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JP6941171B2 - ブタパルボウイルスおよびブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルスに対するワクチン、ならびにこれらを作製する方法 - Google Patents

ブタパルボウイルスおよびブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルスに対するワクチン、ならびにこれらを作製する方法 Download PDF

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Description

配列表
本出願は、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１〜１．８２５に従う配列表を含有する。本出願に付属の配列表は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる。
Ａ．発明の分野
第１の検討事項では、本発明は、ブタパルボウイルスおよび／またはブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルスにより引き起こされる疾患の臨床徴候を軽減することが可能な分離株に特異的なブタパルボウイルスおよびブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルスのワクチンに関する。第２の検討事項では、本発明は、さらに、殺ウイルス活性の低減を呈する免疫原性組成物を作製する方法、ならびにこのような免疫原性組成物に関する。
Ｂ．関連技術についての記載
ブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）とは、Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ科ウイルスのメンバーであり、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科ウイルスと併せて、Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ目ウイルスに属する。ＰＲＲＳＶは、約１５キロベース、一本鎖、プラスセンスのＲＮＡゲノムであって、９つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、すなわち、ＯＲＦ１ａ、ＯＲＦ１ａｂ、ＯＲＦ２ａ、ＯＲＦ２ａｂ、およびＯＲＦ３〜ＯＲＦ７を含むＲＮＡゲノムを伴うエンベロープウイルスである。ＯＲＦ１ａおよびＯＲＦ１ａｂは、ウイルスプロテアーゼであるｎｓｐ１、ｎｓｐ２、およびｎｓｐ４による自己切断およびトランス切断を介して、ウイルス非構造タンパク質（ｎｓｐ）へとプロセシングされる大型のポリタンパク質をコードする（Snijder and Meulenberg, 1998）。ＯＲＦ４は、ウイルスエンベロープ内に見出される主要糖タンパク質（ＧＰ５）および他の２つの副次的糖タンパク質（ＧＰ２ａおよびＧＰ３）に隣接する副次的糖タンパク質（ＧＰ４）をコードするが、ここで、前記糖タンパク質の全てが、感染性ウイルスの作製に重要である。
ＰＲＲＳＶは、雌ブタにおける、長期にわたる生殖障害、および成長するブタにおける呼吸器疾患を引き起こす、ブタにおいて経済的に最も重要な感染作用因子であると考えられる。ＰＲＲＳＶ感染には、ウイルスの免疫抑制的性質に帰せられる続発性細菌感染が併発することが多い。また、ＰＲＲＳＶウイルス血は、何週間にもわたり存続し、次いで、ウイルスは、リンパ系器官において、数カ月間にわたり検出しうることから、宿主の免疫応答が、ウイルスを除去することが困難である、または除去できないことが裏付けられる（Allende et al., 2000）。
同様の臨床症状を引き起こす、２つの別個のＰＲＲＳＶウイルス遺伝子型であって、ヌクレオチド配列レベルで、約４０％異なるウイルス遺伝子型である遺伝子型Ｉ（ＥＵ）および遺伝子型ＩＩ（ＵＳ）が存在する。北米（ＵＳ）原型株が、ＶＲ−２３３２株であるのに対し、欧州（ＥＵ）原型株は、レイスタッドウイルス株である。
ブタパルボウイルスとは、約５１００ヌクレオチドの一本鎖ＤＮＡ分子を含有する、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科内のＰｒｏｔｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ属のＰａｒｖｏｖｉｒｉｎａｅ亜科の自己複製ウイルスである（Cotmore et al., 2014: Arch Virol.: 159(5): 1239-1247; Molitor et al., 1984: Virology: 137(2):241-54）。ビリオンへは、ＤＮＡのマイナス鎖だけがパッケージングされている。ウイルスのゲノムは、３つのカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）、および１つの非構造タンパク質（ＮＳ１）をコードする。パルボウイルスのカプシドは、約２２〜２５ナノメートルの直径であり、ＶＰ１サブユニットおよびＶＰ２サブユニットから構成される。これらのタンパク質は、同じＲＮＡ分子の、代替的なスプライス形に由来し、したがって、配列が重複する。さらに、ブタパルボウイルスは、ネコ汎白血球減少症ウイルス、イヌパルボウイルス、および齧歯動物パルボウイルスとの、高レベルの配列類似性を呈する（Ranz et al., 1989: J. gen. Virol: 70:2541-2553）。
ブタパルボウイルス株には、ある株は、極めて病原性が大きく、他の株は、病原性が小さいか、または全く病原性ではないという差違は見られるが、ウイルスが、地方で確立されるか、または地方固有種となる場合は、病原性株が、集団内に広まると考えられる。
ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）感染は、世界中で、繁殖用ブタにおける生殖障害の一般的な原因である。血清学的研究は、ブタパルボウイルスは、世界の全てのブタ産出地域に広がり、動物のうちの、最大で８０％が、セロコンバージョンを示すことを示す。
ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）は、ブタにおいて、生殖障害を引き起こす結果として、妊娠した雌ブタにおける、死および胎仔のミイラ化、死産、ならびに他の生殖障害をもたらす（Joo & Johnson. 1976. Veterinary Bulletin 46, 653-660; Mengeling. 1978. J. Am. Vet. Med. Assoc. 172, 1291-1294）。
ＰＰＶは、感受性の（非免疫）未経産ブタおよび雌ブタが、妊娠時に感染すると、生殖障害を誘導する。これは、ウイルスが、疾患を引き起こす唯一の時点である。ブタにおける感染は、ウイルス摂取後または吸入後に生じる。次いで、ＰＰＶは、血流中を循環し、妊娠したブタでは、胎盤を超え、発生しつつある胚および胎仔に感染する。自然感染後には、おそらく、ブタの生涯にわたり存続する能動免疫が発現する。能動免疫が、妊娠の前に生じれば、発生しつつある子豚は、影響を受けない。出生時に、子豚は、雌ブタからの初乳中の母体免疫を受け、この母体免疫は、最大で２０週齢にわたり存続する。雌ブタにおける能動免疫レベルが高度であるほど、雌ブタが子豚へと受け渡す母体免疫の量も多い。その後、ＰＰＶの自然感染が生じる場合もある。
ブタにおいて、ＰＰＶにより引き起こされる疾患は、ＳＭＥＤＩ（死産、ミイラ化、胚死、および不妊の頭字語）と称することが多い。感染が、妊娠の０〜３０日目に生じると、胚の死が生じる結果として、同腹仔数の減少がもたらされる。妊娠の３０〜７０日目の感染後における、最も明白な特徴は、ミイラ化した子豚の出生である。ミイラ化とは、骨格が固まり始めた後における、子宮内で死亡する子豚の組織の、無菌的消化の過程である。感染が、妊娠の後期で生じる場合、ＰＰＶ感染はまた、死産および生まれつき虚弱なブタとも関連する。流産もまた、ＰＰＶ感染の結果でありうるが、この疾患の一般的な臨床徴候ではない。総じて、ＰＰＶ感染は、１年当たり、雌ブタ１頭当たりに生まれるブタの数を減少させる。
現在利用可能なＰＰＶワクチンは、天然ウイルスを、ブタ由来の初代細胞または確立された細胞株において増殖させることにより作製されている。この後、感染性ウイルスを単離し、化学的薬剤により不活化させて、最終的に、全細胞死滅ウイルスワクチンを得る。しかし、天然の感染性ウイルスを増殖させる、このような工程には、バイオセキュリティーおよび安全性考慮の点で問題がある。
組換えタンパク質に基づくサブユニットワクチンは、標的タンパク質のフォールディングが不正確なための免疫原性不良、または免疫系への提示不良を被る場合がある。さらに、全細胞死滅ワクチンが、天然ウイルスの全ての抗原を提示するのに対し、サブユニットワクチンでは、特異的アミノ酸配列に限定される。
先行技術では既に、組換えＰＰＶワクチンについて記載されている。しかし、現在までのところ、市販されているのは、全細胞死滅ワクチンだけである。したがって、これまでのところ、適切な組換えＰＰＶサブユニットワクチンは、開発されておらず、有効かつ安全であることが示されていないと考えられる。これまでに記載された、組換えＰＰＶサブユニットワクチンは、制御された実験室における抗原投与実験では調べられていない。査定された組換えＰＰＶサブユニットワクチンは、全細胞死滅ＰＰＶワクチンほどは働かなかった、または組換えＰＰＶサブユニットワクチンは安全でなかった（副作用を示した）。
ワクチン株と、遺伝子的かつ抗原的に異なる、ＰＰＶの野生分離株が同定されている。ＰＰＶ遺伝子型２ウイルスである、ＰＰＶ−２７ａは、ＰＰＶ−２７ａに感染した雌ブタの胎仔における、ＰＰＶの他の株、例えば、ＰＰＶ−ＮＡＤＬ−２に感染した雌ブタと比較した、大きな死亡率（８５％）により裏付けられる通り、実験的感染後の、妊娠した未経産ブタにおいて、高度に強毒性である。しかし、現在利用可能な、ＰＰＶに対する市販のワクチンは、３０年ほど前に単離されたＰＰＶ遺伝子型１株の、全ウイルス不活化調製物に基づく（Jozwik et al 2009; Journal of General Virology; 90; 2437-2441）。
さらなる先行技術は、以下の通りである。
Adriaan F.G. Antonis. “A novel recombinant virus-like particle vaccine for prevention of porcine parvovirus-induced reproductive failure” Vaccine 24 (2006) 5481-5490
Chen Y. Guo W. “A novel recombinant pseudorabies virus expressing parvovirus VP2 gene: Immunogenicity and protective efficacy in swine” Virology Journal 2011, 8:307
Merenga et al. “Large scale production and downstream processing of a recombinant porcine parvovirus vaccine” Appl Microbiol Biotechnol. 2002 Jun;59(1):45-50. Epub 2002 Apr 16
A. Jozwik, J. Manteufel, H.-J. Selbitz and U. Truyen. Vaccination against porcine parvovirus protects against disease, but does not prevent infection and virus shedding after challenge infection with a heterologous virus strain. Journal of General Virology (2009), 90, 2437-2441
中国特許出願第ＣＮ１０２４８８８９５号は、ブタサーコウイルス、ブタパルボウイルス、およびＰＲＲＳＶからなる三重ウイルス様粒子ワクチンについて開示している。この三重ＶＬＰワクチンは、ＰＣＶ−２主要構造タンパク質であるＣＡＰタンパク質、ＰＰＶ ＶＰ２タンパク質のエピトープ、およびＰＲＲＳＶ ＧＰ５タンパク質のエピトープを含有する。
ロシア特許出願第２００４１０８４８４号は、ＰＲＲＳＶおよびＰＰＶに対する不活化ワクチンについて開示している。この不活化ワクチンは、継代細胞培養物である、Ｍａｒｃ−１４５中で複製され、アミノエチルエチレンイミン（ＡＥＥＩ）で不活化させた、ＰＲＲＳウイルス株に由来する抗原材料と、継代ＹＰＫ細胞培養物中で複製され、ＡＥＥＩで不活化させた、ＰＰＶ株に由来する抗原材料とを含有する。
中国特許出願第ＣＮ１０４２８８７６０号は、免疫量の２型ブタサーコウイルス抗原、免疫量のＰＲＲＳＶ抗原、およびＰＰＶ抗原を含むワクチン組成物について開示している。
中国特許出願第ＣＮ１０２７２７８８１号は、高度に病原性のＰＲＲＳ ＪＸＡＩ−Ｒ株と、ＰＰＶ二重生ワクチンとについて開示している。
Puig et al. (http://info.hipra.com/DOCS/UNISTRAIN/PUBLICATIONS/ESPHM-2015/1-Clinical-protection.pdf) relate to vaccination of the mixed administration of the inactivated ERYSENG Parvo and inactivated UNISTRAIN PRRS vaccines manufactured by Hipra
Zeew EJL et al. (Journal of General Virology 2007, 88(2): 420-427) describes a study of the virulence and cross-neutralitzation capability of recent parvovirus field isolates and vaccine viruses in experimentally infected pregnant gilts
米国特許出願２０１４／０３２２２６７号は、交差保護における使用のための、ＰＣＶ２Ａ亜型（ＰＣＶ２Ａ）のＯＲＦ２タンパク質に関する。
欧州特許出願第２，４６０，８１８号は、ＰＣＶ２免疫原性組成物およびこのような組成物を作製する方法に関する。
米国特許第７，７００，２８５号は、ＰＣＶ２免疫原性組成物およびこのような組成物を作製する方法に関する。
ＰＣＴ特許出願第ＷＯ２０１３／０２４１１３号は、インフルエンザＨ５ワクチンに関する。
米国特許出願２０１５／０２８３２２９号は、ブタ流行性下痢ウイルスワクチンに関する。
先行技術の欠点は、例えば、（ｉ）従来の死滅ワクチン中のＰＰＶ構成要素が、完全に不活化していない（したがって、群れの中に、生ＰＰＶを導入する）ことの懸念；（ｉｉ）ＰＰＶの異種株に対する交差保護の欠如；繁殖適齢期の未経産ブタおよび雌ブタならびに胎仔を、ＰＰＶおよびＰＲＲＳＶに関連する生殖疾患から防御するワクチン接種スキームの欠如である。
ＰＲＲＳＶおよび／またはＰＰＶの感染に対する利用が成功する、ＰＲＲＳＶおよびＰＰＶの新たな組合せおよび／または併用ワクチンが必要とされている。通常はある程度の殺ウイルス活性を呈する組成物の殺ウイルス活性を軽減する新規の方法；ならびに殺ウイルス活性が低減されているか、またはこれを伴わない免疫原性組成物もまた、必要とされている。
上記の技術的問題に対する解決は、本明細書で開示される請求項および条項において特徴づけられる記載および実施形態により達成される。
したがって、その異なる態様における本発明は、本明細書で開示される請求項および条項に従い実施される。
本発明の第１の検討事項
第１の検討事項では、本発明は、
ａ）少なくとも１つのブタパルボウイルス（ＰＰＶ）抗原であって、ＰＰＶに含有される、任意の抗原である、少なくとも１つのＰＰＶ抗原と、
ｂ）少なくとも１つのブタ繁殖呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）ウイルス抗原であって、ＰＲＲＳウイルスに含有される、任意の抗原である、少なくとも１つのＰＲＲＳウイルス抗原と
を含む免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せに関する。
本発明は、さらに、本明細書で記載および／もしくは特許請求される、免疫原性組成物もしくは組合せワクチンもしくは組合せを含むキットに関する。
本発明は、さらに、医薬、好ましくは、ワクチンを調製するための、本明細書で記載および／もしくは特許請求される、免疫原性組成物もしくは組合せワクチンもしくは組合せ、または本明細書で記載および／もしくは特許請求されるキットの使用に関する。
有利なことには、本発明により提供される実験データは、本発明のＰＰＶ ＶＰ２サブユニットワクチン成分が、胎仔において、安全であり、かつ、ウイルス血およびＰＰＶ感染を防止するのに効果的であることを開示する。さらに、本発明により提供される実験データは、本発明のＰＰＶ ＶＰ２サブユニットワクチン成分が、ワクチンが異種北米抗原投与株ならびに異種欧州抗原投与株に対して防御するので、広範な保護スペクトルを有することを開示する。
有利なことには、本発明により提供される実験データは、本発明のＰＰＶ ＶＰ２サブユニットワクチン成分が、完全死滅ウイルスと同様に効果的であることを開示する。ＰＰＶ ＶＰ２から構成される組換えサブユニットワクチンを用いることにより、大がかりな不活化工程（完全死滅ウイルスワクチンを作出する場合、天然ＰＰＶを不活化させるために必要である）を回避することができて、有利であろう。
本発明の根底をなすさらなる利点は、例えば、（ｉ）動物へと投与されるワクチン注射回数の低減であり、これにより、動物のストレスを軽減して、動物の福利を増大させること；（ｉｉ）人員の削減；（ｉｉｉ）単独投与と同じ有効性；（ｉｖ）両方の構成要素が、妊娠ブタにおける生殖疾患に対処する場合のワクチンのタイミング；（ｖ）異種ＰＰＶ株による抗原投与後の、ワクチン接種された未経産ブタにおける、ＰＰＶウイルス血の防止；（ｖｉ）ＰＰＶ抗原投与後の、ワクチン接種群における、死産数およびミイラ化子豚数の低減；（ｖｉｉ）ＰＰＶでワクチン接種された雌ブタにおける、胎仔総数の増大；（ｖｉｉｉ）ＰＰＶ抗原投与後の、ＰＰＶでワクチン接種された子豚の１００％が防御されること；（ｉｘ）免疫持続期間（ＤＯＩ）：６カ月間；（ｘ）ＲｅｐｒｏＣｙｃ（登録商標）ＰＲＲＳ ＥＵおよび混合型ＲｅｐｒｏＣｙｃ（登録商標）ＰＲＲＳ ＥＵ＋ＰＰＶ ＶＰ２のいずれも、抗原投与後におけるウイルス負荷およびウイルス血性例比率の低減に基づき、効果的であったこと；（ｘｉ）ＰＲＲＳＶによるワクチン接種の有効性に対する干渉の欠如が裏付けられたこと；（ｘｉｉ）ＲｅｐｒｏＣｙｃ（登録商標）ＰＲＲＳ ＥＵについて、４週間後における免疫の発生を確立しえたこと；（ｘｉｉｉ）Ｉｎｇｅｌｖａｃ（登録商標）ＰＲＲＳ ＭＬＶとの組合せワクチン（１０μｇのＰＰＶ ＶＰ２＋Ｅｒｙ）が、妊娠後４０日目（４０ｄＧ）において、ウイルス血および胎仔のＰＰＶ感染を防止するのに効果的であると裏付けられたことである。
本発明の第２の検討事項
第２の検討事項では、本発明は、組換えタンパク質を含む免疫原性組成物を作製する方法であって、以下の順序で、
（ｉ）・第１の液体、
・組換えタンパク質、および／または複数の前記組換えタンパク質から構成される四次構造、ならびに
・前記組換えタンパク質をコードする核酸配列を含むベクター
を含む混合物を用意する／得るステップと；
（ｉｉ）第２の液体を、ステップ（ｉ）の混合物へと添加するステップであって、第２の液体が、第１の液体と異なるステップと；
（ｉｉｉ）さらなる第２の液体を、ステップ（ｉｉ）から得られる混合物へと、さらに添加し、第１の液体および／または第２の液体の一部を、このような、組み合わされた混合物から除去することにより、混合物中の、組換えタンパク質、および／または複数の前記組換えタンパク質から構成される四次構造を洗浄し、任意選択で、これを最終的に濃縮するステップと；
（ｉｖ）不活化剤を、ステップ（ｉｉｉ）から得られる混合物へと添加することにより、ベクターを不活化させるステップと；
（ｖ）中和剤を、ステップ（ｉｖ）から得られる混合物へと添加することにより、不活化剤を中和するステップと
を含む方法に関する。
本発明は、さらに、上記の、ステップ（ｉ）の混合物が、
（ａ）培養物中の感受性の細胞への、前記組換えタンパク質、および／または複数の前記組換えタンパク質から構成される四次構造をコードする核酸配列を含むベクターの感染を可能とするステップであって、前記組換えタンパク質、および／または複数の前記組換えタンパク質から構成される四次構造を、前記ベクターにより発現させるステップと、
（ｂ）その後、組換えタンパク質、および／または複数の前記組換えタンパク質から構成される四次構造を、細胞培養物から回収するステップであって、少なくとも１つのフィルター、より好ましくは、２つのフィルターを通す精密濾過を好ましくは含む分離ステップを介して、細胞破砕物を、組換えタンパク質、および／または複数の前記組換えタンパク質から構成される四次構造から分離することが好ましく、少なくとも１つのフィルターが、好ましくは、組換えタンパク質、および／または複数の前記組換えタンパク質から構成される四次構造より大きな小孔サイズを有し、特に、約０．１μｍ〜約４μｍの小孔サイズを有するステップと
を含む手順により得られる、本明細書で記載および／または特許請求される方法に関する。
ＰＰＶ抗原調製物について述べると、清明化の後で、かつ、透析濾過の前に、３７℃において、バキュロウイルスの不活化を実施したところ、高度の沈殿（凝集）が観察された。この凝集は、ＰＰＶ抗原に関連しないが、不活化反応速度試験および殺ウイルス試験に干渉すると考えられる。予備的データは、培養物清明化の後で、かつ、バキュロウイルス不活化の前における透析濾過工程が、不活化工程中の、ＰＰＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）採取物の凝集の程度を、大幅に低減することを示唆する。データは、凝集の程度が、時間経過にわたり、高温（３７℃）で強められ、低温（２７℃または４℃）で最小化することを示す：３７℃における、バキュロウイルス不活化の前の透析濾過工程は、加えて、不活性化剤である、中和剤のチオ硫酸ナトリウムの殺ウイルス活性およびＥｘＣｅｌｌ ４２０の培地反応も消失させる。妥当性が確認された工程は、不活化バキュロウイルスが発現させるＰＰＶ ＶＬＰ生成物が、ＰＲＲＳＶワクチンに対して、一貫して、非殺ウイルス性であったことを確認する。このようなＰＰＶ ＶＬＰワクチンは、殺ウイルス効果の欠失に基づき、ＰＲＲＳＶと混合した後で、特に、有利な長期安定性を保有し、これにより、ＰＰＶ構成要素およびＰＲＲＳＶ構成要素の両方を、投与の前に、新たに混合し、かつ／または使用しやすい投与形態（例えば、組合せワクチンまたは組合せキット）を市販化することを可能とする。
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明のある特定の態様をさらに裏付けるために組み入れられる。これらの図面のうちの１つまたは複数を、本明細書に提示される具体的な実施形態についての詳細な記載と組み合わせて参照することにより、本発明をよりよく理解することができる。
群および日ごとの、ＰＲＲＳＶウイルス血（ｑＰＣＲ、１ｍＬ当たりのｌｏｇ１０ ＧＥ）を示す図である。 群ごとの、ＰＲＲＳＶウイルス血（ｑＰＣＲ、１ｍＬ当たりのｌｏｇ10 ＧＥ）についての曲線下面積（ＡＵＣ）を示す図である。 群および日ごとの、幾何平均によるＰＰＶ ＨＩ力価を示す図である。
本発明の態様について記載する前に、本明細書および付属の特許請求の範囲において使用される、文脈により、そうでないことが明確に指示されない限りにおいて、単数形の「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、および「その」は、複数の指示対象を含むことについて言及しなければならない。したがって、例えば、「抗原」への言及は、複数の抗原を含み、「ウイルス」への言及は、１つまたは複数のウイルス、および当業者に公知のこれらの同等物などへの言及である。そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。本発明の実施または試行では、本明細書で記載される方法および材料と同様または同等な、任意の方法および材料を使用しうるが、ここでは、好ましい方法、デバイス、および材料について記載する。本明細書で言及される全ての刊行物は、本発明との関連で使用されうる、刊行物中で報告されている細胞株、ベクター、および方法について記載および開示する目的で、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書におけるいかなることがらも、本発明が、既存の発明によるこのような開示に先行する権利がないことの容認としてはみなされないものとする。
本発明の第１の検討事項
一態様では、本発明は、
（ａ）少なくとも１つのブタパルボウイルス（ＰＰＶ）抗原であって、ＰＰＶに含有される、任意の抗原である、少なくとも１つのＰＰＶ抗原と、
（ｂ）少なくとも１つのブタ繁殖呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）ウイルス抗原であって、ＰＲＲＳウイルスに含有される、任意の抗原である、少なくとも１つのＰＲＲＳウイルス抗原と
を含む免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せに関する。
当業者には、「ブタパルボウイルス」または「ＰＰＶ」という用語が周知である。しかし、「ブタパルボウイルス」は、一本鎖ＤＮＡ分子を含有する、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科内のＰａｒｖｏｖｉｒｕｓ属の自己複製ウイルスである。ウイルスのゲノムは、３つのカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）、および１つの非構造タンパク質（ＮＳ１）をコードする。ブタにおいて、ＰＰＶにより引き起こされる疾患は、ＳＭＥＤＩ（死産、ミイラ化、胚死、および不妊の頭字語）と称することが多い。本発明の範囲内の「ブタパルボウイルス」という用語は、ブタパルボウイルス、ならびにＰａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科内のＰｒｏｔｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ属のＰａｒｖｏｖｉｒｉｎａｅ亜科の、全ての株、遺伝子型、および血清型を包含する。
当業者には、「ブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルス」または「ＰＲＲＳウイルス」または「ＰＲＲＳＶ」という用語が周知である。「ブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルス」とは、Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ科ウイルスのメンバーであり、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科ウイルスと併せて、Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ目ウイルスに属し、約１５キロベース、一本鎖、プラスセンスのＲＮＡゲノムであって、９つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、すなわち、ＯＲＦ１ａ、ＯＲＦ１ａｂ、ＯＲＦ２ａ、ＯＲＦ２ａｂ、およびＯＲＦ３〜ＯＲＦ７を含むＲＮＡゲノムを伴うエンベロープウイルスである。ＯＲＦ１ａおよびＯＲＦ１ａｂは、ウイルスプロテアーゼである、ｎｓｐ１、ｎｓｐ２、およびｎｓｐ４による自己切断およびトランス切断を介して、ウイルス非構造タンパク質（ｎｓｐ）へとプロセシングされる、大型のポリタンパク質をコードする（Snijder and Meulenberg, 1998）。ＯＲＦ４は、ウイルスエンベロープ内に見出される、主要糖タンパク質（ＧＰ５）および他の２つの副次的糖タンパク質（ＧＰ２ａおよびＧＰ３）に隣接する副次的糖タンパク質（ＧＰ４）をコードするが、ここで、前記糖タンパク質の全ては、感染性ウイルスの作製に重要である。同様の臨床症状を引き起こす、２つの別個のＰＲＲＳＶウイルス遺伝子型であって、ヌクレオチド配列レベルで、約４０％異なるウイルス遺伝子型である、遺伝子型Ｉ（ＥＵ）および遺伝子型ＩＩ（ＵＳ）が存在する。北米（ＵＳ）原型株が、ＶＲ−２３３２株であるのに対し、欧州（ＥＵ）原型株は、レイスタッドウイルス株である。本発明の範囲内の、「ブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルス」という用語は、ＰＲＲＳＶの、全ての株、遺伝子型、および血清型を包含する。
ＰＲＲＳＶに関する「遺伝子型Ｉ」および「遺伝子型ＩＩ」という用語は、ＰＲＲＳＶの文脈にある文献で頻繁に使用される、「遺伝子型１」および「遺伝子型２」という用語、または「１型」および「２型」という用語と同義であることが理解される。
本発明の範囲内の「少なくとも１つのブタパルボウイルス（ＰＰＶ）抗原」および「少なくとも１つのブタ繁殖呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）ウイルス抗原」という用語は、単一のＰＰＶ抗原および／またはＰＲＲＳＶ抗原から、多数の抗原を含む全ウイルスまでの、あらゆる抗原を包含する。
別の態様では、本発明は、ＰＰＶが、弱毒化生／改変生ＰＰＶウイルス、死滅／不活化ＰＰＶウイルス、死滅／不活化ＰＰＶ株０１４、ブタパルボウイルスのドイツ野生分離株であるＰＰＶ−２７ａおよびＰＰＶ−１４３ａ、ならびにブタパルボウイルスのワクチンウイルスであるＰＰＶ−ＮＡＤＬ−２およびＰＰＶ−ＩＤＴ（ＭＳＶ）からなる群から選択される、本明細書で記載および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せに関する。
本発明では、「生弱毒化」および「改変生」という用語は、互換的に使用され、特に、ＰＰＶおよび／もしくはＰＲＲＳＶに対する、従来型の、複数代にわたる細胞株の継代により達成され、かつ／または遺伝子操作により達成される、ＰＰＶおよび／またはＰＲＲＳＶ、特に、野生型ＰＰＶウイルスおよび／または野生型ＰＲＲＳウイルスの毒力の低減に関し、この場合、「毒力」とは、病原性の程度であることが理解され、「病原性」とは、例えば、生殖障害など、宿主または宿主の後代における臨床徴候を誘導するウイルスの能力を対象とする。
本発明の範囲内の、「死滅させた」または「不活化させた」という用語は、適切な対象に感染する能力を有さず（生ウイルスと対比される）、かつ／または天然ウイルスと比較して、それらの感染性が与えられていないＰＰＶおよび／またはＰＲＲＳＶに関する。特に、死滅／不活化ウイルスは、その天然宿主細胞に感染しえない（もはや）。
別の態様では、本発明は、少なくとも１つのＰＰＶ抗原が、１つまたは複数のＰＰＶサブユニットである、本明細書で記載および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せに関する。
別の態様では、本発明は、少なくとも１つのＰＰＶサブユニットが、ＰＰＶウイルスタンパク質２（ＶＰ２）であり、好ましくは、ＰＰＶ ＶＰ２が、唯一のＰＰＶ抗原である、本明細書で記載および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せに関する。
「ウイルスタンパク質２」または「ＶＰ２」という用語は、ブタパルボウイルスのカプシドタンパク質であるＶＰ２に関する。当業者には、「ウイルスタンパク質２」または「ＶＰ２」という用語が周知である。
「タンパク質」、「アミノ酸」、および「ポリペプチド」という用語は、互換的に使用される。「タンパク質」という用語は、天然におけるアミノ酸ならびにこれらの誘導体から構成される、アミノ酸残基の配列を指す。当技術分野では、天然におけるアミノ酸が周知であり、生化学の標準的な教科書に記載されている。アミノ酸配列内では、アミノ酸残基は、ペプチド結合により接続される。さらに、２つのアミノ酸配列を、カルボキシル末端（Ｃ末端）およびアミノ末端（Ｎ末端）と称する。「タンパク質」という用語は、本質的に精製されたタンパク質、またはこれに加えて、他のタンパク質を含むタンパク質調製物を包含する。さらに、用語はまた、タンパク質断片にも関する。さらに、用語は、化学修飾タンパク質を含む。このような修飾は、人工的修飾の場合もあり、リン酸化、グリコシル化、ミリストイル化など、天然における修飾の場合もある。
別の態様では、本発明は、ＰＰＶ ＶＰ２が、
・２２８位のアミノ酸において、グルタミン酸（ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄまたはｇｌｕｔａｍａｔｅ）残基を有し、かつ／または
・４１４位のアミノ酸において、セリン残基を有し、かつ／または
・４１９位のアミノ酸において、グルタミン残基を有し、かつ／または
・４３６位のアミノ酸において、トレオニン残基
を有し、
アミノ酸位置の番号付けが、野生型ＰＰＶ ＶＰ２のアミノ酸配列を指す、本明細書で記載および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せに関する。
「アミノ酸位置の番号付けが、野生型ＰＰＶ ＶＰ２のアミノ酸配列を指す」という用語は、全長野生型ＰＰＶ ＶＰ２タンパク質のアミノ酸配列を指す、アミノ酸位置の番号付けに関する。好ましくは、本明細書で言及されるアミノ位置の番号付けは、５７９アミノ酸残基を有し、（Ｎ末端の）アミノ酸１位において、メチオニン残基を含む、野生型ＰＰＶ ＶＰ２タンパク質配列を指す。「アミノ酸位置の番号付けが、野生型ＰＰＶ ＶＰ２のアミノ酸配列を指す」という用語は、配列番号１に例示的に示される、野生型ＰＰＶ ＶＰ２（ＰＰＶ ２７ａ ＶＰ２）を包含する。
別の態様では、本発明は、ＰＰＶ ＶＰ２が、
・２５位のアミノ酸において、イソロイシン残基を有し、かつ／または
・３６位のアミノ酸において、セリン残基を有し、かつ／または
・３７位のアミノ酸において、イソロイシン残基
をさらに有し、
アミノ酸位置の番号付けが、野生型ＰＰＶ ＶＰ２のアミノ酸配列を指す、本明細書で記載および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せに関する。
別の態様では、本発明は、アミノ酸位置の番号付けが、配列番号１に示されるアミノ酸配列を指す、本明細書で記載および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せに関する。
別の態様では、本発明は、ＰＰＶ ＶＰ２が、組換えＰＰＶ ＶＰ２である、本明細書で記載および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せに関する。
本明細書で使用される「組換え」という用語は、特に、組換えＤＮＡ法により作製されるポリペプチドなどの組換えＤＮＡ分子から発現するタンパク質分子を指す。このような技法の例は、発現させるタンパク質（例えば、ＰＰＶ ＶＰ２）をコードするＤＮＡを、適切な発現ベクター、好ましくは、バキュロウイルス発現ベクターへと挿入し、次にこれを使用して、ＤＮＡによりコードされるタンパク質またはポリペプチドを作製するように、宿主細胞にトランスフェクトする、または、バキュロウイルス発現ベクターの場合には、これに感染させる場合を含む。したがって、本明細書で使用される「組換えＰＰＶ ＶＰ２」という用語は、特に、組換えＤＮＡ分子から発現するタンパク質分子を指す。
