KR20010052887A

KR20010052887A - 안지오스타틴-결합 단백질

Info

Publication number: KR20010052887A
Application number: KR1020007014231A
Authority: KR
Inventors: 홀름그렌라르스; 트로야노프스키보리스
Original assignee: 존 헤덴스트룀; 파마시아 에이비
Priority date: 1998-06-15
Filing date: 1999-06-11
Publication date: 2001-06-25
Also published as: TR200003695T2; CY1105675T1; PL344979A1; ATE295417T1; ES2242400T3; BR9911223A; AU4513499A; CN1170931C; CN1305527A; AU2004201999B2; DE69925271D1; AU769933B2; CN1626552A; EA200100037A1; DE69925271T2; EP1088069B1; IL139873A; AU2004201999A1; ID28136A; IL139873A0

Abstract

본 발명은 안지오스타틴 수용체로서 작용할 수 있는 단백질의 서열 및 이의 핵산 서열을 제공한다. 또한, 본 발명은 스크리닝 방법에서의 이의 용도에 관한 것이며, 이에 의해 안지오스타틴과 동일하게 유리한 항-맥관형성 특성을 나타내는 신규한 물질이 개발된다.

Description

안지오스타틴-결합 단백질{Angiostatin-binding protein}

포유동물 신체의 거의 모든 조직은 사람 모발보다 더 가는, 미세 망상조직의 매우 가는 혈관으로 이루어져 있다. 통상적으로, 혈관을 덮고 있는 내피 세포의 분열이 느리기 때문에, 이들 혈관의 수도 크기도 실제로 수년에 이르기까지 증가하지 않는다. 예를 들어, 상처 치유 및 월경 동안, 혈관이 급속히 성장하는 경우는 예외이다. 그러나, 이는 제한된 기간 동안이고, 세포 분열은 이후 중지한다.

현존하는 혈관으로부터의 새로운 혈관의 생성을 맥관형성으로 칭한다. 맥관형성은 암과 종양의 형성뿐만 아니라, 기타 질환, 예를 들어, 당뇨병성 망막증, 류마티스성 관절염 및 특정 염증성 질환과 관련된다. 따라서, 맥관형성 과정을 예방하고 억제하는 방법을 발견하기 위해 상당한 연구 노력을 전세계적으로 기울이고 있다. 이것이 가능할 경우, 종양 성장을 제어할 수 있으며, 위에서 언급한 질환과 관련하여 유용한 요법을 개발할 수 있다.

종양이 수 mm³의 매스 이상의 팽창에 대해 혈관의 새로운 형성에 따라 좌우됨을 보여주는 근거가 다수 존재한다. 맥관형성은 종양 세포에 의해 분비되는 인자에 의해 유발된다. 종양은 방출된 단백질분해 활성에 의해 항-맥관형성 활성을 나타내는 펩타이드 단편을 생성시킨다는 것이 최근 밝혀졌다. 일례는 플라스미노겐의 단편인 분자 안지오스타틴이다.

플라스미노겐은, 활성화될 경우에, 혈액의 응고와 관련된 효소인 플라스민 또는 피브리노라이신을 형성하는 혈장내 물질이다. 이들 내인성 단백질의 일부, 보다 구체적으로는 처음 4개의 크링글 도메인이 내피 세포의 분열을 방지할 수 있음을 밝혀내었다(Judah Folkman et al., Harvard Medical School, Boston). 이러한 부분의 플라스미노겐은 안지오스타틴을 나타내며, 당해 분야의 상당한 연구가 상기 분자에 집중되고 있다. 선행 기술은, 안지오스타틴이 시험관내에서 내피 세포를 특이적으로 억제하고 생체내에서 맥관형성을 차단함을 제시하였다. 안지오스타틴의 피하 주사에 의한 전신 치료는 SCID 마우스내의 광범위한 종양에서 생체내 잠복상태를 유도한다[참고문헌: O'Reilly et al., Nature Med., vol. 2. p. 689, 1996]. 이들 동물에서는 수개월간의 치료 후에도 검출가능한 독성은 전혀 검출되지 않았다. 안지오스타틴은 2가지 수준의 특이성을 나타낸다: 즉, 이는 시험관내에서 내피 세포에서의 아폽토시스(apoptosis)를 특이적으로 유도하고[참고문헌: Claesson-Welsh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. vol. 95, p. 5579, 1998], 생체내에서 맥관형성이 진행 중인 내피 세포에만 영향을 미친다. 확립된 맥관내에 있는 세포에는 네가티브한 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.

또한, 안지오스타틴은 특히 내인성 물질이기 때문에, 특정의 유리한 특성을 나타낸다. 그러나, 의학적 목적을 위한 가능한 용도와 관련된 불이익을 무시할 수는 없다. 시간당 계산될 수 있는 이의 반감기가 매우 짧아, 이의 빈번한 투여를 필요로 한다. 이제까지는, 이의 효능은 다소 낮은 것으로 알려져, 이러한 사실은이의 다량의 복용량의 사용을 필요로 한다. 상기 2가지 불이익 자체가 약제로서 사용할 보다 소형이고/이거나 보다 효능있는 대체 분자의 발견에 대해 추가로 연구하도록 하는 강한 동기이다.

발명의 요약

본 발명은 항-맥관형성 생물학적 활성을 특징으로 하는, 플라스미노겐의 단편, 바람직하게는 이의 처음 4개의 크링글 도메인(K1-K4)을 결합시키는 이의 능력에 의해 정의된 "ABP-1"로 명명되는 사람 단백질을 제공함으로써 위에서 정의된 바와 같은 안지오스타틴과 관련된 문제점을 해소한다.

ABP-1은 서열 2에 제시된 바와 실질적으로 유사한 아미노산 서열로 이루어져 있다. ABP-1의 변이체 및 단편이 본 발명에 포함된다.

또한, 다른 종, 특히 다른 포유동물내의 ABP-1의 동족체가 본 발명에 포함된다.

추가 국면에서, 본 발명은 ABP-1, 또는 이의 변이체, 단편 및 동족체를 포함한, ABP-1과 실질적으로 유사한 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적은, 예를 들어, 조직 및 세포내에서의 ABP-1 생합성을 검출하고 측정하기 위해, 연구 수단으로서 사용하고, 진단 방법에서 사용될 수 있는, 서열 1로부터 유래된 서열을 갖는 핵산 프로브를 제공하는 것이다.

따라서, 본 발명의 목적은 조직 및 세포내에서의 ABP-1 또는 이의 변이체 및 단편의 존재 및 양을 검출하기 위한 진단 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 ABP-1 또는 이의 변이체 및 단편을 상호작용시킬 수 있는 화합물을 동정하기 위한 스크리닝 방법을 포함한다. 당해 스크리닝 방법은 당해 분야의 숙련가에게 익히 공지된 구성일 수 있다.

본 발명의 추가 목적은 상기 스크리닝 방법을 사용하여 동정되고, ABP-1 또는 이의 변이체 및 단편의 생물학적 활성을 조절할 수 있는 화합물을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가 목적은 상기 스크리닝 방법을 사용하여 동정된 화합물을 활성 성분으로서 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가 목적은 ABP-1 또는 이의 변이체내에 존재하는 에피토프에 대해 지시된 항체, 및 상기 항체를 생성시키는 세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 추가 목적은 ABP-1 또는 이의 변이체 및 단편의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 추가 목적은 상기 벡터를 함유하는 세포를 제공하는 것이다.

정의

본 명세서에서, 하기 용어는 아래에 정의된 의미로 사용된다.

본 명세서에서 사용된 용어 "맥관형성"은 조직 또는 기관으로의 새로운 혈관의 생성을 의미한다. 위에서 언급한 바와 같이, 정상 생리학적 상태하에서는, 사람 및 동물은 매우 특이적으로 제한된 상황에서만 맥관형성을 겪는다. 예를 들어, 맥관형성은 통상적으로 상처 치유, 태와 배의 발육 및 황체와 태반의 형성시 관찰된다.

용어 "내피"는 편평 내피 세포, 상기 계열 장막강, 림프관 및 혈관의 박층을 의미한다. 용어 "내피 억제 활성"은 내피 모세혈관 내피 세포의 성장을 억제하는 능력을 의미한다.

용어 "맥관형성 관련 단백질"은 맥관형성시 상호작용할 수 있는 단백질, 예를 들어, 항-맥관형성 물질을 결합시키는 수용체를 의미한다.

서열 2, 서열 3 및 서열 4의 아미노산 서열과 관련하여 사용되는 경우에, 용어 "실질적으로 유사함"은 서열 2, 서열 3 및 서열 4와 고도의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 의미한다. 고도의 상동성은 약 80% 이상의 아미노산 상동성, 바람직하게는 약 90% 이상의 아미노산 상동성, 보다 바람직하게는 약 95% 아미노산 상동성, 가장 바람직하게는 약 98% 이상의 아미노산 상동성을 의미한다.

용어 "특이적으로 하이브리드화함"은 서열이 DNA 또는 RNA의 복합체 혼합물(예를 들어, 전체 세포)내에 존재할 경우에 엄격한 조건하에 특정 뉴클레오타이드 서열에만 분자가 결합하거나, 이본쇄화하거나 하이브리드화하는 것을 의미한다. 용어 "엄격한 조건"은 프로브가 이의 표적 서열과는 하이브리드화할 수 있으나, 다른 서열과는 하이브리드화하지 않는 조건을 의미한다. 엄격한 조건은 서열-의존성이며, 상이한 환경에서는 상이할 수 있다. 보다 긴 서열은 특이적으로 보다 고온에서 하이브리드화한다. 일반적으로는, 엄격한 조건은 정의된 이온 강도 및 pH에서 특정 서열에 대한 열 융점(Tm)보다 약 5℃ 낮도록 선택된다. Tm은 평형에서 표적 서열에 상보적인 프로브 중 50%가 표적 서열과 하이브리드화하는 온도(정의된 이온 강도, pH 및 핵산 농도하에)이다(표적 서열은 일반적으로 과량으로 존재하기 때문에, Tm에서 프로브 중 50%가 평형상태에 존재한다). 전형적으로는, 엄격한 조건은 염 농도가 pH 7.0 내지 8.3에서 약 1.0M Na 이온 미만, 전형적으로는 약 0.01 내지 1.0M Na 이온(또는 기타 염)이고, 온도가 보다 짧은 프로브(예: 10 내지 50개 뉴클레오타이드)에 대해 약 30℃이고, 보다 긴 프로브에 대해 약 60℃ 이상인 조건일 수 있다. 염격한 조건은 포름아미드와 같은 탈안정화제의 첨가로 달성할 수도 있다.

본 발명은 맥관형성 분야, 보다 구체적으로는 항-맥관형성 물질을 개발할 수 있는 단백질 및 펩타이드와 같은 신규한 분자에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 물질을 개발하는 방법에 관한 것이다.

도 1은 시험관내에서의¹²⁵I-표지된 안지오스타틴 및 플라스미노겐의 소 미세모관 내피 세포에의 결합을 도시한다. 가로축 단위는 각각 냉 안지오스타틴 및 플라스미노겐의 배수 몰 과량을 나타낸다.

도 2는 안지오스타틴 결합 단백질을 분리하는 방법을 도시한다.

도 3은 선택적 조건하에서의 포지티브 효모 클론의 성장을 도시한다.

도 4는 각각 재조합 "Big3"의 안지오스타틴 및 플라스미노겐에의 결합을 나타낸다.

도 5는 "Big3" 상의 지도이다.

