barnasa) bajo el control del promotor tac (De Boer et al (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21), se construye como sigue: clonación del fragmento EcoRI-HindIII del plásmido pMT416 (Hartley (1988) supra) en los sitios EcoRi y HindIII del plásmido bMc5p8 (DSM 4566); seguida por deleción de la secuencia que comienza con el codón de iniciación de la secuencia señal phoA y que termina con el último nucleótido antes del codón de iniciación de la traducción de la región codificante de barstar por medio de un procedimiento de mutagénesis de entrelazado ("looping-out") como ha sido descrito en líneas generales por Sollazo et al (1985) Gene 37: 199.

El plásmido R702 procede de Proteus mirabilis y puede replicarse en E. coli (Villaroel et al (1983) Mol. Gen. Genet. 189: 390). El plásmido R702::pMc5BS se obtiene por cointegración mediante recombinación ilegítima entre pMc5BS y R702, mediada por elementos transportables presentes en R702 (Leemans (1982) "Technieken voor het gebruik van Ti-plasmieden van Agrobacterium tumefaciens als vectoren voor de genetic engineering van planten", Ph.D. Thesis Vrije Universiteit Brussel, Bruselas, Bélgica) y se comprueba en cuanto a expresión inducida de Barstar.

El uso de E. coli (R702::pMc5BS) permite la construcción, el mantenimiento, la amplificación, y la purificación de plásmidos que contienen el DNA de Barnasa, tales como pGSJVR1, sin efecto letal alguno sobre el hospedador debido a la expresión accidental del DNA de Barnasa. Sin embargo, dado que el promotor Zm13 no se expresa en E. coli, todos los pasos de la construcción de vectores que implican ese promotor se llevan a cabo también en la cepa MC1061 de E. coli.

Ejemplo 3 Transformación de maíz con el gen mantenedor del Ejemplo 2

Se aíslan embriones cigóticos inmaduros de aproximadamente 0,5 a 1 mm de semillas en desarrollo de la línea H99 de maíz endogámico. Los embriones recién aislados se tratan enzimáticamente durante 1-2 minutos con una solución de enzima II (0,3% de macerozima (Kinki Yakult, Nishinomiya, Japón) en sales CPW (Powell & Chapman (1985) "Plant Cell Culture, A Practical Approach", R.A. Dixon compilador, Capítulo 3) con manitol al 10% y ácido 2-[N-morfolino]-etanosulfónico (MES) 5 mM, pH 5,6). Después de 1-2 minutos de incubación en esta solución enzimática, los embriones se lavan cuidadosamente con solución N6aph (macro- y micro-elementos de medio N6 (Chu et al (1975) Sci. Sin. Peking 18: 659) complementado con asparagina 6 mM, prolina 12 mM, 1 mg/l de tiamina-HCl, 0,5 mg/l de ácido nicotínico, 100 mg/l de hidrolizado de caseína, 100 mg/l de inositol, 30 g/l de sacarosa y 54 g/l de manitol). Después del lavado, los embriones se incuban en el tampón de electroporación de maíz, EPM-KCl (KCl 80 mM, CaCl_{2} 5 mM, HEPES (ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanosulfónico) 10 mM y manitol 0,425 M, pH 7,2). Aproximadamente 100 embriones en 200 \mul de EPM-KCl se cargan en cada cubeta de electroporación. Se añaden a cada cubeta Aproximadamente 20 \mug de un DNA plasmídico, pPGSJVR1 (del Ejemplo 2) linealizado con EcoRI,.

Después de 1 hora de incubación del DNA con los explantes, las cubetas se transfieren a un baño de hielo. Después de 10 minutos de incubación en hielo, se lleva a cabo la electroporación: se descarga un pulso con una intensidad de campo de 375 V/cm desde un condensador de 900 \muF. El aparato de electroporación es como se describe por Dekeyser et al (1990) The Plant Cell 2: 591. Inmediatamente después de la electroporación, se añade sustrato líquido reciente N6aph a los explantes contenidos en la cubeta, después de lo cual se incuban los explantes durante un período adicional de 10 minutos en hielo.

Después de ello, los embriones se transfieren a sustrato Mah1 VII (macro- y micro-elementos y vitaminas de medio N6 complementados con 100 mg/l de hidrolizado de caseína, prolina 6 mM, 0,5 g/l de MES, 1 mg/l de ácido 2,3-diclorofenoxiacético (2,4-D) y sacarosa al 2% solidificada con 0,75 g/l de MgCl_{2} y 1,6 g/l de Phytagel (Sigma Chemical Company, St Louis, Mo. EE.UU.), pH 5,8) y complementado con manitol 0,2 M. Después de 3 días, se transfieren los embriones al mismo sustrato complementado con 200 mg/l de kanamicina. Después de aproximadamente 14 días, se transfieren los embriones a sustrato Mah1 VII sin manitol, complementado con kanamicina. Los embriones se subcultivan ulteriormente sobre este sustrato selectivo durante aproximadamente 2 meses con intervalos de subcultivo de aproximadamente 3 semanas. El tejido embriogénico inducido se aísla cuidadosamente y se transfiere a medio MS (Murashige y Skoog (1962) Physiol. Plant 15: 473) complementado con 5 mg/l de 6-bencilaminopurina para la línea H99. El tejido embriogénico se mantiene en este medio durante aproximadamente 14 días y se transfiere subsiguientemente a medio MS sin hormonas y sacarosa al 6% para la línea H99. Los brotes en desarrollo se transfieren a medio ½ MS con sacarosa al 1,5% para desarrollo ulterior hasta plántulas normales. Estas plántulas se transfieren a suelo y se cultivan en el invernadero.

De modo análogo, se transforman embriones de maíz con un fragmento de DNA de pTS218 que contiene el gen mantenedor y el P35S-bar-3'nos quimérico y que se obtiene por ingestión del plásmido con EcoRI, XhoI y PstI y por purificación del fragmento más largo. La transformación y la regeneración de las plantas es como se describe en el Ejemplo 5.

Ejemplo 4 Análisis de las plantas de maíz transgénicas del Ejemplo 3

Las plantas del Ejemplo 3 transformadas con pGSJVR1 se analizan en cuanto a la presencia del gen mantenedor por medio de PCR. Se prepara el DNA de acuerdo con el protocolo descrito por Dellaporta et al (1983) Plant Mol. Biol. Reporter 1: 19, adaptado para aplicación a cantidades de tejido de aproximadamente 10 a 20 mg. Para cada planta, dicha cantidad de tejido se macera en tampón de extracción en un tubo de microcentrífuga. Fragmentos representativos del gen mantenedor se amplifican utilizando sondas oligonucleotídicas apropiadas.

