JP3143120B2 - 変更された花、種又は胚芽をもつ植物 - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、外来性DNA配列がその核ゲノム内に安定し
た形で組み込まれるように細胞が形質転換された雌性不
稔植物及びその繁殖性材料（例えば種子）に関する。本
発明の外来性DNA配列は、１）植物の花、特にその雌器
又は種子又は胚芽の細胞内で産生又は過剰産生された
場合、この花又は種子又は胚芽の細胞の代謝、機能及び
／又は発生を有意に妨害することができる第１のタンパ
ク質又はポリペプチドをコードし、２）前記植物の花、
特にその単数又は複数の雌器、又は種子又は胚芽の細胞
内で選択的に雌性不稔DNAの発現を誘導することができ
る第１のプロモーターと同じ転写単位内にあって、この
プロモーターの制御下にある、第１の外来性DNA（「雌
性不稔DNA」と呼ぶ）を含む。特に、本発明は、これに
基づく外来性DNA配列が第２の外来性DNA（「標識DNA」
と呼ぶ）をも含みうる外来性キメラDNA配列である核雌
性不稔植物及びその繁殖材料に関し、ここで第２の外来
性DNAとは、１）植物の少なくとも特定の細胞又は特定
の組織内に存在する場合、この植物全体を、少なくとも
特定の組織又は特定の細胞内に第２のタンパク質又はポ
リペプチドを含まないその他の植物から、容易に分離で
きるようにする第２のタンパク質又はポリペプチドをコ
ードし、２）植物の少なくとも特定の細胞又は特定の組
織内で該標識DNAの発現を誘導することのできる第２の
プロモーターを含み、同じ転写単位内にあって、このプ
ロモーターの制御下にあり、３）雌性不稔DNAと同じ植
物細胞核ゲノムの遺伝子座内にあるものである。本発明
は同様に、少なくとも１つの第１のプロモーターの制御
下にある少なくとも１つの雌性不稔DNAを含み、しかも
雌性不稔DNA及び第１のプロモーターに隣接して、少な
くとも１つの第２のプロモーターの制御下にある少なく
とも１つの標識DNAをも含みうるような外来性キメラDNA
配列にも関する。
た形で組み込まれるように細胞が形質転換された雌性不
稔植物及びその繁殖性材料（例えば種子）に関する。本
発明の外来性DNA配列は、１）植物の花、特にその雌器
又は種子又は胚芽の細胞内で産生又は過剰産生された
場合、この花又は種子又は胚芽の細胞の代謝、機能及び
／又は発生を有意に妨害することができる第１のタンパ
ク質又はポリペプチドをコードし、２）前記植物の花、
特にその単数又は複数の雌器、又は種子又は胚芽の細胞
内で選択的に雌性不稔DNAの発現を誘導することができ
る第１のプロモーターと同じ転写単位内にあって、この
プロモーターの制御下にある、第１の外来性DNA（「雌
性不稔DNA」と呼ぶ）を含む。特に、本発明は、これに
基づく外来性DNA配列が第２の外来性DNA（「標識DNA」
と呼ぶ）をも含みうる外来性キメラDNA配列である核雌
性不稔植物及びその繁殖材料に関し、ここで第２の外来
性DNAとは、１）植物の少なくとも特定の細胞又は特定
の組織内に存在する場合、この植物全体を、少なくとも
特定の組織又は特定の細胞内に第２のタンパク質又はポ
リペプチドを含まないその他の植物から、容易に分離で
きるようにする第２のタンパク質又はポリペプチドをコ
ードし、２）植物の少なくとも特定の細胞又は特定の組
織内で該標識DNAの発現を誘導することのできる第２の
プロモーターを含み、同じ転写単位内にあって、このプ
ロモーターの制御下にあり、３）雌性不稔DNAと同じ植
物細胞核ゲノムの遺伝子座内にあるものである。本発明
は同様に、少なくとも１つの第１のプロモーターの制御
下にある少なくとも１つの雌性不稔DNAを含み、しかも
雌性不稔DNA及び第１のプロモーターに隣接して、少な
くとも１つの第２のプロモーターの制御下にある少なく
とも１つの標識DNAをも含みうるような外来性キメラDNA
配列にも関する。
本発明はさらに、本発明に基づく外来性DNA配列を含
み、植物細胞の形質転換に適しており、かくしてこの外
来性DNA配列が細胞の核ゲノム内に安定した形で組み込
まれることになるようなベクターにも関する。
み、植物細胞の形質転換に適しており、かくしてこの外
来性DNA配列が細胞の核ゲノム内に安定した形で組み込
まれることになるようなベクターにも関する。
本発明はさらに、上記外来性DNA配列で形質転換され
た核ゲノムを有する植物の細胞及び植物細胞培養にも関
する。
た核ゲノムを有する植物の細胞及び植物細胞培養にも関
する。
本発明はさらに、外来性DNA配列を含む核雌性不稔雄
性不稔植物及びその繁殖材料の生産方法にも関し、ここ
で雌性不稔DNAは、１）第１のプロモーターの制御下に
あり、２）植物の細胞の核ゲノム内に安定した形で組み
込まれ、３）第１のタンパク質又はポリペプチドの形
で、植物の各々の花、特にその雌器、又は各々の種子又
は各々の胚芽の細胞内で選択的に発現され得、かつ、場
合によっては４）第２のプロモーターの制御下にある標
識DNAと同じ遺伝子座内にあること、を特徴とするもの
である。
性不稔植物及びその繁殖材料の生産方法にも関し、ここ
で雌性不稔DNAは、１）第１のプロモーターの制御下に
あり、２）植物の細胞の核ゲノム内に安定した形で組み
込まれ、３）第１のタンパク質又はポリペプチドの形
で、植物の各々の花、特にその雌器、又は各々の種子又
は各々の胚芽の細胞内で選択的に発現され得、かつ、場
合によっては４）第２のプロモーターの制御下にある標
識DNAと同じ遺伝子座内にあること、を特徴とするもの
である。
本発明はさらに、１）好ましくは植物に対し除草剤に
対する抵抗性を付与するタンパク質をコードする標識DN
Aをその核ゲノム中に含んでいてもよい本発明に基づく
雌性不稔植物と、２）そのゲノム内に標識DNAのない雌
性稔性植物とを交配させることによる、生長して雑種植
物になるような雑種種子の生産方法にも関する。本発明
は特に、商業的規模で、好ましくは実質的に無作為の個
体群で、広範な手仕事を必要とせずに雑種種子を生産す
るための方法に関する。
対する抵抗性を付与するタンパク質をコードする標識DN
Aをその核ゲノム中に含んでいてもよい本発明に基づく
雌性不稔植物と、２）そのゲノム内に標識DNAのない雌
性稔性植物とを交配させることによる、生長して雑種植
物になるような雑種種子の生産方法にも関する。本発明
は特に、商業的規模で、好ましくは実質的に無作為の個
体群で、広範な手仕事を必要とせずに雑種種子を生産す
るための方法に関する。
発明の背景 植物の雑種形成は、親株の望ましい形質の組み合せを
もつ子孫を生産するための重要なプロセスとして認めら
れている。結果として得られた雑種の子孫は、往々にし
て、収量、環境変化に対する適応能力及び疾病抵抗性等
のさまざまな形質において、親株をしのぐ能力をもつ。
この能力は「ヘテロシス（雑種強勢）」又は「ハイブリ
ッド・ヴィガー（雑種強勢）」と呼ばれる。その結果、
雑種形成は、トウモロコシ、サトウキビ及びヒマワリ等
の主要作物を改良するために広く用いられてきた。主と
してほとんどの植物が自家受粉及び他家受粉の両方を受
けることができるという事実に関連する数多くの理由か
ら、雑種種子の収穫物を生産するためのさほど自家受粉
を伴わない制御された植物の他家受粉は、商業的規模で
は達成し難いことであった。
もつ子孫を生産するための重要なプロセスとして認めら
れている。結果として得られた雑種の子孫は、往々にし
て、収量、環境変化に対する適応能力及び疾病抵抗性等
のさまざまな形質において、親株をしのぐ能力をもつ。
この能力は「ヘテロシス（雑種強勢）」又は「ハイブリ
ッド・ヴィガー（雑種強勢）」と呼ばれる。その結果、
雑種形成は、トウモロコシ、サトウキビ及びヒマワリ等
の主要作物を改良するために広く用いられてきた。主と
してほとんどの植物が自家受粉及び他家受粉の両方を受
けることができるという事実に関連する数多くの理由か
ら、雑種種子の収穫物を生産するためのさほど自家受粉
を伴わない制御された植物の他家受粉は、商業的規模で
は達成し難いことであった。
自然界においては、作物植物の大部分は、同じ植物上
の、通常は同じ花の中で互いに近いところに、雄性及び
雌性の繁殖器を形成する。これは自家受粉に有利に働
く。しかしながらいくつかの植物は、他家受粉に有利に
作用するその繁殖器の特別な形態の結果、その例外とな
っている。これらの植物は、改良された生長力及び適応
能力をもつ雑種の子孫を生成する。Cannabis ssp.（大
麻）におけるこのような形態の１つでは、別々の植物に
雄器と雌器がある。Zea mays（トウモロコシ）における
もう１つのこのような形態では、同一植物の異なる部分
に雄器及び雌器がある。Elaeis guineensis（ギネアア
ブラヤシ）におけるもう１つのこのような形態には、植
物の発生中の異なる時期に稔性となる雄性及び雌性の繁
殖体がある。
の、通常は同じ花の中で互いに近いところに、雄性及び
雌性の繁殖器を形成する。これは自家受粉に有利に働
く。しかしながらいくつかの植物は、他家受粉に有利に
作用するその繁殖器の特別な形態の結果、その例外とな
っている。これらの植物は、改良された生長力及び適応
能力をもつ雑種の子孫を生成する。Cannabis ssp.（大
麻）におけるこのような形態の１つでは、別々の植物に
雄器と雌器がある。Zea mays（トウモロコシ）における
もう１つのこのような形態では、同一植物の異なる部分
に雄器及び雌器がある。Elaeis guineensis（ギネアア
ブラヤシ）におけるもう１つのこのような形態には、植
物の発生中の異なる時期に稔性となる雄性及び雌性の繁
殖体がある。
Ananas comosus（パイナップル）等のその他のいくつ
かの植物種は、その繁殖器の特殊な生理学を通して他家
受粉に有利に作用している。このような植物は、１つの
植物の花粉が同じ植物の又は同じ遺伝子型をもつ他の植
物の雌繁殖体と受精できないようにするいわゆる「自家
不和合性システム」を発達させている。
かの植物種は、その繁殖器の特殊な生理学を通して他家
受粉に有利に作用している。このような植物は、１つの
植物の花粉が同じ植物の又は同じ遺伝子型をもつ他の植
物の雌繁殖体と受精できないようにするいわゆる「自家
不和合性システム」を発達させている。
その他のいくつかの種は、いわゆる「雄性不稔」のゲ
ノム特性を自然に示すことにより、他家受粉に有利に作
用する。この特性により、植物の葯（やく）は、葯が生
成した花粉が成熟してしまわないうちに退化する。
〔「Male−Sterility in Higher Plants」、M.L.H.Kaul
1987年（Monographs on Theoretical and Applied Gen
etics 10,Springer−Verlag出版）を参照のこと。〕こ
のような天然の雄性不稔特性は、劣性欠失が関与するこ
とが多い広範な天然の突然変異の結果として生じるもの
と考えられており、天然の条件下では種子が生成されな
いことから優勢に自家受粉する植物種においてはこの特
性を維持することは容易でない。
ノム特性を自然に示すことにより、他家受粉に有利に作
用する。この特性により、植物の葯（やく）は、葯が生
成した花粉が成熟してしまわないうちに退化する。
〔「Male−Sterility in Higher Plants」、M.L.H.Kaul
1987年（Monographs on Theoretical and Applied Gen
etics 10,Springer−Verlag出版）を参照のこと。〕こ
のような天然の雄性不稔特性は、劣性欠失が関与するこ
とが多い広範な天然の突然変異の結果として生じるもの
と考えられており、天然の条件下では種子が生成されな
いことから優勢に自家受粉する植物種においてはこの特
性を維持することは容易でない。
その他のいくつかの植物は、雌性配偶体、雌性繁殖
体、雌性接合体又は種子のいずれかの機能不全のために
「雌性不稔」特性を自然に示すことによって、他家受粉
に有利に作用している。これらの植物は生存種子を全く
生産しない。雌性繁殖器の特定の組織の全ての発生段階
が関与する数多くの異なる突然変異がこの状態を導き出
し得る。この特性により、雌性不稔は、より広く知られ
ている雄性不稔及び自家不和合性等の現象と区別され
る。１つの種が生産できる子孫の数を減少させるもの
の、雌性不稔形質は、いくつかの植物、特に多年生植物
にとって自然の中でのいくつかの進化面の利点を有して
いる。多年生植物においては、栄養成長速度は植物の栄
養組織と繁殖組織の間のバイオマス（生物物質）の分布
によって大方決定される。したがって、雌性不稔植物
は、雌性不稔性植物に比べより勢いよく生長する傾向を
もつ。
体、雌性接合体又は種子のいずれかの機能不全のために
「雌性不稔」特性を自然に示すことによって、他家受粉
に有利に作用している。これらの植物は生存種子を全く
生産しない。雌性繁殖器の特定の組織の全ての発生段階
が関与する数多くの異なる突然変異がこの状態を導き出
し得る。この特性により、雌性不稔は、より広く知られ
ている雄性不稔及び自家不和合性等の現象と区別され
る。１つの種が生産できる子孫の数を減少させるもの
の、雌性不稔形質は、いくつかの植物、特に多年生植物
にとって自然の中でのいくつかの進化面の利点を有して
いる。多年生植物においては、栄養成長速度は植物の栄
養組織と繁殖組織の間のバイオマス（生物物質）の分布
によって大方決定される。したがって、雌性不稔植物
は、雌性不稔性植物に比べより勢いよく生長する傾向を
もつ。
雌性不稔を誘発する突然変異は、恐らく雄性不稔を誘
発する突然変異と同じくらいの頻度で起こると思われる
が、雌性不稔誘発突然変異は、植物育種及び種子生産に
おいて使用されることがずっと少なく、したがって研究
もはるかに少なく、このような突然変異の例はわずかし
か存在しない。
発する突然変異と同じくらいの頻度で起こると思われる
が、雌性不稔誘発突然変異は、植物育種及び種子生産に
おいて使用されることがずっと少なく、したがって研究
もはるかに少なく、このような突然変異の例はわずかし
か存在しない。
自然の雌性不稔について詳しく調べられている例は、
ギネアアブラヤシ（Elaeis guineensis）についてのも
のであり、これは、いわゆる「pisifera」条件が、発育
中の種子が外皮を生成できないことをその特徴としてい
る。その結果、発育中の種子は早い時期に発育停止し、
熟した果実は全く形成されない。「pisifera」遺伝子型
をコードする遺伝子は、不完全優性対立遺伝子として作
用する。この対立遺伝子に関して同型接合の植物は、種
子の外皮を生成することができず、したがって熟した果
実も種子も全く生成できない。この対立遺伝子に関して
異型接合体の植物は、薄い外皮（0.5〜2mm）を有する種
子及び熟した果実を生成するが、一方、野生型植物（こ
の対立遺伝子をもたない）は、厚み2mmから6mmの外皮を
もつ種子及び熟した果実を生み出す。これら２つの遺伝
子型は種子収量においては識別不能であり、その遺伝子
型は雌性親株の遺伝子型によって決定される。アブラヤ
シの育種においては、あらゆる商業的種子生産において
雄性親株として「pisifera」型が用いられる。「pisife
ra」ヤシからの花粉を野生型の雌性親株と交配させるこ
とにより、薄い外皮の果実を生成する均質のF1雑種種子
の個体群が得られる。
ギネアアブラヤシ（Elaeis guineensis）についてのも
のであり、これは、いわゆる「pisifera」条件が、発育
中の種子が外皮を生成できないことをその特徴としてい
る。その結果、発育中の種子は早い時期に発育停止し、
熟した果実は全く形成されない。「pisifera」遺伝子型
をコードする遺伝子は、不完全優性対立遺伝子として作
用する。この対立遺伝子に関して同型接合の植物は、種
子の外皮を生成することができず、したがって熟した果
実も種子も全く生成できない。この対立遺伝子に関して
異型接合体の植物は、薄い外皮（0.5〜2mm）を有する種
子及び熟した果実を生成するが、一方、野生型植物（こ
の対立遺伝子をもたない）は、厚み2mmから6mmの外皮を
もつ種子及び熟した果実を生み出す。これら２つの遺伝
子型は種子収量においては識別不能であり、その遺伝子
型は雌性親株の遺伝子型によって決定される。アブラヤ
シの育種においては、あらゆる商業的種子生産において
雄性親株として「pisifera」型が用いられる。「pisife
ra」ヤシからの花粉を野生型の雌性親株と交配させるこ
とにより、薄い外皮の果実を生成する均質のF1雑種種子
の個体群が得られる。
雑種種子の商業的生産に用いられる、自然の雌性不稔
をもつ植物のもう１つの例としては、アルファルファが
ある。アルファルファは、雄性不稔遺伝子を有するもの
として知られていたが、雄性不稔及び雌性稔性の植物を
別々の帯状に播いた雑種種子生産システムのテストに際
し、無視できる量の雑種種子が生成されるように思われ
た。この低い生産量は、受粉を担うミツバチが雄性不稔
植物に対し低い親和力しかもたず、雄性稔性植物の自家
受粉に有利に働いたせいであった。すぐれた結実度を得
るには、雄性稔性及び雄性不稔の親株を互いにきわめて
密に（したがって別のうねにではなく）混植することが
必要であると思われた。このことは、雌性不稔遺伝子が
発見され、雄性稔性植物内に交配されたときに可能とな
った。したがって、無作為に播かれた画地内で生産され
うる唯一の種子は、雌性不稔及び雄性不稔親株の間の他
家受粉により得られた雑種種子であった。
をもつ植物のもう１つの例としては、アルファルファが
ある。アルファルファは、雄性不稔遺伝子を有するもの
として知られていたが、雄性不稔及び雌性稔性の植物を
別々の帯状に播いた雑種種子生産システムのテストに際
し、無視できる量の雑種種子が生成されるように思われ
た。この低い生産量は、受粉を担うミツバチが雄性不稔
植物に対し低い親和力しかもたず、雄性稔性植物の自家
受粉に有利に働いたせいであった。すぐれた結実度を得
るには、雄性稔性及び雄性不稔の親株を互いにきわめて
密に（したがって別のうねにではなく）混植することが
必要であると思われた。このことは、雌性不稔遺伝子が
発見され、雄性稔性植物内に交配されたときに可能とな
った。したがって、無作為に播かれた画地内で生産され
うる唯一の種子は、雌性不稔及び雄性不稔親株の間の他
家受粉により得られた雑種種子であった。
その他の作物においても、雌性不稔が報告されてい
る。例えばモロコシ類〔Casady他、（1960年）J.Hered.
51,35−38〕、綿花〔Tustus及びMeyer（1963年）J.Here
d.54,167−168〕、トマト〔Honma及びPratak（1964年）
J.Hered.55,143−145〕、小麦〔Gotzov及びDzelepov（1
974年）Gen.Plant Breed.７.480−487〕及びトウジンヒ
エ〔Hanna及びPowel,J.Hered.65,247−249〕。しかしな
がら、雌性不稔系統を維持するにはいくつかの問題点が
あり、この理由のため、このような系統は商業的に大き
い規模で使用されないのである。
る。例えばモロコシ類〔Casady他、（1960年）J.Hered.
