ES2242400T3 - Proteina que se une a la angiostatina. - Google Patents
Proteina que se une a la angiostatina.Info
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Abstract
Una proteína-1 de unión a angiostatina (ABP- 1) de mamífero aislada capaz de unirse a los dominios kringle 1 a 4 y/ó 5 del plasminógeno y que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de secuencia superior a al menos el 80% con las SEC. ID. Nº 2, 3 ó 4.
Description
Proteína que se une a la angiostatina.
La presente invención se relaciona con el campo
de la angiogénesis y, más concretamente, con nuevas moléculas, tales
como proteínas y péptidos, mediante las cuales se pueden desarrollar
nuevas substancias anti-angiogénicas. La invención
se relaciona también con métodos para desarrollar dichas
substancias.
Casi el tejido del cuerpo de un mamífero tiene
una fina malla de vasos sanguíneos muy delgados, cada uno de los
cuales es más delgado que un cabello humano. Normalmente, no aumenta
ni el número ni el tamaño de estos vasos, ya que la división de las
células endoteliales que cubren los vasos es lenta, realmente de
hasta varios años. Las excepciones son, por ejemplo, durante la
curación de heridas y la menstruación, cuando los vasos crecen
rápidamente. Sin embargo, esto se produce durante un período
limitado de tiempo y la división celular cesa a continuación.
La generación de nuevos vasos sanguíneos a partir
de los ya existentes se llama angiogénesis. La angiogénesis ha sido
asociada al cáncer y a la formación de tumores, así como a otras
condiciones, tales como la retinopatía diabética, la artritis
reumatoide e incluso algunas condiciones inflamatorias. En
consecuencia, se realiza un considerable esfuerzo de investigación a
nivel mundial para hallar formas de prevenir e inhibir el proceso de
la angiogénesis. Si esto fuera posible, el crecimiento tumoral
podría ser controlado y se podrían desarrollar terapias útiles en
cuanto a las condiciones antes mencionadas.
Existen numerosas evidencias que muestran que los
tumores dependen de la formación de vasos sanguíneos de novo
para expandirse más allá de unos cuantos mm^{3}. La angiogénesis
se dispara por factores segregados por las células tumorales. Se ha
descubierto recientemente que los tumores, a través de una actividad
proteolítica desatada, generan fragmentos peptídicos, que muestran
actividades anti-angiogénicas. Un ejemplo es la
molécula angiostatina, que es un fragmento del plasminógeno.
El plasminógeno es una substancia del plasma
sanguíneo que, cuando se activa, forma plasmina o fibrinolisina, una
enzima implicada en la coagulación de la sangre. El propio
plasminógeno carece de cualquier actividad
anti-angiogénica detectable. Se ha visto (Judah
Folkman y col., Harvard Medical School, Boston) que una parte de
esta proteína endógena, más concretamente los primeros cuatro
dominios kringle, es capaz de evitar que las células endoteliales se
dividan. Esta parte del plásminógeno ha sido llamada angiostatina y
una gran cantidad de investigación en este campo se centra alrededor
de esta molécula. La técnica anterior ha mostrado que la
angiostatina inhibe las células endoteliales específicamente in
vitro y bloquea la angiogénesis in vivo. Los tratamientos
sistémicos con inyecciones subcutáneas de angiostatina inducen la
latencia in vivo de una amplia variedad de tumores en ratones
SCID (O'Reilly y col., Nature Med., Vol. 2, p. 689, 1996). No se ha
detectado toxicidad detectable en estos animales incluso después de
meses de tratamiento. La angiostatina muestra dos niveles de
especificidad: induce la apoptosis específicamente en células
endoteliales in vitro (Claesson-Welsh y col.,
Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Vol. 95, p. 5579, 1998) y sólo afecta a
las células endoteliales activas en la angiogénesis in vivo.
No ha mostrado afectar negativamente a células en vasos
establecidos.
La angiostatina sí exhibe ciertamente algunas
propiedades ventajosas, entre otras cosas, por ser una substancia
endógena. Sin embargo, los inconvenientes asociados a su posible uso
para fines médicos no pueden ser menospreciados. Uno es que su vida
media es muy corta, se puede cifrar en horas, requiriendo, por lo
tanto, una frecuente administración de la misma. Hasta ahora, su
eficiencia ha mostrado ser bastante baja, cuyo hecho necesita del
uso de grandes dosis de la misma. Estos dos inconvenientes son en sí
mismos fuertes motivos para dirigir una mayor investigación hacia el
descubrimiento de moléculas alternativas de menor tamaño y/o más
eficaces para uso como medicamentos.
La presente invención resuelve los problemas
asociados a la angiostatina antes definidos mediante una proteína
humana, que ha sido denominada "ABP-1",
definida por su capacidad para unirse a un fragmento del
plasminógeno, preferiblemente a los primeros cuatro dominios Kringle
(K1-K4) del mismo, caracterizándose dicho fragmento
por una actividad biológica anti-angiogénica.
ABP-1 consiste en una secuencia
de aminoácidos que tiene una homología de secuencia mayor de al
menos un 80% con la SEC. ID. Nº 2.
También se incluyen en la presente invención los
homólogos de ABP-1 en otras especies, especialmente
en otros mamíferos, que tienen una homología de secuencia mayor de
al menos un 80% con las SEC. ID. Nº 2, 3 ó 4.
En otro aspecto, la invención proporciona
moléculas de ácido nucleico aisladas consistentes en una secuencia
que codifica para ABP-1 o para un polipéptido
substancialmente similar a ABP-1, es decir, que
tiene una homología de secuencia mayor de al menos un 80% con las
SEC. ID. Nº 2, 3 ó 4.
La presente invención incluye también métodos de
rastreo para identificar un compuesto capaz de interaccionar con la
ABP-1 o sus variantes y fragmentos. El método de
rastreo puede estar en cualquier configuración bien conocida para
los expertos en la técnica.
Es aún otro objeto de la presente invención
proporcionar anticuerpos dirigidos contra epitopos presentes en
ABP-1 o sus variantes y fragmentos, así como células
productoras del anticuerpo.
Es otro objeto de la presente invención
proporcionar un vector que contiene la secuencia nucleotídica de
ABP-1 o sus variantes y fragmentos.
Es otro objeto de la presente invención
proporcionar una célula que contiene el vector anterior.
En la presente solicitud, se usan los siguientes
términos en los significados definidos a continuación.
Tal como se usa aquí, el término
"angiogénesis" se relaciona con la generación de nuevos vasos
sanguíneos en un tejido u órgano. Como se ha mencionado
anteriormente, en condiciones fisiológicas normales, los humanos y
los animales sufren angiogénesis sólo en situaciones restringidas
muy específicas. Por ejemplo, se observa normalmente angiogénesis en
la curación de heridas, en el desarrollo fetal y embrionario y en la
formación del cuerpo lúteo y la placenta.
El término "endotelio" se relaciona con la
capa fina de células epiteliales planas que reviste las cavidades
serosas, los vasos linfáticos y los vasos sanguíneos. El término
"actividad inhibidora endotelial" se relaciona con la capacidad
para inhibir el crecimiento de las células endoteliales de los
capilares.
