ES2243937T3 - Poxvirus recombinados en regiones esenciales con la ayuda de polinucleotidos extraños. - Google Patents
Poxvirus recombinados en regiones esenciales con la ayuda de polinucleotidos extraños.Info
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Abstract
LOS POXVIRUS DEFECTIVOS QUE CARECEN DE UNA FUNCION IMPARTIDA POR UNA REGION ESENCIAL DE UN POXVIRUS PARENTAL, PUEDEN SER EMPLEADAS PARA PRODUCCION DE PROTEINAS Y VACUNACION, ENTRE OTROS USOS. UN POLINUCLEOTIDO QUE CODIFICA LA PROTEINA QUE SERA PRODUCIDA POR EL VIRUS RECOMBINANTE, SE INSERTA EN EL POXVIRUS DEFECTIVO, Y SE SITUA BAJO EL CONTROL TRANSCRIPCIONAL DE UN PROMOTOR. EL VIRUS DEFECTIVO ES VIABLE CUANDO LA FUNCION PERDIDA LA REGION ESENCIAL ES COMPLEMENTADA POR UNA CELULA HUESPED, UN ANIMAL TRANSGENICO, O UN VIRUS AUXILIAR.
Description
Poxvirus recombinados en regiones esenciales con
la ayuda de polinucleótidos extraños.
Los poxvirus recombinantes han sido utilizados
como vectores para la expresión de genes foráneos procedentes de una
variedad de fuentes, tales como animales, plantas, protozoos,
hongos, bacterias y virus. Adicionalmente, los poxvirus
recombinantes pueden ser utilizados para expresar genes quiméricos y
genes de origen sintético. Típicamente, los genes quiméricos y los
genes sintéticos son secuencias de ADN que derivan de, o están
basadas en, secuencias que existen en la naturaleza. Por ejemplo,
secuencias de ADNc generadas a partir de transcritos de ARN,
incluyendo los de retrovirus, pueden ser expresadas con vectores
poxvirus recombinantes.
Los vectores poxvirus que se utilizan actualmente
contienen ADN foráneo insertado en regiones genómicas que no son
esenciales para la viabilidad del virus. Estos poxvirus que expresan
genes foráneos son construidos normalmente por inserción de las
secuencias foráneas en regiones genómicas que no son esenciales para
el crecimiento del virus en cultivo celular mediante recombinación
homóloga. Ver Panicali y Paoletti, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 79:
4927-31 (1982); Mackett y col., Proc. Nat'l. Acad.
Sci. USA 79: 7415-19 (1982). Preferiblemente, los
poxvirus recombinantes pueden ser construidos mediante clonaje
molecular directo. Ver EP 0 561 034; Scheiflinger y col., Proc.
Nat'l. Acad. Sci. USA 89: 9977-81 (1992);
Merchlinsky y Moss, Virol. 190: 522-26 (1992). Los
virus con ADN foráneo insertado en regiones no esenciales pueden
crecer de manera autónoma en su organismo huésped y, de este modo,
permanecer infecciosos para sus huéspedes respectivos.
La ausencia de los productos de las regiones no
esenciales no perjudica demasiado a la viabilidad del poxvirus
recombinante. En el caso de vaccinia, considerado a menudo como el
poxvirus prototipo, una de las principales regiones no esenciales
para la inserción es el gen de la timidina quinasa. Cuando un gen
foráneo es insertado en el gen de la timidina quinasa de vaccinia,
el producto del gen se pierde para el virus. No obstante, el
vaccinia recombinante es todavía viable. Otros poxvirus son también
susceptibles de manipulaciones similares en otras regiones no
esenciales. Por ejemplo, se ha desarrollado un avipox recombinante,
tal como el poxvirus de las aves de corral, en el que se ha
insertado ADN foráneo en regiones no esenciales.
El vaccinia recombinante puede ser utilizado como
una vacuna viva, en sistemas de expresión a gran escala y para una
variedad de otros fines. Ver, Miner y Hruby, TIBTECH 8:
20-25 (1990). La utilización de estos virus
recombinantes para la expresión de proteínas a gran escala presenta,
sin embargo, riesgos significativos, ya que los virus conservan la
capacidad infectiva. Por consiguiente, se requieren precauciones
costosas y procedimientos tediosos cuando se manejan vaccinia
recombinantes. Por ejemplo, se requiere la inactivación térmica de
todos los medios, fluidos y material de laboratorio contaminado,
además de un entrenamiento especial de todo el personal que maneje
el virus. Se han considerado varios planteamientos para minimizar la
necesidad de estas elaboradas precauciones. Por ejemplo, se han
desarrollado cepas de vaccinia altamente atenuadas. Estas cepas
altamente atenuadas tienen una infectividad limitada. Por
consiguiente, se ha intentado la producción de proteínas con estas
cepas altamente atenuadas. Desgraciadamente, las cepas de virus
altamente atenuadas tienen un crecimiento lento y limitado que hace
a menudo que estas cepas sean poco adecuadas para la producción de
proteínas a gran escala.
Además de los poxvirus altamente atenuados, se
conocen cepas deterioradas de otros virus. Por ejemplo, retrovirus
deteriorados pueden ser cultivados en líneas celulares cooperadoras
que sean capaces de complementar al virus deteriorado. Ver Kriegler,
GENE TRANSFER AND EXPRESSION (Stockton Press, 1990) en
33-39; Mann y col., Cell 33: 153-59
(1983). Los retrovirus, sin embargo, son pequeños virus que
contienen ARN que se multiplican por integración en el genoma de la
célula huésped, lo que hace que estos virus no sean apropiados para
ser utilizados como vectores de expresión o como vacunas.
Adenovirus deteriorados cultivados en células
complementarias han sido utilizados como vacunas, según está
descrito por Eloit y col., J. Gen. Virol. 71:
2425-31 (1990). Los adenovirus son virus de ADN de
doble hebra que, en contraste con el virus vaccinia, se replican en
el núcleo de las células infectadas y tienen un estrecho rango de
huéspedes. Adicionalmente, se ha informado también del crecimiento
de virus herpes deteriorados en células cooperadoras. Ver las
publicaciones de PCT WO 94/03595, WO 94/21807 y WO 92/05263. El
virus herpes se replica también en el núcleo de las células
infectadas. El ADN desnudo del herpes, igual que el ADN de
adenovirus, es infeccioso. Por consiguiente, los promotores de estos
virus funcionan normalmente en la célula huésped.
En contraste con los poxvirus, los virus herpes y
los adenovirus son virus nucleares. Sin embargo, los virus
defectuosos derivados de virus nucleares tienen el potencial de
rescatar las regiones defectuosas de la célula huésped mediante
recombinación homóloga. Tales acontecimientos de recombinación son
indeseables y peligrosos ya que el virus defectuoso puede retornar
potencialmente al estado de tipo salvaje, lo cual tiene como
resultado una infectividad y una virulencia incrementadas, además de
la pérdida del gen foráneo insertado.
Debido a la necesidad de sistemas de expresión
recombinantes y vacunas más seguros, se requieren procedimientos
ingeniosos para diseñar poxvirus recombinantes fundamentalmente
diferentes. El procedimiento descrito en la presente incluye la
inserción de un gen foráneo en una región esencial del poxvirus.
Es por tanto un objeto de la presente invención
el proporcionar poxvirus recombinantes capaces de expresar
polinucleótidos foráneos, tales como ADN genómico y ADNc.
Es otro objeto de la presente invención el
proporcionar poxvirus recombinantes que sean defectuosos porque
carezcan de una función impartida por una región esencial del genoma
del poxvirus.
Es otro objeto de la presente invención
proporcionar poxvirus defectuosos que posean polinucleótidos
foráneos insertados en regiones esenciales del genoma del
poxvirus.
Es todavía otro objeto de la presente invención
proporcionar poxvirus defectuosos que tengan eliminada toda o parte
de una región esencial.
Es otro objeto más de la presente invención
proporcionar poxvirus defectuosos que puedan ser utilizados como
vacunas.
Para conseguir estos y otros objetos de la
presente invención, se proporcionan, de acuerdo con un aspecto de la
invención, poxvirus defectuosos que carecen de una función impartida
por una región esencial de su poxvirus parental, conteniendo el
poxvirus defectuoso un polinucleótido foráneo bajo el control
transcripcional de un promotor. Esto es, el poxvirus defectuoso
deriva de un poxvirus parental, pero carece de una función que está
presente normalmente en el poxvirus parental.
El promotor debe ser capaz de funcionar con los
enzimas del poxvirus defectuoso o del huésped infectado. Tales
promotores incluyen promotores de poxvirus y promotores sintéticos
basados en los promotores de poxvirus. El polinucleótido foráneo
puede ser insertado en la región esencial o puede sustituir a parte
o a toda la región esencial.
Adicionalmente, la región esencial puede ser
sustituida por un marcador antes de la inserción del polinucleótido
foráneo en el virus. El polinucleótido foráneo puede ser luego
insertado en el marcador o puede sustituir al marcador.
Preferiblemente, el poxvirus parental es vaccinia y las funciones
esenciales que van a ser perdidas están codificadas por los marcos
de lectura abiertos I7L, F18R, F13L, D13L, D6R, A8L, H4L, J1R, J3R,
A10L y A3L o por los marcos de lectura abiertos que codifican una
proteína de la envoltura de 14 kilodaltons o una proteína
estructural de 25 kilodaltons.
De acuerdo con otro aspecto más de la presente
invención, se proporciona un método para producir una proteína que
comprende la etapa de proporcionar un poxvirus defectuoso que
carezca de una función impartida por una región esencial de su
poxvirus parental, donde el poxvirus defectuoso contiene un
polinucleótido foráneo que codifica la proteína que va a ser
producida y en el que el polinucleótido está bajo el control
transcripcional de un promotor. El promotor debe ser capaz de
funcionar con el poxvirus defectuoso o con el huésped infectado;
tales promotores incluyen promotores de poxvirus. El polinucleótido
puede ser insertado en la región esencial del poxvirus parental. En
otra realización, un marcador tal como el gen gpt, puede sustituir a
parte o a toda la región esencial y, a su vez, el polinucleótido
puede ser insertado en el marcador o sustituir a parte o a todo el
marcador. La pérdida de la función del marcador indicará entonces
que el polinucleótido ha sido colocado en el poxvirus
defectuoso.
De acuerdo con otro aspecto más de la presente
invención, se proporcionan vacunas que comprenden poxvirus
defectuosos. Estos poxvirus defectuosos contienen polinucleótidos
que codifican antígenos contra patógenos. Los poxvirus para vacunas
de la presente invención pueden ser construidos de la misma manera,
o de manera similar, que los demás poxvirus defectuosos de la
presente invención.
Estos y otros aspectos de la invención descritos
en la presente serán obvios para el técnico experto a la vista de
las descripciones contenidas en la presente.