別の態様では、本発明は、ＰＰＶ ＶＰ２が、組換えバキュロウイルスにより発現させたＰＰＶ ＶＰ２である、本明細書で記載および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せに関する。
当業者には、「バキュロウイルス」という用語が周知である。本明細書で使用される「バキュロウイルス」とは、特に、前記タンパク質を発現させるようにデザインされた組換えバキュロウイルスベクターを使用して、昆虫細胞内で所望のタンパク質を作製するための系を意味する。バキュロウイルス発現系は、一般に、昆虫細胞内の組換えタンパク質の発現を達成するのに必要な、全てのエレメントを含み、典型的に、所望のタンパク質を発現させるように、バキュロウイルスベクターを操作することと、操作されたバキュロウイルスベクターの、昆虫細胞への導入と、所望のタンパク質を発現させるように、操作されたバキュロウイルスベクターを含有する昆虫細胞を、適切な増殖培地中で培養することと、タンパク質の回収とを伴う。典型的に、バキュロウイルスベクターの操作は、非必須ウイルス遺伝子のプロモーターの後方に、選択された遺伝子のコード配列を挿入されている組換えバキュロウイルスの構築および単離を伴い、この場合、現在使用されているバキュロウイルス発現系の大半は、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の配列に基づく（（Virology 202 (2), 586-605 (1994)、ＮＣＢＩ受託番号：ＮＣ＿００１６２３）。当技術分野では、バキュロウイルス発現系が周知であり、例えば、“Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual” by David R. O'Reilly, Lois Miller, Verne Luckow, pub. by Oxford Univ. Press (1994), “The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide” by Linda A. King, R. D. Possee, published by Chapman & Hall (1992)において記載されている。組換えタンパク質を作製するためのバキュロウイルス系の、例示的な非限定例については、例えば、ＷＯ２００６／０７２０６５において記載されている。
好ましいバキュロウイルスベクターは、特に、作製細胞が、昆虫細胞であるならば、ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）またはＤｉａｍｏｎｄＢａｃ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）などのバキュロウイルスを含む。バキュロウイルス発現系が好ましいが、当業者により、他の発現系も、本発明の目的、すなわち、細胞培養物の上清への、ＰＰＶ ＶＰ２の発現のために働くことが理解される。このような他の発現系は、ＰＰＶ ＶＰ２の、培地への発現を引き起こすために、シグナル配列の使用を必要としうる。
別の態様では、本発明は、ＰＰＶ ＶＰ２が、配列番号１、配列番号２、および／または配列番号５〜１６のアミノ酸配列と、少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、本明細書で開示および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せに関する。
別の態様では、本発明は、ＰＰＶ ＶＰ２が、配列番号１、配列番号２、および／または配列番号５〜１６のアミノ酸配列と、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、本明細書で開示および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せに関する。
別の態様では、本発明は、ＰＰＶ ＶＰ２が、配列番号１、配列番号２、または配列番号５〜１６のアミノ酸配列を含むか、もしくはこれからなるか、または、配列番号１、配列番号２、もしくは配列番号５〜１６に由来する、少なくとも２１０個、少なくとも２５０個、もしくは少なくとも３００個の連続アミノ酸残基を有する任意の断片を含むか、もしくはこれからなる、本明細書で開示および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せに関する。
別の態様では、本発明は、ＰＰＶ ＶＰ２が、配列番号１、配列番号２、または配列番号５〜１６のアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、本明細書で開示および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せに関する。
別の態様では、本発明は、ＰＰＶ ＶＰ２が、配列番号１、配列番号２、および／または配列番号５〜１６のアミノ酸配列と、少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によりコードされる、本明細書で開示および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せに関する。
別の態様では、本発明は、ＰＰＶ ＶＰ２が、配列番号１、配列番号２、および／または配列番号５〜１６のアミノ酸配列と、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によりコードされる、本明細書で開示および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せに関する。
別の態様では、本発明は、ＰＰＶ ＶＰ２が、配列番号１、配列番号２、または配列番号５〜１６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によりコードされる、本明細書で開示および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せに関する。
配列番号４は、コドンを最適化させたＰＰＶ ２７ａ ＶＰ２のヌクレオチド配列であって、グリシンリピートから構成される、ＶＰ２コード領域を挟むように、２つのＣｌａＩ制限酵素部位（アミノ酸２５位は、イソロイシン残基であり、アミノ酸３６位は、セリン残基であり、アミノ酸３７位は、イソロイシン残基である）を有するよう、さらに修飾されたヌクレオチド配列である。ＣｌａＩ部位は、ＶＰ２コード領域を破壊しない形で導入した。配列番号２は、配列番号４に対応するタンパク質配列である。配列番号３は、コドンを最適化させたＰＰＶ ２７ａ ＶＰ２のヌクレオチド配列（ＣｌａＩ制限酵素部位を伴わない）である。配列番号１は、配列番号３に対応するタンパク質配列である。
本明細書では、「核酸」または「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」または「ポリヌクレオチド」という用語は、互換的に使用され、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、または誘導体を含むポリヌクレオチドを指す。用語は、一本鎖ポリヌクレオチドならびに二本鎖ポリヌクレオチドを包含する。本発明の核酸は、単離ポリヌクレオチド（すなわち、その天然の文脈から単離されたポリヌクレオチド）および遺伝子改変形態を包含する。さらに、グリコシル化ポリヌクレオチドもしくはメチル化ポリヌクレオチドなど、天然における修飾ポリヌクレオチド、またはビオチニル化ポリヌクレオチドなどの人工修飾ポリヌクレオチドを含む化学修飾ポリヌクレオチドもまた含まれる。さらに、「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、互換的に使用され、任意の核酸を指す。「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語はまた、とりわけ、５つの生体内発生塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシン、およびウラシル）以外の塩基から構成された核酸も含む。
当技術分野では、「同一性」または「配列同一性」という用語が公知であり、２つもしくはこれを超えるポリペプチド配列、または２つもしくはこれを超えるポリヌクレオチド配列の間の関係、すなわち、基準配列と、基準配列と比較される所与の配列との関係を指す。配列同一性は、このような配列の連なりの間のマッチにより決定される、最高度の配列類似性をもたらすように、配列を、最適な形でアライメントした後で、所与の配列を、基準配列と比較することにより決定する。このようなアライメントがなされたら、配列同一性が、位置対位置ベースで確認される、例えば、配列は、特定の位置において、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基が同一であれば、その位置において「同一」である。次いで、このような位置同一性の総数を、基準配列内のヌクレオチドまたは残基の総数で除して、配列同一性％をもたらす。配列同一性は、公知の方法であって、それらの教示が参照により本明細書に組み込まれる、Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, New York (1988), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991); and Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)に記載されている方法を含むがこれらに限定されない方法により、たやすく計算することができる。配列同一性を決定するのに好ましい方法は、被験配列の間で、最大のマッチをもたらすようにデザインされる。配列同一性を決定する方法は、所与の配列の間の配列同一性を決定する、公開のコンピュータプログラムにコード化されている。このようなプログラムの例は、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984)）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)）を含むがこれらに限定されない。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、ＮＣＢＩおよび他の供給元から公開されている（それらの教示が参照により本明細書に組み込まれる、BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894、Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)）。これらのプログラムは、所与の配列と、基準配列との、最高のレベルの配列同一性をもたらすために、デフォルトのギャップ重みを使用して、配列を、最適な形でアライメントする。例示として述べると、基準ヌクレオチド配列に対する、少なくとも、例えば、８５％、好ましくは、９０％、なおより好ましくは、９５％の「配列同一性」を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにより、所与のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、所与のポリヌクレオチド配列が、基準ヌクレオチド配列の、各１００ヌクレオチド当たり、最大で１５カ所、好ましくは、最大で１０カ所、なおより好ましくは、最大で５カ所の点突然変異を含みうることを除き、基準配列と同一であることを意図する。言い換えれば、基準ヌクレオチド配列と比べて、少なくとも８５％、好ましくは、９０％、なおより好ましくは、９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド内では、基準配列内のヌクレオチドのうちの、最大で１５％、好ましくは、１０％、なおより好ましくは、５％を、欠失させるか、または別のヌクレオチドで置換することもでき、基準配列内の全ヌクレオチドのうちの、最大で１５％、好ましくは、１０％、なおより好ましくは、５％の、多数のヌクレオチドを、基準配列へと挿入することもできる。基準配列のこれらの突然変異は、基準ヌクレオチド配列の、５’末端位または３’末端位に生じる場合もあり、これらの末端位の間の、ある位置であって、基準配列内のヌクレオチド間で、個別に散在するか、または基準配列内の、１つもしくは複数の連続群内に散在する、ある位置に生じる場合もある。同様に、基準アミノ酸配列に対する、少なくとも、例えば、８５％、好ましくは、９０％、なおより好ましくは、９５％の配列同一性を有する所与のアミノ酸配列を有するポリペプチドにより、所与のポリペプチドのアミノ酸配列は、所与のポリペプチド配列が、基準アミノ酸配列の、各１００アミノ酸当たり、最大で１５カ所、好ましくは、最大で１０カ所、なおより好ましくは、最大で５カ所のアミノ酸の変更を含みうることを除き、基準配列と同一であることを意図する。言い換えれば、基準アミノ酸配列との、少なくとも８５％、好ましくは、９０％、なおより好ましくは、９５％の配列同一性を有する、所与のポリペプチド配列を得るために、基準配列内のアミノ酸残基のうちの、最大で１５％、好ましくは、最大で１０％、なおより好ましくは、最大で５％を、欠失させるか、または別のアミノ酸で置換することもでき、基準配列内のアミノ酸残基の総数のうちの、最大で１５％、好ましくは、最大で１０％、なおより好ましくは、最大で５％の、多数のアミノ酸を、基準配列へと挿入することもできる。基準配列のこれらの変更は、基準アミノ酸配列の、アミノ末端位またはカルボキシ末端位に生じる場合もあり、これらの末端位の間の、ある位置であって、基準配列内の残基間で、個別に散在するか、または基準配列内の、１つもしくは複数の連続群内に散在する、ある位置に生じる場合もある。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換により異なる。しかし、保存的置換は、配列同一性を決定する場合のマッチとしては組み入れない。
本明細書では、「同一性」、「配列同一性」、および「同一性パーセント」という用語を、互換的に使用する。本明細書では、本発明の目的で、２つのアミノ酸配列または２つの核酸の同一性パーセントを決定するには、最適の比較を目的として、配列をアライメントする（例えば、第２のアミノ酸配列または核酸配列との最適のアライメントのために、第１のアミノ酸または核酸の配列内に、ギャップを導入することができる）ことを規定する。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸またはヌクレオチド残基を比較する。第１の配列内の位置が、第２の配列内の対応する位置と、同じアミノ酸またはヌクレオチド残基により占有される場合、分子は、この位置において同一である。２つの配列の間の同一性パーセントとは、配列により共有される同一な位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一な位置の数／位置の総数（すなわち、重複する位置）×１００）。好ましくは、２つの配列は、同じ長さである。
配列の比較は、比較される２つの配列の全長にわたり実行することもでき、２つの配列の断片にわたり実行することもできる。比較は、比較される２つの配列の全長にわたり実行することが典型的である。しかし、配列同一性は、例えば、２０、５０、１００、またはこれを超える連続アミノ酸残基の領域にわたり実行することもできる。
当業者は、２つの配列の間の相同性を決定するのに、いくつかの、異なるコンピュータプログラムが利用可能である事実を承知しているであろう。例えば、数学的アルゴリズムを使用して、２つの配列の間の、配列の比較および同一性パーセントの決定を達することができる。好ましい実施形態では、２つのアミノ酸配列または核酸配列の間の同一性パーセントは、Ｂｌｏｓｕｍ ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックス、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重み、および１、２、３、４、５、または６の長さ重みを使用する、Ａｃｃｅｌｒｙｓ ＧＣＧソフトウェアパッケージ（http://www.accelrys.com/products/gcg/において入手可能である）内のＧＡＰプログラムへと組み込まれた、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)）によるアルゴリズムを使用して決定する。当業者は、全てのこれらの異なるパラメータは、異なる結果をわずかにもたらすが、異なるアルゴリズムを使用しても、２つの配列の、全体的な同一性百分率は、著明に変更されないことを理解するであろう。
本発明のタンパク質配列または核酸配列は、公開されているデータベースに対する検索を実施して、例えば、他のファミリーメンバーまたは類縁の配列を同定するための、「クエリー配列」としても、さらに使用することができる。Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10による、ＢＬＡＳＴＮプログラムおよびＢＬＡＳＴＰプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０）を使用して、このような検索を実施することができる。スコア＝５０、ワード長＝３とするＢＬＡＳＴＰプログラムにより、ＢＬＡＳＴによるタンパク質検索を実施して、本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較を目的として、ギャップ処理されたアライメントを得るためには、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402において記載されている、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを用いることができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合、それぞれのプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮ）のデフォルトのパラメータを使用することができる。http://www.ncbi.nlm.nih.gov/における、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのホームページを参照されたい。
別の態様では、本発明は、ＰＲＲＳウイルスが、ＰＲＲＳウイルス遺伝子型１、ＰＲＲＳウイルス遺伝子型２からなる群から選択され、ＰＲＲＳウイルス遺伝子型１が、配列番号１７（レイスタッド野生型配列）の核酸配列と、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされるゲノムを含み、ＰＲＲＳウイルス遺伝子型２が、配列番号１８（ＶＲ２３３２野生型配列）の核酸配列と、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされるゲノムを含む、本明細書で開示および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せに関する。
別の態様では、本発明は、ＰＲＲＳウイルスが、弱毒化生／改変生ＰＲＲＳウイルス、１型遺伝子型弱毒化生／改変生ＰＲＲＳウイルス（例えば、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ ＰＲＲＳ、Ｕｎｉｓｔｒａｉｎ ＰＲＲＳ、Ａｍｅｒｖａｃ ＰＲＲＳなど）、２型遺伝子型弱毒化生／改変生ＰＲＲＳウイルス（例えば、Ｉｎｇｅｌｖａｃ（登録商標）ＰＲＲＳ ＭＬＶ、Ｆｏｓｔｅｒａ ＰＲＲＳなど）、弱毒化生／改変生ＰＲＲＳウイルス株９４８８１［（遺伝子型１）、ＲｅｐｒｏＣｙｃ（登録商標）ＰＲＲＳ ＥＵ］、死滅／不活化ＰＲＲＳウイルス、１型遺伝子型死滅／不活化ＰＲＲＳウイルス（例えば、Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｓ）、２型遺伝子型死滅／不活化ＰＲＲＳウイルス、レイスタッドウイルス株（ＣＤＩ−ＮＬ−２．９１、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ、寄託番号：Ｉ−１１０２）、ＰＲＲＳウイルスサブユニット、または受託番号：ＥＣＡＣＣ ０４１０２７０３、ＥＣＡＣＣ ０４１０２７０２、ＥＣＡＣＣ ０４１０２７０４、ＣＮＣＭ受託番号：Ｉ−１１４０、ＣＮＣＭ受託番号：Ｉ−１３８７、ＣＮＣＭ受託番号：Ｉ−１３８８、ＡＴＣＣ ＶＲ２３３２、ＶＲ ２３８５、ＶＲ ２３８６、ＶＲ ２４２９、ＶＲ ２４７４、およびＶＲ ２４０２；ＣＮＣＭＩ−１１０２、ＣＮＣＭＩ−１１４０、ＣＮＣＭＩ−１３８７、ＣＮＣＭＩ−１３８８、またはＥＣＡＣＣ Ｖ９３０７０１０８、北米ＰＲＲＳウイルスｐＴ７Ｐ１２９Ａ（ＡＴＣＣ受託番号：２０３４８８）、ＡＴＣＣ寄託物ＶＲ−２３３２、ＡＴＣＣ寄託物ＶＲ−２３６８；ＡＴＣＣ ＶＲ−２４９５；ＡＴＣＣ ＶＲ２３８５、ＡＴＣＣ ＶＲ２３８６、ＡＴＣＣ ＶＲ２４２９、ＡＴＣＣ ＶＲ２４７４、およびＡＴＣＣ ＶＲ２４０２の下で寄託された株など、他の株からなる群から選択される、本明細書で開示および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せに関する。
「免疫原性組成物」または「組合せワクチン」または「組合せ」という用語は、少なくとも１つの抗原を含み、「組合せワクチン」または「組合せ」の場合は、少なくとも２つの抗原を含む組成物であって、「免疫原性組成物」または「組合せワクチン」または「組合せ」が投与される宿主において、免疫応答を誘発する組成物を指す。このような免疫応答は、本発明の「免疫原性組成物」または「組合せワクチン」または「組合せ」に対する、細胞媒介性免疫応答および／または抗体媒介性免疫応答でありうる。好ましくは、「免疫原性組成物」または「組合せワクチン」または「組合せ」は、免疫応答を誘導し、より好ましくは、ＰＰＶおよび／またはＰＲＲＳＶへの感染の臨床徴候のうちの１つまたは複数に対する防御性免疫を付与する。宿主はまた、「対象」としても記載される。好ましくは、本明細書で記載または言及される宿主または対象は、ブタである。
通例、「免疫応答」は、以下の効果：本発明の「免疫原性組成物」または「組合せワクチン」または「組合せ」に含まれる、１つまたは複数の抗原を特異的に指向する、抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、ならびに／または細胞傷害性Ｔ細胞および／もしくはガンマ−デルタＴ細胞の産生または活性化のうちの１つまたは複数を含むがこれらに限定されない。宿主は、防御的免疫応答または治療的応答を提示することが好ましいであろう。
「防御的免疫応答」または「防御性免疫」は、感染した宿主により通常提示される臨床徴候の軽減もしくは欠如、迅速な回復時間、および／または感染性の持続期間の短縮、または感染した宿主の組織もしくは体液もしくは排出物における病原体力価の低下により裏付けられるであろう。
宿主が、新たな感染への抵抗性を増強し、かつ／または疾患の臨床重症度を軽減するように、防御的免疫応答を提示する場合は、「免疫原性組成物」または「組合せ」を、「ワクチン」と記載する。
別の態様では、本発明は、単回投与のために製剤化される、本明細書で開示および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せに関する。
単回投与のための容量については、本明細書の別の箇所で規定した。
本明細書で開示および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せは、局所投与または全身投与することが好ましい。従来使用されている、適切な投与経路は、鼻腔内投与、静脈内投与、筋内投与、腹腔内投与、皮下投与のほか、吸入など、経口投与または非経口投与である。しかし、化合物の性質および作用方式に応じて、本明細書で開示および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せは、他の経路により投与することもできる。本明細書で開示および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せは、筋内投与することが最も好ましい。
別の態様では、本発明は、筋内投与される、本明細書で開示および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せに関する。
別の態様では、本発明は、妊娠時および授乳時の未経産ブタおよび／または雌ブタに安全である、本明細書で開示および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せに関する。
別の態様では、本発明は、妊娠３０日目、好ましくは、妊娠４０日目からの未経産ブタおよび／または雌ブタに安全である、本明細書で開示および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せに関する。
別の態様では、本発明は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体をさらに含む、本明細書で開示および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せに関する。
「薬学的に許容される担体」という用語は、任意かつ全ての溶媒、分散媒、コーティング、安定化剤、希釈剤、防腐剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤、吸着遅延剤、アジュバント、免疫刺激剤、およびこれらの組合せを含む。
「希釈剤」は、水、生理食塩液、デキストロース、エタノール、グリセロール、リン酸緩衝生理食塩液などを含みうる。等張剤は、とりわけ、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースを含みうる。安定化剤は、とりわけ、アルブミンおよびエチレンジアミン四酢酸のアルカリ塩を含む。
本発明の一態様では、薬学的に許容される担体は、カルボマーである。
好ましくは、免疫原性組成物は、例えば、インターロイキン、インターフェロン、または他のサイトカインなど、１つまたは複数の他の免疫調節剤をさらに含みうる。本発明の文脈で有用な、アジュバントおよび添加剤の量および濃度は、当業者にたやすく決定されうる。
一部の態様では、本発明の免疫原性組成物は、アジュバントを含有する。本明細書で使用される「アジュバント」は、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム、サポニン、例えば、Ｑｕｉｌ Ａ、ＱＳ−２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＭＡ）、ＧＰＩ−０１００（Ｇａｌｅｎｉｃａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）、油中水エマルジョン、水中油エマルジョン、水中油中水エマルジョンを含みうる。エマルジョンは、特に、ライト液体パラフィン油（欧州薬局方型）；スクアランまたはスクアレンなどのイソプレノイド油；アルケン、特に、イソブテンまたはデケンのオリゴマー化から得られる油；直鎖状アルキル基を含有する酸またはアルコールのエステル、より特定すると、植物油、オレイン酸エチル、プロピレングリコールジ（カプリル酸／カプリン酸）エステル、グリセリルトリ（カプリル酸／カプリン酸）エステル、またはプロピレングリコールジオレイン酸エステル；分枝状脂肪酸またはアルコールのエステル、特に、イソステアリン酸エステルに基づくことができる。油を、乳化剤と組み合わせて使用して、エマルジョンを形成する。乳化剤は、好ましくは、非イオン性界面活性剤、特に、ソルビタン、マンニド（例えば、無水マンニトールオレイン酸エステル）、グリコール、ポリグリセロール、プロピレングリコール、およびオレイン酸、イソステアリン酸、リノレン酸、またはヒドロキシステアリン酸のエステルであって、任意選択で、エトキシル化されたエステル、ならびにポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンコポリマーブロック、特に、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ製品、とりわけ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１である。Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull, D. E. S.). JohnWiley and Sons, NY, pp51-94 (1995) and Todd et al., Vaccine 15:564-570 (1997)を参照されたい。例示的なアジュバントは、“Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach” edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995の１４７頁に記載されているＳＰＴエマルジョン、およびこの同じ書物の１８３頁に記載されているエマルジョンＭＦ５９である。
アジュバントのさらなる例は、アクリル酸またはメタクリル酸のポリマー、および無水マレイン酸と、アルケニル誘導体とのコポリマーから選択される化合物である。有利なアジュバント化合物は、とりわけ、糖またはポリアルコールのポリアルケニルエーテルで架橋された、アクリル酸またはメタクリル酸のポリマーである。これらの化合物は、カルボマーという用語で公知である（Phameuropa Vol. 8, No. 2, June 1996）。当業者はまた、ポリヒドロキシル化化合物で架橋された、このようなアクリルポリマーであって、好ましくは、少なくとも３つのヒドロキシルの、８つ以下の水素原子が、少なくとも２つの炭素原子を有する不飽和脂肪族ラジカルで置きかえられた、少なくとも３つのヒドロキシル基を有するアクリルポリマーについて記載する、米国特許第２，９０９，４６２号も参照することができる。好ましいラジカルは、２〜４個の炭素原子、例えば、ビニル、アリル、および他のエチレン系不飽和基を含有するラジカルである。不飽和ラジカルは、それら自体、メチルなど、他の置換基を含有しうる。Ｃａｒｂｏｐｏｌ（ＢＦ Ｇｏｏｄｒｉｃｈ、Ｏｈｉｏ、ＵＳＡ）の商標名で販売されている製品が、特に、適切である。Ｃａｒｂｏｐｏｌは、アリルスクロースまたはアリルペンタエリトリトールで架橋されている。これらの中で、Ｃａｒｂｏｐｏｌ ９７４Ｐ、Ｃａｒｂｏｐｏｌ ９３４Ｐ、およびＣａｒｂｏｐｏｌ ９７１Ｐを挙げることができる。Ｃａｒｂｏｐｏｌ ９７１Ｐの使用が、最も好ましい。無水マレイン酸と、アルケニル誘導体とのコポリマーの中には、無水マレイン酸と、エチレンとのコポリマーである、コポリマーＥＭＡ（Ｍｏｎｓａｎｔｏ）がある。これらのポリマーの、水中の溶解は、酸溶液をもたらすが、免疫原性組成物、免疫学的組成物、またはワクチン組成物が組み込まれるアジュバント溶液をもたらすために、これを、好ましくは、生理学的ｐＨへと中和する。
さらなる、適切なアジュバントは、とりわけ、ＲＩＢＩアジュバント系（Ｒｉｂｉ Ｉｎｃ．）、ブロックコポリマー（ＣｙｔＲｘ、Ａｔｌａｎｔａ ＧＡ）、ＳＡＦ−Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ ＣＡ）、モノホスホリルリピドＡ、アブリジン脂質−アミンアジュバント、Ｅ．ｃｏｌｉに由来する易熱性エンテロトキシン（組換えまたは他の形の）、コレラ毒素、ＩＭＳ １３１４、もしくはムラミルジペプチド、あるいは天然におけるサイトカインもしくは組換えサイトカインまたはこれらの類似体もしくは内因性サイトカイン放出の刺激因子を含むがこれらに限定されない。
アジュバントは、投与１回当たり約１００μｇ〜約１０ｍｇの量、好ましくは、投与１回当たり約１００μｇ〜約１０ｍｇの量、より好ましくは、投与１回当たり約５００μｇ〜約５ｍｇの量、なおより好ましくは、投与１回当たり約７５０μｇ〜約２．５ｍｇの量で添加することができ、最も好ましくは、投与１回当たり約１ｍｇの量で添加しうることが予測される。代替的に、アジュバントは、最終生成物の容量で、約０．０１％〜５０％の濃度、好ましくは、約２％〜３０％の濃度、より好ましくは、約５％〜２５％の濃度、さらにより好ましくは、約７％〜２２％の濃度であることが可能であり、最も好ましくは、１０％〜２０％の濃度でありうる。
別の態様では、本発明は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体が、カルボマーである、本明細書で開示および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せに関する。
別の態様では、本発明は、０．１μｇ〜５０μｇのＰＰＶ ＶＰ２抗原、好ましくは、０．５μｇ〜１０μｇのＰＰＶ ＶＰ２抗原、より好ましくは、１．０μｇ〜１０μｇのＰＰＶ ＶＰ２抗原、および／または３．９〜７．０ ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50のＰＲＲＳウイルスを含む、本明細書で開示および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せに関する。
別の態様では、本発明は、約０．１μｇ〜５０μｇの間のＰＰＶ ＶＰ２抗原を含む、本明細書で開示および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せに関する。好ましくは、免疫原性組成物は、約０．２μｇ〜４０μｇの間、より好ましくは、約０．３μｇ〜３０μｇの間、より好ましくは、約０．４μｇ〜２０μｇの間を含み、なおより好ましくは、約０．５μｇ〜１０μｇの間を含み、なおより好ましくは、約１．０μｇ〜１０μｇの間を含み、０．５μｇ、０．７５μｇ、１μｇ、１．２５μｇ、１．５μｇ、２μｇ、２．５μｇ、３μｇ、３．５μｇ、４μｇ、４．５μｇ、５μｇ、５．５μｇ、６μｇ、６．５μｇ、７μｇ、７．５μｇ、８μｇ、８．５μｇ、９μｇ、９．５μｇ、または１０μｇのＰＰＶ ＶＰ２抗原の量が最も好ましい。
別の態様では、本発明は、約３．９〜７．０ ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50の間のＰＲＲＳウイルスを含む、本明細書で開示および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せに関する。
別の態様では、本発明は、ワクチンである、本明細書で開示および特許請求される、免疫原性組成物または組合せに関する。
「ワクチン」という用語については、本明細書の別の箇所で、既に記載した。しかし、宿主が、新たな感染への抵抗性を増強し、かつ／または疾患の臨床重症度を軽減するように、防御的免疫応答を提示する場合は、免疫原性組成物または組合せを、「ワクチン」と記載する。
別の態様では、本発明は、同種抗原投与および／または異種抗原投与に対して防御する、本明細書で開示および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せに関する。本発明により提供される実験データは、本発明の免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せが、異種北米抗原投与株および／または異種欧州抗原投与株に対して防御するので、広範な保護スペクトルを有することを開示して、有利である。
本出願では、「〜を防御する」および「予防」および「〜を防止すること」という用語を互換的に使用する。これらの用語については、別の箇所で規定した。
別の態様では、本発明は、北米分離株および／もしくは欧州分離株による抗原投与に対して防御する、本明細書で開示および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せに関する。
当業者には、「北米分離株および／もしくは欧州分離株」という用語が周知である。「北米分離株および／もしくは欧州分離株」という用語は、北米および欧州で単離されているか、または単離される、全ての分離株を包含する。