El término "una proteína asociada a la
angiogénesis" se relaciona con una proteína capaz de
interaccionar en la angiogénesis, tal como un receptor que se une a
una substancia anti-angiogénica.
El término "substancialmente similar",
cuando se usa en relación a la secuencia de aminoácidos de la SEC.
ID. Nº 2, la SEC. ID. Nº 3 y la SEC. ID. Nº 4, significa una
secuencia de aminoácidos que tiene un alto grado de homología de
secuencia con la SEC. ID. 2, la SEC. ID. Nº 3 y la SEC. ID. Nº 4. Un
alto grado de homología significa al menos aproximadamente un 80% de
homología de aminoácidos, preferiblemente al menos aproximadamente
un 90% de homología de aminoácidos, más preferiblemente al menos
aproximadamente un 95% de homología de aminoácidos y más
preferiblemente al menos aproximadamente un 98% de homología de
aminoácidos.
El término "que se hibrida específicamente
con" se refiere a la unión, a la formación de dúplex o a la
hibridación de una molécula sólo con una secuencia nucleotídica
particular en condiciones estrictas cuando la secuencia está
presente en una mezcla compleja (por ejemplo, celular total) de ADN
o ARN. El término "condiciones estrictas" se relaciona con
condiciones bajo las cuales una sonda se hibridará con su
subsecuencia diana, pero no con otras secuencias. Las condiciones
estrictas son dependientes de secuencia y serán diferentes en
diferentes circunstancias. Las secuencias más largas se hibridarán
específicamente a mayores temperaturas. En general, las condiciones
estrictas son seleccionadas para ser aproximadamente 5ºC inferiores
al punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica a una
fuerza iónica y pH definidos. La Tm es la temperatura (bajo una
fuerza iónica, un pH y una concentración de ácido nucleico
definidos) a la cual un 50% de las sondas complementarias de la
secuencia diana se hibridan con la secuencia diana en el equilibrio.
(Como las secuencias diana están generalmente presentes en exceso, a
la Tm, un 50% de las sondas están ocupadas en el equilibrio).
Típicamente, las condiciones estrictas serán aquéllas en las cuales
la concentración salina es menor de aproximadamente 1,0 M de ion Na,
típicamente de aproximadamente 0,01 a 1,0 M de ion Na (u otras
sales), a pH 7,0 a 8,3y la temperatura es de al menos
aproximadamente 30ºC para sondas cortas (por ejemplo, de 10 a 50
nucleótidos) y de al menos aproximadamente 60ºC para sondas más
largas. También se pueden conseguir condiciones estrictas con la
adición de agentes desestabilizantes, tales como formamida.
La Figura 1 muestra la unión de angiostatina
marcada con ^{125}I y plasminógeno a células endoteliales de
microcapilares bovinos in vitro. Las unidades de la abscisa
representan las veces de exceso molar de angiostatina fría y
plasminógeno, respectivamente.
La Figura 2 muestra la estrategia para aislar
proteínas que se unen a la angiostatina.
La Figura 3 muestra el crecimiento de clones de
levadura positivos en condiciones selectivas.
La Figura 4 compara la unión de
"Big-3" recombinante a angiostatina y
plasminógeno, respectivamente.
La Figura 5 es un mapa sobre
"Big-3".
La Figura 6 muestra el marco abierto de lectura
(Marco 2) del gen codificante del receptor de angiostatina según la
invención. Los otros marcos posibles no producen ninguna proteína
putativa.
La Figura 7 muestra los patrones de expresión de
ARNm fetal y de adulto, así como células endoteliales.
La Figura 8 muestra la cuantificación relativa de
la expresión génica ABP-1 en diferentes tejidos.
Véase la sección experimental para más detalles.
La Figura 9 ilustra (A) la localización celular
del receptor ABP-1 marcado con GFP en células HeLa
transitoriamente transfectadas y (B) la reorganización de
ABP-1 marcada con GFP tras incubación con
angiostatina. La Figura 9C muestra la unión de angiostatina a
ABP-1. Véase la sección de experimentos para más
detalles. La Figura 9D es una inmunotinción de ABP-1
en células endoteliales de cordón umbilical humano (HUVE) junto con
la tinción frente a F-actina con faloidina marcada
con rodamina. ABP-1 se localiza en las adhesiones
focales y los rizos de la membrana (flechas).
La Figura 10 ilustra la regulación decreciente de
la actividad kinasa asociada a ABP-1 tras al adición
de angiostatina.
La Figura 11 es una autorradiografía de una
SDS-PAGE que demuestra que ABP-1
media en la actividad kinasa de adhesión focal inducida por
angiostatina. Véase la sección experimental para más detalles.
La presente invención se relaciona con una
proteína asociada a la angiogénesis humana aislada capaz de unirse a
un fragmento del plasminógeno, preferiblemente a un fragmento
N-terminal, tal como los dominios Kringle 1 a 4 y/o
kringle 5. Así, la proteína de la invención actúa como receptor de
fragmentos de plasminógeno, en particular como receptor de la
angiostatina y/o el dominio kringle 5 del plasminógeno. La proteína
de la invención puede ser sintetizada por métodos biológicos o
químicos (por ejemplo, expresión de genes recombinantes y síntesis
peptídica). Las técnicas recombinantes incluyen la clonación o
amplificación génica por métodos in vitro, tales como la
reacción en cadena de polimerasa ("PCR"), la reacción en cadena
de ligasa ("LCR"), el sistema de amplificación basado en la
transcripción ("TAS") o el sistema de replicación de secuencia
automantenida ("SSR"). Una amplia variedad de metodologías de
clonación y amplificación in vitro son bien conocidas para
los expertos en la técnica. Se encuentran ejemplos de estas
técnicas, v.g., en Berger y Kimmel, Guide to Molecular
Cloning Techniques, Methods in Enzymology 152, Academic Press,
Inc., San Diego, CA (Berger). La presente invención incluye
proteínas que consisten en secuencias de aminoácidos
substancialmente similares a las mostradas en la SEC. ID. Nº 2, la
SEC. ID. Nº 3 y la SEC. ID. Nº 4. Una comparación de la secuencia
proteica de la SEC. ID. Nº 2 con las secuencias presentes en todas
las bases de datos disponibles mostró una homología del 23,7% con
una proteína hipotética de Caenorhabditis elegans codificada
por un marco abierto de lectura putativo localizado en el grupo
central del cromosoma III de este organismo (descrito en R. Wilson y
col., Nature, Vol. 368, 3 de Marzo de 1994, pp.
32-38). No se ha atribuido ninguna función a esta
proteína hipotética.
Según la definición dada anteriormente, hay que
entender que todos los polipéptidos capaces de unirse a un fragmento
del plasminógeno y que tienen una secuencia de aminoácidos que tiene
al menos aproximadamente un 80% de homología de secuencia,
preferiblemente aproximadamente un 90% de homología de secuencia,
más preferiblemente aproximadamente un 95% de homología de secuencia
y más preferiblemente aproximadamente un 98% de homología de
secuencia con las SEC. ID. Nº 2, 3 ó 4, se contemplan como incluidos
en la presente invención. Estas formas variantes pueden resultar,
por ejemplo, del ayustamiento alternativo o de la expresión
diferencial en diferentes tejidos del mismo organismo de origen. Las
formas variantes pueden caracterizarse, por ejemplo, por inserción,
deleción o substitución de aminoácidos. Una forma variante preferida
de ABP-1 es ilustrada en la SEC. ID. Nº 3 (véase más
adelante).
