CZ20012174A3 - Vnějąí povrchové proteiny, jejich geny a jejich pouľití - Google Patents

Description

(57) Anotace:

Byla identifikována série genů ve Streptococcus skupiny B, jejichž produkty mohou být lokalizovány na vnějším povrchu organismu. Geny nebo jejich funkční fragmenty mohou být užitečné při přípravě terapeutických prostředků, například vakcín pro imunizaci pacientů proti mikrobiální infekci.

Vnější povrchové proteiny, jejich geny a jejich použití

Oblast techniky

Vynález se týká identifikace vnějších povrchových proteinů, jejich genů a jejich použití. Zvláště se vynález týká jejich použití v terapii, pro imunizaci a screening léků.

Dosavadní stav techniky

Skupina B rodu Streptococcus (GBS), také známá jako Streptococcus agalactiae, je příčinou různých chorobných stavů. Konkrétně GBS způsobuje následující stavy:

Časná neonatální infekce

Tato infekce obvykle začíná v děloze a způsobuje vážnou otravu krve a zápal plic dětí, pokud není léčena, je letální a dokonce je-li léčena, je stále spojena s 10 až 20% stupněm úmrtnosti.

Pozdní neonatální infekce

Tato infekce se vyskytuje v období časně po porodu do stáří asi 3 měsíců. Způsobuje otravu krve, která je v 90 % případů komplikována meningitidou. Doprovází ji často další fokální infekce, včetně zánětu kosti a kostní dřeně, septické arthritidy, abscesů a endoftalmitidy.

Infekce dospělých

Tyto infekce se stávají stále častějšími a vyskytují se hlavně u žen, které právě porodily, starších a s poruchami imunity. Jsou charakterizovány otravou krve a fokálními infekcemi včetně zánětu kosti a kostní dřeně, septické arthritidy, abscesů a endoftalmitidy.

Infekce močového traktu

GBS jsou příčinou infekcí močového traktu a v těhotenství zapříčiňují asi 10 % všech infekcí.

Veterinární infekce

GBS způsobují chronickou mastitidu u krav. Ta vede ke snížené produkci mléka a je tedy velmi závažná z ekonomického hlediska.

···· ·· ·♦ ♦· — — , . , . . · · · · · · • · · · .·.· · · · ,, ·· ·* ·· ·· ♦·

GBS infekce mohou být léčeny antibiotiky. Imunizace je však výhodnější. Je tedy žádoucí vyvinout imunogen, který by mohl být použit v terapeuticky efektivní vakcíně.

Podstata vynálezu

Vynález je založen na identifikaci série genů GBS a také příbuzných organismů, jejichž produkty mohou být spojovány s vnějším povrchem organismu a mohou být tedy použity jako cíl imunoterapie.

Podle jednoho aspektu vynálezu je peptid kódován operonem obsahujícím kterýkoli z genů zde identifikovaných jako MS4, MS10, MS11, MS14 a MS16, které lze získat ze skupiny B rodu Streptococcus, nebo jejich homolog nebo jejich funkční fragment. Takový peptid je vhodný pro terapeutické použití, je-li izolován.

Termín „funkční fragmenty“ je zde použit pro definování části genu nebo peptidu, která si zachovala aktivitu celého genu nebo peptidu. Například může být funkční fragment peptidu použit jako antigenní determinant použitelný jako vakcína, nebo pro produkci protilátek.

Genový fragment může být použit pro kódování aktivního peptidu. Případné může mít genový fragment použití v genové terapii, se zacílením na gen divokého typu in-vivo k uplatnění terapeutického účinku.

Peptid podle vynálezu může zahrnovat kteroukoli z aminokyselinových sekvencí identifikovaných zde jako SEKV. ID. ČÍS. 2, 4, 6, 8, 10 a 12, nebo jejich funkční fragmenty.