La actividad del producto de expresión del primer gen marcador (es decir, neomicina-fosfotransferasa II (NPTII)) se ensaya en las plantas como sigue. Se preparan extractos brutos por trituración del tejido vegetal en tampón de extracción (McDonnell et al (1987) Plant Molecular Biol. Reporter 5: 380). Los extractos se someten luego a electroforesis en gel de poliacrilamida no desnaturalizante de acuerdo con el procedimiento descrito por Reiss et al (1984) Gen 30: 211. Se ensaya luego la actividad de NPTII por fosforilación in situ de kanamicina utilizando [gamma-32P]ATP como sustrato (McDonnell et al (1987) supra).

Las plantas que resultan positivas en ambos ensayos PCR y NPTII se analizan ulteriormente por medio de hibridación Southern. Se prepara DNA genómico a partir del tejido vegetal de acuerdo con el protocolo descrito por Dellaporta et al (1983) supra, complementado por un tratamiento con RNasa para separar el RNA remanente. Se utiliza como control una planta H99 no transformada. Las muestras del DNA se digieren con enzimas de restricción apropiadas y se someten a electroforesis horizontal con agarosa. La transferencia Southern a membranas Hybond N+ (Amersham International PLC, Amersham, Reino Unido) por medio del protocolo "transferencia con álcali de DNA" y la hibridación subsiguiente se lleva a cabo como se recomienda por el fabricante (folleto Amersham Hybond-N+). Se preparan sondas radiactivas adecuadas con el kit de marcación de DNA multi-prima (Amersham) de acuerdo con el protocolo suministrado por el fabricante que se deriva de procedimientos publicados (Feinberg y Vogelstein (1983) Anal. Biochem. 132: 6). Los patrones de listado en bandas indican que al menos el gen mantenedor está integrado en el DNA genómico de la planta.

Los ensayos PCR indican que está presente el gen mantenedor. Los ensayos NPTII indican que se expresa el DNA del primer marcador. Las plantas maduras transformadas pueden analizarse luego fenotípicamente para ver si el DNA de barstar se expresa en las células de tapete y el gen de barnasa se expresa en las células del polen. La expresión de barstar se determina por transferencia Northern de mRNA de las anteras y por realización de cruzamientos de ensayo para determinar la restauración en la progenie. La expresión del gen de letalidad del polen se determina por examen citológico de la antera. A este respecto, el polen maduro viable y no viable se determina por análisis de la tinción de polen aislado después de incubación durante 30 minutos a 24ºC en la mezcla de reacción siguiente: tampón de fosfato 100 mM de pH 7,8, succinato de sodio 100 mM y NitroAzul Tetrazolio 1 mM, seguido por inspección visual de la precipitación de formazano en polen viable. Técnicas alternativas para la diferenciación entre el polen maduro viable y no viable son las descritas por ejemplo Alexander (1969) Stain Technology 44: 117 y por Heslop-Harrison y Heslop-Harrison (1970) Stain Technology 45: 115. La viabilidad de las microsporas se determina por inclusión de yemas de flores en plástico en etapas de desarrollo diferentes y sometimiento de las yemas a tinción histoquímica con el ensayo de la succinato-deshidrogenasa, como han sido descritos ambos por De Block y Debrouwer (1992) The Plant Journal 2: 261.

Por último, se determina la progenie de la planta transformada con el gen de letalidad del polen. Ninguno de los descendientes obtenidos a partir de un cruzamiento utilizando esta planta como progenitor masculino tiene este gen, mientras que el 50% de los descendientes obtenidos a partir de un cruzamiento utilizando esta planta como progenitor femenino poseen el gen.

Las plantas del Ejemplo 3 transformadas con el DNA pTS218 se analizan del mismo modo, excepto que el producto de expresión del primer gen marcador, es decir, fosfinotricina-acetiltransferasa, se ensaya por medio de un ensayo PAT como se describe en el Ejemplo 5.

Ejemplo 5 Producción de plantas de maíz con esterilidad masculina

Embriones cigóticos de la línea H99 de maíz endogámico, se aislaron, se trataron enzimáticamente, se lavaron, y se cargaron en tampón de electroporación como se describe en el Ejemplo 3. Aproximadamente 100 embriones en 200 \mul de EPM-RCI se cargaron en cada cubeta de electroporación. Se añadieron por cubeta aproximadamente 20 \mug de un DNA plasmídico, pVE108 linealizado con HindIII. pVE108 es un plásmido de 5620 pb que contiene: un gen quimérico que comprende el DNA bar (documento EP 242236), codificante de fosfinotricin-acetil-transferasa (PAT) y que confiere resistencia a un inhibidor del herbicida de glutamina-sintetasa tal como fosfinotricina (PPT), bajo el control del promotor 35S3; y otro gen quimérico que comprende el DNA codificante de barnasa (Hartley (1988) supra) bajo el control del promotor específico de tapete del gen TA29 (documento EP 344029) de N. tabacum. La secuencia completa del plásmido pVE108 se da en SEQ ID NO. 4. Todas las construcciones de vectores que implican fragmentos de DNA que comprenden el gen de barnasa se llevaron a cabo en la cepa MC1061 de E. coli que contenía el plásmido R702::pMc5BS del Ejemplo 3. Después de una hora de incubación del DNA con los explantes, las cubetas se transfirieron a un baño de hielo. Después de 10 minutos de incubación en hielo, se llevó a cabo la electroporación como se ha descrito en el Ejemplo 3. Inmediatamente después de la electroporación, se añadió sustrato líquido reciente N6aph a los explantes contenidos en la cubeta, tras lo cual se incubaron los explantes durante un período adicional de 10 minutos en hielo.