도 6은 본 발명에 따르는 안지오스타틴 수용체를 암호화하는 유전자의 오픈 리딩 프레임(프레임 2)을 도시한다. 기타 가능한 프레임은 어떠한 추정 단백질도 생산하지 않는다.

도 7은 태아 및 성체 mRNA와 내피 세포의 발현 패턴을 도시한다.

도 8은 상이한 조직내에서의 ABP-1 유전자 발현의 상대 정량화를 도시한다(보다 상세한 사항은 실험 부문 참조).

도 9A는 일시적으로 형질감염된 HeLa 세포내에서의 GFP-태그된 ABP-1 수용체의 세포성 국재화를 도시하고, 도 9B는 안지오스타틴과의 배양 후 GFP-표지된 ABP-1의 재조직화를 도시한다. 도 9C는 안지오스타틴의 ABP-1에의 결합을 도시한다(보다 상세한 사항은 실험 부문 참조). 도 9D는 사람 제대 내피(HUVE) 세포내에서의 ABP-1의 면역염색 및 로다민-표지된 팔로이딘을 사용한 F-액틴에 대한 염색을 도시한다. ABP-1은 병소 유착 및 막 주름에 위치한다(화살표).

도 10은 안지오스타틴의 첨가 후 ABP-1 관련된 키나제 활성의 하향 조절을 도시한다.

도 11은 ABP-1이 안지오스타틴-유도된 병소 유착 키나제 활성을 조절함을 입증하는 SDS-PAGE의 방사선사진이다.

본 발명은 플라스미노겐의 단편, 바람직하게는 N-말단 단편, 예를 들어, 크링글 도메인 1 내지 4 및/또는 크링글 5를 결합시킬 수 있는 분리된 사람 맥관형성-관련 단백질에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 단백질은 플라스미노겐 단편, 특히 안지오스타틴 및/또는 플라스미노겐의 크링글 5 도메인의 수용체로서 작용한다. 본 발명의 단백질은 생물학적 또는 화학적 방법(예를 들어, 재조합 유전자 발현 및 펩타이드 합성)에 의해 합성할 수 있다. 재조합 기술은 시험관내 방법, 예를 들어, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR), 리가제 연쇄 반응(LCR), 전사-기초 증폭 시스템(TAS) 또는 자가-유지 서열 복제 시스템(SSR)에 의한 유전자 클로닝 또는 증폭을 포함한다. 다양한 클로닝 및 시험관내 증폭 방법론은 당해 분야의 숙련가에게 익히 공지되어 있다. 상기 기술의 예는 문헌[참조: Berger 및 Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA(Berger)]에서 찾아볼 수 있다. 본 발명은 서열 2, 서열 3 및 서열 4에 제시된 것과 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 포함한다. 서열 2의 단백질 서열과 모든 입수가능한 데이터 베이스에 존재하는 서열과의 비교는 상기 유기체의 염색체 III의 중심 클러스터에 위치하는 추정 오픈 리딩 프레임에 의해 암호화된 캐노르합디티스 엘레간스(Caenorhabditis elegans)의 가정의 단백질과 23.7%의 상동성을 나타낸다[참고문헌: R. Wilson et al., Nature, vol. 368, 3 March 1994, p. 32-38]. 어떠한 기능도 이러한 가정의 단백질에 기인하지 않는다.

위에서 제공된 정의에 따라, 플라스미노겐의 단편을 결합시킬 수 있고, 서열 2, 서열 3 또는 서열 4에 약 80% 이상의 서열 상동성, 바람직하게는 약 90% 서열 상동성, 보다 바람직하게는 약 95% 서열 상동성, 가장 바람직하게는 약 98% 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있는 모든 폴리펩타이드가 본 발명에 포함되는 것으로 간주되는 것으로 이해된다. 이들 변이체 형태는, 예를 들어, 동일한 근원 유기체의 상이한 조직내에서 대체 스플라이싱 또는 분화 발현으로부터 발생할 수 있다. 변이체 형태는, 예를 들어, 아미노산 삽입, 결실 또는 치환에 의해 특성화될 수 있다. ABP-1의 바람직한 변이체 형태는 서열 3에 제시한다(하기 참조).

특히 바람직한 본 발명의 양태는 아래에 보다 상세히 기술되고 ABP-1의 안지오스타틴-결합 도메인(서열 4)을 포함하는, Big3으로 명명되는 ABP-1의 단편이다.

추가 양태에서, 본 발명은 서열 2 또는 이의 변이체 또는 단편의 약 5개 이상, 바람직하게는 약 10개 이상의 연속적인 아미노산 잔기를 포함하는 펩타이드를 제공한다. 그러나, 펩타이드의 가장 유리한 크기는 이의 계획된 차후 용도에 따라 달라질 것이며, 본 발명은 위에 기재된 아미노산 잔기의 수에 한정되지 않는다.

또한, 다른 종, 특히 다른 포유동물내의 ABP-1 및 Big3의 상동체가 본 발명에 포함된다. 용어 "상동체"는 상응하는 아미노산 서열 사이에 존재하는 상동성과는 관계없이 실질적으로 본 발명의 단백질과 동일한 생물학적 기능을 발휘하는 단백질을 의미한다.

또 다른 국면에서, 본 발명은 위에서 정의한 바와 같은 변이체, 단편 및 상동체를 포함하는, 본 발명의 단백질 및 펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, 핵산 분자는 서열 1의 서열을 갖는다. 당해 서열은 5'(뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 796) 및 3'(뉴클레오타이드 2825 내지 뉴클레오타이드 6463) 비해독 영역을 나타낸다. 또 다른 바람직한 양태에서, 핵산 분자는 서열 1의 뉴클레오타이드 797 내지 뉴클레오타이드 2824의 서열을 갖는다. 또 다른 바람직한 양태에서, 핵산 서열은 Big3으로 명명된 ABP-1 단편(서열 4에 제시)을 암호화하고, 이는 서열 1의 위치 2180 내지 위치 2608의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하고 서열 1의 뉴클레오타이드 서열과는 상이한 모든 뉴클레오타이드 서열 또는 유전자 암호의 축퇴에 의한 이의 단편은 본 발명의 일부로 간주된다. 서열화 분석으로 서열 1의 코돈 1199 내지 1201내에서의 가능한 다형체의 존재가 밝혀졌으며, 여기서, Asn, Ser 또는 Asp에 대한 코돈이 존재할 수 있고, 서열 1의 뉴클레오타이드 위치 1238 내지 1246에 상응하는 추가 영역은 트리펩타이드 Glu-Leu-Ala 또는 트리펩타이드 Thr-Trp-Pro를 암호화하는 것으로 밝혀졌다. ABP-1의 아미노산 서열내의 이들 변이는 본 발명의 또 다른 바람직한 단백질을 구성하는 서열 3에 제시한다. 또한, ABP-1의 상동체 또는 이의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 분자는 본 발명에 포함된다.

본 발명은 엄격한 조건하에 상기한 바와 같은 본 발명의 핵산 분자 중 하나와 특이적으로 하이브리드화할 수 있는 핵산을 추가로 포함한다.

본 발명에 따르는 핵산을 프로브로서 사용할 경우, 검출가능한 마커를 갖는 서열을 표지화시키는 것이 종종 바람직하다. 이러한 마커는 현미경, 광화학, 생화학, 면역화학, 전기, 광학 또는 화학적 수단에 의해 검출가능한 조성물을 포함할 수 있다. 당해 마커는 당해 분야의 숙련가에게 익히 공지된 다수의 방법에 의해 혼입할 수 있다. 이러한 마커를 검출하는 방법 또한 당해 분야에 익히 공지되어 있으며, 문헌에 기술되어 있다. 프로브는, 예를 들어, 조직 및 세포내에서의 ABP-1 생합성을 검출하고 측정하는 진단학적 응용에서 유용한 적용성을 제공한다.

또 다른 국면에서, 본 발명은, 안지오스타틴 및/또는 크링글 5와 동일한 특성을 나타내는 분자를 선별하는 스크리닝 방법 또는 검정법을 제공한다. 전형적인 스크리닝 방법에서는, 안지오스타틴 시그널 형질도입 경로를 활성화시킬 수 있는 화합물은 고처리량 세포-기본 스크린을 통해 동정된다. 상기 스크린은 안지오스타틴-반응성 세포주내에 안정하게 형질감염된 안지오스타틴-반응성 인자에 의해 구동된 리포터 유전자에 의존한다. 반응성 인자는 리포터 유전자, 예를 들어, 루시페라제에 대한 유전자에 결합하여, 화합물이 본 발명의 단백질에 결합할 때, 세포내 경로를 활성화시켜, 검출할 수 있는 리포터 유전자 활성의 증가를 야기시킨다.

상기한 바와 같은 스크리닝 방법을 통해 동정된 화합물은 본 발명의 범주내에 있다. 이러한 화합물은 바람직하게는 펩타이드성 또는 비-펩타이드성 저분자량 분자이다. 이들의 작은 크기로 인해, 이들은 안지오스타틴과 비교하여, 의학적 목적으로 사용하기에 보다 실용적이다. 상기 분자 및 이의 용도는 아래에 보다 상세히 기술한다.

본 발명에 따르는 단백질 및 펩타이드는 표준 화학 펩타이드 합성 기술을 사용하여 합성할 수 있다[고체 상 합성의 경우, 예를 들어, 문헌(Barany 및 Merrifield, Solid-Phase Peptide Synthesis, pp 3-284 in The Peptides: Analysis, Synthesis Biology, Vol. 2: Special Methids in Peptide Synthesis, Part A) 참조].

바람직하게는, 본 발명에 따르는 단백질, 펩타이드 및 폴리펩타이드는, 일반적으로 단백질 또는 펩타이드를 암호화하는 DNA 서열을 생성시키고, DNA를 특정 프로모터의 조절하에 발현 카세트내에 위치시키고, 단백질 또는 펩타이드를 숙주내에서 발현시키고, 발현된 단백질 또는 펩타이드를 분리하고, 필요한 경우, 생성물을 복원함을 포함하는 재조합 DNA 방법을 사용하여 합성한다. 일단 발현되면, 재조합 펩타이드 또는 단백질은 당해 분야의 표준 조작에 따라 정제할 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 국면은 본 발명에 따르는 핵산을 포함하는 벡터, 예를 들어, 바이러스 또는 플라스미드이다. 추가로, 본 발명은 또한 이후 본 발명의 단백질 또는 펩타이드를 발현시키는 벡터로 형질전환되거나 형질감염된 재조합 세포, 및 본 발명의 항체를 발현시키는 재조합 세포를 포함하며, 이들은 이후 보다 상세하게 정의할 것이다. 본 발명에 따르는 펩타이드 및 단백질을 암호화하는 벡터는 항체 생산용 면역원을 제공하기 위해 분자를 발현시키는데 유용하다. 본 발명에 따르는 벡터는 또한 시험관내 또는 생체내에서 세포를 형질전환시켜 본 발명의 펩타이드 및 단백질을 발현시키는데 유용하다. 서열 1에 의해 정의된 유전자와 같은 본 발명의 핵산 중 하나를 발현시키는 세포는 다양한 분야에서 사용될 수 있으며, 또한 본 발명의 범주내에 있다. 이러한 세포는 원핵성 또는 진핵성이다.

본 발명에 따르는 단백질 및 펩타이드는 항체를 바로 그 항체 자체에 대해 발생시키는 항원으로서 사용할 수 있다. 결과적으로, 본 발명은 또한 본 발명에 따르는 펩타이드를 특이적으로 결합시키는 항체를 포함한다. 이러한 항체는 면역검정, 예를 들어, 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 분리에 유용하다. 본 발명에 따르는 펩타이드는 증폭 특이적 검정, 면역학적 검정 등과 같은 검정법에서 사용할 수도 있다.