Protože peptidy podle vynálezu jsou lokalizovány extracelulárně nebo na buněčném povrchu, mohou být vhodnými kandidáty pro produkci terapeuticky účinných vakcín proti GBS. Termín „terapeuticky účinný“ má zahrnovat profylaktický účinek vakcín. Například může vakcína obsahovat peptid podle vynálezu nebo prostředky pro jeho expresi pro léčbu infekcí.

Tato vakcína může být podávána ženám buď před nebo v průběhu těhotenství pro ochranu matky a plodu proti infekci GBS.

Podle dalšího aspektu vynálezu mohou být peptidy nebo geny použity pro screening potenciálních antimikrobiálních léků nebo pro detekci virulence.

• ·

Dalším aspektem vynálezu je použití některého ze zde uvedených produktů pro léčbu nebo prevenci stavů spojených s infekcí kmenem Streptococcus skupiny B.

Ačkoli byl protein popsán pro léčbu lidí, veterinární použití produktů podle vynálezu je považováno za spadající do rozsahu vynálezu. Zvláště mohou být peptidy nebo vakcíny použity pro léčbu chronické mastitidy, a to zejména u krav.

Popis vynálezu

Vynález je popsán s odkazem na kmen Streptococcus skupiny Β M732. Všechny kmeny GBS a mnoho dalších bakteriálních kmenů však pravděpodobně obsahují příbuzné peptidy nebo proteiny s aminokyselinovými sekvencemi homologickými s peptidem M732. Organismy, které pravděpodobně obsahují tyto peptidy, zahrnují, ale nejsou omezeny na S. pneumoniae, S. pyogenes, S. suis, S. milleri, Streptococci skupin C a G a Enterococci. Vakcíny proti uvedeným bakteriím mohou být připraveny stejným způsobem, jako je popsáno pro GBS.

S výhodou mají peptidy, které mohou být použity pro produkci vakcín, větší než 40% sekvenční podobnost se zde identifikovanými peptidy. Ještě výhodněji mají tyto peptidy větší než 60% sekvenční podobnost. Nejvýhodněji mají tyto peptidy větší než 80% sekvenční podobnost, například 95% podobnost.

Po charakterizaci genu podle vynálezu je možné použít sekvenci genu a určit homologie s jinými mikroorganismy. Tak je možné určit, zda další mikroorganismy mají na vnějším povrchu podobné produkty. Sekvenční homologie mohou být stanoveny prohledáváním existujících databází, například EMBL nebo Genbank.

Peptidy nebo proteiny podle vynálezu mohou být čištěny a izolovány metodami dobře známými odborníkům v oboru. Zvláště pak, identifikujeme-li genové sekvence, je možné užít rekombinantních technik pro expresy genů ve vhodném hostiteli. Aktivní fragmenty a homology mohou být identifikovány a mohou být užitečné v terapii. Například peptidy nebo jejich aktivní fragmenty mohou být použity jako antigenní determinanty ve vakcínách k vyvolání imunitní odpovědi. Mohou být rovněž použity pro přípravu protilátek, pro pasivní imunizaci nebo diagnostické aplikace. Vhodné protilátky zahrnují monoklonální protilátky nebo jejich fragmenty, včetně jednořetězcových Fv fragmentů. Způsoby přípravy protilátek jsou odborníkům v oboru známé.

Příprava vakcín založených na oslabených mikroorganismech je odborníkům v oboru známa. Kompozice vakcín mohou být formulovány s vhodnými nosiči nebo pomocnými látkami, např. ledkem, je-li to nezbytné nebo žádoucí, pro poskytnutí efektivní imunizace proti Streptococci skupiny B nebo jiným příbuzným mikroorganismům. Příprava formulací vakcíny je odborníkům v oboru známá.