51,35−38〕、綿花〔Tustus及びMeyer（1963年）J.Here
d.54,167−168〕、トマト〔Honma及びPratak（1964年）
J.Hered.55,143−145〕、小麦〔Gotzov及びDzelepov（1
974年）Gen.Plant Breed.７.480−487〕及びトウジンヒ
エ〔Hanna及びPowel,J.Hered.65,247−249〕。しかしな
がら、雌性不稔系統を維持するにはいくつかの問題点が
あり、この理由のため、このような系統は商業的に大き
い規模で使用されないのである。
雄性不稔に比べると、雌性不稔は雑種種子の生産にお
いていくつかのその他の利点を提供する。雌性不稔は、
種なし果実の生産及び栄養バイオマス生産量の向上を可
能にし、いくつかのケースにおいては１つの季節内でよ
り多くの着花を誘発することができる。
いていくつかのその他の利点を提供する。雌性不稔は、
種なし果実の生産及び栄養バイオマス生産量の向上を可
能にし、いくつかのケースにおいては１つの季節内でよ
り多くの着花を誘発することができる。
発明の概要 本発明に従うと、細胞の核ゲノム内に安定した形で組
み込まれた状態の外来性DNA配列、好ましくはキメラDNA
配列を含む核ゲノムを有する植物の細胞において、該外
来性DNA配列が、 ａ）前記植物の花、特にその雌器、又は種子又は胚芽の
細胞内で産生又は過剰産生された場合、この花又は種子
又は胚芽の細胞の代謝、機能及び／又は発生を有意に妨
害する第１のタンパク質又はポリペプチドをコードする
雌性不稔DNA、及び ｂ）前記植物の花、特にその雌器、又は種子又は胚芽の
細胞内で選択的に雌性不稔DNAの発現を誘導することが
できる第１のプロモーター（なお、雌性不稔DNAはこの
第１のプロモーターと同じ転写単位内にあり、このプロ
モーターの制御下にある） を特徴とする植物細胞が提供される。
み込まれた状態の外来性DNA配列、好ましくはキメラDNA
配列を含む核ゲノムを有する植物の細胞において、該外
来性DNA配列が、 ａ）前記植物の花、特にその雌器、又は種子又は胚芽の
細胞内で産生又は過剰産生された場合、この花又は種子
又は胚芽の細胞の代謝、機能及び／又は発生を有意に妨
害する第１のタンパク質又はポリペプチドをコードする
雌性不稔DNA、及び ｂ）前記植物の花、特にその雌器、又は種子又は胚芽の
細胞内で選択的に雌性不稔DNAの発現を誘導することが
できる第１のプロモーター（なお、雌性不稔DNAはこの
第１のプロモーターと同じ転写単位内にあり、このプロ
モーターの制御下にある） を特徴とする植物細胞が提供される。
形質転換された細胞の核ゲノム内の外来性DNA配列
は、さらに、好ましくは雌性不稔DNAと同じ遺伝子座
に、 ｃ）植物の少なくとも特定の細胞又は特定の組織の中に
存在する場合、この植物を、同じ第２のタンパク質又は
ポリペプチドを、少なくともこの特定の細胞又は組織内
に含んでいないその他の植物から容易に分離できるよう
にする第２のタンパク質又はポリペプチドをコードする
標識DNA;及び ｄ）少なくとも特定の細胞又は特定の組織の中で標識DN
Aの発現を誘導することのできる第２のプロモーター
（なお、標識DNAはこの第２のプロモーターと同じ転写
単位内にあり、このプロモーターの制御下にある） をも含むことができる。
は、さらに、好ましくは雌性不稔DNAと同じ遺伝子座
に、 ｃ）植物の少なくとも特定の細胞又は特定の組織の中に
存在する場合、この植物を、同じ第２のタンパク質又は
ポリペプチドを、少なくともこの特定の細胞又は組織内
に含んでいないその他の植物から容易に分離できるよう
にする第２のタンパク質又はポリペプチドをコードする
標識DNA;及び ｄ）少なくとも特定の細胞又は特定の組織の中で標識DN
Aの発現を誘導することのできる第２のプロモーター
（なお、標識DNAはこの第２のプロモーターと同じ転写
単位内にあり、このプロモーターの制御下にある） をも含むことができる。
同様に、本発明に従うと、雌性不稔DNA及び第１のプ
ロモーターを含み、かつ標識DNA及び第２のプロモータ
ーならびに、少なくとも１つの付加的なDNAをも含むこ
とができる外来性キメラDNA配列が提供され、ここで付
加的なDNAとは、外来性キメラDNA配列をその細胞質内で
発現する植物細胞の葉緑体又はミトコンドリア内に第１
のタンパク質又はポリペプチド及び／又は第２のタンパ
ク質又はポリペプチドを移送することができるトランジ
ットペプチド；及び／又は外来性キメラDNA配列を発現
する植物細胞又は植物組織から第１のタンパク質又はポ
リペプチド及び／又は第２のタンパク質又はポリペプチ
ドを分泌させることができる分泌シグナルペプチドをコ
ードするものである。
ロモーターを含み、かつ標識DNA及び第２のプロモータ
ーならびに、少なくとも１つの付加的なDNAをも含むこ
とができる外来性キメラDNA配列が提供され、ここで付
加的なDNAとは、外来性キメラDNA配列をその細胞質内で
発現する植物細胞の葉緑体又はミトコンドリア内に第１
のタンパク質又はポリペプチド及び／又は第２のタンパ
ク質又はポリペプチドを移送することができるトランジ
ットペプチド；及び／又は外来性キメラDNA配列を発現
する植物細胞又は植物組織から第１のタンパク質又はポ
リペプチド及び／又は第２のタンパク質又はポリペプチ
ドを分泌させることができる分泌シグナルペプチドをコ
ードするものである。
さらに本発明に従うと、各々外来性DNA配列を含む細
胞からなる雌性不稔雄性稔性植物及び植物細胞培養；雌
性不稔植物の果実；雌性不稔植物を雌性稔性植物と交配
することによって生成される雑種種子及び植物；及びこ
のような雑種種子ならびに種なし果実の生産方法、も提
供される。
胞からなる雌性不稔雄性稔性植物及び植物細胞培養；雌
性不稔植物の果実；雌性不稔植物を雌性稔性植物と交配
することによって生成される雑種種子及び植物；及びこ
のような雑種種子ならびに種なし果実の生産方法、も提
供される。
さらに、本発明に従うと、花柱、柱頭、子房、種子及
び胚芽に特異的な第１のプロモーターが提供される。
び胚芽に特異的な第１のプロモーターが提供される。
発明の詳細な説明 本発明に従うと、本発明に基づく外来性DNA配列を細
胞の核ゲノム内に安定した形で挿入するための周知の方
法で植物細胞を形質転換することにより、植物の単一細
胞から雌性不稔雄性稔性植物が生産される。この外来性
DNA配列は、その５′末端で第１のプロモーターと融合
され、その制御下にあり、しかも、その３′末端でポリ
アデニル化シグナルを含む適当な転写終結（又は調節）
シグナルと融合されている、少なくとも１つの雌性不稔
DNAを含んでいる。したがって、第１のタンパク質又は
ポリペプチドは、植物を雌性不稔にするため、植物の全
ての胚芽内及び／又は全ての種子内及び／又は全ての
花、特にその単数又は複数の雌器の細胞内で、選択的に
産生又は過剰産生される。外来性DNA配列は同様に、そ
の５′末端で第２のプロモーターと融合され、その制御
下にあり、しかもその３′末端でポリアデニル化シグナ
ルを含む適当な転写終結シグナルと融合されている、少
なくとも１つの標識DNAをも含みうる。標識DNAは好まし
くは雌性不稔DNAと同じ遺伝子座内にあり、それにより
第２のタンパク質又はポリペプチドは、特定の組織又は
特定の範囲内に第２のタンパク質又はポリペプチドを含
まないその他の植物からこの植物を容易に識別及び／又
は分離することができるように、雌性不稔植物の少なく
とも特定の組織又は特定の細胞内で生成される。こうし
て、植物の子孫への雌性不稔DNA及び標識DNAの両方の合
同分離が、高い確実性で保証されることになる。
胞の核ゲノム内に安定した形で挿入するための周知の方
法で植物細胞を形質転換することにより、植物の単一細
胞から雌性不稔雄性稔性植物が生産される。この外来性
DNA配列は、その５′末端で第１のプロモーターと融合
され、その制御下にあり、しかも、その３′末端でポリ
アデニル化シグナルを含む適当な転写終結（又は調節）
シグナルと融合されている、少なくとも１つの雌性不稔
DNAを含んでいる。したがって、第１のタンパク質又は
ポリペプチドは、植物を雌性不稔にするため、植物の全
ての胚芽内及び／又は全ての種子内及び／又は全ての
花、特にその単数又は複数の雌器の細胞内で、選択的に
産生又は過剰産生される。外来性DNA配列は同様に、そ
の５′末端で第２のプロモーターと融合され、その制御
下にあり、しかもその３′末端でポリアデニル化シグナ
ルを含む適当な転写終結シグナルと融合されている、少
なくとも１つの標識DNAをも含みうる。標識DNAは好まし
くは雌性不稔DNAと同じ遺伝子座内にあり、それにより
第２のタンパク質又はポリペプチドは、特定の組織又は
特定の範囲内に第２のタンパク質又はポリペプチドを含
まないその他の植物からこの植物を容易に識別及び／又
は分離することができるように、雌性不稔植物の少なく
とも特定の組織又は特定の細胞内で生成される。こうし
て、植物の子孫への雌性不稔DNA及び標識DNAの両方の合
同分離が、高い確実性で保証されることになる。
植物の細胞（特にAgrobacteriumに感染しうる植物）
は、好ましくは本発明に従うと、外来性DNA配列を含
む、Agrobacteriumが運んでいる非病原化されたTi−プ
ラスミドであるベクターを用いて形質転換される。この
形質転換は、例えば欧州特許公報0,116,718号及び0,27
0,822号に記載されているような手順を用いて行うこと
ができる。好ましいTi−プラスミドベクターは、Ti−プ
ラスミドのＴ−DNAのボーダー配列の間に、又は少なく
とも右ボーダー配列の左側に位置づけられた形で、外来
性DNA配列を含む。当然のことながら、例えば直接遺伝
子移入（例えば欧州特許公報0,223,247号に記載のも
の）、花粉媒介形質転換（例えば欧州特許公報0,270,35
6号、PCT公報W085/01856及び欧州特許公報0,275,069号
に記載のもの）、生体外原形質体（プロトプラスト）形
質転換（例えば米国特許4,684,611号に記載のもの）、
植物RNAウイルス媒介形質転換（例えば欧州特許公報0,0
67,553号及び米国特許4,407,956号に記載のもの）、及
びリポゾーム媒介形質転換（例えば米国特許4,536,475
号に記載のもの）等の手順を用いて、その他のタイプの
ベクターを植物細胞の形質転換のために用いることもで
きる。
は、好ましくは本発明に従うと、外来性DNA配列を含
む、Agrobacteriumが運んでいる非病原化されたTi−プ
ラスミドであるベクターを用いて形質転換される。この
形質転換は、例えば欧州特許公報0,116,718号及び0,27
0,822号に記載されているような手順を用いて行うこと
ができる。好ましいTi−プラスミドベクターは、Ti−プ
ラスミドのＴ−DNAのボーダー配列の間に、又は少なく
とも右ボーダー配列の左側に位置づけられた形で、外来
性DNA配列を含む。当然のことながら、例えば直接遺伝
子移入（例えば欧州特許公報0,223,247号に記載のも
の）、花粉媒介形質転換（例えば欧州特許公報0,270,35
6号、PCT公報W085/01856及び欧州特許公報0,275,069号
に記載のもの）、生体外原形質体（プロトプラスト）形
質転換（例えば米国特許4,684,611号に記載のもの）、
植物RNAウイルス媒介形質転換（例えば欧州特許公報0,0
67,553号及び米国特許4,407,956号に記載のもの）、及
びリポゾーム媒介形質転換（例えば米国特許4,536,475
号に記載のもの）等の手順を用いて、その他のタイプの
ベクターを植物細胞の形質転換のために用いることもで
きる。
好ましくは、本発明に基づく核雌性不稔雄性稔性植物
は、第１のプロモーターの制御下にある雌性不稔DNA及
び好ましくは第２のプロモーターの制御下にある標識DN
Aを含む外来性DNA配列を含む非病原化されたTi−プラス
ミドベクターを用いて植物細胞を形質転換することによ
って提供される。標識DNAは、Ti−プラスミドベクター
内の雌性不稔DNAの上流にあっても下流にあってもよい
が、好ましくは、これら２つは互いに隣接し合い、Ti−
プラスミドベクターのボーダー配列の間にあるかあるい
は少なくとも右ボーダー配列の左側に位置づけされ、植
物細胞の核ゲノム内に一緒に適切に移入されるようにな
っている。しかしながら望まれる場合には、細胞を、最
初雌性不稔DNA及び第１のプロモーターを含む外来性DNA
配列で形質転換し、その後、細胞の核ゲノム内の雌性不
稔DNAの遺伝子座の中又は近くに挿入される標識DNA及び
第２のプロモーターで形質転換してもよいし、あるいは
またこの形質転換を逆に行うこともできる。この目的に
適当なベクターは、外来性DNA配列で細胞を形質転換す
る場合について前述したものと同じである。好ましいベ
クターは、非病原化されたTi−プラスミドベクターであ
る。
は、第１のプロモーターの制御下にある雌性不稔DNA及
び好ましくは第２のプロモーターの制御下にある標識DN
Aを含む外来性DNA配列を含む非病原化されたTi−プラス
ミドベクターを用いて植物細胞を形質転換することによ
って提供される。標識DNAは、Ti−プラスミドベクター
内の雌性不稔DNAの上流にあっても下流にあってもよい
が、好ましくは、これら２つは互いに隣接し合い、Ti−
プラスミドベクターのボーダー配列の間にあるかあるい
は少なくとも右ボーダー配列の左側に位置づけされ、植
物細胞の核ゲノム内に一緒に適切に移入されるようにな
っている。しかしながら望まれる場合には、細胞を、最
初雌性不稔DNA及び第１のプロモーターを含む外来性DNA
配列で形質転換し、その後、細胞の核ゲノム内の雌性不
稔DNAの遺伝子座の中又は近くに挿入される標識DNA及び
第２のプロモーターで形質転換してもよいし、あるいは
またこの形質転換を逆に行うこともできる。この目的に
適当なベクターは、外来性DNA配列で細胞を形質転換す
る場合について前述したものと同じである。好ましいベ
クターは、非病原化されたTi−プラスミドベクターであ
る。
本発明の雌性不稔DNAの選定は重要なことではない。
雌性不稔DNAを中で発現する花及び／又は種子及び／又
は胚芽のいずれかの細胞の適切な代謝、及び／又は機能
及び／又は発生を有害な形で有意に妨害し、好ましくは
この細胞を死に導くような第１のタンパク質又はポリペ
プチドをコードするように、適当な雌性不稔DNAを周知
のやり方で選択し、分離することができる。雌性不稔DN
Aの好ましい例は、（あらゆるグアニン残基の後で結合
を加水分解することによりRNA分子を分解する）RNA分解
酵素T1等のRNA分解酵素及びバルナーゼ；エンドヌクレ
アーゼ等のDNA分解酵素（例・EcoR I）；又は、パパイ
ン等のタンパク質分解酵素（例：パパインチモーゲン及
びパパイン活性タンパク質）をコードする。雌性不稔DN
Aのその他の好ましい例は、T2〔クワタ他（1988年）Eur
o.J.Biochem,176.683−697〕又はRh〔ホリウチ他（1988
年）J.Biochem,103,408−418〕等のリボヌクレアーゼ；
又は特にNicotiana alataの、S1、S2、S3、S6及びS7対
立遺伝子によりコードされる糖タンパク質〔McClure他
（1989年）Nature 342,955−957〕をコードする。
雌性不稔DNAを中で発現する花及び／又は種子及び／又
は胚芽のいずれかの細胞の適切な代謝、及び／又は機能
及び／又は発生を有害な形で有意に妨害し、好ましくは
この細胞を死に導くような第１のタンパク質又はポリペ
プチドをコードするように、適当な雌性不稔DNAを周知
のやり方で選択し、分離することができる。雌性不稔DN
Aの好ましい例は、（あらゆるグアニン残基の後で結合
を加水分解することによりRNA分子を分解する）RNA分解
酵素T1等のRNA分解酵素及びバルナーゼ；エンドヌクレ
アーゼ等のDNA分解酵素（例・EcoR I）；又は、パパイ
ン等のタンパク質分解酵素（例：パパインチモーゲン及
びパパイン活性タンパク質）をコードする。雌性不稔DN
Aのその他の好ましい例は、T2〔クワタ他（1988年）Eur
o.J.Biochem,176.683−697〕又はRh〔ホリウチ他（1988
年）J.Biochem,103,408−418〕等のリボヌクレアーゼ；
又は特にNicotiana alataの、S1、S2、S3、S6及びS7対
立遺伝子によりコードされる糖タンパク質〔McClure他
（1989年）Nature 342,955−957〕をコードする。
雌性不稔DNAのその他の例は、サイトカイニン生合成
の最初の段階に触媒として作用し、Agrobacterium T−D
NAの遺伝子４（cyt）によりコードされる酵素であるイ
ソペンテニルトランスフェラーゼ（転移酵素）；又はオ
ーキシン合成に関与し、Agrobacterium T−DNAの遺伝子
１（aux−１）及び遺伝子２（aux−２）によりコードさ
れる酵素の一方又は両方のような、植物ホルモン合成に
触媒として作用する酵素をコードする。雌性不稔DNAの
さらにその他の例は、グルカナーゼ；ホスホリパーゼA2
のようなリパーゼ〔Verheij他（1981年）Rev.Biochem.P
harmacol.91,92−203〕；脂質ペルオキシダーゼ；又は
植物細胞壁阻害剤をコードする。雌性不稔DNAのさらに
その他の例は、細菌毒素のような植物細胞に対し有毒な
タンパク質（例：ジフテリア毒素のＡ−フラグメント又
はボツリン）をコードする。
の最初の段階に触媒として作用し、Agrobacterium T−D
NAの遺伝子４（cyt）によりコードされる酵素であるイ
ソペンテニルトランスフェラーゼ（転移酵素）；又はオ
ーキシン合成に関与し、Agrobacterium T−DNAの遺伝子
１（aux−１）及び遺伝子２（aux−２）によりコードさ
れる酵素の一方又は両方のような、植物ホルモン合成に
触媒として作用する酵素をコードする。雌性不稔DNAの
さらにその他の例は、グルカナーゼ；ホスホリパーゼA2
のようなリパーゼ〔Verheij他（1981年）Rev.Biochem.P
harmacol.91,92−203〕；脂質ペルオキシダーゼ；又は
植物細胞壁阻害剤をコードする。雌性不稔DNAのさらに
その他の例は、細菌毒素のような植物細胞に対し有毒な
タンパク質（例：ジフテリア毒素のＡ−フラグメント又
はボツリン）をコードする。
雌性不稔DNAのさらにもう１つの例は、 ｉ）本発明の植物の花、種子又は胚芽の細胞に関し内在
性であり、この細胞の中で天然に転写されるDNAの鎖
（ストランド）に相補的なDNAの鎖をコードし、ii）例
えば欧州特許公報0,223,399号に記載されているような
内在性プロモーターの制御下にある、アンチセンスDNA
である。このようなアンチセンスDNAは、花、種子又は
胚芽の細胞内で天然に生成されたRNAのコード部分及び
／又は非コード部分に結合することのできるRNA配列へ
と転写され、天然に生産されたRNAの翻訳を阻害する。
このようなアンチセンスDNAの例としては、本書の例２
中のSTMG07遺伝子、STMG08遺伝子、STMG4B12遺伝子及び
STMG3C9遺伝子のようなSTMGタイプの遺伝子;KT13遺伝子
〔Jofuku及びGoldberg（1989年）The Plant Cell １,10
79−1093〕;2Sアルブミン等の種子特異的貯蔵タンパク
質をコードする遺伝子〔Krebbers他（1988年）、Plant
Physiol.,87,859−866;Altenbach他（1987年）Plant Mo
lecular Biol.８,239−250〕；〔Scolfield及びGouch
（1987年）J.Biol.Chem.262,12202−12208〕；又はcDNA
クローンpMON9608に相当する遺伝子〔Gasser他（1989
年）The Plant Cell １,15〕のアンチセンスDNAがあ
る。このようなアンチセンスDNAは、例えば花柱（STMG0
7、STMG08、STMG4B12、又はSTMG3C9遺伝子のアンチセン
スDNAの場合）；胚芽軸（KT13遺伝子のアンチセンスDNA
の場合）；種子（2Sアルブミンをコードする遺伝子のア
ンチセンスDNAの場合）；及び胚珠細胞（pMON9608のア
ンチセンスDNAの場合）の中で、植物の内在性相補的DNA
鎖（又は遺伝子）の内在性プロモーターの制御下で、植
物の花、種子又は胚芽の細胞の中で天然に発現されう
る。
性であり、この細胞の中で天然に転写されるDNAの鎖
（ストランド）に相補的なDNAの鎖をコードし、ii）例
えば欧州特許公報0,223,399号に記載されているような
内在性プロモーターの制御下にある、アンチセンスDNA
である。このようなアンチセンスDNAは、花、種子又は
胚芽の細胞内で天然に生成されたRNAのコード部分及び
／又は非コード部分に結合することのできるRNA配列へ
と転写され、天然に生産されたRNAの翻訳を阻害する。
このようなアンチセンスDNAの例としては、本書の例２
中のSTMG07遺伝子、STMG08遺伝子、STMG4B12遺伝子及び
STMG3C9遺伝子のようなSTMGタイプの遺伝子;KT13遺伝子
〔Jofuku及びGoldberg（1989年）The Plant Cell １,10
79−1093〕;2Sアルブミン等の種子特異的貯蔵タンパク
質をコードする遺伝子〔Krebbers他（1988年）、Plant
Physiol.,87,859−866;Altenbach他（1987年）Plant Mo
lecular Biol.８,239−250〕；〔Scolfield及びGouch
（1987年）J.Biol.Chem.262,12202−12208〕；又はcDNA
クローンpMON9608に相当する遺伝子〔Gasser他（1989
年）The Plant Cell １,15〕のアンチセンスDNAがあ
る。このようなアンチセンスDNAは、例えば花柱（STMG0
7、STMG08、STMG4B12、又はSTMG3C9遺伝子のアンチセン
スDNAの場合）；胚芽軸（KT13遺伝子のアンチセンスDNA
の場合）；種子（2Sアルブミンをコードする遺伝子のア
ンチセンスDNAの場合）；及び胚珠細胞（pMON9608のア
ンチセンスDNAの場合）の中で、植物の内在性相補的DNA
鎖（又は遺伝子）の内在性プロモーターの制御下で、植
物の花、種子又は胚芽の細胞の中で天然に発現されう
る。
雌性不稔DNAのさらにもう１つの例は、Haseloff及びG
erlach（1988年）Nature 334,585−591に記載されてい
るように一定の与えられた標的配列に対してきわめて特
異的な切断を行うことのできる特異的RNA酵素（すなわ
ち、いわゆる「リボザイム」）をコードする。このよう
なリボザイムは、例えば、STMG07遺伝子、STMG08遺伝
子、STMG4B12遺伝子、STMG3C9遺伝子、KTI3遺伝子、2S
アルブミン等の種子特異的貯蔵タンパク質をコードする
遺伝子、又はcDNAクローンpMON9608に相当する遺伝子に
よりコードされるRNAを標的とするリボザイムである。
erlach（1988年）Nature 334,585−591に記載されてい
るように一定の与えられた標的配列に対してきわめて特
異的な切断を行うことのできる特異的RNA酵素（すなわ
ち、いわゆる「リボザイム」）をコードする。このよう
なリボザイムは、例えば、STMG07遺伝子、STMG08遺伝
子、STMG4B12遺伝子、STMG3C9遺伝子、KTI3遺伝子、2S
アルブミン等の種子特異的貯蔵タンパク質をコードする
遺伝子、又はcDNAクローンpMON9608に相当する遺伝子に
よりコードされるRNAを標的とするリボザイムである。
雌性不稔DNAのさらにその他の例は、花、種子及び／
又は胚芽を、真菌感染等の特定の病気にかかりやすくす
ることのできる生成物をコードする。このような雌性不
稔DNAは、雌性不稔DNAを中で発現していない他の全ての
細胞又は組織がその特定の病気に対する抵抗性をもって
いるような植物で用いることができる。
又は胚芽を、真菌感染等の特定の病気にかかりやすくす
ることのできる生成物をコードする。このような雌性不
稔DNAは、雌性不稔DNAを中で発現していない他の全ての
細胞又は組織がその特定の病気に対する抵抗性をもって
いるような植物で用いることができる。
雌性不稔DNAのさらにもう１つの例は、 １）TNVレプリカーゼ〔Meulewater他（1990年）、Virol
ogy 177,1−11〕のようなウイルス由来のRNA依存性RNA
ポリメラーゼをコードし、本発明の第１のプロモーター
の制御下にある第１の遺伝子、 ならびに、 ２）第２の遺伝子の負鎖（すなわちアンチセンスDNA） の組合せを含み、ここで第２の遺伝子とは、 ｉ）本発明の植物細胞内で産生又は過剰産生された場
合、細胞の代謝、発生及び／又は機能を有意に妨害する
本発明に基づく第１のタンパク質又はポリペプチドをコ
ードし、 ii）その３′末端で、ウイルスRNA複製認識配列、又
はTNVサブゲノミックプロモーター〔Lexis他（1990年）
J.of Virology 64（４）,1726−1733〕のような、いわ
ゆる「ウイルスサブゲノミックプロモーター」の負鎖と
融合され、さらに iii）その５′末端で、本発明に基づく植物細胞内で
の負鎖の発現を誘導することのできる別の適切なプロモ
ーター、例えば本発明に基づく 第１のプロモーターと融合され、その制御下にある、 ものである。ウイルスサブゲノミックプロモーター配列
は、第１の遺伝子によりコードされたウイルス由来のRN
A依存性RNAポリメラーゼによって特異的に認識される。
この認識により、第２の遺伝子の負鎖がセンス鎖として
くり返し複製され、それにより第１のタンパク質又はポ
リペプチドの合成という結果がもたらされる。第１の遺
伝子及び負鎖は両方共本発明の植物細胞の核ゲノムの中
で提供される。これは、１回の形質転換事象、２回の連
続した形質転換事象、又はそのゲノムの中に挿入された
負鎖をもつ植物とそのゲノム内に挿入された第１の遺伝
子をもつ植物との交配によって、達成できる。
ogy 177,1−11〕のようなウイルス由来のRNA依存性RNA
ポリメラーゼをコードし、本発明の第１のプロモーター
の制御下にある第１の遺伝子、 ならびに、 ２）第２の遺伝子の負鎖（すなわちアンチセンスDNA） の組合せを含み、ここで第２の遺伝子とは、 ｉ）本発明の植物細胞内で産生又は過剰産生された場