Una realización particularmente preferida de la
presente invención consiste en un fragmento de ABP-1
llamado Big-3, que será descrito con más detalle a
continuación y que incluye el dominio de unión a angiostatina de
ABP-1 (SEC. ID. Nº 4).
En otra realización, la presente invención
proporciona péptidos que consisten en al menos aproximadamente 5,
preferiblemente al menos aproximadamente 10, residuos contiguos de
aminoácidos de la SEC. ID. Nº 2 o cualquier variante o fragmento de
la misma. Sin embargo, el tamaño más ventajoso del péptido dependerá
del futuro uso pretendido del mismo y la presente invención no se
limita al número antes indicado de residuos de aminoácidos.
También se incluyen en la presente invención
homólogos de ABP-1 y Big-3 en otras
especies, en particular, en otros mamíferos. El término
"homólogo" se refiere a proteínas que ejercen substancialmente
la misma función biológica de las proteínas de la invención,
independientemente de la homología que exista entre las secuencias
de aminoácidos correspondientes.
En otro aspecto, la presente invención se
relaciona con moléculas de ácido nucleico aisladas consistentes en
una secuencia que codifica para las proteínas y péptidos de la
invención, incluyendo las variantes, fragmentos y homólogos, como se
ha definido anteriormente. En una realización preferida, la molécula
de ácido nucleico tiene la secuencia de la SEC. ID. Nº 1. Esta
secuencia presenta una región no traducida 5' (del nucleótido 1 al
nucleótido 796) y una región no traducida 3' (del nucleótido 2825 al
nucleótido 6463). En otra realización preferida, la molécula de
ácido nucleico tiene la secuencia que va del nucleótido 797 al
nucleótido 2824 de la SEC. ID. Nº 1. En otra realización preferida,
la secuencia de ácido nucleico codifica para el fragmento de
ABP-1 llamado Big-3 (ilustrado en la
SEC. ID. Nº 4) y consiste en la secuencia nucleotídica que va de la
posición 2180 a la posición 2608 de la SEC. ID. Nº 1. Todas las
secuencias nucleotídicas codificantes de los polipéptidos de la
invención y que difieren de la secuencia nucleotídica de la SEC. ID.
Nº 1 o un fragmento de la misma por la degeneración del código
genético, son consideradas parte de la invención. El análisis de
secuenciación ha revelado la presencia de un posible polimorfismo en
el codon 1199-1201 de la SEC. ID. Nº 1, donde puede
estar presente un codon para Asn, Ser o Asp: se ha visto que otra
región correspondiente a las posiciones nucleotídicas 1238 a 1246 de
la SEC. ID. Nº 1 codifica para el tripéptido
Glu-Leu-Ala o para el tripéptido
Thr-Trp-Pro. Estas variaciones en la
secuencia de aminoácidos de ABP-1 están ilustradas
en la SEC. ID. Nº 3, que constituye otra proteína preferida de la
invención. También se incluyen en la presente invención moléculas
nucleotídicas codificantes de un homólogo de ABP-1 o
fragmento de la misma.
La presente invención incluye también un ácido
nucleico capaz de hibridarse específicamente, en condiciones
estrictas, con cualquiera de las moléculas de ácido nucleico de la
invención antes descritas.
Cuando los ácidos nucleicos según la invención
han de ser usados como sondas, es con frecuencia deseable marcar las
secuencias con marcadores detectables. Dichos marcadores pueden
incluir cualquier composición detectable por medios
espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos,
eléctricos, ópticos o químicos. Los marcadores pueden ser
incorporados por cualquiera de una serie de medios bien conocidos
para los expertos en la técnica. Los métodos para detectar dichos
marcadores son también bien conocidos en la técnica y están
descritos en la literatura. Las sondas hallan una aplicación útil en
la aplicación diagnóstica, por ejemplo, para detectar y medir la
biosíntesis de ABP-1 en tejidos y células.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona métodos o ensayos de rastreo, donde se rastrean
moléculas que exhiben las mismas propiedades que la angiostatina y/o
kringle 5. En un método típico de rastreo, se identifica un
compuesto capaz de activar la ruta de transducción de la señal de
angiostatina a través de un rastreo basado en células de alto
rendimiento. Dicho rastreo se basa en un gen informador dirigido por
un elemento que responde a angiostatina que es establemente
transfectado en una línea celular que responde a angiostatina. El
elemento que responde se une a un gen informador, por ejemplo, el
gen para la luciferasa; al unirse el compuesto a la proteína de la
invención, se activa la ruta intracelular, provocando así un aumento
en la actividad del gen informador, que puede ser detectado.
Los compuestos identificados por el método de
rastreo aquí descrito están dentro del alcance de la presente
invención. Dichos compuestos son preferiblemente moléculas de bajo
peso molecular de naturaleza peptídica o no peptídica. Gracias a su
pequeño tamaño, son más prácticas para uso con fines médicos, en
comparación con la angiostatina. Estas moléculas y sus usos son
descritos con mayor detalle a continuación.
Las proteínas y péptidos según la invención
pueden ser sintetizados usando técnicas químicas de síntesis
peptídica estándar. Para la síntesis en fase sólida, véase, por
ejemplo, Barany y Merrifield, Solid-Phase Peptide
Synthesis, pp. 3-284, en The Peptides:
Analysis, Synthesis and Biology, Vol. 2: Special Methods in
Peptide Synthesis, Parte A.
Preferiblemente, las proteínas, péptidos y
polipéptidos según la invención son sintetizados usando metodología
de ADN recombinante, que generalmente implica crear una secuencia de
ADN que codifica para la proteína o péptido, poner el ADN en un
cassette de expresión bajo el control de un promotor particular,
expresar la proteína o péptido en un huésped, aislar la proteína o
péptido expresado y, si se requiere, renaturalizar el producto. Una
vez expresados, los péptidos o proteínas recombinantes pueden ser
purificados según procedimientos estándar en la técnica. Así, otro
aspecto de la presente invención es un vector, tal como un virus o
un plásmido, que contiene un ácido nucleico según la invención.
Además, la invención también concierne a una célula recombinante
transformada o transfectada con dicho vector que expresa la presente
proteína o péptido, así como a una célula recombinante que expresa
el presente anticuerpo, lo que se definirá con más detalle a
continuación. Los vectores codificantes de los péptidos y proteínas
según la invención son útiles para expresar esas moléculas para
obtener inmunógenos para la producción de anticuerpos. Los vectores
según la invención son también de utilidad para transformar células
in vitro o in vivo para que expresen los presentes
péptidos y proteínas. Las células que expresan cualquiera de los
presentes ácidos nucleicos, tales como el gen definido por la SEC.
ID. Nº 1, pueden ser usadas en una amplia variedad de contextos y
quedan también dentro del alcance de la presente invención. Dichas
células pueden ser eucarióticas o procarióticas.