Obecněji, což je rovněž dobře známo odborníkům v oboru, může být zvoleno vhodné množství aktivní komponenty podle vynálezu pro terapeutické použití, stejně jako nosiče nebo masťové základy a způsoby podání. Tyto faktory budou zvoleny nebo stanoveny podle známých kritérií jako je např. povaha/závažnost léčeného stavu, typ nebo zdravotní stav subjektu atd.

Produkty podle vynálezu byly identifikovány následovně:

Todd-Hewitt živná půda byla naočkována GBS a nechala se růst přes noc při 37 °C. Buňky byly sklizeny centrifugací a promytím fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (PBS). Buňky byly znovu suspendovány v osmotickém pufru (20% (hmotn./obj.) sacharóza, 20mM Tris-HCI pH 7,0, 10mM MgCI₂) obsahujícím inhibitory proteáz (1mM PMSF, 10 μΜ kyselina jodoctová, 10mM 1,10-fenantrolin, 1μΜ pepstatin A) a Mutanolysin v konečné koncentraci 4 jednotky na mikrolitr. To bylo inkubováno (při třepání) při 37 °C 2 hodiny.

Buňky a jejich zbytky byly odstraněny nejprve vysokorychlostní centrifugací a poté ultracentrifugací po dobu 1 hodiny. Výsledný supernatant obsahující proteiny buněčné stěny byl zakoncentrován za zvýšeného tlaku pomocí ultrafiltračního zařízení (hrana molekulových hmotností 10 000).

Vzorek byl dialyzován proti vodě vysoké čistoty a lyofilizován. Po opětovném suspendování v nanášecím pufru byly proteiny separovány pomocí preparativní dvojrozměrné gelové elektroforézy. Po elektroforéze byla vybrána samostatná skvrna pro studium. Skvrna byla podrobena in-gel štěpení trypsinem. Výsledné peptidy byly extrahovány z gelu a čištěny pomocí RP-HPLC s mikro-otvory. Frakce byly sbírány každých 45 sekund a ta jejich část, která odpovídala oblastem UV absorbce, byla analyzována pomocí Delayed Extraction-Matrix Assisted Laser Desorbtion Time of Flight Mass Spectroscopy (zpožděná laserová desorpce s pomocí extrakční matrice - průletová hmotnostní spektrometrie). Peptidy, které nebyly pozorovány v blanku, byly poté sekvencovány pomocí Nanospray-MS/MS.

S využitím informace o sekvenci peptidů byly navrženy degenerované oligonukleotidy jako primery pro polymerasovou řetězovou reakci (PCR) pro amplifikaci DNA úseku ležícího mezi identifikovanými peptidovými sekvencemi.

Výsledkem PCR amplifikace bylo vytvoření několika polynukleotidových fragmentů, které byly klonovány do pCR 2.1-TOPO vektoru (Invitrogen BV, Nizozemí) podle doporučení výrobce.

DNA fragment v každém z plasmidů byl identifikován sekvencováním a poté použit pro získání celé délky genové sekvence následujícím způsobem.

Pomocí identifikovaného DNA fragmentu byly vytvořeny oligonukleotidové primery pro sekvencování genomové DNA. Tyto příměry byly navrženy tak, aby sekvencování probíhalo ve směru ven od získané sekvence. Poté bylo ověřeno, jestli v získané sekvenci bylo dosaženo 5' a 3' konce genu. Přítomnost těchto znaků byla zjištěna porovnáním s homologickými sekvencemi, a v případě konce 5' byla zkontrolována přítomnost startovacího kodonu (nebo jeho přijatelné alternativy), jemuž předcházela Shineova-Dalgarnova konvenční sekvence, a v případě konce 3'byla zkontrolována přítomnost kodonu terminace translace (stop kodon).

Na základě identifikace genu plné délky byly navrženy primery pro amplifikaci produktu plné délky z GBS genomické DNA. Použité primery zahrnují rozpoznávací místa pro restrikční enzymy (Ncol na 5' konci a Eco0109l na 3' konci) pro umožnění následného klonování produktu do použitého Lactococcal expresního systému.