본 발명에 따르는 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있고, 개체 대립형질 균주 또는 종 변이체, 또는 이의 단편, 이들의 천연(전장) 형태 및 재조합 형태 둘다를 포함한다. 추가로, 항체를 이들의 천연 배위 또는 비천연 배위로 본 발명의 펩타이드 또는 폴리펩타이드에 대해 발생시킨다. 항-이디오타입 항체를 또한 발생시킬 수 있다. 항체를 제조하는 다수의 방법은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다[모노클로날 항체를 제조하는 기술에 대해서는, 예를 들어, 문헌(Stiites et al(eds.), Basic and Clinical Immunology(4^thed), Lange Medical Publications, Los Altos, CA) 및 본원에 인용된 참고문헌 참조; 재조합 항체 라이브러리의 파아지 또는 유사 벡터내에서의 선택을 포함하는 기술에 대해서는, 예를 들어, 문헌(Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281) 참조].

본 발명에 따르는 분자는, 특히 맥관형성 관련 장애의 치료 및/또는 예방용 약제학적 제제에서 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 약제로서 사용하기 위한 본 발명에 따르는 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질 또는 항체, 및 맥관형성 관련 질환 또는 장애용 약제 제조에서의 상기 분자의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명에 따르는 분자를 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 약리학적 제제에 관한 것이다. 본 발명에 따르는 약제로서 사용되는 분자는 상기한 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질 또는 항체, 및 상기한 바와 동일한 것을 사용하는 스크리닝 방법에서 동정되는 신규한 물질일 수 있다.

따라서, 본 발명의 분자의 용도는 신규한 물질을 스크리닝하는 검정법에서 가장 바람직하다. 안지오스타틴 및/또는 크링글 5와 유사한 항맥관형성 효과를 나타내나, 사람 또는 동물 신체에서 안지오스타틴보다 소형이고, 효능적이고, 바람직하게는 긴 반감기를 나타내는 화합물을 동정할 수 있다. 보다 짧은 반감기는 프로테아제에 의한 분해에 대한 보다 낮은 경향에 기인한 것일 수 있다. 유기 화합물을 디자인할 경우, 본 발명에 따르는 분자를 "리드(lead)" 화합물로서 사용한다. 공지된 약제학적 활성 화합물에 대한 모사체의 디자인은 상기 "리드" 화합물을 기본으로 하는 약제의 개발에서 익히 공지된 접근법이다. 모사체 디자인, 합성법 및 시험법은 일반적으로 다수의 분자를 표적 특성에 대해 임의로 스크리닝하는 것을 방지하기 위해 사용한다.

따라서, 상기 신규한 분자는 바람직하게는 안지오스타틴보다 아주 낮은 용량으로 투여할 수 있고, 예를 들어, 매일 14일보다 덜 빈번하게 투여할 수 있고, 반감기가 안지오스타틴과 비교하여 약 10배 더 짧은 약제로서 사용된다. 특정 양태에서, 본 발명에 따르는 스크리닝 방법에 의해 동정된 신규한 분자는, 약제학적 제제를 경구 투여용으로 정제로 제조할 경우에, 저분자량 유기 분자이다.

그러나, 본 발명에 따르는 약제학적 제제는 임의의 투여 경로, 예를 들어, 경구, 정맥내, 피부 또는 피하, 비내, 근육내 또는 복막내용으로 제조할 수 있다. 담체 또는 기타 성분의 특성은 특정 투여 경로에 따라 달라질 수 있다[본 명세서에서 유용한 기술 및 프로토콜의 예는 특히 문헌(참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, 16^thedition, Osol, A (ed.), 1980)에서 찾아볼 수 있다].

상기 저분자량 화합물의 투여량은 치료할 질환 또는 장애, 및 사람 및 동물의 체중 및 상태와 같은 기타 임상적 인자 및 화합물의 투여 경로에 따라 달라질 수 있다. 사람 또는 동물을 치료할 경우, 화합물 약 0.5mg/체중 kg 내지 500mg/체중 kg을 투여할 수 있다.

본 발명의 화합물 및 방법은 유리하게는 모든 종류의 맥관형성 관련 장애 및/또는 질환, 예를 들어, 종양 질환, 당뇨병, 류마티스성 관절염 및 특정 염증성 질환, 예를 들어, 건선, 장의 만성 염증, 천식 등과 관련하여 사용된다. 또한, 이들은 비만증을 치료 및 치유, 또는 예방하기 위해 사용할 수 있는 것으로 제안되어 있다.

특정 양태에서, 본 발명의 분자는 유전자 요법에서 사용된다[유전자 요법 조작에 대한 개관은, 예를 들어, 문헌(Anderson, Science (1992) 256:808-813) 참조].

본 발명의 추가의 유리한 용도는 본 발명의 안지오스타틴 및/또는 크링글 5 수용체의 신체내에서의 시그널링을 조절하는 방법을 개발하는 것이고, 따라서, 본 발명은 또한 맥관형성 관련 질환 또는 장애를 앓고 있는 사람 또는 동물 환자를 치료하는 방법 및 상기 질환을 예방하는 방법에 관한 것이다.

실험

이하, 본 발명은 도면을 참조로 하여 보다 상세하게 기술될 것이다.

본 기술 및 상기의 모든 참고문헌은 본 명세서내에 인용되어 있다.

안지오스타틴이 내피 세포에 결합한다는 증거

안지오스타틴과 맥관형성 인자인 VEGF 및 bFGF간의 경쟁적 결합 검정에 의해, 본 발명자들은 안지오스타틴은 상기 분자들의 리간드-수용체 상호작용에 영향을 미치지 않는다는 것을 제시하였다. 동일한 수준의 결합이 비표지된 안지오스타틴의 존재 또는 부재하에 검출될 수 있다. 따라서, 안지오스타틴이 내피 세포와의 맥관형성 인자 상호작용을 차단함으로써 작용한다는 사실을 인정할 수 없다.

안지오스타틴과 이의 전구체 플라스미노겐의 직접 결합은, 요오드화된 단백질을 사용하고 소 미세모관 내피 세포와의 상호작용을 분석하는 결합 검정에 의해 연구되어 있다(도 1 참조).

특히, 사람 안지오스타틴(크링글 도메인 1 내지 4) 또는 플라스미노겐을 제조업자(Pierce Inc.)의 프로토콜에 따르는 Iodogen 방법에 의해 요오드 125로 표지화시킨다. 다음, 표지화된 단백질을 G50 세파로즈 칼럼(제조원: Pharmacia Inc.) 상에서 정제한다. 특이적 활성은 90,000cpm/ng 단백질에서 평가한다. 결합 검정의 경우, 소 모관 내피 세포를 12웰 플레이트내에서 컨플루언시로 성장시킨다. 세포를 1mg/ml 소 혈청 알부민(BSA)을 함유하는 PBS로 세척한다. 다음, 세포를 10ng/ml 방사선-표지화 안지오스타틴 또는 플라스미노겐과 함께 배양한다. 비표지화 리간드의 농도를 증가시키면서 결합을 경쟁화시킨다. 세포를 얼음 중에서 2시간 동안 배양한다. 다음, 세포를 PBS + 1mg/ml BSA로 5회 세척한다. 세포를 PBS 중의 1% Triton X100으로 용해시킨 다음, 방사능을 감마 카운터로 측정한다. 해리 상수 및 수용체 수는 RBINDING 프로그램을 사용하여 평가한다[참고문헌: van Zoelen EJ. Anal. Biochem. 1992 Feb 1:200 (2):393-9].

효모 투 하이브리드 시스템(yeast two hybrid system)을 사용하는 안지오스타틴 결합 분자의 동정

안지오스타틴이 축소 후에도 활성을 보유한다는 것은, 3차원 폴딩이 결합 및 활성에 대해 필수적이지 않다는 것을 암시한다. 이는 단백질 재폴딩이 보다 덜 정확하더라도 다수의 클론을 스크리닝할 수 있는 스크리닝 시스템을 지지한다.

효모 투 하이브리드 시스템을 사용하여, 플라스미노겐의 크링글 도메인 1 내지 4를 결합시키는 분자를 스크리닝한다. 이는 도 2를 참조로 하여 아래에 추가로 기술되어 있다. 사람의 만기된 태반 유래의 2개의 하이브리드 cDNA 라이브러리(제조원: Stratagene)로부터의 약 2x10⁶개 클론을 스크리닝한다. 포지티브 클론을 다음과 같은 방식으로 동정한다:

(1) 선택적 조건(His-, Leu- 및 Trp-)하의 스크리닝은 효모 균주 CG1945내에서 37개의 포지티브 클론을 생성시킨다.

(2) 37개의 클론 중 7개는 ONPG(제조원: SIGMA)와 함께 30℃에서 2시간 동안 배양한 후에 높은 β-갈락토시다제 활성을 나타낸다.

(3) 높은 β-gal 활성을 함유하는 7개의 콜로니로부터의 DNA를 정제하여, 효모 균주 Y190내로 재형질감염시킨다. 7개의 콜로니 중 3개는 새로운 효모 균주내에서 활성을 보유한다. 이들 클론의 서열화 분석으로 이들은 동일한 유전자로부터 유래되었다는 것을 밝혀내었다.

(4) 50mM 3-아미노트리아졸의 존재하에서의 성장(도 3) 및 β-gal 활성(하기 표 1 참조)을 Big3 클론내에서 평가한 다음, 포지티브 및 네가티브 대조군과 비교한다.

결합 도메인	활성화 도메인	β-gal 활성
안지오스타틴 + 결합 도메인	Big3 - 활성화 도메인	15u
안지오스타틴 + 결합 도메인	활성화 도메인 단독	＜0.04u
결합 도메인 단독	Big3 - 활성화 도메인	0.07u
p53 + 결합 도메인	Big3 - 활성화 도메인	0.05u
p53 + 결합 도메인	SV40LT - 활성화 도메인	90u

Big3의 서열(안지오스타틴-결합 도메인)

Big3 클론의 태반 효모 투-하이브리드 라이브러리(Stratagene, Inc.)로부터의 분리 후, GAL4 AD 서열화 프라이머를 갖는 pGAD 활성화 도메인 벡터로부터 cDNA 삽입체를 직접 서열화한다. cDNA 삽입체를, 어댑터로부터 EcoR1 부위를 사용하여 pUC18 벡터내로 재클로닝시키고, 서열화를 만능 및 역방향 프라이머를 사용하여 반복한다. 서열을 ALF 자동화 서열화기(제조원: Pharmacia)로 분석한다. Big3의 서열을 서열 4에 제시한다.

Big3 및 Big3-GST 융합 단백질의 발현 및 정제

Big3 서열을, 스키스토소마 자포니쿰(Schistosoma japonicum) 유래의 글루타치온 S-트랜스퍼라제(GST) 도메인을 갖는 융합 단백질로서 이. 콜라이내에서 발현시킨다.

· 벡터 작제:

Big3 단편(429bp)을, 주형으로서 pUC18-Big3 플라스미드를 사용하는 PCR 증폭에 의해 수득한다. 프라이머 서열은 다음과 같다:

BamHI-NH₂5' TAC GGA TCC GAA TCG AAC AAA ACT GCA GCT G 3'(서열 5)

XhoI-COOH 5' ATA CTC GAG TCA TGG AGC TGG AGT TGG AGC CA 3'(서열 6)

사용된 사이클링 프로토콜은 다음과 같다:

94℃ 3', 60℃ 1', 72℃ 1' 1사이클

94℃ 30", 60℃ 1', 72℃ 2' 30사이클

94℃ 30", 60℃ 1', 72℃ 5' 1사이클

Taq 폴리머라제: 천연 Pfu DNA 폴리머라제(제조원: Stratagene)

PCR 단편을 BamHI 및 XhoI으로 분해하고, 정제한 다음, 동일한 제한 효소를 사용하여 분해된 PGEX-6P-2 플라스미드(제조원: Pharmacia Biotech)에 연결한다. 연결 혼합물을 사용하여, XL1-Blue 세포(제조원: Stratagene)를 형질전환시킨다. 재조합 플라스미드를 제한 분석 및 자동화 서열화에 의해 확인한다.