Después de ello, los embriones procedentes de un solo experimento de electroporación se transfirieron a sustrato Mah1 VII complementado con manitol 0,2 M y 2 mg/l de PPT. Después de aproximadamente 14 días, se transfirieron los embriones a sustrato Mh1 VII (sustrato Mh1 VII del Ejemplo 3 pero sin prolina e hidrolizado de caseína) complementado con 2 mg/l de PPT pero sin manitol. Después de aproximadamente 4 semanas, los embriones se subcultivaron durante un mes más en sustrato Mh1 VII complementado con 10 mg/l de PPT. El tejido embriogénico inducido se aisló cuidadosamente y se transfirió a medio MS complementado con 5 mg/l de 6-bencilaminopurina. El tejido embriogénico se mantuvo en este medio durante aproximadamente 14 días y se transfirió subsiguientemente a medio MS sin hormonas y sacarosa. Los brotes que se desarrollaron se transfirieron a medio ½ MS con sacarosa al 1,5% para desarrollo ulterior hasta plántulas normales. Estas plántulas sobrevivieron a una pulverización in vitro con dosis de BASTA® (Hoechst AG, Frankfurt am Main, Alemania) correspondiente a 2 l/ha. Estas plántulas se transfirieron luego a suelo y se cultivaron en el invernadero, y dos de las plántulas transformadas, denotadas RZM31-1 y RZM35-18, se caracterizaron ulteriormente.

Los embriones de un segundo experimento de electroporación se transfirieron a sustrato Mh1 VII complementado con 2 mg/l de PPT y manitol 0,2 M. Después de aproximadamente 14 días, los embriones se transfirieron a sustrato Mh1 VII complementado con 2 mg/l de PPT pero sin manitol. Después de aproximadamente otras tres semanas, se transfirieron los embriones a sustrato Mh1 VII complementado con 10 mg/l de PPT pero sin manitol. Después de otras tres semanas, el tejido embriogénico inducido se aisló cuidadosamente y se transfirió a medio MS complementado con 2 mg/l de PPT y 5 mg/l de 6-bencilaminopurina. El tejido embriogénico se mantuvo en este medio durante aproximadamente 14 días y se transfirió subsiguientemente a medio MS sin hormonas, sacarosa o PPT. Los brotes en desarrollo se transfirieron a medio ½ MS con sacarosa al 1,5% para desarrollo ulterior a plántulas normales. Las plántulas resultantes se transfirieron a suelo y se cultivaron en el invernadero, y tres de las plántulas transformadas, denotadas RZM34-1, RZM34-12, y RZM34-14, se caracterizaron ulteriormente.

RZM34-1, RZM34-12, RZM34-14, RZM35-1, y RZM35-18 se cultivaron en el invernadero. La actividad del producto de expresión del gen bar en las hojas de las plantas se ensayó como sigue en un "ensayo PAT". 100 mg de tejido de las hojas de cada planta, junto con 50 mg de arena de mar tratada a los ácidos (Merck, Darmstadt, Alemania) y 5 mg de polivinilpolipirrolidona (PVPP), se trituraron en un tubo Eppendorf con una varilla de vidrio en 50 \mul de tampón de extracción (Tris-HCl 25 mM, pH 7,5, Na_{2}-EDTA (sal disódica del ácido etilenodiaminatetraacético) 1 mM, 0,15 mg/ml de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), 0,3 mg/ml de ditiotreitol (DTT), y 0,3 mg/ml de seroalbúmina bovina). El extracto se centrifugó en una microcentrífuga durante 5 minutos a 16.000 rpm. El sobrenadante se recuperó y se diluyó 10 veces con TE 25/1 (Tris-HCl 25 mM, pH 7,5, Na_{2}-EDTA 1 mM. A 12 \mul del extracto diluido se añadieron luego 1 \mul de PPT 1 mM en TE 25/1, 1 \mul de AcetilCoenzima A 2 mM en TE 25/1, y 2 \mul de [14C]AcetilCoenzima A (60 mCi/mmol, 0,02 mCi/ml, [NEN Research Producs, Dupont, Wilmington, Delaware, Estados Unidos]. La mezcla de reacción se incubó durante 30 minutos a 37ºC y se aplicó por puntos sobre una placa de cromatografía en capa fina de gel de sílice 60 sobre hoja de aluminio con zona de concentración (Merck). Se llevó a cabo una cromatografía ascendente en una mezcla 3 a 2 de 1-propanol y NH_{4}OH (25% NH_{3}). Se visualizó 14C por autorradiografía durante una noche (película Kodak XAR-5). La tolerancia al herbicida BASTA® se ensayó pincelando una pequeña área cerca del ápice de una hoja por planta con una solución al 1% del herbicida y observando los síntomas de deterioro en y cerca de los sitios pincelados. Mientras que RZM34-1, RZM35-1 y RZM35-18 no exhibían síntoma alguno de daño en absoluto, RZM34-12 y RZM34-14 mostraban ligero pardeo y desecación del sitio pincelado. Se demostró también que RZM34-1, RZM34-12, RZM34-14, RZM35-1 y RZM35-18 exhibían esterilidad masculina pero por lo demás eran completamente normales desde el punto de vista fenotípico; la fertilidad femenina, por ejemplo, era normal. Las espiguillas de las flores masculinas tenían una longitud aproximadamente normal, pero eran muy delgadas y parecían estar vacías, y no se abrieron en ningún caso. Un análisis detallado demostró que las anteras estaban reducidas a estructuras casi microscópicas. Este fenotipo indica no sólo que se expresaba al menos una copia del gen de barnasa, sino también que el mismo se expresaba selectivamente en algunos o todos los tejidos de las anteras.

El análisis Southern demostró que RZM35-1 y RZM35-18 tenían un patrón de integración idéntico, estando presente sólo una copia del plásmido pVE108 en el genoma de cada planta. Una pequeña parte de la secuencia del DNA plasmídico adyacente al sitio HindIII (utilizado para linealización antes de la electroporación) parecía estar ausente en la copia integrada. El análisis Southern de RZM34-1, RZM34-12 y RZM34-14 demostró que cada una de estas plantas tiene probablemente dos o tres copias de parte o la totalidad de pVE108 integrada en su genoma. Con gran probabilidad, las copias no están insertadas en una configuración concatémera.

Los transformantes RZM35-1 y RZM34-1 se polinizaron con polen de una planta H99 no transformada, y se recuperaron las plántulas de la progenie. De las 35 plántulas recuperadas a partir de RZM35-1, 16 (46%) se clasificaron como positivas en un ensayo PAT, mientras que 19 (54%) eran PAT-negativas. Esta proporción en la progenie F1 no difiere significativamente de la relación 1:1 esperada conforme a la segregación mendeliana normal de una sola copia activa del gen bar quimétrico (X2 = 0,26).

De las 34 plántulas recuperadas a partir de RZM34-1, 19 (56%) se clasificaron como positivas en un ensayo PAT, mientras que 15 (44%) eran PAT-negativas. Esta proporción en la progenie F1 no difiere significativamente de la relación 1:1 esperada de acuerdo con la segregación mendeliana normal, suponiendo que el progenitor femenino transformado tenía una sola copia activa, o alternativamente copias activas múltiples pero estrechamente unidas, del gen bar quimérico (X2 = 0,47).