La Figura 1 representa esquemáticamente la
construcción del plásmido pRSET-I7L.
La Figura 2 representa esquemáticamente la
construcción del plásmido
pSV-I7L-EDH.
La Figura 3 representa esquemáticamente la
construcción del plásmido
pCR-I7Lf-ZG.
La Figura 4 representa esquemáticamente la
construcción del plásmido
pRSET-A8L-3'/2.
La Figura 5 representa esquemáticamente la
construcción del plásmido
pSV-A8L-EDH.
La Figura 6 representa esquemáticamente la
construcción del plásmido
pCR-A8Lf-ZG.
La Figura 7 representa esquemáticamente la
construcción de los plásmidos pRSET-D6R y
pRSET-D6R-3'.
La Figura 8 representa esquemáticamente la
construcción del plásmido
pSV-D6R-EDH.
La Figura 9 representa esquemáticamente la
construcción del plásmido
pCR-D6Rf-ZG.
La Figura 10 representa esquemáticamente la
construcción del plásmido pRSET-J1R.
La Figura 11 representa esquemáticamente la
construcción del plásmido
pSV-J1R-EDH.
La Figura 12 representa esquemáticamente la
construcción del plásmido
pCR-J1R-ZG.
La Figura 13 representa esquemáticamente la
construcción del plásmido
pSV-H4L-EDH.
La Figura 14 representa esquemáticamente la
construcción del plásmido
pCR-H4Lf-ZG.
La Figura 15 representa esquemáticamente la
construcción del plásmido pHS-I7L.
La presente invención se refiere en un aspecto a
la utilización de poxvirus defectuosos para la producción de
proteínas. Un "poxvirus defectuoso", de acuerdo con la presente
invención, es un poxvirus que carece de una función impartida por
una región esencial de un poxvirus parental en el que está basado el
poxvirus defectuoso; como consecuencia, el poxvirus defectuoso no es
viable ni infectivo sin complementación de la función perdida por
otra fuente. Una "región esencial" es una región del genoma del
poxvirus que es necesaria para la viabilidad o infectividad del
poxvirus parental. El término "complementación" connota la
restauración de una función perdida por otra fuente, tal como una
célula huésped. Por tanto, un poxvirus defectuoso es una forma no
viable o no infectiva de un poxvirus parental, y puede convertirse
en viable o infectivo en presencia de complementación.
Un poxvirus parental puede ser un poxvirus que
exista en la naturaleza o un poxvirus derivado del mismo.
Un virus defectuoso está basado en (derivado de)
poxvirus parentales tales como los poxvirus que existen en la
naturaleza o poxvirus derivados de los poxvirus que existen en la
naturaleza. Estos poxvirus derivados para ser utilizados como
poxvirus parentales pueden ser obtenidos mediante técnicas tales
como la ingeniería genética por mutagénesis específica de una región
y específica de un sitio, recombinación in vivo, el pase del
virus a través de células huésped en presencia o ausencia de
mutágenos y por cualquier combinación de las técnicas anteriores. Un
poxvirus defectuoso puede estar basado en cualquier tipo de poxvirus
en el que pueda introducirse un defecto en una región esencial.
El poxvirus defectuoso puede ser utilizado como
un sistema de expresión de proteínas. Las proteínas producidas por
los poxvirus defectuosos de la presente invención están codificadas
por polinucleótidos foráneos, tales como genes o versiones de ADNc
de transcritos de ARN. El término "polinucleótido foráneo" se
refiere a un polinucleótido que no está presente normalmente en el
poxvirus parental en el que está basado el poxvirus defectuoso, o es
un polinucleótido que está presente en una posición o en una forma
diferentes de las que se encontraría en el poxvirus parental en el
que está basado el poxvirus defectuoso. Los polinucleótidos foráneos
pueden proceder una variedad de orígenes, tales como animales,
plantas, protozoos, hongos, bacterias y virus.
Los poxvirus defectuosos de la presente invención
pueden incluir un promotor que es operativo con el poxvirus
defectuoso, o con el huésped infectado por el poxvirus defectuoso,
con el fin de controlar la transcripción del polinucleótido foráneo
en el poxvirus defectuoso. Un "promotor" se refiere a una
secuencia de nucleótidos que puede iniciar y/o dirigir la
transcripción. Puede utilizarse en la presente invención cualquier
promotor que sea operativo en el poxvirus defectuoso o en el huésped
infectado. "Operatividad" indica la capacidad del promotor para
ser reconocido o leído por los enzimas transcripcionales.
Típicamente, los promotores son promotores de poxvirus o promotores
sintéticos basados en promotores de origen poxvírico.
Un virus defectuoso puede tener al menos un
polinucleótido foráneo insertado en una región esencial del
poxvirus. Un promotor puede ser unido al polinucleótido foráneo de
tal manera que el promotor sea insertado junto con el polinucleótido
con el fin de que el promotor tenga control transcripcional sobre el
polinucleótido. Alternativamente, el promotor para controlar la
transcripción del polinucleótido foráneo puede estar ya presente en
el poxvirus defectuoso en una posición que permita al promotor
controlar la transcripción del polinucleótido foráneo.
La región esencial puede ser eliminada
completamente del genoma del virus defectuoso de tal manera que no
sea posible una recombinación homóloga entre el genoma de la fuente
de complementación y el virus defectuoso. Un virus defectuoso con
tal deleción puede crecer solamente en presencia de la fuente de
complementación, tal como una línea celular cooperadora que
proporcione la función de la región esencial en trans. Pueden
cultivarse soluciones madre puras del virus defectuoso en la línea
celular cooperadora mientras que el crecimiento y la multiplicación
en células y organismos normales continúa siendo imposible. El rango
de huéspedes de este tipo de virus puede estar restringido a líneas
celulares cooperadoras que son manipuladas específicamente para
complementar el defecto del virus defectuoso. Puede utilizarse un
gen marcador para sustituir una región esencial del poxvirus
defectuoso. El polinucleótido foráneo puede ser luego insertado en
el marcador o sustituir a todo o a parte del marcador mediante
recombinación homóloga. Este procedimiento proporciona un sistema
para seleccionar los poxvirus que contengan los insertos de
interés.
La presente invención es útil para más cosas
además de la expresión de proteínas a gran escala. Los poxvirus
defectuosos de la invención pueden ser utilizados también con fines
de vacunación. Por ejemplo, si un gen esencial apropiado es
inactivado, los virus defectuosos conservarán todavía su capacidad
para penetrar en las células e iniciar un ciclo vital abortivo. Tal
gen sería uno que fuera requerido tardíamente en el ciclo vital y,
por tanto, el virus sería todavía capaz de replicar su ADN, de
formar finalmente partículas inmaduras y de expresar su información
genómica, que incluiría el polinucleótido foráneo. A este respecto,
estos virus defectuosos podrían tener el efecto de las "vacunas
vivas-muertas". Taylor y Paoletti, Vaccine 6:
466-68 (1988). Un poxvirus defectuoso que sea
utilizado como vacuna comprenderá un polinucleótido de ADN que
codifique un antígeno. Los antígenos son moléculas que un organismo
reconoce como foráneas. Estos antígenos pueden inducir una respuesta
inmunológica del organismo expuesto al antígeno. Los antígenos
incluyen proteínas de origen bacteriano, vírico, fúngico y de
protozoos. Una cepa parental de vaccinia preferida para la
construcción de virus defectuosos para ser utilizados como vacunas
sería una cepa de vaccinia tal como la cepa del New York City
Department of Health Laboratories (ATCC VR-325).
Los poxvirus defectuosos de la presente invención
pueden ser cultivados en células huésped que complementen la función
esencial perdida del virus defectuoso. Típicamente, estas células
huésped proceden de líneas celulares que son manipuladas
específicamente para que complementen la función perdida.
Típicamente, la célula huésped tendrá la misma región esencial del
poxvirus, o una región similar, insertada en la célula huésped de
tal manera que la región esencial sea expresada por la célula
huésped o que la región esencial sea inducible en la célula después
de la infección de la célula huésped.
Los productos génicos esenciales adecuados como
agentes de complementación incluyen, en general, productos génicos
que son requeridos tardíamente en el ciclo vital del poxvirus. Son
ilustrativos de tales productos génicos los implicados en la
morfogénesis o en otros acontecimientos posteriores a la
replicación, así como enzimas y proteínas reguladoras.
Un producto génico esencial que es un agente de
complementación adecuado es la proteína de 47 kDa (la "proteína
I7") codificada por el marco de lectura abierto ("orf") I7L,
que se cree que está implicada en la organización del genoma del
virus. Kane y Shuman, J. Virol. 67: 2689-98 (1993).
La proteína I7 está encapsulada en el núcleo central del virus.
Existe una mutación sensible a la temperatura (ts) conocida como
ts16. Condit y col., Virol. 128: 429-43 (1983). El
gen I7 cumple por tanto un requisito clásico de un gen esencial,
como es la existencia de un mutante letal condicional (sensibilidad
a la temperatura).
Entre los productos génicos esenciales que son
agentes de complementación adecuados en el presente contexto está la
proteína de 65 kDa codificada por el orf D13L. Esta proteína se
expresa tardíamente en la infección. Si se impide la expresión, la
replicación no se ve afectada aunque la morfogénesis del virus es
bloqueada en una etapa temprana. Ver Zhang y Moss, Virol. 187:
643-53 (1992). Otros productos génicos esenciales
que son adecuados como agentes de complementación son la proteína de
la envoltura de vaccina de 14 kDa, Lai y col., J. Biol. Chem. 265:
22174-80 (1990); la proteína estructural principal
de vaccinia de 25 kDa, Weir y Moss, J. Virol. 56:
534-40 (1985); y otras proteínas estructurales tales
como P4a y P4b.
Otro producto génico esencial que puede ser
utilizado como agente de complementación es la fosfoproteína de 11
kDa, Wittek y col., J. Virol. 49: 371-78 (1984),
codificada por el orf F18R del virus de tipo salvaje WR (conocido
como "F17R" de la cepa Copenhagen de vaccinia). Ver Goebel y
col., Virol. 179: 247-66 (1990). La fosfoproteína de
11 kDa codificada por el orf F18R es un gen esencial que es
requerido para el ensamblaje correcto del virión. Ver Zhang y Moss,
J. Virol. 65: 6101-10 (1991). Los mutantes letales
condicionales de vaccinia en los orfs F18R y F17R forman partículas
inmaduras con estructuras internas aberrantes bajo ciertas
condiciones. F18R solapa, sin embargo, con el orf A, y generalmente
no sería por tanto la región esencial de primera elección. Goebel y
col., supra.