合、細胞の代謝、発生及び／又は機能を有意に妨害する
本発明に基づく第１のタンパク質又はポリペプチドをコ
ードし、 ii）その３′末端で、ウイルスRNA複製認識配列、又
はTNVサブゲノミックプロモーター〔Lexis他（1990年）
J.of Virology 64（４）,1726−1733〕のような、いわ
ゆる「ウイルスサブゲノミックプロモーター」の負鎖と
融合され、さらに iii）その５′末端で、本発明に基づく植物細胞内で
の負鎖の発現を誘導することのできる別の適切なプロモ
ーター、例えば本発明に基づく 第１のプロモーターと融合され、その制御下にある、 ものである。ウイルスサブゲノミックプロモーター配列
は、第１の遺伝子によりコードされたウイルス由来のRN
A依存性RNAポリメラーゼによって特異的に認識される。
この認識により、第２の遺伝子の負鎖がセンス鎖として
くり返し複製され、それにより第１のタンパク質又はポ
リペプチドの合成という結果がもたらされる。第１の遺
伝子及び負鎖は両方共本発明の植物細胞の核ゲノムの中
で提供される。これは、１回の形質転換事象、２回の連
続した形質転換事象、又はそのゲノムの中に挿入された
負鎖をもつ植物とそのゲノム内に挿入された第１の遺伝
子をもつ植物との交配によって、達成できる。
本発明の外来性DNAに関して用いている「外来性」と
いう語は、この外来性DNA配列が、外来性の雌性不稔DNA
及び／又は外来性の第１のプロモーターを含んでいるこ
とを意味している。雌性不稔DNA及び第１のプロモータ
ーならびに標識DNA、第２のプロモーター、及び外来性D
NA配列内のその他のあらゆるDNAに関して用いている
「外来性」という語は、このようなDNAが、その起源で
ある植物、細菌、動物、真菌、ウイルスその他の細胞内
に自然に見い出される場合と比べ、本発明に従ってこの
ようなDNAにより形質転換された植物細胞内で同じゲノ
ム環境の中にないことを意味している。すなわち、例え
ば、外来性雌性不稔DNA又は標識DNAは、１）原植物内の
核DNAであり、２）形質転換された植物細胞に関し内在
性であり（すなわち形質転換されている植物と同じ遺伝
子型をもつ原植物からのもの）、しかも３）形質転換さ
れた植物細胞内の本発明に基づく外来性DNA配列内で
（原植物からの）３′末端転写調節シグナル及びそれ自
体の内在性プロモーターと同じ転写単位内にあるもの
の、４）形質転換された細胞内で、原植物内で天然にそ
れをとり囲んでいた遺伝子によってとり囲まれることが
ないよう、形質転換された植物の核ゲノム内で原植物内
における場合とは異なる場所に挿入されていることがで
きる。外来性雌性不稔DNA又は標識DNAは、例えば、１）
原植物内の核DNAであり、２）形質転換された植物細胞
に関して内在性であるものの、３）形質転換された植物
細胞内の本発明に基づく外来性キメラDNA配列で、異な
る（つまり独自のものでない）内在性プロモーター及び
／又は３′末端転写調節シグナルと同じ転写単位内にあ
ることもできる。外来性雌性不稔DNA又は標識DNAは同様
に、例えば、１）原植物内の核DNAであり、２）形質転
換された植物細胞に関して内在性のあるものの、３）形
質転換された植物細胞内の本発明の外来性キメラDNA配
列内で非相同プロモーター及び／又は３′末端転写調節
シグナルと同じ転写単位内にあることができる。外来性
雌性不稔DNA又は標識DNAは同様に、例えば、形質転換さ
れた植物細胞に対し非相同で、形質転換された植物細胞
内の本発明に基づく外来性キメラDNA配列内で（例えば
形質転換される植物と同じ遺伝子型をもつ植物の核ゲノ
ムからの）３′転写調節シグナル及び／又は内在性プロ
モーターと同じ転写単位内にあることができる。外来性
雌性不稔DNAの１つの例は、形質転換される植物と同じ
遺伝子型をもつ植物の核ゲノムから由来するもので、
花、種子及び／又は胚芽の形質転換された細胞内でその
代謝、機能及び／又は発生を有意に妨害するため酵素が
過剰産生されるように、形質転換される植物の花、種子
及び／又は胚芽の細胞に関して内在性であるタンパク質
分解酵素又はリボヌクレアーゼのような触媒酵素をコー
ドするものであってよい。好ましくは、雌性不稔DNA及
び標識DNAは、各々、形質転換される植物細胞に対して
非相同である。
いう語は、この外来性DNA配列が、外来性の雌性不稔DNA
及び／又は外来性の第１のプロモーターを含んでいるこ
とを意味している。雌性不稔DNA及び第１のプロモータ
ーならびに標識DNA、第２のプロモーター、及び外来性D
NA配列内のその他のあらゆるDNAに関して用いている
「外来性」という語は、このようなDNAが、その起源で
ある植物、細菌、動物、真菌、ウイルスその他の細胞内
に自然に見い出される場合と比べ、本発明に従ってこの
ようなDNAにより形質転換された植物細胞内で同じゲノ
ム環境の中にないことを意味している。すなわち、例え
ば、外来性雌性不稔DNA又は標識DNAは、１）原植物内の
核DNAであり、２）形質転換された植物細胞に関し内在
性であり（すなわち形質転換されている植物と同じ遺伝
子型をもつ原植物からのもの）、しかも３）形質転換さ
れた植物細胞内の本発明に基づく外来性DNA配列内で
（原植物からの）３′末端転写調節シグナル及びそれ自
体の内在性プロモーターと同じ転写単位内にあるもの
の、４）形質転換された細胞内で、原植物内で天然にそ
れをとり囲んでいた遺伝子によってとり囲まれることが
ないよう、形質転換された植物の核ゲノム内で原植物内
における場合とは異なる場所に挿入されていることがで
きる。外来性雌性不稔DNA又は標識DNAは、例えば、１）
原植物内の核DNAであり、２）形質転換された植物細胞
に関して内在性であるものの、３）形質転換された植物
細胞内の本発明に基づく外来性キメラDNA配列で、異な
る（つまり独自のものでない）内在性プロモーター及び
／又は３′末端転写調節シグナルと同じ転写単位内にあ
ることもできる。外来性雌性不稔DNA又は標識DNAは同様
に、例えば、１）原植物内の核DNAであり、２）形質転
換された植物細胞に関して内在性のあるものの、３）形
質転換された植物細胞内の本発明の外来性キメラDNA配
列内で非相同プロモーター及び／又は３′末端転写調節
シグナルと同じ転写単位内にあることができる。外来性
雌性不稔DNA又は標識DNAは同様に、例えば、形質転換さ
れた植物細胞に対し非相同で、形質転換された植物細胞
内の本発明に基づく外来性キメラDNA配列内で（例えば
形質転換される植物と同じ遺伝子型をもつ植物の核ゲノ
ムからの）３′転写調節シグナル及び／又は内在性プロ
モーターと同じ転写単位内にあることができる。外来性
雌性不稔DNAの１つの例は、形質転換される植物と同じ
遺伝子型をもつ植物の核ゲノムから由来するもので、
花、種子及び／又は胚芽の形質転換された細胞内でその
代謝、機能及び／又は発生を有意に妨害するため酵素が
過剰産生されるように、形質転換される植物の花、種子
及び／又は胚芽の細胞に関して内在性であるタンパク質
分解酵素又はリボヌクレアーゼのような触媒酵素をコー
ドするものであってよい。好ましくは、雌性不稔DNA及
び標識DNAは、各々、形質転換される植物細胞に対して
非相同である。
雌性不稔DNA、第１のプロモーター、標識DNA、第２の
プロモーター及び本発明の外来性DNA配列内のその他の
あらゆるDNAに関して用いる「非相同」という語は、こ
のようなDNAが、形質転換される植物と同じ遺伝子型を
もつ植物の細胞の核ゲノム内に天然に見い出せないこと
を意味している。非相同DNAの例としては、形質転換さ
れる植物と同じ遺伝子型をもつ植物から得られる葉緑体
DNA及びミトコンドリアDNAがあるが、好ましい例は、形
質転換される植物と異なる遺伝子型をもつ植物からの葉
緑体DNA、ミトコンドリアDNA及び核DNA、動物及び細菌
ゲノムからのDNA、及び真菌及びウイルスのゲノムから
の染色体及びプラスミドDNAである。
プロモーター及び本発明の外来性DNA配列内のその他の
あらゆるDNAに関して用いる「非相同」という語は、こ
のようなDNAが、形質転換される植物と同じ遺伝子型を
もつ植物の細胞の核ゲノム内に天然に見い出せないこと
を意味している。非相同DNAの例としては、形質転換さ
れる植物と同じ遺伝子型をもつ植物から得られる葉緑体
DNA及びミトコンドリアDNAがあるが、好ましい例は、形
質転換される植物と異なる遺伝子型をもつ植物からの葉
緑体DNA、ミトコンドリアDNA及び核DNA、動物及び細菌
ゲノムからのDNA、及び真菌及びウイルスのゲノムから
の染色体及びプラスミドDNAである。
本発明の外来性DNA配列に関して用いる「キメラ」と
いう語は、その雌性不稔DNAのうち少なくとも１つが、
１）天然には、その１つの雌性不稔DNAに対するその第
１のプロモーターの制御下になく、及び／又は２）天然
には、その標識DNAのうち少なくとも１つと同じ遺伝子
座の中に見い出されない、ということを意味している。
本発明に基づく外来性キメラDNA配列の例としては、植
物起源の第１のプロモーターの制御下にある細菌起源の
雌性不稔DNA、及び、植物起源の第１のプロモーターの
制御下にあり、細菌起源の標識DNAと同じ遺伝子座にあ
る植物起源の雌性不稔DNA、がある。
いう語は、その雌性不稔DNAのうち少なくとも１つが、
１）天然には、その１つの雌性不稔DNAに対するその第
１のプロモーターの制御下になく、及び／又は２）天然
には、その標識DNAのうち少なくとも１つと同じ遺伝子
座の中に見い出されない、ということを意味している。
本発明に基づく外来性キメラDNA配列の例としては、植
物起源の第１のプロモーターの制御下にある細菌起源の
雌性不稔DNA、及び、植物起源の第１のプロモーターの
制御下にあり、細菌起源の標識DNAと同じ遺伝子座にあ
る植物起源の雌性不稔DNA、がある。
「花」というのは、花の器官全体、ならびにその単数
又は複数の個々の部分、例えばその苗状軸（又はshoot
apex茎端）、がく片、花弁、雄性繁殖器（又は雄ずい）
又は雄性繁殖器（又は心皮）を含み、本発明に従ってそ
の全体又は一部分の発育が遅らされたり止められると、
花の中の生存種子の発生が妨げられるが雄性繁殖体の発
生は妨げられないようなものを意味する。「雌器」とい
うのは、雌性繁殖体及び／又は生存種子及び／又は生存
胚芽、ならびにその単数又は複数の個々の部分、例えば
その胚珠、子房、花柱、柱頭、花冠、花盤、がく及び胎
座組織等の生産に関与する花の器官全体のことである。
「胚芽」というのは、植物の胚芽全体、ならびに単数又
は複数のその個々の部分、例えば胚芽軸及び子葉を含む
ものである。
又は複数の個々の部分、例えばその苗状軸（又はshoot
apex茎端）、がく片、花弁、雄性繁殖器（又は雄ずい）
又は雄性繁殖器（又は心皮）を含み、本発明に従ってそ
の全体又は一部分の発育が遅らされたり止められると、
花の中の生存種子の発生が妨げられるが雄性繁殖体の発
生は妨げられないようなものを意味する。「雌器」とい
うのは、雌性繁殖体及び／又は生存種子及び／又は生存
胚芽、ならびにその単数又は複数の個々の部分、例えば
その胚珠、子房、花柱、柱頭、花冠、花盤、がく及び胎
座組織等の生産に関与する花の器官全体のことである。
「胚芽」というのは、植物の胚芽全体、ならびに単数又
は複数のその個々の部分、例えば胚芽軸及び子葉を含む
ものである。
本発明に基づく雌性不稔DNAが、花、特にその単数又
は複数の雌器の細胞中、種子の細胞中及び／又は本発明
の植物の胚芽の細胞中で選択的に発現されるためには、
外来性DNA配列内の雌性不稔DNAを制御する第１のプロモ
ーターが、植物の花、種子及び／又は胚芽の細胞内で選
択的に遺伝子発現を誘導することができるプロモーター
であることが好ましい。このような花、種子及び／又は
胚芽特異的プロモーターは、内在性プロモーター又は外
来性プロモーターであってよく、植物細胞の核ゲノムか
らのものでも、ミトコンドリア又は葉緑体ゲノムからの
ものでもよい。いずれの場合でも、第１のプロモーター
は、形質転換される植物細胞の核ゲノムに対し外来性の
ものである。好ましくは、第１のプロモーターは、雌性
不稔DNAが、花、特にその単数及び複数の雌器、又は種
子又は胚芽の、単数又は複数の特定の組織の細胞内、特
に花柱細胞、子房細胞、隔膜細胞、種皮細胞、胚乳細
胞、胚芽軸細胞及び／又は子葉細胞の中でのみ発現され
るようにする。
は複数の雌器の細胞中、種子の細胞中及び／又は本発明
の植物の胚芽の細胞中で選択的に発現されるためには、
外来性DNA配列内の雌性不稔DNAを制御する第１のプロモ
ーターが、植物の花、種子及び／又は胚芽の細胞内で選
択的に遺伝子発現を誘導することができるプロモーター
であることが好ましい。このような花、種子及び／又は
胚芽特異的プロモーターは、内在性プロモーター又は外
来性プロモーターであってよく、植物細胞の核ゲノムか
らのものでも、ミトコンドリア又は葉緑体ゲノムからの
ものでもよい。いずれの場合でも、第１のプロモーター
は、形質転換される植物細胞の核ゲノムに対し外来性の
ものである。好ましくは、第１のプロモーターは、雌性
不稔DNAが、花、特にその単数及び複数の雌器、又は種
子又は胚芽の、単数又は複数の特定の組織の細胞内、特
に花柱細胞、子房細胞、隔膜細胞、種皮細胞、胚乳細
胞、胚芽軸細胞及び／又は子葉細胞の中でのみ発現され
るようにする。
本発明に基づく第１のプロモーターは、植物の花、種
子、及び／又は胚芽を殺す又は不能にし、植物が雌性稔
性繁殖体は、生存種子及び／又は生存胚芽を生産できな
いようにするため、第１のプロモーターが植物の花、種
子及び／又は胚芽の細胞内で選択的に雌性不稔DNAの発
現を誘導するよう、雌性不稔にされるべき植物から周知
の方法で選択及び分離することができる。この第１のプ
ロモーターは、好ましくは、植物が雄性稔性でありつづ
けるように、特に花の雄器内で、雌性稔性繁殖体、生存
種子及び／又は生存胚芽の生産に関与していないその植
物のその他の部分における雌性不稔DNAの発現を妨げる
のに有効であるように、選択及び分離する。例えば、適
当な花特異的（好ましくは雌性繁殖器特異的）、種子特
異的又は胚芽特異的な第１のプロモーターを、以下の作
業により雌性不稔にされるべき植物内で識別及び分離す
ることができる： 1.花、種子又は胚芽、好ましくは子房、花柱、胎座、が
く、胚盤、隔膜、種皮、胚乳又は胎盤の発生中のみに植
物内に存在しているmRNAを探すこと； 2.この花、種子又は胚芽特異的mRNAを単離すること； 3.この特異的RNAからcDNAを調製すること； 4.このcDNAをプローブとして用いて、この特異的mRNAを
コードするDNAを含む植物ゲノム内の領域を識別するこ
と；そして次に、 5.この特異的mRNAをコードするDNAから上流（すなわち
５′側）にあり、このDNAのプロモーターを含む植物ゲ
ノムの一部分を識別すること。
子、及び／又は胚芽を殺す又は不能にし、植物が雌性稔
性繁殖体は、生存種子及び／又は生存胚芽を生産できな
いようにするため、第１のプロモーターが植物の花、種
子及び／又は胚芽の細胞内で選択的に雌性不稔DNAの発
現を誘導するよう、雌性不稔にされるべき植物から周知
の方法で選択及び分離することができる。この第１のプ
ロモーターは、好ましくは、植物が雄性稔性でありつづ
けるように、特に花の雄器内で、雌性稔性繁殖体、生存
種子及び／又は生存胚芽の生産に関与していないその植
物のその他の部分における雌性不稔DNAの発現を妨げる
のに有効であるように、選択及び分離する。例えば、適
当な花特異的（好ましくは雌性繁殖器特異的）、種子特
異的又は胚芽特異的な第１のプロモーターを、以下の作
業により雌性不稔にされるべき植物内で識別及び分離す
ることができる： 1.花、種子又は胚芽、好ましくは子房、花柱、胎座、が
く、胚盤、隔膜、種皮、胚乳又は胎盤の発生中のみに植
物内に存在しているmRNAを探すこと； 2.この花、種子又は胚芽特異的mRNAを単離すること； 3.この特異的RNAからcDNAを調製すること； 4.このcDNAをプローブとして用いて、この特異的mRNAを
コードするDNAを含む植物ゲノム内の領域を識別するこ
と；そして次に、 5.この特異的mRNAをコードするDNAから上流（すなわち
５′側）にあり、このDNAのプロモーターを含む植物ゲ
ノムの一部分を識別すること。
本発明に基づく第１のプロモーターの例としては、花
柱及び／又は柱頭特異的プロモーターである例２に記述
されているSTMG型の遺伝子のNicotiana tabacumプロモ
ーターがある。その他の植物種からのその他の花柱−柱
頭特異的第１のプロモーターは、上記工程４のものと同
様のプローブとしてSTMG型遺伝子を用いてそのゲノムか
ら単離することができる。ハイブリダイゼーション条件
下で、このようなプローブは、その他の植物種のゲノム
からのDNA配列の混合物の中の花柱−柱頭特異的mRNAを
コードするDNAとハイブリダイズする〔Maniatis他（198
2年）「分子クローニング、実験室マニュアル」、Cold
Spring Harbor Laboratory刊行〕。その後、上記工程５
にあるように、もう１つの花柱−柱頭特異的な第１のプ
ロモーターを識別することができる。例えばNicotiana
alataから単離されたように、Ｓ遺伝子のような自家不
和合性遺伝子から、その他の花柱特異的プロモーターを
単離することができる〔McClure他（1989年）,Nature 3
42,955−957〕。その他の雌器特異的プロモーターは、
トマト植物の胚珠の中でのみ発現される遺伝子とだけ排
他的にハイブリダイズするcDNAクローンpMON9608〔Gass
er他（1989年）The Plant Cell １,15〕のようなその他
の雌器特異的cDNAを用いて識別することが可能である。
柱及び／又は柱頭特異的プロモーターである例２に記述
されているSTMG型の遺伝子のNicotiana tabacumプロモ
ーターがある。その他の植物種からのその他の花柱−柱
頭特異的第１のプロモーターは、上記工程４のものと同
様のプローブとしてSTMG型遺伝子を用いてそのゲノムか
ら単離することができる。ハイブリダイゼーション条件
下で、このようなプローブは、その他の植物種のゲノム
からのDNA配列の混合物の中の花柱−柱頭特異的mRNAを
コードするDNAとハイブリダイズする〔Maniatis他（198
2年）「分子クローニング、実験室マニュアル」、Cold
Spring Harbor Laboratory刊行〕。その後、上記工程５
にあるように、もう１つの花柱−柱頭特異的な第１のプ
ロモーターを識別することができる。例えばNicotiana
alataから単離されたように、Ｓ遺伝子のような自家不
和合性遺伝子から、その他の花柱特異的プロモーターを
単離することができる〔McClure他（1989年）,Nature 3
42,955−957〕。その他の雌器特異的プロモーターは、
トマト植物の胚珠の中でのみ発現される遺伝子とだけ排
他的にハイブリダイズするcDNAクローンpMON9608〔Gass
er他（1989年）The Plant Cell １,15〕のようなその他
の雌器特異的cDNAを用いて識別することが可能である。
このような第１のプロモーターのその他の例として
は、胚芽軸特異的なプロモーターであるKTI3遺伝子のプ
ロモーター〔Jofuku及びGoldberg（1989年）The Plant
Cell,１,1079−1093〕；及びAribidopsis thaliana〔Kr
ebbers他（1988年）Plant Physiol.87,859−866〕の４
つの2Sアルブミン遺伝子（「AT2S遺伝子」）のプロモー
ターであるPAT2S1、PAT2S2、PAT2S3及びPAT2S4等のPAT2
Sプロモーター等の種子特異的貯蔵タンパク質をコード
する遺伝子から由来する種子特異的プロモーターがあ
る。
は、胚芽軸特異的なプロモーターであるKTI3遺伝子のプ
ロモーター〔Jofuku及びGoldberg（1989年）The Plant
Cell,１,1079−1093〕；及びAribidopsis thaliana〔Kr
ebbers他（1988年）Plant Physiol.87,859−866〕の４
つの2Sアルブミン遺伝子（「AT2S遺伝子」）のプロモー
ターであるPAT2S1、PAT2S2、PAT2S3及びPAT2S4等のPAT2
Sプロモーター等の種子特異的貯蔵タンパク質をコード
する遺伝子から由来する種子特異的プロモーターがあ
る。
本発明の外来性DNA配列内に２つ以上の雌性不稔DNAが
存在する場合、全ての雌性不稔DNAは単一の第１のプロ
モーターの制御下にあることができるが、好ましくは、
各々の雌性不稔DNAはそれ独自の別々の第１のプロモー
ターの制御下にある。雌性不稔DNAが外来性DNA配列内に
複数存在する場合、各々の雌性不稔DNAは、同じ又は異
なる第１のポリペプチド又はタンパク質をコードするこ
とができる。例えば、雌性不稔DNAがRNA分解酵素T1等の
RNA分解酵素をコードする場合、雌性不稔DNA及びその第
１のプロモーターの少なくとも３つ、特に４つ乃至６つ
のコピーが、外来性DNA配列内に提供されていることが
好ましい。このような場合、全ての雌性不稔DNA及びそ
の第１のプロモーターが、外来性DNA配列及びこの外来
性DNA配列で植物細胞を形質転換するのに用いられるあ
らゆるベクター内で、互いに隣接していることも同様に
好ましい。複数の雌性不稔DNAが遺伝子１及び遺伝子
２、又はTNVレプリカーゼ及びRNA分解酵素、DNA分解酵
素又はタンパク質分解酵素のような異なる生成物をコー
ドする場合、雌性不稔DNAは互いに隣接せず、おそらく
は外来性DNA配列で植物細胞を形質転換するのに用いら
れる同じベクター内に存在せず、又は本発明の雌性不稔
植物の同じ親株内に存在しないことが好ましいかもしれ
ない。
存在する場合、全ての雌性不稔DNAは単一の第１のプロ
モーターの制御下にあることができるが、好ましくは、
各々の雌性不稔DNAはそれ独自の別々の第１のプロモー
ターの制御下にある。雌性不稔DNAが外来性DNA配列内に
複数存在する場合、各々の雌性不稔DNAは、同じ又は異
なる第１のポリペプチド又はタンパク質をコードするこ
とができる。例えば、雌性不稔DNAがRNA分解酵素T1等の
RNA分解酵素をコードする場合、雌性不稔DNA及びその第
１のプロモーターの少なくとも３つ、特に４つ乃至６つ
のコピーが、外来性DNA配列内に提供されていることが
好ましい。このような場合、全ての雌性不稔DNA及びそ
の第１のプロモーターが、外来性DNA配列及びこの外来
性DNA配列で植物細胞を形質転換するのに用いられるあ
らゆるベクター内で、互いに隣接していることも同様に
好ましい。複数の雌性不稔DNAが遺伝子１及び遺伝子
２、又はTNVレプリカーゼ及びRNA分解酵素、DNA分解酵
素又はタンパク質分解酵素のような異なる生成物をコー
ドする場合、雌性不稔DNAは互いに隣接せず、おそらく
は外来性DNA配列で植物細胞を形質転換するのに用いら
れる同じベクター内に存在せず、又は本発明の雌性不稔
植物の同じ親株内に存在しないことが好ましいかもしれ
ない。
本発明の標識DNAの選択も同様に重要なことではな
い。標識DNAを発現する植物又はその組織、種子さらに
は細胞が、第２のタンパク質又はポリペプチドを発現し
ていない植物又はその組織、種子さらには細胞から容易
に識別され分離されうるようにする第２のタンパク質又
はポリペプチドをコードするように、適当な標識DNAを
周知の方法で選択及び分離することができる。標識DNA
の例は、ジヒドロケルセチン−４−レダクターゼ（還元
酵素）をコードするA1遺伝子〔Meyer他（1987年）、Nat
ure 330,677−678〕及びβ−グルクロニダーゼ遺伝子
〔Jefferson他（1988年）Proc.Natl.Acad.Sci.USA（「P
NAS」）83,8447〕等の、植物細胞に識別可能な色を与え
ることができるタンパク質か、あるいはまた、矮性生長
又はさまざまな形状の葉のような特異的な形態特性を植
物に与えることのできるタンパク質をコードする。標識
DNAのその他の例は、植物に対して、欧州特許出願明細
書88/402,222.9号に記載されているようなスーパーオキ
シドジスムターゼをコードする遺伝子によって提供され
るようなストレス許容性；欧州特許出願明細書86/300,2
91.1号に記載されているような虫害抵抗性を与えるBaci
llus thuringiensis内毒素をコードする遺伝子又は欧州
特許出願明細書88/401,673.4号に記載されているような
細菌抵抗性を付与する細菌ペプチドをコードする遺伝子
により提供される疾病又は有害生物抵抗性を付与する。
い。標識DNAを発現する植物又はその組織、種子さらに
は細胞が、第２のタンパク質又はポリペプチドを発現し
ていない植物又はその組織、種子さらには細胞から容易
に識別され分離されうるようにする第２のタンパク質又
はポリペプチドをコードするように、適当な標識DNAを
周知の方法で選択及び分離することができる。標識DNA
の例は、ジヒドロケルセチン−４−レダクターゼ（還元
酵素）をコードするA1遺伝子〔Meyer他（1987年）、Nat
ure 330,677−678〕及びβ−グルクロニダーゼ遺伝子
〔Jefferson他（1988年）Proc.Natl.Acad.Sci.USA（「P
NAS」）83,8447〕等の、植物細胞に識別可能な色を与え
ることができるタンパク質か、あるいはまた、矮性生長
又はさまざまな形状の葉のような特異的な形態特性を植
物に与えることのできるタンパク質をコードする。標識
DNAのその他の例は、植物に対して、欧州特許出願明細
書88/402,222.9号に記載されているようなスーパーオキ
シドジスムターゼをコードする遺伝子によって提供され
るようなストレス許容性；欧州特許出願明細書86/300,2
91.1号に記載されているような虫害抵抗性を与えるBaci
llus thuringiensis内毒素をコードする遺伝子又は欧州
特許出願明細書88/401,673.4号に記載されているような
細菌抵抗性を付与する細菌ペプチドをコードする遺伝子
により提供される疾病又は有害生物抵抗性を付与する。
好ましい標識DNAは、欧州特許出願明細書87/400,544.