· 발현 및 정제:

DH5α 세포(제조원: Clontech)를 pGEX-Big3으로 명명되는 특정의 확인된 클론으로 형질전환시킨 다음, 0.1mM IPTG를 사용하여 실온에서 6시간 동안 유도시킨다.

발효액을 4000xrpm에서 15분 동안 원심분리하고, 세포 펠릿을 10% w/v 용해 완충액(50mM TRIS.HCl pH 8.0, 100mM NaCl, 20mM DTT, 1mM EDTA, 프로테아제 억제인자 혼합물)에 재현탁시킨 다음, 초음파처리에 의해 용해시킨다. 전체 용해물을 15000xg, 4℃에서 20분 동안 원심분리한다. 맑아진 상청액을 용해 완충액으로 예비평형화시킨 글루타치온-세파로즈 칼럼(용해물 20ml에 대해 1ml)에 적용시킨다. 수지를 10 칼럼 용적(CV)의 용해 완충액으로 세척하고, 융합 단백질을 3CV의 용출 완충액(100mM TRIS.HCl pH 8.0, 20mM 환원된 글루타치온)으로 용출시킨다.

글루타치온-세파로즈 결합된 융합 단백질을, 50mM TRIS.HCl pH 7.0, 100mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM DTT, 1mM PMSF를 함유하는 PS 완충액 중의 PreScission 프로테아제의 20㎕/ml 수지와 함께 배양함으로써, GST-Big3 단백질을 절단할 수 있다.

용출된 단백질은 rp-HPLC(물 + 0.1% TFA 중의 아세토니트릴의 10-90% 구배)에서 단일 피크와 같이 거동하고, 질량 분석(전기분무) 및 정확한 NH2 서열에 의해 예상된 분자 크기를 나타낸다. SDS-PAGE에서, 오염물은 겉보기 MW 80kD에서 나타나고, HiTrapQ 칼럼 상에서의 이온 교환 크로마토그래피의 실시를 배제할 수 있는 세균성 샤페론인 DnaK인 것으로 입증되었다.

발효액 1ℓ로부터 수득된 산물은 GST-Big3 융합 단백질 약 10mg 및 절단된 Big3 약 3mg이다.

재조합 GST-태그된 Big3의 안지오스타틴에의 시험관내 결합

결합에 사용되는 프로토콜은 아래에 기술한다.

pGEX-Big3 형질전환체의 특정 콜로니를 암피실린이 첨가된 10ml LB 배지에 접종하여, 37℃에서 밤새 성장시킨다.

하룻밤 지난 배양물을 100ml 새로운 배지로 1:10 희석시킨 다음, 37℃에서 1시간 동안 배양한 후, 최종 농도가 0.5mM이 되도록 IPTG를 가하여, 3 내지 7시간 동안 계속 배양한다.

배양물을 5000g에서 10분 동안 원심분리한 다음, 펠릿을 빙냉 PBS 3 내지 5ml에 재현탁시켜, 세포를 초음파처리에 의해 용해시킨다. 최종 농도가 0.5 내지 1%가 되도록 Triton X100을 가한 다음, 현탁액의 1.5ml 분액을 14000rpm에서 10분 동안 원심분리한다.

글루타치온-아가로스 비즈의 50% 슬러리 0.1 내지 0.3ml를 상청액에 가한 다음, 4℃에서 3 내지 5시간 동안 혼합한다. 다음, 비즈를 원심분리에 의해 회수하여, 빙냉 PBS로 5회 세척한 다음, 50mM Tris pH 7.5, 150mM NaCl, 0.5mM EDTA, 1mM DTT, 1mM PMST로 이루어진 결합 용액(B.S.)으로 2회 세척한다.

결합 검정: 0.7ml B.S., 0.1% 송아지 혈청. 500ng 안지오스타틴을 Big3-고정화 글루타치온-아가로스 비즈의 50% 슬러리 30-50㎕와 4℃에서 1 내지 3시간 동안 혼합한다.

상기 수지를 빙냉 B.S.로 5 내지 7회 세척한 다음, 항-사람 플라스미노겐 항체(제조원: Dako Inc.)를 사용하는 웨스턴 블롯 분석에 사용한다.

도 4는 정제된 재조합 Big3이 시험관내에서 안지오스타틴을 어떻게 결합시키는지를 도시한다. 흥미롭게도, 플라스미노겐의 결합은, 단지 DTT로 처리함으로써 디설파이드 결합을 감소시킨 후에만 검출할 수 있었다.

전장 서열의 클로닝

도 5는 ABP-1의 전장 서열의 클로닝에 대한 도식도를 도시한다. 사람 제대 내피 세포 유래의 mRAN를 사용하는 5' PACE PCR(제조원: Gibco)과 함께 Big3 프로브(제거된 반복 서열과 함께)를 사용하여, 태반 cDNA 파아지 라이브러리를 스크리닝함으로써 전체 유전자를 클로닝시킨다. cDNA 클론의 전체 서열은 서열 1에 기재하는 한편, 암호화된 단백질은 서열 2에 제시한다. 상세한 실험 프로토콜은 다음과 같다.

태반 람다 파아지 라이브러리의 10만개 클론을, 프로브로서 Big3의 HinfI 단편을 사용하여 스크리닝한다. DNA 분리 및 서던 블롯 조작을 확립된 프로토콜(Sambrook et al 1989)에 따라 수행한다. Big3과 중복되는 서열을 갖는 5개의 클론(7-1, 7-2, 8-2, 9-3, 9-5)을 분리한다. 7-2 클론의 5'-서열은 5'RACE PCR용 Gene-Specific Primers(GSP)(제조원: Gibco Life technologies, Inc.)를 디자인하는데 사용한다. 사람 제대 내피 세포로부터 분리된 mRNA를 사용하여 5' 서열을 동정한다.

1차 RACE PCR에 사용되는 프라이머:

프라이머: GSP1-(5'에서 3'로) GCTGACAGTTGCCCTGACGCTGCT(서열 10)

GSP2-(5'에서 3'로) CGGAGACGGTGCTCTAGCTGCTCA(서열 11)

GSP3-(5'에서 3'로) TCCTTCCAACTCTTGCCTCAAGTTCCG(서열 12)

RACE 조작은 GSP2 및 GSP3 사이의 미지의 서열 및 mRNA ABP-1의 5'-말단을 증폭시키고 클로닝하기 위해 사용하였다. 이후, 이들 서열을 RACE PCR의 다음 세트를 위한 새로운 프라이머를 디자인하는데 사용한다.

프라이머: GSP1-(5'에서 3'로) GGTGGCAGCGGACAGGCAGGATAC(서열 13)

GSP2 GAGGCGGAGAGAACTAAGAGAAGA(서열 14)

GSP3 GAGCGGAGATGGAGGAGTAATTCA(서열 15)

서열과 일치하는 클론 A2-2, A2-1 및 A1-C를 분리한다. A2-1 서열을 태반 파아지 라이브러리의 제2 스크리닝용 프로브로서 사용한다. 당해 스크리닝으로부터, 또 다른 2개의 클론(7-10 및 6-5)을 분리한다. 도 6에서 알 수 있는 바와 같이, 6개의 가능한 프레임 중, 완전 오픈 리딩 프레임을 생성시키는 유일한 것은 675개 아미노산 잔기의 추정 단백질을 생산하는 프레임 2이다.

mRNA 발현 패턴

상업적으로(Clontech, Inc.) 수득된 사람 성체 및 태아 조직(#7760-1 및 #7756-1) mRNA 블롯(2mg mRNA/웰)을 ABP-1에 대해 프로브화시킨다. 블롯을 제조업자의 프로토콜에 따라 ExpressHyb 하이브리드화 용액(Clontech, Unc.)을 사용하여 하이브리드화시킨다. 블롯을 7-2 5'PstI 단편으로 프로브화시킨다. 도 7은 실험 결과를 도시한다; 크기는 9.5kb 및 7.5kb이다.

또한, ABP-1을 사람 제대, 소 대동맥 및 소 미세모관 내피 세포에서 검출한다. 고정화 내피 세포주 EaHy926 및 사람 태아 섬유아세포에서는 거의 또는 전혀 발현되지 않는 것으로 검출된다. 어떠한 세포주도 안지오스타틴에 반응하지 않거나, FITC-표지화 안지오스타틴의 결합을 나타내지 않는다.

실시간 RT-PCR

5' 뉴클레아제 검정(TaqMan 검정)은 비신장성 올리고뉴클레오타이드 하이브리드화 프로브(TaqMan Probe)를 사용한다. TaqMan 프로브는 5'-리포터 색소 및 3'-실활제 색소를 함유하는 올리고뉴클레오타이드로 이루어져 있다. 프로브가 온전한 경우, 리포터 색소와 실활제 색소와의 근접은 포스터(Foster) 유형 에너지 전이에 의한 리포터 형광발광의 억제를 유발한다. PCR 동안, 전방향 및 역방향 프라이머는 표적 DNA의 특이적 서열과 하이브리드화한다. TaqMan 프로브는 PCR 산물내에서 표적 서열과 하이브리드화한다. Taq 폴리머라제는 이의 5'-3' 뉴클레아제 활성을 사용하여 TaqMan 프로브를 절단한다. 리포터 색소 및 실활제 색소는 절단시 분리되어, 리포터의 형광발광을 증가시킨다.

실시간 RT-PCR 분석

RNA 제제

아래에 기재된 조직 및 세포로부터의 전체 RNA의 분리 및 정제는 Ultraspec RNA 분리 시스템(Biotex)을 사용하여 수행한다.

HDMEC/2	사람 피부 미세맥관 EC	폴리 A+
A2780	사람 난소암	전체
A375	사람 흑색종	전체
HDF	사람 피부 섬유아세포	전체
HELA	사람 경부암	전체
DU145	사람 전립선암	전체
HUVEC	사람 제정맥 EC	전체
ECV304	불멸화 EC	전체
CEM	사람 급성 임파아구 백혈병	전체
K562	사람 적백혈병	전체
JURKAT	사람 급성 T-세포 백혈병	전체
THP-1	사람 단핵세포(급성 백혈병)	전체
EaHy926	사람 피부 세포	전체
S35/K9	사람 결장암	전체
뇌	사람 정상 조직	전체
결장	사람 정상 조직	전체
전립선	사람 정상 조직	전체
골격근	사람 정상 조직	전체
자궁	사람 정상 조직	전체
태반	사람 정상 조직	전체

cDNA 합성

랜덤 헥사머를 함유하는 TaqMan Reverse Transcription Reagent(PE Applied Biosystems)를 RT 프라이머로서 사용하여 RT 반응을 수행한다. 역전사 반응 단계에 대한 반응 용적은 100㎕이고, 전체 RNA 양은 샘플에 대해 1㎍이다.