Pueden emplearse también como agentes de
complementación enzimas y proteínas reguladoras, ya que estas
proteínas necesitan estar presentes solamente en cantidades
catalíticas, que pueden ser fácilmente proporcionadas por la línea
celular de complementación. Las subunidades del factor de
transcripción temprano del virus vaccinia ("VETF") son
adecuadas a este respecto. El VETF es esencial para el inicio de la
transcripción de los genes "tempranos" de vaccinia. La ARN
polimerasa de vaccinia carente del VETF es incapaz de transcribir
moldes de ADN de doble hebra in vitro. Ver Broyles y col., J.
Biol. Chem. 263: 10754-60 (1988). El factor es un
heterodímero que tiene un polipéptido de 77 kDa y un polipéptido de
82 kDa, que están codificados respectivamente por el orf del gen D6R
y del gen A8L del genoma de vaccinia WR. Ver Gershon y Moss, Proc.
Nat'l. Acad. Sci. USA 87: 4401-05 (1990).
Las proteínas VETF son expresadas tardíamente en
la infección y son empaquetadas en las partículas nacientes del
virus. Un virus defectuoso carente del gen D6R o del gen A8L aislado
de células que expresen VETF, debería ser capaz por tanto de llevar
a cabo un ciclo vital completo adicional en una línea celular que no
sea de complementación, sin limitaciones adicionales de síntesis de
proteínas. La síntesis de proteínas es un requisito esencial para la
utilización de tales virus defectuosos como "vacunas
vivas-muertas".
Las vacunas vivas-muertas
incluyen avipoxvirus que expresan genes foráneos que son utilizadas
para inmunizar huéspedes mamífero. En el huésped mamífero los virus
no se multiplican, sino que experimentan más bien un ciclo vital
abortivo. No obstante, este tipo de vacuna estimula la respuesta
inmune de células T particulares. Ver Taylor y Paoletti,
supra. Es deseable un virus defectuoso carente de VETF, ya
que debería ser capaz de llevar a cabo un ciclo vital adicional en
los huéspedes de tipo salvaje, en comparación con los virus capaces
de llevar a cabo solamente ciclos vitales abortivos, lo cual permite
una mayor producción de antígenos.
Otro factor vírico que es adecuado para la
complementación es la proteína RAP94 asociada a la ARN polimerasa o
factor de especificidad de la transcripción temprano. La RAP94 está
codificada por el orf H4L, Ahn y Moss, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA
89: 3536-40 (1992), y es una subunidad de la ARN
polimerasa dependiente del ADN del virus que puede ser disociada. La
subunidad confiere especificidad de promotor al complejo de la ARN
polimerasa para el inicio de la transcripción de genes de la etapa
temprana. Como agente de complementación cumple los mismos
requisitos que las subunidades del VETF. La RAP94 es sintetizada
tardíamente en la infección y empaquetada en el virus naciente para
mediar la transcripción temprana en la ronda de infección siguiente.
Por tanto, las partículas de virus fenotípicamente intactas carentes
del gen H4L deberían ser capaces de llevar a cabo una ronda de
infección adicional en un huésped que no sea de complementación sin
limitaciones adicionales en la síntesis de proteínas. La existencia
de mutantes letales condicionales, Condit y Motytzca, Virol. 113:
224-41 (1981), confirma que H4L es un gen esencial.
Se ha encontrado que la proteína está presente en el virión en
cantidades submolares en comparación con otros componentes del
complejo de la ARN polimerasa. Ahn y Moss, supra. Por
consiguiente, niveles bajos de expresión de RAP94 en la línea
celular de complementación no deberían afectar al crecimiento del
virus defectuoso.
Otro gen que puede ser utilizado para la
complementación del virus defectuoso es el gen J1R, que es esencial
para el crecimiento del virus en cultivo celular. Aunque hasta ahora
no se ha identificado su producto génico, este orf es de
considerable interés debido a su posición adyacente al gen de la
timidina quinasa en el genoma del virus vaccinia. La eliminación de
una secuencia que incluya el orf J1R y al menos partes del gen de la
timidina quinasa adyacente (J2R), tiene como resultado un virus que
depende de una línea celular de complementación y que es al mismo
tiempo seleccionable mediante selección negativa en células
tk-negativas tales como las células LM(TK-)
o las células Vero tk-negativas. Soluciones madre
puras de virus defectuosos son obtenidas rápidamente utilizando este
procedimiento de selección adicional.
El gen J3R es de interés en el mismo sentido que
el orf J1R. La selección negativa en células
tk-negativas puede ser realizada debido a la
delección simultánea del orf J3R y el orf J2R adyacente (timidina
quinasa). El gen J3R codifica una subunidad de la
poli(A)polimerasa (VP39) que es requerida para la
formación de la estructura de casquete 5' del ARNm y que estimula la
formación de colas de poli(A) largas. Gershon y col., Cell
66: 1269-78 (1991); Schnierle y col., Proc. Nat'l.
Acad. Sci. USA 89: 2897-01 (1991).
Los poxvirus defectuosos de la presente invención
pueden ser producidos con muchos de los mismos métodos utilizados
para construir virus recombinantes con insertos en regiones no
esenciales. Por ejemplo, puede utilizarse la recombinación in
vivo a través de la región flanqueante homóloga. Ver Panicali y
Paoletti, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 79: 4927-31
(1982); Mackett y col., loc. cit. 79: 7415-19
(1982). Un método alternativo para producir poxvirus defectuosos es
el clonaje molecular directo y el empaquetamiento heterólogo. Ver EP
0 561 034; Scheiflinger y col., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 89:
9977-81 (1992); Merchlinsky y Moss, Virol. 190:
522-26 (1992).
La primera etapa en la construcción de la línea
celular cooperadora fue el clonaje del orf I7L mediante metodología
convencional, mediada por PCR, en un plásmido de expresión de E.
coli y en un plásmido de expresión eucariótico. La expresión del
orf I7L en E. coli permite la producción rápida de la
proteína para la inmunización de conejos con el fin de obtener
anticuerpos anti-proteína I7L, que pueden ser
utilizados posteriormente para identificar la proteína I7L en líneas
celulares permanentes.
Para este fin, el orf I7L fue amplificado por PCR
y clonado posteriormente en el plásmido pCRII (InVitrogen, Inc.). Se
utilizaron los cebadores oI7-1
(5'-AGT ACT CCA TGG AAA GAT ATA CAG ATT
TAG-3') (SEC ID Nº:1) y oI7-2
(5'-ATC CCG GGT TTT AGA GAC TTT GAA GCT
ACT-3') (SEC ID Nº:2) para amplificar el gen I7L
como un fragmento de 1,3 kb. Este fragmento fue insertado en el
plásmido pCRII, lo cual tuvo como resultado pCR-I7L.
El plásmido pCR-I7L fue el origen del fragmento
génico NcoI-HindIII que fue insertado posteriormente
mediante clonaje forzado en el plásmido pRSET-B
(InVitrogen, Inc.), produciendo pRSET-I7L (Figura
1). El plásmido pRSET-I7L permitía la sobreexpresión
del orf I7L, que estaba corriente abajo del promotor de T7. La
expresión bajo el control del promotor de T7 requiere ARN polimerasa
de T7, que es proporcionada por la infección de la E. coli
portadora del plásmido por el bacteriófago M13mp18/T7.
La proteína I7L era sobreexpresada en células de
E. coli JM109 infectadas con M13mp18/T7 y que albergaban el
plásmido pRSET-I7L. La inducción del promotor lac
con isopropiltiogalactósido ("IPTG") dirige la expresión de la
polimerasa de T7 en el bacteriófago M13mp18/T7. El sistema de
expresión de E. coli utilizado en este ejemplo particular fue
obtenido de InVitrogen, Inc. (EE.UU.), e incluye los plásmidos
parentales pRSET A, pRSET B y pRSET C y un fago cooperador,
M13mp18/T7, basado en M13. Pueden utilizarse también con la presente
invención otros sistemas de expresión adecuados.
Después de la expresión, se prepararon lisados
bacterianos y se sometieron a electroforesis en gel de
poliacrilamida. Se detectó la banda que contenía la proteína I7L y
se cortó del gel y se electroeluyó. Se inmunizaron conejos con el
material electroeluido y adyuvante completo de Freund (30 mg de
proteína por dosis, i.m.). Después de un mes, los animales fueron
reforzados con la misma dosis en adyuvante incompleto de Freund y se
monitorizó el desarrollo de anticuerpos mediante transferencias
Western.
Las transferencias Western pueden ser realizadas
esencialmente según está descrito por Towbin y col., Proc. Nat'l.
Acad. Sci. USA 76: 4350-54 (1979). El primer
anticuerpo es un anticuerpo anti-I7L producido en
conejo (ver anteriormente) utilizado en una dilución 1:100. El
segundo anticuerpo es un anti-IgG de conejo
producido en cabra acoplado a fosfatasa alcalina (BioRad, Inc.)
utilizado en una dilución 1:1000. Los reactivos (BCIP y NBT) y los
protocolos de tinción eran de Promega, Inc.
Un fragmento génico NcoI-SmaI del
plásmido pCR-I7L es parte del plásmido de expresión
pSV-I7L-EDH. Ver la Figura 2. El
plásmido pEDH1 (Figura 2) comprende el "casete del gen EDH" que
incluye un sitio de entrada de ribosomas interno, el gen de la
dihidrofolato reductasa ("dhfr") y el gen de la higromicina
("hph") como un fragmento EcoRV-SalI. Este
plásmido pEDH1 deriva del plásmido pB4/EDHPro (Herlitschka, tesis),
en el que se insertaron cuatro sitios de restricción adicionales
(SalI, ClaI, SwaI y DraI) corriente abajo del "casete del gen
EDH" entre los sitios de SpeI y NotI. El "casete del gen
EDH" de pEDH1 fue insertado como un fragmento
EcoRV-SalI entre los sitios de restricción únicos de
SmaI y SalI del plásmido pSV-I7L. Esta construcción
produjo el plásmido pSV-I7L-EDH.
El plásmido pSV-I7L fue obtenido
insertando el fragmento NcoI-SmaI de 1,3 kb de
pCR-I7L entre los sitios de
BbsI-SmaI del plásmido pSV-Bbs. El
plásmido pSV-Bbs es un derivado del plásmido
pSV\beta (Clontech, Inc., EE.UU.), que carece del gen de la
\beta-galactosidasa pero contiene un único sitio
de BbsI. El sitio de BbsI es introducido por un adaptador que
incluye los oligonucleótidos oBbs-1
(5'-CTA GGC TTT TGC AAA AAG CTC CTC GAC CAT GGT GTC
TTC A-3') (SEC ID Nº:3) y oBbs-2
(5'-AGC TTG AAG ACA CCA TGG TCG AGG AGC TTT TTG CAA
AAG C-3') (SEC ID Nº:4). El adaptador fue insertado
entre los sitios de AvrII y HindIII del plásmido pSV\beta. Ver la
Figura 2.