0号に記載されているようにBiolaphos及びホスフィノト
リシン等のグルタミンシンセターゼ阻害剤に対する抵抗
性を与える酵素をコードするsfr遺伝子及びsfrv遺伝
子；ならびに欧州特許公報0,240,792号記載のホスフィ
ノトリシンのための標的としての改変グルタミンシンセ
ターゼ及び欧州特許公報0,218,571号記載のグリフォセ
ートのための標的としての改変５−エノールピルビルシ
キメート−３リン酸塩シンターゼのような、天然産の内
在性酵素に比べて低い除草剤親和性をもついくつかの除
草剤の改変標的酵素をコードする遺伝子のように、除草
剤の作用を阻害又は中和する第２のタンパク質又はポリ
ペプチドをコードする。その他の例としては、除草剤ブ
ロムオキシニル〔Stalker他（1988年）「農業的に重要
な作物の遺伝子改良」、刊行:R.T.Fraley,N.M.Frey及び
J.Schell,Cold Spring Harbor Laboratories〕；除草剤
スルフォニル尿素〔Lee他（1988年）,EMBO J.７,1241−
1248〕；及び除草剤2,4D〔エルサレム第２回植物分子生
物学国際シンポジウム、1988年11月13日〜18日で提出さ
れたもの〕の作用を中和するタンパク質をコードする標
識DNAがある。
0号に記載されているようにBiolaphos及びホスフィノト
リシン等のグルタミンシンセターゼ阻害剤に対する抵抗
性を与える酵素をコードするsfr遺伝子及びsfrv遺伝
子；ならびに欧州特許公報0,240,792号記載のホスフィ
ノトリシンのための標的としての改変グルタミンシンセ
ターゼ及び欧州特許公報0,218,571号記載のグリフォセ
ートのための標的としての改変５−エノールピルビルシ
キメート−３リン酸塩シンターゼのような、天然産の内
在性酵素に比べて低い除草剤親和性をもついくつかの除
草剤の改変標的酵素をコードする遺伝子のように、除草
剤の作用を阻害又は中和する第２のタンパク質又はポリ
ペプチドをコードする。その他の例としては、除草剤ブ
ロムオキシニル〔Stalker他（1988年）「農業的に重要
な作物の遺伝子改良」、刊行:R.T.Fraley,N.M.Frey及び
J.Schell,Cold Spring Harbor Laboratories〕；除草剤
スルフォニル尿素〔Lee他（1988年）,EMBO J.７,1241−
1248〕；及び除草剤2,4D〔エルサレム第２回植物分子生
物学国際シンポジウム、1988年11月13日〜18日で提出さ
れたもの〕の作用を中和するタンパク質をコードする標
識DNAがある。
標識DNAを制御する本発明の第２のプロモーターも同
様に、この標識DNAによりコードされる第２のタンパク
質又はポリペプチドの性質に応じて望まれるように、植
物全体の中に構造的にあるいは単数又は複数の特定の組
織又は特定の細胞の中で選択的に、この標識DNAが発現
されるような形で、周知の方法で選択及び分離されう
る。例えば、標識DNAが除草剤抵抗性をコードする場
合、35Sプロモーター〔Odell他（1985年）、Nature 31
3,810−812〕、35S′３プロモーター〔Hull及びHowell
（1987年）Virology 86,482−493〕、Ti−プラスミドの
ノパリンシンセターゼ遺伝子のプロモーター（「PNO
S」）〔Herrera−Estrella（1983年）Nature 303,209−
213〕又はオクトピンシンターゼ遺伝子のプロモーター
〔「POCS」〔De Greve他、（1982年）、J.Mol.Appl.Gen
et.１ （６）,499−511）〕のような強力な構造的第２
プロモーターを用いて、植物の全ての細胞内で標識DNA
を発現させることが有効である。標識DNAが疾病抵抗性
を付与するタンパク質をコードする場合には、例えばTi
−プラスミドのTR1′又はTR2′プロモーター〔Velten
他、（1984年）EMBO J.３,2723−2730〕のようなTRプロ
モーターを用いることにより障害組織内で選択的に標識
DNAを発現させることが有効である。標識DNAが除草剤抵
抗性をコードする場合、例えば、Rubisco（RUBPカルボ
キシラーゼ）の小サブユニットをコードする遺伝子のプ
ロモーター〔欧州特許出願明細書87/400,544.0号）を用
いることにより、緑色組織内で選択的に標識DNAを発現
させることも有効である。標識DNAが色素をコードする
場合、花弁細胞、葉細胞又は種子細胞のような特定の細
胞内、好ましくは種皮の外側層の中で標識DNAを発現さ
せることも有効である。
様に、この標識DNAによりコードされる第２のタンパク
質又はポリペプチドの性質に応じて望まれるように、植
物全体の中に構造的にあるいは単数又は複数の特定の組
織又は特定の細胞の中で選択的に、この標識DNAが発現
されるような形で、周知の方法で選択及び分離されう
る。例えば、標識DNAが除草剤抵抗性をコードする場
合、35Sプロモーター〔Odell他（1985年）、Nature 31
3,810−812〕、35S′３プロモーター〔Hull及びHowell
（1987年）Virology 86,482−493〕、Ti−プラスミドの
ノパリンシンセターゼ遺伝子のプロモーター（「PNO
S」）〔Herrera−Estrella（1983年）Nature 303,209−
213〕又はオクトピンシンターゼ遺伝子のプロモーター
〔「POCS」〔De Greve他、（1982年）、J.Mol.Appl.Gen
et.１ （６）,499−511）〕のような強力な構造的第２
プロモーターを用いて、植物の全ての細胞内で標識DNA
を発現させることが有効である。標識DNAが疾病抵抗性
を付与するタンパク質をコードする場合には、例えばTi
−プラスミドのTR1′又はTR2′プロモーター〔Velten
他、（1984年）EMBO J.３,2723−2730〕のようなTRプロ
モーターを用いることにより障害組織内で選択的に標識
DNAを発現させることが有効である。標識DNAが除草剤抵
抗性をコードする場合、例えば、Rubisco（RUBPカルボ
キシラーゼ）の小サブユニットをコードする遺伝子のプ
ロモーター〔欧州特許出願明細書87/400,544.0号）を用
いることにより、緑色組織内で選択的に標識DNAを発現
させることも有効である。標識DNAが色素をコードする
場合、花弁細胞、葉細胞又は種子細胞のような特定の細
胞内、好ましくは種皮の外側層の中で標識DNAを発現さ
せることも有効である。
以下の作業によって、植物を雌性不稔でかつ形質転換
されていない植物から容易に識別できるものにするため
の組織特異的な第２のプロモーターを、既知の方法で識
別し分離することができる： 1.花弁、葉又は種子とのような或る種の組織の発生の間
のみ植物内に存在するmRNAを探すこと； 2.この組織特異的mRNAを分離すること； 3.この組織特異的mRNAからcRNAを調製すること； 4.このcDNAをプローブとして用いて、組織特異的mRNAを
コードするDNAを含む植物ゲノム内の領域を識別するこ
と；そして次に 5.組織特異的mRNAをコードするDNAから上流にあり、か
つ前記DNAのためのプロモーターを含んでいる植物ゲノ
ムの一部分を識別すること。
されていない植物から容易に識別できるものにするため
の組織特異的な第２のプロモーターを、既知の方法で識
別し分離することができる： 1.花弁、葉又は種子とのような或る種の組織の発生の間
のみ植物内に存在するmRNAを探すこと； 2.この組織特異的mRNAを分離すること； 3.この組織特異的mRNAからcRNAを調製すること； 4.このcDNAをプローブとして用いて、組織特異的mRNAを
コードするDNAを含む植物ゲノム内の領域を識別するこ
と；そして次に 5.組織特異的mRNAをコードするDNAから上流にあり、か
つ前記DNAのためのプロモーターを含んでいる植物ゲノ
ムの一部分を識別すること。
複数の標識DNAが本発明の外来性DNA配列内に存在する
場合には、全ての標識DNAは単一の第２のプロモーター
の制御下にあることもできるが、好ましくは、各標識DN
Aはそれ独自の別々の第２のプロモーターの制御下にあ
る。さらに好ましくは、各々の標識DNAは独自の第２の
プロモーターの制御下にあり、異なる第２のタンパク質
又はポリペプチドをコードして、形質転換された植物に
対し、区別できる異なる特性を提供する。いくつかのケ
ースにおいては、標識DNA（単数又は複数）と第２のプ
ロモーター（単数又は複数）が、互いに対して、及び本
発明の外来性DNA配列内及びこの外来性DNA配列で植物細
胞を形質転換するのに用いられるあらゆるベクター内に
含まれる単数又は複数の雌性不稔DNAに対して、隣接し
ていることが好ましいかもしれない。その他のケースに
おいては、標識DNAが、互いに対して及び／又は雌性不
稔DNAに対して、隣接していないことが好ましいかもし
れない。
場合には、全ての標識DNAは単一の第２のプロモーター
の制御下にあることもできるが、好ましくは、各標識DN
Aはそれ独自の別々の第２のプロモーターの制御下にあ
る。さらに好ましくは、各々の標識DNAは独自の第２の
プロモーターの制御下にあり、異なる第２のタンパク質
又はポリペプチドをコードして、形質転換された植物に
対し、区別できる異なる特性を提供する。いくつかのケ
ースにおいては、標識DNA（単数又は複数）と第２のプ
ロモーター（単数又は複数）が、互いに対して、及び本
発明の外来性DNA配列内及びこの外来性DNA配列で植物細
胞を形質転換するのに用いられるあらゆるベクター内に
含まれる単数又は複数の雌性不稔DNAに対して、隣接し
ていることが好ましいかもしれない。その他のケースに
おいては、標識DNAが、互いに対して及び／又は雌性不
稔DNAに対して、隣接していないことが好ましいかもし
れない。
雌性不稔DNAによってコードされる第１のタンパク質
又はポリペプチドが、花及び／又は種子及び／又は胚芽
の細胞の核又は細胞質内で作用することにより、これら
の細胞の代謝、機能及び／又は発生を有意に妨害するこ
とが一般に好ましい。しかしながら、形質転換された植
物の細胞の葉緑体又はミトコンドリアの中に、細胞質か
ら第１のタンパク質又はポリペプチド及び／又は第２の
タンパク質又はポリペプチドを輸送させることが望まし
い場合、この外来性DNAはさらに、トランジットペプチ
ドをコードする第１の付加的な外来性DNAを含むことが
できる。この第１の付加的なDNAは、第１のタンパク質
又はポリペプチドがこのように輸送される場合には雌性
不稔DNAと第１のプロモーターとの間に位置づけられ、
第２のタンパク質又はポリペプチドがこのように輸送さ
れる場合には標識DNAと第２のプロモーターとの間にあ
る。「トランジットペプチド」というのは、細胞の核DN
Aによりコードされる前駆体タンパク質として細胞内に
産生されるタンパク質のサブユニット又は葉緑体もしく
はミトコンドリアタンパク質と通常結びついているポリ
ペプチドフラグメントである。このトランジットペプチ
ドは、葉緑体又はミトコンドリアの中への核にコードさ
れた葉緑体又はミトコンドリアタンパク質又はサブユニ
ットの移動プロセスの原因となるものであり、このよう
なプロセス中、このトランジットペプチドは葉緑体又は
ミトコンドリアタンパク質又はサブユニットから分離さ
れるか又はタンパク質分解により除去される。単数又は
複数のこのような第１の付加的なDNAは、欧州特許出願
明細書85/402,596.2号及び88/402,222.9号内及びVan de
n Broeck他（1985年）Nature 313,358−363;Schtz（198
7年）Eur.J.of Bioch.165,1−6;及びBoutry他（1987
年）Nature 328,340−342の中に一般的に記載されてい
るような、単数又は複数の第１又は第２のタンパク質又
はポリペプチドを輸送するため、本発明に基づく外来性
DNA配列内に提供される。葉緑体内への輸送のための適
当なトランジットペプチドの一例としては、酵素RUBPカ
ルボキシラーゼの小サブユニットのトランジットペプチ
ド（欧州特許出願明細書85/402,596.2号）があり、ミト
コンドリア内への輸送のためのトランジットペプチドの
一例としては、酵素Mn−スーパーオキシドジスムターゼ
のトランジットペプチドがある〔本書中の例10及び欧州
特許出願明細書89/401,194.9号参照〕。
又はポリペプチドが、花及び／又は種子及び／又は胚芽
の細胞の核又は細胞質内で作用することにより、これら
の細胞の代謝、機能及び／又は発生を有意に妨害するこ
とが一般に好ましい。しかしながら、形質転換された植
物の細胞の葉緑体又はミトコンドリアの中に、細胞質か
ら第１のタンパク質又はポリペプチド及び／又は第２の
タンパク質又はポリペプチドを輸送させることが望まし
い場合、この外来性DNAはさらに、トランジットペプチ
ドをコードする第１の付加的な外来性DNAを含むことが
できる。この第１の付加的なDNAは、第１のタンパク質
又はポリペプチドがこのように輸送される場合には雌性
不稔DNAと第１のプロモーターとの間に位置づけられ、
第２のタンパク質又はポリペプチドがこのように輸送さ
れる場合には標識DNAと第２のプロモーターとの間にあ
る。「トランジットペプチド」というのは、細胞の核DN
Aによりコードされる前駆体タンパク質として細胞内に
産生されるタンパク質のサブユニット又は葉緑体もしく
はミトコンドリアタンパク質と通常結びついているポリ
ペプチドフラグメントである。このトランジットペプチ
ドは、葉緑体又はミトコンドリアの中への核にコードさ
れた葉緑体又はミトコンドリアタンパク質又はサブユニ
ットの移動プロセスの原因となるものであり、このよう
なプロセス中、このトランジットペプチドは葉緑体又は
ミトコンドリアタンパク質又はサブユニットから分離さ
れるか又はタンパク質分解により除去される。単数又は
複数のこのような第１の付加的なDNAは、欧州特許出願
明細書85/402,596.2号及び88/402,222.9号内及びVan de
n Broeck他（1985年）Nature 313,358−363;Schtz（198
7年）Eur.J.of Bioch.165,1−6;及びBoutry他（1987
年）Nature 328,340−342の中に一般的に記載されてい
るような、単数又は複数の第１又は第２のタンパク質又
はポリペプチドを輸送するため、本発明に基づく外来性
DNA配列内に提供される。葉緑体内への輸送のための適
当なトランジットペプチドの一例としては、酵素RUBPカ
ルボキシラーゼの小サブユニットのトランジットペプチ
ド（欧州特許出願明細書85/402,596.2号）があり、ミト
コンドリア内への輸送のためのトランジットペプチドの
一例としては、酵素Mn−スーパーオキシドジスムターゼ
のトランジットペプチドがある〔本書中の例10及び欧州
特許出願明細書89/401,194.9号参照〕。
同様に、雌性不稔DNAによりコードされる第１のタン
パク質又はポリペプチドが、植物内の細胞代謝、機能及
び／又は発生を妨害するように細胞内で作用することが
一般に好ましい。しかしながら、第１のタンパク質又は
ポリペプチド及び／又は第２のタンパク質又はポリペプ
チドを、それらが発現される植物細胞の細胞間部域の外
又はそれらが発現される組織の外に分泌させることが望
ましい場合、外来性DNA配列はさらに、分泌シグナルペ
プチドをコードする第２の付加的な外来性DNAを含むこ
とができる。この第２の付加的な外来性DNAは、第１の
タンパク質又はポリペプチドを分泌させる場合には雌性
不稔DNAと第１のプロモーターとの間に位置づけされ、
第２のタンパク質又はポリペプチドを分泌させる場合に
は、標識DNAと第２のプロモーターとの間に位置づけさ
れる。「分泌シグナルペプチド」というのは、特に真核
細胞内において、移動の間、細胞から通常分泌されるタ
ンパク質と結びついている天然のポリペプチドフラグメ
ント、あるいは移動の間にタンパク質又はポリペプチド
と結びついているとき、細胞からのその分泌を誘発する
ような人工的ポリペプチドフラグメントのことである。
適当な分泌シグナルペプチドの例は、Von Heijne（1986
年）,NAR 14（11）,4683−4690;Denecke他（1990年）,T
he Plant Cell ２,51−59;及びChrispeels及びTaque（1
990年）International Review of Cytology、印刷中；
の中に記載されている。
パク質又はポリペプチドが、植物内の細胞代謝、機能及
び／又は発生を妨害するように細胞内で作用することが
一般に好ましい。しかしながら、第１のタンパク質又は
ポリペプチド及び／又は第２のタンパク質又はポリペプ
チドを、それらが発現される植物細胞の細胞間部域の外
又はそれらが発現される組織の外に分泌させることが望
ましい場合、外来性DNA配列はさらに、分泌シグナルペ
プチドをコードする第２の付加的な外来性DNAを含むこ
とができる。この第２の付加的な外来性DNAは、第１の
タンパク質又はポリペプチドを分泌させる場合には雌性
不稔DNAと第１のプロモーターとの間に位置づけされ、
第２のタンパク質又はポリペプチドを分泌させる場合に
は、標識DNAと第２のプロモーターとの間に位置づけさ
れる。「分泌シグナルペプチド」というのは、特に真核
細胞内において、移動の間、細胞から通常分泌されるタ
ンパク質と結びついている天然のポリペプチドフラグメ
ント、あるいは移動の間にタンパク質又はポリペプチド
と結びついているとき、細胞からのその分泌を誘発する
ような人工的ポリペプチドフラグメントのことである。
適当な分泌シグナルペプチドの例は、Von Heijne（1986
年）,NAR 14（11）,4683−4690;Denecke他（1990年）,T
he Plant Cell ２,51−59;及びChrispeels及びTaque（1
990年）International Review of Cytology、印刷中；
の中に記載されている。
本発明の外来性DNA配列においては、３′転写終結及
びポリアデニル化シグナルは、植物細胞内でmRNAの適正
な転写終結及びポリアデニル化を提供することのできる
シグナルの中から、従来の方法で選択されうる。これら
の転写終結及びポリアデニル化シグナルは、転写される
べき遺伝子の自然のシグナルであってよいが、外来性又
は非相同のものであってもよい。非相同の転写終結及び
ポリアデニル化シグナルの例としては、オクトピンシン
ターゼ遺伝子〔Gielen他（1984年）EMBO J.３,835−84
5〕及びＴ−DNA遺伝子７〔Velten及びSchell（1985
年）,Nucleic Acids Reseaich（「NAR」）13,6981−699
8〕のものがある。
びポリアデニル化シグナルは、植物細胞内でmRNAの適正
な転写終結及びポリアデニル化を提供することのできる
シグナルの中から、従来の方法で選択されうる。これら
の転写終結及びポリアデニル化シグナルは、転写される
べき遺伝子の自然のシグナルであってよいが、外来性又
は非相同のものであってもよい。非相同の転写終結及び
ポリアデニル化シグナルの例としては、オクトピンシン
ターゼ遺伝子〔Gielen他（1984年）EMBO J.３,835−84
5〕及びＴ−DNA遺伝子７〔Velten及びSchell（1985
年）,Nucleic Acids Reseaich（「NAR」）13,6981−699
8〕のものがある。
同様に、本発明に従うと、本発明の外来性DNA配列を
含む植物細胞培養は、二倍体〔Chuong及びBeversdorf
（1985年）Plant Sci.39,219−226〕又は一倍体細胞培
養に対して必要な形質転換を行い、次に（一倍体細胞培
養については）周知の技術（例えばコルヒチンを用い
て）染色体の数を倍増することにより、同型接合の優性
雌性不稔雄性稔性植物を再生するために用いることがで
きる。〔「植物組織と細胞培養」Plant Biology ３,A.
R.Liss Inc.N.Y（1987年）を参照のこと。〕かくして、
外来性DNA配列は、このように形質転換された植物細胞
の各々の核ゲノム内で同型接合の形をしていることにな
る。このことは、雌性不稔DNAが全ての雌性繁殖体又は
それから誘導された植物細胞の中に存在し、この中で発
現されうるように、種子又は胚芽細胞等の雌性繁殖体か
ら誘導された細胞内で、特に減数分裂後の胚珠等の雌性
繁殖体の一定の与えられた発生段階における遺伝子の発
現を誘導する第１のプロモーターの制御下にある雌性不
稔DNAを含む植物細胞培養のために好ましいことであ
る。
含む植物細胞培養は、二倍体〔Chuong及びBeversdorf
（1985年）Plant Sci.39,219−226〕又は一倍体細胞培
養に対して必要な形質転換を行い、次に（一倍体細胞培
養については）周知の技術（例えばコルヒチンを用い
て）染色体の数を倍増することにより、同型接合の優性
雌性不稔雄性稔性植物を再生するために用いることがで
きる。〔「植物組織と細胞培養」Plant Biology ３,A.