別の態様では、本発明は、北米分離株および／もしくは欧州分離株に対して交差防御性である、本明細書で開示および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せに関する。
別の態様では、本発明は、それを必要とする対象におけるＰＰＶおよび／またはＰＲＲＳＶへの感染により引き起こされる臨床徴候を、処置および／または予防するのに有効である、本明細書で開示および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せに関する。「処置および／もしくは予防」、「臨床徴候」、および「それを必要とする」という用語については、別の箇所で規定した。
別の態様では、本発明は、ＰＰＶの同種抗原投与および／もしくは異種抗原投与、および／またはＰＲＲＳウイルスの同種抗原投与および／もしくは異種抗原投与に対して防御する、本明細書で開示および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せに関する。
別の態様では、本発明は、ＰＰＶの北米分離株および／もしくは欧州分離株による抗原投与に対して、かつ／またはＰＲＲＳウイルスの北米分離株および／もしくは欧州分離株による抗原投与に対して防御する、本明細書で開示および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せに関する。
別の態様では、本発明は、ＰＰＶの北米分離株および／もしくは欧州分離株に対して交差防御性であり、かつ／またはＰＲＲＳウイルスの北米分離株および／もしくは欧州分離株に対して交差防御性である、本明細書で開示および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せに関する。
別の態様では、本発明は、それを必要とする対象における、ＰＰＶ感染および／またはＰＲＲＳウイルス感染により引き起こされる臨床徴候を、処置および／または予防するのに有効である、本明細書で開示および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せに関する。
さらに、本発明は、本明細書で記載および特許請求されるＰＰＶ ＶＰ２を含むウイルス様粒子を提供する。
「ウイルス様粒子」（ＶＬＰ）という用語は、ウイルスに由来する、非複製性で、空のウイルス殻を包含する。ＶＬＰは一般に、カプシドタンパク質、コートタンパク質、殻タンパク質、表面タンパク質、および／もしくはエンベロープタンパク質、またはこれらのタンパク質に由来する粒子形成ポリペプチドと称するタンパク質などであるがこれらに限定されない、１つまたは複数のウイルスタンパク質から構成される。ＶＬＰは、適切な発現系内で、タンパク質が組換え発現されると、自発的に形成されうる。ウイルスタンパク質の組換え発現後におけるＶＬＰの存在は、電子顕微鏡法、Ｘ線結晶構造解析など、当技術分野で公知の従来の技法を使用して検出することができる。例えば、Baker et al., Biophys. J. (1991) 60: 1445-1456; Hagensee et al., J. Virol. (1994) 68: 4503-4505を参照されたい。例えば、低温電子顕微鏡法は、問題となるＶＬＰ調製物のガラス化水性試料に対して実施することができ、画像は、適切な露出条件下で記録することができる。
「ウイルス様粒子」（ＶＬＰ）という用語はまた、複数のＰＰＶ ＶＰ２から構成されるＶＬＰも包含する。
本発明の別の態様では、ウイルス様粒子は、複数の、本明細書で記載および特許請求されるＰＰＶ ＶＰ２から構成される。
さらに、本発明は、本明細書で記載されるポリヌクレオチドまたはベクターを含む細胞を提供する。好ましくは、ベクターは、バキュロウイルスである。
当業者には、「細胞」という用語が周知である。「細胞」という用語は、動物細胞、原生生物細胞、植物細胞、または真菌細胞などの真核細胞を包含する。好ましくは、真核細胞は、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、もしくはＣＯＳ細胞などの哺乳動物細胞、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの真菌細胞、またはＳｆ９などの昆虫細胞である。
本発明の別の態様では、細胞は、昆虫細胞である。
本明細書で使用される「昆虫細胞」とは、昆虫種に由来する細胞または細胞培養物を意味する。本発明との関連で、特に目的となるのは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ種およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ種に由来する昆虫細胞である。
好ましくは、本明細書で言及される昆虫細胞は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）細胞、またはＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａに由来する細胞株に由来する細胞であり、より好ましくは、Ｓｆ９細胞およびＳｆ＋細胞からなる群から選択される。本明細書で言及される昆虫細胞は、それぞれ、好ましくは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）細胞、またはＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａに由来する細胞株に由来する細胞であり、より好ましくは、Ｓｆ９細胞およびＳｆ＋細胞からなる群から選択される。
本発明の別の態様では、昆虫細胞は、Ｓｆ９細胞およびＳｆ＋細胞からなる群から選択される。
さらに、本発明は、本明細書で記載および特許請求されるＰＰＶ ＶＰ２を作製する方法であって、細胞に、本明細書で記載されるベクターをトランスフェクトするステップを含む方法を提供する。
当業者には、「ベクター」という用語が周知である。当技術分野で公知の「ベクター」という用語は、ポリヌクレオチド構築物、典型的に、遺伝子的素材を、宿主細胞へと伝染させるのに使用される、プラスミドまたはウイルスを指す。ベクターは、例えば、ウイルス、プラスミド、コスミド、またはファージでありうる。本明細書で使用されるベクターは、ＤＮＡから構成される場合もあり、ＲＮＡから構成される場合もある。一部の実施形態では、ベクターは、ＤＮＡから構成される。
「発現ベクター」とは、適切な環境内に存在する場合、ベクターに保有される、１つまたは複数の遺伝子によりコードされるタンパク質の発現を方向付けることが可能なベクターである。ベクターは、自己複製が可能であることが好ましい。典型的に、発現ベクターは、転写プロモーター、遺伝子、および転写ターミネーターを含む。遺伝子発現は通例、プロモーターの制御下に置かれ、遺伝子は、プロモーター「に作動可能に連結された」という。
本明細書で使用される「作動可能に連結された」という用語は、調節エレメントと、遺伝子またはそのコード領域との接続について記載するように使用される。典型的に、遺伝子の発現は、１つまたは複数の調節エレメント、例えば、限定せずに述べると、構成的プロモーターまたは誘導的プロモーター、組織特異的調節エレメント、およびエンハンサーの制御下に置かれる。遺伝子またはコード領域は、調節エレメント「に作動可能に連結される」か、またはこれ「に作動的に連結される」か、またはこれ「と作動可能に会合した」といい、遺伝子またはコード領域が、調節エレメントに制御されるか、またはこの影響を受けることを意味する。例えば、プロモーターが、コード配列の転写または発現をもたらす場合、プロモーターは、コード配列に作動可能に連結されている。
ベクター、ならびに発現のためのベクター（または組換え体）を作製および／または使用するための方法は、米国特許第４，６０３，１１２号、同第４，７６９，３３０号、同第５，１７４，９９３号、同第５，５０５，９４１号、同第５，３３８，６８３号、同第５，４９４，８０７号、同第４，７２２，８４８号、同第５，９４２，２３５号、同第５，３６４，７７３号、同第５，７６２，９３８号、同第５，７７０，２１２号、同第５，９４２，２３５号、同第３８２，４２５号、ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／１６７１６号、同第ＷＯ９６／３９４９１号、同第ＷＯ９５／３００１８号；Paoletti, “Applications of pox virus vectors to vaccination: An update, “PNAS USA 93: 11349-11353, October 1996; Moss, “Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety,” PNAS USA 93: 11341-11348, October 1996；Ｓｍｉｔｈら、米国特許第４，７４５，０５１号（組換えバキュロウイルス）；Richardson, C. D. (Editor), Methods in Molecular Biology 39, “Baculovirus Expression Protocols” (1995 Humana Press Inc.); Smith et al., “Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector”, Molecular and Cellular Biology, December, 1983, Vol. 3, No. 12, p. 2156-2165;Pennock et al., “Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector, “Molecular and Cellular Biology March 1984, Vol. 4, No. 3, p. 406;欧州特許出願第０３７０５７３号；１９８６年１０月１６日に出願された米国出願第９２０，１９７号；欧州特許公開第２６５７８５号；米国特許第４，７６９，３３１号（組換えヘルペスウイルス）；Roizman, “The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors,” PNAS USA 93:11307-11312, October 1996;Andreansky et al., “The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors,” PNAS USA 93: 11313-11318, October 1996;Robertson et al., “Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes”, PNAS USA 93: 11334-11340, October 1996;Frolov et al., “Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications,” PNAS USA 93: 11371-11377, October 1996;Kitson et al., J. Virol. 65, 3068-3075, 1991;米国特許第５，５９１，４３９号、同第５，５５２，１４３号；ＷＯ９８／００１６６；いずれも、１９９６年７月３日に出願され、許可された、米国出願第０８／６７５，５５６号、および同第０８／６７５，５６６号（組換えアデノウイルス）；Grunhaus et al., 1992, “Adenovirus as cloning vectors,” Seminars in Virology (Vol. 3) p. 237-52, 1993;Ballay et al. EMBO Journal, vol. 4, p. 3861-65, Graham, Tibtech 8, 85-87, April, 1990; Prevec et al., J. Gen Virol. 70, 42434;ＰＣＴ ＷＯ９１／１１５２５；Felgner et al. (1994), J. Biol. Chem. 269, 2550-2561, Science, 259: 1745-49, 1993;およびMcClements et al., “Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease”, PNAS USA 93: 11414-11420, October 1996;ならびに米国特許第５，５９１，６３９号、同第５，５８９，４６６号、および同第５，５８０，８５９号のほか、ＷＯ９０／１１０９２、ＷＯ９３／１９１８３、ＷＯ９４／２１７９７、ＷＯ９５／１１３０７、ＷＯ９５／２０６６０；とりわけ、ＤＮＡ発現ベクターに関する、Tang et al., Nature, and Furth et al., Analytical Biochemistryにおいて開示されている方法を介する場合もあり、これと類似する場合もある。また、ＷＯ９８／３３５１０；Ju et al., Diabetologia, 41: 736-739, 1998(レンチウイルス発現系); Ｓａｎｆｏｒｄら、米国特許第４，９４５，０５０号；Fischbach et al.（イントラセル）；ＷＯ９０／０１５４３；Robinson et al., Seminars in Immunology vol. 9, pp. 271-283 (1997)（ＤＮＡベクター系）；Ｓｚｏｋａら、米国特許第４，３９４，４４８号（ＤＮＡを伴う細胞を挿入する方法）；ＭｃＣｏｒｍｉｃｋら、米国特許第５，６７７，１７８号（細胞変性ウイルスの使用）；および米国特許第５，９２８，９１３号（遺伝子送達のためのベクター）のほか、本明細書で引用される他の文献も参照されたい。
「調節エレメント」および「発現制御エレメント」という用語は、互換的に使用され、特定の宿主生物において、作動可能に連結されたコード配列の発現に影響を及ぼしうる核酸分子を指す。これらの用語は、転写を促進または調節する全てのエレメントであって、プロモーター、ＲＮＡポリメラーゼと転写因子との基本的相互作用に必要とされるコアエレメント、上流エレメント、エンハンサー、および応答エレメントを含むエレメントを対象とするように、広範に使用される。原核生物内の例示的な調節エレメントは、プロモーター、オペレーター配列、およびリボソーム結合性部位を含む。真核細胞内で使用される調節エレメントは、限定せずに述べると、プロモーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、タンパク質分解シグナル、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、コード配列の発現および／または宿主細胞内でコードされるポリペプチドの産生をもたらし、かつ／または調節する２Ａ配列などの転写制御配列および翻訳制御配列を含みうる。
本明細書で使用される「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を可能とし、遺伝子の転写を方向付けるヌクレオチド配列である。典型的に、プロモーターは、遺伝子の転写開始部位に対して近位である、遺伝子の５’側非コード領域に位置する。転写の誘発において機能するプロモーター内の配列エレメントは、コンセンサスヌクレオチド配列を特徴とすることが多い。プロモーターの例は、細菌、酵母、植物、ウイルス、および哺乳動物（ヒトを含む）に由来するプロモーターを含むがこれらに限定されない。プロモーターは、誘導的プロモーターの場合もあり、抑制性プロモーターの場合もあり、かつ／または構成的プロモーターの場合もある。誘導的プロモーターは、それらの制御下における、ＤＮＡからの転写のレベルの上昇であって、温度の変化など、培養条件における何らかの変化に応答する上昇を誘発する。
本明細書で使用される「エンハンサー」という用語は、転写の開始部位と比べた、エンハンサーの距離または配向性に関わらず、転写の効率を増大させうる種類の調節エレメントを指す。
ウイルスベクターの作出は、当技術分野で周知である、任意の適切な遺伝子操作法であって、限定せずに述べると、制限エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション、形質転換、プラスミド精製、およびＤＮＡシーケンシングの標準法を含み、例えば、Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (1989))において記載されている遺伝子操作法を使用して達することができる。
さらに、本発明は、本明細書で記載されるＰＰＶ ＶＰ２を作製する方法であって、細胞、好ましくは、昆虫細胞に、本明細書で記載されるバキュロウイルスを感染させるステップを含む方法を提供する。
組成物は、所望の場合、有効成分を含有する、１つまたは複数の単位剤形を含有しうる、パックまたは分注デバイスにより提供することができる。パックは、例えば、ブリスターパックなど、金属製フォイルまたはプラスチック製フォイルを含みうる。パックまたは分注デバイスは、好ましくは、動物、とりわけ、ブタへの投与のための説明書を伴いうる。このような容器には、医薬または生物学的医薬品の製造、使用、または販売を規制する政府機関により規定された形態の通知であって、ヒトへの投与のための、製造、使用、または販売についての機関による承認を反映する通知が添付されうる。
別の態様では、本発明は、少なくとも１つのブタパルボウイルス（ＰＰＶ）抗原と、少なくとも１つのブタ繁殖呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）ウイルス抗原とが、単一の容器に併せて含有されるか、または互いと空間的に分離され、好ましくは、２つまたはこれを超える個別の容器に含有される、本明細書で開示および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せに関する。
別の態様では、本発明は、本明細書で開示および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せを含むキットに関する。
別の態様では、本発明は、少なくとも１つのブタパルボウイルス（ＰＰＶ）抗原と、少なくとも１つのブタ繁殖呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）ウイルス抗原とが、２つまたはこれを超える個別の容器に、互いと別々に、好ましくは、いずれも、乾燥凍結形態または凍結形態で、互いと独立に含有された、本明細書で開示および特許請求されるキットであって、空間的に分離された少なくとも１つのＰＰＶ抗原と、少なくとも１つのＰＲＲＳウイルス抗原とを混合するための取扱説明書をさらに含み、好ましくは、このような取扱説明書が、少なくとも１つのＰＰＶ抗原を含有する容器の内容物を、少なくとも１つのＰＰＲＳウイルス抗原を含有する容器の内容物と組み合わせる指示を含有し、より好ましくは、このような取扱説明書が、少なくとも１つのブタパルボウイルス（ＰＰＶ）抗原と、少なくとも１つのブタ繁殖呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）ウイルス抗原とを、対象へと、同時に、より好ましくは、同じまたは異なる投与部位に、個別に同時に、逐次的に（任意の順序で）、かつ／または時間を前後して投与するものとする指示を含有する、本明細書で開示および特許請求されるキットに関する。
別の態様では、本発明は、ブタにおける疾患を処置および／もしくは予防するための指示をさらに含み、かつ／またはＰＰＶ感染および／もしくはＰＲＲＳウイルス感染を処置および／もしくは予防するための指示をさらに含み、好ましくは、本明細書で開示および特許請求され、このようなキットに含有される免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せのＰＰＶ構成要素（好ましくは、分離されたキット構成要素としての）、およびＰＲＲＳＶ構成要素（好ましくは、分離されたキット構成要素としての）の、関連する使用のための指示をさらに含む、本明細書で開示および特許請求されるキットに関する。
本発明の範囲における、「関連する使用」という用語は、１つの注射部位における投与の前に、２つのワクチンを混合すること、または２つのワクチンの、同時であるが、異なる投与部位における投与による、２つのワクチンまたはワクチン成分である、ＰＲＲＳＶおよびＰＰＶ（各々が、互いから独立であり、本明細書ではまた、「分離されたキットの構成要素」とも称する）の使用に関する。好ましくは、このような２つのワクチンを、同時に、より好ましくは、同じまたは異なる投与部位に、個別に同時に、逐次的に（任意の順序で）、かつ／または時間を前後して投与する。
本発明の別の態様では、本発明のＰＰＶおよび／またはＰＲＲＳＶを不活化させる結果として、本明細書で記載されるウイルスタンパク質２（ＶＰ２）を伴う、全不活化ウイルスをもたらす。
従来の任意の不活化法を、本発明の目的で使用することができる。したがって、不活化は、当業者に公知の化学的処理および／または物理的処理により実施することができる。好ましい不活化法は、環化バイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）の添加を含むが、これは、バイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）へと環化された、２−ブロモエチレンアミンヒドロブロミド（ＢＥＡ）の溶液の添加を含む。好ましい、さらなる化学的不活化剤は、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、デオキシコール酸ナトリウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、β−プロピオラクトン、チメロサール、フェノール、およびホルムアルデヒド（ホルマリン）を含むがこれらに限定されない。しかし、不活化はまた、中和ステップも含みうる。好ましい中和剤は、チオ硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウムなどを含むがこれらに限定されない。
好ましいホルマリン不活化条件は、約０．０２％（容量／容量）〜２．０％（容量／容量）、より好ましくは、約０．１％（容量／容量）〜１．０％（容量／容量）、さらにより好ましくは、約０．１５％（容量／容量）〜０．８％（容量／容量）、なおより好ましくは、約０．１６％（容量／容量）〜０．６％（容量／容量）の間のホルマリン濃度を含み、最も好ましくは、約０．２％（容量／容量）〜０．４％（容量／容量）の間のホルマリン濃度を含む。インキュベーション時間は、ＰＰＶおよび／またはＰＲＲＳＶの耐性に依存する。一般に、不活化工程は、ＰＰＶおよび／またはＰＲＲＳＶの増殖が、適切な培養系で検出されえなくなるまで実施される。
好ましくは、本発明の不活化ＰＰＶおよび／またはＰＲＲＳＶ好ましくは、本明細書の上記で記載した濃縮を使用して、ホルマリンにより不活化される。
好ましくは、本発明の不活化ＰＰＶおよび／またはＰＲＲＳＶは、環化バイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）により不活化されるが、これは、バイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）へと環化された、２−ブロモエチレンアミンヒドロブロミド（ＢＥＡ）の溶液の添加を含む。
本発明の不活化ＰＰＶおよび／またはＰＲＲＳＶは、Nature, 1974, 252, 252-254またはJournal of Immunology, 1978, 120, 1109-1113において記載されている技術など、公知の技術を使用して、リポソームへと組み込むことができる。本発明の別の実施形態では、本発明の不活化ＰＰＶを、多糖、ペプチド、タンパク質など、またはこれらの組合せなど、適切な生体化合物へとコンジュゲートさせることができる。
「〜を免疫化すること」という用語は、免疫化される対象への、免疫原性組成物の投与による能動的免疫化であって、これにより、このような免疫原性組成物に含まれる抗原に対する免疫応答を引き起こす能動的免疫化に関する。
好ましくは、免疫化は、群れの中の、特定のＰＰＶおよび／もしくはＰＲＲＳＶへの感染の発生率を低下させること、または特定のＰＰＶおよび／またはＰＲＲＳＶへの感染により引き起こされるか、もしくはこれと関連する、臨床徴候の重症度の軽減を結果としてもたらす。
さらに、本明細書で提示される免疫原性組成物による、それを必要とする対象の免疫化は、ＰＰＶおよび／またはＰＲＲＳＶへの感染により、対象の感染の防止を結果としてもたらす。なおより好ましくは、免疫化は、ＰＰＶおよび／またはＰＲＲＳＶへの感染に対する、有効で、長期持続的な、免疫学的応答を結果としてもたらす。前記期間は、１カ月間を超えて、好ましくは、２カ月間を超えて、好ましくは、３カ月間を超えて、より好ましくは、４カ月間を超えて、より好ましくは、５カ月間を超えて、より好ましくは、６カ月間を超えて持続することが理解されるであろう。免疫化は、免疫化された全ての対象において有効ではありえないことを理解されたい。しかし、用語は、群れの対象のうちの著明な部分が、有効に免疫化されることを要求する。
好ましくは、この文脈では、通常、すなわち、免疫化を伴わなければ、ＰＰＶおよび／またはＰＲＲＳＶへの感染により引き起こされるか、またはこれと関連する、臨床徴候を発症する対象の群れが想定される。群れの対象が、効果的に免疫化されたのかどうかは、当業者による、さらなる煩雑さを伴わずに決定することができる。好ましくは、所与の群れの対象のうちの、少なくとも３３％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、さらにより好ましくは、少なくとも９５％における臨床徴候であり、最も好ましくは、１００％における臨床徴候を、発生率または重症度において、本発明の前に利用可能であった免疫原性組成物で処置されていないか、または処置されたが、その後、特定のＰＰＶに感染した対象と比較して、少なくとも１０％、より好ましくは、少なくとも２０％、さらにより好ましくは、少なくとも３０％、なおより好ましくは、少なくとも４０％、さらにより好ましくは、少なくとも５０％、なおより好ましくは、少なくとも６０％、さらにより好ましくは、少なくとも７０％、なおより好ましくは、少なくとも８０％、さらにより好ましくは、少なくとも９０％、さらにより好ましくは、少なくとも９５％低下させ、最も好ましくは、１００％低下させたら、免疫化は、有効であるものとする。
別の態様では、本発明は、医薬、好ましくは、ワクチンを調製するための、本明細書で記載および特許請求される、免疫原性組成物もしくは組合せワクチンもしくは組合せ、またはキットの使用に関する。
別の態様では、本発明は、ＰＰＶおよび／もしくはＰＲＲＳウイルスの感染の処置および／もしくは防止、ＰＰＶおよび／もしくはＰＲＲＳウイルスの感染により引き起こされる臨床徴候の軽減、防止、もしくは処置、またはＰＰＶおよび／もしくはＰＲＲＳウイルスの感染により引き起こされる疾患の処置および／もしくは防止のための、本明細書で記載および特許請求される、免疫原性組成物もしくは組合せワクチンもしくは組合せ、またはキットの使用に関する。
別の態様では、本発明は、対象を免疫化する方法であって、このような対象へと、本明細書で記載および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ（または分離されたキットの構成要素）を投与するステップを含む方法に関する。
別の態様では、本発明は、それを必要とする対象における、好ましくは、ブタにおける、ＰＰＶ感染および／またはＰＲＲＳウイルス感染により引き起こされる臨床徴候、好ましくは、ブタ繁殖呼吸障害症候群を処置および／または防止する方法であって、対象へと、治療有効量の、本明細書で記載および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ（または分離されたキットの構成要素）を投与するステップを含む方法に関する。
別の態様では、本発明は、対象における生殖障害を、同じ種の非免疫化対照群の対象と比較して軽減する方法であって、対象へと、治療有効量の、本明細書で記載および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ（または分離されたキットの構成要素）を投与するステップを含む方法に関する。
別の態様では、本発明は、対象における胚死および胎仔死を、同じ種の非免疫化対照群の対象と比較して軽減する方法であって、対象へと、治療有効量の、本明細書で記載および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ（または分離されたキットの構成要素）を投与するステップを含む方法に関する。
別の態様では、本発明は、ブタパルボウイルス感染に対して、胚および胎仔を保護するための、繁殖用ブタ（雌ブタおよび未経産ブタ）の能動的免疫化のための方法であって、このようなブタ（雌ブタおよび未経産ブタ）へと、治療有効量の、本明細書で記載および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ（または分離されたキットの構成要素）を投与するステップを含む方法に関する。
別の態様では、本発明は、前記対象が、ブタ、ウシ、ネコ、およびイヌ、好ましくは、ブタ、より好ましくは、雌ブタおよび／または未経産ブタからなる群から選択される、本明細書で記載および特許請求される方法に関する。
別の態様では、本発明は、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ（または分離されたキットの構成要素）が、１回、または２回もしくはこれを超える回数にわたり投与される、本明細書で記載および特許請求される方法に関する。
別の態様では、本発明は、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ（または分離されたキットの構成要素）が、筋内投与される、本明細書で記載および特許請求される方法に関する。
別の態様では、本発明は、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ（または分離されたキットの構成要素）が、未経産ブタおよび／または雌ブタへと、好ましくは、未経産ブタおよび／または少なくとも３週齢である雌ブタへと、より好ましくは、未経産ブタおよび／または妊娠前の雌ブタへと、なおより好ましくは、妊娠時および授乳時の雌ブタへと投与される、本明細書で記載および特許請求される方法に関する。
別の態様では、本発明は、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ（または分離されたキットの構成要素）が、妊娠時および授乳時の未経産ブタおよび／または雌ブタ、ならびに妊娠前の未経産ブタに安全である、本明細書で記載および特許請求される方法に関する。
別の態様では、本発明は、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ（または分離されたキットの構成要素）が、妊娠３０日目、好ましくは、妊娠４０日目からの雌ブタおよび／または未経産ブタに安全である、本明細書で記載および特許請求される方法に関する。
別の態様では、本発明は、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ（または分離されたキットの構成要素）が、０．１μｇ〜５０μｇのＰＰＶ ＶＰ２抗原、好ましくは、０．５μｇ〜１０μｇのＰＰＶ ＶＰ２抗原、より好ましくは、１．０μｇ〜１０μｇのＰＰＶ ＶＰ２抗原、および／または３．９〜７．０ ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50のＰＲＲＳウイルスを含む、本明細書で記載および特許請求される方法に関する。
別の態様では、本発明は、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ（または分離されたキットの構成要素）が、ＰＰＶの同種抗原投与および／もしくは異種抗原投与、および／またはＰＲＲＳウイルスの同種抗原投与および／もしくは異種抗原投与に対して防御する、本明細書で記載および特許請求される方法に関する。
別の態様では、本発明は、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ（または分離されたキットの構成要素）が、ＰＰＶの北米分離株および／もしくは欧州分離株による抗原投与に対して、かつ／またはＰＲＲＳウイルスの北米分離株および／もしくは欧州分離株による抗原投与に対して防御する、本明細書で記載および特許請求される方法に関する。
別の態様では、本発明は、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ（または分離されたキットの構成要素）が、ＰＰＶの北米分離株および／もしくは欧州分離株に対して交差防御性であり、かつ／またはＰＲＲＳウイルスの北米分離株および／もしくは欧州分離株に対して交差防御性である、本明細書で記載および特許請求される方法に関する。
別の態様では、本発明は、本明細書で記載および特許請求される方法であって、胚および／もしくは胎仔の感染および死、またはこれらの組合せを特徴とする、一過性の白血球減少症および生殖障害の、同じ種の非免疫化対照群の対象と比較した軽減からなる群から選択される、少なくとも１つの有効性パラメータの改善を結果としてもたらす方法に関する。
別の態様では、本発明は、対象を免疫化する方法であって、前記免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せを、このような対象（または分離されたキットの構成要素）へと投与するステップを含む方法における使用のための、本明細書で記載および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ（または分離されたキットの構成要素）に関する。
別の態様では、本発明は、それを必要とする対象における、好ましくは、ブタにおける、ＰＰＶ感染および／またはＰＲＲＳウイルス感染により引き起こされる臨床徴候、好ましくは、ブタ繁殖呼吸障害症候群を処置および／または防止する方法であって、対象へと、治療有効量の、前記免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ（または分離されたキットの構成要素）を投与するステップを含む方法における使用のための、本明細書で記載および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ（または分離されたキットの構成要素）に関する。
別の態様では、本発明は、対象における生殖障害を、同じ種の非免疫化対照群の対象と比較して軽減する方法であって、対象へと、治療有効量の、前記免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ（または分離されたキットの構成要素）を投与するステップを含む方法における使用のための、本明細書で記載および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ（または分離されたキットの構成要素）に関する。
別の態様では、本発明は、対象における胚死および胎仔死を、同じ種の非免疫化対照群の対象と比較して軽減する方法であって、対象へと、治療有効量の、前記免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ（または分離されたキットの構成要素）を投与するステップを含む方法における使用のための、本明細書で記載および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ（または分離されたキットの構成要素）に関する。