En pSV-I7L-EDH,
el orf I7L está controlado por el promotor temprano de SV40. El
marcador de selección para obtener líneas celulares permanentes es
un gen de fusión que incluye los genes dhfr y hph, que permite la
selección y la amplificación eficaz de los genes de interés en
líneas celulares permanentes. Herlitschka, S.E. (1994), tesis
doctoral, Universität für Bodenkultur, Vienna, Austria. Sin embargo,
la práctica de la presente invención no está limitada a la
utilización de este marcador.
Este plásmido es transfectado a células Vero de
riñón de mono (ATCC Nº CCL 81). Las células Vero fueron obtenidas de
la American Type Culture Collection (Rockville, MD). Las células
fueron transfectadas con el plásmido
pSV-I7L-EDH de acuerdo con Graham y
van der Eb, Virol. 52: 456-67 (1973), y se incubaron
en medio selectivo basado en higromicina B (DMEM, 10% de suero
bovino fetal, 250 mg/ml de higromicina B). Las colonias fueron
visibles después de 10 a 14 días. Estas colonias fueron expandidas,
subclonadas dos veces y posteriormente caracterizadas
adicionalmente. Se seleccionaron las líneas celulares hph positivas
permanentes en presencia de higromicina B. Las líneas celulares
fueron caracterizadas adicionalmente mediante análisis por PCR para
determinar la presencia de la construcción génica de complementación
(I7L). Se utilizaron transferencias Western para mostrar que se
expresaba el gen de interés, la proteína I7L. La línea celular de
complementación final fue denominada V-I7L.
Con el fin de construir el virus
d-I7L-ZG, que carece del producto
I7L, se construyó el plásmido pCR-I7Lf según está
resumido en la Figura 3. Este plásmido está basado en el vector
pCRII y contiene el orf I7L, incluyendo 0,5 kb aproximadamente de la
región flanqueante en cada lado. Se utilizaron los cebadores
oI7-3 (5'-AGG AGT TAA TGA GGC CAA
TGG A-3') (SEC ID Nº:5) y oI7-4
(5'-GAC ATA GGT ATA GAA TCC GGA-3')
(SEC ID Nº:6) para obtener un producto de PCR de 2,3 kb
aproximadamente, que fue sublonado en el plásmido pCRII para dar
pCR-I7Lf.
Un casete de dos genes que incluía los genes de
E. coli lac Z y gpt fue escindido del plásmido pLGb como un
fragmento de SmaI e insertado en el único sitio de HpaI situado en
el orf I7L, lo cual inactivaba el gen de pCR-I7L en
el plásmido resultante
pCR-I7Lf-ZG.
El plásmido pLGb fue obtenido a partir de p2T,
que está basado en los plásmidos plTa y pTZ19R (Pharmacia).
Primeramente, el fragmento del vector de PvuII grande de pTZ19R fue
ligado con los oligonucleótidos hibridados
P-1T(1): 5'-AGT TTA AAC GGC
GCG CCC GGG CTC GAG AGG CCT CTG CAG ATG CAT CCA TGG GGA TCC GAA
TTC-3' (SEC ID Nº:7) y
P-1T(2): 5'-GAA TTC GGA TCC
CCA TGG ATG CAT CTG CAG AGG CCT CTC GAG CCC GGG CGC GCC GTT TAA ACT
(SEC ID Nº:8). Esto produjo plTa, que fue luego cortado con EcoRI y
BamHI. El plTa fue ligado posteriormente a los oligonucleótidos
hibridados P-2T(1): 5'-GAT
CCT ACG TAT CTA GAA TTA ATT AAT GGC CAA TTT AAA TGC CCG
GGA-3' (SEC ID Nº:9) y
P-2T(2): 5'-AAT TTC CCG GGC
ATT TAA ATT GGC CAT TAA TTA ATT CTA GAT ACG TAG-3'
(SEC ID Nº:10). Esto produjo el plásmido p2T, que fue luego cortado
con SmaI. Un casete de dos genes que incluía los genes de E.
coli lac Z y gpt fue insertado como un fragmento de HindIII,
SalI y tratamiento con polimerasa Klenow. El casete de dos genes es
obtenido del plásmido pZgpt-a, que está basado en el
plásmido pTNa y en plásmidos relacionados.
Para la construcción del virus
d-I7L-ZG, el plásmido
pCR-I7Lf-ZG fue insertado en la cepa
WR del virus vaccinia mediante recombinación in vivo en
células CV-1. En primer lugar, 5 x 10^{6} células
CV-1 fueron infectadas con 0,1 ufp/célula de
vaccinia WR, cultivadas durante 1 hora, transfectadas con un
precipitado de fosfato de calcio que incluía 20 \mug del plásmido
pCR-I7Lf-ZG, y cultivadas
posteriormente durante 3 días. Ver Graham y van der Eb,
supra. Se preparó una solución madre de virus bruta y se
utilizó para la formación de placas en células en presencia de
selección por gpt, Falkner y Moss, J. Virol. 62:
1849-54 (1988) y selección por placas azules,
Chakrabarti y col., Mol. Cell. Biol. S. 5: 3403-09
(1985).
El virus defectuoso crece solamente en células
V-I7L y es gpt y lac Z positivo, mientras que el
virus de tipo salvaje crece en ambas líneas celulares pero es gpt y
lac Z negativo. La purificación se lleva a cabo diez veces. Los
virus defectuosos purificados son cultivados posteriormente a mayor
escala y examinados mediante transferencia Southern. La ausencia de
virus de tipo salvaje y la presencia de las bandas pronosticadas
confirma que se han formado los genomas defectuosos correctos. Los
ensayos de placas de los virus defectuosos en las células de
complementación y en las células de tipo salvaje confirman que el
rango de huéspedes de los virus defectuosos está limitado a la línea
celular de complementación. Estudios en animales confirmaron que los
virus defectuosos no eran patógenos.
Con el fin de demostrar la expresión de genes
foráneos en el nuevo sistema, el gen gp160 del VIH de la cepa VIH MN
es insertado en la región esencial I7L. Para este fin, se obtiene un
casete génico a partir de un fragmento de SmaI del plásmido
pSep-ST2. El plásmido pSep-ST2
contiene las secuencias de gp160MN del VIH-1
controladas por el potente promotor semisintético Sep de poxvirus y
un casete para selección que incluye el gen gpt P7.5. Ver Falkner y
Moss, J. Virol. 62: 1849-54 (1988).
Para construir el plásmido
pSep-ST2, se construyó primeramente el plásmido
pSep(1). Para obtener pSep(1), se construyó el
promotor semisintético Sep de poxvirus mediante combinación del
promotor tardío P2 del poxvirus de las aves de corral (EP 0 538 496
A1, Dorner y col.) con una secuencia sintética del promotor
temprano. Brevemente, el vector pS2gpt-P2 digerido
con HpaI/NcoI (Solicitud de Patente Europea Número de Publicación 0
561 034 A2) fue ligado con los oligonucleótidos hibridados
P-Sep(3) y P-Sep(4).
Las secuencias de los oligonucleótidos eran,
P-Sep(3), 5'-CTCGTAAAAA
TTGAAAAACT ATTCTAATTT ATTGCACGGT CGCGA-3' (SEC ID
Nº:11) y p-Sep(4),
5'-CATGGTACGT ACCGTGCAAT AAATTAGAAT AGTTTTTCAA
TTTTTACGAG-3' (SEC ID Nº:12). El plásmido resultante
fue denominado pSep(1). Para obtener
pSep-ST2, primeramente un fragmento StuI/PvuII de
2,65 kb derivado del plásmido pMNenv2 (descrito en EP 0 561 034 A2),
que contenía el gen env de VIH1-MN, fue ligado con
el plásmido pSep(1) linealizado con SnaBI. El plásmido
resultante, que contenía el inserto en orientación correcta con
respecto al "promotor Sep", fue denominado
pSep-gp160mn. Con el fin de reparar una mutación
puntual localizada en el orf gp160, un fragmento NsiI/SalI de 1,9 kb
de pSep-gp160mn fue sustituido por un fragmento
equivalente derivado del plásmido pMN-ST2. El
plásmido resultante fue denominado pSep-ST2. Los
plásmidos pMNenv1 y pMN-ST2 fueron proporcionados
por Marvin Reitz (N.C.I. Bethesda, Maryland,
EE.UU.).
EE.UU.).
El casete de pSep-ST2 contiene el
gen gp160 del VIH y el gen gpt de E. coli, y es insertado en
el único sitio de HpaI de pCR-I7Lf, teniendo como
resultado el plásmido pCR-I7Lf-MN.
Este plásmido es utilizado en un experimento de recombinación in
vivo en células CV-1 que implicaba al virus de
tipo salvaje WR, para obtener una solución madre bruta de virus que
es una mezcla de: (1) virus defectuosos que han experimentado dos
acontecimientos de sobrecruzamiento para convertirse en un virus
recombinante; (2) virus que han experimentado solamente un
acontecimiento de sobrecruzamiento y (3) virus cooperadores de tipo
salvaje. Una explicación global de los acontecimientos de
sobrecruzamiento está contenida en Falkner y Moss, J. Virol. 64:
3108-11 (1990).
Esta mezcla de virus es purificada en un ensayo
de placas en la célula de complementación y analizada para
determinar su pureza según se describió en el Ejemplo 1, excepto en
que los ensayos de placas están basados únicamente en la selección
por gpt. El virus resultante es denominado
d-I7L-MN y utilizado para la
expresión de gp160 recombinante en células V-I7L. El
virus d-I7L-MN es utilizado en
combinación con su línea celular de complementación para expresar
gp160. Las células V-I7L son infectadas con 0,1 ufp
de d-I7L-MN y cultivadas durante
tres días. La proteína recombinante es detectada mediante
transferencias Western utilizando un anticuerpo monoclonal
anti-gp41 en un método de acuerdo con Towbin y col.,
supra. Se llevaron a cabo experimentos con animales en
ratones para demostrar que el
d-I7L-MN no es patógeno pero es
todavía capaz de estimular una respuesta inmune.
El factor VETF es un heterodímero compuesto por
un polipéptido de 77 kD y un polipéptido de 82 kD, que están
codificados respectivamente por los orfs D6R y A8L del genoma de
vaccinia WR. Gershon y Moss, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 87:
4401-05 (1990). Las proteínas VETF son expresadas
tardíamente en la infección y son empaquetadas en las partículas
víricas nacientes. Es deseable un virus defectuoso que carezca de
VETF ya que debería ser capaz de llevar a cabo un ciclo vital
adicional en los huéspedes de tipo salvaje, en comparación con los
virus capaces de llevar a cabo solamente ciclos vitales
abortivos.
La subunidad D6R contiene un posible sitio de
unión de ATP y se ha encontrado que se une a la secuencia de ADN del
promotor temprano. Ver, Broyles y Li, J. Virol. 67:
5677-80 (1993). Se han elaborado mapas de
mutaciones sensibles a la temperatura del gen D6R. El orf A8L fue
elegido con el fin de evitar interacciones
proteína-ADN indeseables en la línea celular de
complementación.
