ES2241352T3 - Proteinas superficiales externas, sus genes, y su utilizacion. - Google Patents
Proteinas superficiales externas, sus genes, y su utilizacion.Info
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Abstract
Péptido que comprende la secuencia aminoácida que se identifica en la presente memoria como SEC ID nº 12, que puede obtenerse a partir del Streptococcus del Grupo B, o un homólogo del mismo con una similitud superior al 80% al nivel de aminoácido, o un fragmento funcional del mismo que conserva la capacidad de provocar una respuesta inmune contra el péptido entero, para utilización terapéutica.
Description
Proteínas superficiales externas, sus genes, y su
utilización.
La presente invención se refiere a la
identificación de una proteína superficial externa y su gen, que
resulta útil en terapia, en la inmunización y en el rastreo de
fármacos.
El Streptococcus del grupo B (GBS),
también conocido como Streptococcus agalactiae, es el agente
que causa varias afecciones patológicas, en particular:
Esta infección empieza habitualmente in
utero y provoca ssepticemia grave y neumonía en los lactantes,
que resulta letal si no se trata y que incluso con tratamiento, se
asocia con un porcentaje de mortalidad de entre el 10 y el 20%.
Esta infección tiene lugar en el corto período de
tiempo que transcurre desde después del nacimiento hasta los 3
meses de edad. Provoca una septicemia, que se complica con
meningitis en el 90% de los casos. Asimismo, tienen lugar otras
infecciones focalizadas, que incluyen osteomielitis, artritis
séptica, abscesos y endoftalmitis.
Parecen ser habituales "in crescendo" y
tienen lugar muy frecuentemente en mujeres que acaban de dar a luz,
en las personas mayores y en los inmunodeprimidos. Se caracterizan
por septicemia e infecciones focales que incluyen osteomielitis,
artritis séptica, abscesos y endoftalmitis.
GBS es una causa de infecciones del tracto
urinario y en el embarazo representa el 10% aproximadamente de
todas las infecciones.
GBS causa mastitis crónica en las vacas. Esto, a
su vez, conduce a una producción reducida de leche y es por tanto
de una importancia económica considerable.
Las infecciones por GBS pueden tratarse con
antibióticos. Sin embargo, es preferible la inmunización. Es por
tanto deseable desarrollar un inmunógeno que pueda utilizarse en
una vacuna terapéuticamente efectiva.
La presente invención se basa en la
identificación de un gen en GBS y también en organismos
relacionados, cuyos productos están asociados con la superficie
externa del organismo y son por tanto útiles como dianas para
inmunoterapia.
Según un aspecto de la invención, un péptido es
codificado por el gen que se identifica en la presente memoria como
MS10, que puede obtenerse a partir del Streptococcus del
grupo B, o de un fragmento homólogo o funcional suyo. Dicho péptido
resulta apropiado para su utilización terapéutica, por ejemplo,
cuando se aísla.
El término "fragmentos funcionales" se
utiliza en la presente memoria para definir una parte del gen o del
péptido que conserva la actividad del gen o péptido enteros. Por
ejemplo, un fragmento funcional del péptido puede utilizarse como un
determinante antigénico, útil en una vacuna o en la producción de
anticuerpos.
Un fragmento génico puede utilizarse para
codificar el péptido activo. Alternativamente, el fragmento génico
puede tener utilidad en la terapia génica, dirigiendo el gen de
tipo salvaje in vivo para ejercer un efecto terapéutico.
Un péptido según la presente invención comprende
la secuencia aminoácida que se identifica en la presente memoria
como SEC ID nº 12, o un fragmento funcional de la misma.
A causa de la localización extracelular o
superficial celular, los péptidos de la presente invención
constituyen candidatos apropiados para la producción de vacunas
terapéuticamente efectivas contra GBS. El término
"terapéuticamente efectivas" tiene el propósito de incluir el
efecto profiláctico de las vacunas. Por ejemplo, una vacuna
comprende un péptido según la invención, o los medios para su
expresión, para el tratamiento de la infección.
Esta vacuna puede administrarse a hembras, bien
antes del embarazo, o durante el mismo, para proteger a la madre y
al recién nacido contra la infección por GBS.
Según otro aspecto de la invención, el péptido o
gen puede utilizarse para el rastreo de medicamentos
antimicrobianos potenciales o para la detección de la
virulencia.
Otro aspecto de la presente invención es la
utilización de cualquiera de los productos que se identifican en la
presente memoria, para el tratamiento o prevención de una afección
asociada con la infección por una cepa Estreptocócica del
Grupo B.