別の態様では、本発明は、ブタパルボウイルス感染に対して、胚および胎仔を保護するための、繁殖用ブタ（雌ブタおよび未経産ブタ）の能動的免疫化のための方法であって、このようなブタ（雌ブタおよび未経産ブタ）へと、前記免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ（または分離されたキットの構成要素）を投与するステップを含む方法における使用のための、本明細書で記載および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ（または分離されたキットの構成要素）に関する。
別の態様では、本発明は、前記対象が、ブタ、ウシ、ネコ、およびイヌ、好ましくは、ブタ、より好ましくは、雌ブタおよび／または未経産ブタからなる群から選択される、本明細書で記載および特許請求される使用のための、本明細書で記載および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ（または分離されたキットの構成要素）に関する。
別の態様では、本発明は、１回、または２回もしくはこれを超える回数にわたり投与される、本明細書で記載および特許請求される使用のための、本明細書で記載および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ（または分離されたキットの構成要素）に関する。
別の態様では、本発明は、筋内投与される、本明細書で記載および特許請求される使用のための、本明細書で記載および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ（または分離されたキットの構成要素）に関する。
別の態様では、本発明は、未経産ブタおよび／または雌ブタ、好ましくは、少なくとも３週齢である雌ブタ、より好ましくは、妊娠前の雌ブタ、なおより好ましくは、妊娠時および授乳時の雌ブタへと投与される、本明細書で記載および特許請求される使用のための、本明細書で記載および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ（または分離されたキットの構成要素）に関する。
別の態様では、本発明は、妊娠時および授乳時の未経産ブタおよび／または雌ブタに安全である、本明細書で記載および特許請求される使用のための、本明細書で記載および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ（または分離されたキットの構成要素）に関する。
別の態様では、本発明は、妊娠３０日目、好ましくは、妊娠４０日目からの未経産ブタおよび／または雌ブタに安全である、本明細書で記載および特許請求される使用のための、本明細書で記載および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ（または分離されたキットの構成要素）に関する。
別の態様では、本発明は、０．１μｇ〜５０μｇのＰＰＶ ＶＰ２抗原、好ましくは、０．５μｇ〜１０μｇのＰＰＶ ＶＰ２抗原、より好ましくは、１．０μｇ〜１０μｇのＰＰＶ ＶＰ２抗原、および／または３．９〜７．０ ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50のＰＲＲＳウイルスを含む、本明細書で記載および特許請求される使用のための、本明細書で記載および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ（または分離されたキットの構成要素）に関する。
別の態様では、本発明は、ＰＰＶの同種抗原投与および／もしくは異種抗原投与に対して防御し、かつ／またはＰＲＲＳウイルスの同種抗原投与および／もしくは異種抗原投与に対して防御する、本明細書で記載および特許請求される使用のための、本明細書で記載および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ（または分離されたキットの構成要素）に関する。
別の態様では、本発明は、ＰＰＶの北米分離株および／もしくは欧州分離株による抗原投与に対して防御し、かつ／またはＰＲＲＳウイルスの北米分離株および／もしくは欧州分離株による抗原投与に対して防御する、本明細書で記載および特許請求される使用のための、本明細書で記載および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ（または分離されたキットの構成要素）に関する。
別の態様では、本発明は、ＰＰＶの北米分離株および／もしくは欧州分離株に対して交差防御性であり、かつ／またはＰＲＲＳウイルスの北米分離株および／もしくは欧州分離株に対して交差防御性である、本明細書で記載および特許請求される使用のための、本明細書で記載および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ（または分離されたキットの構成要素）に関する。
別の態様では、本発明は、前記方法が、胚および／もしくは胎仔の感染および死、またはこれらの組合せを特徴とする、一過性の白血球減少症および生殖障害の、同じ種の非免疫化対照群の対象と比較した軽減からなる群から選択される、少なくとも１つの有効性パラメータの改善を結果としてもたらす、本明細書で記載および特許請求される使用のための、本明細書で記載および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ（または分離されたキットの構成要素）に関する。
「処置および／または予防」という用語は、群れの中の、特定のＰＰＶおよび／もしくはＰＲＲＳＶへの感染の発生率を低下させること、または特定のＰＰＶおよび／またはＰＲＲＳＶへの感染により引き起こされるか、もしくはこれと関連する、臨床徴候の重症度の軽減を指す。したがって、「処置および／または予防」という用語はまた、有効量の、本明細書で提示される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せを施された動物の動物群における、特定のＰＰＶおよび／もしくはＰＲＲＳＶに感染した群れの中の動物数の、このような免疫原性組成物または組合せワクチンもしくは組合せを施されていない動物の動物群と比較した低減（＝特定のＰＰＶおよび／またはＰＲＲＳＶへの感染の発生率を低下させること）、または、通常、ＰＰＶおよび／もしくはＰＲＲＳＶへの感染と関連するか、もしくはこれにより引き起こされる、臨床徴候の重症度の軽減も指す。
「処置および／または予防」は、一般に、有効量の本発明の免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せの、このような処置／予防を必要とする対象もしくは対象の群れ、またはこのような処置／予防から利益を得うる対象もしくは対象の群れへの投与を伴う。「処置」という用語は、有効量の免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せの投与であって、対象または群れの少なくとも一部の動物が、このようなＰＰＶおよび／またはＰＲＲＳＶに、既に感染しており、このような動物が、既に、このようなＰＰＶおよび／またはＰＲＲＳＶへの感染により引き起こされるか、またはこれと関連する、何らかの臨床徴候を示す場合の投与を指す。「予防」という用語は、このような対象への、ＰＰＶおよび／もしくはＰＲＲＳＶの、任意の感染の前における、対象への投与または少なくともこのような動物もしくは動物群内の動物のいずれも、このようなＰＰＶおよび／もしくはＰＲＲＳＶへの感染により引き起こされるか、もしくはこれと関連する、いかなる臨床徴候を示さない場合の投与を指す。本出願では、「予防」および「〜を防止すること」という用語は、互換的に使用される。
本明細書で使用される「有効量」という用語は、対象における免疫応答を誘発するか、またはこれを誘発することが可能な量の抗原を意味するがこれらに限定されない。このような有効量は、群れの中の、特定のＰＰＶおよび／またはＰＲＲＳＶへの感染の発生率を低下させるか、または特定のＰＰＶおよび／またはＰＲＲＳＶへの感染の臨床徴候の重症度を軽減することが可能である。
好ましくは、臨床徴候を、発生率または重症度において、本発明の前に利用可能であった免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せで処置されていないか、または処置されたが、その後、特定のＰＰＶおよび／またはＰＲＲＳＶに感染した対象と比較して、少なくとも１０％、より好ましくは、少なくとも２０％、さらにより好ましくは、少なくとも３０％、なおより好ましくは、少なくとも４０％、さらにより好ましくは、少なくとも５０％、なおより好ましくは、少なくとも６０％、さらにより好ましくは、少なくとも７０％、なおより好ましくは、少なくとも８０％、さらにより好ましくは、少なくとも９０％、さらにより好ましくは、少なくとも９５％低下させ、最も好ましくは、１００％低下させる。
本明細書で使用される「臨床徴候」という用語は、ＰＰＶおよび／またはＰＲＲＳＶに由来する、対象の感染の徴候を指す。感染の臨床徴候は、選択された病原体に依存する。このような臨床徴候の例は、胚および／もしくは胎仔の感染および死、またはこれらの組合せを特徴とする、一過性の白血球減少症および生殖障害の軽減を含むがこれらに限定されない。直接観察可能な臨床徴候の例は、同腹仔数の低減、同腹仔ごとの胚もしくは胎仔のミイラ化の増大、胚もしくは胎仔の自己溶解、胚もしくは胎仔のサイズの低減、胚もしくは胎仔の体重の低減など、またはこれらの組合せを含む。このような臨床徴候のさらなる例は、ウイルス血の増大、ターゲティングされた組織および血液内のウイルス負荷の増大、ＰＰＶの、ペンメートへの伝染／拡散の増大など、またはこれらの組合せを含むがこれらに限定されない。
好ましくは、処置された対象の発生率または重症度における、臨床徴候の、本発明の前に利用可能であった免疫原性組成物で処置されていないか、または処置されたが、その後、特定のＰＰＶおよび／またはＰＲＲＳＶに感染した対象と比較した低下とは、胚および／もしくは胎仔の感染および死、またはこれらの組合せを特徴とする、一過性の白血球減少症および生殖障害を指す。
本明細書で使用される「必要とする（ｉｎ ｎｅｅｄまたはｏｆ ｎｅｅｄ）」という用語は、投与／処置が、健康もしくは臨床徴候の増進もしくは改善、または本発明に従う免疫原性組成物を施される動物（その胚または胎仔を含む）の健康に対する、他の任意の肯定的な医学的効果と関連することを意味する。
本出願では、「〜を軽減すること」または「軽減された」または「軽減」または「〜を減少させる」という用語を、互換的に使用する。「軽減」という用語は、臨床徴候を、処置されず（免疫化されず）、その後、特定のＰＰＶおよび／またはＰＲＲＳＶに感染した対象と比較して、少なくとも１０％、より好ましくは、少なくとも２０％、さらにより好ましくは、少なくとも３０％、なおより好ましくは、少なくとも４０％、さらにより好ましくは、少なくとも５０％、なおより好ましくは、少なくとも６０％、さらにより好ましくは、少なくとも７０％、なおより好ましくは、少なくとも８０％、なおより好ましくは、少なくとも９０％、さらにより好ましくは、少なくとも９５％、最も好ましくは、１００％軽減することを意味する。
本発明の一態様では、本明細書で記載および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ（または分離されたキットの構成要素）は、１回投与される。単回投与は、１回だけ投与されることが理解される。
対象１例当たりの投与容量は、ワクチン接種の経路と、対象の週齢とに依存する。好ましくは、単回投与は、約０．２ｍｌ〜２．５ｍｌの間、より好ましくは、約０．２ｍｌ〜２．０ｍｌの間、なおより好ましくは、約０．２ｍｌ〜１．７５ｍｌの間、さらにより好ましくは、約０．２ｍｌ〜１．５ｍｌの間、なおより好ましくは、約０．４ｍｌ〜１．２５ｍｌの間、なおより好ましくは、約０．４ｍｌ〜１．０ｍｌの間の総容量を有し、０．５ｍｌの単回投与または１．０ｍｌの単回投与が最も好ましい。最も好ましい単回投与は、０．５ｍｌ、１ｍｌ、１．５ｍｌ、または２ｍｌの総容量を有する。
本発明の一態様では、本明細書で記載および特許請求される、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ（または分離されたキットの構成要素）は、２回またはこれを超える回数にわたり投与される。
しかし、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せは、２回またはこれを超える回数にわたり投与することもでき、この場合、１回目の投与を、２回目の（追加）投与を行う前に投与する。好ましくは、２回目の投与を、１回目の投与の少なくとも１５日後に投与する。より好ましくは、２回目の投与を、１回目の投与後１５日間〜４０日間の間に投与する。なおより好ましくは、２回目の投与を、１回目の投与の少なくとも１７日後に投与する。さらにより好ましくは、２回目の投与を、１回目の投与後１７日間〜３０日間の間に投与する。なおより好ましくは、２回目の投与を、１回目の投与の少なくとも１９日後に投与する。さらにより好ましくは、２回目の投与を、１回目の投与後１９日間〜２５日間の間に投与する。最も好ましくは、２回目の投与を、１回目の投与の少なくとも２１日後に投与する。なおより好ましくは、２回目の投与を、１回目の投与の約２１日後、または１回目の投与の２１日後に投与する。２回投与レジメンについての好ましい態様では、免疫原性組成物１回目および２回目の投与のいずれも、同じ量で投与する。各回の投与は、上記で指定された好ましい量であることが好ましく、１回目および２回目の投与に対する、１ｍｌまたは２ｍｌの用量が最も好ましい。１回目および２回目の投与レジメンに加えて、代替的な実施形態は、さらなる後続の投与を含む。例えば、これらの態様では、３回目、４回目、または５回目の投与を、行いうるであろう。後続の３回目、４回目、および５回目の投与レジメンは、１回目の投与と同じ量で投与することが好ましく、投与間の時間枠は、上記で言及された１回目の投与と２回目の投与との間のタイミングと符合する。上記の投与レジメンは、未経産ブタだけに適用することが好ましい。ブタには、単回投与／単回接種としての、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せだけを投与することが好ましい。
本発明の一態様では、対象は、ブタ、ウシ、ネコ、およびイヌからなる群から選択される。
好ましくは、対象は、ブタである。ブタは、雌動物および雄動物を含むことが理解されている。精子は、ＰＰＶを含有する場合があり、この理由から、「ブタ」という言葉には、雌および雄の繁殖用動物が包含される。したがって、「ブタ」という言葉は、雄ブタなどの雄動物のほか、未経産ブタおよび雌ブタなどの雌動物を含む。
本明細書で使用される「未経産ブタ」という用語は、ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）、好ましくは、初回の妊娠（ｇｅｓｔａｔｉｏｎ）／妊娠（ｐｒｅｇｎａｎｃｙ）の前および初回の妊娠時のブタ（ｐｉｇ）を指す。これに対し、本明細書で使用される「雌ブタ」という用語は、ブタ、好ましくは、初回の分娩（その初回の妊娠の肯定的な結果としての）の後のブタを指す。
対象１例当たりの投与容量は、ワクチン接種の経路と、対象の週齢とに依存する。好ましくは、総容量は、約０．２ｍｌ〜５ｍｌの間、より好ましくは、約０．５ｍｌ〜３．０ｍｌの間、なおより好ましくは、約１．０ｍｌ〜２．５ｍｌの間、なおより好ましくは、約１．０ｍｌ〜２．０ｍｌの間である。最も好ましい容量は、投与１回当たり１ｍｌ、１．５ｍｌ、２ｍｌ、または２．５ｍｌである。
免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ（または分離されたキットの構成要素）は、局所投与または全身投与することが好ましい。従来使用されている、適切な投与経路は、鼻腔内、静脈内、皮内、経皮、筋内、腹腔内、皮下のほか、吸入など、経口投与または非経口投与である。しかし、化合物の性質および作用方式に応じて、免疫原性組成物は、他の経路により投与することもできる。例えば、このような他の経路は、皮内投与、静脈内投与、血管内投与、動脈内投与、腹腔内投与、髄腔内投与、気管内投与、皮内投与、心内投与、肺葉内（ｉｎｔｒａｌｏｂａｌｌｙ、ｉｎｔｒａｌｏｂａｒｌｙ）投与、髄内投与、肺内投与、直腸内投与、および膣内投与を含む。しかし、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せは、皮下投与または筋内投与することがより好ましい。免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せは、筋内投与することが最も好ましい。
本明細書では、以下の条項について記載される。
１．（ａ）少なくとも１つのブタパルボウイルス（ＰＰＶ）抗原であって、ＰＰＶに含有される、任意の抗原である、少なくとも１つのＰＰＶ抗原と、
（ｂ）少なくとも１つのブタ繁殖呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）ウイルス抗原であって、ＰＲＲＳウイルスに含有される、任意の抗原である、少なくとも１つのＰＲＲＳウイルス抗原と
を含む免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
２．ＰＰＶが、弱毒化生／改変生ＰＰＶウイルス、死滅／不活化ＰＰＶウイルス（例えば、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ Ｐａｒｖｏ）、死滅／不活化ＰＰＶ株０１４、ブタパルボウイルスのドイツ野生分離株であるＰＰＶ−２７ａおよびＰＰＶ−１４３ａならびにブタパルボウイルスのワクチンウイルスであるＰＰＶ−ＮＡＤＬ−２およびＰＰＶ−ＩＤＴ（ＭＳＶ）からなる群から選択される、条項１による免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
３．少なくとも１つのＰＰＶ抗原が、１つまたは複数のＰＰＶサブユニットである、条項１〜２のうちのいずれか１項による免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
４．少なくとも１つのＰＰＶサブユニットが、ＰＰＶウイルスタンパク質２（ＶＰ２）である、条項１〜３のうちのいずれか１項による免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
５．ＰＰＶ ＶＰ２が、唯一のＰＰＶ抗原である、条項４による免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
６．ＰＰＶ ＶＰ２が、
・２２８位のアミノ酸において、グルタミン酸残基を有し、かつ／または
・４１４位のアミノ酸において、セリン残基を有し、かつ／または
・４１９位のアミノ酸において、グルタミン残基を有し、かつ／または
・４３６位のアミノ酸において、トレオニン残基
を有し、
アミノ酸位置の番号付けが、野生型ＰＰＶ ＶＰ２のアミノ酸配列を指す、条項４〜５のうちのいずれか１項による免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
７．ＰＰＶ ＶＰ２が、
・２５位のアミノ酸において、イソロイシン残基を有し、かつ／または
・３６位のアミノ酸において、セリン残基を有し、かつ／または
・３７位のアミノ酸において、イソロイシン残基
をさらに有する、条項６による免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
８．アミノ酸位置の番号付けが、配列番号１に示されるアミノ酸配列を指す、条項６〜７のうちのいずれか１項による免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
９．ＰＰＶ ＶＰ２が、組換えＰＰＶ ＶＰ２である、条項４〜８のうちのいずれか１項による免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
１０．ＰＰＶ ＶＰ２が、組換えバキュロウイルスにより発現させたＰＰＶ ＶＰ２である、条項９による免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
１１．ＰＰＶ ＶＰ２が、配列番号１、配列番号２、および／または配列番号５〜１６のアミノ酸配列と、少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、条項４〜１０のうちのいずれか１項による免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
１２．ＰＰＶ ＶＰ２が、配列番号１、配列番号２、および／または配列番号５〜１６のアミノ酸配列と、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、条項１１による免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
１３．ＰＰＶ ＶＰ２が、配列番号１、配列番号２、または配列番号５〜１６のアミノ酸配列を含むか、もしくはこれからなるか、または、配列番号１、配列番号２、もしくは配列番号５〜１６に由来する、少なくとも２１０個、少なくとも２５０個、もしくは少なくとも３００個の連続アミノ酸残基を有する任意の断片を含むか、もしくはこれからなる、条項１２による免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
１４．ＰＰＶ ＶＰ２が、配列番号１、配列番号２、または配列番号５〜１６のアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、条項１３による免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
１５．ＰＰＶ ＶＰ２が、配列番号１、配列番号２、および／または配列番号５〜１６のアミノ酸配列と、少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によりコードされる、条項４〜１４のうちのいずれか１項による免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
１６．ＰＰＶ ＶＰ２が、配列番号１、配列番号２、および／または配列番号５〜１６のアミノ酸配列と、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によりコードされる、条項１５による免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
１７．ＰＰＶ ＶＰ２が、配列番号１、配列番号２、または配列番号５〜１６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によりコードされる、条項１６による免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
１８．ＰＲＲＳウイルスが、ＰＲＲＳウイルス遺伝子型１、ＰＲＲＳウイルス遺伝子型２からなる群から選択され、ＰＲＲＳウイルス遺伝子型１が、配列番号１７（レイスタッド野生型配列）の核酸配列と、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされるゲノムを含み、ＰＲＲＳウイルス遺伝子型２が、配列番号１８（ＶＲ２３３２野生型配列）の核酸配列と、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされるゲノムを含む、条項１〜１６のうちのいずれか１項による免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
１９．ＰＲＲＳウイルスが、弱毒化生／改変生ＰＲＲＳウイルス、１型遺伝子型弱毒化生／改変生ＰＲＲＳウイルス（例えば、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ ＰＲＲＳ、Ｕｎｉｓｔｒａｉｎ ＰＲＲＳ、Ａｍｅｒｖａｃ ＰＲＲＳ）、２型遺伝子型弱毒化生／改変生ＰＲＲＳウイルス（例えば、Ｉｎｇｅｌｖａｃ（登録商標）ＰＲＲＳ ＭＬＶ、Ｆｏｓｔｅｒａ ＰＲＲＳ）、弱毒化生／改変生ＰＲＲＳウイルス株９４８８１［（遺伝子型１）、ＲｅｐｒｏＣｙｃ（登録商標）ＰＲＲＳ ＥＵ］、死滅／不活化ＰＲＲＳウイルス、１型遺伝子型死滅／不活化ＰＲＲＳウイルス（例えば、Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｓ）、２型遺伝子型死滅／不活化ＰＲＲＳウイルス、レイスタッドウイルス株（ＣＤＩ−ＮＬ−２．９１、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ、寄託番号：Ｉ−１１０２）、ＰＲＲＳウイルスサブユニット、または受託番号：ＥＣＡＣＣ ０４１０２７０３、ＥＣＡＣＣ ０４１０２７０２、ＥＣＡＣＣ ０４１０２７０４、ＣＮＣＭ受託番号：Ｉ−１１４０、ＣＮＣＭ受託番号：Ｉ−１３８７、ＣＮＣＭ受託番号：Ｉ−１３８８、ＡＴＣＣ ＶＲ２３３２、ＶＲ ２３８５、ＶＲ ２３８６、ＶＲ ２４２９、ＶＲ ２４７４、およびＶＲ ２４０２；ＣＮＣＭＩ−１１０２、ＣＮＣＭＩ−１１４０、ＣＮＣＭＩ−１３８７、ＣＮＣＭＩ−１３８８、またはＥＣＡＣＣ Ｖ９３０７０１０８、北米ＰＲＲＳウイルスｐＴ７Ｐ１２９Ａ（ＡＴＣＣ受託番号：２０３４８８）、ＡＴＣＣ寄託物ＶＲ−２３３２、ＡＴＣＣ寄託物ＶＲ−２３６８；ＡＴＣＣ ＶＲ−２４９５；ＡＴＣＣ ＶＲ２３８５、ＡＴＣＣ ＶＲ２３８６、ＡＴＣＣ ＶＲ２４２９、ＡＴＣＣ ＶＲ２４７４、およびＡＴＣＣ ＶＲ２４０２の下で寄託された株など、他の株からなる群から選択される、条項１８による免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
２０．少なくとも１つのＰＰＶ抗原が、１つまたは複数のＰＰＶサブユニットであり、好ましくは、少なくとも１つのＰＰＶ抗原は、ＰＰＶウイルスタンパク質２（ＶＰ２）であり、より好ましくは、ＰＰＶ ＶＰ２は、唯一のＰＰＶ抗原であり、かつ、少なくとも１つのＰＲＲＳウイルス抗原が、弱毒化生／改変生ＰＲＲＳウイルス、好ましくは、１型遺伝子型弱毒化生／改変生ＰＲＲＳウイルス（例えば、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ ＰＲＲＳ、Ｕｎｉｓｔｒａｉｎ ＰＲＲＳ、Ａｍｅｒｖａｃ ＰＲＲＳ）、より好ましくは、弱毒化生／改変生ＰＲＲＳウイルス株９４８８１［（遺伝子型１）、ＲｅｐｒｏＣｙｃ（登録商標）ＰＲＲＳ ＥＵ］、および２型遺伝子型弱毒化生／改変生ＰＲＲＳウイルス（例えば、Ｉｎｇｅｌｖａｃ（登録商標）ＰＲＲＳ ＭＬＶ、Ｆｏｓｔｅｒａ ＰＲＲＳ）である、条項１〜１９のうちのいずれか１項による免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
２１．単回投与または２回投与のために製剤化される、条項１〜２０のうちのいずれか１項による免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
２２．筋内投与される、条項１〜２１のうちのいずれか１項による免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
２３．妊娠時および授乳時の未経産ブタおよび／または雌ブタに安全である、条項１〜２２のうちのいずれか１項による免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
２４．妊娠３０日目、好ましくは、妊娠４０日目からの未経産ブタおよび／または雌ブタに安全である、条項２３による免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
２５．少なくとも１つの薬学的に許容される担体をさらに含む、条項１〜２４のうちのいずれか１項による免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
２６．少なくとも１つの薬学的に許容される担体が、カルボマーである、条項２５による免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
２７．０．１μｇ〜５０μｇのＰＰＶ ＶＰ２抗原、好ましくは、０．５μｇ〜１０μｇのＰＰＶ ＶＰ２抗原、より好ましくは、１．０μｇ〜１０μｇのＰＰＶ ＶＰ２抗原、および／または３．９〜７．０ ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50のＰＲＲＳウイルスを含む、条項４〜２６のうちのいずれか１項による免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
２８．ワクチンである、条項１〜２７のうちのいずれか１項による免疫原性組成物または組合せ。
２９．ＰＰＶの同種抗原投与および／もしくは異種抗原投与、および／またはＰＲＲＳウイルスの同種抗原投与および／もしくは異種抗原投与に対して防御する、条項１〜２８のうちのいずれか１項による免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
３０．ＰＰＶの北米分離株および／もしくは欧州分離株による抗原投与に対して、かつ／またはＰＲＲＳウイルスの北米分離株および／もしくは欧州分離株による抗原投与に対して防御する、条項１〜２９のうちのいずれか１項による免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
３１．ＰＰＶの北米分離株および／もしくは欧州分離株に対して交差防御性であり、かつ／またはＰＲＲＳウイルスの北米分離株および／もしくは欧州分離株に対して交差防御性である、条項１〜３０のうちのいずれか１項による免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
３２．それを必要とする対象における、ＰＰＶ感染および／またはＰＲＲＳウイルス感染により引き起こされる臨床徴候を、処置および／または予防するのに有効である、条項１〜３１のうちのいずれか１項による免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
３３．少なくとも１つのブタパルボウイルス（ＰＰＶ）抗原と、少なくとも１つのブタ繁殖呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）ウイルス抗原とが、単一の容器に併せて含有されるか、または互いと空間的に分離され、好ましくは、２つまたはこれを超える個別の容器に含有される、条項１〜３１のうちのいずれか１項による免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
３４．条項１〜３３のうちのいずれか１項による免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せを含むキット。
３５．少なくとも１つのブタパルボウイルス（ＰＰＶ）抗原と、少なくとも１つのブタ繁殖呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）ウイルス抗原とが、２つまたはこれを超える個別の容器に、互いと別々に、好ましくは、いずれも、乾燥凍結形態または凍結形態で、互いと独立に含有され、キットが、空間的に分離された少なくとも１つのＰＰＶ抗原と、少なくとも１つのＰＲＲＳウイルス抗原とを混合するための取扱説明書をさらに含み、好ましくは、このような取扱説明書が、少なくとも１つのＰＰＶ抗原を含有する容器の内容物を、少なくとも１つのＰＰＲＳウイルス抗原を含有する容器の内容物と組み合わせる指示を含有し、より好ましくは、少なくとも１つのＰＰＶ抗原を含有する容器の液体内容物を、少なくとも１つのＰＰＲＳウイルス抗原を含有する容器の乾燥凍結内容物のための希釈剤として使用する、条項３４によるキット。
３６．ブタにおける疾患を処置および／もしくは予防するための指示をさらに含み、かつ／またはＰＰＶ感染および／もしくはＰＲＲＳウイルス感染を処置および／もしくは予防するための指示をさらに含み、好ましくは、条項１〜３３のうちのいずれか１項による、免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せの、ＰＰＶ構成要素およびＰＲＲＳＶ構成要素の、関連する使用のための指示をさらに含む、条項３４〜３５のうちのいずれか１項によるキット。
３７．医薬、好ましくは、ワクチンを調製するための、条項１〜３３のうちのいずれか１項による免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ、または条項３４〜３６のうちのいずれか１項によるキットの使用。
３８．ＰＰＶおよび／もしくはＰＲＲＳウイルスの感染の処置および／もしくは防止、ＰＰＶおよび／もしくはＰＲＲＳウイルスの感染により引き起こされる臨床徴候の軽減、防止、もしくは処置、またはＰＰＶおよび／もしくはＰＲＲＳウイルスの感染により引き起こされる疾患の処置および／もしくは防止のための医薬を調製するための、条項３７による使用。
３９．対象を免疫化する方法であって、このような対象へと、条項１〜３３のうちのいずれか１項による免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せを投与するステップを含む方法。
４０．それを必要とする対象における、好ましくは、ブタにおける、ＰＰＶ感染および／またはＰＲＲＳウイルス感染により引き起こされる臨床徴候、好ましくは、ブタ繁殖呼吸障害症候群を処置および／または防止する方法であって、対象へと、治療有効量の、条項１〜３３のうちのいずれか１項による免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せを投与するステップを含む方法。
４１．対象における生殖障害を、同じ種の非免疫化対照群の対象と比較して軽減する方法であって、対象へと、治療有効量の、条項１〜３３のうちのいずれか１項による免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せを投与するステップを含む方法。
４２．対象における胚死および胎仔死を、同じ種の非免疫化対照群の対象と比較して軽減する方法であって、対象へと、治療有効量の、条項１〜３３のうちのいずれか１項による免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せを投与するステップを含む方法。
４３．前記対象が、ブタ、ウシ、ネコ、およびイヌ、好ましくは、ブタ、より好ましくは、雌ブタおよび／または未経産ブタからなる群から選択される、条項３９〜４２のうちのいずれか１項による方法。
４４．免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せを、１回、または２回もしくはこれを超える回数にわたり投与する、条項３９〜４３のうちのいずれか１項による方法。
４５．免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せを、筋内投与する、条項３９〜４４のうちのいずれか１項による方法。
４６．免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せを、未経産ブタおよび／または雌ブタ、好ましくは、少なくとも３週齢である雌ブタ、より好ましくは、妊娠前の雌ブタ、なおより好ましくは、妊娠時および授乳時の雌ブタへと投与する、条項３９〜４５のうちのいずれか１項による方法。
４７．免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せが、妊娠時および授乳時の未経産ブタおよび／または雌ブタに安全である、条項３９〜４６のうちのいずれか１項による方法。
４８．免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せが、妊娠３０日目、好ましくは、妊娠４０日目からの雌ブタおよび／または未経産ブタに安全である、条項３９〜４７のうちのいずれか１項による方法。