La primera etapa en la construcción de la línea
celular cooperadora fue el clonaje del orf A8L mediante técnicas
mediadas por PCR en un plásmido de expresión de E. coli y en
un plásmido de expresión eucariótico. La expresión del orf en E.
coli permitía la producción rápida de la proteína para la
inmunización de conejos con el fin de obtener anticuerpos
anti-subunidad grande del VETF que son utilizados
posteriormente para identificar la proteína en las líneas celulares
permanentes.
Para este fin, el orf A8L fue amplificado por PCR
y clonado en el plásmido pCRII. Se utilizaron los cebadores
oA8-9t (5'-AAA CTG CAG GAT GCG ATA
TAT AGT AAG TCC GCA AAT GGT ATT A-3') (SEC ID Nº:13)
y oA8-2t (5'-AGG AAT TCA GGC CTG TTT
AAT TAA TTT GTG CTC TTC-3') (SEC ID Nº:14) para
amplificar el gen A8L como un fragmento de 2,1 kb. Este fragmento
fue insertado en el plásmido pCRII (InVitrogen, Inc.), dando como
resultado pCR-A8Lt.
El plásmido pCR-A8Lt es la fuente
de un fragmento génico BamHI-EcoRI de 0,9 kb. El
sitio de BamHI (presente en el gen A8L) y el sitio de EcoRI
(introducido por el sitio de clonaje múltiple de pCRII) fueron
cortados para obtener el fragmento que fue insertado mediante
clonaje forzado en el plásmido pRSET-B (InVitrogen,
Inc.), dando como resultado el plásmido
pRSET-A8L-3'/2. Ver la Figura 4. El
plásmido contiene un gen de fusión que codifica la porción
C'-terminal de la subunidad grande de VETF con una
marca de 6 histidinas N'-terminal. La proteína A8L
truncada era sobreexpresada en células de E. coli (cepa
JM109) que albergaban el plásmido
pRSET-A8L-3'/2.
Las bacterias fueron posteriormente infectadas
por el fago cooperador M13mp18/T7 en presencia de ITPG, que induce
la dirección de la expresión de la polimerasa de T7 por el promotor
lac en el bacteriófago M13mp18/T7. La proteína A8L truncada
recombinante que incluye la marca de his fue purificada a partir de
lisados bacterianos mediante cromatografía de afinidad en columnas
de níquel-NTA, de acuerdo con el protocolo del
fabricante (Diagen, Inc.). El material purificado emulsionado en
adyuvante completo de Freund fue utilizado para inmunizar conejos
(80 mg de proteína por dosis, s.c. e i.m.). Después de un mes, los
animales fueron reforzados con la misma dosis y se monitorizó el
desarrollo de anticuerpos mediante transferencia Western.
Para caracterizar los antisueros de conejo, las
proteínas A8L de los lisados bacterianos fueron detectadas mediante
transferencias Western. Las transferencias Western fueron realizadas
esencialmente según está descrito por Towbin y col., supra.
El primer anticuerpo era un anticuerpo anti-proteína
A8L producido en conejo utilizado en una dilución 1:100. El segundo
anticuerpo era un anti-IgG de conejo producido en
cabra acoplado a fosfatasa alcalina (BioRad, Inc.)
utilizado en una dilución 1:1000. Los reactivos (BCIP y NBT) y los protocolos de tinción procedían de Promega, Inc.
utilizado en una dilución 1:1000. Los reactivos (BCIP y NBT) y los protocolos de tinción procedían de Promega, Inc.
Con el fin de obtener el plásmido de expresión
pSV-A8L-EDH, el gen A8L fue aislado
del plásmido pCR-A8Lt como un fragmento génico
PstI-StuI de 2,1 kb. Los sitios de PstI y StuI
fueron introducidos por los cebadores de PCR oA8-9t
y oA8-2t, respectivamente. Este fragmento y un
fragmento génico EcoRV-ClaI procedente del plásmido
pEDH1 que contiene el "casete del gen EDH", fueron ligados en
el vector de expresión pSVMCS#51 cortado con
PstI-ClaI, que es derivado de pSV\beta (Clontech,
Inc.) mediante sustitución del gen de la
\beta-galactosidasa por un sitio de clonaje
múltiple ("msc") que incluye los sitios de restricción de ApaI,
AvrIII, SpeI, HindIII, PstI, SalI, XbaI, SmaI, EcoRI y ClaI. Para
este fin el vector pCMV\beta fue cortado con NotI y vuelto a
ligar, teniendo como resultado el plásmido pCMV. Este plásmido fue
cortado con SalI y HindIII, tratado con polimerasa Klenow y vuelto a
ligar, dando como resultado un plásmido intermedio. Este plásmido
fue cortado con XhoI y se insertó un adaptador de doble hebra que
codificaba los sitios de restricción de ApaI, AvrIII, SpeI, HindIII,
PstI, SalI, XbaI, SmaI, EcoRI y ClaI, dando como resultado el
plásmido pSVMCS#51. Ver la Figura 5.
En el plásmido
pSV-A8L-EDH, el orf A8L está
controlado por el promotor temprano de SV40. El marcador de
selección para obtener líneas celulares permanentes es un gen de
fusión que incluye el gen dhfr y el gen hph, según se describió en
el Ejemplo 1.
El plásmido
pSV-A8L-EDH fue transfectado a
células Vero de riñón de mono (ATCC Nº CCL 81) en un método de
acuerdo con Graham y van der Eb, supra, y se incubaron en
medio selectivo (DMEM, 10% de suero bovino fetal, 250 \mug/ml de
higromicina) y posteriormente se trataron según se describió en el
Ejemplo 1. Las líneas celulares permanentes positivas para la
fosfotransferasa de higromicina fueron seleccionadas en presencia
del antibiótico higromicina B. Después de cinco pases, la
integración del ADN foráneo fue demostrada mediante PCR utilizando
cebadores específicos para un segmento de 0,5 kb del gen A8L.
Se utilizaron transferencias Western para
determinar si se expresaba el gen de interés, la subunidad grande
del VETF. Las líneas celulares que expresaban los mayores niveles de
la subunidad grande del VETF fueron caracterizadas adicionalmente
mediante análisis por PCR y utilizadas como línea celular de
complementación, y se denominaron V-A8L.
Para construir el virus
d-A8L-ZG el plásmido
pCR-A8Lf-ZG fue clonado según se
muestra esquemáticamente en la Figura 6. Las regiones (entre 0,5 kb
y 0,7 kb de tamaño) que flanqueaban al orf A8L en ambos lados fueron
amplificadas por PCR y subclonadas en el plásmido pCRII para obtener
pCR-A8L-fl y
pCR-A8L-fr, respectivamente.
Los cebadores de la PCR para la amplificación de
la región flanqueante 5' de A8L fueron oA8-8
(5'-AGC GCC GCT ACT AGC ACT CC-3')
(SEC ID Nº:15) y oA8-5 (5'-GAA CGT
TAA CAT TTA TAT CGT GGG GTA AAG TGA AAA TC-3') (SEC
ID Nº:16). Los cebadores para la región flanqueante 3' de A8L fueron
oA8-4 (5'-TTG GAG AAC TTG ATA CGC
CG-3') (SEC ID Nº:17) y oA8-6
(5'-CAT ATG CAA TTG TAA ATT AAA CAA CTA AAT CTG TAA
ATA AAT A-3') (SEC ID Nº:18). La región flanqueante
5' de A8L, como un fragmento NotI-SpeI de 0,7 kb
procedente de pCR-A8L-fl, fue ligada
entre los sitios de NotI y XbaI justo corriente arriba de la región
flanqueante 3' de A8L en pCR-A8L-fr,
produciendo el plásmido
pCR-A8L-flancos.
Con el fin de facilitar los procedimientos de
clonaje posteriores, un adaptador sintético que contenía los sitios
de restricción poco frecuentes SmaI, NotI, SfiI y RsrII, fue ligado
entre las regiones flanqueantes de A8L en
pCR-A8L-flancos. Los
oligonucleótidos utilizados para la construcción del adaptador
fueron oA8-11 (5'-AAC GGT CCG GCC
CGG GCG GCC GCC-3') (SEC ID Nº:19) y
oA8-12 (5'-AAT TGG CGG CCG CCC GGG
CCG GAC CGT T-3') (SEC ID Nº:20). El plásmido
pCR-A8L-flancos fue linealizado
posteriormente con MunI y HpaI (ambos sitios fueron introducidos por
los cebadores de PCR oA8-5 y oA8-6,
respectivamente). El plásmido resultante, denominado pdA8L, fue
ligado con un casete de dos genes de SmaI de 3,9 kb procedente del
plásmido pLGb descrito en el Ejemplo 1, para dar
pCR-A8Lf-ZG. En esta construcción,
el orf A8L es eliminado completamente para prevenir el rescate del
virus defectuoso por la línea celular de complementación a través de
recombinación homóloga.
Para la construcción del virus
d-A8L-ZG, el plásmido
pCR-A8L-ZG fue insertado en el virus
vaccinia WR. El plásmido pCR-A8Lf-ZG
fue utilizado para recombinación in vivo en células
CV-1. Primeramente, 5 x 10^{6} células
CV-1 fueron infectadas con 0,1 ufp/célula de
vaccinia WR, incubadas durante 1 hora, transfectadas con un
precipitado de fosfato de calcio, de acuerdo con Graham y van der
Eb, supra, que contenía 20 \mug del plásmido
pCR-A8L-ZG y cultivadas durante 3
días.
Esto tuvo como resultado una solución madre bruta
que contenía virus de tipo salvaje (cooperadores) y virus
defectuosos. Con el fin de obtener soluciones madre puras del virus
defectuoso, se llevaron a cabo ensayos de placas en células
V-A8L que son capaces de complementar al virus
defectuoso. La solución madre bruta de virus fue preparada y
utilizada para los ensayos de placas en células
V-A8L en presencia de selección por gpt (Falkner y
Moss (1988), supra) y selección por placas azules
(Chakrabarti y col., supra). La purificación de placas se
repitió diez veces. Los poxvirus defectuosos purificados fueron
cultivados a mayor escala y examinados mediante transferencia
Southern. La ausencia de virus de tipo salvaje y la presencia de las
bandas pronosticadas confirma que se habían formado los genomas
defectuosos correctos. Los ensayos de placas de los virus
defectuosos en las células de complementación y en las células de
tipo salvaje confirman que el rango de huéspedes de los virus
defectuosos está limitado a la línea celular de complementación.
Estudios en animales confirmaron que los virus defectuosos no
eran
patógenos.
patógenos.