PCR bylo provedeno pomocí těchto primerů a produkty byly klonovány do pCR 2.1 klonovacího vektoru (In Vitrogen). Po ověření přítomnosti klonovaného fragmentu byla DNA vystřižena pomocí restrikčních enzymů Ncol a Eco0109l.

Vektor, do kterého byl tento fragment vložen, byl modifikovanou verzí pNZ8048 (Kuipers, O.P. a kol. (1998) J. Biotech 64: 15-21). Tento vektor, nesoucí laktokokální počátek replikace, resistenci k chloramfenikolu, inducibilní promotor nisinu a multiklonovací místo, byl upraven nahrazením části multiklonovacího místa dvěma volnými konci 10X His, ohraničenými na 5' konci Ncol místem, přerušeným uprostřed multiklonovacím místem (zahrnujícím EcoO109l místo), a na 3' konci stop (terminačním) kodonem volného konce His.

Zkoumaný gen byl vložen tak, že volný konec 10x His byl na 3' konci vzhledem ke kódující oblasti.

• · · ·

Po transformaci rekombinantního plasmidu do L.lactis (kmen NZ9000 - Kuipers, O.P. a kol. (1998), viz výše) bylo připraveno 400 ml tekuté kultury a translace proteinu byla indukována přídavkem nisinu do kultury. Po 2 hodinách inkubace byly buňky sklizeny a lyžovány třepáním se skleněnými mikrokuličkami. Výsledný lyzát byl vyčištěn centrifugací, poté nanesen na afinitní kolonu s imobilizovaným iontem kovu (Talon, Clonetech). Kolona byla promyta opakovaně a poté byl vázaný protein eluován imidazolem.

Pro identifikaci frakcí obsahujících His-zakončený rekombinantní protein byl z každé frakce odebrán alikvot a analyzován pomocí SDS-PAGE, Western blotu a identifikován anti-His protilátkou.

Získaný rekombinantní protein byl poté použit pro imunizaci novozélandských bílých králíků, před imunizací bylo odebráno pre-imunní sérum. Po propagaci byli králíci utraceni a bylo odebráno sérum. Toto sérum bylo použito pro Western bloty, ELISA a modely ochrany zvířat.

S použitím séra získaného z pokusů se zvířaty byly prováděny studie pomocí imunosorbce.

Streptococcus skupiny B byl pěstován ve 20 ml Todd Hewittovy živné půdy (THB) 8 hodin, sklizeny a opětovně suspendovány v 5 ml PBS. 50μΙ alikvoty byly použity pro pokrytí jamek 96-jamkové destičky (Nunc Immono-Sorb). Destička byla ponechána přes noc při 4 °C, aby došlo k adsorpci bakterií na destičku. Destičky byly dvakrát promyty PBS, poté blokovány 3% BSA v PBS 1 hodinu při 37 °C. Destičky byly znovu promyty. Byla připravena desetinná ředění séra v PBS a 50 μΙ těchto ředění byla přidána do jamek vždy dvojmo. Destičky byly zakryty a inkubovány 1 hodinu při 37 °C. Destičky byly promyty, poté bylo přidáno do každé jamky 50 μ) anti-králičí sekundární protilátky konjugované s alkalickou fosfatázou v koncentraci 1 : 5000. Po inkubaci při 37 °C 1 hodinu byla destička znovu promyta. 50 μΙ substrátu (PNPP) bylo přidáno do každé jamky a reakce probíhala 30 minut a poté byla změřena absorbance při 405 nm.

Pro testování efektivity ochrany zvířat byly prováděny studie na imunizovaných králících.

GBS M732 byl nepěstován na THB do střední logaritmické fáze, tj. asi 5 hodin. Buňky byly spočítány v počítací cele a bakterie byly naředěny na koncentraci

2x10⁷ bakterií na ml v pre-imunním nebo testovacím séru. 50 μΙ této suspenze bylo injektováno intraperitoneálně 0-1 den starým myším. Přežívání myší bylo pozorováno 48 hodin.