４９．免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せが、０．１μｇ〜５０μｇのＰＰＶ ＶＰ２抗原、好ましくは、０．５μｇ〜１０μｇのＰＰＶ ＶＰ２抗原、より好ましくは、１．０μｇ〜１０μｇのＰＰＶ ＶＰ２抗原、および／または３．９〜７．０ ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50のＰＲＲＳウイルスを含む、条項３９〜４８のうちのいずれか１項による方法。
５０．免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せが、ＰＰＶの同種抗原投与および／もしくは異種抗原投与、および／またはＰＲＲＳウイルスの同種抗原投与および／もしくは異種抗原投与に対して防御する、条項３９〜４９のうちのいずれか１項による方法。
５１．免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せが、ＰＰＶの北米分離株および／もしくは欧州分離株による抗原投与に対して、かつ／またはＰＲＲＳウイルスの北米分離株および／もしくは欧州分離株による抗原投与に対して防御する、条項３９〜５０のうちのいずれか１項による方法。
５２．免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せが、ＰＰＶの北米分離株および／もしくは欧州分離株に対して交差防御性であり、かつ／またはＰＲＲＳウイルスの北米分離株および／もしくは欧州分離株に対して交差防御性である、条項３９〜５１のうちのいずれか１項による方法。
５３．胚および／もしくは胎仔の感染および死、またはこれらの組合せを特徴とする、一過性の白血球減少症および生殖障害の、同じ種の非免疫化対照群の対象と比較した軽減からなる群から選択される、少なくとも１つの有効性パラメータの改善を結果としてもたらす、条項３９〜５２のうちのいずれか１項による方法。
５４．少なくとも１つのブタパルボウイルス（ＰＰＶ）抗原と、少なくとも１つのブタ繁殖呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）ウイルス抗原とを、対象へと、同時に、好ましくは、同じまたは異なる投与部位に、個別に同時に、逐次的に（任意の順序で）、かつ／または時間を前後して投与する、条項３９〜５３のうちのいずれか１項による方法。
５５．ブタパルボウイルス感染に対して、胚および胎仔を保護するための、繁殖用ブタ（雌ブタおよび未経産ブタ）の能動的免疫化のための、条項３９〜５４のうちのいずれか１項による方法であって、このようなブタ（雌ブタおよび未経産ブタ）へと、条項１〜３３のうちのいずれか１項による免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せを投与するステップを含む方法。
５６．対象を免疫化する方法であって、前記免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せを、このような対象へと投与するステップを含む方法における使用のための、条項１〜３３のうちのいずれか１項による免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
５７．それを必要とする対象における、好ましくは、ブタにおける、ＰＰＶ感染および／またはＰＲＲＳウイルス感染により引き起こされる臨床徴候、好ましくは、ブタ繁殖呼吸障害症候群を処置および／または防止する方法であって、対象へと、治療有効量の、前記免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せを投与するステップを含む方法における使用のための、条項１〜３３のうちのいずれか１項による免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
５８．対象における生殖障害を、同じ種の非免疫化対照群の対象と比較して軽減する方法であって、対象へと、治療有効量の、前記免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せを投与するステップを含む方法における使用のための、条項１〜３３のうちのいずれか１項による免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
５９．対象における胚死および胎仔死を、同じ種の非免疫化対照群の対象と比較して軽減する方法であって、対象へと、治療有効量の、前記免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せを投与するステップを含む方法における使用のための、条項１〜３３のうちのいずれか１項による免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
６０．前記対象が、ブタ、ウシ、ネコ、およびイヌ、好ましくは、ブタ、より好ましくは、雌ブタおよび／または未経産ブタからなる群から選択される、条項５６〜５９のうちのいずれか１項による使用のための、条項１〜３３のうちのいずれか１項による免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
６１．免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せを、１回、または２回もしくはこれを超える回数にわたり投与する、条項５６〜６０のうちのいずれか１項による使用のための、条項１〜３３のうちのいずれか１項による免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
６２．免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せを、筋内投与する、条項５６〜６１のうちのいずれか１項による使用のための、条項１〜３３のうちのいずれか１項による免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
６３．免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せを、未経産ブタおよび／または雌ブタ、好ましくは、少なくとも３週齢である雌ブタ、より好ましくは、妊娠前の雌ブタ、なおより好ましくは、妊娠時および授乳時の雌ブタへと投与する、条項５６〜６２のうちのいずれか１項による使用のための、条項１〜３３のうちのいずれか１項による免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
６４．免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せが、妊娠時および授乳時の未経産ブタおよび／または雌ブタに安全である、条項５６〜６３のうちのいずれか１項による使用のための、条項１〜３３のうちのいずれか１項による免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
６５．免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せが、妊娠３０日目、好ましくは、妊娠４０日目からの未経産ブタおよび／または雌ブタに安全である、条項５６〜６４のうちのいずれか１項による使用のための、条項１〜３３のうちのいずれか１項による免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
６６．免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せが、０．１μｇ〜５０μｇのＰＰＶ ＶＰ２抗原、好ましくは、０．５μｇ〜１０μｇのＰＰＶ ＶＰ２抗原、より好ましくは、１．０μｇ〜１０μｇのＰＰＶ ＶＰ２抗原、および／または３．９〜７．０ ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50のＰＲＲＳウイルスを含む、条項５６〜６５のうちのいずれか１項による使用のための、条項１〜３３のうちのいずれか１項による免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
６７．免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せが、ＰＰＶの同種抗原投与および／もしくは異種抗原投与に対して防御し、かつ／またはＰＲＲＳウイルスの同種抗原投与および／もしくは異種抗原投与に対して防御する、条項５６〜６６のうちのいずれか１項による使用のための、条項１〜３３のうちのいずれか１項による免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
６８．免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せが、ＰＰＶの北米分離株および／もしくは欧州分離株による抗原投与に対して防御し、かつ／またはＰＲＲＳウイルスの北米分離株および／もしくは欧州分離株による抗原投与に対して防御する、条項５６〜６７のうちのいずれか１項による使用のための、条項１〜３３のうちのいずれか１項による免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
６９．免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せが、ＰＰＶの北米分離株および／もしくは欧州分離株に対して交差防御性であり、かつ／または、ＰＲＲＳウイルスの北米分離株および／もしくは欧州分離株に対して交差防御性である、条項５６〜６８のうちのいずれか１項による使用のための、条項１〜３３のうちのいずれか１項による免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
７０．前記方法が、胚および／もしくは胎仔の感染および死、またはこれらの組合せを特徴とする、同じ種の非免疫化対照群の対象と比較して、一過性の白血球減少症および生殖障害からなる群から選択される、少なくとも１つの有効性パラメータの改善を結果としてもたらす、条項５６〜６９のうちのいずれか１項による使用のための、条項１〜３３のうちのいずれか１項による免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
７１．少なくとも１つのブタパルボウイルス（ＰＰＶ）抗原と、少なくとも１つのブタ繁殖呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）ウイルス抗原とを、対象へと、同時に、好ましくは、同じまたは異なる投与部位に、個別に同時に、逐次的に（任意の順序で）、かつ／または時間を前後して投与する、条項５６〜７０のうちのいずれか１項による使用のための、条項１〜３３のうちのいずれか１項による免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
７２．ブタパルボウイルス感染に対して、胚および胎仔を保護するための、繁殖用ブタ（雌ブタおよび未経産ブタ）の能動的免疫化のための方法であって、前記免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せを、このようなブタ（雌ブタおよび未経産ブタ）へと投与するステップを含む方法における使用のための条項１〜３３のうちのいずれか１項による免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
本発明の第２の検討事項
一態様では、本発明は、組換えタンパク質を含む免疫原性組成物を作製する方法であって、以下の順序で、
（ｉ）・第１の液体、
・組換えタンパク質、および／または複数の前記組換えタンパク質から構成される四次構造、ならびに
・前記組換えタンパク質をコードする核酸配列を含むベクター
を含む混合物を用意する／得るステップと；
（ｉｉ）第２の液体を、ステップ（ｉ）の混合物へと添加するステップであって、第２の液体が、第１の液体と異なるステップと；
（ｉｉｉ）さらなる第２の液体を、ステップ（ｉｉ）から得られる混合物へと、さらに添加し、第１の液体および／または第２の液体の一部を、このような、組み合わされた混合物から除去することにより、混合物中の、組換えタンパク質、および／または複数の前記組換えタンパク質から構成される四次構造を洗浄し、任意選択で、これを最終的に濃縮するステップと；
（ｉｖ）不活化剤を、ステップ（ｉｉｉ）から得られる混合物へと添加することにより、ベクターを不活化させるステップと；
（ｖ）中和剤を、ステップ（ｉｖ）から得られる混合物へと添加することにより、不活化剤を中和するステップと
を含む方法に関する。
本発明の目的で、「第１の液体」とは、典型的に、細胞、抗原、免疫原性組成物、ワクチンなどと組み合わせて使用される、液体、水性、または流体の培地を指す。好ましくは、第１の液体は、抗原組成物に由来する培地を含み；より好ましくは、第１の液体は、培養宿主細胞内で、組換えタンパク質を作製するために使用される、細胞培養物培地を含むか、または、好ましくは、これからなる。前記培養宿主細胞は、細菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞、および哺乳動物細胞でありうるが、昆虫細胞および哺乳動物細胞が、特に、好ましい。したがって、第１の液体は、細菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞、または哺乳動物細胞を培養するための培地を含みうるか、またはこれからなりうる。好ましくは、細胞培地は、無血清細胞培地であり、最も好ましくは、昆虫細胞を使用する場合、培養培地は、Ｅｘｃｅｌｌ ４２０無血清培地である。
本発明の目的では、「第２の液体」とは、通常、細胞、抗原、免疫原性組成物、ワクチンなどと組み合わせて使用される、任意の液体であって、第１の液体と異なる液体を指す。好ましくは、第２の液体は、水溶液であり、なおより好ましくは、薬学的に許容される溶液であり、なおより好ましくは、生理食塩液またはリン酸緩衝液などの緩衝液である。最も好ましくは、第２の液体は、生ウイルスまたは生細菌を、このような液体中で培養または保管する場合に、生ウイルスまたは生細菌に対して殺ウイルス性ではないことを特徴とする。
本発明の目的では、「一部」とは、総量を包含しない、任意の量を指す。例えば、液体の一部は、液体の容量のうちの１００％未満など、液体のうちの９０％、液体のうちの８０％、液体のうちの７０％、および０％を超える量〜１００％未満の間の全ての量であろう。
本発明の目的の「組換えタンパク質」は、任意の組換えタンパク質、好ましくは、ＰＰＶ ＶＰ２タンパク質、より好ましくは、配列番号１、配列番号２、および／または配列番号５〜１６の配列との、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含むか、またはこれからなる、ＰＰＶ ＶＰ２タンパク質を指す。
本発明の目的のための「四次構造」ならびに「複数の前記組換えタンパク質から構成される四次構造」とは、ウイルス様粒子および／またはホモ三量体など、複数の前記組換えタンパク質の三次元的配置を指す。
本発明の目的のための「ベクター」ならびに「前記組換えタンパク質をコードする核酸配列を含むベクター」とは、適切な発現ベクター、好ましくは、バキュロウイルス発現ベクターを指し、次にこれを使用して、ＤＮＡによりコードされるタンパク質またはポリペプチドを作製するように、宿主細胞にトランスフェクトする、または、バキュロウイルス発現ベクターの場合には、これに感染させる。
ベクター、ならびに発現のためのベクター（または組換え体）を作製および／または使用するための方法は、米国特許第４，６０３，１１２号、同第４，７６９，３３０号、同第５，１７４，９９３号、同第５，５０５，９４１号、同第５，３３８，６８３号、同第５，４９４，８０７号、同第４，７２２，８４８号、同第５，９４２，２３５号、同第５，３６４，７７３号、同第５，７６２，９３８号、同第５，７７０，２１２号、同第５，９４２，２３５号、同第３８２，４２５号、ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／１６７１６号、同第ＷＯ９６／３９４９１号、同第ＷＯ９５／３００１８号；Paoletti, “Applications of pox virus vectors to vaccination: An update, “PNAS USA 93: 11349-11353, October 1996; Moss, “Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety,” PNAS USA 93: 11341-11348, October 1996；Ｓｍｉｔｈら、米国特許第４，７４５，０５１号（組換えバキュロウイルス）；Richardson, C. D. (Editor), Methods in Molecular Biology 39, “Baculovirus Expression Protocols” (1995 Humana Press Inc.); Smith et al., “Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector”, Molecular and Cellular Biology, December, 1983, Vol. 3, No. 12, p. 2156-2165;Pennock et al., “Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector, “Molecular and Cellular Biology March 1984, Vol. 4, No. 3, p. 406;欧州特許出願第０３７０５７３号；１９８６年１０月１６日に出願された米国出願第９２０，１９７号；欧州特許公開第２６５７８５号；米国特許第４，７６９，３３１号（組換えヘルペスウイルス）；Roizman, “The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors,” PNAS USA 93:11307-11312, October 1996;Andreansky et al., “The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors,” PNAS USA 93: 11313-11318, October 1996;Robertson et al., “Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes”, PNAS USA 93: 11334-11340, October 1996;Frolov et al., “Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications,” PNAS USA 93: 11371-11377, October 1996;Kitson et al., J. Virol. 65, 3068-3075, 1991;米国特許第５，５９１，４３９号、同第５，５５２，１４３号；ＷＯ９８／００１６６；いずれも、１９９６年７月３日に出願され、許可された、米国出願第０８／６７５，５５６号、および同第０８／６７５，５６６号（組換えアデノウイルス）；Grunhaus et al., 1992, “Adenovirus as cloning vectors,” Seminars in Virology (Vol. 3) p. 237-52, 1993;Ballay et al. EMBO Journal, vol. 4, p. 3861-65, Graham, Tibtech 8, 85-87, April, 1990; Prevec et al., J. Gen Virol. 70, 42434;ＰＣＴ ＷＯ９１／１１５２５；Felgner et al. (1994), J. Biol. Chem. 269, 2550-2561, Science, 259: 1745-49, 1993;およびMcClements et al., “Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease”, PNAS USA 93: 11414-11420, October 1996;ならびに米国特許第５，５９１，６３９号、同第５，５８９，４６６号、および同第５，５８０，８５９号のほか、ＷＯ９０／１１０９２、ＷＯ９３／１９１８３、ＷＯ９４／２１７９７、ＷＯ９５／１１３０７、ＷＯ９５／２０６６０；とりわけ、ＤＮＡ発現ベクターに関する、Tang et al., Nature, and Furth et al., Analytical Biochemistryにおいて開示されている方法を介する場合もあり、これと類似する場合もある。また、ＷＯ９８／３３５１０；Ju et al., Diabetologia, 41: 736-739, 1998(レンチウイルス発現系); Ｓａｎｆｏｒｄら、米国特許第４，９４５，０５０号；Fischbach et al.（イントラセル）；ＷＯ９０／０１５４３；Robinson et al., Seminars in Immunology vol. 9, pp. 271-283 (1997)（ＤＮＡベクター系）；Ｓｚｏｋａら、米国特許第４，３９４，４４８号（生細胞にＤＮＡを挿入する方法）；ＭｃＣｏｒｍｉｃｋら、米国特許第５，６７７，１７８号（細胞変性ウイルスの使用）；および米国特許第５，９２８，９１３号（遺伝子送達のためのベクター）のほか、本明細書で引用される他の文献も参照されたい。
好ましい細胞は、組換えタンパク質のＤＮＡを含有し、組換えタンパク質を発現させる、適切な組換えウイルスベクターの感染に感受性の細胞である。好ましくは、細胞は、昆虫細胞であり、より好ましくは、昆虫細胞は、ＳＦ＋昆虫細胞の商標（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＣＴ）下で市販されている昆虫細胞を含む。好ましい細胞培地は、１ｍＬ当たりの細胞約０．３〜２．０×１０6個、より好ましくは、１ｍＬ当たりの細胞約０．３５〜１．９×１０6個、さらにより好ましくは、１ｍＬ当たりの細胞約０．４〜１．８×１０6個、なおより好ましくは、１ｍＬ当たりの細胞約０．４５〜１．７×１０6個の間であり、最も好ましくは、１ｍＬ当たりの細胞約０．５〜１．５×１０6個の間である、細胞カウントを有する。
好ましいウイルスベクターは、特に、作製細胞が、昆虫細胞であるならば、ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）などのバキュロウイルスを含む。バキュロウイルス発現系が好ましいが、当業者により、上記で記載した発現系を含む、他の発現系も、本発明の目的、すなわち、組換えタンパク質の発現のために働くことが理解される。
また、適切な増殖培地も、当業者により決定可能であり、好ましい増殖培地は、Ｅｘｃｅｌｌ ４２０（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ）などの無血清昆虫細胞培地である。
組換えタンパク質のＤＮＡ配列を含有する組換えウイルスベクターは、感受性細胞の感染に使用される場合、約０．０３〜１．５、より好ましくは、約０．０５〜１．３、さらにより好ましくは、約０．０９〜１．１の間であり、最も好ましくは、約０．１〜１．０の間である、好ましい感染多重度（ＭＯＩ）を有する。好ましくは、上記で言及したＭＯＩは、１ｍＬの細胞培養液に関する。好ましくは、本明細書で記載される方法は、１ｍＬ当たりの細胞０．３５〜１．９×１０6個、さらにより好ましくは、１ｍＬ当たりの細胞約０．４〜１．８×１０6個、なおより好ましくは、１ｍＬ当たりの細胞約０．４５〜１．７×１０6個であり、最も好ましくは、１ｍＬ当たりの細胞約０．５〜１．５×１０6個への、組換えウイルスベクターであって、組換えタンパク質のＤＮＡを含有し、約０．０３〜１．５、より好ましくは、約０．０５〜１．３、さらにより好ましくは、約０．０９〜１．１の間であり、最も好ましくは、約０．１〜１．０の間であるＭＯＩ（感染多重度）を有する組換えタンパク質を発現させる組換えウイルスベクターの感染を含む。
フィルターを用いる濾過ステップにより、組換えタンパク質を含む、組み合わされたステップ（ｉｉｉ）の混合物から、第１の液体の一部を除去することができる。しかし、当業者に公知の、他の任意の方法を使用して、組み合わされたステップ（ｉｉｉ）の混合物から、第１の液体を含む、任意の液体の一部と、該当する場合ならいつでも、第２の液体の一部とを除去することもできる。このような方法は、例えば、遠心分離および／またはクロマトグラフィーを含むがこれらに限定されない。しかし、濾過が最も好ましい。前記第１の液体の一部、または、該当する場合ならいつでも、他の任意の液体を除去するのに好ましい濾過方法は、限外濾過および／または透析濾過を含む。限外濾過および透析濾過は、当業者に公知の標準法であって、例えば、Protein Purification Methods - A Practical Approach - editors: E.L.V. Harris and S. Angel, Oxford University Press 1995（その内容および教示が、参照により本明細書に組み込まれている）に詳細に記載されている標準法である。特に、この教科書の第３章では、当業者が、本発明の目的で、例示的な形で、それらの全てを使用しうる、いくつかの方法およびいくつかの種類の装置が記載されている。
本発明の目的の「不活化剤」とは、従来の任意の不活化法において使用されうる、任意の薬剤を指す。不活化は、当業者に公知の化学的処理および／または物理的処理により実施することができる。好ましい不活化剤は、バイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）へと環化された、２−ブロモエチレンアミンヒドロブロミド（ＢＥＡ）の溶液を含む、環化バイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）を含む。好ましい、さらなる化学的不活化剤は、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、デオキシコール酸ナトリウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、β−プロピオラクトン、チメロサール、フェノール、およびホルムアルデヒド（ホルマリン）を含むがこれらに限定されない。
本発明の目的の「中和剤」とは、不活化剤に、ベクターを不活化させることが、もはや可能でなくなるように、本明細書に記載される不活化剤を中和することが可能な、任意の薬剤を指す。不活化剤を中和する薬剤は、好ましくは、チオ硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウムなどである。
別の態様では、本発明は、ステップ（ｉ）の混合物が、
（ａ）培養物中の感受性の細胞への、前記組換えタンパク質、および／または複数の前記組換えタンパク質から構成される四次構造をコードする核酸配列を含むベクターの感染を可能とするステップであって、前記組換えタンパク質、および／または複数の前記組換えタンパク質から構成される四次構造を、前記ベクターにより発現させるステップと、
（ｂ）その後、組換えタンパク質、および／または複数の前記組換えタンパク質から構成される四次構造を、細胞培養物から回収するステップであって、少なくとも１つのフィルター、より好ましくは、２つのフィルターを通す精密濾過を好ましくは含む分離ステップを介して、細胞破砕物を、組換えタンパク質、および／または複数の前記組換えタンパク質から構成される四次構造から分離することが好ましく、少なくとも１つのフィルターが、好ましくは、組換えタンパク質、および／または複数の前記組換えタンパク質から構成される四次構造より大きな小孔サイズを有し、特に、約０．１μｍ〜約４μｍの小孔サイズを有するステップと
を含む手順により得られる、本明細書で記載および特許請求される方法に関する。
別の態様では、本発明は、ステップ（ａ）における細胞培養物が、好ましくは、組換えタンパク質、および／または複数の前記組換えタンパク質から構成される四次構造を、前記ベクターにより発現させる間、２７±２℃で維持され、かつ／またはステップ（ｂ）における回収することが、細胞へのベクターの接種の６〜８日後、好ましくは、８日後になされる、本明細書で記載および特許請求される方法に関する。
別の態様では、本発明は、分離ステップが、
・約２μｍ〜約４μｍの小孔サイズを有する、少なくとも１つのフィルターを通す精密濾過、および／または
・約０．１μｍ〜約０．８μｍの小孔サイズを有する、少なくとも１つのフィルターを通す精密濾過
を含むか、またはこれらからなる、本明細書で記載および特許請求される方法に関する。
別の態様では、本発明は、前記第１の液体が、細胞培養培地の一部を含むか、または細胞培養培地からなり、細胞培養培地が、好ましくは、昆虫細胞培養培地である、本明細書で記載および特許請求される方法に関する。
別の態様では、本発明は、前記組換えタンパク質が、
・好ましくは、配列番号１、配列番号２、および／または配列番号５〜１６の配列と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含むか、またはこれからなるＰＰＶ ＶＰ２タンパク質
からなる群から選択される、本明細書で記載および特許請求される方法に関する。
別の態様では、本発明は、複数の前記組換えタンパク質から構成される前記四次構造が、ウイルス様粒子であるか、または複数の前記組換えタンパク質から構成される前記四次構造が、ホモ三量体である、本明細書で記載および特許請求される方法に関する。
別の態様では、本発明は、ベクターが、組換えウイルス、好ましくは、バキュロウイルスであり、かつ／または核酸配列が、ＤＮＡ配列である、本明細書で記載および特許請求される方法に関する。
別の態様では、本発明は、前記組換えタンパク質、および／または複数の前記組換えタンパク質から構成される四次構造をコードする核酸を含むベクターが、組換えバキュロウイルスであり、前記バキュロウイルスが、前記組換えタンパク質、および／または複数の前記組換えタンパク質から構成される四次構造をコードするＤＮＡ配列を含む、本明細書で記載および特許請求される方法に関する。
別の態様では、本発明は、ステップ（ｉｉｉ）で、前記組換えタンパク質、および／または複数の前記組換えタンパク質から構成される前記四次構造を、第２の液体で、少なくとも２回、好ましくは、２回〜３回にわたり洗浄し、任意選択で、ステップ（ｉ）の混合物中の、前記組換えタンパク質、および／または複数の前記組換えタンパク質から構成される前記四次構造の元の体積と比較して、最終的に濃縮する、本明細書で記載および特許請求される方法に関する。より好ましくは、ステップ（ｉｉｉ）で、このような洗浄ステップ、すなわち、透析濾過の工程を、例えば、４℃〜２９℃の間の温度、例えば、２７℃または４℃など、３７℃より低い温度で、より好ましくは、３０℃より低い温度で、なおより好ましくは、２０℃より低い温度で、なおより好ましくは、１０℃より低い温度で実施し、これにより、沈殿（凝集）度を、著明に低減する。
別の態様では、本発明は、ステップ（ｉｉｉ）で、第１の液体および／または第２の液体の一部を、混合物から、濾過により除去し、好ましくは、前記組換えタンパク質、および／もしくは複数の前記組換えタンパク質から構成される前記四次構造より小さい平均小孔サイズを有する半透膜を含むフィルターもしくは中空フィルターを用い、かつ／または２０ｋＤａ〜５００ｋＤａのサイズのタンパク質の大部分、好ましくは、実質的に全ての、半透膜を通した通過を防止する、本明細書で記載および特許請求される方法に関する。
フィルターは、当技術分野における、従来の任意のフィルターでありうる。好ましくは、前記フィルターは、半透膜を含む。さらなる、好ましい形態では、前記半透膜は、組換えタンパク質より小さい平均小孔サイズを有して、これにより、前記組換えタンパク質のうちの少なくとも９０％の、前記半透膜孔を通した通過を防止し、フィルターにより、組換えタンパク質を引き留める。
さらなる態様では、前記フィルターは、２０ｋＤａ〜５００ｋＤａのサイズのタンパク質のうちの、少なくとも９０％の通過を防止する平均小孔サイズを有し、より好ましくは、前記フィルターは、５０ｋＤａ〜４００ｋＤａのサイズのタンパク質のうちの、少なくとも９０％の通過を防止する平均小孔サイズを有し、最も好ましくは、前記フィルターは、７５ｋＤａ〜３００ｋＤａのサイズのタンパク質のうちの、少なくとも９０％の通過を防止する平均小孔サイズを有する。この小孔サイズは、組換えタンパク質を、全ウイルスまたはウイルス様粒子として作製する場合に好ましい。なおさらなる態様では、前記半透膜は、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、および再生セルロースからなる群から選択される材料を含む。しかし、第１の液体の一部の除去を可能とし、工程ステップが複数の場合には、第１の液体と第２の液体との混合物の、組換えタンパク質からの除去を可能とする、他の任意の材料を使用することができる。前記フィルターは、中空糸膜限外濾過カートリッジ、中空糸膜限外濾過フラットシート、または中空糸膜限外濾過カセットからなる群から選択することができ、中空糸膜限外濾過カートリッジが、特に、好ましい。
記載される方法のうちのいずれかにおいて使用される、好ましい第２の液体は、緩衝液、好ましくは、生理学的に許容される緩衝液であり、生理食塩液が、特に、好ましい。
別の態様では、本発明は、第２の液体が、緩衝液、好ましくは、洗浄用リン酸緩衝生理食塩液（ＷＰＢＳ）である、本明細書で記載および特許請求される方法に関する。
本明細書で記載される方法の濃縮ステップと液体添加ステップとは、実質的に同時に実施することもでき、代替的に、濃縮ステップと液体添加ステップとは、逐次的に実施することもできる。
濃縮ステップと液体添加ステップとは、逐次的に実施する場合、ステップの順序は、問題とならない。例えば、さらなる態様では、液体添加ステップが、前記濃縮ステップの前になされ、代替的な態様では、濃縮ステップが、前記液体添加ステップの前になされる。液体添加ステップおよび濃縮ステップは、それらが実施される順序に関わらず、複数回にわたり実施することができる。例えば、これらのそれぞれのステップの各々は、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも１０回、所望される最大の回数にわたり実施することができる。一態様では、濃縮ステップおよび液体添加ステップは各々、少なくとも２回にわたり実施される。別の態様では、濃縮ステップおよび液体添加ステップは各々、少なくとも３回にわたり実施される。
本明細書で提示される方法の濃縮ステップは、組換えタンパク質が、前記第１の液体の容量と比較して、３倍〜５０倍に濃縮されるように実施することができる。より好ましくは、前記濃縮ステップは、組換えタンパク質が、前記第１の液体の容量と比較して、４倍〜２０倍に濃縮されるように行うことができる。最も好ましくは、前記濃縮ステップは、組換えタンパク質が、第１の液体の容量と比較して、７倍〜１０倍に濃縮されるように行うことができる。
別の態様では、本発明は、ステップ（ｉｉ）で添加される第２の液体の容量が、およそ、ステップ（ｉｉｉ）で除去される第１の液体および／または第２の液体の容量である本明細書で記載および特許請求される方法に関する。言い換えれば、濃縮ステップは、実施および／または要求されない。
組換えポックスウイルス、アデノウイルス、またはバキュロウイルスなどのウイルスベクターを使用して、組換えタンパク質を作製する場合、適切な不活化処置により、ウイルス核酸を不活化させることが推奨される。このような不活化は、組換えタンパク質の精製中のいかなる時点でもなされうる。したがって、不活化は、組換えタンパク質を含む細胞培養液の採取の直後になされる場合もあり、精密濾過を行う場合は、組換えタンパク質の精密濾過の後でなされる場合もあり、精製ステップを行う場合は、この前に、またはこの後で、例えば、ゲル濾過の前に、またはこの後であり、アニオン交換クロマトグラフィーの前に、またはこの後でなされる場合もある。