Las proteínas y péptidos según la invención
pueden ser usados como antígenos para producir anticuerpos contra
los mismos. Por consiguiente, la invención también incluye un
anticuerpo que se une específicamente a un péptido según la
invención. Dichos anticuerpos son útiles para inmunoensayos, por
ejemplo, para el aislamiento de péptidos o polipéptidos. Los
péptidos según la invención pueden ser también usados en ensayos,
tales como ensayos específicos de amplificación, ensayos
inmunológicos, etc.
Los anticuerpos según la invención pueden ser
monoclonales o policlonales e incluyen variantes individuales,
alélicas, de cepa o de especie, o sus fragmentos, tanto en sus
formas naturales (de longitud completa) como en sus formas
recombinantes. Adicionalmente, los anticuerpos son producidos para
los presentes péptidos o polipéptidos en su configuración nativa o
en configuraciones no nativas. También se pueden generar anticuerpos
anti-idiopáticos. Muchos métodos de preparación de
anticuerpos son conocidos para las personas expertas en la técnica.
Para técnicas de preparación de anticuerpos monoclonales, véase, por
ejemplo, Stlites y col. (eds.), Basic and Clinical Immunology
(4ª ed),
Lange Medical Publications, Los Altos, CA, y las referencias allí citadas. Para técnicas que implican la selección de librerías de anticuerpos en fagos o vectores similares, véase, por ejemplo, Huse y col. (1989), Science 246: 1275-1281.
Lange Medical Publications, Los Altos, CA, y las referencias allí citadas. Para técnicas que implican la selección de librerías de anticuerpos en fagos o vectores similares, véase, por ejemplo, Huse y col. (1989), Science 246: 1275-1281.
Las moléculas según la invención pueden ser
usadas en preparaciones farmacéuticas, especialmente para el
tratamiento y/o la prevención de trastornos relacionados con la
angiogénesis. En consecuencia, la invención se relaciona con un
péptido, polipéptido, proteína o anticuerpo según la invención para
uso como medicamento, así como con el uso de dichas moléculas en la
fabricación de un medicamento dirigido hacia una enfermedad o
trastorno relacionado con la angiogénesis. La invención se relaciona
también con una preparación farmacológica consistente en una
molécula según la invención junto con un vehículo farmacéuticamente
aceptable. Las moléculas usadas como medicamentos según la invención
pueden ser cualquiera de los péptidos, polipéptidos, proteínas o
anticuerpos antes descritos, así como con cualquier nueva substancia
identificada en un método de rastreo que las utiliza y como se ha
descrito anteriormente.
En consecuencia, el uso más preferido de las
presentes moléculas es en ensayos, donde las nuevas substancias son
rastreadas. Se pueden identificar compuestos que exhiben efectos
antiangiogénicos similares a la angiostatina y/o al kringle 5, pero
que son más pequeños, más eficientes y exhiben una vida media mayor
en un organismo humano o animal que la angiostatina. La menor vida
corta puede ser debida a una menor tendencia a degradarse por las
proteasas. Cuando se diseña un compuesto orgánico, se usa una
molécula según la invención como compuesto "principal". El
diseño de miméticos de compuestos farmacéuticamente activos
conocidos es una aproximación bien conocida al desarrollo de
productos farmacéuticos basados en dichos compuestos
"principales". Generalmente se usan el diseño, la síntesis y el
estudio de miméticos para evitar el rastreo aleatorio de un gran
número de moléculas para una propiedad de blanco.
Así, dichas nuevas moléculas son preferiblemente
usadas como medicamentos que pueden ser administrados a dosis mucho
menores que la angiostatina y que pueden ser administrados con menor
frecuencia, tal como, por ejemplo, una vez cada catorce días, que se
ha de comparar con la vida media de la angiostatina, que es
aproximadamente diez veces menor. En una realización particular, las
nuevas moléculas identificadas por los métodos de rastreo según la
invención son moléculas orgánicas de bajo peso molecular, en cuyo
caso se puede preparar una preparación farmacéutica de éstas para
ingestión oral, tal como en tabletas.
Las preparaciones farmacéuticas según la
invención pueden ser, sin embargo, preparadas para cualquier vía de
administración, por ejemplo, oral, intravenosa, cutánea o
subcutánea, nasal, intramuscular o intraperitoneal. La naturaleza
del vehículo o de otros ingredientes dependerá de la vía específica
de administración. (Se encuentra ejemplos de técnicas y protocolos
útiles en este contexto, entre otros, en Remington's Pharmaceutical
Sciences, 16ª edición, Osol, A. (ed.), 1980).
La dosificación de estos nuevos compuestos de
bajo peso molecular dependerá del estado o condición de la
enfermedad que se ha de tratar y de otros factores clínicos, tales
como el peso y la condición del humano o animal y la vía de
administración del compuesto. Para tratar a humanos o animales, se
pueden administrar entre aproximadamente 0,5 mg/kg de peso corporal
y 500 mg/kg de peso corporal del compuesto.
Los presentes compuestos y métodos son
ventajosamente utilizados en relación a todo tipo de trastornos y/o
enfermedades relacionados con la angiogénesis, tales como
condiciones tumorales, diabetes, artritis reumatoides e incluso
alguna enfermedad inflamatoria, tal como la psoriasis, las
inflamaciones crónicas del intestino, el asma, etc. También se
sugiere que pueden ser usados para tratar y curar, o prevenir, la
obesidad.
En una realización particular, las presentes
moléculas son usadas en terapia génica. Para una revisión de
procedimientos de terapia génica, véase, por ejemplo, Anderson,
Science (1992) 256: 808-813.
Otro uso ventajoso de la presente invención es
desarrollar métodos de regulación de la señalización del presente
receptor de angiostatina y/o kringle 5 en el organismo y, por lo
tanto, la invención se relaciona también con métodos de tratamiento
de un paciente humano o animal que sufre de una enfermedad o
trastorno relacionado con la angiogénesis, así como con métodos de
prevención de dichas condiciones.
A continuación, la invención será descrita con
más detalle en relación a los dibujos.
Todas las referencias en la presente descripción
y las anteriores son incorporadas en la presente solicitud.
Mediante ensayos de unión competitiva entre la
angiostatina y los factores angiogénicos, VEGF y bFGF, los presentes
inventores han mostrado que la angiostatina no afecta a la
interacción ligando-receptor de estas moléculas. Se
podría detectar el mismo nivel de unión en presencia o ausencia de
angiostatina no marcada. Así, se puede descartar que la angiostatina
actúe bloqueando la interacción de los factores angiogénicos con las
células endoteliales.
La unión directa de angiostatina y su precursor,
el plasminógeno, ha sido estudiada por ensayos de unión usando
proteínas yodadas y analizando su interacción con células
endoteliales microcapilares bovinas; véase la Figura 1.
En particular, se marcó la angiostatina o el
plasminógeno humano (dominios kringle 1-4) con yodo
125 por el método del yodógeno según el protocolo del fabricante
(Pierce Inc.). Se purificó entonces la proteína marcada en una
columna de sepharose G50 (Pharmacia Inc.). Se estimó la actividad
específica a 90.000 cpm/ng de proteína. Para los ensayos de unión,
se cultivaron células endoteliales de capilares bovinas hasta la
confluencia en placas de 12 pocillos. Se lavaron las células con PBS
que contenía 1 mg/ml de seroalbúmina bovina (BSA). Se incubaron
entonces las células con 10 ng/ml de angiostatina o plasminógeno
radiomarcados. Se compitió la unión con concentraciones crecientes
de ligando no marcado. Se incubaron las células sobre hielo durante
2 horas. Se lavaron entonces las células cinco veces con PBS + 1
mg/ml de BSA. Se lisaron las células con Triton X100 al 1% en PBS y
se midió la radiactividad en un contador gamma. Se calcularon la
constante de disociación y el número de receptores usando el
programa RBINDING (van Zoelen EJ, Anal. Biochem., 1 de Feb. de 1992,
200(2): 393-9).