R.Liss Inc.N.Y（1987年）を参照のこと。〕かくして、
外来性DNA配列は、このように形質転換された植物細胞
の各々の核ゲノム内で同型接合の形をしていることにな
る。このことは、雌性不稔DNAが全ての雌性繁殖体又は
それから誘導された植物細胞の中に存在し、この中で発
現されうるように、種子又は胚芽細胞等の雌性繁殖体か
ら誘導された細胞内で、特に減数分裂後の胚珠等の雌性
繁殖体の一定の与えられた発生段階における遺伝子の発
現を誘導する第１のプロモーターの制御下にある雌性不
稔DNAを含む植物細胞培養のために好ましいことであ
る。
同様に本発明に従うと、雑種植物にまで生長できる雑
種種子を生産するための方法が提供されている。これら
の方法には、ａ）花、好ましくはその少なくとも１つの
雌器、又は胚芽内で、選択的に第１のタンパク質又はポ
リペプチドが発現されるような、本発明に基づく核雌性
不稔雄性稔性植物と、ｂ）雄性不稔雌性稔性植物とを、
他の点では慣習的な従来のやり方で交配することが関与
している。適当な雄性不稔雌性稔性植物は、欧州特許出
願明細書89/401,194.9号に、 （ａ）植物の雄ずい細胞内で産生又は過剰産生されたと
き、雄ずい細胞の代謝、機能及び／又は発生を不利な形
で有意に妨害するタンパク質又はポリペプチドをコード
する雄性不稔DNA;及び （ｂ）植物の雄ずい細胞内、好ましくは葯、花粉及び／
又は花糸細胞、特に内面層（タペータム）及び／又は葯
表皮細胞内で、選択的に雄性不稔DNAの発現を誘導する
ことのできるプロモーター（なお、この雄性不稔DNAは
このプロモーターと同じ転写単位内にあり、このプロモ
ーターの制御下にある） が中に安定した形で組み込まれており、しかも場合によ
っては同じ遺伝子座の中に、 （ｃ）植物の少なくとも特定の細胞又は特定の組織内に
存在するとき、少なくとも特定の細胞又は特定の組織内
にこのタンパク質又はポリペプチドを含まないその他の
植物からこの植物を容易に分離できるようにするタンパ
ク質又はポリペプチドをコードする別の標識DNA;及び （ｄ）少なくとも特定の細胞又は特定の組織の中でこの
別の標識DNAの発現を誘導することができ、しかも、別
の標識DNAと同じ転写単位内にあり、このDNAを制御する
ことができる別のプロモーター、 を有しているような核ゲノムを有するものとして記述さ
れている。
種種子を生産するための方法が提供されている。これら
の方法には、ａ）花、好ましくはその少なくとも１つの
雌器、又は胚芽内で、選択的に第１のタンパク質又はポ
リペプチドが発現されるような、本発明に基づく核雌性
不稔雄性稔性植物と、ｂ）雄性不稔雌性稔性植物とを、
他の点では慣習的な従来のやり方で交配することが関与
している。適当な雄性不稔雌性稔性植物は、欧州特許出
願明細書89/401,194.9号に、 （ａ）植物の雄ずい細胞内で産生又は過剰産生されたと
き、雄ずい細胞の代謝、機能及び／又は発生を不利な形
で有意に妨害するタンパク質又はポリペプチドをコード
する雄性不稔DNA;及び （ｂ）植物の雄ずい細胞内、好ましくは葯、花粉及び／
又は花糸細胞、特に内面層（タペータム）及び／又は葯
表皮細胞内で、選択的に雄性不稔DNAの発現を誘導する
ことのできるプロモーター（なお、この雄性不稔DNAは
このプロモーターと同じ転写単位内にあり、このプロモ
ーターの制御下にある） が中に安定した形で組み込まれており、しかも場合によ
っては同じ遺伝子座の中に、 （ｃ）植物の少なくとも特定の細胞又は特定の組織内に
存在するとき、少なくとも特定の細胞又は特定の組織内
にこのタンパク質又はポリペプチドを含まないその他の
植物からこの植物を容易に分離できるようにするタンパ
ク質又はポリペプチドをコードする別の標識DNA;及び （ｄ）少なくとも特定の細胞又は特定の組織の中でこの
別の標識DNAの発現を誘導することができ、しかも、別
の標識DNAと同じ転写単位内にあり、このDNAを制御する
ことができる別のプロモーター、 を有しているような核ゲノムを有するものとして記述さ
れている。
雌性不稔植物及び雄性不稔植物は、正確な栽植様式の
必要なく、他家受粉の機会を増大させるように互いの近
くに任意に栽植される。発芽できる収穫種子は、雌性不
稔植物による雄性不稔植物の受精（稔性化）の結果であ
り、100％の雑種となる。雌性不稔及び雄性不稔特性の
原因である外来性DNA配列が、それぞれの親株の核ゲノ
ム内に異型接合の形で存在する場合、このような雑種種
子から栽培された植物は、25％稔性、25％雌性不稔、25
％雄性不稔及び25％不稔性となるだろう。雌性不稔性を
コードする外来性DNA配列が同型接合の形で雄性稔性親
株の核ゲノム内に存在する場合（これは第１のプロモー
ターが胚珠、種子又は胚芽特異的プロモーターであると
きに好ましい）、このような雑種種子から栽培された全
ての植物は雌性不稔となる。
必要なく、他家受粉の機会を増大させるように互いの近
くに任意に栽植される。発芽できる収穫種子は、雌性不
稔植物による雄性不稔植物の受精（稔性化）の結果であ
り、100％の雑種となる。雌性不稔及び雄性不稔特性の
原因である外来性DNA配列が、それぞれの親株の核ゲノ
ム内に異型接合の形で存在する場合、このような雑種種
子から栽培された植物は、25％稔性、25％雌性不稔、25
％雄性不稔及び25％不稔性となるだろう。雌性不稔性を
コードする外来性DNA配列が同型接合の形で雄性稔性親
株の核ゲノム内に存在する場合（これは第１のプロモー
ターが胚珠、種子又は胚芽特異的プロモーターであると
きに好ましい）、このような雑種種子から栽培された全
ての植物は雌性不稔となる。
さらに本発明に従うと、その他の点では慣習的なもの
であるやり方で、 ａ）第１のタンパク質又はポリペプチドが種子内で選択
的に発現され、第１のタンパク質又はポリペプチドをコ
ードする外来性DNA配列が植物の核ゲノム内で同型接合
の形をしている、本発明に基づく雌性不稔雄性稔性植物
と、 ｂ）雄性不稔雌性稔性植物とを 交配させることにより、種なし果実を生産するための方
法が提供されている。
であるやり方で、 ａ）第１のタンパク質又はポリペプチドが種子内で選択
的に発現され、第１のタンパク質又はポリペプチドをコ
ードする外来性DNA配列が植物の核ゲノム内で同型接合
の形をしている、本発明に基づく雌性不稔雄性稔性植物
と、 ｂ）雄性不稔雌性稔性植物とを 交配させることにより、種なし果実を生産するための方
法が提供されている。
雌性不稔DNA、場合によっては好ましくは除草剤抵抗
性をコードする標識DNAを用いて形質転換され、それら
が本発明に従って植物の核ゲノム内に安定した形で組み
込まれ、優性対立遺伝子として何世代にもわたり伝達さ
れる植物は、雑種作物を育種し生産するために現在用い
られている細胞質及び雄性不稔システムに対する代替物
であり、このシステムに比べ利点を提供しうるものであ
る。この点において、雌性不稔雄性稔性植物は、以下に
記すとおり、１）作物中の阻害された種子形成、２）容
易に他家受粉しない作物のための雑種種子、及び３）植
物系統のより容易な育種を提供することができる。
性をコードする標識DNAを用いて形質転換され、それら
が本発明に従って植物の核ゲノム内に安定した形で組み
込まれ、優性対立遺伝子として何世代にもわたり伝達さ
れる植物は、雑種作物を育種し生産するために現在用い
られている細胞質及び雄性不稔システムに対する代替物
であり、このシステムに比べ利点を提供しうるものであ
る。この点において、雌性不稔雄性稔性植物は、以下に
記すとおり、１）作物中の阻害された種子形成、２）容
易に他家受粉しない作物のための雑種種子、及び３）植
物系統のより容易な育種を提供することができる。
1.種子形成の阻害 種子が望ましくない副産物であるような、人工的に栽
培された多種多様な作物が存在する。
培された多種多様な作物が存在する。
ａ）植物の経済的産物がその栄養部分で構成されている
場合。種子生産を阻害することにより、植物のエネルギ
ーを栄養バイオマス生産に集中させることができる。そ
の例としては、多年生植物（例えば、青刈飼料用イネ科
牧草、青刈飼料豆果及びゴムの木）、いくつかの一年生
植物（例えばサトウキビ及びジャガイモ）及び特に通常
経済的産物が収穫される前に開花し結実するような全て
の作物がある。その他の例としては、その栄養組織内
で、薬学又は工業的用途のためのタンパク質、ポリペプ
チド又はその他の代謝産物を生産する、遺伝子工学によ
って得ることのできる植物がある。
場合。種子生産を阻害することにより、植物のエネルギ
ーを栄養バイオマス生産に集中させることができる。そ
の例としては、多年生植物（例えば、青刈飼料用イネ科
牧草、青刈飼料豆果及びゴムの木）、いくつかの一年生
植物（例えばサトウキビ及びジャガイモ）及び特に通常
経済的産物が収穫される前に開花し結実するような全て
の作物がある。その他の例としては、その栄養組織内
で、薬学又は工業的用途のためのタンパク質、ポリペプ
チド又はその他の代謝産物を生産する、遺伝子工学によ
って得ることのできる植物がある。
ｂ）植物の経済的産物がその果実であり、消費者の好み
のため（トマト、メロン及びカンキツ類）又はそうでな
ければ果実の中に貯蔵されうるバイオマスが種子形成に
より使い果たされてしまうため（例えば、加工すべきト
マト内に高い固形含有率を提供する目的で）、のいずれ
かの理由で果実が種なしであることが望まれる場合。こ
のような作物は果実の形成を必要とすることから、通常
果実の発育停止を誘発する種なし状態を、単為結果を得
る可能性によって補償しなくてはならない。天然の単為
結果果実誘発遺伝子は、トマトやメロンのようないくつ
かの作物内に存在する。
のため（トマト、メロン及びカンキツ類）又はそうでな
ければ果実の中に貯蔵されうるバイオマスが種子形成に
より使い果たされてしまうため（例えば、加工すべきト
マト内に高い固形含有率を提供する目的で）、のいずれ
かの理由で果実が種なしであることが望まれる場合。こ
のような作物は果実の形成を必要とすることから、通常
果実の発育停止を誘発する種なし状態を、単為結果を得
る可能性によって補償しなくてはならない。天然の単為
結果果実誘発遺伝子は、トマトやメロンのようないくつ
かの作物内に存在する。
ｃ）植物がその種子を目的として栽培されているのでは
ないが、収穫後に残った栄養分が種子形成をひき起こし
うる場合。これらの種子からの再生長は、次の栽培にお
いて多大な雑草問題をひき起こす可能性がある。この
「雑草」問題は、特にテンサイについてよく知られてい
る。
ないが、収穫後に残った栄養分が種子形成をひき起こし
うる場合。これらの種子からの再生長は、次の栽培にお
いて多大な雑草問題をひき起こす可能性がある。この
「雑草」問題は、特にテンサイについてよく知られてい
る。
ｄ）植物がその花を目的として栽培されている場合（例
えば切花、鉢物又は庭用観賞植物）。これらの種につい
ては、結実を避けることが望ましい場合が多い。切花又
は鉢物の場合、花の受精は往々にして花弁の老化の加速
化を誘発する。庭用観賞植物の場合、果実及び種子の形
成は、開花の期間及び強さを減少する。
えば切花、鉢物又は庭用観賞植物）。これらの種につい
ては、結実を避けることが望ましい場合が多い。切花又
は鉢物の場合、花の受精は往々にして花弁の老化の加速
化を誘発する。庭用観賞植物の場合、果実及び種子の形
成は、開花の期間及び強さを減少する。
2.雑種種子の生産 工学的に生み出された雌性不稔は、天然の細胞質又は
核の雄性不稔システム又は工学的に生み出された核雄性
不稔システムと組合わせた種子生産手段として、種子が
経済的な収穫物でなく容易に他家受粉しないような作物
における（例えば青刈飼料イネ科牧草、青刈飼料豆果、
テンサイ及び数多くの野菜）商業的雑種種子の生産のた
めに役立つ。雄性不稔植物での核雌性不稔植物の育種
は、雑種種子の品質をより良く制御できるようにし（例
えばあやまって雄性条が収穫されることはない）、雄性
不稔及び雌性不稔親株の無作為の混植を通して他家受粉
に有利に作用することによりさらに結実度を高め、また
受精能の回復剤を必要としない。このような雑種種子
（例えばテンサイ）の生産のための戦略には、以下のよ
うな段階が含まれると考えられる〔なお、「MS」は雄性
不稔、「FS」は雌性不稔、「Ｈ」は除草剤抵抗性を表わ
す〕。
核の雄性不稔システム又は工学的に生み出された核雄性
不稔システムと組合わせた種子生産手段として、種子が
経済的な収穫物でなく容易に他家受粉しないような作物
における（例えば青刈飼料イネ科牧草、青刈飼料豆果、
テンサイ及び数多くの野菜）商業的雑種種子の生産のた
めに役立つ。雄性不稔植物での核雌性不稔植物の育種
は、雑種種子の品質をより良く制御できるようにし（例
えばあやまって雄性条が収穫されることはない）、雄性
不稔及び雌性不稔親株の無作為の混植を通して他家受粉
に有利に作用することによりさらに結実度を高め、また
受精能の回復剤を必要としない。このような雑種種子
（例えばテンサイ）の生産のための戦略には、以下のよ
うな段階が含まれると考えられる〔なお、「MS」は雄性
不稔、「FS」は雌性不稔、「Ｈ」は除草剤抵抗性を表わ
す〕。
A.雌性親株系統Ａの開発 Aa）系統Ａを、雄ずい特異的プロモーターの制御下にあ
る雄性不稔DNA及びそれに隣接する除草剤抵抗性をコー
ドする標識DNAを含む外来性DNAで、欧州特許出願明細書
89/401,194.9号に従って形質転換し、ＡMSH/mshを得
る。
る雄性不稔DNA及びそれに隣接する除草剤抵抗性をコー
ドする標識DNAを含む外来性DNAで、欧州特許出願明細書
89/401,194.9号に従って形質転換し、ＡMSH/mshを得
る。
Ab）系統Ａmsh/mshとの交配を通して、系統ＡMSH/mshを
維持する。これにより:50％のＡMSH/msh（雄性不稔、除
草剤抵抗性）及び50％のＡmsh/msh（稔性、除草剤感受
性）が得られる。
維持する。これにより:50％のＡMSH/msh（雄性不稔、除
草剤抵抗性）及び50％のＡmsh/msh（稔性、除草剤感受
性）が得られる。
B.雄性親株系統Ｂの開発 Ba）系統Ｂを、植物の雌性器官の細胞内に選択的に遺伝
子発現を誘導する第１のプロモーターの制御下にある雌
性不稔DNA及びそれに隣接して除草剤抵抗性をコードす
る標識DNAを含む本発明に基づくキメラDNA配列で形質転
換し、ＢFSH/fshを得る。
子発現を誘導する第１のプロモーターの制御下にある雌
性不稔DNA及びそれに隣接して除草剤抵抗性をコードす
る標識DNAを含む本発明に基づくキメラDNA配列で形質転
換し、ＢFSH/fshを得る。
Bb）Ｂfsh/fshとの交配を通して系統ＢFSH/fshを維持
し、次のものを得る:50％のＢFSH/fsh（雌性不稔、除草
剤抵抗性）及び50％のＢfsh/fsh（稔性、除草剤感受
性）。
し、次のものを得る:50％のＢFSH/fsh（雌性不稔、除草
剤抵抗性）及び50％のＢfsh/fsh（稔性、除草剤感受
性）。
C.雑種種子作物の生産 Ca）Ab）及びBb）で得られた種子を無作為に植付けす
る。
る。
Cb）他家受粉及び自家受粉が起こる前に、望ましくない
遺伝子型を、除草剤噴霧により除去する。
遺伝子型を、除草剤噴霧により除去する。
Cc）他家受粉： ＡMSH/msh×ＢFSH/fsh が起こり、以下の遺伝子型を伴う100％の雑種種子が得
られる： 25％のABMSH/msh；FSH/fsh 25％のABMSH/msh；fsh/fsh 25％のABmsh/msh；FSH/fsh 25％のABmsh/msh；fsh/fsh これは、市販されている種子を表わす。
られる： 25％のABMSH/msh；FSH/fsh 25％のABMSH/msh；fsh/fsh 25％のABmsh/msh；FSH/fsh 25％のABmsh/msh；fsh/fsh これは、市販されている種子を表わす。
3.より容易な育種 ａ）標識DNAなしの場合 大部分の主要な作物が小胞子由来の２重一倍体を得る
能力を有することから、多少の差こそあれ直接的な方法
で同型接合核雌性不稔系統の生産が可能となる〔Chuong
及びBeversdorf（1985年）,Plant Sci.39,219−226〕。
これにより数多くの場合において、雌性不稔DNAと同じ
植物細胞核ゲノムの遺伝子座の中に標識DNAを有するこ
とが不要となる。このことは特に、同型接合雌性不稔植
物が栄養機能的に増殖されうる場合に言えることである
（例えば数多くの野菜）。
能力を有することから、多少の差こそあれ直接的な方法
で同型接合核雌性不稔系統の生産が可能となる〔Chuong
及びBeversdorf（1985年）,Plant Sci.39,219−226〕。
これにより数多くの場合において、雌性不稔DNAと同じ
植物細胞核ゲノムの遺伝子座の中に標識DNAを有するこ
とが不要となる。このことは特に、同型接合雌性不稔植
物が栄養機能的に増殖されうる場合に言えることである
（例えば数多くの野菜）。
ｂ）標識DNAを伴う場合 雌性不稔DNAが標識DNA（例えば除草剤抵抗性をコード
する）と同じ形質転換植物核ゲノム遺伝子座の中にある
場合、同型接合雌性不稔植物は、系統評価プログラムに
おける検定親株としてその他の数多くの系統よりも技術
的に優れている。このことは特に、種子が経済的収穫物
でなく、他家受粉が容易な作物について言えることであ
る。実際、これらの雌性不稔植物は、異なる系統の間で
のかけ合わせの結果得られた種子からテスト中の異なる
植物系統からの自家受粉種子を全て除去することを容易
にしながら、互いに近接した数多くの雌性稔性及び雄性
稔性系統のテストを可能にする。
する）と同じ形質転換植物核ゲノム遺伝子座の中にある
場合、同型接合雌性不稔植物は、系統評価プログラムに
おける検定親株としてその他の数多くの系統よりも技術
的に優れている。このことは特に、種子が経済的収穫物
でなく、他家受粉が容易な作物について言えることであ
る。実際、これらの雌性不稔植物は、異なる系統の間で
のかけ合わせの結果得られた種子からテスト中の異なる
植物系統からの自家受粉種子を全て除去することを容易
にしながら、互いに近接した数多くの雌性稔性及び雄性
稔性系統のテストを可能にする。
以下の実施例は本発明を例示している。
例中で参照している図は、以下のとおりである。
図1Aは、例１のSTMG07遺伝子のcDNA配列を示す。
図1Bは、例１のSTMG08遺伝子のcDNA配列を示す。
図2Aは、例１のSTMG4B12遺伝子のcDNA配列を示す。
図2Bは、例１のSTMG3C9遺伝子のcDNA配列を示す。
図３は、例４のベクターpMG100の地図を示す。
図４は、例６のベクターpMG101の地図を示す。
図５は、例８のベクターpMG102の地図を示す。
図６は、例８のベクターpMG103の地図を示す。
図７は、例10のベクターpMG104の地図を示す。
図８は、例10のベクターpMG105の地図を示す。
例中に相反する記述のないかぎり、組換え型DNAを作
り取り扱う手順は全て、Maniatis他著、「分子クローニ
ング−実験室マニュアル」Cold Spring HarborLaborato
ry（1982年）に記載されている標準化された手順により
実施した。例中に用いられている以下のベクターは、ブ
タペスト条約の規定に基づき、ドイツ連邦共和国Masche
roder weg 1B,D−3300 Braunschweig,のDeutsche Samml
ung Fr Mikroorganismen und Zellculturen（「DS
M」）に寄託されている： 例１−Nicotiana tabacum「プティ・ハバナ」8R1からの
花柱−柱頭特異的cDNAの分離 周知の手順（Matiatis他、1982年）を用いて、以下の
異なるタバコ組織から総mRNAを分離した：段階３〜７の
花からの花柱−柱頭組織〔Goldberg（1988年）Science
240,1460−1467に従って〕；段階８〜11の、花粉粒を発
達させなかった花からのいわゆる「幼年段階」の花柱−
柱頭組織〔Goldberg,1988年に従って〕；幼年段階の花
からのいわゆる「老年段階」の子房組織；老年段階の花
からの子房組織；及び生体外（in vitro）で栽培された
実生苗からの茎、根及び葉の組織。Amersham（Amersham
International PLC,Buckingshamshire,米国）キット、
cDNA合成システムプラス−RPN1256Y/Zを用いて、このキ
ットの使用上の指示に従って、幼年及び老年の花柱−柱
頭組織から、cDNAを合成した。このcDNAを、Amershamの
キットcDNAクローニングシステム−ラムダgt10−RPN125
7を用いて、このキットの指示に従って、ラムダgt10ベ
クターにクローニングした。このようにして得られたcD
NAライブラリーから、一方では実生苗からのcDNAプロー
ブ及び他方では花柱−柱頭組織からのcDNAプローブを用
いて、ディファレンシャル（差次的）スクリーニングを
行った。選択されたクローンをpGEM1（Promega,Madiso
n,Wisconsin,USA）にサブクローニングした。これらの
サブクローンの各々のプローブを調製し、さまざまなタ
バコ組織（根、茎、葉、がく片、花弁、葯、幼年段階の
花柱−柱頭、老年段階の花柱−花頭及び老年段階の子
房）からの総mRNA10μｇを用いてノーザンプロット法で
その特異性についてまず検査した。花柱−柱頭mRNAとこ
れらのノーザン法において特異的にハイブリダイズした
サブクローンを、幼年の子房、種子及びウイルス感染し
た葉を含む上述の組織から分離した２μｇのポリA+mRNA
と、ノーザン法で再度ハイブリダイズさせた。「pMG0
7」及び「pMG08」と呼ばれ、それぞれ0.963kb及び0.472
kbのインサートを含むクローンは、花柱−柱頭特異的cD
NA配列であることが立証された。これらのクローンを配
列決定し、そのcDNA配列をそれぞれ図1A及び図1Bに示し
た。pMG07のDNA配列は800個のヌクレオチドの配列全体
にわたり１つのオープンリーディングフレーム（「OR
F」）の存在を明らかにしている。pMG08の配列は、配列
全体にわたる１つのORFを明らかにしている。
り取り扱う手順は全て、Maniatis他著、「分子クローニ
ング−実験室マニュアル」Cold Spring HarborLaborato
ry（1982年）に記載されている標準化された手順により
実施した。例中に用いられている以下のベクターは、ブ
タペスト条約の規定に基づき、ドイツ連邦共和国Masche
roder weg 1B,D−3300 Braunschweig,のDeutsche Samml
ung Fr Mikroorganismen und Zellculturen（「DS
M」）に寄託されている： 例１−Nicotiana tabacum「プティ・ハバナ」8R1からの
花柱−柱頭特異的cDNAの分離 周知の手順（Matiatis他、1982年）を用いて、以下の
異なるタバコ組織から総mRNAを分離した：段階３〜７の
花からの花柱−柱頭組織〔Goldberg（1988年）Science
240,1460−1467に従って〕；段階８〜11の、花粉粒を発
達させなかった花からのいわゆる「幼年段階」の花柱−
柱頭組織〔Goldberg,1988年に従って〕；幼年段階の花
からのいわゆる「老年段階」の子房組織；老年段階の花
からの子房組織；及び生体外（in vitro）で栽培された
実生苗からの茎、根及び葉の組織。Amersham（Amersham
International PLC,Buckingshamshire,米国）キット、
cDNA合成システムプラス−RPN1256Y/Zを用いて、このキ
ットの使用上の指示に従って、幼年及び老年の花柱−柱
頭組織から、cDNAを合成した。このcDNAを、Amershamの
キットcDNAクローニングシステム−ラムダgt10−RPN125
7を用いて、このキットの指示に従って、ラムダgt10ベ
クターにクローニングした。このようにして得られたcD
NAライブラリーから、一方では実生苗からのcDNAプロー
ブ及び他方では花柱−柱頭組織からのcDNAプローブを用
いて、ディファレンシャル（差次的）スクリーニングを
行った。選択されたクローンをpGEM1（Promega,Madiso
n,Wisconsin,USA）にサブクローニングした。これらの
サブクローンの各々のプローブを調製し、さまざまなタ
バコ組織（根、茎、葉、がく片、花弁、葯、幼年段階の
花柱−柱頭、老年段階の花柱−花頭及び老年段階の子
房）からの総mRNA10μｇを用いてノーザンプロット法で
その特異性についてまず検査した。花柱−柱頭mRNAとこ
れらのノーザン法において特異的にハイブリダイズした
サブクローンを、幼年の子房、種子及びウイルス感染し
た葉を含む上述の組織から分離した２μｇのポリA+mRNA
と、ノーザン法で再度ハイブリダイズさせた。「pMG0
7」及び「pMG08」と呼ばれ、それぞれ0.963kb及び0.472
kbのインサートを含むクローンは、花柱−柱頭特異的cD
NA配列であることが立証された。これらのクローンを配
列決定し、そのcDNA配列をそれぞれ図1A及び図1Bに示し
た。pMG07のDNA配列は800個のヌクレオチドの配列全体
にわたり１つのオープンリーディングフレーム（「OR
F」）の存在を明らかにしている。pMG08の配列は、配列
全体にわたる１つのORFを明らかにしている。
カリフォルニア大学ロサンゼルス校（UCLA）のGoldbe
rg教授から、pGEM3zf（−）（Promega,Madison,Wiscons
in,USA）内にPst I−Sma Iフラグメントとしてクローニ
ングされた２つのNicotiana tabacum花柱−柱頭特異的c
DNA（4B12及び3C9）を入手した。これらのクローンは、
それぞれ0.748kb及び1.046kbのインサートを含んでい
た。これら２つのクローンのプローブを、その特異性を
検査する目的で、さまざまなタバコ組織（根、茎、葉、
がく片、葯、幼年段階の花柱−柱頭、老年段階の花柱−
柱頭及び老年段階の子房）からの10μｇの総mRNAと、ノ
ーザン法にてハイブリダイズさせた。これらのノーザン
法により、クローンの特異性を確認し、4B12の転写産物
が0.8kbであり、3C9の転写産物が1.2kbであることを明