従来の任意の不活化法を、本発明の目的で使用することができる。したがって、不活化は、化学的処理および／または物理的処理により実施することができる。好ましい形態では、採取液の容量を決定し、温度を、約３２℃〜４２℃の間、より好ましくは、約３４℃〜４０℃の間とし、最も好ましくは、約３５℃〜３９℃の間とする。好ましい不活化法は、好ましくは、約１ｍＭ〜約２０ｍＭ、好ましくは、約２ｍＭ〜約１０ｍＭ、さらにより好ましくは、約２ｍＭ〜約８ｍＭ、さらにより好ましくは、約３ｍＭ〜約７ｍＭ、最も好ましくは、約５ｍＭの濃度で、環化バイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）の添加を含む。例えば、不活化は、流体に約５ｍＭのＢＥＩの最終濃度をもたらすように、０．３ＮのＮａＯＨ中に０．２Ｍのバイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）へと環化された、好ましくは、約０．４Ｍの、２−ブロモエチレンアミンヒドロブロミド（ＢＥＡ）溶液の添加を含む。好ましくは、次いで、流体を、２〜９６時間にわたり、連続的に攪拌し、不活化採取液を、−４０℃もしくはこれを下回る温度、または約１℃〜７℃の間で凍結させて保管することができる。不活化を完了させた後、好ましくは、１．０Ｍのチオ硫酸ナトリウム溶液を添加して、残存する任意のＢＥＩを中和する。好ましくは、チオ硫酸ナトリウムを、不活化のために添加したＢＥＩと比較して等量を添加する。例えば、ＢＥＩを、５ｍＭの最終濃度まで添加する場合は、残存する任意のＢＥＩを中和する、５ｍＭの最終最小濃度をもたらすように、１．０Ｍのチオ硫酸ナトリウム溶液を添加する。
別の態様では、本発明は、不活化剤が、アジリジン化合物、好ましくは、バイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）であり、かつ／または不活化剤が、ベクターと比べモル過剰量で添加される、本明細書で記載および特許請求される方法に関する。
別の態様では、本発明は、中和剤が、チオ硫酸ナトリウムであり、かつ／または中和剤が、不活化剤と比べモル過剰量で添加される、本明細書で記載および特許請求される方法に関する。
別の態様では、本発明は、ステップ（ｖ）の後で残存する混合物を、薬学的に許容される担体、アジュバント、希釈剤、賦形剤、およびこれらの組合せからなる群から選択される、さらなる成分と混合するステップをさらに含む、本明細書で記載および特許請求される方法に関する。
別の態様では、本発明は、生ウイルスを、免疫原性組成物と、２時間またはこれを超える時間にわたり混合する場合に、前記方法から得られた混合物の殺ウイルス活性が、前記方法を経なかった混合物と比較して、少なくとも１０％低減され、かつ／または前記方法により作製された免疫原性組成物が、生ウイルス１ｍＬ当たり１ｌｏｇ ＴＣＩＤ50未満の喪失を引き起こす、本明細書で記載および特許請求される方法に関する。
別の態様では、本発明は、生ウイルスが、ブタ繁殖呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）ウイルスである、本明細書で記載および特許請求される方法に関する。
別の態様では、本発明は、ステップ（ｖ）の後で残存する、組換えタンパク質、および／または複数の前記組換えタンパク質から構成される四次構造を採取するステップ（ｖｉ）をさらに含み、特に、クロマトグラフィー手順、好ましくは、サイズ除外クロマトグラフィーにより、組換えタンパク質、および／または複数の前記組換えタンパク質から構成される四次構造を含む採取物を精製するステップをさらに含む、本明細書で記載および特許請求される方法に関する。
別の態様では、本発明は、（精製された）採取された組換えタンパク質、および／または複数の前記組換えタンパク質から構成される四次構造を、少なくとも１つのさらなる抗原と組み合わせるステップをさらに含む、本明細書で記載および特許請求される方法に関する。
別の態様では、本発明は、少なくとも１つのさらなる抗原が、ブタ繁殖呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）ウイルスである、本明細書で記載および特許請求される方法に関する。
さらなる態様では、方法は、前記第１の液体のうちの少なくとも一部を、前記組換えタンパク質から除去した後で得られる組換えタンパク質を採取するステップをさらに含む。
本明細書で使用される「〜を採取すること」または「〜を採取する」とは、組換えタンパク質を回収すること（ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇまたはｒｅｃｏｖｅｒｉｎｇ）を指す。当技術分野で公知である、従来の任意の方法を使用して、組換えタンパク質を、本発明の方法および組成物を伴う使用のために作製するか、または組換えタンパク質が、本明細書で記載される方法を経るときに、組換えタンパク質を回収することができる。特に好ましい採取方式では、前記第１の液体の一部を、前記組換えタンパク質から、濾過ステップを介して除去し、組換えタンパク質を、フィルター残留物から回収または採取する。より好ましい形態では、組換えタンパク質を、本明細書で記載される小孔サイズを有する半透膜の残留物から採取または回収する。
本明細書で提示される方法を経た後で、好ましくは、フィルター残留物から採取された後で残存する組換えタンパク質を、薬学的に許容される担体、アジュバント、希釈剤、賦形剤、およびこれらの組合せからなる群から選択される、さらなる成分と混合する。好ましくは、前記さらなる成分は、アジュバントであり、なおより好ましくは、前記アジュバントは、アクリル酸またはメタクリル酸のポリマーであり、さらにより好ましくは、前記アジュバントは、カルボマーである。
本出願のさらなる態様では、上記で記載した方法は、不活化ステップおよび中和ステップの後で得られた組換えタンパク質を、薬学的に許容される担体、アジュバント、希釈剤、賦形剤、およびこれらの組合せからなる群から選択される、さらなる成分と混合するステップをさらに含む。精製組換えタンパク質を、アジュバントと混合する前に、精製組換えタンパク質を、リン酸緩衝生理食塩液、ｐＨ７．４、または他の任意の生理学的緩衝液に対して透析することもまた推奨される。
本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」および「獣医学的に許容される担体」は、任意かつ全ての溶媒、分散媒、コーティング、安定化剤、希釈剤、防腐剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤、吸着遅延剤などを含む。
本明細書で使用される「アジュバント」は、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム、サポニン、例えば、Ｑｕｉｌ Ａ、ＱＳ−２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＭＡ）、ＧＰＩ−０１００（Ｇａｌｅｎｉｃａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）、油中水エマルジョン、水中油エマルジョン、水中油中水エマルジョンを含みうる。エマルジョンは、特に、ライト液体パラフィン油（欧州薬局方型）；スクアランまたはスクアレンなどのイソプレノイド油；アルケン、特に、イソブテンまたはデケンのオリゴマー化から得られる油；直鎖状アルキル基を含有する酸またはアルコールのエステル、より特定すると、植物油、オレイン酸エチル、プロピレングリコールジ（カプリル酸／カプリン酸）エステル、グリセリルトリ（カプリル酸／カプリン酸）エステル、またはプロピレングリコールジオレイン酸エステル；分枝状脂肪酸またはアルコールのエステル、特に、イソステアリン酸エステルに基づくことができる。油を、乳化剤と組み合わせて使用して、エマルジョンを形成する。乳化剤は、好ましくは、非イオン性界面活性剤、特に、ソルビタン、マンニド（例えば、無水マンニトールオレイン酸エステル）、グリコール、ポリグリセロール、プロピレングリコール、およびオレイン酸、イソステアリン酸、リノレン酸、またはヒドロキシステアリン酸のエステルであって、任意選択で、エトキシル化されたエステル、ならびにポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンコポリマーブロック、特に、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ製品、とりわけ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１である。Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull, D. E. S.). JohnWiley and Sons, NY, pp51-94 (1995) and Todd et al., Vaccine 15:564-570 (1997)を参照されたい。例えば、“Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach” edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995の１４７頁に記載されているＳＰＴエマルジョン、およびこの同じ書物の１８３頁に記載されているエマルジョンＭＦ５９を使用することが可能である。さらなる、適切なアジュバントは、とりわけ、ＲＩＢＩアジュバント系（Ｒｉｂｉ Ｉｎｃ．）、ブロックコポリマー（ＣｙｔＲｘ、Ａｔｌａｎｔａ ＧＡ）、ＳＡＦ−Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ ＣＡ）、モノホスホリルリピドＡ、アブリジン脂質−アミンアジュバント、Ｅ．ｃｏｌｉに由来する易熱性エンテロトキシン（組換えまたは他の形の）、コレラ毒素、ＩＭＳ １３１４、またはムラミルジペプチドを含むがこれらに限定されない。無水マレイン酸と、アルケニル誘導体とのコポリマーの中には、無水マレイン酸と、エチレンとのコポリマーである、コポリマーＥＭＡ（Ｍｏｎｓａｎｔｏ）が含まれる。これらのポリマーの、水中の溶解は、酸溶液をもたらすが、免疫原性組成物、免疫学的組成物、またはワクチン組成物が組み込まれるアジュバント溶液をもたらすために、これを、好ましくは、生理学的ｐＨへと中和する。
アジュバントのさらなる例は、アクリル酸またはメタクリル酸のポリマー、および無水マレイン酸と、アルケニル誘導体とのコポリマーから選択される化合物である。有利なアジュバント化合物は、とりわけ、糖またはポリアルコールのポリアルケニルエーテルで架橋された、アクリル酸またはメタクリル酸のポリマーである。これらの化合物は、カルボマーという用語で公知である（Phameuropa Vol. 8, No. 2, June 1996）。当業者はまた、ポリヒドロキシル化化合物で架橋された、このようなアクリルポリマーであって、好ましくは、少なくとも３つのヒドロキシルの、８つ以下の水素原子が、少なくとも２つの炭素原子を有する不飽和脂肪族ラジカルで置きかえられた、少なくとも３つのヒドロキシル基を有するアクリルポリマーについて記載する、米国特許第２，９０９，４６２号も参照することができる。好ましいラジカルは、２〜４個の炭素原子、例えば、ビニル、アリル、および他のエチレン系不飽和基を含有するラジカルである。不飽和ラジカルは、それら自体、メチルなど、他の置換基を含有しうる。Ｃａｒｂｏｐｏｌ（ＢＦ Ｇｏｏｄｒｉｃｈ、Ｏｈｉｏ、ＵＳＡ）の商標名で販売されている製品が、特に、適切である。Ｃａｒｂｏｐｏｌは、アリルスクロースまたはアリルペンタエリトリトールで架橋されている。これらの中で、Ｃａｒｂｏｐｏｌ ９７４Ｐ、Ｃａｒｂｏｐｏｌ ９３４Ｐ、およびＣａｒｂｏｐｏｌ ９７１Ｐを挙げることができる。Ｃａｒｂｏｐｏｌ ９７１Ｐの使用が、最も好ましい。
「希釈剤」は、水、生理食塩液、デキストロース、エタノール、グリセロールなどを含みうる。等張剤は、とりわけ、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースを含みうる。安定化剤は、とりわけ、アルブミンおよびエチレンジアミン四酢酸のアルカリ塩を含む。
本明細書で使用される「防腐剤」とは、例えば、ゲンタマイシン、メルチオレートなどの抗微生物活性剤を指す。特に、防腐剤の添加は、複数回投与用組成物の調製に最も好ましい。これらの抗微生物的活性の薬剤を、目的の組成物を、任意の微生物汚染について防止するか、または目的の組成物中の任意の微生物増殖を阻害するのに有効な濃度で添加する。
組換えタンパク質のさらなる精製は、クロマトグラフィー手順、好ましくは、２ステップのクロマトグラフィー手順により達成することができる。組換えタンパク質を、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）へとアセンブルする場合、１つのステップ、好ましくは、第１のステップは、好ましくは、例えば、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ３００マトリックスを使用することにより行いうる、サイズ除外（ゲル濾過）クロマトグラフィーである。実験室のスケールでは、ＨｉＰｒｅｐ ２６／６０ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ３００ＨＲカラムの使用が、最も好ましい。しかし、当業者に公知の、他の任意のサイズ除外クロマトグラフィーマトリックスであって、培養物の濾液または上清からの、組換えタンパク質ＶＬＰの分離を可能とするマトリックスを使用することができる。適切なマトリックスについては、例えば、E.L.V. Harris and S. Angel (eds.), Protein purification methods - a practical approach, IRL Press Oxford 1995)において記載されている。ゲル濾過クロマトグラフィーは、例えば、カラムに、組換えタンパク質を含む粗調製物を、１．０ｍｌ／分の流量でロードし、カラムを、２０ｍＭのトリス、ｐＨ６．５、５ｍＭのＤＴＴを含む、１．５カラム容量の緩衝液で溶出させることにより行うことができる。しかし、組換えタンパク質はまた、例えば、固定化させた組換えタンパク質特異的抗体への選択的結合を介するアフィニティークロマトグラフィー、または当業者に公知の、他の任意の方法を使用することにより精製することもできる。
高純度を得るために、第２のクロマトグラフィーステップを行いうるが、これは、第１のクロマトグラフィーステップと異なる。例えば、第１の精製ステップ／クロマトグラフィーステップが、サイズ除外（ゲル濾過）クロマトグラフィーステップである場合、第２のクロマトグラフィーステップは、これとは異なり、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどであるものとする。好ましくは、組換えタンパク質を精製する第１のステップが、サイズ除外（ゲル濾過）クロマトグラフィーである場合、第２のステップは、イオン交換クロマトグラフィー、好ましくは、アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＩＥＸ）でありうる。組換えタンパク質の精製に好ましいアニオン交換クロマトグラフィーマトリックスは、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅである。約５０ｍｌの小スケールでは、５ｍｌ ＨｉＴｒａｐ Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰカラムの使用が最も好ましい。
本出願は、組換えタンパク質を含有する免疫原性組成物を作製する方法を提示するだけでなく、また、免疫原性組成物を含有する組換えタンパク質にも関する。
別の態様では、本発明は、本明細書で記載および特許請求される方法により得られる免疫原性組成物に関する。
さらなる態様では、本明細書の方法により作製される免疫原性組成物を含有する組換えタンパク質の殺ウイルス活性は、前記作製法を経なかった免疫原性組成物を含有する組換えタンパク質と比較して、少なくとも１０％低減される。より好ましくは、免疫原性組成物を含有する組換えタンパク質の殺ウイルス活性は、前記作製法を経なかった免疫原性組成物を含有する組換えタンパク質と比較して、少なくとも５０％低減される。さらにより好ましくは、免疫原性組成物を含有する組換えタンパク質の殺ウイルス活性は、前記作製法を経なかった免疫原性組成物を含有する組換えタンパク質と比較して、少なくとも７０％低減される。なおさらにより好ましくは、免疫原性組成物を含有する組換えタンパク質の殺ウイルス活性は、前記作製法を経なかった免疫原性組成物を含有する組換えタンパク質と比較して、少なくとも９０％低減される。
本発明の目的で、「殺ウイルス活性」という用語は、液体、流体、溶液、組成物などを、このような生ウイルスまたは生細菌と混合する場合に、前記液体、流体、溶液、組成物などが、生ウイルスまたは生細菌をある程度不活化または死滅させることを意味する。したがって、液体、流体、溶液、組成物などの殺ウイルス活性の、少なくとも１０％の低減とは、本明細書で記載される作製法のうちのいずれかを経た液体、流体、溶液、組成物などにおける、生ウイルスまたは生細菌の生存率が、このような作製法のうちのいずれかを経ていない液体、流体、溶液、組成物などと比較して、９０％大きいことを意味する。
本明細書で記載される方法により作製された、組換えタンパク質の免疫原性組成物は、生ウイルスまたは生細菌を、組換えタンパク質の免疫原性組成物と混合し、２時間またはこれを超える時間にわたり、好ましくは、４時間を超える時間にわたり、なおより好ましくは、１２時間を超える時間にわたり、なおより好ましくは、２４時間を超える時間にわたり、なおより好ましくは、２日間を超える期間にわたり、なおより好ましくは、４日間を超える期間にわたり、なおより好ましくは、７日間を超える期間にわたり、なおより好ましくは、２週間を超える期間にわたり、なおより好ましくは、４週間を超える期間にわたり、なおより好ましくは、２カ月間を超える期間にわたり、なおより好ましくは、３カ月間を超える期間にわたり、なおより好ましくは、４カ月間を超える期間にわたり、なおより好ましくは、６カ月間を超える期間にわたり、なおより好ましくは、９カ月間を超える期間にわたり、なおより好ましくは、１２カ月間を超える期間にわたり、なおより好ましくは、１８カ月間を超える期間にわたり、最も好ましくは、２年間を超える期間にわたりインキュベートする場合、生ウイルスの１ｌｏｇ ＴＣＩＤ50未満、または生細菌１ｍｌ当たり１ｌｏｇ ＣＦＵ未満の喪失を引き起こす。より好ましくは、本明細書で記載される方法により作製された、組換えタンパク質の免疫原性組成物は、生ウイルスまたは生細菌を、組換えタンパク質の免疫原性組成物と混合し、２時間またはこれを超える時間にわたり、好ましくは、４時間を超える時間にわたり、なおより好ましくは、１２時間を超える時間にわたり、なおより好ましくは、２４時間を超える時間にわたり、なおより好ましくは、２日間を超える期間にわたり、なおより好ましくは、４日間を超える期間にわたり、なおより好ましくは、７日間を超える期間にわたり、なおより好ましくは、２週間を超える期間にわたり、なおより好ましくは、４週間を超える期間にわたり、なおより好ましくは、２カ月間を超える期間にわたり、なおより好ましくは、３カ月間を超える期間にわたり、なおより好ましくは、４カ月間を超える期間にわたり、なおより好ましくは、６カ月間を超える期間にわたり、なおより好ましくは、９カ月間を超える期間にわたり、なおより好ましくは、１２カ月間を超える期間にわたり、なおより好ましくは、１８カ月間を超える期間にわたり、最も好ましくは、２年間を超える期間にわたりインキュベートする場合、生ウイルス１ｍｌ当たり０．９ｌｏｇ ＴＣＩＤ50未満、または生細菌１ｍｌ当たり０．９ｌｏｇ ＣＦＵ未満の喪失を引き起こす。なおより好ましくは、本明細書で記載される方法により作製された、組換えタンパク質の免疫原性組成物は、生ウイルスまたは生細菌を、組換えタンパク質の免疫原性組成物と混合し、２時間またはこれを超える時間にわたり、好ましくは、４時間を超える時間にわたり、なおより好ましくは、１２時間を超える時間にわたり、なおより好ましくは、２４時間を超える時間にわたり、なおより好ましくは、２日間を超える期間にわたり、なおより好ましくは、４日間を超える期間にわたり、なおより好ましくは、７日間を超える期間にわたり、なおより好ましくは、２週間を超える期間にわたり、なおより好ましくは、４週間を超える期間にわたり、なおより好ましくは、２カ月間を超える期間にわたり、なおより好ましくは、３カ月間を超える期間にわたり、なおより好ましくは、４カ月間を超える期間にわたり、なおより好ましくは、６カ月間を超える期間にわたり、なおより好ましくは、９カ月間を超える期間にわたり、なおより好ましくは、１２カ月間を超える期間にわたり、なおより好ましくは、１８カ月間を超える期間にわたり、最も好ましくは、２年間を超える期間にわたりインキュベートする場合、生ウイルス１ｍｌ当たり０．７ｌｏｇ ＴＣＩＤ50未満、または生細菌１ｍｌ当たり０．７ｌｏｇ ＣＦＵ未満の喪失を引き起こす。さらにより好ましくは、本明細書で記載される方法により、段階的に作製された、組換えタンパク質の免疫原性組成物は、生ウイルスまたは生細菌を、組換えタンパク質の免疫原性組成物と混合し、２時間またはこれを超える時間にわたり、好ましくは、４時間を超える時間にわたり、なおより好ましくは、１２時間を超える時間にわたり、なおより好ましくは、２４時間を超える時間にわたり、なおより好ましくは、２日間を超える期間にわたり、なおより好ましくは、４日間を超える期間にわたり、なおより好ましくは、７日間を超える期間にわたり、なおより好ましくは、２週間を超える期間にわたり、なおより好ましくは、４週間を超える期間にわたり、なおより好ましくは、２カ月間を超える期間にわたり、なおより好ましくは、３カ月間を超える期間にわたり、なおより好ましくは、４カ月間を超える期間にわたり、なおより好ましくは、６カ月間を超える期間にわたり、なおより好ましくは、９カ月間を超える期間にわたり、なおより好ましくは、１２カ月間を超える期間にわたり、なおより好ましくは、１８カ月間を超える期間にわたり、最も好ましくは、２年間を超える期間にわたりインキュベートする場合、生ウイルス１ｍｌ当たり０．５ｌｏｇ ＴＣＩＤ50未満、または生細菌１ｍｌ当たり０．５ｌｏｇ ＣＦＵ未満の喪失を引き起こす。なおより好ましくは、本明細書で記載される方法により作製された、組換えタンパク質の免疫原性組成物は、生ウイルスまたは生細菌を、組換えタンパク質の免疫原性組成物と混合し、２時間またはこれを超える時間にわたり、好ましくは、４時間を超える時間にわたり、なおより好ましくは、１２時間を超える時間にわたり、なおより好ましくは、２４時間を超える時間にわたり、なおより好ましくは、２日間を超える期間にわたり、なおより好ましくは、４日間を超える期間にわたり、なおより好ましくは、７日間を超える期間にわたり、なおより好ましくは、２週間を超える期間にわたり、なおより好ましくは、４週間を超える期間にわたり、なおより好ましくは、２カ月間を超える期間にわたり、なおより好ましくは、３カ月間を超える期間にわたり、なおより好ましくは、４カ月間を超える期間にわたり、なおより好ましくは、６カ月間を超える期間にわたり、なおより好ましくは、９カ月間を超える期間にわたり、なおより好ましくは、１２カ月間を超える期間にわたり、なおより好ましくは、１８カ月間を超える期間にわたり、最も好ましくは、２年間を超える期間にわたりインキュベートする場合、生ウイルス１ｍｌ当たり０．３ｌｏｇ ＴＣＩＤ50未満、または生細菌１ｍｌ当たり０．３ｌｏｇ ＣＦＵ未満の喪失を引き起こす。１ｍｌ当たりのＴＣＩＤ50は、生ウイルス量の推定を可能とする、標準的なｉｎ ｖｉｔｒｏ滴定アッセイにより推定することができる。１ｍｌ当たりのＣＦＵもまた、生細菌量の推定を可能とする、標準的なｉｎ ｖｉｔｒｏ滴定アッセイにより決定することができる。「１ｍｌ当たり」という用語は、好ましくは、１ｍｌの流体を指す。このような精製組換えタンパク質は、本明細書で規定される、殺ウイルス活性の低減を示すだけでなく、また、本明細書で規定される、非精製組換えタンパク質と比較した、免疫原性の増大も示し、好ましくは、このような組換えタンパク質は、細胞媒介性免疫応答および／または抗体媒介性免疫応答を、非精製組換えタンパク質を含む、基準免疫原性組成物により誘発される、細胞媒介性免疫応答および／または抗体媒介性免疫応答と比較して、少なくとも１０％、好ましくは、少なくとも２０％、より好ましくは、少なくとも３０％、なおより好ましくは、少なくとも４０％、なおより好ましくは、少なくとも５０％、なおより好ましくは、少なくとも７５％、最も好ましくは、少なくとも１００％増大させる。
精製組換えタンパク質、好ましくは、本明細書で記載される方法により得られる精製組換えタンパク質を含む免疫原性組成物は、このような精製組換えタンパク質を含まない免疫原性組成物と比較した、免疫原性の増大を特徴とする。
加えて、本明細書で使用される「免疫原性の増大または免疫原性の改善」という用語は、目的の抗原を含む免疫原性組成物により引き起こされる免疫応答が、この免疫応答が、細胞媒介性免疫応答であれ、かつ／または抗体媒介性免疫応答であれ、異なる抗原または異なる純度の抗原を含む基準免疫原性組成物と比較して増大することを意味する。好ましい実施形態により、免疫原性の増大または免疫原性の改善という用語は、目的の抗原を含む免疫原性組成物により誘発される抗体媒介性免疫応答が、異なる抗原または異なる純度の抗原を含む基準免疫原性組成物と比較して増大することを意味する。この点で、抗体媒介性免疫応答は、目的の抗原に対して特異的な抗体の産生が、異なる抗原または異なる純度の抗原を含む基準免疫原性組成物により誘発される、抗体の産生と比較して増大することを意味する。
「増大した」という用語は、細胞媒介性免疫応答および／または抗体媒介性免疫応答が、組換えタンパク質または異なる純度の組換えタンパク質を含む基準免疫原性組成物により誘発される細胞媒介性免疫応答および／または抗体媒介性免疫応答と比較して、少なくとも１０％、好ましくは、少なくとも２０％、より好ましくは、少なくとも３０％、なおより好ましくは、少なくとも４０％、なおより好ましくは、少なくとも５０％、なおより好ましくは、少なくとも７５％、最も好ましくは、少なくとも１００％増大することを意味する。
細胞媒介性免疫応答および／または抗体媒介性免疫応答をどのようにして測定するのかは、当業者に一般に公知である。特に、このような当業者には、目的の免疫原性組成物の細胞媒介性免疫応答を、基準の抗体媒介性免疫応答と比較すること、または目的の免疫原性組成物の細胞媒介性免疫応答を、基準の細胞媒介性免疫応答と比較することのいずれも明らかであるが、目的の免疫原性組成物の抗体媒介性免疫応答を、基準組成物の抗体媒介性免疫応答と比較すること、またはその逆はいずれも明らかでない。さらに、細胞媒介性免疫応答は、例えば、免疫原性組成物／目的の抗原による細胞傷害性Ｔ細胞の活性化を測定することにより測定することができる。抗体媒介性免疫応答は、例えば、このような抗原を含む免疫原性組成物の、動物への投与に起因して生じる抗原特異的抗体の量を測定することにより測定することができる。細胞媒介性免疫応答および／または抗体媒介性免疫応答は、例えば、マウスモデルを使用することにより測定することができる。本発明に従い、マウスモデルを、基準方法として使用する。
「免疫原性組成物」という用語は、宿主において、目的の抗原に対する細胞媒介性免疫応答および／または抗体媒介性免疫応答を誘発する、少なくとも１つの抗原を含む組成物を意味するがこれらに限定されない。通例、「免疫応答」は、以下の効果：目的の組成物またはワクチンに含まれる、１つまたは複数の抗原を特異的に指向する、抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、ならびに／または細胞傷害性Ｔ細胞および／もしくはガンマ−デルタＴ細胞の産生または活性化のうちの１つまたは複数を含むがこれらに限定されない。宿主は、新たな感染への抵抗性を増強し、かつ／または疾患の臨床重症度を軽減するように、治療的免疫応答または防御的免疫応答を提示することが好ましいであろう。このような場合、免疫原性組成物は、「ワクチン」である。このような保護は、感染した宿主により通常提示される症状の軽減もしくは欠如、迅速な回復時間、および／または感染した宿主におけるウイルス力価の低下により裏付けられるであろう。
別の態様では、本発明は、弱毒化生ウイルス、好ましくは、弱毒化ブタ繁殖呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）ウイルス、または弱毒化生細菌をさらに含む、本明細書で記載および特許請求される免疫原性組成物に関する。
本発明の目的のための「生」ウイルスまたは「生」細菌とは、宿主における複製が可能なウイルスまたは細菌を指す。本発明の、好ましい生ウイルスおよび好ましい生細菌は、それぞれ、ＰＲＲＳウイルスおよびＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ菌である。しかし、生ウイルスまたは生細菌という用語は、それぞれ、ＰＲＲＳおよびＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに限定されない。
別の態様では、本発明は、弱毒化生ウイルスが、ブタ繁殖呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）ウイルスである、本明細書で記載および特許請求される免疫原性組成物に関する。
別の態様では、本発明は、免疫原性組成物の１回の投与の後で、病原体、好ましくは、本明細書で記載および特許請求される組換えタンパク質を含む病原体に対する防御的免疫応答を誘導する、本明細書で記載および特許請求される免疫原性組成物に関する。
別の態様では、本発明は、免疫原性組成物の１回の投与の後で、ＰＲＲＳウイルスに対する防御的免疫応答を誘導する、本明細書で記載および特許請求される免疫原性組成物に関する。
上記で記載した方法により得られる、組換えタンパク質の免疫原性組成物、または上記で記載した方法のステップｉ）において使用した組換えタンパク質は、少なくとも１つのさらなる抗原、好ましくは、ウイルス抗原または細菌抗原と組み合わせることができ、なおより好ましくは、ブタにおける、少なくとも１つの他の疾患原因生物に由来する、ウイルス抗原または細菌抗原と組み合わせることができる。さらなる抗原は、国際特許出願第ＷＯ２００７／０９４８９３号（その内容および教示が、参照により本明細書に組み込まれる）において開示されている抗原のうちのいずれか１つでありうる。略述すると、さらなる抗原は、ブタの他の任意の疾患原因生物の抗原でありうる。好ましくは、ブタの「別の疾患原因生物」は、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（１）；アデノウイルス（２）；東部ウマ脳炎ウイルスなどのアルファウイルス（３）；Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ（４）；Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ属種（５）、好ましくは、Ｂ．ｈｙｏｄｙｅｎｔｈｅｒｉａｅ（６）；Ｂ．ｐｉｏｓｉｃｏｌｉ（７）；Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｕｉｓ、好ましくは、生物型１、２、および３（８）；ブタコレラウイルス（９）；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属種（１０）、好ましくは、Ｃｌ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ（１１）、Ｃｌ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓＡ、Ｂ、およびＣ型（１２）、Ｃｌ．ｎｏｖｙｉ（１３）、Ｃｌ．ｓｅｐｔｉｃｕｍ（１４）、Ｃｌ．ｔｅｔａｎｉ（１５）；コロナウイルス（１６）、好ましくは、ブタ呼吸器コロナウイルス（１７）；Ｅｐｅｒｙｔｈｒｏｚｏｏｎｏｓｉｓ ｓｕｉｓ（１８）；Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｓｉｏｐａｔｈｉａｅ（１９）；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（２０）；Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓ、好ましくは、亜型１、７、および１４（２１）；ブタ血球凝集性脳脊髄炎ウイルス（２２）；日本脳炎ウイルス（２３）；Ｌａｗｓｏｎｉａ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ（２４）Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ属種（２５）、好ましくは、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｓｔｒａｌｉｓ（２６）；Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｃａｎｉｃｏｌａ（２７）；Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ（２８）；Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉｃａｅ（２９）；およびＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ（３０）；Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｐｏｍｏｎａ（３１）；Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｔａｒａｓｓｏｖｉ（３２）；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属種（３３）好ましくは、Ｍ．ａｖｉｕｍ（３４）、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ（３５）；およびＭ．ｂｏｖｉｓ（３６）；Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（３７）；Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ（３８）；ブタサイトメガロウイルス（３９）；ブタパルボウイルス（４０）；ブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルス（４１）；仮性狂犬病ウイルス（４２）；ロタウイルス（４３）；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属種（４４）、好ましくは、Ｓ．ｔｈｙｈｉｍｕｒｉｕｍ（４５）およびＳ．ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ（４６）；Ｓｔａｐｈ．ｈｙｉｃｕｓ（４７）；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属種（４８）、好ましくは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属種（４９）、好ましくは、Ｓｔｒｅｐ．ｓｕｉｓ（５０）；ブタヘルペスウイルス（５１）；ブタインフルエンザウイルス（５２）；ブタポックスウイルス（５３）；ブタポックスウイルス（５４）；水疱性口炎ウイルス（５５）；ブタ水疱疹ウイルス（５６）；Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ Ｈａｒｄｊｏ（５７）；ならびに／またはＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｓｙｎｏｖｉａｅ（５８）からなる群から選択される。
別の態様では、本発明は、本明細書で記載および特許請求される免疫原性組成物を含有する容器を含むキットに関する。