La angiostatina conserva la actividad incluso
después de reducirse, lo que sugiere que el plegamiento
tridimensional no es vital para la unión y la actividad. Esto
favorece los procedimientos de rastreo, en los que se pueden
rastrear un gran número de clones aunque el replegamiento de la
proteína puede ser menos preciso.
Se empleó el sistema de dos híbridos de levadura
para rastrear moléculas que se unen a los dominios kringle
1-4 del plasminógeno. Esto se describe con más
detalle a continuación en relación a la figura 2. Se rastrearon
aproximadamente 2x10^{6} clones de una librería de ADNc de dos
híbridos de placenta humana a término (Stratagene). Se identificaron
los clones positivos de la siguiente forma:
- (1)
- El rastreo en condiciones selectivas (His-, Leu- y Trp-) generó 37 clones positivos en la cepa de levadura CG1945.
- (2)
- Siete de los 37 clones exhibía actividad \beta-galactosidasa tras incubación con ONPG (SIGMA) a 30ºC durante 2 h.
- (3)
- El ADN de las siete colonias que contenían una alta actividad \beta-gal fue purificado y retransfectado en la cepa de levadura Y190. Tres de las siete colonias retuvieron la actividad en la nueva cepa de levadura. El análisis de secuenciación de estos clones reveló que derivaban del mismo gen.
- (4)
- Se valoró el crecimiento en presencia de 3-aminotriazol 50 mM (Fig. 3), así como la actividad \beta-gal (véase la tabla siguiente), en clones Big 3 y se comparó con controles positivos y negativos.
| Dominio de unión | Dominio de activación | Actividad \beta-Gal |
| Angiostatina+Dominio de unión | Big3 - Dominio de activación | 15 u |
| Angiostatina+Dominio de unión | Dominio de activación solo | <0,04 u |
| Domino de unión solo | Big3 - Dominio de activación | 0,07 u |
| p53+Dominio de unión | Big3 - Dominio de activación | 0,05 u |
| p53+Dominio de unión | SV40LT - Dominio de activación | 90 u |
Después de aislar el clon big 3 de una librería
de dos híbridos de levadura de placenta (Stratagene, Inc.),
secuenciamos directamente la inserción de ADNc del vector del
dominio de activación pGAD con cebadores de secuenciación GAL4 AD.
Se volvió a clonar la inserción de ADNc en el vector pUC18 usando
sitios EcoR1 de adaptadores y se repitió la secuenciación usando
cebadores universales e inversos. Se analizaron las secuencias en un
secuenciador automatizado ALF (Pharmacia). En la SEC. ID. Nº 4, se
muestra la secuencia de Big 3.
Se ha expresado la secuencia de Big3 en E.
coli como proteína de fusión con el dominio de la glutatión
S-transferasa (GST) de Schistosoma
japonicum.
Se obtuvo el fragmento Big3 (429 pb) por
amplificación por PCR usando plásmido pUC18-Big3
como plantilla. Las secuencias cebadoras eran:
BamHI-NH_{2} 5'-TAC GGA
TCC GAA TCG AAC AAA ACT GCA GCT G 3' (SEC. ID. Nº 5).
XhoI-COOH 5' ATA CTC GAG TCA TGG AGC TGG
AGT TGG AGC CA 3' (SEC. ID. Nº 6).
El protocolo usado de ciclación fue:
\newpage
| 94ºC 3 min., 60ºC 1 min., 72ºC 1 min. | 1 ciclo |
| 94ºC 30 seg., 60ºC 1 min., 72ºC 2 min. | 30 ciclos |
| 94ºC 30 seg., 60ºC 1 min., 72ºC 5 min. | 1 ciclo |
Tag polimerasa: ADN polimerasa Pfu nativa
(Stratagene).
Se digirió el fragmento de PCR con BamHI y
XhoI, se purificó y se ligó al plásmido
PGEX-6P-2 (Pharmacia Biotech)
digerido con las mismas enzimas de restricción. Se usó la mezcla de
ligación para transformar células XL1-Blue
(Stratagene). Se verificaron los plásmidos recombinantes por
análisis de restricción y secuenciación automatizada.
Se transformaron células DH5\alpha (Clontech)
con un clon verificado, denominado pGEX-Big3, y se
indujeron durante 6 horas a temperatura ambiente con IPTG 0,1
mM.
Se centrifugó el caldo de la fermentación a 4.000
x rpm durante 15 minutos y se resuspendió la pella celular en un 10%
p/v de tampón de lisis (TRIS-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl
100 mM, DTT 20 mM, EDTA 1 mM, mezcla de inhibidores de proteasas) y
se lisó por sonicación. Se centrifugó la totalidad del lisado a
15.000 x g durante 20 minutos a 4ºC. Se aplicó el sobrenadante
clarificado a una columna de Glutatión-Sepharose (1
ml para 20 ml de lisado) preequilibrada con tampón de lisis. Se lavó
la resina con 10 volúmenes de columna (VC) de tampón de lisis y se
eluyó la proteína de fusión con 3 VC de tampón de elución
(TRIS-HCl 100 mM, pH 8,0, glutatión reducido 20
mM).
Se puede escindir la proteína
GST-Big3 por incubación de la proteína de fusión
unida a glutatión-Sepharose con 20 \mul/ml de
resina de proteasa PreScission en tampón PS que contiene
TRIS-HCl 50 mM, pH 7,0, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, DTT
1 mM, PMSF 1 mM.
Las proteínas eluidas se comportan como un solo
pico en HPLC de fase invertida (gradiente 10-90% de
acetonitrilo en agua más un 0,1% de TFA), muestran el tamaño
molecular esperado por análisis de masa (electropulverización) y la
secuencia NH_{2} correcta. En SDS-PAGE, aparece un
contaminante en el PM aparente de 80 kD; se demostró que era DnaK,
un acompañante bacteriano, que puede ser eliminado por cromatografía
de intercambio iónico sobre una columna HITrapQ.
Los rendimientos obtenidos de 1 litro de
fermentación son de aproximadamente 10 mg de proteína de fusión
GST-Big3 y aproximadamente 3 mg del Big3
escindido.
A continuación, se describe el protocolo usado
para la unión.
Se inoculó una colonia de transformante
pGEX-Big3 en 10 ml de medio LB más ampicilina y se
cultivó durante la noche a 37ºC.
Se diluyó el cultivo de la noche a 1:10 en 100 ml
de medio fresco y, después de 1 hora de incubación a 37ºC, se añadió
IPTG a una concentración final de 0,5 mM y se continuó incubando
durante 3 a 7 horas.