らかにした。２つのクローンをpGEM1（Promega）にサブ
クローニングし、このサブクローンを4B12クローンにつ
いては「pMG4B12」、3C9クローンについては「pMG3C9」
と呼んだ。これらのサブクローンを、幼年段階の子房、
種子及びウイルス感染葉を含む上述の組織から分離され
た２μｇのポリA+mRNAを用いて、ノーザン法で再度その
特異性について検査した。それぞれ0.748kb及び1.046kb
のインサートを含むクローンpMG4B12及びpMG3C9は、花
柱−柱頭特異的配列であることがわかった。これらのク
ローンを配列決定し、そのcDNA配列をそれぞれ図2A及び
図2Bに示した。
rg教授から、pGEM3zf（−）（Promega,Madison,Wiscons
in,USA）内にPst I−Sma Iフラグメントとしてクローニ
ングされた２つのNicotiana tabacum花柱−柱頭特異的c
DNA（4B12及び3C9）を入手した。これらのクローンは、
それぞれ0.748kb及び1.046kbのインサートを含んでい
た。これら２つのクローンのプローブを、その特異性を
検査する目的で、さまざまなタバコ組織（根、茎、葉、
がく片、葯、幼年段階の花柱−柱頭、老年段階の花柱−
柱頭及び老年段階の子房）からの10μｇの総mRNAと、ノ
ーザン法にてハイブリダイズさせた。これらのノーザン
法により、クローンの特異性を確認し、4B12の転写産物
が0.8kbであり、3C9の転写産物が1.2kbであることを明
らかにした。２つのクローンをpGEM1（Promega）にサブ
クローニングし、このサブクローンを4B12クローンにつ
いては「pMG4B12」、3C9クローンについては「pMG3C9」
と呼んだ。これらのサブクローンを、幼年段階の子房、
種子及びウイルス感染葉を含む上述の組織から分離され
た２μｇのポリA+mRNAを用いて、ノーザン法で再度その
特異性について検査した。それぞれ0.748kb及び1.046kb
のインサートを含むクローンpMG4B12及びpMG3C9は、花
柱−柱頭特異的配列であることがわかった。これらのク
ローンを配列決定し、そのcDNA配列をそれぞれ図2A及び
図2Bに示した。
例２−花柱−柱頭cDNAクローンに対応する花柱−柱頭特
異的遺伝子（「STMG型遺伝子」）の分離 既知の手順（Maniatis他、1982年）を用いて、タバコ
の雌器の花柱−柱頭組織内で特異的に発現される対応す
るゲノム遺伝子を分離するのに、花柱−柱頭特異的配列
の例１のcDNAクローンの各々からのプローブを用いた。
Promegaが提供しているプロトコール（実験手順）に従
って、タバコのゲノムDNAをSau3Aで部分的に消化し、制
限フラグメントを、Xho Iで消化したラムダファージベ
クターGEM.12（Promega）にクローニングして、「ラム
ダSTG07」、「ラムダSTG08」、「ラムダSTG4B12」及び
「ラムダSTG3C9」と呼ばれるゲノミッククローンを生成
した。その後、これらのゲノミッククローンをPromega
の手順に従ってpGEM1（Promega）にサブクローニングし
た。これらのサブクローンを、花柱−柱頭特異DNA配列
を含んでいるクローンを識別するため、プローブとして
それぞれのcDNAクローンを用いて、サザン法で再び分析
した。それぞれ「pSTG07」、「pSTG08」、「pSTG4B12及
び「pSTG3C9」と呼ばれるこれらのサブクローンを配列
決定した〔Maxam及びGilbert（1977年）PNAS,74,56
0〕。これらのクローンの方向性は、両方向のリボプロ
ーブを用いてノーザン分析法で決定した。各々のcDNAを
そのそれぞれのゲノミッククローン配列と比較したとこ
ろ、相同性領域を識別することができた。各領域の５′
末端において、ATGコドン及びコンセンサス配列TATAが
見極められた。この「TATA」ボックスが遺伝子のプロモ
ーターの一部であることは、プライマー伸展によって確
認されている〔Mcknight他（1987年）Cell（細胞）25,3
85〕。プローブとして花柱−柱頭cDNAを用いて分離され
た花柱−柱頭特異遺伝子は、一般に「STMG型」遺伝子と
呼ばれている。pSTG07の花柱−柱頭特異遺伝子は、「ST
MG07」、pSTG08はそれは「STMG08」、pSTG4B12のそれは
「STMG4B12」、pSTG3C9のそれは「STMG3C9」と呼ばれ
る。
異的遺伝子（「STMG型遺伝子」）の分離 既知の手順（Maniatis他、1982年）を用いて、タバコ
の雌器の花柱−柱頭組織内で特異的に発現される対応す
るゲノム遺伝子を分離するのに、花柱−柱頭特異的配列
の例１のcDNAクローンの各々からのプローブを用いた。
Promegaが提供しているプロトコール（実験手順）に従
って、タバコのゲノムDNAをSau3Aで部分的に消化し、制
限フラグメントを、Xho Iで消化したラムダファージベ
クターGEM.12（Promega）にクローニングして、「ラム
ダSTG07」、「ラムダSTG08」、「ラムダSTG4B12」及び
「ラムダSTG3C9」と呼ばれるゲノミッククローンを生成
した。その後、これらのゲノミッククローンをPromega
の手順に従ってpGEM1（Promega）にサブクローニングし
た。これらのサブクローンを、花柱−柱頭特異DNA配列
を含んでいるクローンを識別するため、プローブとして
それぞれのcDNAクローンを用いて、サザン法で再び分析
した。それぞれ「pSTG07」、「pSTG08」、「pSTG4B12及
び「pSTG3C9」と呼ばれるこれらのサブクローンを配列
決定した〔Maxam及びGilbert（1977年）PNAS,74,56
0〕。これらのクローンの方向性は、両方向のリボプロ
ーブを用いてノーザン分析法で決定した。各々のcDNAを
そのそれぞれのゲノミッククローン配列と比較したとこ
ろ、相同性領域を識別することができた。各領域の５′
末端において、ATGコドン及びコンセンサス配列TATAが
見極められた。この「TATA」ボックスが遺伝子のプロモ
ーターの一部であることは、プライマー伸展によって確
認されている〔Mcknight他（1987年）Cell（細胞）25,3
85〕。プローブとして花柱−柱頭cDNAを用いて分離され
た花柱−柱頭特異遺伝子は、一般に「STMG型」遺伝子と
呼ばれている。pSTG07の花柱−柱頭特異遺伝子は、「ST
MG07」、pSTG08はそれは「STMG08」、pSTG4B12のそれは
「STMG4B12」、pSTG3C9のそれは「STMG3C9」と呼ばれ
る。
例３−それぞれのSTMG型遺伝子から誘導されたプロモー
ターカセット（「PSTMG」）の構築 第１の非相同雌性不稔DNAと同じ転写単位内にありこ
れを制御するSTMG型遺伝子のプロモーターを含む５′調
節配列を含むキメラDNA配列を構築するためには、プロ
モーターを含むDNAフラグメントをpMAC5−８のポリリン
カー〔欧州特許出願明細書87/402,348.4号〕へとサブク
ローニングすることによってカセットが構築される。こ
うして、部位指向性突然変異誘発において用いるために
一本鎖DNAを分離するのに用いることのできるそれぞれ
のベクター生成される。
ターカセット（「PSTMG」）の構築 第１の非相同雌性不稔DNAと同じ転写単位内にありこ
れを制御するSTMG型遺伝子のプロモーターを含む５′調
節配列を含むキメラDNA配列を構築するためには、プロ
モーターを含むDNAフラグメントをpMAC5−８のポリリン
カー〔欧州特許出願明細書87/402,348.4号〕へとサブク
ローニングすることによってカセットが構築される。こ
うして、部位指向性突然変異誘発において用いるために
一本鎖DNAを分離するのに用いることのできるそれぞれ
のベクター生成される。
部位指向性突然変異誘発（欧州特許出願明細書87/40
2,348.4号）を用いて、遺伝子の各々のATG開始コドンを
とり囲む配列は、突然変異が一定の与えられた制限酵素
のための唯一の認識部位である一定の与えられた配列を
作り出すような形で、変更される。結果として得られた
プラスミドは各々新たに作られた制限部位を含む。この
新たに作られた制限部位にまたがる正確なヌクレオチド
配列は、それが、新たな制限部位を作り出す置換という
点でのみ対応するSTMG型遺伝子の５′配列と異なってい
るということを確認するために決定される。各々１つの
プロモーター、そのATG開始コドンまでのSTMG型遺伝子
の５′非翻訳末端ならびに新たな制限部位を含んでいる
新たに生成されたプロモーターカセットは、一般に「PS
TMGs」と呼ばれる。プロモーターとSTMG07の５′末端を
含むPSTMGは「PSTMG07」と呼ばれ、STMG08のそれは「PS
TMG08」、STMG4B12のそれは「PSTMG4B12」、そしてSTMG
3C9のそれは「PSTMG3C9」と呼ばれる。
2,348.4号）を用いて、遺伝子の各々のATG開始コドンを
とり囲む配列は、突然変異が一定の与えられた制限酵素
のための唯一の認識部位である一定の与えられた配列を
作り出すような形で、変更される。結果として得られた
プラスミドは各々新たに作られた制限部位を含む。この
新たに作られた制限部位にまたがる正確なヌクレオチド
配列は、それが、新たな制限部位を作り出す置換という
点でのみ対応するSTMG型遺伝子の５′配列と異なってい
るということを確認するために決定される。各々１つの
プロモーター、そのATG開始コドンまでのSTMG型遺伝子
の５′非翻訳末端ならびに新たな制限部位を含んでいる
新たに生成されたプロモーターカセットは、一般に「PS
TMGs」と呼ばれる。プロモーターとSTMG07の５′末端を
含むPSTMGは「PSTMG07」と呼ばれ、STMG08のそれは「PS
TMG08」、STMG4B12のそれは「PSTMG4B12」、そしてSTMG
3C9のそれは「PSTMG3C9」と呼ばれる。
例４−PSTMG及びRNA分解酵素T1遺伝子のキメラDNA配列
の構築 図３に示されている「pMG100」という名のプラスミド
が、各々以下の周知のDNAフラグメントを例３のPSTMGs
のうちの異なる１つと組立てることによって構築され
る： 1.Sac I部位への挿入によりアンピシリン抵抗性をコー
ドするβ−ラクタマーゼ遺伝子が不活性化されたpGSC17
00からの、Ｔ−DNAボーダー配列を含むベクターフラグ
メント〔なおこれらのボーダーボーダー配列の間には以
下のDNAフラグメント２〜４が位置づけされている〕； 2.Arabidopsis Rubisco SSUプロモーター（「PSSU」又
は「PSSUARA」）、除草剤抵抗性遺伝子sfr（欧州特許出
願明細書87/400,544.0号）及びＴ−DNA遺伝子７〔Velte
n及びSchell（1985年）NAR,13,6981〕の３′末端（すな
わち転写終結）シグナルを含むキメラ配列； 3.ノパリンシンターゼプロモーター（「PNOS」）、カナ
マイシン抵抗性をコードするneo遺伝子、及びオクトピ
ンシンターゼ（「OCS」）遺伝子の３′末端シグナル
〔欧州特許出願明細書87/400,544.0号；なおここでpGSF
R401は「pGSR4」と呼ばれている〕を含むpGSFR401から
のEcoR I/Sac Iフラグメントを含むキメラ配列；及び 4.A.oryzaeからのRNA分解酵素T1をコードする合成遺伝
子とフレーム内で融合された例３からのPSTMGプロモー
ターカセットの１つ〔Quaas他「生体リン酸塩とその類
似体−合成、構造、代謝及び活性」（1987年）Elsevier
Science Publisher B.V.,アムステルダム;Quaas他（19
88年）Eur.J.Biochem.173,617−622〕及びノパリンシン
ターゼ（「NOS」）遺伝子の３′末端シグナル〔An他（1
985年）EMBO J.４（２）,277〕を含むキメラ配列。
の構築 図３に示されている「pMG100」という名のプラスミド
が、各々以下の周知のDNAフラグメントを例３のPSTMGs
のうちの異なる１つと組立てることによって構築され
る： 1.Sac I部位への挿入によりアンピシリン抵抗性をコー
ドするβ−ラクタマーゼ遺伝子が不活性化されたpGSC17
00からの、Ｔ−DNAボーダー配列を含むベクターフラグ
メント〔なおこれらのボーダーボーダー配列の間には以
下のDNAフラグメント２〜４が位置づけされている〕； 2.Arabidopsis Rubisco SSUプロモーター（「PSSU」又
は「PSSUARA」）、除草剤抵抗性遺伝子sfr（欧州特許出
願明細書87/400,544.0号）及びＴ−DNA遺伝子７〔Velte
n及びSchell（1985年）NAR,13,6981〕の３′末端（すな
わち転写終結）シグナルを含むキメラ配列； 3.ノパリンシンターゼプロモーター（「PNOS」）、カナ
マイシン抵抗性をコードするneo遺伝子、及びオクトピ
ンシンターゼ（「OCS」）遺伝子の３′末端シグナル
〔欧州特許出願明細書87/400,544.0号；なおここでpGSF
R401は「pGSR4」と呼ばれている〕を含むpGSFR401から
のEcoR I/Sac Iフラグメントを含むキメラ配列；及び 4.A.oryzaeからのRNA分解酵素T1をコードする合成遺伝
子とフレーム内で融合された例３からのPSTMGプロモー
ターカセットの１つ〔Quaas他「生体リン酸塩とその類
似体−合成、構造、代謝及び活性」（1987年）Elsevier
Science Publisher B.V.,アムステルダム;Quaas他（19
88年）Eur.J.Biochem.173,617−622〕及びノパリンシン
ターゼ（「NOS」）遺伝子の３′末端シグナル〔An他（1
985年）EMBO J.４（２）,277〕を含むキメラ配列。
各々のpMG100は、Ｔ−DNAボーダー配列内に３つのキ
メラ配列、すなわち第２のプロモーターとしてそれぞれ
PSSU及びPNOSを有する標識DNAであるPSSU−sfr及びPNOS
−neo、ならびに第１のプロモーターとしてPSTMGの制御
下にある雌性不稔DNAであるPSTMG−RNase（RNA分解酵
素）T1遺伝子を含む、２元（バイナリー）タイプのＴ−
DNAベクターである。PSTMGプロモーターの制御下での雌
性不稔DNAの発現は、花柱及び／又は柱頭細胞内で選択
的にRNaseT1を産生することになる。RNaseT1はこれらの
細胞の代謝にとって必要不可欠なものであるRNA分子を
分解することから、これらはこれらの花柱及び／又は柱
頭の細胞にとって致命的なことである。
メラ配列、すなわち第２のプロモーターとしてそれぞれ
PSSU及びPNOSを有する標識DNAであるPSSU−sfr及びPNOS
−neo、ならびに第１のプロモーターとしてPSTMGの制御
下にある雌性不稔DNAであるPSTMG−RNase（RNA分解酵
素）T1遺伝子を含む、２元（バイナリー）タイプのＴ−
DNAベクターである。PSTMGプロモーターの制御下での雌
性不稔DNAの発現は、花柱及び／又は柱頭細胞内で選択
的にRNaseT1を産生することになる。RNaseT1はこれらの
細胞の代謝にとって必要不可欠なものであるRNA分子を
分解することから、これらはこれらの花柱及び／又は柱
頭の細胞にとって致命的なことである。
例５−タバコ及びアルファルファへの例４の各キメラDN
A配列の導入 E.coli（大腸菌）から、pMP90を含むAgrobacterium t
umefaciens C58C1 RifR〔Koncz及びSchell（1986年）Mo
l.Gen.Genetics 204,383−396〕内に各々のpMG100（例
４からのもの）を可動化（授動）することにより、組換
え型Agrobacterium菌株を構築する。
A配列の導入 E.coli（大腸菌）から、pMP90を含むAgrobacterium t
umefaciens C58C1 RifR〔Koncz及びSchell（1986年）Mo
l.Gen.Genetics 204,383−396〕内に各々のpMG100（例
４からのもの）を可動化（授動）することにより、組換
え型Agrobacterium菌株を構築する。
結果として得られた、pMP90及びpMG100を宿すAgrobac
terium菌株は、欧州特許出願明細書87/400,544.0号に記
載されているような標準的手順を用いたタバコのリーフ
ディスク（N.tabacum Petite Havane,SR1）の形質転換
及びＤ′Halluin他（1990年）Crop Science 30（印刷
中）の中に記載されている手順に従ったアルファルファ
の形質転換のために用いられる。
terium菌株は、欧州特許出願明細書87/400,544.0号に記
載されているような標準的手順を用いたタバコのリーフ
ディスク（N.tabacum Petite Havane,SR1）の形質転換
及びＤ′Halluin他（1990年）Crop Science 30（印刷
中）の中に記載されている手順に従ったアルファルファ
の形質転換のために用いられる。
Carbenicillinは、共栽培の後Agrobacterium菌株を殺
すのに用いられる。形質転換されたカルスを、5mg/ホ
スフィノトリシン及び100μg/mlのカナマイシンを含む
基質上で選択し、抵抗性あるカルスを植物まで再生させ
た。RNaseT1遺伝子が存在しているにもかかわらず植物
が正常に生長していることを証明する苗条及び根の誘発
の後、形質転換体を温室に移し、開花するまで栽培し
た。花を検査したところ、正常な花柱−柱頭形成は全く
みられない。受粉の後、いかなる生存種子も形成されて
いない。形質転換された植物は雌性不稔である。
すのに用いられる。形質転換されたカルスを、5mg/ホ
スフィノトリシン及び100μg/mlのカナマイシンを含む
基質上で選択し、抵抗性あるカルスを植物まで再生させ
た。RNaseT1遺伝子が存在しているにもかかわらず植物
が正常に生長していることを証明する苗条及び根の誘発
の後、形質転換体を温室に移し、開花するまで栽培し
た。花を検査したところ、正常な花柱−柱頭形成は全く
みられない。受粉の後、いかなる生存種子も形成されて
いない。形質転換された植物は雌性不稔である。
例６−PSTMG及びBarnase遺伝子のキメラDNA配列の構築 図４に示されている「pMG101」という名のプラスミド
が、各々例３のPSTMGのうちの異なる１つと以下の周知
のDNAフラグメントを組立てることによって構築され
る： 1.ボーダー配列間に以下のDNAフラグメント２〜４を有
する、例４に記述されているようなpGSC1700から誘導さ
れたＴ−DNAボーダー配列を含むベクターフラグメン
ト； 2.PSSUプロモーター、除草剤抵抗性遺伝子sfr及びＴ−D
NA遺伝子７の３′末端を含む、例４のキメラ配列（No.
2）； 3.PNOSプロモーター、カナマイシン抵抗性をコードする
neo遺伝子及びOCS遺伝子の３′末端シグナルを含む、例
４のキメラ配列（No.3）；及び 4.Bacillus amiloliquefaciensからのBarnase遺伝子と
フレーム内で融合された例３からのPSTMGsの１つ〔Hart
ley及びRogerson（1972年）Preparative Biochemistry
２．（３）,243−250〕及び例４のNOS遺伝子の３′末端
を含むキメラ配列。
が、各々例３のPSTMGのうちの異なる１つと以下の周知
のDNAフラグメントを組立てることによって構築され
る： 1.ボーダー配列間に以下のDNAフラグメント２〜４を有
する、例４に記述されているようなpGSC1700から誘導さ
れたＴ−DNAボーダー配列を含むベクターフラグメン
ト； 2.PSSUプロモーター、除草剤抵抗性遺伝子sfr及びＴ−D
NA遺伝子７の３′末端を含む、例４のキメラ配列（No.
2）； 3.PNOSプロモーター、カナマイシン抵抗性をコードする
neo遺伝子及びOCS遺伝子の３′末端シグナルを含む、例
４のキメラ配列（No.3）；及び 4.Bacillus amiloliquefaciensからのBarnase遺伝子と
フレーム内で融合された例３からのPSTMGsの１つ〔Hart
ley及びRogerson（1972年）Preparative Biochemistry
２．（３）,243−250〕及び例４のNOS遺伝子の３′末端
を含むキメラ配列。
各々のpMG101は、Ｔ−DNAボーダー配列の中に３つの
キメラ配列、すなわち、第２のプロモーターとしてそれ
ぞれPSSU及びPNOSを有する標識DNAであるPSSU−sfr及び
PNOS−neo;及び第１のプロモーターとしてPSTMGの制御
下にある雌性不稔DNAであるPSTMG−Barnase遺伝子を含
む、２元タイプのＴ−DNAベクターである。PSTMGプロモ
ーターの制御下での雌性不稔DNAの発現は、花柱及び／
又は柱頭の細胞内で選択的にBarnaseを生成することに
なる。BarnaseはRNA分子を分解し、かくして花柱及び／
又は柱頭細胞の代謝を妨げることから、このことはこれ
らの細胞にとって致命的である。
キメラ配列、すなわち、第２のプロモーターとしてそれ
ぞれPSSU及びPNOSを有する標識DNAであるPSSU−sfr及び
PNOS−neo;及び第１のプロモーターとしてPSTMGの制御
下にある雌性不稔DNAであるPSTMG−Barnase遺伝子を含
む、２元タイプのＴ−DNAベクターである。PSTMGプロモ
ーターの制御下での雌性不稔DNAの発現は、花柱及び／
又は柱頭の細胞内で選択的にBarnaseを生成することに
なる。BarnaseはRNA分子を分解し、かくして花柱及び／
又は柱頭細胞の代謝を妨げることから、このことはこれ
らの細胞にとって致命的である。
例７−タバコ及びアルファルファへの例６の各キメラDN
A配列の導入 例５で記述したように、pMP90を含むAgrobacterium C
58C1 RifR〔Koncz及びSchell（1986年）Mol.Gen.Geneti
cs 204,383−396〕内にE.coli（大腸菌）から各々のpMG
101（例６からのもの）を可動化（授動）することによ
り、組換え型Agrobacterium菌株を構築する。結果とし
て得られた、pMP90及びpMG100を宿すAgrobacterium菌株
は、タバコのリーフディスクの形質転換及びアルファル
ファの形質転換のために用いられる。形質転換されたカ
ルス及び苗条（従長板）を、5mg/のホスフィノトリシ
ン及び100μg/mlのカナマイシンを用いて選択する。Bar
nase遺伝子が形質転換された除草剤抵抗性のカルス及び
苗条内で発現されていないことは、その生長によって示
される。
A配列の導入 例５で記述したように、pMP90を含むAgrobacterium C
58C1 RifR〔Koncz及びSchell（1986年）Mol.Gen.Geneti
cs 204,383−396〕内にE.coli（大腸菌）から各々のpMG
101（例６からのもの）を可動化（授動）することによ
り、組換え型Agrobacterium菌株を構築する。結果とし
て得られた、pMP90及びpMG100を宿すAgrobacterium菌株
は、タバコのリーフディスクの形質転換及びアルファル
ファの形質転換のために用いられる。形質転換されたカ
ルス及び苗条（従長板）を、5mg/のホスフィノトリシ
ン及び100μg/mlのカナマイシンを用いて選択する。Bar
nase遺伝子が形質転換された除草剤抵抗性のカルス及び
苗条内で発現されていないことは、その生長によって示
される。
形質転換された苗条を発根させ、温室内の土壌に移
し、開花するまで栽培する。タバコ及びアルファルファ
の両方の花を検査すると、例５に記述されている形質転
換植物において観察されたものと基本的に同じ表現型が
形質転換植物に観察できる（すなわち正常な花柱−柱頭
形成なし）。形質転換植物は、雌性不稔である。
し、開花するまで栽培する。タバコ及びアルファルファ
の両方の花を検査すると、例５に記述されている形質転
換植物において観察されたものと基本的に同じ表現型が
形質転換植物に観察できる（すなわち正常な花柱−柱頭
形成なし）。形質転換植物は、雌性不稔である。
例８−PSTMG及びパパインをコードする遺伝子のキメラD
NA配列の構築 図５に示されている「pMG102」という名のプラスミド
は、例３のPSTMGのうちの異なる１つと以下の周知のDNA
フラグメントを組み合わせることによって各々構築され
る； 1.例４に記述したようにpGSC1700から誘導されたＴ−DN
A配列を含み、ボーダー配列間に以下のDNAフラグメント
２〜４を有するベクターフラグメント、 2.PSSUプロモーター、除草剤抵抗性遺伝子sfr及びＴ−D
NA遺伝子７の３′末端を含む、例４のキメラ配列（No.
2）、 3.PNOSプロモーター、neo遺伝子及びOCS遺伝子の３′末
端を含む、例４のキメラ配列（No.3）、 4.フレーム内で以下のものと融合された、例３からのPS
TMGの１つを含むキメラ配列； ａ）ペプチド結合ならびにエステル結合を攻撃するこ
とのできる植物のエンドペプチダーゼであるパパインチ
モーゲンをコードするCarica papaya果実からのパパイ
ン遺伝子〔Cohen他（1986年）Gene,48,219−227〕；例
３に記述されている部位指向性突然変異誘発を用いて、
Cohen他（1986年）に従ったパパイン遺伝子のDNA配列内
に、以下の変更を加える： i.第１のATGコドンの上流の位置１のヌクレオチド
Ａを、適当なNco Iクローニング部位を得るためにヌク
レオチドＣに突然変異させる；及び ii.位置47、118及び135にあるグルタミン酸をコー
ドするGAAコドンを、グルタミンをコードするCAAコドン
へと突然変異させる。
NA配列の構築 図５に示されている「pMG102」という名のプラスミド
は、例３のPSTMGのうちの異なる１つと以下の周知のDNA
フラグメントを組み合わせることによって各々構築され
る； 1.例４に記述したようにpGSC1700から誘導されたＴ−DN
A配列を含み、ボーダー配列間に以下のDNAフラグメント
２〜４を有するベクターフラグメント、 2.PSSUプロモーター、除草剤抵抗性遺伝子sfr及びＴ−D
NA遺伝子７の３′末端を含む、例４のキメラ配列（No.