하기 사이클링 파라미터를 사용하여 RT를 수행한다:

25℃에서 10'

48℃에서 45'

95℃에서 5'

PCR 반응

프라이머 농도 적합화 후, cDNA 10ng 상에서의 PCR 반응을, TaqMan Universal PCR Master Mix(PE Applied Systems) 및 하기 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 수행한다:

· ABP-1 전방향 프라이머: 5' GTTTGACCTGCAATCCAGACAA 3'(서열 7) 최종 농도 300nM

· ABP-1 역방향 프라이머: 5' CCCAGGATCTGAATGGGAGTT 3'(서열 8) 최종 농도 900nm

· ABP-1 TaqMan 프로브: 5'(FAM 색소)-CAGATGGGCCTGTGTTCCACTCCAA-(TAMRA 색소) 3'(서열 9) 최종 프로브 농도 200nM

사이클링 프로토콜은 다음과 같다:

50℃에서 2'; 95℃에서 10' 1사이클

95℃에서 15"; 60℃에서 1' 40사이클

유전자 발현의 비교 정량화

비교 방법은 표준 곡선을 필요로 하지 않는 비교 정량화에 대한 결과를 획득하기 위한 수학식을 사용한다.

도 8에 도시된 결과는, 가장 낮은 수준의 표적의 발현을 나타내는 샘플인 캘리브레이터와 비교하여 샘플 X가 표적을 몇배로 발현시키는지를 나타낸다. 본 실험에서는, EaHY926 샘플을 캘리브레이터로서 선택한다.

Big3에 대한 항체

뉴질랜드계 화이트 래빗의 면역화를 위해, Big3-GST 융합 단백질 100㎍을, 프로인트 완전 보조액(Gibco) 1ml로 균질화된 인산염 완충 염수(PBS) 1ml에 용해시킨다. 생성된 유탁액을 0일째에 피하 주사한 다음, 이 처리를 15일째 및 28일째에 반복한다. 혈액을 래빗으로부터 35일째에 제거하여, 4℃에서 밤새 응고시킨 다음, 생성된 혈청을 -20℃에서 보관한다.

특정 항체의 정제를 위해, 수지-고정화 리간드를 다음과 같이 제조한다: Big3 폴리펩타이드를 총 용적 2ml 중의 농도 5mg/ml로 0.1M 중탄산나트륨, 0.5M NaCl, pH 8.3에 희석시킨다. 이를 시아노겐 브로마이드-활성화 세파로즈 CL-4B 수지(Sigma Chemical Co.; 미주리주 세인트루이스 소재) 2ml와 실온에서 2시간 동안 반응시킨다. 반응 후, 수지를 100mM Tris, 500mM NaCl, pH 7.5 10용적으로 3회 세척한다. 면역 혈청을 친화성 수지와 함께 4℃에서 2시간 동안 배양한 다음, 수지를 100mM Tris, 500mM NaCl, pH 7.5 25용적을 사용하는 유리 크로마토그래피 칼럼(Bio-Rad; 캘리포니아주 리치먼드 소재) 5ml내에서 세척한다. 특이적 항체를 100mM 글리신/HCl, pH 2.8을 함유하는 1ml 분액으로 용출시킨다. 항체를 용출시킨 다음, 280nM(OD280)에서의 광학 밀도를 모니터링하고, OD280이 1 이상인 분획을 풀링시켜, 완충액을 3회 교환하면서 PBS 1ℓ에 대해 4℃에서 36시간 동안 투석(Slide-A-lyzer cassettes, Pierce)시킨다.

ABP-1 단백질에 의한 안지오스타틴의 결합 및 시그널링

도 9A 및 9B는 FITC-표지화 안지오스타틴의 ABP-1 형질감염된 HeLa 및 벡터 대조군으로 형질감염된 EaHy926 세포에의 결합 데이터를 도시한다. 특히, 도 9A는 일시적으로 형질감염된 세포내에서의 녹색 형광 단백질(GFP)에 융합된 ABP-1의 세포 국재화를 도시한다. 단백질은 내부원형질 세망 및 세포막내에서 검출할 수 있다. DABP-1은 유전자의 5' 말단에서 500bp 결실을 함유하고, 이는 ABP-1의 상기한 국재화를 붕괴시킨다.

도 9B는 ABP-1 GFP로 형질감염된 HeLa 세포를 도시한다. 안지오스타틴 2.5mg과 0℃에서 60분 동안 배양한 다음, 37℃에서 15분 동안 배양하면, ABP-1-GFP의 내재화가 유도된다.

도 9C는 안지오스타틴의 ABP-1에의 결합을 도시한다. 플루오레스세인 이소티오시아네이트(FITC)-표지화 안지오스타틴이 내피 세포에 특이적으로 결합한다는 것을 제시하였다(데이터는 제시하지 않음). HeLa 세포를 ABP-1 발현 작제물 또는 벡터 대조군(p RC/CMV, In Vitrogen, Inc.)으로 형질감염시킨다. DMEM+10% 태아 송아지 혈청 중의 생 HeLa 세포 FITC-표지화 안지오스타틴(10㎍/ml)을 0℃에서 60분 동안 배양한다. 다음, 세포를 37℃에서 15분 동안 배양하여, 결합된 안지오스타틴을 수집한다. 형광 현미경을 사용하여 결합을 분석한다. 안지오스타틴의 결합은 ABP-1 형질감염된 세포내에서는 검출되나, 벡터 대조군내에서는 검출되지 않는다.

도 9D는 사람 제대 내피(HUVE) 세포내에서의 ABP-1의 면역염색 및 로다민-표지된 팔로이딘을 사용한 F-액틴에 대한 염색을 도시한다.

· 면역염색 프로토콜:

HUVE 세포를 4% 포름알데히드내에 고정시키고, PBS로 세척한 다음, 5% 말 혈청내에서 예비차단한다. 차단 용액을 제거한 다음, 5% 말 혈청으로 희석된 안지오스타틴-결합 도메인 Big3에 대한 래빗 폴리클로날 항체로 대체한다. 포지티브 염색은 형광-표지화 2차 항체(Dako, Inc.)를 사용하여 가시화시킨다. 로다민-공액화 팔로이딘(Molecular Probes, Inc.)을 2차 항체와 동시에 염색한다(1% Triton X100을 사용하여 1분 동안 투과성을 상승시킨 후). 녹색 형광 단백질에 대한 래빗 폴리클로날 항체를 네가티브 대조군으로서 사용한다. 또한, 포지티브 염색은 사람 섬유아세포에서 전혀 검출될 수 없다.

도 9D에서 알 수 있는 바와 같이, ABP-1은 병소 유착 및 막 주름에 위치한다(화살표).

시험관내 키나제 데이터

Huve 세포를 5cm 페트리 디쉬내에 서브컨플루언트로 플레이팅시킨다. 안지오스타틴을 다음날 상이한 시점에 2.5mg/ml로 가한다. 대조군을 포함하는 모든 플레이트를 동시에 수거한다. 세포를 빙냉 PBS로 세정한 다음, 1ml 용해 완충액 중에서 배양한다. 세포를 에펜도르프 튜브에 이송시킨 다음, 14,000rpm, 4℃에서 5분 동안 원심분리한다. 상청액을 다른 에펜도르프 튜브에 이송시켜, Big3 래빗 폴리클로날 항체 2㎍을 가한다. 샘플을 4℃에서 60분 동안 배양한 다음, 단백질 A 세파로즈(Pharmacia, Inc.) 슬러리 50㎕를 가하여, 회전 배양기내에서 추가 60분 동안 배양한다. 면역침전물을 단시간 원심분리에 의해 수거하여, 용해 완충액으로 2회, 완충액으로 1회 및 키나제 완충액으로 1회 세척한다. 잔류 완충액을 주사기로 제거한다. 키나제 완충액 25㎕를 1μCi γATP(Amersham, Inc.)와 함께 각각의 튜브에 가한다. 샘플을 실온에서 20분 동안 배양한다. 2xSDS PAGE 샘플 완충액을 가하여 반응을 중지시킨다. 샘플을 변성 조건하에 비등시킨 다음, SDS PAGE에 의해 분석한다.

도 10에 제시된 데이터는 안지오스타틴의 첨가가 ABP-1 관련된 키나제 활성을 30분 이내에 하향조절함을 보여준다. 이는 안지오스타틴이 ABP-1에 의해 매개된 시그널링 경로에 영향을 미친다는 직접적인 증거이다.

ABP-1은 안지오스타틴-유도된 병소 유착 키나제 활성을 매개함

도 11에 의해 제시된 데이터는, 안지오스타틴 2.5㎍/ml의 첨가가 첨가 후 1시간 이내에 FAK 활성을 상향조절한다는 것을 보여준다.

EaHy926 세포를 5cm 페트리 디쉬내에 서브컨플루언트로 플레이팅시킨다. 안지오스타틴을 다음날 상이한 시점에 2.5μg/ml로 가한다. 대조군을 포함하는 모든 플레이트를 동시에 수거한다. 세포를 빙냉 PBS로 세정한 다음, 1ml 용해 완충액 중에서 배양한다. 세포를 에펜도르프 튜브에 이송시킨 다음, 14,000rpm, 4℃에서 5분 동안 원심분리한다. 상청액을 다른 에펜도르프 튜브에 이송시켜, FAK 모노클로날 항체(Transduction Lab. Inc.) 1㎍을 가한다. 샘플을 4℃에서 60분 동안 배양한 다음, 래빗 항-마우스 IgG + 단백질 A 세파로즈(Pharmacia, Inc.) 슬러리 50㎕를 가하여, 회전 배양기내에서 추가 60분 동안 배양한다. 면역침전물을 단시간 원심분리에 의해 수거하여, 용해 완충액으로 2회, 완충액으로 1회 및 키나제 완충액으로 1회 세척한다. 잔류 완충액을 주사기로 제거한다. 키나제 완충액 25㎕를 1μCi γATP(Amersham, Inc.)와 함께 각각의 튜브에 가한다. 샘플을 실온에서 20분 동안 배양한다. 2xSDS PAGE 샘플 완충액을 가하여 반응을 중지시킨다. 샘플을 변성 조건하에 비등시킨 다음, SDS PAGE에 의해 분석한다.

도 11에서 알 수 있는 바와 같이, 안지오스타틴의 첨가는 FAK 활성을 1시간 이내에 상향조절한다. EaHy926 세포는 역전사효소 PCR 분석에 의해 입증된 바와 같이 ABP-1을 발현시키지 않음을 주목하여야 한다.