Se centrifugó entonces el cultivo a 5.000 g
durante 10 minutos, se resuspendió la pella en 3-5
ml de PBS helado y se lisaron las células por sonicación. Se añadió
Triton X100 a una concentración final del 0,5-1% y
se centrifugaron alícuotas de 1,5 ml de la suspensión a 14.000 rpm
durante 10 minutos.
Se añadieron 0,1-0,3 ml de
suspensión al 50% de glutatión-perlas de agarosa al
sobrenadante y se mezcló durante 3-5 horas a 4ºC. Se
recogieron entonces las perlas por centrifugación y se lavaron 5
veces con PBS helado y 2 veces con solución de unión (S.U.),
consistente en Tris 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 0,5 mM, DTT 1
mM, PMSF 1 mM.
Ensayo de unión: Se mezclaron 0,7 ml de S.U.,
suero de ternera al 0,1% y 500 ng de angiostatina con
30-50 \mul de una suspensión al 50% de
Big3-glutatión inmovilizado-perlas
de agarosa durante 1-3 horas a 4ºC.
Se lavó la resina 5-7 veces con
S.U. helada y se usó luego para el análisis de Western blot usando
anticuerpos anti-plasminógeno humano (Dako
Inc.).
La Figura 4 muestra cómo se une el Big 3
recombinante purificado a la angiostatina in vitro. Es
interesante el hecho de que también se pudo detectar la unión del
plasminógeno, pero sólo tras reducción de los enlaces disulfuro
tratándolo con DTT.
La Figura 5 ilustra el esquema para la clonación
de la secuencia de longitud completa de ABP-1. Se
clonó todo el gen por rastreo de una librería de fagos de ADNc de
placenta con una sonda Blg3 (eliminando las secuencias repetitivas)
junto con una PCR RACE 5' (Gibco) usando ARNm de células
endoteliales de cordón umbilical humano. Se describe la secuencia
completa del clon de ADNc en la SEC. ID. Nº 1, mientras que se
muestra la proteína codificada en la SEC. ID. Nº 2. Los detalles del
protocolo experimental son los siguientes.
Se rastrearon 10 millones de clones de una
librería de fago lambda de placenta (Stratagene, Inc.) usando un
fragmento Hinfl de Big 3 como sonda. Se llevaron a cabo los
procedimientos de aislamiento del ADN y de Southern blot según
protocolos establecidos (Sambrook y col., 1989). Aislamos los clones
(7-1, 7-2, 8-2,
9-3, 9-5) con secuencias que se
solapan con Big3. Se usó la secuencia 5' del clon
7-2 para diseñar Cebadores Específicos de Genes
("GSP") para la PCR RACE 5' (Gibco Life Technologies, Inc.). Se
usó el ARNm aislado de células endoteliales de cordón umbilical
humano para identificar las secuencias 5'.
Cebadores usados para la primera PCR RACE:
| Cebadores: | GSP1 - (5' a 3') | GCTGACAGTTGCCCTGACGCTGCT |
| (SEC. ID. Nº 10) | ||
| GSP2 - (5' a 3') | CGGAGACGGTGCTCTAGCTGCTCA | |
| (SEC. ID. Nº 11) | ||
| GSP3 - (5' a 3') | TCCTTCCAACTCTTGCCTCAAGTTCCG | |
| (SEC. ID. Nº 12) |
Se han usado procedimientos RACE para la
amplificación y clonación de secuencias desconocidas entre el GSP2 y
el GSP3 y el extremo 5' del ARNm de ABP-1. Se usó
entonces esta secuencia para diseñar nuevos cebadores para el
siguiente grupo de PCR RACE:
| Cebadores: | GSP1 - (5' a 3') | GGTGGCAGCGGACAGGCAGGATAC |
| (SEC. ID. Nº 13) | ||
| GSP2 - | GAGGCGGAGAGAACTAAGAGAAGA | |
| (SEC. ID. Nº 14) | ||
| GSP3 - | GAGCGGAGATGGAGGAGTAATTCA | |
| (SEC. ID. Nº 15) |
Se aislaron clones A2-2,
A2-1 y A1-C con secuencias
solapantes. Se usó la secuencia A2-1 como sonda para
el segundo rastreo de la librería de fagos de placenta. De este
rastreo, se aislaron otros 2 clones (7-10 y
6-5). Como muestra la Figura 6, de los seis posibles
marcos, el único que producía un marco abierto de lectura completo
es el marco 2, que da una proteína putativa de 675 residuos de
aminoácido.
Se sondaron blots de ARNm de tejido adulto y
fetal humano múltiple obtenido comercialmente (Clontech, Inc.)
(#7760-1 y #7756-1) (2 mg de
ARNm/pocillo) para ABP-1. Se hibridaron los blots
con la solución de hibridación ExpressHyb (Clontech, Inc.) según el
protocolo del fabricante. Se sondaron los blots con el fragmento
5'Pts/ de 7-2. La Figura 7 muestra los resultados
del experimento; los tamaños son de 9,5 y 7,5 kb.
Se detectó también ABP-1 en
células endoteliales de cordón umbilical humano, de aorta bovina y
de microcapilares bovinos. Se detectó poca o ninguna expresión en
una línea celular endotelial inmortalizada, EaHy926, y en
fibroblastos fetales humanos. Ninguna de las líneas celulares
respondió a la angiostatina o exhibió unión alguna de angiostatina
marcada con FITC.
El ensayo de 5'-nucleasa (ensayo
TaqMan) usa una sonda de hibridación oligonucleotídica no extensible
(Sonda TaqMan). La sonda TaqMan consiste en un oligonucleótido con
un tinte informador 5' y un tinte apagador 3'. Cuando la sonda está
intacta, la proximidad del tinte informador al tinte apagador da
lugar a supresión de la fluorescencia del informador, primariamente
por una transferencia de energía de tipo Foster. Durante la PCR, se
hibridan cebadores hacia delante e inversos a una secuencia
específica del ADN diana. La sonda TaqMan se hibrida con una
secuencia diana en el producto de la PCR. La polimerasa Taq escinde
la sonda TaqMan con su actividad nucleasa 5'-3'. El
tinte informador y el tinte apagador se separan tras la escisión,
dando como resultado una mayor fluorescencia del informador.
Se realizó el aislamiento y la purificación del
ARN total de los tejidos y células indicados a continuación usando
el sistema de aislamiento de ARN Ultraspec (Biotex).
Se llevó a cabo la reacción RT usando el Reactivo
de Transcripción Inversa TaqMan (PE Applied Biosystems) con
hexámeros aleatorios como cebadores de RT. El volumen de reacción
para la etapa de Transcripción Inversa era de 100 \mul y la
cantidad de ARN total era de 1 \mug por muestra. Se realizó la RT
usando el siguiente parámetro de ciclación:
10 minutos a 25ºC
45 minutos a 48ºC
5 minutos a 95ºC
Después de una optimización de la concentración
de cebadores, se llevó a cabo la reacción de PCR sobre 10 ng del
ADNc usando la Mezcla Maestra de PCR Universal TaqMan (PE Applied
Biosystems) y los siguientes oligonucleótidos:
- \bullet
- Cebador hacia delante ABP-1: 5' GTTTGACCTGCAATCCAGACAA 3' (SEC. ID. Nº 7). Concentración final 300 nM.