Ejemplo 6 Producción de plantas de maíz restauradoras

Embriones cigóticos de la línea H99 de maíz endogámico se aislaron, se trataron enzimáticamente, se lavaron y se cargaron en tampón de electroporación como se describe en el Ejemplo 5. Aproximadamente 100 embriones en 200 \mul de EPM-KCl se cargaron en cada cubeta de electroporación. Se añadieron aproximadamente 20 \mug de un DNA plasmídico, pVE144 linealizado con Hindi, por cubeta. pVE144 es un plásmido de 6555 pb que se ha descrito en el Ejemplo 2.

Los embriones se sometieron a electroporación, y las células transformadas se seleccionaron, se cultivaron hasta producir callo, y se regeneraron como se describe en el Ejemplo 3. Las plantas transgénicas se analizaron respecto a la presencia del gen restaurador de la fertilidad y el gen marcador por medio de hibridación Southern y PCR. La expresión del gen restaurador de la fertilidad se ensaya por medio de transferencia Northern, y la expresión del gen marcador se determina por el ensayo NPTII como se describe en el Ejemplo 3.

Ejemplo 7 Producción de plantas de maíz mantenedoras y una línea de maíz con esterilidad masculina, y mantenimiento de la línea de maíz con esterilidad masculina

Se obtienen plantas mantenedoras de esta invención de la línea de maíz H99 como se reseña en la Figura 1. Una planta de la línea H99 de maíz endogámico con el genotipo de esterilidad masculina H99^{S/s,r/r,p/p}, transformada con el gen de esterilidad masculina del Ejemplo 5, se cruza con plantas que tienen el genotipo H99^{s/s,R/r,p/p}, transformadas con el gen restaurador de la fertilidad del Ejemplo 6. la progenie que tiene el genotipo H99^{S/s,R/r,P/p} se identifica por análisis PCR respecto a la presencia de los genes S y R. estas plantas se autopolinizan, produciendo progenie con nueve genotipos diferentes. Dos de estos genotipos (H99^{S/S,r/r} y H99^{S/s,r/r}) se desarrollarán en plantas con esterilidad masculina, mientras que todos los restantes genotipos se desarrollarán en plantas con fertilidad masculina. Cuando estas plantas con fertilidad masculina se autopolinizan, el análisis de la progenie muestra la identificación de su genotipo. Así: a) la progenie de las autopolinizaciones de H99^{S/S,R/R}, H99^{S/s,R/R}, H99^{s/s,R/R}, H99^{s/s,R/r} y H99^{s/s,r/r} se desarrollarán todas ellas en plantas con fertilidad masculina; b) las autopolinizaciones de las plantas H99^{S/s,R/r} producirían una progenie, de la cual 13 de 16 exhibirían fertilidad masculina, y dado que el gen de la esterilidad masculina está unido al gen de resistencia a los herbicidas, bar, 4 de las 13 plantas con fertilidad masculina serían sensibles al herbicida BASTA®; y c) las autopolinizaciones de las plantas H99^{S/S,R/r} producían una progenie de la cual 12 de 16 serían fértiles (4 de 16 tendrían el genotipo H99^{S/S,R/R} y 8 de 16 tendrían el genotipo H99^{S/S,R/r}), todas las cuales serían resistentes al herbicida, y la progenie con esterilidad masculina de la cual (4 de 16) serían todas ellas homocigóticas para el gen de esterilidad masculina (H99^{S/S,r/r}).

La progenie con esterilidad masculina homocigótica (H99^{S/S,r/r}) de la autopolinización (c) se cruza luego con sus plantas hermanas con fertilidad masculina, y solamente cuando el cruzamiento es con plantas que tienen el genotipo H99^{S/S,R/r} las plantas resultantes tienen en un 50% esterilidad masculina (todas ellas con el genotipo H99^{S/S,r/r}) y 50% fertilidad masculina (todas ellas con el genotipo H99^{S/S,R/r}. De hecho, el cruzamiento alternativo entre H99^{S/S,r/r} y H99^{S/S,R/R} daría como resultado 100% de plantas de la progenie con fertilidad masculina.

Las plantas mantenedoras se seleccionan por cruzamiento de la planta que tiene el genotipo H99^{S/s,R/r,p/p} con una planta que es heterocigótica para el gen mantenedor del Ejemplo 2, es decir, (H99^{s/s,r/r,P/p}), utilizando la última planta como el progenitor femenino. La descendencia con el genotipo H99^{S/s,r/r,P/p} se selecciona por medio de cruzamientos de ensayo complementados con análisis PCR de la progenie (que puede identificarse fácilmente por PCR y transferencia Southern respecto a la presencia de los genes S y P y la ausencia del gen R). Los descendientes fértiles seleccionados se autopolinizan luego. Uno de cada ocho descendientes tiene el genotipo deseado para una planta mantenedora de esta invención (H99^{S/S,P/p}) y puede seleccionarse ulteriormente por medio de cruzamientos de ensayo y análisis PCR de la progenie. De hecho, únicamente plantas con este genotipo producirán 50% de descendientes con esterilidad masculina (todos ellos H99^{S/S,p/p}) y 50% de descendientes con fertilidad masculina (todos ellos H99^{S/S,P/p}), desarrollándose así al mismo tiempo tanto la línea homocigótica con esterilidad masculina deseada y la línea mantenedora de esta invención. Los cruzamientos de ensayo incluyen también la polinización de plantas H99 de tipo salvaje con polen de las plantas de la progenie obtenidas por la autopolinización de plantas H99^{S/s,P/p}.

Las plantas homocigóticas con esterilidad masculina que tienen el genotipo H99^{S/S,r/r,p/p} se polinizan luego con plantas mantenedoras (H99^{S/S,r/r,P/p}) de esta invención. Todos los descendientes tienen el genotipo H99^{S/S,r/r,p/p}, por lo que se mantiene la línea con esterilidad masculina, como se deseaba.