＜110＞ Pharmacia AB

＜120＞ Angiostatin-binding protein

＜130＞ 5-1998-082044-1

＜150＞ SE 9802130-6

＜151＞ 1998-06-15

＜150＞ US 60/089,266

＜151＞ 1998-06-15

＜150＞ SE 9804372-2

＜151＞ 1998-12-17

＜150＞ US 60/114,386

＜151＞ 1998-12-29

＜160＞ 15

＜170＞ KOPATIN 1.5

＜210＞ 1

＜211＞ 6463

＜212＞ DNA

＜213＞ Homo sapiens

＜220＞

＜221＞ CDS

＜222＞ (797)..(2824)

＜400＞ 1

ccaggagctg ccttggcagt cacgcccctt ccttccgagg agctttctgg ctgcctaaac 60

tggtagaccc cctgaattac tcctccatct ccgctctctt tcgcctcctc ttctcttagt 120

tctctccgcc tccccctcaa ctaccaccac ctccagtcag tctcgcctcc ggctatccgc 180

tgctccaccc tctggcccgg tatcctgcct gtccgctgcc accaaggaga gcccggacgg 240

agcagcgagg aggggagcag ccgggagttg gggcttcccc cctgcccatc cctggccgct 300

ggcccgggac cgaagccact tgagcgagca gagagtcgtc accttgtctt ctttgccttc 360

agggagctgc taagaaggac aaataagata gcagagtgaa agagcttttg tctccttaga 420

aggaaggctg agaaactaaa ggccagcgca ggacatctca ttgccattgt cagccaggaa 480

ctcgcagcct cacagcccta cttcttctct gacctctggg gggtccttgc ccttgctaca 540

atctccacca tccactagat tgtctcctgc ccgacacccc ttggtcccaa accagggaga 600

ccattcagct cacctgccta ggccgcagca gcatttcctt cctaatcagg ctcaccaggg 660

ggatcattac cgtctctccc aacctggcct gagtcagcag cagcagcaac agcagcagca 720

gcaccatcat caccatcacc accaacaaca gcagcagcag cagccacagc agcagccagg 780

agaagcctat tcagct atg cct cgg gct cag cca tcc tct gct tct tat 829

Met Pro Arg Ala Gln Pro Ser Ser Ala Ser Tyr

1 5 10

cag cca gtg cca gca gac cct ttt gcc att gtt tcc aga gcc cag cag 877

Gln Pro Val Pro Ala Asp Pro Phe Ala Ile Val Ser Arg Ala Gln Gln

15 20 25

atg gtt gag atc ctc tca gac gag aac cgg aac ttg agg caa gag ttg 925

Met Val Glu Ile Leu Ser Asp Glu Asn Arg Asn Leu Arg Gln Glu Leu

30 35 40

gaa gga tgc tat gag aag gtg gca aga ctg cag aag gtg gag aca gaa 973

Glu Gly Cys Tyr Glu Lys Val Ala Arg Leu Gln Lys Val Glu Thr Glu

45 50 55

atc cag cgc gtc tcg gag gca tat gag aac ctc gtg aag tca tcc tcc 1021

Ile Gln Arg Val Ser Glu Ala Tyr Glu Asn Leu Val Lys Ser Ser Ser

60 65 70 75

aaa aga gag gcc cta gag aaa gcc atg aga aac aag cta gag ggc gag 1069

Lys Arg Glu Ala Leu Glu Lys Ala Met Arg Asn Lys Leu Glu Gly Glu

80 85 90

att cgg agg atg cat gat ttc aac agg gat ctg aga gag cgt cta gag 1117

Ile Arg Arg Met His Asp Phe Asn Arg Asp Leu Arg Glu Arg Leu Glu

95 100 105

act gcc aac aag cag ctt gca gag aag gaa tat gag ggg tca gag gac 1165

Thr Ala Asn Lys Gln Leu Ala Glu Lys Glu Tyr Glu Gly Ser Glu Asp

110 115 120

acc aga aaa acc atc tcg cag ctc ttt gca aaa aat aaa gaa agc cag 1213

Thr Arg Lys Thr Ile Ser Gln Leu Phe Ala Lys Asn Lys Glu Ser Gln

125 130 135

cgt gag aag gag aag ctg gaa gcg gag ctg gcc act gcc cgt tct acc 1261

Arg Glu Lys Glu Lys Leu Glu Ala Glu Leu Ala Thr Ala Arg Ser Thr

140 145 150 155

aat gag gac caa aga cga cac atc gaa atc cga gat cag gcc ctg agt 1309

Asn Glu Asp Gln Arg Arg His Ile Glu Ile Arg Asp Gln Ala Leu Ser

160 165 170

aat gcc cag gcc aag gtg gta aag ctg gaa gaa gag ctg aaa aag aag 1357

Asn Ala Gln Ala Lys Val Val Lys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Lys Lys

175 180 185

caa gtg tac gtt gac aag gtg gag aag atg cag cag gcc ctt gta cag 1405

Gln Val Tyr Val Asp Lys Val Glu Lys Met Gln Gln Ala Leu Val Gln

190 195 200

ctc cag gca gca tgt gaa aaa cgt gag cag cta gag cac cgt ctc cgg 1453

Leu Gln Ala Ala Cys Glu Lys Arg Glu Gln Leu Glu His Arg Leu Arg

205 210 215

aca cga ctg gag agg gaa ctg gaa tcc ctg aga atc cag cag cgt cag 1501

Thr Arg Leu Glu Arg Glu Leu Glu Ser Leu Arg Ile Gln Gln Arg Gln

220 225 230 235

ggc aac tgt cag ccc acc aac gtt tca gaa tac aat gct gcc gca ctg 1549

Gly Asn Cys Gln Pro Thr Asn Val Ser Glu Tyr Asn Ala Ala Ala Leu

240 245 250

atg gag ctc ctt cgg gag aaa gag gag agg att ctg gct ctg gaa gct 1597

Met Glu Leu Leu Arg Glu Lys Glu Glu Arg Ile Leu Ala Leu Glu Ala

255 260 265

gat atg aca aag tgg gag cag aaa tat ttg gag gag aat gtg atg aga 1645

Asp Met Thr Lys Trp Glu Gln Lys Tyr Leu Glu Glu Asn Val Met Arg

270 275 280

cat ttt gct ctg gat gct gct gca act gtg gct gct cag agg gac aca 1693

His Phe Ala Leu Asp Ala Ala Ala Thr Val Ala Ala Gln Arg Asp Thr

285 290 295

aca gtc atc agt cac tct cct aac acc agc tat gac aca gct cta gaa 1741

Thr Val Ile Ser His Ser Pro Asn Thr Ser Tyr Asp Thr Ala Leu Glu

300 305 310 315

gct cgc atc cag aaa gag gag gaa gaa atc ttg atg gcc aat aag cgt 1789

Ala Arg Ile Gln Lys Glu Glu Glu Glu Ile Leu Met Ala Asn Lys Arg

320 325 330

tgc ctt gac atg gag ggc agg att aag acc ctc cat gcc cag att att 1837

Cys Leu Asp Met Glu Gly Arg Ile Lys Thr Leu His Ala Gln Ile Ile

335 340 345

gag aag gat gcc atg atc aaa gta ctc cag cag cgt tcc cgg aag gag 1885

Glu Lys Asp Ala Met Ile Lys Val Leu Gln Gln Arg Ser Arg Lys Glu

350 355 360

ccg agc aag aca gag cag ctg tcg tgc atg cgg cca gcg aag tct ctg 1933

Pro Ser Lys Thr Glu Gln Leu Ser Cys Met Arg Pro Ala Lys Ser Leu

365 370 375

atg tcc att tcc aat gct gga tca ggc ttg ctc tcc cac tca tcc acc 1981

Met Ser Ile Ser Asn Ala Gly Ser Gly Leu Leu Ser His Ser Ser Thr

380 385 390 395

ctg act ggc tcc ccc atc atg gaa gaa aag cga gac gac aag agc tgg 2029

Leu Thr Gly Ser Pro Ile Met Glu Glu Lys Arg Asp Asp Lys Ser Trp

400 405 410

aag ggg agc cta ggc att ctc ctg ggt gga gac tac cgt gct gaa tat 2077

Lys Gly Ser Leu Gly Ile Leu Leu Gly Gly Asp Tyr Arg Ala Glu Tyr

415 420 425

gtc cct tcc aca ccc tcg cct gtg cca ccc tcg act ccc ctg ctc tcg 2125

Val Pro Ser Thr Pro Ser Pro Val Pro Pro Ser Thr Pro Leu Leu Ser

430 435 440

gct cac tcc aag aca ggc agc cga gac tgc agt acc caa act gaa cgt 2173

Ala His Ser Lys Thr Gly Ser Arg Asp Cys Ser Thr Gln Thr Glu Arg

445 450 455

ggg acg gaa tcg aac aaa act gca gct gtt gct ccc atc tct gtt cct 2221

Gly Thr Glu Ser Asn Lys Thr Ala Ala Val Ala Pro Ile Ser Val Pro

460 465 470 475

gct cca gtt gct gct gcc gcc act gct gcc gcc atc act gcc act gct 2269

Ala Pro Val Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ile Thr Ala Thr Ala

480 485 490

gcc acc atc acc acc acc atg gta gct gct gct cca gtt gct gtt gct 2317

Ala Thr Ile Thr Thr Thr Met Val Ala Ala Ala Pro Val Ala Val Ala

495 500 505

gct gct gct gct cca gct gct gct gct gcc ccg tct cca gcc act gcc 2365

Ala Ala Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ala Pro Ser Pro Ala Thr Ala

510 515 520

gct gct act gct gct gct gtt tct cca gct gct gct ggt cag att cca 2413

Ala Ala Thr Ala Ala Ala Val Ser Pro Ala Ala Ala Gly Gln Ile Pro

525 530 535

gct gct gcc tct gtt gcc tca gct gct gcc gtt gct cct tct gct gct 2461

Ala Ala Ala Ser Val Ala Ser Ala Ala Ala Val Ala Pro Ser Ala Ala

540 545 550 555

gct gct gct gct gtt cag gtt gct cca gct gct ccg gct cca gtt cca 2509

Ala Ala Ala Ala Val Gln Val Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Val Pro