2）、 3.PNOSプロモーター、neo遺伝子及びOCS遺伝子の３′末
端を含む、例４のキメラ配列（No.3）、 4.フレーム内で以下のものと融合された、例３からのPS
TMGの１つを含むキメラ配列； ａ）ペプチド結合ならびにエステル結合を攻撃するこ
とのできる植物のエンドペプチダーゼであるパパインチ
モーゲンをコードするCarica papaya果実からのパパイ
ン遺伝子〔Cohen他（1986年）Gene,48,219−227〕；例
３に記述されている部位指向性突然変異誘発を用いて、
Cohen他（1986年）に従ったパパイン遺伝子のDNA配列内
に、以下の変更を加える： i.第１のATGコドンの上流の位置１のヌクレオチド
Ａを、適当なNco Iクローニング部位を得るためにヌク
レオチドＣに突然変異させる；及び ii.位置47、118及び135にあるグルタミン酸をコー
ドするGAAコドンを、グルタミンをコードするCAAコドン
へと突然変異させる。
ｂ）例４のNOS遺伝子の３′末端。
各々のpMG102は、Ｔ−DNAボーダー配列の中に３つの
キメラ配列、すなわち、第２のプロモーターとしてそれ
ぞれPSSU及びPNOSの制御下にある植物形質転換のための
優性で選択可能な標識をコードする標識DNAであるPSSU
−sfr及びPNOS−neo、ならびに第１のプロモーターとし
てPSTMGの制御下にある雌性不稔DNAであるPSTMGパパイ
ンチモーゲン遺伝子、を含む二元タイプのＴ−DNAベク
ターである。PSTMGプロモーターの制御下で雌性不稔DNA
を発現させると、花柱及び／又は柱頭の細胞内で選択的
に、花柱及び／又は柱頭細胞内でタンパク質を切断して
これらの細胞を死に導くようなエンドペプチダーゼ（パ
パインチモーゲン）が生み出される。
キメラ配列、すなわち、第２のプロモーターとしてそれ
ぞれPSSU及びPNOSの制御下にある植物形質転換のための
優性で選択可能な標識をコードする標識DNAであるPSSU
−sfr及びPNOS−neo、ならびに第１のプロモーターとし
てPSTMGの制御下にある雌性不稔DNAであるPSTMGパパイ
ンチモーゲン遺伝子、を含む二元タイプのＴ−DNAベク
ターである。PSTMGプロモーターの制御下で雌性不稔DNA
を発現させると、花柱及び／又は柱頭の細胞内で選択的
に、花柱及び／又は柱頭細胞内でタンパク質を切断して
これらの細胞を死に導くようなエンドペプチダーゼ（パ
パインチモーゲン）が生み出される。
図６に示されている「pMG103」という名のプラスミド
も同様に、各々例３のPSTMGのうちの異なる１つと以下
の周知のDNAフラグメントを組立てることによって構築
される： 1.例４に記述されているようにpGSC1700から誘導された
Ｔ−DNAボーダー配列を含み、そのボーダー配列の間に
以下のDNAフラグメント２〜４を有するベクターフラグ
メント； 2.PSSUプロモーター、除草剤抵抗性遺伝子sfr及びＴ−D
NA遺伝子７の３′末端を含む、例４のキメラ配列（No.
2）； 3.PNOSプロモーター、neo遺伝子及びOCS遺伝子の３′末
端を含む、例４のキメラ配列（No.3）；及び 4.フレーム内で以下のものと融合された、例３のPSTMG
のうちの１つを含むキメラ配列： ａ）パパインチモーゲンの活性タンパク質をコードす
るCarica papaya果実からのパライン遺伝子；例３に記
述されているような部位指向性突然変異誘発を用いてCo
hen他（1986年）に従ったパパイン遺伝子の配列に以下
の変更を加える： i.活性タンパク質の第１のIle残基の上流でAsnをコ
ードするATTコドンを、適当なEcoR Vクローニング部位
（GATATC）を提供するGATコドンへと突然変異させる。
パパインチモーゲンの活性タンパク質をコードする配列
とプロモーターとの直接的フレーム内融合を得るため
に、工学的に作られたEcoR V部位を直接PSTMGに融合さ
せる；また ii.位置47、118及び135のグルタミン酸をコードす
るGAAコドンを、グルタミンをコードするCAAコドンへと
突然変異させる；及び ｂ）例４のNOS遺伝子の３′末端。
も同様に、各々例３のPSTMGのうちの異なる１つと以下
の周知のDNAフラグメントを組立てることによって構築
される： 1.例４に記述されているようにpGSC1700から誘導された
Ｔ−DNAボーダー配列を含み、そのボーダー配列の間に
以下のDNAフラグメント２〜４を有するベクターフラグ
メント； 2.PSSUプロモーター、除草剤抵抗性遺伝子sfr及びＴ−D
NA遺伝子７の３′末端を含む、例４のキメラ配列（No.
2）； 3.PNOSプロモーター、neo遺伝子及びOCS遺伝子の３′末
端を含む、例４のキメラ配列（No.3）；及び 4.フレーム内で以下のものと融合された、例３のPSTMG
のうちの１つを含むキメラ配列： ａ）パパインチモーゲンの活性タンパク質をコードす
るCarica papaya果実からのパライン遺伝子；例３に記
述されているような部位指向性突然変異誘発を用いてCo
hen他（1986年）に従ったパパイン遺伝子の配列に以下
の変更を加える： i.活性タンパク質の第１のIle残基の上流でAsnをコ
ードするATTコドンを、適当なEcoR Vクローニング部位
（GATATC）を提供するGATコドンへと突然変異させる。
パパインチモーゲンの活性タンパク質をコードする配列
とプロモーターとの直接的フレーム内融合を得るため
に、工学的に作られたEcoR V部位を直接PSTMGに融合さ
せる；また ii.位置47、118及び135のグルタミン酸をコードす
るGAAコドンを、グルタミンをコードするCAAコドンへと
突然変異させる；及び ｂ）例４のNOS遺伝子の３′末端。
各pMG103は各pMG102と同様、Ｔ−DNAボーダー配列内
に３つのキメラ遺伝子、すなわち、植物形質転換のため
の優性の選択可能な標識をコードするPSSU−sfr及びPNO
S−neoならびに、第１のプロモーターとしてPSTMGの制
御下にあり、花柱及び／又は柱頭細胞内でタンパク質を
切断してこれらの細胞を選択的に死に導くようなエンド
ペプチダーゼをコードする雌性不稔DNAであるPSTMG−パ
パイン活性タンパク質遺伝子を含む、２元タイプのＴ−
DNAベクターである。
に３つのキメラ遺伝子、すなわち、植物形質転換のため
の優性の選択可能な標識をコードするPSSU−sfr及びPNO
S−neoならびに、第１のプロモーターとしてPSTMGの制
御下にあり、花柱及び／又は柱頭細胞内でタンパク質を
切断してこれらの細胞を選択的に死に導くようなエンド
ペプチダーゼをコードする雌性不稔DNAであるPSTMG−パ
パイン活性タンパク質遺伝子を含む、２元タイプのＴ−
DNAベクターである。
例９−タバコ及びアルファルファへの例８の各キメラDN
A配列の導入 例５に記述されているように、各々のpMG102及びpMG1
03（例８からの）を、大腸菌から、pMP90を運ぶ別のAgr
obacteria C58C1RifRに可動化（授動）する。結果とし
て得られる、pMG102を伴うpMP90及びpMG103を伴うpMP90
を宿す菌株は、例５の手順に従ってタバコ及びアルファ
ルファを形質転換するのに用いられる。形質転換された
除草剤−及びカナマイシン−抵抗性カルス、苗条及び根
の中でパパイン遺伝子が発現されないことは、その生長
により示される。
A配列の導入 例５に記述されているように、各々のpMG102及びpMG1
03（例８からの）を、大腸菌から、pMP90を運ぶ別のAgr
obacteria C58C1RifRに可動化（授動）する。結果とし
て得られる、pMG102を伴うpMP90及びpMG103を伴うpMP90
を宿す菌株は、例５の手順に従ってタバコ及びアルファ
ルファを形質転換するのに用いられる。形質転換された
除草剤−及びカナマイシン−抵抗性カルス、苗条及び根
の中でパパイン遺伝子が発現されないことは、その生長
により示される。
形質転換された植物を温室内に移し、開花するまで土
壌中で栽培する。タバコ及びアルファルファの両方の花
を検査し、例５に記述されている形質転換植物で観察さ
れたものと同じ表現型が形質転換植物に観察できる（す
なわち正常な花柱、柱頭形成は全くなし）。形質転換植
物は、雌性不稔である。
壌中で栽培する。タバコ及びアルファルファの両方の花
を検査し、例５に記述されている形質転換植物で観察さ
れたものと同じ表現型が形質転換植物に観察できる（す
なわち正常な花柱、柱頭形成は全くなし）。形質転換植
物は、雌性不稔である。
例10−PSTMG及びEcoR Iをコードする遺伝子のキメラDNA
配列の構築 図７に示されている「pMG104」という名のプラスミド
を、各々例３のPSTMGのうちの異なる１つと以下の周知
のDNAフラグメントを組立てることによって構築する： 1.pGSC1701A2〔欧州特許出願明細書87/115,985.1号）か
ら誘導されたＴ−DNAボーダー配列を含むベクターフラ
グメント；なお、これらのボーダー配列の間には、以下
のDNAフラグメント２〜５が位置づけられている； 2.PSSUプロモーター、除草剤抵抗性遺伝子sfr及びＴ−D
NA遺伝子７の３′末端を含む、例４のキメラ配列（No.
2） 3.PNOSプロモーター、neo遺伝子及びOCS遺伝子の３′末
端を含む、例４のキメラ配列（No.4）； 4.フレーム内で以下のものと融合された、例３のPSTMG
のうちの１つを含むキメラ配列： ａ）大腸菌からの、２本鎖DNA上で標的配列GAATTCを
認識し切断することができるEcoR I制限エンドヌクレア
ーゼをコードする遺伝子〔Green他（1981年）J.Biol.Ch
em.256.2143−2153;Botterman及びZabeau（1985年）Gen
e 37.229−239〕：例３で記述されているような部位指
向性突然変異誘発を用いて、Green他（1981年）に従っ
た遺伝子のDNA配列に以下の変更を行う： i.ATG開始コドンのヌクレオチドをATGCAで置換し、
開始コドンでNsi I部位を作り出し、以下のヌクレオチ
ド配列を生み出す:ATGCA、TCT、AAT...;及び、 ii.pEcoR12にクローニングされたEcoR I遺伝子のHi
nd II−Hind IIIフラグメント（Botterman及びZabeau、
1985年）を、pMAC5−８部位指向性突然変異誘発ベクタ
ーにクローニングする；及び ｂ）例４のNOS遺伝子の３′末端；及び 5.微生物内のEcoR I遺伝子の潜在的な微量の発現を克服
するため、大腸菌又はAgrobacteriumのEcoR Iの活性を
阻害することのできる、その天然のプロモーターの制御
下にある、EcoR Iメチラーゼをコードする遺伝子〔Bott
erman及びZabeau、1985年〕。
配列の構築 図７に示されている「pMG104」という名のプラスミド
を、各々例３のPSTMGのうちの異なる１つと以下の周知
のDNAフラグメントを組立てることによって構築する： 1.pGSC1701A2〔欧州特許出願明細書87/115,985.1号）か
ら誘導されたＴ−DNAボーダー配列を含むベクターフラ
グメント；なお、これらのボーダー配列の間には、以下
のDNAフラグメント２〜５が位置づけられている； 2.PSSUプロモーター、除草剤抵抗性遺伝子sfr及びＴ−D
NA遺伝子７の３′末端を含む、例４のキメラ配列（No.
2） 3.PNOSプロモーター、neo遺伝子及びOCS遺伝子の３′末
端を含む、例４のキメラ配列（No.4）； 4.フレーム内で以下のものと融合された、例３のPSTMG
のうちの１つを含むキメラ配列： ａ）大腸菌からの、２本鎖DNA上で標的配列GAATTCを
認識し切断することができるEcoR I制限エンドヌクレア
ーゼをコードする遺伝子〔Green他（1981年）J.Biol.Ch
em.256.2143−2153;Botterman及びZabeau（1985年）Gen
e 37.229−239〕：例３で記述されているような部位指
向性突然変異誘発を用いて、Green他（1981年）に従っ
た遺伝子のDNA配列に以下の変更を行う： i.ATG開始コドンのヌクレオチドをATGCAで置換し、
開始コドンでNsi I部位を作り出し、以下のヌクレオチ
ド配列を生み出す:ATGCA、TCT、AAT...;及び、 ii.pEcoR12にクローニングされたEcoR I遺伝子のHi
nd II−Hind IIIフラグメント（Botterman及びZabeau、
1985年）を、pMAC5−８部位指向性突然変異誘発ベクタ
ーにクローニングする；及び ｂ）例４のNOS遺伝子の３′末端；及び 5.微生物内のEcoR I遺伝子の潜在的な微量の発現を克服
するため、大腸菌又はAgrobacteriumのEcoR Iの活性を
阻害することのできる、その天然のプロモーターの制御
下にある、EcoR Iメチラーゼをコードする遺伝子〔Bott
erman及びZabeau、1985年〕。
各pMG104は、Ｔ−DNAボーダー配列内に３つのキメラ
配列、すなわち、第２のプロモーターとしてそれぞれPS
SU及びPNOSの制御下にある標識DNAであるPSSU−sfr及び
PNOS−neo、及び第１のプロモーターとしてPSTMGの制御
下にある雌性不稔DNAであるPSTMG−EcoR Iエンドヌクレ
アーゼ遺伝子を含む、２元タイプのＴ−DNAベクターで
ある。花柱及び／又は柱頭細胞内で選択的にPSTMGプロ
モーターの制御下で雌性不稔DNAを発現させると、花柱
及び／又は柱頭細胞内でGAATTC部位において２本鎖DNA
を切断するEcoR I制限エンドヌクレアーゼが生成される
ことになり〔タイプIIの制限変更システムの総説につい
てはWilson（1988年）TIG ４（111,314−318）を参照の
こと〕、かくして、これらの細胞を死に導く。
配列、すなわち、第２のプロモーターとしてそれぞれPS
SU及びPNOSの制御下にある標識DNAであるPSSU−sfr及び
PNOS−neo、及び第１のプロモーターとしてPSTMGの制御
下にある雌性不稔DNAであるPSTMG−EcoR Iエンドヌクレ
アーゼ遺伝子を含む、２元タイプのＴ−DNAベクターで
ある。花柱及び／又は柱頭細胞内で選択的にPSTMGプロ
モーターの制御下で雌性不稔DNAを発現させると、花柱
及び／又は柱頭細胞内でGAATTC部位において２本鎖DNA
を切断するEcoR I制限エンドヌクレアーゼが生成される
ことになり〔タイプIIの制限変更システムの総説につい
てはWilson（1988年）TIG ４（111,314−318）を参照の
こと〕、かくして、これらの細胞を死に導く。
「pMG105」と呼ばれるプラスミドも同様に、各々例３
のPSTMGのうちの異なる１つと以下の周知のフラグメン
トを組立てることによって構築される； 1.pGSC1701A2から誘導された、Ｔ−DNAボーダー配列を
含むベクターフラグメント；なおこのボーダー配列の間
には以下のDNAフラグメント２〜５が位置づけされてい
る； 2.PSSUプロモーター、除草剤抵抗性遺伝子sfr及びＴ−D
NA遺伝子７の３′末端を含む、例４のキメラ配列（No.
2）、 3.PNOSプロモーター、neo遺伝子及びOCS遺伝子のneo3′
末端を含む、例４のキメラ配列（No.3）； 4.フレーム内で以下のものと融合された、例３のPSTMG
の１つを含むキメラ配列； ａ）pSOD1らのHpa I−Hind IIIのNco I−Pst Iフラグ
メントであるMn−スーパーオキシドジスムターゼ（「Mn
−SOD」）のトランジットペプチドをコードする遺伝子
フラグメント〔Bowler他（1989年）EMBO.J.８,31−3
8〕；なお、例３に記述されているような部位指向性突
然変異誘発を用いて、Bowler他（1989年）に従い遺伝子
フラグメントのDNA配列に以下の変更を加える： i.ATG開始コドンの上流の位置−２及び−１にあるA
Aヌクレオチドを、開始コドンでNco I部位を作り出し次
のヌクレオチド配列を生み出すCCヌクレオチドに変え
る： −CCATGGCACTAC Nco I ii.トランジットペプチドのプロセッシング部位の
すぐ下流にあるT,TCG,CTCヌクレオチドを、プロセッシ
ング部位の後ろにPst I部位を作り出し以下のヌクレオ
チド配列を生み出すべくC,TGC,AGCに変える： なおここで、矢印はトランジットペプチドのプロセッシ
ング部位を示し、上部ラインはMn−SODコード配列に対
応するアミノ酸配列を示す;Nco I−Pst Iフラグメント
も同様にフレーム内で、pMG104に見られるように２本鎖
DNA上で標識配列GAATTCを認識し切断することができる
大腸菌からのEcoR I制限エンドヌクレアーゼをコードす
る遺伝子と融合させる〔Greene他（1981年）J.Biol.Che
m.256.2143−2153;Botterman及びZabeau（1985年）Gene
37,229−239〕；及び ｂ）例４のNOS遺伝子の３′末端；及び 5.ボーダー配列の外側のベクターフラグメント内に挿入
されており、微生物内のEcoR I遺伝子の微量の発現を克
服するため、大腸菌又はAgrobacterium内のEcoR I活性
を抑制することのできる、その天然のプロモーターの制
御下にあるEcoR Iメチラーゼをコードする遺伝子。
のPSTMGのうちの異なる１つと以下の周知のフラグメン
トを組立てることによって構築される； 1.pGSC1701A2から誘導された、Ｔ−DNAボーダー配列を
含むベクターフラグメント；なおこのボーダー配列の間
には以下のDNAフラグメント２〜５が位置づけされてい
る； 2.PSSUプロモーター、除草剤抵抗性遺伝子sfr及びＴ−D
NA遺伝子７の３′末端を含む、例４のキメラ配列（No.