Ejemplo 8 Introducción del gen de esterilidad masculina y el gen mantenedor en líneas de maíz endogámicas por reproducción clásica

El gen de esterilidad masculina del Ejemplo 5 y el gen mantenedor del Ejemplo 2 se transfieren desde la línea de maíz endogámica H99 a otra línea de maíz endogámica (A) por retrocruzamientos repetidos como sigue. La planta mantenedora H99^{S/S,P/p} se cruza como progenitor femenino con una planta no transformada de la línea A (A^{s/s,p/p}). Los descendientes con el genotipo A-H99^{S/s,P/p} se seleccionan por escrutinio, utilizando PCR, respecto a la presencia tanto del gen mantenedor (P) como del gen de esterilidad masculina (S). Estas plantas se cruzan luego nuevamente como progenitores femeninos con plantas A^{s/s,p/p}, y los descendientes que son heterocigóticos para ambos genes P y S se seleccionan nuevamente por PCR. Este proceso de retrocruzamiento se repite hasta que finalmente se obtienen plantas con el genotipo A^{S/s,P/p}. Estas plantas se autopolinizan luego, y los descendientes se analizan del mismo modo que se ha descrito en el Ejemplo 7. De este modo, se obtienen plantas con esterilidad masculina que tienen el genotipo A^{S/S,p/p} y plantas mantenedoras de esta invención con el genotipo A^{S/S,P/p}.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE:

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(A): NOMBRE: PLANT GENETIC SYSTEMS N.V.

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: Jozef Plateustraat 22

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(D): CIUDAD: Gante

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(E): PAÍS: Bélgica

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(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): 9000

\vskip0.500000\baselineskip

(G): TELÉFONO: 32 91 358411

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(H): TELEFAX: 32 91 240694

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(I): TELEX: 11.361 Pgsgen

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Mantenimiento de plantas con esterilidad masculina

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 17

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: Disco flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: IBM PC Compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): SOPORTE LÓGICO: PatentIn Release #1.0, Versión #1.25 (EPO)

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DATOS DE SOLICITUDES ANTERIORES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: US 07/899.072

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 12 de junio de 1992

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): DATOS DE SOLICITUDES ANTERIORES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: US 07/970.849

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 3 de noviembre de 1992

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 2661 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Zea mays

\vskip0.500000\baselineskip

(B): VARIEDAD: línea endogámica W-92

\vskip0.800000\baselineskip

(x): INFORMACIÓN DE PUBLICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): AUTORES: Hamilton et al,

\vskip0.500000\baselineskip

(C): REVISTA: Sex Plant ReproD.

\vskip0.500000\baselineskip

(D): VOLUMEN: 2

\vskip0.500000\baselineskip

(F): PÁGINAS: 208-

\vskip0.500000\baselineskip

(G): FECHA: 1989

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

1

2

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(E): LONGITUD: 6555 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(F): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(G): CLASE DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(H): TOPOLOGÍA: circular

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: plásmido pVE144 (replicable en E. coli)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: -

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..396

\vskip0.500000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN: /marcador= pUC18 /nota= "secuencia derivada de pUC18"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: -

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: complemento (397..751)

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /marcador= 3'nos /nota= "secuencia reguladora 3' que contiene el sitio de poli-adenilación derivado del gen de T-DNA de nopalina-sintasa de Agrobacterium"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: -

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: complemento (752..1024)

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /marcador= barstar /nota= "región codificante del gen barstar de Bacillus amyloliquefaciens"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: -

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: complemento 1025.. 1607

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /marcador= TA29 /nota= "promotor derivado del gen TA29 de Nicotiana tabacum"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: -

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1608..2440

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /marcador= 35S3 /nota= "secuencia promotora 35S3 derivada de un aislado CabbB-JI del virus del mosaico de la coliflor"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: -

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 2441..3256

\vskip0.500000\baselineskip

(C): OTRA INFORMACIÓN: /marcador= neo /nota= "región codificante el gen de neomicina-fosfotransferasa de Tn5"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: -

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 3257..4315

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /marcador= 3'ocs /nota= "secuencia reguladora 3' que contiene el sitio de poliadenilación derivado del gen de octopina-sintasa de T-DNA de Agrobacterium"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: -

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 4316..6555

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /marcador= pUC18 /nota= "secuencia derivada de pUC18"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

3

4

5

6

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 5620 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: circular

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: plásmido pVE108 (replicable en E. coli)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: -

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..395

\vskip0.500000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: -

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: complemento (396..802)

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /marcador= 3'nos /nota= "secuencia reguladora 3' que contiene el sitio de poliadenilación derivado del gen de nopalina-sintasa de T-DNA de Agrobacterium"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: -

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: complemento (803..1138)

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /marcador= barnasa /nota= "región codificante del gen de barnasa de Bacillus amyloliquefaciens"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: -

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: complemento (1139..1683)

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /marcador= TA29 /nota= "secuencia derivada del promotor específico de tapete de Nicotiana tabacum"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: -

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1684..2516

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /marcador= 35S3 /nota= "secuencia promotora ``35S3'' derivada del aislado CabB-JI del virus del mosaico de la coliflor"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: -

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 2517..3068

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /marcador= bar /nota= "secuencia codificante del gen de fosfinotricin-acetiltransferasa"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: -

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 3069..3356

\vskip0.500000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: -

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 3357..5620

\vskip0.500000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

8

9

10

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTISENTIDO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Oligonucleótido MDB80

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: -

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..21

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /marcador= MCB80 /nota= "oligonucleótido designado como MDB80"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGCTTGTCA GTGAATGTTG C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Oligonucleótido MDB81

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: -

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..21

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /marcador= MDB81 /nota= "oligonucleótido designado como MDB81"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGAGGCCAT GGTTGCCGCC G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Oligonucleótido MDB82

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: -

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..21

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /marcador= MDB82 /nota= "oligonucleótido designado como MDB82"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACGCATAGGC ATAGGATGAC G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 3627 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Oryza sativa

\vskip0.500000\baselineskip

(B): VARIEDAD: Akihikari

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE:-

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..2845

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /marcador= PT72 /nota= "secuencia que comprende el promotor PT72 específico de las anteras"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE:-

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 2733..2739

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /marcador= TATA /nota= "secuencia TATA"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE:-

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 2765

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "iniciación de la transcripción determinada por extensión con iniciador"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE:-

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 2846..2848

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /marcador= ATG /nota= "comienzo ATG de la traducción del gen T72 del arroz"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

12

13

14

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 2370 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Oryza sativa

\vskip0.500000\baselineskip

(B): VARIEDAD: Akihikari

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE:-

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..1808

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /marcador= PT42 /nota= "secuencia que comprende el promotor PT42 específico de las anteras"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE:-

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1748..1755

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /marcador= TATA /nota= "secuencia TATA"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE:-

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1780

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "sitio de iniciación de la transcripción determinado por extensión con iniciador"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE:-