560 565 570

gct ccg gct ctg gtt ccg gtt cca gct cca gca gcg gct cag gct tct 2557

Ala Pro Ala Leu Val Pro Val Pro Ala Pro Ala Ala Ala Gln Ala Ser

575 580 585

gct cct gct cag act cag gca cca act tca gct ccg gct gtg gct cca 2605

Ala Pro Ala Gln Thr Gln Ala Pro Thr Ser Ala Pro Ala Val Ala Pro

590 595 600

act cca gct cca act cca act cca gct gtg gct cag gct gag gtt cct 2653

Thr Pro Ala Pro Thr Pro Thr Pro Ala Val Ala Gln Ala Glu Val Pro

605 610 615

gca agt cca gct acc ggt cct gga cca cat cgt ttg tct ata cca agt 2701

Ala Ser Pro Ala Thr Gly Pro Gly Pro His Arg Leu Ser Ile Pro Ser

620 625 630 635

ttg acc tgc aat cca gac aaa aca gat ggg cct gtg ttc cac tcc aat 2749

Leu Thr Cys Asn Pro Asp Lys Thr Asp Gly Pro Val Phe His Ser Asn

640 645 650

act ctg gaa aga aaa act ccc att cag atc ctg gga caa gag cct gat 2797

Thr Leu Glu Arg Lys Thr Pro Ile Gln Ile Leu Gly Gln Glu Pro Asp

655 660 665

gca gag atg gtg gaa tat ctc atc taa acggccaaat caagagctgc agattatcag 2854

Ala Glu Met Val Glu Tyr Leu Ile

670 675

caaaaatgct tttaatcatt ttcccccttt tattggttct tgttttgagg gtgaggacaa 2914

gggttgtggg gaggggatgt tttttaacag gactttttat tggaacaatg tactacttga 2974

gtaataccat gtgaacacca gtctattttg gtatgcttag ggagtacctc taaagacaga 3034

ttaatcagaa tgtgctctaa agcttattgt ttgaatttat acgaatactg ggactgttaa 3094

caggtggcta tacatcgacg ttttcaatgt gcttaaattt gtttaaattt tccatattct 3154

agatcatttt ttattgaaga gcacagtatg tgtggaagac agtgtataac acgtagtttg 3214

gaagtgggaa gctagagaga attgagtgtg tgctgttttg tatagttact atcctgtgca 3274

gcagctggag aaagcactca cctcaggctt acaaaaggga atagtttcag gagctatgta 3334

agctggaaaa aaggtaggga gttttggggt gcagaagggt actggagcta attttttctt 3394

ccagtttccc agctaccctg ccccagggaa ttgtgtttgt cttcatttca gtggtgcttt 3454

ggaaatggat tcttttggtt ccctcctgga ggttcataca ttcatatata tgctctggag 3514

taatttatgc atttggataa ttaatatatt gctttcagat gctgggagag tacattaact 3574

gagtgatgcg caacttcctc tctcttaggg aattagacca tcagaggcct tgatggagag 3634

ttgcatgggg tgctatatgc agacttccat ggtttgtgtg tagccatgaa cacagcttgc 3694

ttgcatttag taagaccaat cagcttagtg tttatttctt ctacagcaca gattcactgg 3754

ctgggtctcc agtctcaaat tgccaatcat ttgcaaagtg aggaaggatc tttgttgaca 3814

ggttgaatgc tttgaatttc tggtgactac tttgaaataa cttgttttgt ttgtcaaatt 3874

ctaagcatat gtcttaaaag gcatttttga ctatcacctc caagggaata gcttgagaaa 3934

cccaaagtac tatgctgcag tcgggggaga ggtggattgc agcagtatcc tcaactacct 3994

cttctcactg tcagtgacac catcttggaa tacctttggg aagcagcagg aaatgtgcat 4054

gtgggtagag atcaaaggag gcaatggctc caagccttgc catagggctg cctccaagga 4114

cacagaagga tgccagttgc cacaggtccc tgccctgtgt cacctgtctg cccttcatta 4174

aggtgagaaa tctgcagata gcatcattaa gatcagtttt aaggggtata gggagggtga 4234

gggaagtggg gggtgttagg taagggttgg gggtagaggt tttgggatgt cttagttaga 4294

aaccagatta atagaagagt aggcctgata tattacatca tgagccatag tggtgggaaa 4354

gaactttagc aatatagccc tacctcctca ttttagtgat gaggaatctg agaactggag 4414

aggttcagtg actttttgaa agtcatacaa cacagctaac cattatgcca atcaccatgc 4474

ttattttggg aaactcttta tcttttttaa attccatttt atgaaaaggc atcttcatgg 4534

tccagggaat atgtatcttg taaaatgtac ctggttggag tagcttgtcc agtcttgaca 4594

aactactgaa tttctgtctt gcctctcctt cagtgccttt taaaaggttt tcccttttct 4654

gatctgcatt tcaacataga gtcacataaa tgtccccctg agaaaccaat cccacttctt 4714

tctaggagat tgggtatctt agataatctt ttggggttcc tctgtgagta taggaatggt 4774

atccttccta attatcttcc aaaggaatta ttttgtgtgt gtgcctgtgt gtgtgtagag 4834

acataaagga gggtgatgtg attttcagct agtcctttca cattttcaat aatgaggtaa 4894

tcatgttaca tacacattag tcctcagtta taaagtgaat ctcagataga aattaaaagt 4954

gcagttgtgt taagactctt tcatactacc ctttagtcat aaggagaaaa aaacactcaa 5014

atagtagaag cagcaagtag caaacttcag gagagctact ttctatccaa ataatttaaa 5074

aaacactttt cacctactcc tttcatggtt ataacacatt ggcagacttt ttgctggctc 5134

tgggagccat gattttaatc acattctgca aggtgacaaa tgtcatacat tccacattgt 5194

gtggtagcca tctctttaga ctcatgtgtt ttggggaaag gaagaagttc ttggctgagt 5254

actattttga actttccaga accctctcac accagagaca gttcttctct gttcagtttc 5314

caatccccga taatttgcta aaataacatt gtacatccaa gagagggaag aagagtatgt 5374

cagtatatta tgcagaagat agatacagcc ttttcagaag atctccacta gtttttgttc 5434

caaaaattca agtttatggg agaaatctca attagccacc ttttcacagt tgtgtggata 5494

taacatttgg gggatctttc tggactccta cctatctgtg cattttaccg gcacctcagg 5554

aaaggagggt gaccaggttg tcttagcttg tactgcttgg tgatctctga ggaccttcta 5614

attcagttgt accccagtgt tccatgtata gaaaaacttc attagaacaa actttacttg 5674

atatgaaact cctattaaca gtcttttttt gaaataaaaa gtagcttgag ctttctttta 5734

aaatcatgta tcttgattgt tgatttaatg aaggatttcc ttttaatgct gcttttgagc 5794

ttcaaggtaa taggacagca ggaacctaaa atatctgcca tcatctgcca taggaaagat 5854

acccagagac ccatcatgtt ctctttttgt tgttacactg ttgggtgggt ataacaattg 5914

gaaaatgaac aaactgattg attgtgcaaa ctacttttta tgacaagcct aaaccctcat 5974

aatgcggcag cttaaagtgt atacatatgc actaactttg atcaattata ttctcatatc 6034

tgttagctac acagtctcct attatctcaa ttgcttatgt gcatatggaa tatgttactt 6094

aaaacgtgtg cattcttact gaaaatgttt tcaaaggaag gtatcagctg tgggctaatt 6154

gccaccaatt tcagcctgcc acgattcttg gaaatatgtc ttccaagtgc catccatcat 6214

cagtaggaca agtgtcggga gtttgtttat ttttttccag tagcaacgat gggttacatg 6274

gagccatgaa acctccttct ggcctccctt gtgattaatg gcatgtgttt gtaaaatgga 6334

tagctggggt tggcagatgg ctagagaaga atcgcctttg gtttaaaatg tatgtggtcc 6394

cctaatgatt gtgaccccat tctgtaatca actgagctag ttccaataaa gttaagcagg 6454

tttaaatcc 6463

＜210＞ 2

＜211＞ 675

＜212＞ PRT

＜213＞ Homo sapiens

＜400＞ 2

Met Pro Arg Ala Gln Pro Ser Ser Ala Ser Tyr Gln Pro Val Pro Ala

1 5 10 15

Asp Pro Phe Ala Ile Val Ser Arg Ala Gln Gln Met Val Glu Ile Leu

20 25 30

Ser Asp Glu Asn Arg Asn Leu Arg Gln Glu Leu Glu Gly Cys Tyr Glu

35 40 45

Lys Val Ala Arg Leu Gln Lys Val Glu Thr Glu Ile Gln Arg Val Ser

50 55 60

Glu Ala Tyr Glu Asn Leu Val Lys Ser Ser Ser Lys Arg Glu Ala Leu

65 70 75 80

Glu Lys Ala Met Arg Asn Lys Leu Glu Gly Glu Ile Arg Arg Met His

85 90 95

Asp Phe Asn Arg Asp Leu Arg Glu Arg Leu Glu Thr Ala Asn Lys Gln

100 105 110

Leu Ala Glu Lys Glu Tyr Glu Gly Ser Glu Asp Thr Arg Lys Thr Ile

115 120 125

Ser Gln Leu Phe Ala Lys Asn Lys Glu Ser Gln Arg Glu Lys Glu Lys

130 135 140

Leu Glu Ala Glu Leu Ala Thr Ala Arg Ser Thr Asn Glu Asp Gln Arg

145 150 155 160

Arg His Ile Glu Ile Arg Asp Gln Ala Leu Ser Asn Ala Gln Ala Lys

165 170 175

Val Val Lys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Lys Lys Gln Val Tyr Val Asp

180 185 190

Lys Val Glu Lys Met Gln Gln Ala Leu Val Gln Leu Gln Ala Ala Cys

195 200 205

Glu Lys Arg Glu Gln Leu Glu His Arg Leu Arg Thr Arg Leu Glu Arg

210 215 220

Glu Leu Glu Ser Leu Arg Ile Gln Gln Arg Gln Gly Asn Cys Gln Pro

225 230 235 240

Thr Asn Val Ser Glu Tyr Asn Ala Ala Ala Leu Met Glu Leu Leu Arg

245 250 255

Glu Lys Glu Glu Arg Ile Leu Ala Leu Glu Ala Asp Met Thr Lys Trp

260 265 270

Glu Gln Lys Tyr Leu Glu Glu Asn Val Met Arg His Phe Ala Leu Asp

275 280 285

Ala Ala Ala Thr Val Ala Ala Gln Arg Asp Thr Thr Val Ile Ser His

290 295 300

Ser Pro Asn Thr Ser Tyr Asp Thr Ala Leu Glu Ala Arg Ile Gln Lys

305 310 315 320

Glu Glu Glu Glu Ile Leu Met Ala Asn Lys Arg Cys Leu Asp Met Glu

325 330 335

Gly Arg Ile Lys Thr Leu His Ala Gln Ile Ile Glu Lys Asp Ala Met

340 345 350

Ile Lys Val Leu Gln Gln Arg Ser Arg Lys Glu Pro Ser Lys Thr Glu

355 360 365

Gln Leu Ser Cys Met Arg Pro Ala Lys Ser Leu Met Ser Ile Ser Asn

370 375 380

Ala Gly Ser Gly Leu Leu Ser His Ser Ser Thr Leu Thr Gly Ser Pro

385 390 395 400

Ile Met Glu Glu Lys Arg Asp Asp Lys Ser Trp Lys Gly Ser Leu Gly

405 410 415

Ile Leu Leu Gly Gly Asp Tyr Arg Ala Glu Tyr Val Pro Ser Thr Pro

420 425 430

Ser Pro Val Pro Pro Ser Thr Pro Leu Leu Ser Ala His Ser Lys Thr

435 440 445

Gly Ser Arg Asp Cys Ser Thr Gln Thr Glu Arg Gly Thr Glu Ser Asn

450 455 460

Lys Thr Ala Ala Val Ala Pro Ile Ser Val Pro Ala Pro Val Ala Ala

465 470 475 480

Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ile Thr Ala Thr Ala Ala Thr Ile Thr Thr

485 490 495

Thr Met Val Ala Ala Ala Pro Val Ala Val Ala Ala Ala Ala Ala Pro

500 505 510

Ala Ala Ala Ala Ala Pro Ser Pro Ala Thr Ala Ala Ala Thr Ala Ala

515 520 525

Ala Val Ser Pro Ala Ala Ala Gly Gln Ile Pro Ala Ala Ala Ser Val

530 535 540

Ala Ser Ala Ala Ala Val Ala Pro Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val

545 550 555 560

Gln Val Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Val Pro Ala Pro Ala Leu Val

565 570 575

Pro Val Pro Ala Pro Ala Ala Ala Gln Ala Ser Ala Pro Ala Gln Thr

580 585 590

Gln Ala Pro Thr Ser Ala Pro Ala Val Ala Pro Thr Pro Ala Pro Thr

595 600 605

Pro Thr Pro Ala Val Ala Gln Ala Glu Val Pro Ala Ser Pro Ala Thr

610 615 620

Gly Pro Gly Pro His Arg Leu Ser Ile Pro Ser Leu Thr Cys Asn Pro

625 630 635 640

Asp Lys Thr Asp Gly Pro Val Phe His Ser Asn Thr Leu Glu Arg Lys

645 650 655

Thr Pro Ile Gln Ile Leu Gly Gln Glu Pro Asp Ala Glu Met Val Glu

660 665 670

Tyr Leu Ile

675

＜210＞ 3

＜211＞ 675

＜212＞ PRT

＜213＞ Homo sapiens

＜220＞

＜221＞ VARIANT

＜222＞ ()..)