- \bullet
- Cebador inverso ABP-1: 5' CCCAGGATCTGAATGGGAGTT 3' (SEC. ID. Nº 8). Concentración final 900 nm.
- \bullet
- Sonda TaqMan ABP-1:
- 5' (tinte FAM)-CAGATGGGCCTGTGTTCCACTCCAA-(tinte TAMRA) 3' (SEC. ID. Nº 9). Concentración final de la sonda 200 nM.
- El protocolo de ciclación fue:
- 2 minutos a 50ºC, 10 minutos a 95ºC, 1 ciclo 15 segundos a 95ºC, 1 minuto a 60ºC, 40 ciclos
El método comparativo usa una fórmula aritmética
para conseguir el resultado para la cuantificación relativa sin
necesidad de curva estándar.
El resultado, representado en la Figura 8, indica
cuántas veces la muestra X expresa el objetivo en relación al
Calibrador, que es la muestra que exhibe el menor nivel de expresión
del objetivo. En este experimento, se eligió la muestra EaHY936 como
calibrador.
Para la inmunización de conejos blancos de Nueva
Zelanda, se disolvieron 100 microgramos de proteína de fusión
Big3-GST en 1 ml de solución salina tamponada con
fosfatos (PBS) y se homogeneizó con 1 ml de adyuvante completo de
Freund (Gibco). Se inyectó la emulsión resultante subcutáneamente el
día 0 y se repitió este tratamiento los días 15 y 28. Se recogió
sangre de los conejos el día 35, se dejó que coagulara durante la
noche a 4ºC y se guardó el suero resultante a -20ºC.
Para la purificación de anticuerpos específicos,
se produjo ligando inmovilizado con resina como sigue: Se diluyó
polipéptido Big3 en bicarbonato de sodio 0,1M, NaCl 0,5M, pH 8,3, a
una concentración de 5 mg/ml en un volumen total de 2 ml. Éste
reaccionó durante dos horas a temperatura ambiente con 2 ml de
resina de Sepharose activada con bromuro de cianógeno
CL-48 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Tras la
reacción, se lavó la resina tres veces en 10 volúmenes de Tris 100
mM, NaCl 500 mM, pH 7,5. Se incubó el suero inmune con la resina de
afinidad durante dos horas a 4ºC, después de lo cual se lavó la
resina en una columna de cromatografía de vidrio de 5 ml
(Bio-Rad, Richmond CA) con 25 volúmenes de Tris 100
mM, NaCl 500 mM, pH 7,5. Se eluyeron los anticuerpos específicos en
alícuotas de 1 ml con Glicina 100 mM/HCl, pH 2,8. La elución del
anticuerpo fue seguida de monitorización de la densidad óptica a 280
nM (DO_{280}) y se juntaron las fracciones con una DO_{280} de
más de 1 y se dializaron (cassettes
Slide-A-lyzer, Pierce) durante 38
horas a 4ºC contra 1 litro de PBS, con tres cambios de tampón.
Las Figuras 9A y 9B muestran datos de la unión de
angiostatina marcada con FITC a células HeLa y EaHy926 transfectadas
con ABP-1 y transfectadas con el control de vector.
En particular, la Figura 9A muestra la localización celular de
ABP-1 fusionada a proteína fluorescente verde
("GFP") en células transitoriamente transfectadas. La proteína
puede ser detectada en el retículo endoplásmico y la membrana
celular. DABP-1 contiene una deleción de 500 pb en
extremo 5' del gen, que altera la localización previamente descrita
de ABP-1.
La Figura 9B muestra células HeLa transfectadas
con ABP-1-GFP. La incubación con 2,5
mg de angiostatina durante 60 minutos a 0ºC y la posterior
incubación durante 15 minutos a 37ºC induce la internalización de
ABP-1-GFP.
La Figura 9C muestra la unión de angiostatina a
ABP-1. Hemos mostrado que la angiostatina marcada
con isotiocianato de fluoresceína (FITC) se une específicamente a
células endoteliales (datos no mostrados). Hemos transfectado
células HeLa con la construcción de expresión de
ABP-1 o con el control de vector (p RC/CMV,
Invitrogen, Inc.). Incubamos células HeLa vivas con angiostatina
marcada con FITC (10 \mug/ml) en DMEM + 10% de suero de ternera
fetal a 0ºC durante 60 minutos. Se incubaron entonces las células a
37ºC durante 15 minutos para agregar la angiostatina unida. Se
analizó la unión con un microscopio fluorescente. Se detectó la
unión de angiostatina en células transfectadas con
ABP-1, pero no en el control de vector.
La Figura 9D muestra la inmunotinción de
ABP-1 en células endoteliales de cordón umbilical
humano ("HUVE") junto con la tinción frente
F-actina con faloidina marcada con rodamina.
Se fijaron células HUVE en formaldehído al 4%, se
lavaron en PBS y se prebloquearon en suero de caballo al 5%. Se
retiró la solución bloqueante y se substituyó por anticuerpos
policlonales de conejo contra el dominio de unión a angiostatina
Big3 diluidos en suero de caballo al 5%. Se visualizó la unión
positiva con un anticuerpo secundario marcado fluorescentemente
(Dako, Inc.). Se tiñó faloidina conjugada con rodamina (Molecular
Probes, Inc.) simultáneamente con el anticuerpo secundario (tras la
permeabilización con Triton X100 al 1% durante 1 minuto). Se usaron
anticuerpos policlonales de conejo contra proteína fluorescente
verde como control negativo. Además, no se pudo detectar tinción
positiva en fibroblastos humanos. Como puede verse en la Fig. 9D,
ABP-1 se localiza en las adhesiones focales y los
rizos de membrana (flechas).
Se plaquearon células Huve hasta la
subconfluencia en placas de Petri de 5 cm. Se añadió angiostatina a
2,5 mg/ml en diferentes puntos de tiempo al día siguiente. Se
cosecharon todas las placas, incluidos los controles,
simultáneamente. Se lavaron las células en PBS helado y se incubaron
en 1 ml de tampón de lisis. Se transfirieron las células a un tubo
Eppendorf y se centrifugaron a 14.000 rpm durante 5 minutos a 4ºC.
Se transfirió el sobrenadante a otro tubo Eppendorf y se añadieron 2
\mug de anticuerpos policlonales de conejo Big 3. Se incubaron las
muestras durante 60 minutos a 4ºC y posteriormente se añadieron 50
\mul de una suspensión de proteína A-Sepharose
(Pharmacia, Inc.) y se incubaron durante otros 60 minutos en una
incubadora rotatoria. Se recogieron los inmunoprecipitados por
centrifugación breve y se lavaron dos veces en tampón de lisis, un
vez en tampón de lavado y una vez en tampón de kinasa. Se eliminó el
tampón residual con una jeringa y se añadieron 25 \mul de tampón
de kinasa a cada tubo junto con 1 \muCi de
gamma-ATP (Amersham, Inc.). Se incubaron las
muestras a T.A. durante 20 minutos. Se detuvo la reacción añadiendo
tampón de muestra SDS-PAGE 2X. Se hirvieron las
muestras en condiciones desnaturalizantes y se analizaron a
continuación por SDS-PAGE.
Los datos ilustrados en la Figura 10 muestran que
la adición de angiostatina da una regulación decreciente de la
actividad kinasa asociada a ABP-1 en 30 minutos.