La subunidad pequeña del factor de transcripción
temprano VETF es un polipéptido de 77 kD de tamaño. Según se
describió en el Ejemplo 3, VETF contiene un posible sitio de unión
de ATP y se ha encontrado que se une a la secuencia de ADN del
promotor temprano. Broyles y Li, supra. El orf D6R es elegido
para la complementación porque se han elaborado mapas de mutaciones
sensibles a la temperatura de este gen, lo cual es un elemento que
está en la definición de un gen esencial. Seto y col., Virol. 60:
110-19 (1987).
Las etapas de la construcción de la línea celular
cooperadora V-D6R son en general idénticas a las de
la construcción de la línea celular V-A8L del
Ejemplo 3. En primer lugar, el orf D6R fue clonado en el plásmido
pCRII (InVitrogen, Inc.) mediante técnicas mediadas por PCR. El
plásmido resultante es el origen del fragmento génico D6R para la
construcción de un vector de expresión eucariótico y de un plásmido
de expresión en E. coli. La expresión del orf en E.
coli permite la producción rápida de la proteína para la
inmunización de conejos con el fin de obtener anticuerpos
anti-subunidad pequeña de VETF, los cuales son
utilizados posteriormente para identificar la proteína en las líneas
celulares permanentes. Para este fin, el orf D6R fue amplificado
como un fragmento de 1,9 kb mediante PCR utilizando los cebadores
oD6-1 (5'-CTG CAG AAT GAA TAC CGG
AAT TAT AGA TTT-3') (SEC ID Nº:21) y
oD6-2 (5'-CCC GGG TTA TGG AGA AGA
TAC CAC GTT-3') (SEC ID Nº:22), y clonado en pCRII,
teniendo como resultado el plásmido pCR-D6R.
Según se muestra en la Figura 7, el plásmido de
expresión en E. coli
pRSET-D6R-3' fue construido ligando
un fragmento de EcoRI de 1,6 kb procedente de
pCR-D6R en el vector pRSET-B
(InVitrogen, Inc.). El plásmido
pRSET-D6R-3' contiene un gen de
fusión que codifica una marca de 6 histidinas
N'-terminal fusionada a la subunidad pequeña de VETF
que carece de sus 100 primeros aminoácidos. La expresión bacteriana,
la purificación de la proteína recombinante mediada por la marca y
la producción de anticuerpos anti-subunidad pequeña
de VETF, se realizaron según se esquematizó en el Ejemplo 3. El
plásmido de expresión pSV-D6R-EDH
fue construido según sigue: El orf D6R del fragmento génico de 1,9
kb fue aislado de pCR-D6R cortando el plásmido con
PstI y SmaI y ligado en el vector pSVMCS#51 (Herlitschka,
supra) mediante clonaje forzado para obtener el plásmido
pSV-D6R. Los sitios de PstI y SmaI fueron
introducidos por los cebadores de PCR oD6-1
(5'-CTGCAGAATG AATACCGGAA
TTATAGATTT-3') (SEC ID Nº:21) y
oD6-2 (5'-CCCGGGTTAT GGAGAAGATA
CCACGTT-3') (SEC ID Nº:22), respectivamente. La
ligadura de un fragmento génico EcoRV-ClaI
procedente del plásmido pEDH1 conteniendo el "casete del gen
EDH" en pSV-D6R cortado con
SmaI-ClaI, produjo el plásmido de expresión
pSV-D6R-EDH. Ver la Figura 8.
En el plásmido
pSV-D6R-EDH, el orf D6R está
controlado por el promotor temprano de SV40. El marcador de
selección para obtener líneas celulares permanentes es un gen de
fusión que tiene el gen dhfr y el gen hph, según se describió en el
Ejemplo 1. Los procedimientos de transfección y selección para la
construcción de la línea celular de complementación fueron idénticos
a los del Ejemplo 3.
Para construir el virus
d-D6R-ZG, el plásmido
pCR-D6Rf-ZG fue clonado según está
mostrado esquemáticamente en la Figura 9. Las regiones (de entre 0,5
kb y 0,6 kb de tamaño) flanqueantes del orf D6R en ambos lados
fueron amplificadas mediante técnicas mediadas por PCR y subclonadas
en el plásmido pCRII para obtener
pCR-D6R-fl y
pCR-D6R-fr, respectivamente. Los
cebadores de la PCR para la amplificación de la región flanqueante
5' de D6R fueron oD6-3 (5'-TGA GAA
GAA TTG CCG TCG-3') (SEC ID Nº:23) y
oD6-5 (5'-GTC GAC GAT ATC TTC TAT
AAA TAT ATG AGC-3') (SEC ID Nº:24). Los cebadores
para la región flanqueante 3' de D6R fueron oD6-4
(5'-TAC AGT ACC CGA ATC TCT AC-3')
(SEC ID Nº:25) y oD6-6 (5'-ACA ATT
GGT ATT AAG TAT AAC GAC TCC-3') (SEC ID Nº:26). La
región flanqueante 5' de D6R, como un fragmento
SacI-SpeI de 0,6 kb procedente de
pCR-D6R-fl, fue ligada entre los
sitios de SacI y XbaI justo corriente abajo de la región flanqueante
5' de D6R en pCR-D6R-fl, produciendo
el plásmido pCR-D6R-flancos. Con el
fin de facilitar los procedimientos de clonaje posteriores, un
adaptador sintético que contenía los sitios de restricción poco
frecuentes SmaI, NotI, SfiI y RsrII fue ligado entre las regiones
flanqueantes de D6R en
pCR-D6R-flancos. Los
oligonucleótidos utilizados para la construcción del adaptador
fueron oA8-11 y oA8-12. Ver el
Ejemplo 3. El plásmido
pCR-D6R-flancos es por tanto
linealizado con SalI, tratado con la polimerasa Klenow y cortado con
MunI (ambos sitios de restricción son introducidos por los cebadores
de PCR oD6-5 y oD6-6,
respectivamente). El plásmido resultante, denominado pdD6R, es
ligado con un casete de dos genes de SmaI de 3,9 kb procedente del
plásmido pLGb descrito en el Ejemplo 1 para dar
pCR-D6Rf-ZG. En esta construcción,
el orf D6R es eliminado completamente con fin de impedir el rescate
del virus defectuoso por la línea celular de complementación debido
a recombinación homóloga.
Para la construcción del virus
d-D6R-ZG, el plásmido
pCR-D6Rf-ZG es insertado en el virus
vaccinia WR. El plásmido pCR-D6Rf-ZG
es utilizado para recombinación in vivo en células
CV-1. Primeramente, 5 x 10^{6} células
CV-1 son infectadas con 0,1 ufp/célula de vaccinia
WR, incubadas durante 1 hora, transfectadas con un precipitado de
fosfato de calcio (según Graham y van der Eb, supra)
conteniendo 20 \mug del plásmido
pCR-D6R-ZG y cultivadas durante 3
días. Esto tiene como resultado una solución madre bruta que
contiene virus de tipo salvaje (cooperadores) y virus defectuosos.
Para obtener soluciones madre puras de los virus defectuosos, se
llevan a cabo ensayos de placas en células V-D6R que
son capaces de complementar al virus defectuoso. Se prepara la
solución madre bruta de virus y se utiliza para ensayos de placas en
células V-D6R en presencia de selección por gpt
(Falkner y Moss, supra (1988)) y selección por placas azules
(Chakrabarti y col., supra). La purificación de placas es
repetida diez veces. Los poxvirus defectuosos purificados son
cultivados a mayor escala y examinados mediante transferencia
Southern. La ausencia de virus de tipo salvaje y la presencia de las
bandas pronosticadas confirma que se han formado los genomas
defectuosos correctos. Los ensayos de placas de los virus
defectuosos en las células de complementación y en las células de
tipo salvaje confirman que el rango de huéspedes de los virus
defectuosos está limitado a la línea celular de complementación.
Estudios en animales confirmaron que los virus defectuosos no
eran
patógenos.
patógenos.
La primera etapa fue la expresión del orf J1R en
E. coli (utilizando el sistema de vectores pRSET de
InVitrogen). En primer lugar, se construyó el plásmido
pCR-J1R mediante clonaje del producto de PCR de J1R
obtenido con los cebadores oJ1R-1
(5'-GCCATGGATC ACAACCAGTA TCTCTT-3')
(SEC ID Nº:27) y oJ1R-2
(5'-ACCCGGGTTA ATTAATTATT
GTTCACTTTA-3') (SEC ID Nº:28) en el vector pCRII. Un
fragmento NcoI-EcoRI fue insertado posteriormente en
pRSET-B produciendo el vector de expresión de E.
coli pRSET-J1R (Figura 10). Con este plásmido se
obtuvieron grandes cantidades de proteína J1R que, señaladamente, no
era inmunogénica en conejos. Se produjeron por tanto anticuerpos
contra un conjugado de un péptido sintético de J1R y la proteína
transportadora KLH para la identificación posterior de la proteína
en las líneas celulares permanentes. El péptido sintético con la
secuencia de aminoácidos SLATTAIDPIRYIDP, correspondiente a las
posiciones de aminoácidos 118 a 132 de la proteína J1R, fue acoplado
a KLH (KLH preactivada de Pierce, EE.UU.). El conjugado purificado
en adyuvante completo de Freund fue utilizado para inmunizar conejos
(100 mg de proteína por dosis, s.c. e i.m.). Después de un mes, los
animales fueron reforzados con la misma dosis y se monitorizó el
desarrollo de anticuerpos mediante transferencias
Western.
Western.
Las proteínas fueron detectadas por
transferencias Western. Las transferencias Western fueron realizadas
esencialmente según está descrito por Towbin y col., supra.
El primer anticuerpo era un anticuerpo anti-proteína
J1R producido en conejo utilizado a una dilución 1:100. El segundo
anticuerpo era un anti-IgG de conejo producido en
cabra acoplado a fosfatasa alcalina (BioRad, Inc.) utilizado a una
dilución 1:1000. Los reactivos (BCIP y NBT) y los protocolos de
tinción procedían de Promega, Inc. (EE.UU.).
Con el fin de obtener el plásmido de expresión
pSV-J1R-EDH (Fig. 11) para
transformación en las células Vero, se aisló del plásmido
pCR-J1R un fragmento génico
NcoI-SmaI de 0,5 kb que codificaba el gen J1R
completo. Los sitios de NcoI y SmaI fueron introducidos por los
cebadores de PCR oJ1R-1 y oJ1R-2
(ver anteriormente), respectivamente. Este fragmento fue ligado en
el vector de expresión pSV-Bbs cortado con BbsI (ver
el Ejemplo 1). La inserción de un fragmento génico
EcoRV-ClaI procedente del plásmido pEDH1 que
contenía el "casete del gen EDH" en pSV-J1R
cortado con SmaI-ClaI, produjo
pSV-J1R-EDH. Ver la Figura 11. En el
plásmido pSV-J1R-EDH, el orf J1R
está controlado por el promotor temprano de SV40. El marcador de
selección para la obtención de líneas celulares permanentes es un
gen de fusión que incluye el gen dhfr y el gen hph, según se
describió en el Ejemplo 1.