2）、 3.PNOSプロモーター、neo遺伝子及びOCS遺伝子のneo3′
末端を含む、例４のキメラ配列（No.3）； 4.フレーム内で以下のものと融合された、例３のPSTMG
の１つを含むキメラ配列； ａ）pSOD1らのHpa I−Hind IIIのNco I−Pst Iフラグ
メントであるMn−スーパーオキシドジスムターゼ（「Mn
−SOD」）のトランジットペプチドをコードする遺伝子
フラグメント〔Bowler他（1989年）EMBO.J.８,31−3
8〕；なお、例３に記述されているような部位指向性突
然変異誘発を用いて、Bowler他（1989年）に従い遺伝子
フラグメントのDNA配列に以下の変更を加える： i.ATG開始コドンの上流の位置−２及び−１にあるA
Aヌクレオチドを、開始コドンでNco I部位を作り出し次
のヌクレオチド配列を生み出すCCヌクレオチドに変え
る： −CCATGGCACTAC Nco I ii.トランジットペプチドのプロセッシング部位の
すぐ下流にあるT,TCG,CTCヌクレオチドを、プロセッシ
ング部位の後ろにPst I部位を作り出し以下のヌクレオ
チド配列を生み出すべくC,TGC,AGCに変える： なおここで、矢印はトランジットペプチドのプロセッシ
ング部位を示し、上部ラインはMn−SODコード配列に対
応するアミノ酸配列を示す;Nco I−Pst Iフラグメント
も同様にフレーム内で、pMG104に見られるように２本鎖
DNA上で標識配列GAATTCを認識し切断することができる
大腸菌からのEcoR I制限エンドヌクレアーゼをコードす
る遺伝子と融合させる〔Greene他（1981年）J.Biol.Che
m.256.2143−2153;Botterman及びZabeau（1985年）Gene
37,229−239〕；及び ｂ）例４のNOS遺伝子の３′末端；及び 5.ボーダー配列の外側のベクターフラグメント内に挿入
されており、微生物内のEcoR I遺伝子の微量の発現を克
服するため、大腸菌又はAgrobacterium内のEcoR I活性
を抑制することのできる、その天然のプロモーターの制
御下にあるEcoR Iメチラーゼをコードする遺伝子。
各々のpMG105は、ボーダー配列内に３つのキメラ配
列、すなわち、第２のプロモーターとしてそれぞれPSSU
及びPNOSの制御下にある標識DNAであるPSSU−sfr及びPN
OS−NPT II、ならびに第１のプロモーターとしてPSTMG
を有しそれとの間にトランジットペプチドをコードする
配列を有する雌性不稔DNAであるPSTMG−トランジットペ
プチド−EcoR Iエンドヌクレアーゼ遺伝子、を含む２元
タイプのＴ−DNAベクターである。PSTMGプロモーターの
制御下にある雌性不稔DNAを花柱及び／又は柱頭細胞内
で選択的に発現させると、制限エンドヌクレアーゼが生
産され、この制限エンドヌクレアーゼは花柱及び／又は
柱頭細胞のミトコンドリア内にターゲティングされ、こ
のような細胞でGAATTC部位で２本鎖DNAを切断すること
になる。こうしてこれらの細胞は死に導かれる。
列、すなわち、第２のプロモーターとしてそれぞれPSSU
及びPNOSの制御下にある標識DNAであるPSSU−sfr及びPN
OS−NPT II、ならびに第１のプロモーターとしてPSTMG
を有しそれとの間にトランジットペプチドをコードする
配列を有する雌性不稔DNAであるPSTMG−トランジットペ
プチド−EcoR Iエンドヌクレアーゼ遺伝子、を含む２元
タイプのＴ−DNAベクターである。PSTMGプロモーターの
制御下にある雌性不稔DNAを花柱及び／又は柱頭細胞内
で選択的に発現させると、制限エンドヌクレアーゼが生
産され、この制限エンドヌクレアーゼは花柱及び／又は
柱頭細胞のミトコンドリア内にターゲティングされ、こ
のような細胞でGAATTC部位で２本鎖DNAを切断すること
になる。こうしてこれらの細胞は死に導かれる。
例11−タバコ及びアルファルファへの例10の各キメラDN
Aの導入 例５に記述されているように、各々のpMG104及びpMG1
05（例10からの）は、大腸菌から、pMP90を運ぶ別のAgr
obacteria C58C1RifR内へ可動化（授動）される。pMP90
を伴うpMG104及びpMP90を伴うpMG105を宿す、結果とし
て得られた菌株は、例５に記述されている手順に従って
タバコ及びアルファルファを形質転換するのに用いられ
る。EcoR Iエンドヌクレアーゼ遺伝子が形質転換された
除草剤及びカナマイシン抵抗性のカルス、苗条及び根内
で発現されていないことは、その生長によって示され
る。
Aの導入 例５に記述されているように、各々のpMG104及びpMG1
05（例10からの）は、大腸菌から、pMP90を運ぶ別のAgr
obacteria C58C1RifR内へ可動化（授動）される。pMP90
を伴うpMG104及びpMP90を伴うpMG105を宿す、結果とし
て得られた菌株は、例５に記述されている手順に従って
タバコ及びアルファルファを形質転換するのに用いられ
る。EcoR Iエンドヌクレアーゼ遺伝子が形質転換された
除草剤及びカナマイシン抵抗性のカルス、苗条及び根内
で発現されていないことは、その生長によって示され
る。
形質転換された植物は、温室内に移され、開花するま
で土壌中にて栽培される。タバコとアルファルファの両
方の花を検査すると、例５で記述されている形質転換植
物において観察されたものと同じ遺伝子型が、形質転換
植物について観察される〔すなわち正常な花柱−柱頭形
成なし）。形質転換植物は、雌性不稔である。
で土壌中にて栽培される。タバコとアルファルファの両
方の花を検査すると、例５で記述されている形質転換植
物において観察されたものと同じ遺伝子型が、形質転換
植物について観察される〔すなわち正常な花柱−柱頭形
成なし）。形質転換植物は、雌性不稔である。
言うまでもないことではあるが、本発明は何らかの特
定の植物の形質転換に制限されるわけではない。本発明
は、植物の花、特にその雌器、又は種子又は胚芽の細胞
内における雌性不稔DNAの選択的な発現を誘導すること
のできる第１のプロモーターの制御下にある雌性不稔DN
Aで形質転換されうる核ゲノムを有し、かくして自家受
粉と他家受粉の両方が可能であるあらゆる植物に関す
る。
定の植物の形質転換に制限されるわけではない。本発明
は、植物の花、特にその雌器、又は種子又は胚芽の細胞
内における雌性不稔DNAの選択的な発現を誘導すること
のできる第１のプロモーターの制御下にある雌性不稔DN
Aで形質転換されうる核ゲノムを有し、かくして自家受
粉と他家受粉の両方が可能であるあらゆる植物に関す
る。
同様に、本発明は、上述の各例に記述されている特異
的プラスミド及びベクターに制限されるものではなく、
むしろ第１のプロモーターの制御下にある雌性不稔DNA
を含む全てのプラスミド及びベクターを包含する。
的プラスミド及びベクターに制限されるものではなく、
むしろ第１のプロモーターの制御下にある雌性不稔DNA
を含む全てのプラスミド及びベクターを包含する。
さらに、本発明は、上述の各例の中に記述されている
特定のPSTMGプロモーターに制限されず、むしろ植物の
花、特にその単数又は複数の雌器、及び／又は種子及び
／又は胚芽の細胞内での雌性不稔DNAの選択的な発現を
誘導することのできるプロモーターをコードする全ての
DNA配列を包含する。
特定のPSTMGプロモーターに制限されず、むしろ植物の
花、特にその単数又は複数の雌器、及び／又は種子及び
／又は胚芽の細胞内での雌性不稔DNAの選択的な発現を
誘導することのできるプロモーターをコードする全ての
DNA配列を包含する。
さらに、本発明は、上述の各例に記述されている特定
の雌性不稔DNAに限られるわけではなく、むしろ、第１
のプロモーターの制御下で、それを産生する植物の花、
種子又は胚芽の細胞の代謝、機能及び／又は発生を不利
な方向に有意に妨害するような第１のタンパク質又はポ
リペプチドをコードする全てのDNA配列を内含する。
の雌性不稔DNAに限られるわけではなく、むしろ、第１
のプロモーターの制御下で、それを産生する植物の花、
種子又は胚芽の細胞の代謝、機能及び／又は発生を不利
な方向に有意に妨害するような第１のタンパク質又はポ
リペプチドをコードする全てのDNA配列を内含する。
同様に、本発明は、上述の各例の中に記述されている
特定の標識DNAに限られるわけではなく、むしろ、それ
が発現されている少なくとも特定の植物組織又は特定の
植物細胞に対して、それが発現されていないような特定
の植物組織又は特定の植物細胞に比べて全く異なる特徴
を付与するような、第２のDNA、タンパク質又はポリペ
プチドをコードするあらゆるDNA配列を包含する。
特定の標識DNAに限られるわけではなく、むしろ、それ
が発現されている少なくとも特定の植物組織又は特定の
植物細胞に対して、それが発現されていないような特定
の植物組織又は特定の植物細胞に比べて全く異なる特徴
を付与するような、第２のDNA、タンパク質又はポリペ
プチドをコードするあらゆるDNA配列を包含する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 デ・オリヴェイラ・デュルセ・エレオノ ラ ブラジル国、ビーアール―リオ・デ・ジ ャネイロ、20470 ラゴア、アベニ・リ ネウ・デ・パウラ・マカド 905／507 (72)発明者 ドゥ・スザ，マリア―ヘレナ ベルギー国、ビー―9000 ゲント、ホル ダール 31 (72)発明者 ファン・モンターグ，マルク ベルギー国、ビー―1050 ブリュッセ ル、ドゥ・シュタザールトシュトラート 120 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) A01H 5/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)
Claims (64)
- 【請求項１】細胞の核ゲノム内に外来性DNAが組み込ま
れているAgrobacteriumにより形質転換し得る植物であ
って、該外来性DNAが、 （ａ）該植物の雌性繁殖器官の細胞内で発現された場
合、該細胞を殺すか又は損傷して、該植物による稔性の
雌性配偶子及び／又は生存種子の産生を防止することが
できる雌性不稔DNA、及び （ｂ）該植物の雌性繁殖器官の花柱細胞、柱頭細胞、子
房細胞、胚珠細胞及び／又は隔壁細胞内で選択的に遺伝
子発現を指令することができる第１のプロモーターを含
み、 そして該雌性不稔DNAが、該第１のプロモーターと同じ
転写単位内にあってかつその制御下にある植物。 - 【請求項２】前記第１のプロモーターが、特に花柱細胞
及び／又は柱頭細胞内において前記雌性不稔DNAの発現
を指令することができる、請求項１に記載の植物。 - 【請求項３】前記第１のプロモーターが、PSTMG07、PST
MG08、PSTMG4B12、及びPSTMG3C9からなる群より選択さ
れる、請求項１又は２に記載の植物。 - 【請求項４】前記雌性不稔DNAが、植物の雌性繁殖器官
の細胞内で産生される場合に、該細胞を殺すか損傷し
て、該植物による稔性の雌性配偶子及び／又は生存種子
の産生を防止することができる第１のタンパク質又はポ
リペプチドをコードする、請求項１〜３のいずれか１項
に記載の植物。 - 【請求項５】前記雌性不稔DNAが、Rnase T1又はバルナ
ーゼのようなRNA分解酵素;Eco R IのようなDNA分解酵
素；パパインチモーゲンもしくはパパイン活性タンパク
質のようなプロテアーゼ；グルカナーゼ；ホスホリパー
ゼA2のようなリパーゼ；脂質ペルオキシダーゼ；細胞壁
阻害剤；又は細菌性毒素をコードするDNAである、請求
項４に記載の植物。 - 【請求項６】前記雌性不稔DNAが、Agrobacterium T−DN
Aの遺伝子４によってコードされる酵素、あるいはAgrob
acterium T−DNAの遺伝子１及び／又は遺伝子２によっ
てコードされる酵素のような植物ホルモンの合成を触媒
する酵素をコードする、請求項４に記載の植物。 - 【請求項７】前記雌性不稔DNAが、リボヌクレアーゼを
コードする、請求項４に記載の植物。 - 【請求項８】前記雌性不稔DNAが、バルナーゼをコード
する、請求項４に記載の植物。 - 【請求項９】前記外来性DNAが、 前記第１のタンパク質もしくはポリペプチドを、前記雌
性繁殖器官の細胞の葉緑体もしくはミトコンドリアの中
に移送することができるトランジットペプチドをコード
する第１のDNAであって、前記雌性不稔DNA及び前記第１
のプロモーターと同じ転写単位内にあり、かつ該雌性不
稔DNAと該第１のプロモーターとの間にある第１のDNA;
あるいは 前記第１のタンパク質もしくはポリペプチドを、前記植
物の雌性繁殖器官の細胞の外に分泌することができる分
泌シグナルペプチドをコードする第２のDNAであって、
該雌性不稔DNAと該第１のプロモーターと同じ転写単位
内にあり、かつ該雌性不稔DNA及び該第１のプロモータ
ーとの間に位置する第２のDNAをさらに含む、 請求項４〜８のいずれか１項に記載の植物。 - 【請求項１０】前記外来性DNAが、 （ｃ）マーカーRNA、又はマーカータンパク質もしくは
マーカーポリペプチド（それらは、該植物の少なくとも
特定の組織もしくは少なくとも特定の細胞に存在する場
合に、該特定の組織もしくは特定の細胞内に該マーカー
RNA又はマーカータンパク質もしくはマーカーポリペプ
チドを含まない他の植物から該植物を容易に分離するこ
とができるようにする）をコードするマーカーDNA;及
び； （ｄ）少なくとも該特定の組織もしくは特定の範囲内で
該マーカーDNAの発現を指令することができる第２のプ
ロモーターであって、該マーカーDNAが該第２のプロモ
ーターと同じ転写単位内にあり、かつその制御下にある
第２のプロモーターをさらに含む、 請求項１〜９のいずれか１項に記載の植物。 - 【請求項１１】前記マーカーDNAが；グリホセートの標
的としての改変５−エノールピルビルシキメート−３−
ホスフェートシンターゼ、ホスフィノトリシンのような
グルタミンシンターゼ阻害剤の標的としての改変グルタ
ミンシンセターゼのような除草剤に対してより低い親和
性を有する除草剤用に改変された標的酵素をコードする
遺伝子;A1遺伝子もしくはGUS遺伝子のような少なくとも
前記特定の組織もしくは特定の細胞に色を付与するタン
パク質もしくはポリペプチドをコードする遺伝子;Mn−
スーパーオキシドジスムターゼをコードする遺伝子のよ
うな前記植物にストレス許容性を付与するタンパク質も
しくはポリペプチドをコードする遺伝子；あるいは、虫
害抵抗性を付与するBacillus thuringiensis内毒素をコ
ードする遺伝子、又は細菌抵抗性を付与する殺菌ペプチ
ドをコードする遺伝子のような、疾病もしくは害虫抵抗
性を付与するタンパク質もしくはポリペプチドをコード
する遺伝子である、請求項10に記載の植物。 - 【請求項１２】前記マーカーDNAが、ホスフィノトリシ
ンのようなグルタミンシンセターゼ阻害剤に対する抵抗
性を付与する遺伝子のような除草剤抵抗性遺伝子であ
る、請求項10に記載の植物。 - 【請求項１３】前記マーカーDNAが、sfrもしくはsfrv遺
伝子である、請求項12に記載の植物。 - 【請求項１４】前記第２のプロモーターが;35Sプロモー
ター、35S′３−プロモーター、PNOSプロモーターもし
くはPOCSプロモーターのような構造的プロモーター;TR
1′もしくはTR2′プロモーターのような創傷誘導性プロ
モーター;SSUプロモーターのような光合成活性を有する
植物組織内で選択的に遺伝子発現を指令するプロモータ
ー；又は葉細胞、花弁細胞、もしくは種皮細胞等の種子
細胞において選択的に遺伝子発現を指令するプロモータ
ーである、請求項10〜13のいずれか１項に記載の植物。 - 【請求項１５】前記外来性DNAが、 前記マーカータンパク質もしくはポリペプチドを、少な
くとも前記特定の組織もしくは特定の細胞の葉緑体もし
くはミトコンドリアに移入することができるトランジッ
トペプチドをコードする第３のDNAであって、前記マー
カーDNA及び前記第２のプロモーターと同じ転写単位内
にあり、かつ該マーカーDNAと該第２のプロモーターと
の間にある第３のDNA;あるいは、該マーカータンパク質
もしくはポリペプチドを少なくとも該特定の組織もしく
は特定の細胞の外に分泌することができる分泌シグナル
ペプチドをコードする第４のDNAであって、該マーカーD
NA及び該第２のプロモーターと同じ転写単位内にあり、
かつ該マーカーDNAと該第２のプロモーターとの間に位
置する第４のDNAをさらに含む、請求項10〜14のいずれ
か１項に記載の植物。 - 【請求項１６】前記外来性DNAが、pMG100、pMG101、pMG
102、pMG103、pMG104及びpMG105からなる群より選択さ
れるベクターのＴ−DNAである、請求項１に記載の植
物。 - 【請求項１７】ジャガイモ、トマト、アルファルファ、
タバコ及びテンサイからなる群より選択される、請求項
１〜16のいずれか１項に記載の植物。 - 【請求項１８】請求項１〜17のいずれか１項に記載の植
物の種なし果実であって、前記外来性DNAを含む種なし
果実。 - 【請求項１９】ハイブリッド植物である、請求項１〜17
のいずれか１項に記載の植物。 - 【請求項２０】請求項１〜17のいずれか１項に記載の植
物の植物細胞を含む植物細胞培養物。 - 【請求項２１】（ａ）植物の雌性繁殖器官の細胞内で発
現された場合、該細胞を殺すか又は損傷して、該植物に
よる稔性の雌性配偶子及び／又は生存種子の産生を防止
することができる雌性不稔DNA;及び （ｂ）該植物の雌性繁殖器官の花柱細胞、柱頭細胞、子
房細胞、胚珠細胞及び／又は隔壁細胞内で選択的に遺伝
子発現を指令することができる第１のプロモーター を含む第１のキメラDNAを含むDNAであって、そして該雌
性不稔DNAが、該第１のプロモーターと同じ転写単位内
にあり、かつその制御下にあるDNAを含む組換えDNAカセ
ット。 - 【請求項２２】前記第１のプロモーターが、特に花柱細
胞及び／又は柱頭細胞内において前記雌性不稔DNAの発
現を指令することができる、請求項21に記載の組換えDN
Aカセット。 - 【請求項２３】前記第１のプロモーターが、PSTMG07、P
STMG08、PSTMG4B12及びPSTMG3C9からなる群より選択さ
れる、請求項21又は22に記載の組換えDNAカセット。 - 【請求項２４】前記雌性不稔DNAが、植物の雌性繁殖器
官の細胞内で産生された場合に、該細胞を殺すか損傷し
て、該植物による稔性の雌性配偶子及び／又は生存種子
の産生を防止することができる第１のタンパク質もしく
はポリペプチドをコードする、請求項21〜23のいずれか
１項に記載の組換えDNAカセット。 - 【請求項２５】前記雌性不稔DNAが、RNase T1のような
リボヌクレアーゼをコードする、請求項24に記載の組換
えDNAカセット。 - 【請求項２６】前記雌性不稔DNAが、バルナーゼをコー
ドする、請求項24に記載の組換えDNAカセット。 - 【請求項２７】前記雌性不稔DNAが、RNase T1もしくは
バルナーゼのようなRNA分解酵素;Eco R IのようなDNA
分解酵素；パパインチモーゲンもしくはパパイン活性タ
ンパク質のようなプロテアーゼ；グルカナーゼ；ホスホ
リパーゼA2のようなリパーゼ；脂質ペルオキシダーゼ；
細胞壁阻害剤；又は細菌性毒素をコードする、請求項24
に記載の組換えDNAカセット。 - 【請求項２８】前記雌性不稔DNAが、Agrobacterium T−
DNAの遺伝子４によってコードされる酵素、あるいはAgr
obacterium T−DNAの遺伝子１及び／又は遺伝子２によ
ってコードされる酵素のような植物ホルモンの合成を触
媒する酵素をコードする、請求項24に記載の組換えDNA
カセット。 - 【請求項２９】前記外来性DNAが、前記第１のタンパク
質もしくはポリペプチドを、前記雌性繁殖器官の細胞の
葉緑体もしくはミトコンドリアに移送することができる
トランジットペプチドをコードする第１のDNAであっ
て、前記雌性不稔DNA及び前記第１のプロモーターと同
じ転写単位内にあり、かつ該雌性不稔DNAと該第１のプ
ロモーターとの間にある第１のDNAをさらに含む、請求
項24〜28のいずれか１項に記載の組換えDNAカセット。 - 【請求項３０】前記外来性DNAが、前記第１のタンパク
質もしくはポリペプチドを、植物の雌性繁殖器官の細胞
の外に分泌することができる分泌シグナルペプチドをコ
ードする第２のDNAであって、該雌性不稔DNAと該第１の
プロモーターと同じ転写単位内にあり、かつ該雌性不稔
DNAと該第１のプロモーターとの間に位置する第２のDNA
をさらに含む、請求項24〜28のいずれか１項に記載の組
換えDNAカセット。 - 【請求項３１】（ｃ）マーカーRNA、又はマーカータン
パク質もしくはマーカーポリペプチド（それらは、植物
の少なくとも特定の組織もしくは少なくとも特定の細胞
内に存在する場合に、該特定の組織もしくは特定の細胞
内に該マーカーRNA、又はマーカータンパク質もしくは
マーカーポリペプチドを含まない他の植物から該植物を
容易に分離することができる）をコードするマーカーDN
A;及び （ｄ）少なくとも該特定の組織もしくは特定の細胞内で
該マーカーDNAの発現を指令することができる第２のプ
ロモーター を含む第２のキメラDNAも含む組換えDNAカセットであっ
て、該マーカーDNAが該第２のプロモーターと同じ転写
単位内にあり、かつその制御下にある、請求項21〜30の
いずれか１項に記載の組換えDNAカセット。 - 【請求項３２】前記マーカーDNAが、除草剤の作用を阻
害するかもしくは中和するタンパク質をコードする、請
求項31に記載の組換えDNAカセット。 - 【請求項３３】前記マーカーDNAが、ホスフィノトリシ
ンのようなグルタミンシンセターゼ阻害剤に対する抵抗
性を付与する遺伝子のような除草剤抵抗性遺伝子であ
る、請求項32に記載の組換えDNAカセット。 - 【請求項３４】前記マーカーDNAが、sfr又はsfrv遺伝子
である、請求項33に記載の組換えDNAカセット。 - 【請求項３５】前記マーカーDNAが、グリホセートの標
的としての改変５−エノールピルビルシキメート−３−
ホスフェートシンターゼ、ホスフィノトリシンのような
グルタミンシンセターゼ阻害剤の標的としての改変グル
タミンシンターゼのような除草剤に対してより低い親和
性を有する除草剤用に改変された標的酵素をコードする
遺伝子である、請求項32に記載の組換えDNAカセット。 - 【請求項３６】前記マーカーDNAが、A1遺伝子もしくはG
US遺伝子のような少なくとも前記特定の組織もしくは特
定の細胞に色を付与するタンパク質もしくはポリペプチ
ドをコードする遺伝子;Mn−スーパーオキシドジスムタ
ーゼをコードする遺伝子のような前記植物にストレス許
容性を付与するタンパク質もしくはポリペプチドをコー
ドする遺伝子；あるいは虫害抵抗性を付与するBacillus
thuringiensis内毒素をコードする遺伝子、又は細菌抵
抗性を付与する殺菌ペプチドをコードする遺伝子のよう
な、疾病もしくは害虫抵抗性を付与するタンパク質もし
くはポリペプチドをコードする遺伝子である、請求項31
に記載の組換えDNAカセット。 - 【請求項３７】前記第２のプロモーターが;PNOSプロモ
ーターもしくはPOCSプロモーターのような構造的プロモ
ーター;TR1′もしくはTR2′プロモーターのような創傷
誘導性プロモーター；光合成活性を有する植物組織内で
選択的に遺伝子発現を指令するプロモーター；又は葉細
胞、花弁細胞、もしくは種皮細胞等の種子細胞において
選択的に遺伝子発現を指令するプロモーターである、請
求項31〜36のいずれか１項に記載の組換えDNAカセッ
ト。 - 【請求項３８】前記第２のプロモーターが、35Sプロモ
ーターもしくはSSUプロモーターである、請求項37に記
載の組換えDNAカセット。 - 【請求項３９】前記外来性DNAが、前記マーカータンパ
ク質もしくはポリペプチドを、少なくとも前記特定の組
織もしくは特定の細胞の葉緑体もしくはミトコンドリア
に移入することができるトランジットペプチドをコード
する第３のDNAであり、かつ前記マーカーDNA及び前記第
２のプロモーターと同じ転写単位内にあり、かつ該マー
カーDNAと該第２のプロモーターとの間にある第３のDNA
をさらに含む、請求項31〜38のいずれか１項に記載の組
換えDNAカセット。 - 【請求項４０】前記外来性DNAが、前記マーカータンパ
ク質もしくはポリペプチドを少なくとも特定の組織もし
くは特定の細胞の外に分泌することができる分泌シグナ
ルペプチドをコードする第４のDNAであって、該マーカ
ーDNA及び該第２のプロモーターと同じ転写単位内にあ
り、かつ該マーカーDNAと該第２のプロモーターとの間
に位置する第４のDNAをさらに含む、請求項31〜38のい
ずれか１項に記載の組換えDNAカセット。 - 【請求項４１】pMG100、pMG101、pMG102、pMG103、pMG1
04及びpMG105からなる群より選択されるベクターのＴ−
DNAを含む組換えDNAカセット。 - 【請求項４２】植物又は種子の細胞の核DNAである、請
求項21〜41のいずれか１項に記載の組換えDNAカセッ
ト。 - 【請求項４３】請求項21〜41のいずれか１項に記載の組
換えDNAカセットを含むベクター。 - 【請求項４４】請求項21〜42のいずれか１項に記載の組
換えDNAカセットを含む、Agrobacteriumにより形質転換
し得る植物の細胞。 - 【請求項４５】請求項21〜41のいずれか１項に記載の組
換えDNAカセットが、その核DNAに安定に組み込まれてい
る、Agrobacteriumにより形質転換し得る植物の細胞。 - 【請求項４６】雌性不稔であるAgrobacteriumにより形
質転換し得る植物に再生され得る、請求項44又は45に記
載の細胞。 - 【請求項４７】請求項21〜42のいずれか１項に記載の組
換えDNAカセットを含むAgrobacteriumにより形質転換し
得る植物。 - 【請求項４８】請求項21〜42のいずれか１項に記載の組
換えDNAカセットをそのすべての細胞に含むAgrobacteri
umにより形質転換し得る植物。 - 【請求項４９】雌性不稔である、請求項47又は48に記載
の植物。 - 【請求項５０】ハイブリッド植物である、請求項47〜49
のいずれか１項に記載の植物。 - 【請求項５１】請求項21〜42のいずれか１項に記載の組
換えDNAカセットを含むAgrobacteriumにより形質転換し
得る植物の種子。 - 【請求項５２】請求項21〜42のいずれか１項に記載の組
換えDNAカセットを含むAgrobacteriumにより形質転換し
得る植物の種なし果実。 - 【請求項５３】Agrobacteriumにより形質転換し得る雌
性不稔植物及び該植物の種子もしくは栄養繁殖物質を生
産する方法であって、 ａ）請求項21〜41のいずれか１項に記載の組換えDNAカ
セットを植物細胞の核ゲノムに導入して形質転換した植
物細胞を得る工程；及び ｂ）該形質転換した植物細胞からAgrobacteriumにより
形質転換し得る該雌性不稔植物を再生させる工程 を包含する方法。 - 【請求項５４】前記組換えDNAカセットを含む前記雌性
不稔植物から前記種子もしくは栄養繁殖物質を得る工程
をさらに包含する、請求項53に記載の方法。 - 【請求項５５】ハイブリッド種子のような種子を生産す
る方法であって、 ａ）請求項21〜41のいずれか１項に記載の組換えDNAカ
セットがその全ての細胞の核DNAに組み込まれており、
かつ雌性不稔であるAgrobacteriumにより形質転換し得
る植物を提供する工程； ｂ）ｉ）該雌性不稔植物とii）雌性稔性植物とを他家受
粉させる工程、及び ｃ）該種子を該雌性稔性植物から回収する工程、 を包含する方法。 - 【請求項５６】以下の工程： ａ）前記第２のプロモーター及び前記マーカーDNAの両
方を含む請求項31〜41のいずれか１項に記載の組換えDN
Aカセットがその全ての細胞の核DNAに組み込まれてお
り、かつ雌性不稔である植物を提供する工程； ｂ）ｉ）該雌性不稔植物とii）該マーカーDNA及び／又
は該第２のプロモーターを持たない雌性稔性植物とを他
家受粉させる工程、及び ｃ）該種子を該雌性稔性植物から回収する工程、 を包含する、請求項55に記載の方法。 - 【請求項５７】以下の工程： ａ）請求項31〜41のいずれか１項に記載の組換えDNAカ
セットがその全ての細胞の核DNAに組み込まれており、
かつ雌性不稔である植物であって、さらに前記マーカー
DNAが、sfr又はsfrv遺伝子のようなグルタミンシンセタ
ーゼ阻害剤に対する抵抗性を与える遺伝子のような除草
剤抵抗性遺伝子、又はグリホセートの標的としての改変
５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシ
ンターゼ、もしくはホスフィノトリシンのようなグルタ
ミンシンセターゼ阻害剤の標的としての改変グルタミン
シンターゼのような除草剤に対してより低い親和性を有
する除草剤用に改変された標的酵素をコードする遺伝子
である、植物を提供する工程； ｂ）ｉ）該雌性不稔植物とii）前記マーカーDNA及び／
又は前記第２のプロモーターを持たない雌性稔性植物と
を他家受粉させる工程、及び ｃ）該種子を該雌性稔性植物から回収する工程、 を包含する、請求項56に記載の方法。 - 【請求項５８】前記種子がハイブリッド種子である、請
求項55〜57のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項５９】前記雌性不稔植物が、前記除草剤耐性遺
伝子に加えて、少なくとももう１つのマーカーDNAを該
雌性不稔DNAと同じ遺伝子座でその細胞の核ゲノムに安
定に組み込んでおり、そして前記雌性稔性植物が該もう
１つのマーカーDNAを含まない、請求項57又は58に記載
の方法。 - 【請求項６０】前記雌性稔性植物が雄性不稔である、請
求項55〜59のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項６１】種子を生産するための１組の親植物であ
って;a）その全ての細胞の核DNAに組み込まれた請求項2
1〜41のいずれか１項に記載の組換えDNAカセットを含む
Agrobacteriumにより形質転換し得る雌性不稔親植物、
及びｂ）雌性稔性親植物を含む親植物対。 - 【請求項６２】前記雌性不稔親植物及び前記雌性稔性親
植物が異なる系統に属する、請求項61に記載の親植物
対。 - 【請求項６３】前記雌性不稔親植物及び前記雌性稔性親
植物が同じ近交系統から誘導される、請求項61に記載の
親植物対。 - 【請求項６４】前記雌性稔性親植物が雄性不稔である、
請求項61〜63のいずれか１項に記載の親植物対。
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