Aunque la proteína se ha descrito para su
utilización en el tratamiento de los pacientes, también se
considera que está dentro del alcance de la presente invención la
utilización veterinaria de los productos de ésta. En particular, los
péptidos o las vacunas pueden utilizarse en el tratamiento de la
mastitis crónica, especialmente en las vacas.
La presente invención se describe haciendo
referencia a la cepa Estreptocócica M732 del grupo B. Sin
embargo, es probable que todas las cepas GBS y muchas otras cepas
bacterianas incluyan péptidos o proteínas relacionados que poseen
una homología secuencial aminoácida con el péptido de M732.
Organismos que es probable que contengan los péptidos incluyen,
pero no se limitan a S. pneumoniae, S. pyogenes,
S. suis, S. milleri, Estreptococos del Grupo C
y Grupo G y Enterococos. Las vacunas para cada uno de estos
pueden desarrollarse de la misma manera que se describió para
GBS.
Preferentemente, los péptidos que pueden resultar
útiles para la producción de vacunas presentan una similitud
secuencial superior al 80% con el péptido que se identifica en la
presente memoria, por ejemplo, una similitud del 95%.
Habiéndose caracterizado el gen según la
invención, es posible utilizar la secuencia génica para establecer
homologías en otros microorganismos. De esta forma es posible
determinar si otros microorganismos tienen productos superficiales
externos similares. Las homologías secuenciales pueden establecerse
investigando en las bases de datos que existen, por ejemplo, EMBL o
Genbank.
Los péptidos o proteínas según la invención
pueden purificarse y aislarse mediante procedimientos que se
conocen en la técnica. En particular, habiendo identificado la
secuencia génica, se podrán utilizar las técnicas recombinantes para
expresar los genes en un huésped apropiado. Fragmentos activos y
homólogos pueden ser identificados y pueden resultar útiles en la
terapia. Por ejemplo, los péptidos o sus fragmentos activos pueden
utilizarse como determinantes antigénicos en una vacuna, para
provocar una respuesta inmunitaria. Asimismo, pueden utilizarse en
la preparación de anticuerpos, para inmunización pasiva o
aplicaciones diagnósticas. Los anticuerpos apropiados incluyen
anticuerpos monoclonales, o fragmentos de los mismos, incluyendo
fragmentos fv de cadena única. Los procedimientos para la
preparación de anticuerpos resultarán evidentes para los expertos
en la materia.
La preparación de vacunas basadas en
microorganismos atenuados es conocida por los expertos en la
materia. Las composiciones vacunales pueden formularse con
transportadores o adyuvantes apropiados, por ejemplo alumbre, si es
necesario o se desea, y ser utilizadas terapéuticamente, para
proporcionar una inmunización efectiva contra Estreptococos
del grupo B u otros microorganismos relacionados. La preparación de
formulaciones vacunales resultará evidente para el experto en la
materia.
Más generalmente, y como es bien conocido por los
expertos en la materia, puede seleccionarse una cantidad apropiada
de un componente activo de la invención, para su utilización
terapéutica, así como transportadores o excipientes apropiados y
vías de administración. Estos factores serán seleccionados o
determinados según criterios conocidos tales como la
naturaleza/gravedad de la afección que vaya a ser tratada, el tipo
o salud del individuo, etc.
Los productos de la presente invención se
identificaron de la forma siguiente:
El caldo de cultivo Todd-Hewitt
se inoculó con GBS y se dejó que éste se desarrollara durante la
noche a 37ºC. Las células se recogieron mediante centrifugación y se
lavaron con solución salina de tampón fosfato (PBS). Las células se
volvieron a suspender en un tampón osmótico (20% (peso/vol)
sacarosa, 20 mM Tris-HCl pH 7,0, 10 mM MgCl_{2})
que contenía inhibidores de la proteasa (1 mM PMSF, 10 \muM ácido
yodoacético, 10 mM 1,10-Fenantrolina, 1 \muM
Pepstatina A) y Mutanolisina con una concentración final de 4
Unidades por microlitro. Se sometió a incubación (agitación) a 37ºC
durante 2 horas.
Las células y los desechos se eliminaron primero
mediante centrifugación a gran velocidad, y a continuación mediante
ultracentrifugación durante 1 hora. El sobrenadante resultante que
contenía proteínas de la pared celular se concentró bajo presión
utilizando un dispositivo de ultrafiltración (límite de peso
molecular 10.000).