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1809

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /marcador= ATG /nota= "comienzo de la traducción ATG del gen T42 del arroz"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

15

16

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 2407 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Oryza sativa

\vskip0.500000\baselineskip

(B): VARIEDAD: Akihikari

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE:-

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..2263

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /marcador= PE1 /nota= "secuencia que comprende el promotor PE1 específico de las anteras"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE:-

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 2181..2187

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /marcador= TATA /nota= "secuencia TATA"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE:-

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 2211

\vskip0.500000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE:-

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 2264..2266

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /marcador= ATG /nota= "comienzo ATG de la traducción del gen E1"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

17

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 2784 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Zea mays

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE:-

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..1179

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /marcador= PCA55 /nota= "región que comprende el promotor específico de las anteras y la secuencia conductora, PCA55"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE:-

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1072

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /marcador= TATA /nota= "secuencia TATA"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE:-

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1180..1596

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "secuencia codificante supuesta del gen CA55 del maíz"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

19

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Oligonucleótido Zm13Oli2

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE:-

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..24

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /marcador= Zm13Oli2 /nota= "oligonucleótido designado como Zm13 Oli2"

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGGATTGAA CGGGACTGAG TTGG

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Oligonucleótido Zm13Oli1

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE:-

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..25

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /marcador= Zm13Oli1 /nota= "oligonucleótido designado como Zm13 Oli1"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGTCTCCAA GACTTTGGTT ATTCC

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Oligonucleótido Zm13Oli5

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE:-

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..31

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /marcador= Zm13Oli5 /nota= "oligonucleótido designado como Zm13 Oli5"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGATCCATGG TTGCCGCCGG GTGAATGTAC G

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Oligonucleótido BXOL2

\vskip0.500000\baselineskip

(B): VARIEDAD:

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE:-

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..24

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /marcador= BXOL2 /nota= "oligonucleótido designado como BXOL2"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACGGAAAACC TGAAGCACAC TCTC

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 49 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Oligonucleótido TA29SBXOL2

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE:-

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..49

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /marcador= TA29SBXOL2 /nota= "oligonucleótido designado como TA29SBXOL2"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTTTTTACTT AAAGAAATTA GCTACCATGA AAAAAGCAGT CATTAACGG

\hfill

49

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Oligonucleótido PTA29OL5

\vskip0.500000\baselineskip

(B): VARIEDAD:

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE:-

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..27

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /marcador= PTA29OL5 /nota= "oligonucleótido designado como PTA29 OL5"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGCCATAAC TGAAATCAGG GTGAGAC

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 4808 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: fragmento EcoRI-HindIII del plásmido pTS218

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE:-

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: complemento (18..401)

\vskip0.500000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE:-

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: complemento (402..737)

\vskip0.500000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE:-

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: complemento (738..1944)

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /marcador= PCM13 /nota= "región promotora del gen Zm13 de Zea mays"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE:-

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: complemento (1945..2281)

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /marcador= 3'nos

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE:-

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: complemento (2282..2544)

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /marcador= barstar /nota= "región codificante del gen de barstar de Bacillus amyloliquefaciens"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE:-

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: complemento (2555..3099)

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /marcador= PTA29 /nota= "región promotora del gen TA29 de Nicotiana tabacum"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE:-

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 3100..3932

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /marcador= 35S3 /nota= "secuencia promotora ``35S3'' derivada del aislado CabbB-JI del virus del mosaico de la coliflor"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE:-

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 3933..4484

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /marcador= bar /nota= "región codificante del gen de fosfinotricin-acetiltransferasa"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE:-

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 4485..4763

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /marcador= 3'nos

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE:-

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 2333..2356

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /marcador= BXOL2 /nota= "región co-correspondiente al oligonucleótido BXOL2"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE:-

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: complemento (2538..2586)

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /marcador= TA29SBXOL2 /nota= "región complementaria al oligonucleótido TA29SBXOL2"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE:-

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: complemento (2800..2823)

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /marcador= PTA29OL5 /nota= "región complementaria a parte del oligonucleótido PTA29OL5"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:

21

22

23

Figura 1

\vskip0.800000\baselineskip

1.: Acción: Transformar embriones de maíz (v.g. H99) con el gen S de esterilidad masculina, enlazado al gen {}\hskip1.2cm bar de resistencia a los herbicidas (Ejemplo 5)

\vskip0.800000\baselineskip

: Resultado: Plantas transformadas con el genotipo S/s

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

2.: Acción: Transformar embriones de maíz (v.g. H99) con el gen R restaurador de la fertilidad (Ejemplo 6)

\vskip0.800000\baselineskip

: Resultado: Plantas transformadas con el genotipo R/r

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

3.: Acción: Transformar embriones de maíz (v.g. H99) con el gen mantenedor P (Ejemplo 3)

\vskip0.800000\baselineskip

: Resultado: Plantas transformadas con el genotipo P/p

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

4.: Acción: Cruzar S/s,r/r x s/s,R/r.

\vskip0.800000\baselineskip

: Seleccionar la descendencia respecto a la presencia a la vez de los genes S y R por medio de PCR.

\vskip0.800000\baselineskip

: Resultado: Plantas con el genotipo S/s, R/r

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

5.: Acción: Autopolinizar plantas seleccionadas de 4 (opcional)

\vskip0.800000\baselineskip

: Resultado: Plantas de la progenie con 9 genotipos diferentes

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

6.: Acción: Autopolinizar plantas con fertilidad masculina de la progenie de 5 (opcional)

\vskip0.800000\baselineskip

: Resultado:

\vskip1.000000\baselineskip

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+\hfil#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 6.1 \+ Autopolinización de S/S,R/R \+ : \+ 100% plantas con
fertilidad masculina\cr  \+ Autopolinización de S/s,R/R \+ : \+ 100%
plantas con fertilidad masculina\cr  \+ Autopolinización de s/s,R/R
\+ : \+ 100% plantas con fertilidad masculina\cr  \+
Autopolinización de s/s,R/r \+ : \+ 100% plantas con fertilidad
masculina\cr  \+ Autopolinización de s/s,r/r \+ : \+ 100% plantas
con fertilidad masculina\cr \+\+\+\cr  6.2 \+ Autopolinización de
S/s,R/r \+ : \+ La misma progenie que en 5\cr  \+ \+ \+ 13/16
plantas con fertilidad masculina\cr  \+ \+ \+ con 4/13 sensibles a
los herbicidas\cr \+\+\+\cr  6.3 \+ Autopolinización de S/S,R/r \+ :
\+ Progenie como sigue
:\cr}

\vskip1.000000\baselineskip

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

: Así pues: 3/4 plantas con fertilidad masculina, 0% sensibles a herbicidas. Todas las plantas con esterilidad masculina son de genotipo S/S,r/r

\vskip0.800000\baselineskip

7.: Acción: Cruzar

\vskip1.000000\baselineskip

100

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

* esto es igual de hecho a

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

101

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

: Resultado:Progenie con los genotipos siguientes:

\vskip1.000000\baselineskip

26

\vskip0.800000\baselineskip

8.: Acción: De la descendencia de 7, se seleccionan plantas con genotipo S/s,r/r,P/p por escrutinio, mediante{}\hskip1.1cm PCR y/o transferencia Southern, respecto a la presencia de los genes S y P y la ausencia del gen {}\hskip1.1cm R.