El plásmido
pSV-J1R-EDH fue transfectado a
células Vero de riñón de mono (ATCC Nº CCL 81) en un método de
acuerdo con Graham y van der Eb, supra, y las células
incubadas en medio selectivo (DMEM, 10% de suero bovino fetal, 250
\mug/ml de higromicina) y tratadas posteriormente según se
describió en el Ejemplo 1. Las líneas celulares permanentes
positivas para la fosfotransferasa de higromicina fueron
seleccionadas en presencia del antibiótico higromicina B. Después de
cinco pases, la integración del ADN foráneo fue demostrada mediante
PCR utilizando cebadores específicos para un segmento de 0,5 kb del
gen J1R. Se utilizaron transferencias Western para determinar si se
expresaba el gen de interés, la proteína J1R. Las líneas celulares
que expresaban los mayores niveles de proteína J1R fueron
caracterizadas adicionalmente mediante transferencia Southern y
utilizadas como la línea celular de complementación, y se
denominaron V-J1R.
Para construir el virus
d-J1R-ZG, el plásmido
pCR-J1Rf-ZG fue clonado según está
mostrado esquemáticamente en la Figura 12. Un fragmento génico de
1,5 kb que contenía el orf J1R y alrededor de 0,5 kb de secuencias
flanqueantes en ambos lados, fue amplificado del virus vaccinia
(cepa WR) por PCR y subclonado en el plásmido pCRII para obtener
pCR-J1Rf.
Los cebadores de la PCR fueron
oJ1-3 (5'-TCC ACA TCC ATG AGA TTG
AAT-3') (SEC ID Nº:29) y oJ1-4
(5'-CGA TTG ATA CAT ATC ATT ACC-3')
(SEC ID Nº:30). Se llevó a cabo también la eliminación del gen J1R
completo y de los primeros 40 nucleótidos del gen de la timidina
quinasa adyacente mediante técnicas mediadas por PCR. El plásmido
pCR-J1Rf completo, excluyendo las secuencias que
iban a ser eliminadas, fue amplificado por PCR, teniendo como
resultado un producto de 6 kb. El tratamiento con polinucleótido
quinasa y la religadura posterior del producto de la PCR produjo el
plásmido pCR-J1R-flancos. Los
cebadores oJ1-5 (5'-AACAATTGCA
TCATCTGCGA AGAACATCG-3') (SEC ID Nº:31) y
oJ1-6 (5'-CAGTTAACTT TTCAGGTAAA
AGTACAGAAT-3') (SEC ID Nº:32) que fueron empleados
para esta reacción introducen los sitios de restricción MunI y HpaI.
El plásmido fue cortado en estos sitios y el adaptador
(oA8-11 y oA8-12, según se describió
en el Ejemplo 3) fue insertado para obtener pdJ1R. De manera análoga
a la del Ejemplo 3, un casete de dos marcadores lac
Z-gpt fue ligado en el sitio de SmaI de pdJ1R,
teniendo como resultado el vector de recombinación
pCR-J1Rf-ZG. (Este plásmido contiene
solamente 40 pares de bases del gen J1R, en su extremo 5', que son
necesarios para la integridad del orf L5R adyacente en el virus
defectuoso).
Para la construcción del virus
d-J1R-ZG, el plásmido
pCR-J1R-ZG fue insertado en el virus
vaccinia WR. El plásmido pCR-J1Rf-ZG
fue utilizado para recombinación in vivo en células
CV-1. Primeramente, 5 x 10^{6} células
CV-1 fueron infectadas con 0,1 ufp/célula de
vaccinia WR, incubadas durante 1 hora, transfectadas con un
precipitado de fosfato de calcio (de acuerdo con Graham y van der
Eb, supra) que contenía 20 microgramos del plásmido
pCR-J1R-ZG y cultivadas durante 3
días.
Este procedimiento tuvo como resultado una
solución madre bruta que contenía virus de tipo salvaje (virus
cooperadores) y virus defectuosos. Para obtener soluciones madre
puras del virus defectuoso, se llevan a cabo ensayos de placas en
células V-J1R que son capaces de complementar al
virus defectuoso. Se preparó la solución madre bruta de virus y se
utilizó para ensayos de placas en células V-J1R en
presencia de selección por gpt (Falkner y Moss (1988), supra)
y selección por placas azules (Chakrabarti y col., supra),
alternando con ensayos de placas en células V-J1R
tk-negativas en presencia de BUdR (Mackett y col.,
supra). La purificación de placas se repitió diez veces. Los
poxvirus defectuosos purificados fueron cultivados a mayor escala y
examinados mediante transferencia Southern. La ausencia de virus de
tipo salvaje y la presencia de las bandas pronosticadas confirma que
se habían formado los genomas defectuosos correctos. Ensayos de
placas de los virus defectuosos en las células de complementación y
en células de tipo salvaje confirman que el rango de huéspedes de
los virus defectuosos está limitado a la línea celular de
complementación. Estudios en animales confirmaron que los virus
defectuosos no eran patógenos.
Se eligió el orf H4L para la complementación ya
que se habían generado mapas de mutaciones letales condicionales
sensibles a la temperatura de este gen. Seto y col.,
supra.
Las etapas de la construcción de la línea celular
cooperadora V-H4L son en general idénticas a las de
la construcción de la línea celular V-A8L del
Ejemplo 3. En primer lugar, el orf H4L fue clonado en el plásmido
pCRII (Invitrogen, Inc.) mediante técnicas mediadas por PCR. El
plásmido resultante es la fuente del fragmento del gen H4L para la
construcción del vector de expresión en células Vero
pSV-H4L-EDH, según se muestra en la
Figura 13. Se produjeron anticuerpos contra un conjugado de un
péptido sintético con KLH para identificar el producto del gen H4L
(RAP94) en las líneas celulares permanentes. El conjugado fue
preparado mediante la unión del péptido sintético KIYKNSFSEDHNNSLD,
correspondiente a las posiciones de aminoácidos 242 a 258 en el orf
H4L, Kane y Shuman, J. Virol. 66: 5752-62 (1992), a
KLH activada (kit de acoplamiento a KLH, Pierce, Inc. EE.UU.). Este
conjugado fue utilizado para la producción de anticuerpos
anti-H4L de manera análoga a la del Ejemplo 5.
Para la construcción del vector de expresión en
células Vero, el orf H4L fue amplificado como un fragmento de 2,4 kb
mediante PCR utilizando los cebadores oH4-1
(5'-ACC ATG GAC TCT AAA GAG ACT
AT-3') (SEC ID Nº:33) y oH4-2
(5'-CAA TTG CCC GGG TTA ATT AAT GAA ATT AAT CAT ATA
CAA CTC-3') (SEC ID Nº:34) y clonado en pCRII,
teniendo como resultado el plásmido pCR-H4L. El
plásmido de expresión pSV-H4L-EDH
fue construido según sigue: El orf H4L fue aislado como un fragmento
génico de 2,4 kb de pCR-H4L mediante el corte del
plásmido con NcoI y SmaI y ligado en el vector
pSV-Bbs (ver el Ejemplo 1) mediante clonaje forzado
para obtener el plásmido pCV-H4L. Los sitios de NcoI
y SmaI fueron introducidos por los cebadores de PCR
oH4-1 y oH4-2, respectivamente. La
ligadura de un fragmento génico EcoRV-SalI
procedente del plásmido pEDH1, que contenía el "casete del gen
EDH", en pSV-H4L cortado con
SmaI-SalI produjo el plásmido de expresión
pSV-H4L-EDH. Ver la Figura 13.
En el plásmido
pSV-H4L-EDH, el orf H4L está
controlado por el promotor temprano de SV40. El marcador de
selección para la obtención de líneas celulares permanentes es un
gen de fusión que incluye el gen dhfr y el gen hph, según se
describió en el Ejemplo 1. Los procedimientos de transfección y
selección para la construcción de la línea celular de
complementación se llevaron a cabo según se describió en el Ejemplo
3, excepto en que se utilizaron reactivos específicos para H4L.
Para construir el virus
d-H4L-ZG, el plásmido
pCR-H4Lf-Zg fue clonado según se
muestra esquemáticamente en la Figura 14. Las regiones (de entre 0,5
kb y 0,6 kb de tamaño) flanqueantes del orf H4L en ambos lados
fueron amplificadas mediante técnicas mediadas por PCR y subclonadas
en el plásmido pCRII para obtener
pCR-H4L-fl y
pCR-H4L-fr, respectivamente.
Los cebadores de la PCR para la amplificación de
la región flanqueante 5' de H4L fueron oH4-3
(5'-CCT TTA GGT CAG AA GAT CGC-3')
(SEC ID Nº:35) y oH4-5 (5'-GTC GAC
AAT TGT TAA AG TAC AAA CAA CTA GGA-3') (SEC ID
Nº:36). Los cebadores para la región flanqueante 3' de H4L fueron
oH4-4 (5'-GCT AAC ATC ATA CCC TCC
TG-3') (SEC ID Nº:37) y oH4-6
(5'-GTC GAC GTT AAC AGA AGC ATT GGA ATA CGC
AT-3') (SEC ID Nº:38). La región flanqueante 3' de
H4L, como un fragmento SalI-SpeI de 0,5 kb
procedente de pCR-H4L-fr, fue ligada
entre los sitios de SalI y XbaI justo corriente abajo de la región
flanqueante 5' de H4L en pCR-D6R-fl,
produciendo el plásmido
pCR-H4L-flancos.
Con el fin de facilitar los procedimientos de
clonaje posteriores, un adaptador sintético que contenía los sitios
de restricción poco frecuentes SmaI, NotI, SfiI y RsrII, fue ligado
entre las regiones flanqueantes de H4L en
pCR-H4L-flancos. Los
oligonucleótidos utilizados para la construcción del adaptador
fueron oA8-11 y oA8-12. El plásmido
pCR-H4L-flancos fue linealizado
posteriormente con MunI y HpaI (ambos sitios son introducidos por
los cebadores de PCR oH4-5 y oH4-6,
respectivamente). El plásmido resultante, denominado pdH4L, fue
ligado a un casete de dos genes de SmaI de 3,9 kb procedente del
plásmido pLGb descrito en el Ejemplo 1 para dar
pCR-H4Lf-ZG. En esta construcción el
orf H4L está eliminado completamente con el fin de impedir el
rescate del virus defectuoso por la línea celular de complementación
debido a recombinación homóloga.
La construcción del virus
d-H4L-ZG mediante recombinación
in vivo y purificación de placas, se realizó según el esquema
descrito en el Ejemplo 1.