La muestra se dializó contra agua de calidad
ultra alta y se liofilizó. Después de la resuspensión en tampón de
carga, las proteínas se separaron mediante electroforesis
preparativa en gel bidimensional. Después de la electroforesis, se
escogió una mancha individual para estudio. La mancha se sometió a
digestión tríptica en el interior del gel. Los péptidos resultantes
se extrajeron del gel y se purificaron utilizando
RP-HPLC ("microbore"). Las fracciones se
recuperaron cada 45 segundos y una parte de estas, de acuerdo con
las regiones de absorbancia UV, se analizaron mediante el Tiempo de
desabsorción asistido por láser, de la matriz de extracción
retardada de la espectrometría de masas
(DE-MALDI-TOF-MS).
Los péptidos que no se observaron en una preparación en blanco, se
sometieron entonces a secuenciación utilizando
Nanospray-MS/MS.
Utilizando esta información secuencial peptídica,
se diseñaron oligonucleótidos degenerados para utilizarlos en una
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar el
segmento de ADN que se encontraba entre las secuencias peptídicas
identificadas.
La amplificación PCR condujo a la producción de
varios fragmentos polinucleótidos, cada uno de los cuales se clonó
en el vector pCR 2.1-TOPO (Invitrogen BV Holanda)
según el protocolo de los fabricantes.
El fragmento de ADN en cada plásmido se
identificó mediante secuenciación y se utilizó a continuación para
obtener la secuencia entera del gen, de la manera siguiente:
Utilizando el fragmento identificado de ADN, se
diseñaron iniciadores oligonucleótidos para la secuenciación del
ADN genómico. Estos iniciadores se diseñaron de forma que llevaran
a cabo la secuenciación en una dirección hacia fuera a partir de la
secuencia obtenida. Una vez leída, la secuencia obtenida se sometió
a chequeo para ver si los extremos 5' y 3' del gen se habían
alcanzado. La presencia de estas características se identificó
sometiendo a chequeo secuencias homólogas, y para el extremo 5', la
presencia de un codón de iniciación AUG (o una alternativa aceptada)
precedido por una secuencia de consenso
Shine-Dalgarno, y para el extremo 3', la presencia
de un codón de finalización (Stop) de la traducción.
Después de la identificación del gen completo, se
diseñaron iniciadores para la amplificación del producto entero a
partir del ADN genómico de GBS. Los iniciadores utilizados incluían
sitios de reconocimiento de la enzima de restricción (NcoI en el
extremo 5' y EcoO109I en el extremo 3') para permitir la clonación
subsiguiente del producto en el sistema de expresión Lactocócico
utilizado.
La PCR se llevó a cabo utilizando los
iniciadores, y los productos se clonaron en un vector de clonación
pCR 2.1 (In Vitrogen). Después de la confirmación de la presencia
del fragmento clonado, el ADN se extirpó utilizando los enzimas de
restricción NcoI y EcoO109I.
El vector en el cual este fragmento se insertó
fue una versión modificada de pNZ8048 (Kuipers, O. P. et al.
(1998) J. Biotech 64: 15-21). Este vector, que
alberga un origen lactocócico de replicación, un marcador de
resistencia del cloranfenicol, un promotor nisina inducible y un
sitio de multiclonación, fue alterado por el reemplazamiento del
sitio de multiclonación con dos marcadores 10X His, franqueados en
el extremo 5-más con un sitio NcoI, dividido en el
medio con un sitio de multiclonación (que incluye un sitio
EcoO109I), y un codón Stop (de finalización) en el extremo 3' de los
marcadores His.
El gen de interés se insertó de forma que un
marcador 10X His se encontraba en la posición 3' respecto a la
región codificante. Después de la transformación del plásmido
recombinante en L. lactis (cepa NZ9000 - Kuipers, O.P. et
al. (1998) supra), se estableció un cultivo líquido de
400 ml y se indujo la traducción de la proteína añadiendo nisina al
cultivo. Después de una incubación de 2 horas, las células se
recogieron y lisaron golpeando las perlas. El lisado resultante se
clarificó mediante centrifugación, y se hizo pasar entonces sobre
una columna con afinidad metálica (Talon, Clonetech). La columna se
lavó repetidamente antes de que las proteínas unidas se eluyeran
con
imidazol.
imidazol.
Para identificar las fracciones que contenían la
proteína recombinante marcada His, se analizó una alícuota de cada
fracción mediante SDS-PAGE, transferencia Western y
sondeo con anticuerpos anti-His.
La proteína recombinante obtenida se utilizó a
continuación para inmunizar conejos blancos New Zealand,
recuperándose suero preinmune antes de la inmunización. Después de
una revacunación, los conejos se sacrificaron y se recogió el suero.
Este suero se utilizó en transferencias Western, ELISA y modelos de
protección animal.
Utilizando los sueros obtenidos de los estudios
con animales, se llevaron a cabo estudios de inmunosorción.