\vskip0.800000\baselineskip

: Resultado: Plantas con genotipo S/s,P/p

\vskip0.800000\baselineskip

9.: Acción: Autopolinizar plantas con genotipo S/s,P/p (procedentes de 8)

\vskip0.800000\baselineskip

: Resultado: Progenie con los genotipos siguientes:

\vskip1.000000\baselineskip

27

\vskip0.800000\baselineskip

: Los genotipos no pueden desarrollarse dado que los gametos masculinos (polen) son destruidos por la expresión del gen mantenedor P.

\vskip0.800000\baselineskip

10.: Acción: Autopolinizar plantas con fertilidad masculina de 9.

\vskip0.800000\baselineskip

: Resultado:

\vskip1.000000\baselineskip

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+\hfil#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 10.1 \+ Autopolinización de s/s,P/p \+ : \+ 100% plantas con
fertilidad masculina\cr  \+ Autopolinización de s/s,p/p \+ : \+ 100%
plantas con fertilidad masculina\cr \+\+\+\cr  10.2 \+
Autopolinización de S/s,P/p \+ : \+ misma progenie que en 9\cr  \+
\+ \+ 5/8 plantas con fertilidad masculina\cr  \+ \+ \+ con 2/5
sensibles a los herbicidas\cr \+\+\+\cr  10.3 \+ Autopolinización de
S/S,P/p \+ : \+ Progenie como
sigue:\cr}

\vskip1.000000\baselineskip

280

\vskip0.800000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

* Los genotipos sombreados no pueden desarrollarse dado que los gametos masculinos

\hfill

(polen) son destruidos por la expresión del gen mantenedor P.

\vskip1.000000\baselineskip

RESULTADO FINAL

\vskip0.800000\baselineskip

-: 1/2 plantas con fertilidad masculina, 0% sensibles a los herbicidas. Todas estas

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

plantas son plantas mantenedoras

\hfill

\vskip0.800000\baselineskip

-: 1/2 plantas con esterilidad masculina. Todas ellas con homocigóticas para el gen S de la esterilidad masculina.

Claims

1. Una célula de una planta mantenedora, cuyo genoma nuclear contiene: 1) en un primer locus, un genotipo de esterilidad masculina en condición homocigótica; y 2) en un segundo locus, un gen mantenedor en condición heterocigótica; estando preferiblemente dichos loci primero y segundo no enlazados; siendo dicho gen mantenedor una secuencia de DNA extraña, preferiblemente una secuencia de DNA quimérico extraña, que incluye:

a): un gen restaurador de la fertilidad, que comprende:

i): un DNA restaurador de la fertilidad codificante de un RNA y/o proteína o polipéptido restaurador que, cuando se produce o se produce en exceso en células, preferiblemente células de los estambres, de dicha planta, previene la expresión fenotípica de dicho genotipo de esterilidad nuclear masculina que conferiría a dicha planta esterilidad masculina en ausencia de dicho RNA restaurador, proteína o polipéptido en dichas células de los estambres y

ii): un promotor restaurador capaz de dirigir la expresión de dicho DNA restaurador de la fertilidad al menos en dichas células, preferiblemente dichas células de los estambres, de tal modo que se impide dicha expresión genotípica de dicho genotipo de esterilidad masculina nuclear, encontrándose dicho DNA restaurador de la fertilidad en la misma unidad de transcripción que dicho promotor restaurador y bajo el control del mismo,

b): un gen de letalidad del polen que se expresa selectivamente en microsporas y/o polen de dicha planta para prevenir la producción de polen funcional, y que comprende:

iii): un DNA de letalidad del polen codificante de un RNA y/o proteína o polipéptido de letalidad del polen que, cuando se produce o se produce en exceso en dichas microsporas y/o polen, altera significativamente el metabolismo, el funcionamiento y/o el desarrollo de dichos microsporas y/o polen y

iv): un promotor específico del polen capaz de dirigir la expresión de dicho DNA de letalidad del polen selectivamente en dichas microsporas y/o polen, encontrándose dicho DNA de letalidad del polen en la misma unidad de transcripción que dicho promotor específico del polen, y bajo el control del mismo.

2. La célula de la reivindicación 1, en la cual dicho gen mantenedor contiene también, preferiblemente en dicho segundo locus, un primer gen marcador que comprende:

v): un primer DNA marcador que codifica un primer RNA y/o proteína o polipéptido marcador que, cuando está presente al menos en un primer tejido específico o células específicas de dicha planta, hace que dicha planta pueda separarse fácilmente de otras plantas que no contienen dicho primer RNA, proteína o polipéptido marcador al menos en dicho primer tejido específico o células específicas y

(vi): un primer promotor marcador capaz de dirigir la expresión de dicho primer DNA marcador al menos en dicho primer tejido específico o células específicas, encontrándose dicho primer DNA marcador en la misma unidad de transcripción que dicho primer promotor marcador, y bajo el control del mismo.

3. La célula de la reivindicación 1 ó 2, en la cual dicho genotipo de esterilidad masculina es extraño a dicha planta y es un gen de esterilidad masculina que es una secuencia de DNA extraña, preferiblemente una secuencia de DNA extraña quimérica, que comprende:

1): un DNA de esterilidad masculina codificante de un RNA y/o proteína o polipéptido de esterilidad que, cuando se produce o se produce en exceso en dichas células de los estambres de dicha planta en ausencia de dicho RNA, proteína o polipéptido restaurador, altera significativamente el metabolismo, el funcionamiento y/o el desarrollo de dichas células de los estambres y

2): un promotor de esterilidad capaz de dirigir la expresión de dicho RNA de esterilidad masculina selectivamente en dichas células de los estambres, encontrándose dicho DNA de esterilidad masculina en la misma unidad de transcripción que dicho promotor de esterilidad, y bajo el control del mismo.