別の態様では、本発明は、弱毒化生ウイルス、好ましくは、弱毒化ＰＲＲＳウイルス、および弱毒化生細菌からなる群から選択される、少なくとも１つのさらなる抗原を含有する、少なくとも１つのさらなる容器をさらに含む、本明細書で記載および特許請求されるキットに関する。
別の態様では、本発明は、医薬、好ましくは、ワクチンとしての使用のための、本明細書で記載および特許請求される免疫原性組成物に関する。
別の態様では、本発明は、動物における、病原体感染の、１つまたは複数の臨床症状を、前記免疫原性組成物を施されない動物と比較して軽減する方法における使用のための、本明細書で記載および特許請求される免疫原性組成物、および／または本明細書で記載および特許請求されるキットに関する。
「臨床徴候の発生率の低減または重症度の軽減」という用語は、いずれの動物も、ワクチン中の免疫学的有効成分が由来する病原体に感染するか、またはこれで抗原投与されており、対照群が、ワクチンまたは免疫原性組成物の投与を施されていない場合に、このような徴候のうちのいずれかが、ワクチンの投与を施される動物の発生率または重症度において、「対照群」の動物と比較して低減されることを意味するものとする。この文脈では、「減少」または「軽減」という用語は、ワクチン接種群における、ワクチン接種されていない対照群と比較した、少なくとも１０％、好ましくは、２５％、なおより好ましくは、５０％、最も好ましくは、１００％を超える軽減を意味する。
本明細書で使用される「臨床症状」または「臨床徴候」は、病原体に由来する感染の徴候であって、症状など、生動物から直接観察可能な徴候を指すものとする。代表例は、選択された病原体に依存するが、鼻汁、倦怠感、咳、高熱、体重の増加または減少、脱水、下痢、腫脹、跛行などの事象を含みうる。
本明細書で使用される「防御的免疫応答」とは、最上で、このような徴候または症状の完全な防止であり、これを含む、目的の病原体に由来する感染の、臨床的、病理学的、または組織病理学的な徴候または症状の、発生率の低減または重症度の低減を指す。
「病理学的徴候」という用語は、顕微鏡的または分子的レベルで、生化学的試験を介して、または剖検時の肉眼により観察可能な感染の徴候を指すものとする。
「組織病理学的徴候」という用語は、感染から生じる組織変化の徴候を指すものとする。
「臨床症状」または「臨床徴候」という用語については、上記で規定されている。
本明細書では、以下の条項について記載される。
１．組換えタンパク質を含む免疫原性組成物を作製する方法であって、以下の順序で、
（ｉ）・第１の液体、
・組換えタンパク質、および／または複数の前記組換えタンパク質から構成される四次構造、ならびに
・前記組換えタンパク質をコードする核酸配列を含むベクター
を含む混合物を用意する／得るステップと；
（ｉｉ）第２の液体を、ステップ（ｉ）の混合物へと添加するステップであって、第２の液体が、第１の液体と異なるステップと；
（ｉｉｉ）さらなる第２の液体を、ステップ（ｉｉ）から得られる混合物へと、さらに添加し、第１の液体および／または第２の液体の一部を、このような、組み合わされた混合物から除去することにより、混合物中の、組換えタンパク質、および／または複数の前記組換えタンパク質から構成される四次構造を洗浄し、任意選択で、これを最終的に濃縮するステップと；
（ｉｖ）不活化剤を、ステップ（ｉｉｉ）から得られる混合物へと添加することにより、ベクターを不活化させるステップと；
（ｖ）中和剤を、ステップ（ｉｖ）から得られる混合物へと添加することにより、不活化剤を中和するステップと
を含む方法。
２．ステップ（ｉ）の混合物が、
（ａ）培養物中の感受性の細胞への、前記組換えタンパク質、および／または複数の前記組換えタンパク質から構成される四次構造をコードする核酸配列を含むベクターの感染を可能とするステップであって、前記組換えタンパク質、および／または複数の前記組換えタンパク質から構成される四次構造を、前記ベクターにより発現させるステップと、
（ｂ）その後、組換えタンパク質、および／または複数の前記組換えタンパク質から構成される四次構造を、細胞培養物から回収するステップであって、少なくとも１つのフィルター、好ましくは、２つのフィルターを通す精密濾過を好ましくは含む分離ステップを介して、細胞破砕物を、組換えタンパク質、および／または複数の前記組換えタンパク質から構成される四次構造から分離することが好ましく、少なくとも１つのフィルターが、好ましくは、組換えタンパク質、および／または複数の前記組換えタンパク質から構成される四次構造より大きな小孔サイズを有し、特に、約０．１μｍ〜約４μｍの小孔サイズを有するステップと
を含む手順により得られる、条項１の方法。
３．ステップ（ａ）における細胞培養物が、好ましくは、組換えタンパク質、および／または複数の前記組換えタンパク質から構成される四次構造を、前記ベクターにより発現させる間、２７±２℃で維持され、かつ／またはステップ（ｂ）における回収することが、細胞へのベクターの接種の６〜８日後、好ましくは、８日後になされる、条項２の方法。
４．分離ステップが、
・約２μｍ〜約４μｍの小孔サイズを有する、少なくとも１つのフィルターを通す精密濾過、および／または
・約０．１μｍ〜約０．８μｍの小孔サイズを有する、少なくとも１つのフィルターを通す精密濾過
を含むか、またはこれらからなる、条項２または３の方法。
５．前記第１の液体が、細胞培養培地の一部を含むか、または細胞培養培地からなり、細胞培養培地が、好ましくは、昆虫細胞培養培地である、条項１〜４のうちのいずれか１項の方法。
６．前記組換えタンパク質が、
・好ましくは、配列番号１、配列番号２、および／または配列番号５〜１６の配列と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含むか、またはこれからなるＰＰＶ ＶＰ２タンパク質
からなる群から選択される、条項１〜５のうちのいずれか１項の方法。
７．複数の前記組換えタンパク質から構成される前記四次構造が、ウイルス様粒子であるか、または複数の前記組換えタンパク質から構成される前記四次構造が、ホモ三量体である、条項１〜６のうちのいずれか１項の方法。
８．ベクターが、組換えウイルス、好ましくは、バキュロウイルスであり、かつ／または核酸配列が、ＤＮＡ配列である、条項１〜７のうちのいずれか１項の方法。
９．前記組換えタンパク質、および／または複数の前記組換えタンパク質から構成される四次構造をコードする核酸を含むベクターが、組換えバキュロウイルスであり、前記バキュロウイルスが、前記組換えタンパク質、および／または複数の前記組換えタンパク質から構成される四次構造をコードするＤＮＡ配列を含む、条項１〜８のうちのいずれか１項の方法。
１０．ステップ（ｉｉｉ）で、前記組換えタンパク質、および／または複数の前記組換えタンパク質から構成される前記四次構造を、第２の液体で、少なくとも２回、好ましくは、２回〜３回にわたり洗浄し、任意選択で、ステップ（ｉ）の混合物中の、前記組換えタンパク質、および／または複数の前記組換えタンパク質から構成される前記四次構造の元の体積と比較して、最終的に濃縮する、条項１〜９のうちのいずれか１項の方法。
１１．ステップ（ｉｉｉ）で、このような洗浄ステップ、すなわち、透析濾過の工程を、例えば、４℃〜２９℃の間の温度、例えば、２７℃または４℃など、３７℃より低い温度で、より好ましくは、３０℃より低い温度で、なおより好ましくは、２０℃より低い温度で、なおより好ましくは、１０℃より低い温度で実施する、条項１〜１０のうちのいずれか１項の方法。
１２．ステップ（ｉｉｉ）で、第１の液体および／または第２の液体の一部を、混合物から、濾過により除去し、好ましくは、前記組換えタンパク質、および／もしくは複数の前記組換えタンパク質から構成される前記四次構造より小さい平均小孔サイズを有する半透膜を含むフィルターもしくは中空フィルターを用い、かつ／または２０ｋＤａ〜５００ｋＤａのサイズのタンパク質の大部分、好ましくは、実質的に全ての、半透膜を通した通過を防止する、条項１〜１１のうちのいずれか１項の方法。
１３．第２の液体が、緩衝液、好ましくは、洗浄用リン酸緩衝生理食塩液（ＷＰＢＳ）である、条項１〜１２のうちのいずれか１項の方法。
１４．ステップ（ｉｉ）で添加される第２の液体の容量が、およそ、ステップ（ｉｉｉ）で除去される第１の液体および／または第２の液体の容量である、すなわち、濃縮ステップを、実施および／または要求しない、条項１〜１３のうちのいずれか１項の方法。
１５．不活化剤が、アジリジン化合物、好ましくは、バイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）であり、かつ／または不活化剤が、ベクターと比べモル過剰量で添加される、条項１〜１４のうちのいずれか１項の方法。
１６．中和剤が、チオ硫酸ナトリウムであり、かつ／または中和剤が、不活化剤と比べモル過剰量で添加される、条項１〜１５のうちのいずれか１項の方法。
１７．ステップ（ｖ）の後で残存する混合物を、薬学的に許容される担体、アジュバント、希釈剤、賦形剤、およびこれらの組合せからなる群から選択される、さらなる成分と混合するステップをさらに含む、条項１〜１６のうちのいずれか１項の方法。
１８．生ウイルスを、免疫原性組成物と、２時間またはこれを超える時間にわたり混合する場合に、前記方法から得られた混合物の殺ウイルス活性が、前記方法を経なかった混合物と比較して、少なくとも１０％低減され、かつ／または前記方法により作製された免疫原性組成物が、生ウイルス１ｍＬ当たり１ｌｏｇ ＴＣＩＤ50未満の喪失を引き起こす、条項１〜１７のうちのいずれか１項による方法。
１９．生ウイルスが、ブタ繁殖呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）ウイルスである、条項１８による方法。
２０．ステップ（ｖ）の後で残存する、組換えタンパク質、および／または複数の前記組換えタンパク質から構成される四次構造を採取するステップ（ｖｉ）をさらに含み、特に、クロマトグラフィー手順、好ましくは、サイズ除外クロマトグラフィーにより、組換えタンパク質、および／または複数の前記組換えタンパク質から構成される四次構造を含む採取物を精製するステップをさらに含む、条項１〜１９のうちのいずれか１項による方法。
２１．（精製された）採取された組換えタンパク質、および／または複数の前記組換えタンパク質から構成される四次構造を、少なくとも１つのさらなる抗原と組み合わせるステップをさらに含む、条項１〜２０のうちのいずれか１項による方法。
２２．少なくとも１つのさらなる抗原が、ブタ繁殖呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）ウイルスである、条項２１による方法。
２３．条項１〜２２のうちのいずれか１項による方法により得られる免疫原性組成物。
２４．免疫原性組成物が、弱毒化生ウイルス、好ましくは、弱毒化ブタ繁殖呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）ウイルス、または弱毒化生細菌をさらに含む、条項２３による免疫原性組成物。
２５．弱毒化生ウイルスが、ブタ繁殖呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）ウイルスである、条項２３または２４による免疫原性組成物。
２６．免疫原性組成物の１回の投与の後で、病原体、好ましくは、病原体を含むこと条項６による組換えタンパク質に対する防御的免疫応答を誘導する、条項２３〜２５のうちのいずれか１項による免疫原性組成物。
２７．免疫原性組成物の１回の投与の後で、ＰＲＲＳウイルスに対する防御的免疫応答を誘導する、条項２３〜２６のうちのいずれか１項による免疫原性組成物。
２８．条項２３〜２７のうちのいずれか１項による免疫原性組成物を含有する容器を含むキット。
２９．弱毒化生ウイルス、好ましくは、弱毒化ＰＲＲＳウイルス、および弱毒化生細菌からなる群から選択される、少なくとも１つのさらなる抗原を含有する、少なくとも１つのさらなる容器をさらに含む、条項２８によるキット。
３０．医薬、好ましくは、ワクチンとしての使用のための、条項２３〜２９のうちのいずれか１項による免疫原性組成物。
３１．動物における、病原体感染の、１つまたは複数の臨床症状を、前記免疫原性組成物を施されない動物と比較して軽減する方法における使用のための、条項２３〜２９のうちのいずれか１項による免疫原性組成物、および／または条項２８または２９によるキット。
本発明の具体的実施形態を例示するように、以下の例を、下記に明示する。これらの例は、例示的なものであるに過ぎず、理解された本発明の範囲または基礎原理を限定するものとは理解されない。
（例１）
ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）２７ａ ＶＰ２の作製（前段加工）
ＰＰＶ ２７ａ ＶＰ２を、バキュロウイルスを感染させたＳＦ＋細胞内で作製し、ＰＣＶ２ ＯＲＦ２（ＷＯ２００６／０７２０６５；実施例１〜３）の工程とほぼ同様の工程で、ＢＥＩにより不活化させる。しかし、ＰＰＶ ２７ａ ＶＰ２は、「ＤｉａｍｏｎｄＢａｃ」（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄ６１９２）（ＰＣＶ２ ＯＲＦ２のために使用された、旧型のＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ骨格に代わる）と称する、異なるバキュロウイルス骨格を使用する。
ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）２７ａ ＶＰ２のヌクレオチド配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＡＹ６８４８７１．１から得る。Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＳｃｉＴｏｏｌｓ（登録商標）Ｗｅｂ Ｔｏｏｌｓソフトウェアを使用して、ＰＰＶ ２７ａ ＶＰ２コード領域を、逆翻訳し、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ属について、コドンを最適化させた。ＢａｍＨＩ制限酵素部位およびＮｏｔＩ制限酵素部位を、それぞれ、５’端および３’端へと付加すると共に、コドンを最適化させたＰＰＶ ２７ａ ＶＰ２遺伝子を、さらに修飾して、２つのＣｌａＩ制限酵素部位を、ＶＰ２コード領域へと挿入した。ＶＰ２コード領域を破壊しない形で、ＣｌａＩ部位を挿入する。ＣｌａＩ部位の挿入は、予測される２７ａ ＶＰアミノ酸配列内に、３つの微細なアミノ酸変化を導入する。ＣｌａＩの挿入から生じるアミノ酸変化は、２５位（グリシン→イソロイシン）、３６位（アラニン→セリン）、および３７位（グリシン→イソロイシン）におけるアミノ酸変化である。コドンを最適化させたＰＰＶ ２７ａ−ＣｌａＩ ＶＰ２遺伝子を、化学合成し、その後、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＰＰＶ２７ａ−ＣｌａＩ ３８３２０３７７）において、標準的なクローニングプラスミドであるｐＵＣ５７へとクローニングした。次いで、ＰＰＶ ２７ａ−ＣｌａＩ遺伝子を、ＢａｍＨＩ制限酵素およびＮｏｔＩ制限酵素を伴う消化により、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のｐＵＣ５７プラスミドから切り出し、ＰＰＶ ２７ａ−ＣｌａＩ遺伝子を、バキュロウイルス移入ベクターｐＶＬ１３９３（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、２１４８６Ｐ）の、それぞれの酵素部位へとサブクローニングした。ＰＰＶ ２７ａ−ＣｌａＩ遺伝子を含有するｐＶＬ１３９３プラスミドを、ＤＨ５α Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標） ＭＡＸ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ（商標））内で増幅し、その後、市販のプラスミド精製キット（ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、抽出および精製した。組換えバキュロウイルスを作出するように、Ｅｓｃｏｒｔ（商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｅ９７７０）を使用して、ＰＰＶ ２７ａ−ＣｌａＩ遺伝子と、直鎖化されたバキュロウイルスＤｉａｍｏｎｄＢａｃ（登録商標）骨格とを含有する、精製ｐＶＬ１３９３プラスミドを、Ｓｆ９昆虫細胞へと共トランスフェクトした。限界希釈を実施して、ポリヘドリンプロモーターの制御下で、ＰＰＶ ２７ａ−ＣｌａＩ ＶＰ２遺伝子を含有する精製組換えバキュロウイルス株を得た。ＰＰＶ ２７ａ ＶＰ２タンパク質から構成される組換え抗原を作製するように、バキュロウイルス発現ベクター系（ＢＥＶＳ）を用いて、懸濁液による昆虫細胞（ＳＦ＋）培養を可能とした。この生成物のために、感染したＳＦ＋細胞培養物を、約７日間にわたり、バッチモードにかけ、次いで、細胞破砕物および培地成分を除去するように加工した。
（例２）
ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）２７ａ ＶＰ２の作製（後段加工）
後段の加工を含む、２つの連続ステップに従った。「清明化」として公知の工程で、細胞破砕物の除去を行う一方、２倍容量の洗浄用リン酸緩衝生理食塩液（ＷＰＢＳ）を介する、培地成分の除去であって、「透析濾過」と呼ばれる除去を達成する。
ＰＰＶ ２７ａ ＶＰ２バキュロウイルスベクターは、バイオリアクター内で作製する。培地を、あらかじめ滅菌処理するか、または滅菌濾過して、バイオリアクターへと添加する。培地は、拡大培地に由来するＳＦ＋細胞と共に添加する。ＰＰＶ ２７ａ ＶＰ２バキュロウイルスの種ウイルスを播種すると同時に、細胞に接種する（共時的感染）。ウイルス繁殖を通して、温度を、２７±２℃に維持し、ｐＨをモニタリングする。溶存酸素（ＤＯ）は、清浄化圧縮空気および酸素（Ｏ2）をスパージングすることにより制御する。ウイルス感染の６〜８日後の間を採取時とし、細胞生存率≦２０％の採取基準を達成した。採取時に、小孔サイズを２．０〜４．０μｍとするプレフィルターおよび小孔サイズを０．１〜０．８μｍとする最終フィルターの、２セットのフィルターを使用して、ＰＰＶ ２７ａ ＶＰ２抗原液を清明化させる。濾過された採取液を、タンク内に回収する。
次いで、清明化させたＰＰＶ ２７ａ ＶＰ２抗原液を、温度を４℃〜２９℃の間とする、≧２倍容量（２倍〜２．５倍）のＷＰＢＳ［名目分子量カットオフ（ＮＭＷＣ）を３００，０００〜５００，０００キロドルトン（ｋＤａ）とする、中空糸フィルターを使用する］で「透析濾過」する。透析濾過の後、不活化のために、バイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）を、５ｍＭの最終濃度まで添加することにより、ＰＰＶ ２７ａ ＶＰ２抗原の温度を、３７±２℃へと上昇させる。抗原を、３７±２℃でインキュベートし、７２〜９６時間にわたり混合する。残存ＢＥＩは、モル過剰量のチオ硫酸によるナトリウム溶液で、少なくとも３０分間にわたり中和する。ワクチンブレンディングまで、４±３℃で保管するために、ＰＰＶ ２７ａ ＶＰ２抗原液を、バッグへと移す。
下記の表１Ａおよび１Ｂのデータは、最長で８時間（１作業日）にわたり、併せて混合したところ、ＰＰＶ ２７ａ ＶＰ２ワクチンが、ＲｅｐｒｏＣｙｃ（登録商標）ＰＲＲＳ ＥＵワクチンおよびＩｎｇｅｌｖａｃ（登録商標）ＰＲＲＳ ＭＬＶワクチンのそれぞれに対して、殺ウイルス性ではないことを示す。
表１Ａ：２連番のＲｅｐｒｏＣｙｃ ＰＲＲＳ ＥＵ（登録商標）である、バッチ番号：３９１０００３Ａ（投与１０回分）および３９１０００４Ａ（投与５０回分）を、研究のために使用するまで、パッケージング材料内、５℃±３℃で保管した。２連番のＰＰＶ ２７ａ ＶＰ２である、バッチ番号：７６０００１６Ａ（投与１０回分）および７６０００１８Ｂ（投与５０回分）を、それぞれ、Ｉｎｇｅｌｖａｃ ＲｅｐｒｏＣｙｃ（登録商標）ＰＲＲＳ ＥＵのバッチ３９１０００３Ａ（投与１０回分）および３９１０００４Ａ（投与５０回分）のための希釈剤として使用した。これらの２つのバッチを、研究のために使用するまで、パッケージング材料内、５℃±３℃で保管した。復元（群１におけるＣａｒｂｏｐｏｌ含有希釈剤中の復元、または群２における液体ワクチンＰＰＶ ２７ａ ＶＰ２中の復元）の後、ＲｅｐｒｏＣｙｃ（登録商標）ＰＲＲＳ ＥＵワクチンを、室温（１５〜２５℃）において、最長で８時間にわたり保管し、０、２、４、および８時間後において、力価について調べた。下記の表１Ａにおける、ウイルス滴定（用量２ｍＬ当たりのＬｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０）の、Ｔ０、Ｔ２、Ｔ４、およびＴ８における、群１の結果は、ウイルスの安定性を、最長で８時間にわたり裏付けた。Ｔ０、Ｔ２、Ｔ４、およびＴ８における、関連する生成物についてのウイルス滴定（用量２ｍＬ当たりのＬｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０）についての、群２の結果は、ＰＰＶ ２７ａ ＶＰ２ワクチンが、最大で８時間にわたり、ＲｅｐｒｏＣｙｃ（登録商標）ＰＰＲＳ ＥＵに対する殺ウイルス活性を有さないことを裏付けた。
Figure 0006941171
表１Ｂ：２連番のＩｎｇｅｌｖａｃ ＰＲＲＳ ＭＬＶである、バッチ番号：２４５１１８９Ａ（投与１０回分）および２４５１１８８Ａ（投与５０回分）を、研究のために使用するまで、パッケージング材料内、５℃±３℃で保管した。２連番のＰＰＶ ２７ａ ＶＰ２である、バッチ番号：７６０００１６Ａ（投与１０回分）および７６０００１８Ｂ（投与５０回分）を、それぞれ、Ｉｎｇｅｌｖａｃ（登録商標）ＰＲＲＳ ＭＬＶのバッチ２４５１１８９Ａ（投与１０回分）および２４５１１８８Ａ（投与５０回分）のための希釈剤として使用した。これらの２つのバッチを、研究のために使用するまで、パッケージング材料内、５℃±３℃で保管した。復元（群１におけるＣａｒｂｏｐｏｌ含有希釈剤中の復元、または群２における液体ワクチンＰＰＶ ２７ａ ＶＰ２中の復元）の後、Ｉｎｇｅｌｖａｃ（登録商標）ＰＲＲＳ ＭＬＶワクチンを、室温（１５〜２５℃）において、最長で８時間にわたり保管し、０、２、４、および８時間後において、力価（用量２ｍＬ当たりのＴＣＩＤ50）について調べた。下記の表１Ｂにおける、ウイルス滴定（用量２ｍＬ当たりのＬｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０）の、Ｔ０、Ｔ２、Ｔ４、およびＴ８における、群１の結果は、ウイルスの安定性を、最長で８時間にわたり裏付けた。Ｔ０、Ｔ２、Ｔ４、およびＴ８における、関連する生成物についてのウイルス滴定（用量２ｍＬ当たりのＬｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０）についての、群２の結果は、ＰＰＶ ２７ａ ＶＰ２ワクチンが、最大で８時間にわたり、Ｉｎｇｅｌｖａｃ（登録商標）ＰＲＲＳ ＭＬＶに対する殺ウイルス活性を有さないことを裏付けた。
Figure 0006941171
（例３）
ＰＲＲＳＶ−ＥＵワクチンを、ＰＰＶ ＶＰ２ワクチンと混合する場合の、ＰＲＲＳＶ−ＥＵワクチンの有効性
３６匹の妊娠していない、繁殖適齢期の、未経産ブタを、各群が１２匹ずつの未経産ブタを含む、３つの処置群へと無作為化した。群Ｔ０１には、０日目および２１日目（Ｄ０、Ｄ２１）において、ＷＰＢＳ（洗浄リン酸緩衝生理食塩液）による対照生成物（対照）を施した。群Ｔ０２には、０日目に、投与１回当たり３．９ ｌｏｇ１０ ＴＣＩＤ50のＲｅｐｒｏＣｙｃ（登録商標）ＰＲＲＳ ＥＵ（ＰＲＲＳ株９４８８１）と、ブタパルボウイルスワクチンである、投与１回当たり１０μｇのＰＰＶ−２７ａ ＶＰ２（混合）を施し、２１日目に、投与１回当たり１０μｇのＰＰＶ−２７ａ ＶＰ２だけを施した。乾燥凍結ケーキとしてのＲｅｐｒｏＣｙｃ（登録商標）ＰＲＲＳ ＥＵを、液体のＰＰＶ−２７ａ ＶＰ２により復元した。群Ｔ０３には、０日目において、ＲｅｐｒｏＣｙｃ（登録商標）ＰＲＲＳ ＥＵ（単独）を施した。未経産ブタに、最小免疫化用量のＲｅｐｒｏＣｙｃ（登録商標）ＰＲＲＳ ＥＵおよび最大相対効力のＰＰＶ−２７ａ ＶＰ２が施されるように、処置を決定した。初回ワクチン接種の４週間後（２８日目）、未経産ブタに、総用量６ｍＬ（２ｍＬの筋内および鼻腔１つ当たり２ｍＬずつ）当たり５．５ ｌｏｇ10 ＴＣＩＤ50の異種ＰＲＲＳＶ ＥＵ分離株１９０１３６で抗原投与し、血清試料を、以下の日数後：３１日目、３５日目、３８日目、４２日目、および４９日目に回収した。定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により、ＰＲＲＳＶウイルス血について調べた［Sandra Revilla-Fernandez et al., Journal of Virological Methods 126 (2005) 21-30］。抗原投与用ウイルスである、欧州ＰＲＲＳウイルス分離株１９０１３６は、元は、２００４年４月、ドイツ、ニーダーザクセンにおける蔓延時の、ＰＲＲＳＶに典型的な生殖徴候（雌ブタにおける流産および新生仔子豚における虚弱）を示す農場に由来する新生仔子豚の肺組織から得られた。主治獣医は、診断試験のために、肺試料を、ＢｉｏＳｃｒｅｅｎへと送付した（試料は、２００４年４月２１日に受領された）。抗原投与用ウイルスは、抗原投与の前に、ＡＫ−ＭＡ１０４細胞内で繁殖させ、２代にわたり継代した。
抗原投与後の、いずれの群（混合群および単独群）も、２８日目〜４９日目についての、定量的ウイルス負荷の曲線下面積（ＡＵＣ）であって、対照における１ｍＬ当たり５０．８５ ＧＥと比較した、混合群についての、１ｍＬ当たり２４．３６ ＧＥ（ＧＥ＝ゲノム当量）（ｐ＝０．０００２）、および単独群についての、１ｍＬ当たり３２．５４ ＧＥ（ｐ＝０．００４５）のＡＵＣで、強毒性ＰＲＲＳＶに対して効果的であることが示された。これは、混合群について、ブタにおける全身循環ウイルスの、時間経過にわたる、約５０％の低減を表し、ＲｅｐｒｏＣｙｃ（登録商標）ＰＲＲＳ ＥＵ単独群（図１）について、約４０％低減を表すことから、混合群および単独群の実質的な防御効果が裏付けられる。加えて、定量的平均値ＰＲＲＳＶについてのｑＰＣＲ解析が、３５日目（ｐ＜０．０００１）および３８日目（ｐ＝０．００５２）における混合群についてのＰＲＲＳＶウイルス負荷の、対照と比較した有意な低減、および３５日目（ｐ＜０．０００１）についての単独群におけるＰＲＲＳＶウイルス負荷の、対照と比較した有意な低減を裏付けたことからも、混合群および単独群の実質的な防御効果が裏付けられる。ｑＰＣＲ解析は、３５日目に、混合群（ｐ＝０．００１３）および単独群（ｐ＝０．００４６）について、３８日目に、混合群（ｐ＝０．０１３７）について、対照と比較した、陽性未経産ブタの比率の有意な低減を示した。統計学的に有意ではないが、平均値ウイルス負荷およびＰＲＲＳＶ ｑＰＣＲ陽性比率の低減への数値傾向が、４２日目および４９日目における混合群について観察された。同様の傾向は、４９日目において、平均値ウイルス負荷が数値的に低減され、４２日目および４９日目において、ｑＰＣＲ陽性比率が数値的に低減された、単独群についても見られた。
ＲｅｐｒｏＣｙｃ（登録商標）ＰＲＲＳ ＥＵワクチン単独の使用、またはＰＰＶ−２７ａ ＶＰ２ワクチンと混合した場合の使用は、強毒性ＰＲＲＳＶ−ＥＵ抗原投与株に対して効果的であることが実証されたことから、４週間後における免疫の発生が裏付けられる。図１および図２におけるデータから、ＲｅｐｒｏＣｙｃ（登録商標）ＰＲＲＳ ＥＵワクチンを、ＰＰＶ−２７ａ ＶＰ２と混合することにより、有効性が改善されたことが明らかである。結果は、混合群における、ＰＲＲＳＶ構成要素と、ＰＰＶ構成要素との干渉の欠如を示すことから、混合を介する併用の、有利な可能性が裏付けられる。
（例４）
ＰＲＲＳＶ−ＥＵワクチンを、ＰＰＶ ＶＰ２ワクチンと混合する場合の、ＰＰＶ ＶＰ２ワクチンの有効性
組合せワクチンの有効性についての評価：実験によるＰＰＶ感染に対する、両方のワクチン［ＲｅｐｒｏＣｙｃ（登録商標）ＰＲＲＳ ＥＵ（ＰＲＲＳ株９４８８１）およびＰＰＶ−２７ａ ＶＰ２］の併用の有効性について査定する。
ＰＰＶ野生株による抗原投与実験に対する有効性：ＰＰＶに対する組合せワクチンの有効性について、胎仔におけるＰＰＶ感染に基づき査定する。各処置群内の胎仔のうちの≧８０％が、ＰＰＶについて血清反応陰性であれば、ワクチンは、効果的であると考えられる。
動物愛護：動物は、研究を開始する前に、良好な健康状態および栄養状態にある。組入れおよび無作為化手順の前に、健康検査を行う。研究期間を通して、医薬部外飼料を使用する。飼料補給量は、施設の標準業務手順書に従い、被験動物の週齢、状態、および種に適切である。水は、研究を通して、不断補給される。
異種ＰＰＶ株による抗原投与の後における、ＰＰＶワクチンおよびＰＲＲＳＶワクチンの併用の有効性についての評価：０日目に、従来型の、５〜６カ月齢の、妊娠していない未経産ブタを、３つの処置群へと、衡平に無作為化する。群Ｔ０１には、０日目および２１日目（Ｄ０、Ｄ２１）に、対照生成物（ＰＢＳ−Ｃａｒｂｏｐｏｌ希釈剤（Ｉｍｐｒａｎ ＦＬＥＸ（登録商標））２ｍＬのＩＭを施す。群Ｔ０２には、０日目に、ＲｅｐｒｏＣｙｃ（登録商標）ＰＲＲＳ ＥＵ（ＰＲＲＳ株９４８８１）、およびブタパルボウイルスワクチンであるＰＰＶ−２７ａ ＶＰ２、２１日目に、ＰＰＶ−２７ａ ＶＰ２だけ２ｍＬのＩＭを施す。群Ｔ０２については、乾燥凍結ケーキとしてのＲｅｐｒｏＣｙｃ（登録商標）ＰＲＲＳ ＥＵを、ＰＰＶ−２７ａ ＶＰ２ワクチン溶液により復元した。群Ｔ０３には、０日目および２１日目に、ブタパルボウイルスワクチンであるＰＰＶ−２７ａ ＶＰ２（投与１回当たり１μｇ）２ｍＬのＩＭを施す。未経産ブタを、全般的健康について、毎日観察する。妊娠３９〜４２日目の間に、２００４年６月１５日に、ＢｉｏＳｃｒｅｅｎ（Ｍｕｅｎｓｔｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により、ミイラ化子豚の組織から得られた、異種ＰＰＶ株４０１／０９（１９８６６９）により、動物に抗原投与し、Ｌｅｉｐｚｉｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｇｅｒｍａｎｙ（抗原投与用ウイルスは、融解させ、ＤＭＥＭ（１倍濃度、Ｇｉｂｃｏ、製品番号：１１９６６−０２５、ロット番号：１６３２５０５）中で、用量６ｍＬ当たり６．０ ｌｏｇ１０ ＴＣＩＤ50の目標投与量まで希釈する）へと送付した。胎仔を、妊娠の約９０日目に採取し（標準手順）、それらの臓器または組織液試料に由来するＰＰＶの存在についてＰＣＲ（Molitor TW et al., Journal of Virological Methods 1991, 32: 201-211）により査定するほか、胎仔の状態、サイズ、および体重についても査定する。処置は、未経産ブタが、ＲｅｐｒｏＣｙｃ（登録商標）ＰＲＲＳ ＥＵ（ＰＲＲＳ株９４８８１）、およびブタパルボウイルスワクチンであるＰＰＶ−２７ａ ＶＰ２を、ＲｅｐｒｏＣｙｃ（登録商標）ＰＲＲＳ ＥＵの最大免疫化用量（用量２ｍＬ当たり１０7．0ＴＣＩＤ50；幾何平均）、およびブタパルボウイルスワクチンであるＰＰＶ−２７ａ ＶＰ２については、最小相対効力（投与１回当たり１μｇ）で施されるように決定する。
ワクチンが、９５．７％（Ｔ０３群）および９４．３％（Ｔ０２群）の保護をもたらす一方で、Ｔ０１群（対照）は、９１．４％の陽性胎仔を有した（表２を参照されたい）ので、研究は、欧州薬局方第８．０ ０４／２０１３：０９６５条に従い、妥当であった。
ワクチン接種を、交配の３週間前に完了させる場合、単独のＰＰＶワクチンまたはＲｅｐｒｏＣｙｃ（登録商標）ＰＲＲＳ ＥＵと混合されたＰＰＶワクチンによるワクチン接種は、安全かつ効果的であることが結論づけられる。
Figure 0006941171
（例５）
サブユニットＰＰＶワクチンの調製
Ｇｅｒｍａｎ ＰＰＶ ２７ａ分離株に基づき、ＰＰＶ ＶＰ２抗原を、バキュロウイルスを感染させた昆虫細胞内で発現させるために選択する。ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）２７ａ ＶＰ２のヌクレオチド配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＡＹ６８４８７１．１から得る。ＰＰＶ ２７ａ ＶＰ２コード領域を、逆翻訳し、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ属について、コドンを最適化させる（配列番号４および配列番号３）。コドンを最適化させたＰＰＶ ２７ａ ＶＰ２遺伝子は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにおいて化学合成する。次いで、ＰＰＶ ２７ａ遺伝子を、バキュロウイルス移入ベクターであるｐＶＬ１３９３へとサブクローニングし、直鎖化されたバキュロウイルスＤｉａｍｏｎｄＢａｃ（登録商標）骨格と共に、Ｓｆ９昆虫細胞へと共トランスフェクトして、ポリヘドリンプロモーターの制御下で、ＰＰＶ ２７ａ ＶＰ２遺伝子を含有する組換えバキュロウイルスを作出する。
Ｓｆ９昆虫細胞内で発現させたところ、ＰＰＶ ＶＰ２は、非エンベロープＶＬＰへと自己組織化された（データは示さない）。
ＰＰＶ ＶＰ２抗原は、カルボマー（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）でアジュバント処理する。
（例６）
ＰＰＶワクチンについての概念実証研究
全ての動物研究において、動物は、研究を開始する前に、良好な健康状態および栄養状態にある。無作為化手順の前に、健康検査を行う。研究期間を通して、医薬部外飼料を使用する。飼料補給量は、施設の標準業務手順書に従い、被験動物の週齢、状態、および種に適切である。水は、研究を通して、不断補給される。
このワクチン接種−抗原投与研究の目的は、繁殖前におけるブタパルボウイルス（ＰＰＶ）サブユニットワクチン（実施例５を参照されたい）について、概念実証的な、用量決定有効性を確立することである。強毒性生ＰＰＶ分離株（ＰＰＶ ００２３４６−５；北米株）による抗原投与前の、妊娠約４０日目（ｄＧ）において、未経産ブタにワクチン接種し、これらを繁殖させた。約９０ｄＧにおいて、胎仔を、ＰＰＶ感染について査定する。
研究デザインを、表３に記載する。
Figure 0006941171