El efecto de la inactivación de las proteínas del
huésped de vaccinia varía de tipo celular a tipo celular, lo cual
influye sobre la eficacia de la complementación y determina por
tanto el número de purificaciones de placas necesarias para obtener
soluciones madre puras del virus defectuoso y los títulos obtenibles
con las líneas celulares huésped. Con el fin de hacer que la
complementación sea más eficaz, el marco de lectura abierto esencial
que codifica la función de complementación es clonado corriente
abajo del promotor del gen de la proteína del choque térmico humana
de 70 kDa (Hsp70) (Hunt y Morimoto, supra). La transcripción
del gen Hsp70 es inducida por la infección con vaccinia y se ha
propuesto que la Hsp70 está implicada en el ensamblaje del virión de
vaccinia (Jindal y Young, supra).
La primera etapa es el clonaje del promotor de la
Hsp70 mediante técnicas de PCR. Los oligonucleótidos
oHS-1, 5'-TACGTATGGA GACCAACACC
CTTCC-3' (SEC ID Nº:39) y oHS-2,
5'-CCATGGATAT CGGGTTCCCT GCTCTCTGTC
GG-3' (SEC ID Nº:40) fueron utilizados junto con ADN
humano (Clontech, Inc.) como molde para obtener las secuencias
promotoras de la Hsp70 humana. El producto de la PCR fue clonado en
el vector pCRII (InVitrogen, Inc.) produciendo el plásmido
pCR-Hsp. El fragmento del promotor
SnaBI-NcoI fue utilizado para sustituir al promotor
de SV40 en el plásmido pSV-Bbs (ver el Ejemplo 1)
teniendo como resultado, después de la eliminación del intrón de
SV40 presente en este plásmido, el plásmido pHS. Este vector es
utilizado para insertar marcos de lectura abiertos, tales como I7L,
ligando el fragmento NcoI-SmaI de
pSV-I7L (Ejemplo 1) con pHS, produciendo el plásmido
pHS-I7L. Ver la Figura 15.
Para construir la línea celular de
complementación, se llevó a cabo el procedimiento de
cotransformación (Wigler, supra). Se utilizó un marcador de
selección adecuado, tal como el gen de resistencia a neomicina
presente en el plásmido pSV2-neo (Southern, P.J. y
Berg, P., J. Mol. Appl. Genet. 1: 327 (1982)), junto con el plásmido
pHS-I7L en un experimento de transfección en células
Vero. Las células fueron transfectadas de acuerdo con Graham y van
der Eb, supra, e incubadas en medio selectivo que incluía el
antibiótico G418 (DMEM, 10% de suero bovino fetal, 500 \mug/ml de
G418). Después de 10-14 días, las colonias eran
visibles. Estas colonias fueron expandidas, subclonadas dos veces y
caracterizadas posteriormente. Las líneas celulares fueron
caracterizadas adicionalmente mediante análisis por PCR para
detectar la presencia de la construcción génica de complementación.
Se utilizaron transferencias Western para mostrar que el gen de
interés, la proteína I7L, se expresaba tras la inducción. La línea
celular de complementación final fue denominada
VHsp-I7L. La línea celular fue caracterizada según
se describió en el Ejemplo 1. La construcción del virus defectuoso
d-I7L-ZG/Hsp se realizó según se
describió en el Ejemplo 1 para el virus
d-I7L-ZG, excepto en que se utilizó
la línea celular VHsp-I7L para la complementación y
en que se realizaron solamente cinco rondas de purificación de
placas para obtener el virus defectuoso.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: IMMUNO AG
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Industriestr. 67
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Wien
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: AUSTRIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): A-1221
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Poxvirus recombinantes con polinucleótidos foráneos en regiones esenciales
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 40
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco magnético flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30 (EPO)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLUCITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/235.392
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE REGISTRO: 29-ABRIL-1994
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGTACTCCAT GGAAAGATAT ACAGATTTAG
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATCCCGGGTT TTAGAGACTT TGAAGCTACT
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 40 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTAGGCTTTT GCAAAAAGCT CCTCGACCAT GGTGTCTTCA
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 40 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGCTTGAAGA CACCATGGTC GAGGAGCTTT TTGCAAAAGC
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGGAGTTAAT GAGGCCAATG GA
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGACATAGGTA TAGAATCCGG A
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 63 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGTTTAAACG GCGCGCCCGG GCTCGAGAGG CCTCTGCAGA TGCATCCATG
\hfill50
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGATCCGAA TTC
\hfill63
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 63 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAATTCGGAT CCCCATGGAT GCATCTGCAG AGGCCTCTCG AGCCCGGGCG
\hfill50
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCCGTTTAA ACT
\hfill63
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 48 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATCCTACGT ATCTAGAATT AATTAATGGC CAATTTAAAT GCCCGGGA
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 48 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAATTTCCCGG GCATTTAAAT TGGCCATTAA TTAATTCTAG ATACGTAG
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTCGTAAAAA TTGAAAAACT ATTCTAATTT ATTGCACGGT CGCGA
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 50 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCATGGTACGT ACCGTGCAAT AAATTAGAAT AGTTTTTCAA TTTTTACGAG
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 43 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAACTGCAGG ATGCGATATA TAGTAAGTCC GCAAATGGTA TTA
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGGAATTCAG GCCTGTTTAA TTAATTTGTG CTCTTC
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGCGCCGCTA CTAGCACTCC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 38 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAACGTTAAC ATTTATATCG TGGGGTAAAG TGAAAATC
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTGGAGAACT TGATACGCCG
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 43 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCATATGCAAT TGTAAATTAA ACAACTAAAT CTGTAAATAA ATA
\hfill43
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAACGGTCCGG CCCGGGCGGC CGCC
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAATTGGCGGC CGCCCGGGCC GGACCGTT
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTGCAGAATG AATACCGGAA TTATAGATTT
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCCGGGTTAT GGAGAAGATA CCACGTT
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGAGAAGAAT TGCCGTCG
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCGACGATA TCTTCTATAA ATATATGAGC
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTACAGTACCC GAATCTCTAC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACAATTGGTA TTAAGTATAA CGACTCC
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCCATGGATC ACAACCAGTA TCTCTT
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACCCGGGTTA ATTAATTATT GTTCACTTTA
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 29:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCCACATCCA TGAGATTGAA T
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 30:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGATTGATAC ATATCATTAC C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 31:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 31:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAACAATTGCA TCATCTGCGA AGAACATCG
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 32:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 32:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGTTAACTT TTCAGGTAAA AGTACAGAAT
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 33:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 33:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACCATGGACT CTAAAGAGAC TAT
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 34:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 34:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAATTGCCCG GGTTAATTAA TGAAATTAAT CATATACAAC TC
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 35:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 35:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCTTTAGGTC AGAAGATCGC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 36:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 36:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCGACAATT GTTAAAGTAC AAACAACTAG GA
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 37:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 37:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCTAACATCA TACCCTCCTG
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 38:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 38:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCGACGTTA ACAGAAGCAT TGGAATACGC AT
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 39:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 39:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTACGTATGGA GACCAACACC CTTCC
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 40:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 40:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCATGGATAT CGGGTTCCCT GCTCTCTGTC GG
\hfill32
Claims (20)
1. Un poxvirus defectuoso que carece de una
función impartida por una región esencial de su poxvirus parental,
siendo la región esencial una región del genoma del poxvirus que es
necesaria para la viabilidad y la infectividad del poxvirus
parental, comprendiendo dicho poxvirus defectuoso un polinucleótido
foráneo bajo el control transcripcional de un promotor del
poxvirus.
2. Un poxvirus defectuoso de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que dicho polinucleótido foráneo está
insertado en dicha región esencial.
3. Un poxvirus defectuoso de acuerdo con la
reivindicación 2, en el que dicha región esencial ha sido eliminada
de dicho poxvirus defectuoso.
4. Un poxvirus defectuoso de acuerdo con la
reivindicación 3, en el que un marcador sustituye a dicha región
esencial.
5. Un poxvirus defectuoso de acuerdo con la
reivindicación 4, en el que dicho polinucleótido foráneo está
insertado en dicho marcador.
6. Un poxvirus defectuoso de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 precedentes, donde dicho
poxvirus parental es vaccinia.
7. Un poxvirus defectuoso de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 precedentes, en el que
dicha región esencial es un marco de lectura abierto seleccionado
del grupo que consta de I7L, F18R, D13L, D6R, A8L, J1R, J3R, H4L,
A10L y A3L.
8. Un poxvirus defectuoso de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 precedentes, en el que
dicha región esencial es un marco de lectura abierto que codifica la
proteína de la envoltura de 14 kilodaltons o la proteína estructural
de 25 kilodaltons.
9. Un método para producir una proteína que
comprende la etapa de provisión de un poxvirus defectuoso que carece
de una función impartida por una región esencial de su poxvirus
parental, siendo la región esencial una región del genoma del
poxvirus que es necesaria para la viabilidad y la infectividad del
poxvirus parental, comprendiendo dicho poxvirus defectuoso un
polinucleótido foráneo bajo el control transcripcional de un
promotor del pox-
virus.
virus.
10. El método de acuerdo con la reivindicación 9,
en el que dicha etapa de provisión es llevada a cabo mediante la
inserción de dicho polinucleótido foráneo en dicha región esencial
de dicho poxvirus parental.
11. Un método de acuerdo con la reivindicación 9,
en el que dicha etapa de provisión es llevada a cabo mediante la
sustitución de dicha región esencial de dicho poxvirus parental por
dicho polinucleótido foráneo.
12. Un método de acuerdo con la reivindicación 9,
en el que dicha etapa de provisión es llevada a cabo mediante la
sustitución de dicha región esencial de dicho poxvirus parental por
un marcador.
13. Un método de acuerdo con la reivindicación
12, en el que dicho polinucleótido es insertado en dicho
marcador.
14. Un método de acuerdo con la reivindicación
12, en el que dicho polinucleótido sustituye a dicho marcador.
15. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 14 precedentes, en el que dicho marcador es
gpt.
16. Una vacuna que comprende un poxvirus
defectuoso que carece de una función impartida por una región
esencial de su poxvirus parental, siendo la región esencial una
región del genoma del poxvirus que es necesaria para la viabilidad y
la infectividad del poxvirus parental, conteniendo dicho poxvirus
defectuoso un polinucleótido foráneo bajo el control transcripcional
de un promotor del poxvirus.
17. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación
16, en la que dicho poxvirus parental es vaccinia.
18. Un método para producir una vacuna que
comprende la etapa de provisión de un poxvirus defectuoso que carece
una función impartida por una región esencial de su poxvirus
parental, siendo la región esencial una región del genoma del
poxvirus que es necesaria para la viabilidad y la infectividad del
poxvirus parental, conteniendo dicho poxvirus defectuoso un
polinucleótido foráneo bajo el control transcripcional de un
promotor del pox-
virus.
virus.
\newpage
19. Un método para producir una vacuna de acuerdo
con las reivindicaciones 16-17, en el que dicho
poxvirus parental es vaccinia.
20. La utilización de un poxvirus defectuoso de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para la
preparación de una vacuna.
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