4. La célula de la reivindicación 3, en la cual dicho genotipo de esterilidad masculina contiene también, preferiblemente en dicho primer locus, un segundo gen marcador que comprende:

3): un segundo DNA marcador codificante de un segundo RNA y/o proteína o polipéptido marcador que, cuando está presente al menos en un segundo tejido específico o células específicas de dicha planta, hace que dicha planta pueda separarse fácilmente de otras plantas que no contienen dicho segundo RNA, proteína o polipéptido marcador al menos en dicho segundo tejido específico o células específicas y

4): un segundo promotor marcador capaz de dirigir la expresión de dicho segundo DNA marcador al menos en dicho tejido específico o células específicas, encontrándose dicho segundo DNA marcador en la misma unidad de transcripción que dicho segundo promotor marcador, y bajo el control del mismo.

5. La célula de la reivindicación 3 ó 4, en la cual dicho DNA de esterilidad masculina codifica Barnasa.

6. La célula de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en la cual dicho promotor de esterilidad se selecciona entre el promotor TA29 de Nicotiana tabacum y los promotores de SEQ ID Nos. 7 a 10.

7. La célula de la reivindicación 5 ó 6, en la cual dicho DNA restaurador codifica Barstar.

8. La célula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la cual dicho promotor restaurador se selecciona entre el promotor TA29 de Nicotiana tabacum y los promotores de SEQ ID Nos. 7 a 10.

9. La célula de la reivindicación 1 ó 2, en la cual dicho genotipo de esterilidad masculina es endógeno para dicha planta y es homocigótico para un alelo recesivo.

10. La célula de la reivindicación 9, en la cual dicho gen restaurador de la fertilidad es el alelo dominante del genotipo de esterilidad masculina endógeno, preferiblemente bajo el control de su promotor natural.

11. La célula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la cual dicho DNA de letalidad del polen codifica una ribonucleasa, preferiblemente RNAsa T1 o Barnasa.

12. La célula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la cual dicho promotor específico del polen es el promotor Zm13 de SEQ ID NO. 1.

13. La célula de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 12, en la cual dicho primer DNA marcador o dicho segundo DNA marcador es: un gen de resistencia a los herbicidas, particularmente un gen sfr o sfrv; un gen codificante de una enzima diana modificada para un herbicida que tiene menor afinidad para el herbicida, particularmente una 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato-sintasa modificada como una diana para glifosato o una glutamina-sintetasa modificada como una diana para un inhibidor de glutamina-sintetasa tal como fosfinotricina; un gen codificante de una proteína que confiere resistencia al herbicida sulfonilurea; un gen que codifica una proteína que confiere resistencia al herbicida bromoxinil; un gen codificante de una proteína que confiere resistencia al herbicida 2,4 D; un gen codificante de una proteína o un polipéptido que confiere un color a al menos dicho primer o segundo tejido específico o células específicas, particularmente el gen A1 o el gen de glucuronidasa; un gen codificante de una proteína o un polipéptido que confiere tolerancia al estrés a dicha planta, particularmente un gen codificante de Mn-superóxido-dismutasa; un gen codificante de una proteína o un polipéptido que confiere resistencia a una enfermedad o plaga, particularmente un gen codificante de una endotoxina de Bacillus thuringiensis que confiere resistencia a los insectos; o un gen codificante de un péptido bactericida que confiere resistencia bacteriana.

14. La célula de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 13, en la cual dicho primer promotor marcador o dicho segundo promotor marcador es: un promotor constitutivo, particularmente un promotor 35S, un promotor 35S'3, un promotor PNOS o un promotor POCS, un promotor inducible por heridas, particularmente un promotor TR1' o TR2'; un promotor que dirige la expresión génica selectivamente en un tejido vegetal que tiene actividad fotosintética, particularmente un promotor SSU; o un promotor que dirige la expresión génica selectivamente en las células de las hojas, células de los pétalos o células de las semillas, particularmente células de la envoltura de las semillas.

15. La célula de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 12, en la cual dicho primer DNA marcador y dicho segundo DNA marcador son diferentes.

16. Un cultivo de células vegetales constituido esencialmente por las células de las plantas de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.

17. Una planta, particularmente maíz, colza oleaginosa, trigo, arroz, girasol, remolacha azucarera, tomate, lechuga, pimientos, sorgo, soja, guisantes, alfalfa, céspedes, tréboles, zanahoria, coles, puerro, cebolla, tabaco, petunia, cacao y cítricos, más particularmente maíz, colza oleaginosa, trigo y arroz, constituido esencialmente por las células vegetales de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.

18. Una semilla de la planta de la reivindicación 17, constituida esencialmente por las células vegetales de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.

19. Un gen mantenedor para mantener una población homogénea de plantas con esterilidad masculina, que comprende:

a): un gen restaurador de la fertilidad que comprende:

i): un DNA restaurador de la fertilidad codificante de un RNA y/o proteína o polipéptido restaurador que, cuando se produce o se produce en exceso en las células, preferiblemente células de los estambres, de una planta, impide la expresión fenotípica de un genotipo de esterilidad masculina nuclear que conferiría a dicha planta esterilidad masculina en ausencia de dicho RNA restaurador, proteína o polipéptido de dichas células de los estambres y

ii): un promotor restaurador capaz de dirigir la expresión de dicho DNA restaurador de la fertilidad al menos en dichas células, preferiblemente dichas células de los estambres, de tal modo que se impide dicha expresión fenotípica de dicho genotipo de esterilidad masculina nuclear, encontrándose dicho DNA restaurador de la fertilidad en la misma unidad de transcripción que dicho promotor restaurador, y bajo el control del mismo, y

iii): un DNA de letalidad del polen codificante de un RNA y/o proteína o polipéptido de letalidad del polen que, cuando se produce o se produce en exceso en dichas microsporas y/o polen, altera significativamente el metabolismo, funcionamiento y/o desarrollo de dichas microsporas y/o polen y

20. Un vector para transformar una célula de una planta, que comprende el gen mantenedor de la reivindicación 19.

21. Un método para mantener una población homogénea de plantas con esterilidad masculina o sus semillas, cuyo genoma nuclear contiene, en dicho primer locus de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3-6 y 9, dicho genotipo de esterilidad masculina de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 1-6 y 9 en condición homocigótica; comprendiendo dicho método el paso de cruzar dichas plantas con esterilidad masculina con la planta de la reivindicación 17.