既に、検査結果が、ＰＰＶについて陰性であり、生殖疾患の既往歴またはＰＰＶに対するワクチン接種を伴わない群れに由来する６７例の未経産ブタを使用する。未経産ブタを、３つの囲いへと混在させた、ｎ＝９ずつの６つの処置群（Ｔ）であって、０日目に、ワクチン接種を施され、２１日目に追加接種されるＴ：Ｔ１：ＮＣ（注射用水による陰性対照）、Ｔ２：１０μｇのＰＰＶ、Ｔ３：ＰＣ（陽性対照；全、不活化ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｃａｎｉｃｏｌａ、Ｌ．ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ、Ｌ．ｈａｒｄｊｏ、Ｌ．ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ、およびＬ．Ｐｏｍｏｎａ；市販されている；製造元のマニュアルに従い使用される）へと無作為化する。３例の非処置対照（ＮＴＸ）の未経産ブタを、囲い１つ当たり１例ずつ組み入れる。ワクチン接種後、未経産ブタを同期化し（Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）；アルトレノゲスト、Ｉｎｔｅｒｖｅｔ Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈの投与を介する；表示に従い、１８日目〜３１日目にわたる、１４日間の連続投与）、次いで、３５日目〜４２日目の間に繁殖させる。６７例中５４例の未経産ブタが妊娠する。８０日目（約４０ｄＧ）に、ＮＴＸ未経産ブタを剖検し、残りの未経産ブタに、投与１回（２ｍＬの筋内および鼻腔１つ当たり２ｍＬずつの鼻腔内）当たり４．２５ ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50のＰＰＶ株（北米株）であるＰＰＶ００２３４６−５ ６ｍＬを接種する。未経産ブタから、同期化時および繁殖時（３５日目〜７０日目）を除き、毎週採血する。０日目、７日目、１４日目、２１日目、２８日目、および７３日目の血清に対して、血清学を実施し、ウイルス血についての血清学およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Jozwik et al. 2009; Journal of General Virology, 90, 2437-2441に記載されている）を、８０日目、８７日目、９４日目、１０１日目、１０８日目、１１５日目、１２２日目、および１２８日目の血清に対して実施する。未経産ブタを、１２９日目または１３０日目（約９０ｄＧ）に剖検する。剖検時に、各生殖管を摘出し、子宮内の胎仔の位置、胎仔の状態、サイズ、および体重を記録する。各胎仔に由来する胸部洗浄液および肺の試料を回収する。胸部洗浄液試料を、各胎仔から、無菌的に回収する。略述すると、３ｍｌの滅菌ＰＢＳを、滅菌注射針およびシリンジにより、胸腔へと注入する。胸腔液を、シリンジへと吸引し戻し、適切なサイズの、適切な滅菌ＳＳＴ（血清分離用チューブ）へと注入する。胸部洗浄液を、ＰＰＶの存在について、ＰＣＲにより調べ、ＰＰＶ抗体の存在について、血球凝集阻害（ＨＩ）により調べる。肺組織は、凍結させて保管する。
未経産ブタのウイルス血（ＰＰＶ）
全ての未経産ブタは、０日目、７３日目（データは示さない）、および８０日目の抗原投与の前において、ＰＰＶウイルス血について陰性である（表４）。全ての陰性対照は、８７日目において、ウイルス血性であり、７例中４例は、９４日目において、ウイルス血性である。
ワクチン接種後、Ｔ３の未経産ブタは、追加ワクチン接種の後、セロコンバージョンする。Ｔ２は、初回ワクチン接種に対して、血清学的応答を示し、追加ワクチン接種の後、血清反応陽性を維持する。Ｔ１の対照未経産ブタは、抗原投与まで、ＰＰＶについて血清学的に陰性を維持する。抗原投与後の、全ての陰性対照未経産ブタは、８７日目（抗原投与の７日後）に、ウイルス血性である。１例のＴ３未経産ブタは、８７日目に、ウイルス血性である。他の全ての未経産ブタは、これらの時点において、ウイルス血性ではない（表４を参照されたい）。
ＮＴＸ未経産ブタは、血清反応陰性を維持し、それらの胎仔は全て、胸部洗浄液試料に対するＰＣＲによりＰＰＶ陰性であった。
Figure 0006941171
胎仔の結果
ＮＴＸ胎仔の全ては、８０日目の剖検において、正常であると考えられる（表５）。１２９および１３０日目の最終的な剖検において、Ｔ１（陰性対照）胎仔のうちの２２．５％が、正常であるのに対し、Ｔ３における胎仔のうちの９８．３９％、およびＴ２における胎仔のうちの９７．６２％が、正常である。Ｔ１（陰性対照）胎仔の平均サイズおよび平均体重が、それぞれ、１１．５ｃｍおよび１６８．８ｇであるのに対し、Ｔ２における、胎仔の平均サイズおよび平均体重は、それぞれ、１７．５ｃｍおよび５９０．１ｇである。
全てのＴ４（ＮＴＸ）胎仔は、胸部洗浄液試料に対するＰＣＲにより決定される通り、ＰＰＶ陰性である（表３を参照されたい）。ＰＰＶ感染は、Ｔ１の陰性対照胎仔８０例中６７例（８３．７５％）において確認される。ＰＰＶに感染していることが確認された、陰性対照胎仔６７例中６２例は、ミイラ体である。これに対し、ＰＰＶ感染は、Ｔ２胎仔中０．７９％だけで確認される。
欧州薬局方（第０１／２００８：０９６５条）で言明された有効性を確立するための最終パラメータに基づき、全てのワクチン（陽性対照（全細胞不活化ＰＰＶ）を含む）は、感染からの防御についての基準（＞８０％の胎仔が、ＰＰＶについて陰性である）を満たす。
Figure 0006941171
結論：本発明のＰＰＶワクチンは、強毒性異種ＰＰＶの抗原投与の後における胎仔の保護を示した。研究結果は、ワクチンが、繁殖前に投与した場合に安全であり、胎仔における、ウイルス血、および経胎盤感染を著明に軽減するのに効果的であることを示す。さらに、ワクチンが、異種北米ＰＰＶ抗原投与株に対して保護することも示されている。さらに、サブユニットＰＰＶ ＶＰ２タンパク質が、完全死滅ウイルスと同様に効果的であることも示されている。
（例７）
ＰＰＶワクチンの最小免疫化用量の確立（異種ＵＳ ＰＰＶ株に対する保護）
このワクチン接種−抗原投与研究の目的は、ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）ワクチンの最小免疫化用量（ＭＩＤ）を確立することである。未経産ブタに、妊娠約４０日目（ｄＧ）において、強毒性生ＰＰＶ血清型１分離株（ＰＰＶ ００２３４６−５）により抗原投与する。抗原投与の後で、ワクチン接種群内の胎仔のうちの≧８０％が、ＰＰＶについて陰性であれば、ワクチンは、効果的であると考えられる。補助パラメータは、胎仔のサイズ、体重、および状態、未経産ブタの抗原投与後におけるウイルス血状態および未経産ブタの血清学的状態を含む。
未経産ブタ（生殖疾患の既往歴またはＰＰＶに対するワクチン接種を伴わない）を、処置群：Ｔ０１陰性対照（製品に対応するプラセボ（ＰＭＰ））およびＴ０２＝用量２ｍＬ当たり１．０μｇのＰＰＶへと無作為化する。処置／抗原投与されていない（ＮＴＸ）未経産ブタを、全般的健康状態についての対照としての囲いへと、無作為に割りつける。
０日目および２１日目に、未経産ブタの筋内に、２ｍＬの適切な処置を施す。ワクチン接種後、未経産ブタを、３７日目〜５０日目の間に繁殖させ、次いで、７４日目に、妊娠状態について査定する。８１日目に、妊娠中の未経産ブタに、６ｍＬ当たり６．７７ ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50のＰＰＶ血清型１により、筋内および鼻腔内において抗原投与する。未経産ブタから、発情同期化時および繁殖時（３６〜７３日目）を除き、毎週採血する。血球凝集阻害（ＨＩ）アッセイを、７日目、１４日目、２１日目、２８日目、および３５日目の血清に対して実施し、ウイルス血についてのＨＩおよびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（実施例６を参照されたい）を、−３日目、７４日目、８０日目、８８日目、９５日目、１０２日目、および１２７日目の血清に対して実施する。未経産ブタを、１２８日目または１２９日目（約９０ｄＧ）に剖検する。剖検時に、各雌ブタの生殖管を摘出し、子宮内の各胎仔の位置、胎仔の状態、サイズ、および体重を記録する。胸部洗浄液試料（実施例６を参照されたい）を、各胎仔から、回収し、ＰＰＶの存在について、ＰＣＲにより調べる。
未経産ブタのウイルス血（ＰＰＶ）
動物は、ワクチン接種の２４時間後または４８時間後における異常な体温、ワクチンに帰せられる異常な局所反応、およびワクチン接種に関連する臨床徴候を示さないので、ワクチンは、安全であると考えられる（データは示さない）。
全ての未経産ブタは、７４日目および８０日目の抗原投与の前、ワクチン接種の前において、ＰＰＶウイルス血について陰性である。したがって、ワクチン接種後において、ワクチン投与に関連する臨床徴候は、観察されない。８８日目において、１０例全てのＴ０１未経産ブタは、ウイルス血性であり、ワクチン接種された、全ての未経産ブタは、陰性である。９５日目、１０２日目、および１２７日目における、全ての他の血液試料は、全ての処置群で、ＰＰＶウイルス血について陰性である（表６）。
Figure 0006941171
胎仔の結果
１２８日目および１２９日目の最終的な剖検において、Ｔ０１（陰性対照）胎仔のうちの３８％が、正常状態であるのに対し、ワクチン群における胎仔のうちの９５％が、正常状態である。Ｔ０１（陰性対照）胎仔の平均サイズおよび平均体重が、それぞれ、１４．４ｃｍおよび２４５．９ｇであるのに対し、ワクチン接種された母体に由来する胎仔の平均サイズおよび体重は、それぞれ、１９．３ｃｍおよび５５０ｇである（表７）。したがって、欧州薬局方第０１／２００８：０９６５条により確立された、ＰＰＶの有効性についての最終パラメータは、処置群内の＞８０％の胎仔が、ＰＰＶについて陰性でなければならないことであるので、ワクチン群は、ＰＰＶによる感染からの防御についての基準を満たす。
ＰＰＶ感染は、陰性対照（Ｔ０１）胎仔１４６例中１１３例（７７％）で確認される。しかし、ワクチン接種群（Ｔ０２）におけるＰＰＶ感染は、わずかに１０％である。
Figure 0006941171
結論：本発明のＰＰＶ ＶＰ２サブユニットワクチンは、強毒性異種ＰＰＶの抗原投与の後における胎仔の保護を示す。本研究結果は、１μｇのＰＰＶ ＶＰ２サブユニットワクチンだけを使用する場合に、ワクチンが、安全であり、かつ、未経産ブタにおけるウイルス血および胎仔におけるＰＰＶ感染を防止するのに効果的であることを明らかにする。さらに、ワクチンが、異種北米抗原投与株に対して防御することも示されている。
（例８）
ＰＰＶワクチンの最小免疫化用量の確立（異種ＥＵ ＰＰＶ株に対する保護）
本研究の目的は、ブタパルボウイルスワクチン（本実施例の後続では、ＰＰＶワクチンと呼ばれる、ＰＰＶ ＶＰ２）の免疫の発生について査定することである。加えて、無作為化、盲検、陰性対照ワクチン接種−抗原投与研究デザインを使用して、安全性および有効性についても査定する。
未経産ブタを、無作為に、３つの群へと割りつける。群１および２では、未経産ブタに、３週間間隔で、２回にわたり（０日目および２１日目に）ワクチン接種する。２回目の投与は、交配の３週間前に施す。全ての処置を、２ｍＬの容量で、筋内（ＩＭ）経路により投与する。群２に、ＰＰＶワクチンを施す一方、群１は、対照生成物としての滅菌希釈剤を施されるプラセボ群であり、群３は、いかなる処置も伴わない、厳密対照として用いられる。
未経産ブタを発情同期化させ、２回目のワクチン接種の３週間後、これらに人工授精した。妊娠３９〜４２日目の間の８４日目に、妊娠した動物に、強毒性の異種ＰＰＶ株で抗原投与する。
妊娠の約９０日目である、１３２〜１３５日目に、未経産ブタを、安楽死させ、剖検し、胎仔を査定した。
Figure 0006941171
抗原投与前および抗原投与後の未経産ブタにおける、ＰＰＶウイルス血についての、ＰＣＲによる査定：
全ての動物は、ワクチン接種前の、−６日目および−１日目において、ＰＣＲにより、ＰＰＶについて陰性であり、組入れ基準を満たす。ワクチン接種後、抗原投与まで、厳密対照生成物群および対照生成物群の全ての動物は、ＰＰＶ抗原について陰性であり、したがって、抗原投与前のＰＰＶ感染は、除外することができる。
抗原投与の７日後（９０日目）、１４日後（９７日目）、および２１日後（１０４日目）、ならびに剖検日に、ウイルス血について精査する。ワクチン接種された動物では、抗原投与の後、ウイルス血は、検出されず、ウイルス血は、ワクチン接種されていない対照動物だけで生じる。
９０日目（抗原投与の７日後）に既に、ワクチン接種されていない対照動物のうちの９５％は、ＰＰＶについて陽性である。９７日目には、これらの動物のうちの６０％が、なおも、陽性結果を有するが、１０４日目に、全ての動物は、検査結果が、ＰＰＶについて陰性である。これに対し、ワクチン接種群では、９０日目、９７日目、または１０４日目における、全ての被験動物は、ＰＰＶについて陰性である。
Figure 0006941171
胎仔の結果
ＰＰＶに感染した胎仔の百分率は、対照群では、９１．４％であったが、ＰＰＶ群では、わずかに４．３％であった（表１０を参照されたい）。
Figure 0006941171
胎仔の状態についての査定
全ての胎仔を、それらの状態について査定し、３つの類別：正常、ミイラ化、および自己分解へと割り当てた。
ミイラ化胎仔および自己分解胎仔の大部分は、対照群において見出される。この群の胎仔のうち、わずかに３９．８％が正常状態であるのに対し、ワクチン接種群（ＰＰＶ群）では、胎仔のうちの９７．４％が、正常状態を有する（表１１を参照されたい）。
Figure 0006941171
結論：本発明のＰＰＶワクチンは、強毒性異種ＰＰＶの抗原投与の後における胎仔の保護を示すことから、１μｇのワクチンだけを使用する場合に、ワクチンが、胎仔において、安全であり、かつ、ウイルス血およびＰＰＶ感染を防止するのに効果的であることが指し示される。さらに、ワクチンがまた、ＰＰＶの異種欧州抗原投与株に対して防御することも示されている。したがって、ワクチンは、異種北米抗原投与株ならびに異種欧州抗原投与株に対して防御するので、広範な保護スペクトルを有する。
本明細書で開示され、特許請求される組成物および方法の全ては、本開示に照らして、不要な実験を伴わずに作製し、実行することができる。本発明の組成物および方法について、好ましい実施形態との関係で記載してきたが、当業者には、本発明の概念、精神、および範囲から逸脱しない限りにおいて、本明細書において記載される組成物および方法、ならびに方法のステップまたはステップのシーケンスに、変動を適用しうることが明らかであろう。より具体的には、同じ結果または同様の結果を達成しながら、化学的かつ生理学的に類縁のある特定の薬剤を、本明細書で記載される薬剤で代用しうることが明らかであろう。当業者に明らかな、全てのこのような同様の代用および改変は、付属の特許請求の範囲により規定される、本発明の精神、範囲、および概念の中にあるものとみなされる。
（例９）
繁殖適齢期未経産ブタにおける、ＰＰＶサブユニットによる、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅおよび／またはブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルスとの組合せワクチンについての、ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）概念実証／ワクチン用量決定
このワクチン接種−抗原投与研究の目的は、Ｉｎｇｅｌｖａｃ（登録商標）ＰＲＲＳＶ ＭＬＶの、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ（Ｅｒｙ）菌ワクチンとの実験的サブユニットブタパルボウイルス（ＰＰＶ）組合せワクチンとの併用についてのデータを提供し、５〜６カ月齢の未経産ブタにおいて、ＰＰＶによる、Ｅｒｙ菌ワクチンとの組合せワクチンの有効性についての概念実証用量決定を確立することである。
６７例の未経産ブタは、既に、検査結果が、ＰＰＶについて陰性であり、疾患またはワクチン接種についてのＰＰＶ既往歴を伴わない群れに由来した。未経産ブタを、３つの囲いへと混在させた、ｎ＝９ずつの６つの処置群であって、０日目に、ワクチン接種を施され、２１日目に追加接種される処置群：Ｔ１：陰性対照、Ｔ２：１０μｇのＰＰＶ、Ｔ３：０．１μｇのＰＰＶ＋１０ ｌｏｇのＥｒｙ、Ｔ４：１．０μｇのＰＰＶ＋１０ ｌｏｇのＥｒｙ、Ｔ５：１０μｇのＰＰＶ＋１０ ｌｏｇのＥｒｙ、Ｔ６：陽性対照（ＦａｒｒｏｗＳｕｒｅ（登録商標）ＧＯＬＤ）へと無作為化した。３例の非処置対照（ＮＴＸ）の未経産ブタを、囲い１つ当たり１例ずつ組み入れた。加えて、１０例の未経産ブタは、別個の建物で飼育し、市販のブタ繁殖呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）ワクチンと組み合わせた場合のＰＰＶ有効性について評価するために、Ｔ７：Ｉｎｇｅｌｖａｃ（登録商標）ＰＲＲＳＶ ＭＬＶを再水和させるのに使用される１０μｇのＰＰＶ＋１０ ｌｏｇのＥｒｙを施した。Ｔ７は、本実施例９を目的とする群である。
未経産ブタにワクチン接種し、交配させたところ、６７例中５４例の未経産ブタが妊娠した。妊娠約４０日目（ｄＧ）に、ＮＴＸ未経産ブタを剖検し、残りの未経産ブタに、投与１回（２ｍＬの筋内および鼻腔１つ当たり２ｍＬずつの鼻腔内）当たり４．２５ ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50のＰＰＶ株であるＰＰＶ００２３４６−５ ６ｍＬを接種した。未経産ブタから、同期化時および繁殖時（３５日目〜７０日目）を除き、毎週採血し、血清を、表１２に記載される通りに調べた。
Figure 0006941171
未経産ブタを、１２９日目または１３０日目（約９０ｄＧ）に剖検した。剖検時に、各生殖管を摘出し、子宮内の胎仔の位置、胎仔の状態、サイズ、および体重を記録した。各胎仔に由来する胸部洗浄液および肺の試料を回収した。胸部洗浄液を、ＰＰＶの存在について、ＰＣＲにより調べ、ＰＰＶ抗体の存在について、血球凝集阻害（ＨＩ）により調べた。肺組織は、凍結させて保管した。
Ｔ７の未経産ブタは、ワクチン接種に対する血清学的応答を示し、抗原投与後において、ウイルス血性ではなかった。剖検時に、Ｔ７胎仔のうちの９７．３７％（１１４例中１１１例）は、正常状態であり、検査結果がＰＰＶについて陽性である胎仔は、１例だけであった。これに対し、全てのＴ１未経産ブタは、ワクチン接種期には、血清反応陰性であったが、抗原投与後、全てがセロコンバージョンし、ウイルス血性となった。剖検時に、Ｔ１胎仔のうち、正常状態であるのは、２２．５０％（８０例中１８例）だけであり、８３．７５％（８０例中６７例）は、胸部洗浄液についてのＰＣＲによる検査結果が、ＰＰＶ感染について陽性であった。結論として述べると、Ｉｎｇｅｌｖａｃ ＰＲＲＳ ＭＬＶを伴う組合せワクチン（１０μｇのＰＰＶ＋Ｅｒｙ）は、４０ｄＧにおいて、胎仔のウイルス血およびＰＰＶ感染を防止するのに効果的であった。
研究デザイン：
Figure 0006941171
材料：
対照生成物：陰性対照（Ｔ１）動物へと投与される対照生成物は、ＢＩＶＩ、Ｓｔ．Ｊｏｓｅｐｈ ＭＯ、ＵＳＡにおいて、水から精製された注射用水（ＷＦＩ）を使用して調製された滅菌希釈剤（ロット番号：２４０）であった。対照生成物は、プラスチック製ボトル内の１００ｍＬの容量を充填した提示物として提供された。０日目に、２ｍＬの用量を、右頸部筋肉に適用し、２１日目に、２ｍＬの追加用量を、左頸部筋肉に適用した。
ワクチン：Ｔ７のための、目的の組合せワクチンは、Ｉｎｇｅｌｖａｃ（登録商標）ＰＲＲＳ ＭＬＶを再水和させる希釈剤として使用される、Ｅｒｙ菌ワクチンとの実験的サブユニットＰＰＶ組合せワクチンであった。製造番号３１１−１７１は、２０ｍＬ（投与１０回分）を含有するプラスチック製ボトル内で、実験検査技師により用意された、投与１回当たり１０ ｌｏｇの死滅Ｅｒｙ菌と組み合わせたＰＰＶについて、投与１回当たり１０μｇを目標とした。単一ボトルの製造番号３１１−１７１を使用して、研究責任医師により得られた市販品の製造番号である、製造番号２４５−Ｂ５３の、単一ボトルのＩｎｇｅｌｖａｃ（登録商標）ＰＲＲＳ ＭＬＶを再水和させた。０日目に、２ｍＬの用量を、右頸部筋肉に適用し、２１日目に、２ｍＬの追加用量を、左頸部筋肉に適用した。
抗原投与材料：抗原投与材料は、抗原投与イベントの前に、ＢＩＶＩ−Ｒ＆Ｄ、Ａｍｅｓ ＩＡの実験検査技師が調製した。ＰＰＶ株００２３４６−５は、投与１回当たり５ ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50で、６ｍＬの用量（割当てロット番号：３５４−０２１）を目標とし、抗原投与イベント時は、氷上で維持した。抗原投与力価は、４℃で保持された、抗原投与後の残存材料に対するＴＣＩＤ50アッセイにより決定した。抗原投与材料の最終力価は、１ｍＬ当たり３．４７ ｌｏｇまたは用量６ｍＬ当たり４．２５ ｌｏｇであった。８０日目に、全ての未経産ブタに、右頸部における２ｍＬの筋内に加えた、各鼻腔当たり２ｍＬずつの抗原投与材料を接種した。
方法：
剖検および胎仔の査定：７９日目に、全てのＮＴＸ未経産ブタを、静脈内バルビツール酸系剤の注射により安楽死させ、１２９日目および１３０日目に、全ての残存する未経産ブタを安楽死させた。各剖検では、生殖管を摘出し、胎仔を、帝王切開分娩を介して、無菌的に分娩させた。胎仔は、未経産ブタＩＤ、次いで、文字（「右子宮角」のＲまたは「左子宮角」のＬ）から構成され、次いで、胎仔が見つかったときの、子宮角分岐部からの番号から構成される胎仔ＩＤにより同定した。胎仔の状態（正常またはミイラ体）、サイズ、および体重を記録した。
胎仔試料の回収：試料の交差汚染を防止するために、剖検時に、かつ、実験室内で、各胎仔および各試料の両方を操作する間に、全ての適切な技法を使用して、作業場および器具を、滅菌処理または清浄化した。試料に、胎仔ＩＤ、試料種類、研究日、および回収年月日を表示した。回収日の可能な限り早い時間に、試料を、氷上で、実験検査技師へと搬送した。実験検査技師または指定担当者は、各試料を、適切にサイズ指定され、適切に表示されたチューブへとアリコート分割しながら、交差汚染を防止する適正な技法を使用して、各試料を加工した。１つのアリコートを、ＩＳＵ−ＶＤＬへと提出した。ＰＣＲにより、ウイルスの存在を、各試料について測定した。残りのアリコートは、ＢＩＶＩ−Ｒ＆Ｄ、Ａｍｅｓにおいて、−７０℃で保管した。
胸部洗浄液の回収：可能な限り無菌的に、胸部洗浄液は、研究責任医師が、各胎仔から回収した。略述すると、３ｍＬの滅菌ＰＢＳを、滅菌注射針およびシリンジにより、胸腔へと注入した。可能な限り多量の胸腔液を、シリンジへと吸引し戻し、次いで、適切なサイズのＳＳＴへと注入した。
統計学的方法：
実験単位：Ｔ１〜Ｔ６については、未経産ブタが、実験単位であった。Ｔ７との比較を行う場合は、Ｔ７の畜舎が他の処置群と別個であることを理解して、飼育室を実験単位とした。
動物数の正当性：欧州薬局方は、ワクチン接種された未経産ブタ少なくとも７例、および対照の未経産ブタ５例に抗原投与することを要求していた（欧州薬局方第０１／２００８：０９６５条）。各処置が、未経産ブタの不妊の原因であるのかどうかを問うために、９または１０例の未経産ブタを調達した。
無作為化：研究を開始する前に、統計担当者に、未経産ブタのＩＤ番号を与え、未経産ブタを、囲いおよび処置へと、完全にランダムに無作為化した。３例の未経産ブタを、ＮＴＸ群へと無作為化し、１０例の未経産ブタを、Ｔ７群へと無作為化し、残りの未経産ブタを、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、およびＴ６群へと、同等に無作為化した。Ｔ１〜６の未経産ブタおよびＮＴＸの未経産ブタは、小屋１の中の３つの囲いに分けた。Ｔ７未経産ブタは、小屋２の中の囲いで、個別に飼育した。
盲検化基準：研究を通して、データの収集または実験室アッセイの実施に関与する任意の担当者を、未経産ブタの、処置群Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、およびＴ６への割付けに対して遮蔽した。Ｔ７およびＮＴＸの未経産ブタは、別個に飼育し、血清を、ＰＲＲＳＶ抗体について調べたので、これらの２つの群に対しては、担当者を盲検化することができなかった。処置は、データ収集に関与しない人員が投与した。
データ管理：データの統計学的解析は、統計担当者が行った。全てのデータは、管理および解析のために、ＳＡＳ ｖｅｒｓｉｏｎ ９．２（Ｃａｒｙ、ＵＳＡ／Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ、ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．）へとインポートした。
結果：
本研究の概要では、Ｉｎｇｅｌｖａｃ（登録商標）ＰＲＲＳＶ ＭＬＶを再水和させるのに使用される１０μｇのＰＰＶ＋１０ ｌｏｇのＥｒｙ群（Ｔ７）と比較した、陰性対照（Ｔ１）についての比較だけを提示し、Ｔ１群、Ｔ７群、およびＮＴＸ群についてのデータを提示する。
未経産ブタの結果：０日目に、全ての未経産ブタは、ＥＬＩＳＡにより、ＰＲＲＳＶについて、血清学的に陰性であった。２１日目、８０日目、および１２８日目に、全てのＴ７未経産ブタは、ＰＲＲＳＶについて、血清反応陽性であった。７３日目に、全てのＴ７未経産ブタは、血清反応陽性であり、全ての他の処置群内の未経産ブタは、血清反応陰性であった。
Ｔ７についての幾何平均ＰＰＶ ＨＩ力価は、２１日目の追加ワクチン接種の後で、血清反応陽性となり、これを維持したのに対し、Ｔ１およびＮＴＸ処置についての幾何平均ＰＰＶ ＨＩ力価は、ワクチン接種期において、血清反応陰性（＜１００）にとどまった。Ｔ１およびＴ７未経産ブタに、ＰＰＶで抗原投与した８０日目以後、いずれの群も、血清反応陽性であった。
全ての未経産ブタは、０日目、７３日目（データは示さない）、および８０日目の抗原投与の前において、ＰＰＶウイルス血について陰性（０）であった。全ての陰性対照は、８７日目において、ウイルス血性であり、７例中４例は、９４日目において、ウイルス血性であった。
Figure 0006941171
胎仔の結果：ＮＴＸ胎仔の全ては、８０日目の剖検において、正常であると考えられた（[00430]）。１２９日目および１３０日目の最終的な剖検において、Ｔ１（陰性対照）胎仔のうちの２２．５％が、正常であるのに対し、Ｔ７における胎仔のうちの９９．１２％が、正常であった。Ｔ１（陰性対照）胎仔の平均サイズおよび平均体重が、それぞれ、１１．５ｃｍおよび１６８．８ｇであるのに対し、Ｔ７における、胎仔の平均サイズおよび平均体重は、それぞれ、１７．８ｃｍおよび５７６．３ｇであった。
全てのＮＴＸ胎仔は、胸部洗浄液試料に対するＰＣＲにより決定される通り、ＰＰＶ陰性であった。ＰＰＶ感染は、Ｔ１の陰性対照胎仔８０例中６７例（８３．７５％）において確認された。ＰＰＶに感染していることが確認された、陰性対照胎仔６７例中６２例は、ミイラ体であった。１８例の正常な外見の胎仔は全て、同じ同腹仔に由来し、これら１８例の胎仔中、ＰＰＶ陽性であることが確認されたのは、５例だけであった。Ｔ７では、感染したブタは、１例だけであり、感染率は、＜１％であった。
Figure 0006941171
考察／結論
ＮＴＸ未経産ブタは、血清反応陰性を維持し、それらの胎仔は全て、胸部洗浄液試料に対するＰＣＲによりＰＰＶ陰性であった。
Ｔ７（１０μｇのＰＰＶ＋Ｅｒｙ＋ＰＲＲＳＶ）を投与された未経産ブタは、初回ワクチン接種に対して、血清学的応答を示し、追加ワクチン接種の後、血清反応陽性を維持した。Ｔ７の未経産ブタは、抗原投与後の、毎週のサンプリング時点において、ウイルス血性ではなかった。剖検時に、Ｔ７胎仔のうちの９７．３７％（１１４例中１１１例）は、正常状態であり、胸部洗浄液についてのＰＣＲによる検査結果が、ＰＰＶ感染について陽性である胎仔は、１例だけであった。これに対し、Ｔ１（陰性対照）を投与された未経産ブタは、ワクチン接種期には、血清反応陰性であったが、抗原投与後、全ての未経産ブタがセロコンバージョンし、ウイルス血性となった。Ｔ１胎仔の平均サイズおよび平均体重は、実質的に、Ｔ７の平均未満であった。剖検時に、Ｔ１胎仔のうち、正常状態であるのは、２２．５０％（８０例中１８例）だけであり、８３．７５％（８０例中６７例）は、胸部洗浄液についてのＰＣＲによる検査結果が、ＰＰＶ感染について陽性であった。
結論として述べると、ＰＲＲＳ ＭＬＶを伴う組合せワクチン（１０μｇのＰＰＶ＋Ｅｒｙ）は、４０ｄＧにおいて、胎仔のウイルス血およびＰＰＶ感染を防止するのに効果的であった。
配列表
配列番号４は、コドンを最適化させたＰＰＶ ２７ａ ＶＰ２のヌクレオチド配列であって、グリシンリピートから構成される、ＶＰ２コード領域を挟むように、２つのＣｌａＩ制限酵素部位（アミノ酸２５位は、イソロイシン残基であり、アミノ酸３６位は、セリン残基であり、アミノ酸３７位は、イソロイシン残基である）を有するよう、さらに修飾されたヌクレオチド配列である。しかし、ＣｌａＩ部位は、ＶＰ２コード領域を破壊しない形で導入した。配列番号２は、配列番号４に対応するタンパク質配列である。配列番号３は、コドンを最適化させたＰＰＶ ２７ａ ＶＰ２のヌクレオチド配列（ＣｌａＩ制限酵素部位を伴わない）である。配列番号１は、配列番号３に対応するタンパク質配列である。配列番号５〜１６は、ＣｌａＩ部位を伴う（配列番号５〜１０）か、またはこれを伴わない（配列番号１１〜１６）、さらなるＰＰＶ ＶＰ２タンパク質配列を開示する。配列番号１７は、ＰＲＲＳＶレイスタッド野生型配列に対応し、配列番号１８は、ＰＲＲＳＶＶＲ２３３２野生型配列に対応する。

Claims (16)

  1. ａ）少なくとも１つのブタパルボウイルス（ＰＰＶ）抗原であって、前記少なくとも１つのＰＰＶ抗原が、１つまたは複数のＰＰＶサブユニットであり、かつ、前記少なくとも１つまたは複数のＰＰＶサブユニットが、ＰＰＶウイルスタンパク質２（ＶＰ２）であり、好ましくはＰＰＶ ＶＰ２が、唯一のＰＰＶ抗原である、少なくとも１つのＰＰＶ抗原と、
    ｂ）少なくとも１つのブタ繁殖呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）ウイルス抗原であって、弱毒化生／改変生ＰＲＲＳウイルスに含有される、任意の抗原である、少なくとも１つのＰＲＲＳウイルス抗原と
    を含む免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
  2. ＰＰＶが、弱毒化生／改変生ＰＰＶ、死滅／不活化ＰＰＶ、死滅／不活化ＰＰＶ株０１４、ブタパルボウイルスのドイツ野生分離株であるＰＰＶ−２７ａおよびＰＰＶ−１４３ａ、ならびにブタパルボウイルスのワクチンウイルスであるＰＰＶ−ＮＡＤＬ−２およびＰＰＶ−ＩＤＴ（ＭＳＶ）からなる群から選択される、請求項１に記載の免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
  3. ＰＰＶ ＶＰ２が、
    ・２２８位のアミノ酸において、グルタミン酸（ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄまたはｇｌｕｔａｍａｔｅ）残基を有し、かつ／または
    ・４１４位のアミノ酸において、セリン残基を有し、かつ／または
    ・４１９位のアミノ酸において、グルタミン残基を有し、かつ／または
    ・４３６位のアミノ酸において、トレオニン残基
    を有し、
    アミノ酸位置の番号付けが、野生型ＰＰＶ ＶＰ２のアミノ酸配列を指す、請求項１または２に記載の免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
  4. ＰＰＶ ＶＰ２が、
    ・２５位のアミノ酸において、イソロイシン残基を有し、かつ／または
    ・３６位のアミノ酸において、セリン残基を有し、かつ／または
    ・３７位のアミノ酸において、イソロイシン残基
    をさらに有する、請求項３に記載の免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
  5. アミノ酸位置の番号付けが、配列番号１に示されるアミノ酸配列を指す、請求項３または４に記載の免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
  6. ＰＰＶ ＶＰ２が、配列番号１、配列番号２、および／または配列番号５〜１６のアミノ酸配列と、少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、請求項１から５までのいずれか１項に記載の免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
  7. 弱毒化生／改変生ＰＲＲＳウイルスが、１型遺伝子型弱毒化生／改変生ＰＲＲＳウイルス、２型遺伝子型弱毒化生／改変生ＰＲＲＳウイルス、弱毒化生／改変生ＰＲＲＳウイルス株９４８８１、およびＡＴＣＣ ＶＲ２３３２からなる群から選択される、請求項１から６までのいずれか１項に記載の免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
  8. 単回投与または２回投与のために製剤化される、請求項１から７までのいずれか１項に記載の免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
  9. 少なくとも１つの薬学的に許容される担体、好ましくは、カルボマーをさらに含む、請求項１から８までのいずれか１項に記載の免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
  10. ０．１μｇ〜５０μｇのＰＰＶ ＶＰ２抗原、好ましくは、０．５μｇ〜１０μｇのＰＰＶ ＶＰ２抗原、より好ましくは、１．０μｇ〜１０μｇのＰＰＶ ＶＰ２抗原、および／または３．９〜７．０ ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50の弱毒化生／改変生ＰＲＲＳウイルスを含む、請求項１から９までのいずれか１項に記載の免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
  11. 少なくとも１つのブタパルボウイルス（ＰＰＶ）抗原と、少なくとも１つのブタ繁殖呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）ウイルス抗原とが、単一の容器に併せて含有されるか、または互いと空間的に分離され、好ましくは、２つまたはこれを超える個別の容器に含有される、請求項１から１０までのいずれか１項に記載の免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せ。
  12. 請求項１から１１までのいずれか１項に記載の免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せを含むキット。
  13. 少なくとも１つのブタパルボウイルス（ＰＰＶ）抗原と、少なくとも１つのブタ繁殖呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）ウイルス抗原とが、２つまたはこれを超える個別の容器に、互いと別々に、好ましくは、いずれも、乾燥凍結形態または凍結形態で、互いと独立に含有され、前記キットが、空間的に分離された少なくとも１つのＰＰＶ抗原と、少なくとも１つのＰＲＲＳウイルス抗原とを混合するための取扱説明書をさらに含み、好ましくは、このような取扱説明書が、少なくとも１つのＰＰＶ抗原を含有する容器の内容物を、少なくとも１つのＰＰＲＳウイルス抗原を含有する容器の内容物と組み合わせる指示を含有し、より好ましくは、少なくとも１つのＰＰＶ抗原を含有する容器の液体内容物を、少なくとも１つのＰＰＲＳウイルス抗原を含有する容器の乾燥凍結内容物のための希釈剤として使用する、請求項１２に記載のキット。
  14. ブタにおける疾患を処置および／もしくは予防するための指示をさらに含み、かつ／またはＰＰＶ感染および／もしくはＰＲＲＳウイルス感染を処置および／もしくは予防するための指示をさらに含み、好ましくは、本明細書で開示および特許請求され、このようなキットに含有される免疫原性組成物または組合せワクチンまたは組合せのＰＰＶ構成要素（好ましくは、分離されたキット構成要素としての）、およびＰＲＲＳＶ構成要素（好ましくは、分離されたキット構成要素としての）の、関連する使用のための指示をさらに含む、請求項１２または１３に記載のキット。
  15. 医薬、好ましくは、ワクチンとしての使用のための、請求項１から１１までのいずれか１項に記載の免疫原性組成物もしくは組合せワクチンもしくは組合せ、または請求項１２から１４までのいずれか１項に記載のキット。
  16. 好ましくは、少なくとも１つのブタパルボウイルス（ＰＰＶ）抗原と、少なくとも１つのブタ繁殖呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）ウイルス抗原とを、対象へと、同時に、より好ましくは、同じまたは異なる投与部位に、個別に同時に、逐次的に（任意の順序で）、かつ／または時間を前後して投与する、ＰＰＶおよび／もしくはＰＲＲＳウイルスの感染の処置および／もしくは防止、ＰＰＶおよび／もしくはＰＲＲＳウイルスの感染により引き起こされる臨床徴候の軽減、防止、もしくは処置、またはＰＰＶおよび／もしくはＰＲＲＳウイルスの感染により引き起こされる疾患の処置および／もしくは防止の方法における使用のための、請求項１５に記載の免疫原性組成物もしくは組合せワクチンもしくは組合せ。
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