Ésta es una prueba directa de que la angiostatina afecta a las rutas
de señalización que están mediadas por ABP-1.
Los datos ilustrados en la Figura 11 muestran que
la adición de 2,5 \mug/ml de angiostatina da una regulación
creciente de la actividad FAK en 1 hora tras la adición.
Se plaquearon células EaHy926 hasta la
subconfluencia en placas de Petri de 5 cm. Se añadió angiostatina a
2,5 \mug/ml en diferentes puntos temporales al día siguiente.
Todas las placas, incluidos los controles, fueron cosechadas
simultáneamente. Se lavaron las células en PBS helado y se incubaron
en 1 ml de tampón de lisis. Se transfirieron las células a un tubo
Eppendorf y se centrifugaron a 14.000 rpm durante 5 minutos a 4ºC.
Se transfirió el sobrenadante a otro tubo Eppendorf y se añadió 1
\mug de anticuerpo monoclonal FAK (Transduction Lab., Inc.). Se
incubaron las muestras durante 60 minutos a 4ºC y se añadió a
continuación una suspensión de IgG de conejo
anti-ratón + 50 \mul de proteína
A-Sepharose (Pharmacia, Inc.) y se incubó durante
otros 60 minutos en un evaporador rotatorio. Se recogieron los
inmunoprecipitados por breve centrifugación y se lavaron dos veces
en tampón de lisis, una vez en tampón de lavado y una vez en tampón
de kinasa. Se eliminó el tampón residual con una jeringa y se
añadieron 25 \mul de tampón de kinasa a cada tubo junto con 1
\muCi de \gamma-ATP (Amersham, Inc.). Se
incubaron las muestras a T.A. durante 20 minutos. Se detuvo la
reacción añadiendo tampón de muestra SDS-PAGE 2X. Se
hirvieron las muestras en condiciones desnaturalizantes y se
analizaron a continuación por SDS-PAGE.
Como puede verse en la Fig. 11, la adición de
angiostatina da una regulación creciente de la actividad FAK en 1
hora. Habría que hacer notar que las células EaHy926 no expresan
ABP-1, según demuestra el análisis de transcriptasa
inversa-PCR.
<110> Pharmacia & Upjohn
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Moléculas relacionadas con la
angiogénesis
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<130> pctpha 1856
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> SE9804372-2
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
17-12-1998
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6483
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (797)..(2824)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<212> PRT
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<211> 675
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<220>
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<221> VARIANT
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<222> ()..)
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<223> Residuo 135 = Asn, Ser o Asp
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<220>
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<221> VARIANT
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<222> ()..(150)
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<223> Residuos 148-150 =
Glu-Leu-Ala o
Thr-Thr-Pro
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<212> ADN
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<220>
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<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador oligonucleotídico para reacción de PCR
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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cebador oligonucleotídico para reacción de PCR
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador oligonucleotídico para reacción de PCR
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<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador oligonucleotídico para reacción de PCR
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<223> Descripción de secuencia artificial:
cebador oligonucleotídico para reacción de PCR
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<223> Descripción de secuencia artificial:
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cebador oligonucleotídico para reacción de PCR RACE
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cebador oligonucleotídico para reacción de PCR RACE
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cebador oligonucleotídico para reacción de PCR RACE
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\hfill24
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cebador oligonucleotídico para reacción de PCR RACE
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<400> 15
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\hskip-.1em\dddseqskipgagcggagat ggaggagtaa ttca
\hfill24
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Claims (27)
1. Una proteína-1 de unión a
angiostatina (ABP-1) de mamífero aislada capaz de
unirse a los dominios kringle 1 a 4 y/ó 5 del plasminógeno y que
comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de
secuencia superior a al menos el 80% con las SEC. ID. Nº 2, 3 ó
4.
2. La proteína de la reivindicación 1, donde la
proteína es una proteína humana.
3. La proteína de la reivindicación 1 ó 2, donde
la secuencia de aminoácidos tiene al menos un 90% de homología de
secuencia con las SEC. ID. Nº 2, 3 ó 4.
4. La proteína de la reivindicación 1 ó 2, donde
la secuencia de aminoácidos tiene al menos un 95% de homología de
secuencia con las SEC. ID. Nº 2, 3 ó 4.
5. La proteína de la reivindicación 1 ó 2, donde
la secuencia de aminoácidos tiene al menos un 98% de homología de
secuencia con las SEC. ID. Nº 2, 3 ó 4.
6. La proteína de la reivindicación 5, que
comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. Nº 2.
7. La proteína de la reivindicación 5, que
comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. Nº 3, donde el
residuo de aminoácido en la posición 135 es Asn, Ser o Asp y los
tres residuos de aminoácido en las posiciones 148 a 150 son el
tripéptido Glu-Leu-Ala o el
tripéptido Thr-Trp-Pro.
8. La proteína de la reivindicación 5, que
comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. Nº 4.
9. Una molécula de ácido nucleico aislada
consistente en una secuencia que codifica para una proteína o
péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
10. La molécula de ácido nucleico aislada de la
reivindicación 9, que codifica para la proteína de la reivindicación
6.
11. La molécula de ácido nucleico aislada de la
reivindicación 9, que codifica para la proteína de la reivindicación
7.
12. La molécula de ácido nucleico aislada de la
reivindicación 9, que codifica para la proteína de la reivindicación
8.
13. La molécula de ácido nucleico aislada de
cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, que incluye al menos la
secuencia desde el nucleótido 2177 hasta el nucleótido 2608 de la
SEC. ID. Nº 1.
14. La molécula de ácido nucleico aislada de la
reivindicación 9, que incluye la secuencia desde el nucleótido 797
hasta el nucleótido 2824 de la SEC. ID. Nº 1.
15. La molécula de ácido nucleico aislada de la
reivindicación 14, que consiste en la secuencia de la SEC. ID. Nº
1.
16. Un vector que incluye un ácido nucleico según
cualquiera de las reivindicaciones 9 a 15.
17. El vector de la reivindicación 16, que es un
plásmido.
18. El vector de la reivindicación 16, que es un
virus.
19. Una célula recombinante transformada o
transfectada con el vector de cualquiera de las reivindicaciones
16-18.
20. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, que
se une específicamente a una proteína según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8.
21. Un anticuerpo según la reivindicación 20, que
es un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo.
22. El anticuerpo de cualquiera de las
reivindicaciones 20 ó 21 para uso como medicamento.
23. Una célula recombinante que expresa el
anticuerpo según las reivindicaciones 20 ó 21.
24. Un método de rastreo para identificar un
compuesto capaz de interaccionar con una proteína según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 8.
25. Las proteínas, moléculas, anticuerpos o
fragmentos de anticuerpos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a
8, 9 a 15 o 20 a 21 para uso como medicamento.
26. Uso de las proteínas, moléculas, anticuerpos
o fragmentos de anticuerpos de cualquiera de las reivindicaciones 1
a 8, 9 a 15 o 20 a 21 en la fabricación de un medicamento dirigido a
una enfermedad o trastorno relacionado con la angiogénesis.
27. Una preparación farmacéutica que incluye una
proteína, una molécula, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo
de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, 9 a 15 o 20 a 21 junto
con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
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