Se hicieron crecer Streptococcus del Grupo
B en 20 ml de caldo de cultivo Todd Hewitt (THB) durante 8 horas,
recogiéndose y volviéndose a suspender en 5 ml de PBS. Alícuotas de
50 \mul de éste se utilizaron para cubrir los pocillos en una
placa con 96 pocillos (Nunc Immuno-Sorb). Ésta se
dejó a 4ºC por la noche para permitir la absorbancia de las
bacterias en la placa. Las placas se lavaron dos veces con PBS,
bloqueándose entonces con BSA al 3% en PBS durante 1 hora a 37ºC.
Las placas se lavaron otra vez. Se llevaron a cabo diluciones
décuples seriadas de los sueros en PBS, y 50 \mul de estas
diluciones se añadieron a los pocillos de la placa, por duplicado.
La placa se cubrió y se incubó durante 1 hora a 37ºC. La placa se
lavó, añadiéndose entonces a cada pocillo 50 \mul del anticuerpo
secundario conjugado con la fosfatasa alcalina
anti-conejo a una concentración de 1:5000. Después
de la incubación a 37ºC durante una hora, la placa se lavó otra vez.
50 \mul de substrato (PNPP) se añadieron a cada pocillo, y se
dejó que la reacción prosiguiera durante 30 minutos, antes de que
la absorbancia fuera leída a 405 nm.
Estudios de protección animal se llevaron a cabo
asimismo para ensayar la efectividad de protección sobre los
conejos inmunizados.
GBS M732 se hizo crecer en THB hasta que se
alcanzó la fase logarítmica media, aproximadamente en 5 horas. Las
células se contaron en una cámara de contaje, y las bacterias se
diluyeron para dar lugar a una concentración de 2 x 10^{7}
bacterias por ml en los sueros preinmunes o de ensayo. 50 \mul de
éste se inyectaron mediante la vía intraperitoneal en ratones de
entre 0 y 1 día de edad. Los ratones se observaron respecto a la
supervivencia durante 48 horas.
El siguiente Ejemplo ilustra la invención.
Un plásmido se denominó pMS10. El fragmento de
ADN clonado se secuenció. La secuencia nucleótida y la aminoácida
deducida (SEC ID nº 11 y nº 12) se utilizaron para investigar bases
de datos de proteínas.
Homólogos para el producto del gen MS10 de GBS
pueden identificarse en Streptococcus mutans, Nicotiana plumb,
Pisum sativum y Zea mays. En todos los casos los
homólogos son los genes para la
Gliceraldehído-3-Fosfato
Deshidrogenasa NADP dependiente, no fosforilizante
(NPGAP-3-DH). Se ha informado que
NPGAP-3-DH constituye un medio
importante de generar NADPH para las reacciones biosintéticas en
S. mutans (opuesto al
GAP-3-DH NAD específico que
satisface los requerimientos de la vía glicolítica) (Boyd, D.A.,
Cvitkovitch, D. G. y Hamilton, I.R. 1995 J. Bacteriol.
177:2622-2727).
<110> Microscience Limited
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<120> Proteínas superficiales externas, sus
genes, y su utilización
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<130> REP05969WO
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<141>
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<160> 12
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<170> PatentIn versión 2.1
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<210> 1
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<211> 1014
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<400> 12
Claims (10)
1. Péptido que comprende la secuencia aminoácida
que se identifica en la presente memoria como SEC ID nº 12, que
puede obtenerse a partir del Streptococcus del Grupo B, o un
homólogo del mismo con una similitud superior al 80% al nivel de
aminoácido, o un fragmento funcional del mismo que conserva la
capacidad de provocar una respuesta inmune contra el péptido
entero, para utilización terapéutica.
2. Polinucleótido que codifica un péptido según
la reivindicación 1, para utilización terapéutica.
3. Vacuna que comprende un péptido según la
reivindicación 1.
4. Utilización de un producto según la
reivindicación 1 ó 2, para el rastreo de fármacos antimicrobianos
potenciales.
5. Utilización de un producto según la
reivindicación 1 ó 2, destinado a la preparación de un medicamento
para su utilización en el tratamiento o prevención de una afección
asociada a una infección bacteriana.
6. Utilización según la reivindicación 5, en la
que la infección es una infección estreptocócica del Grupo
B.
7. Utilización según la reivindicación 5 ó 6, en
la que la infección es una infección focal.
8. Utilización según la reivindicación 5 ó 6, en
la que la infección es una infección del tracto urinario.
9. Anticuerpo que se une específicamente a la
secuencia identificada en la presente memoria como SEC ID nº 12.
10. Utilización del péptido definido en la
reivindicación 1, para aumentar los anticuerpos.
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