＜223＞ Residue 135 = Asn, Ser or Asp

＜220＞

＜221＞ VARIANT

＜222＞ ()..(150)

＜223＞ Residues 148-150 = Glu-Leu-Ala or Thr-Thr-Pro

＜400＞ 3

Met Pro Arg Ala Gln Pro Ser Ser Ala Ser Tyr Gln Pro Val Pro Ala

1 5 10 15

Asp Pro Phe Ala Ile Val Ser Arg Ala Gln Gln Met Val Glu Ile Leu

20 25 30

Ser Asp Glu Asn Arg Asn Leu Arg Gln Glu Leu Glu Gly Cys Tyr Glu

35 40 45

Lys Val Ala Arg Leu Gln Lys Val Glu Thr Glu Ile Gln Arg Val Ser

50 55 60

Glu Ala Tyr Glu Asn Leu Val Lys Ser Ser Ser Lys Arg Glu Ala Leu

65 70 75 80

Glu Lys Ala Met Arg Asn Lys Leu Glu Gly Glu Ile Arg Arg Met His

85 90 95

Asp Phe Asn Arg Asp Leu Arg Glu Arg Leu Glu Thr Ala Asn Lys Gln

100 105 110

Leu Ala Glu Lys Glu Tyr Glu Gly Ser Glu Asp Thr Arg Lys Thr Ile

115 120 125

Ser Gln Leu Phe Ala Lys Xaa Lys Glu Ser Gln Arg Glu Lys Glu Lys

130 135 140

Leu Glu Ala Xaa Xaa Xaa Thr Ala Arg Ser Thr Asn Glu Asp Gln Arg

145 150 155 160

Arg His Ile Glu Ile Arg Asp Gln Ala Leu Ser Asn Ala Gln Ala Lys

165 170 175

Val Val Lys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Lys Lys Gln Val Tyr Val Asp

180 185 190

Lys Val Glu Lys Met Gln Gln Ala Leu Val Gln Leu Gln Ala Ala Cys

195 200 205

Glu Lys Arg Glu Gln Leu Glu His Arg Leu Arg Thr Arg Leu Glu Arg

210 215 220

Glu Leu Glu Ser Leu Arg Ile Gln Gln Arg Gln Gly Asn Cys Gln Pro

225 230 235 240

Thr Asn Val Ser Glu Tyr Asn Ala Ala Ala Leu Met Glu Leu Leu Arg

245 250 255

Glu Lys Glu Glu Arg Ile Leu Ala Leu Glu Ala Asp Met Thr Lys Trp

260 265 270

Glu Gln Lys Tyr Leu Glu Glu Asn Val Met Arg His Phe Ala Leu Asp

275 280 285

Ala Ala Ala Thr Val Ala Ala Gln Arg Asp Thr Thr Val Ile Ser His

290 295 300

Ser Pro Asn Thr Ser Tyr Asp Thr Ala Leu Glu Ala Arg Ile Gln Lys

305 310 315 320

Glu Glu Glu Glu Ile Leu Met Ala Asn Lys Arg Cys Leu Asp Met Glu

325 330 335

Gly Arg Ile Lys Thr Leu His Ala Gln Ile Ile Glu Lys Asp Ala Met

340 345 350

Ile Lys Val Leu Gln Gln Arg Ser Arg Lys Glu Pro Ser Lys Thr Glu

355 360 365

Gln Leu Ser Cys Met Arg Pro Ala Lys Ser Leu Met Ser Ile Ser Asn

370 375 380

Ala Gly Ser Gly Leu Leu Ser His Ser Ser Thr Leu Thr Gly Ser Pro

385 390 395 400

Ile Met Glu Glu Lys Arg Asp Asp Lys Ser Trp Lys Gly Ser Leu Gly

405 410 415

Ile Leu Leu Gly Gly Asp Tyr Arg Ala Glu Tyr Val Pro Ser Thr Pro

420 425 430

Ser Pro Val Pro Pro Ser Thr Pro Leu Leu Ser Ala His Ser Lys Thr

435 440 445

Gly Ser Arg Asp Cys Ser Thr Gln Thr Glu Arg Gly Thr Glu Ser Asn

450 455 460

Lys Thr Ala Ala Val Ala Pro Ile Ser Val Pro Ala Pro Val Ala Ala

465 470 475 480

Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ile Thr Ala Thr Ala Ala Thr Ile Thr Thr

485 490 495

Thr Met Val Ala Ala Ala Pro Val Ala Val Ala Ala Ala Ala Ala Pro

500 505 510

Ala Ala Ala Ala Ala Pro Ser Pro Ala Thr Ala Ala Ala Thr Ala Ala

515 520 525

Ala Val Ser Pro Ala Ala Ala Gly Gln Ile Pro Ala Ala Ala Ser Val

530 535 540

Ala Ser Ala Ala Ala Val Ala Pro Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val

545 550 555 560

Gln Val Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Val Pro Ala Pro Ala Leu Val

565 570 575

Pro Val Pro Ala Pro Ala Ala Ala Gln Ala Ser Ala Pro Ala Gln Thr

580 585 590

Gln Ala Pro Thr Ser Ala Pro Ala Val Ala Pro Thr Pro Ala Pro Thr

595 600 605

Pro Thr Pro Ala Val Ala Gln Ala Glu Val Pro Ala Ser Pro Ala Thr

610 615 620

Gly Pro Gly Pro His Arg Leu Ser Ile Pro Ser Leu Thr Cys Asn Pro

625 630 635 640

Asp Lys Thr Asp Gly Pro Val Phe His Ser Asn Thr Leu Glu Arg Lys

645 650 655

Thr Pro Ile Gln Ile Leu Gly Gln Glu Pro Asp Ala Glu Met Val Glu

660 665 670

Tyr Leu Ile

675

＜210＞ 4

＜211＞ 143

＜212＞ PRT

＜213＞ Homo sapiens

＜400＞ 4

Glu Ser Asn Lys Thr Ala Ala Val Ala Pro Ile Ser Val Pro Ala Pro

1 5 10 15

Val Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ile Thr Ala Thr Ala Ala Thr

20 25 30

Ile Thr Thr Thr Met Val Ala Ala Ala Pro Val Ala Val Ala Ala Ala

35 40 45

Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ala Pro Ser Pro Ala Thr Ala Ala Ala

50 55 60

Thr Ala Ala Ala Val Ser Pro Ala Ala Ala Gly Gln Ile Pro Ala Ala

65 70 75 80

Ala Ser Val Ala Ser Ala Ala Ala Val Ala Pro Ser Ala Ala Ala Ala

85 90 95

Ala Ala Val Gln Val Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Val Pro Ala Pro

100 105 110

Ala Leu Val Pro Val Pro Ala Pro Ala Ala Ala Gln Ala Ser Ala Pro

115 120 125

Ala Gln Thr Gln Ala Pro Thr Ser Ala Pro Ala Val Ala Pro Thr

130 135 140

＜210＞ 5

＜211＞ 31

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ oligonucleotide primer for PCR reaction

＜400＞ 5

tacggatccg aatcgaacaa aactgcagct g 31

＜210＞ 6

＜211＞ 32

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ oligonucleotide primer for PCR reaction

＜400＞ 6

atactcgagt catggagctg gagttggagc ca 32

＜210＞ 7

＜211＞ 22

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ oligonucleotide primer for PCR reaction

＜400＞ 7

gtttgacctg caatccagac aa 22

＜210＞ 8

＜211＞ 21

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ oligonucleotide primer for PCR reaction

＜400＞ 8

cccaggatct gaatgggagt t 21

＜210＞ 9

＜211＞ 25

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ oligonucleotide primer for PCR reaction

＜400＞ 9

cagatgggcc tgtgttccac tccaa 25

＜210＞ 10

＜211＞ 24

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ oligonucleotide primer for RACE PCR reaction

＜400＞ 10

gctgacagtt gccctgacgc tgct 24

＜210＞ 11

＜211＞ 24

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ oligonucleotide primer for RACE PCR reaction

＜400＞ 11

cggagacggt gctctagctg ctca 24

＜210＞ 12

＜211＞ 27

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ oligonucleotide primer for RACE PCR reaction

＜400＞ 12

tccttccaac tcttgcctca agttccg 27

＜210＞ 13

＜211＞ 24

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ oligonucleotide primer for RACE PCR reaction

＜400＞ 13

ggtggcagcg gacaggcagg atac 24

＜210＞ 14

＜211＞ 24

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ oligonucleotide primer for RACE PCR reaction

＜400＞ 14

gaggcggaga gaactaagag aaga 24

＜210＞ 15

＜211＞ 24

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ oligonucleotide primer for RACE PCR reaction

＜400＞ 15

gagcggagat ggaggagtaa ttca 24

Claims

플라스미노겐의 N-말단 단편을 결합시킬 수 있는 분리된 사람 맥관형성-관련 단백질.
제1항에 있어서, 플라스미노겐의 N-말단 단편이 플라스미노겐의 크링글 도메인 1 내지 4로 이루어진 단백질.
제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 2, 서열 3 또는 서열 4와 적어도 약 80% 이상의 서열 상동성, 바람직하게는 약 90% 이상의 서열 상동성, 보다 바람직하게는 약 95% 이상의 서열 상동성, 가장 바람직하게는 약 98% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질.
제3항에 있어서, 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질.
제3항에 있어서, 위치 135의 아미노산 잔기가 Asn, Ser 또는 Asp이고 위치 148 내지 150의 3개 아미노산 잔기가 트리펩타이드 Glu-Leu-Ala 또는 트리펩타이드 Thr-Trp-Pro인 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 단백질.
제3항에 있어서, 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 단백질.
플라스미노겐의 N-말단 단편을 결합시킬 수 있고, 서열 2의 5개 이상의 연속적인 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드.
제7항에 있어서, 서열 2의 10개 이상의 연속적인 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드.
제3항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 따르는 단백질 또는 펩타이를 암호화하는 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자.
제9항에 있어서, 제4항의 단백질을 암호화하는 분리된 핵산 분자.
제9항에 있어서, 제5항의 단백질을 암호화하는 분리된 핵산 분자.
제9항에 있어서, 제6항의 단백질을 암호화하는 분리된 핵산 분자.
제10항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 적어도 서열 1의 뉴클레오타이드 2177 내지 뉴클레오타이드 2608의 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자.
제9항에 있어서, 서열 1의 뉴클레오타이드 797 내지 뉴클레오타이드 2824의 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자.
제14항에 있어서, 서열 1의 서열로 이루어진 단백질.
제7항 또는 제8항에 따르는 펩타이드를 암호화하는 핵산 분자.
엄격한 조건하에 제9항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 따르는 핵산과 특이적으로 하이브리드화할 수 있는 핵산.
제9항 내지 제17항 중의 어느 한 항에 따르는 핵산을 포함하는 벡터.
제18항에 있어서, 플라스미드인 벡터.
제18항에 있어서, 바이러스인 벡터.
제18항의 벡터로 형질전환되거나 형질감염된 재조합 세포.
제3항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 따르는 단백질 또는 펩타이드를 특이적으로 결합시키는 항체 또는 항체 단편.
제22항에 있어서, 모노클로날 항체 또는 이의 단편인 항체.
약제로서 사용하기 위한 제22항 또는 제23항에 따르는 항체.
제22항 또는 제23항에 따르는 항체를 발현시키는 재조합 세포.
제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 따르는 단백질과 상호작용할 수 있는 화합물을 동정하기 위한 스크리닝 방법.
제26항의 스크리닝 방법에 의해 동정되는 화합물.
약제로서 사용하기 위한 제1항 내지 제8항 및 제27항 중의 어느 한 항에 따르는 단백질, 펩타이드 또는 화합물.
맥관형성-관련 질환 또는 장애용 약제 제조시의 제1항 내지 제8항 및 제27항 중의 어느 한 항에 따르는 단백질, 펩타이드 또는 화합물의 용도.
제1항 내지 제8항 및 제27항 중의 어느 한 항에 따르는 단백질, 펩타이드 또는 화합물을 약제학적으로 허용되는 담체와 배합된 상태로 포함하는 약제학적 제제.