Následující příklady ilustrují vynález.

Příklad 1

První plasmid byl označen MS4. Klonovaný fragment DNA byl sekvencován a nukleotidová a odvozená aminokyselinová sekvence (SEQ ID č. 1 a 2) byla použita pro prohledávání proteinových databází.

Homology GBS MS4 genového produktu mohou být identifikovány u Clostridium perfingens, Haemophilus influenzae, Neisseria flavescens a Thermatoga marítima. Ve všech případech jsou homology geny pro omitinkarbamoyltransferázu (OCT). V eukariotických systémech tento enzym katalyzuje druhý krok v močovinovém cyklu, konverzi ornitinu na citrulin, reakci vyžadující karbamoylfosfát. U prokaryot je OCT jedním ze třech enzymů účastnících se arginindeaminázové aktivity systému, který chrání bakterii před poškozením kyselinou. Konkrétně je OCT zodpovědná za konverzi citrulinu na ornitin a karbamoylfosfát (opačný směr v porovnání s eukaryoty) (Casiano-Colon, A a Marquis, R. E. 1988. Appl. Environ. Microbiol. 54: 1318-1324, Cunin, R. a kol. 1986. Microbiol. Rev. 50: 314-352).

Studie ochrany zvířat byly prováděny jak bylo popsáno výše. Výsledky byly následující:

Léčba	počet mláďat	počet mláďat přežívajících v daném čase
24 hodin	48 hodin
PBS	15	6	0
Pre-imunní	41	18	1
Test	41	33	14

Příklad 2

Druhý plasmid byl označen MS11. Nukleotidová a odvozená aminokyselinová sekvence (SEQ ID č. 3 a 4) byly použity pro prohledávání databází.

Homology GBS MS11 genového produktu mohou být identifikovány u Lactobacilus delbrueckii, Thermotoga maritima, Clostridium acetobutylicum, Bacillus megaterium, Triticum aestivium a Synechocystis PCC6803.

Ve všech případech byly homology geny pro protein fosfoglycerátkinázu (PGK). PGK je hlavním enzymem v glykolytické dráze, který se účastní konverze glyceraldehyd-3-fosfátu na fosfoenolpyruvát. Konkrétně se účastní katalýzy reakce mezi glycerát-1,3-difosfátem a 3-fosfoglycerátem za uvolnění fosfátu v reakci probíhající vpřed.

Příklad 3

Třetí plasmid byl označen pMS16. 5' a 3' klonované fragmenty DNA byly sekvencovány a nukleotidové a odvozené aminokyselinové sekvence pro každý z nich jsou označeny pod čísly SEQ ID č. 5 a 6 pro 5' fragment a SEQ ID č. 7 a 8 pro 3' fragment).

Homology GBS MS16 genového produktu mohou být identifikovány u Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis a Mycoplasma genitalium.

Ve všech případech byly homology geny pro protein glukóza-6-fosfátizomeráza (GPI).

Enzym glukóza-6-fosfátizomeráza katalyzuje reakci mezi glukóza-6-fosfátem a fruktóza-6-fosfátem jak při glykolýze (G6P na F6P), tak glukoneogenezi (F6P na G6P). Bylo dokázáno, že mutace v gpi genu dodávají sensitivitu organismu vůči analogům purinu.

Příklad 4

Čtvrtý plasmid byl označen pMS14. Fragment klonované DNA byl sekvencován a nukleotidová odvozená aminokyselinová sekvence (SEQ ID č. 9 a 10) byly použity pro prohledávání databází.

Homology GBS MS14 genového produktu mohou být identifikovány u Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus, Mus musculus, Bos taurus a Zea mays. Ve všech případech jsou homology geny pro protein purinnukleosidfosfatázy (PNP).

Funkcí tohoto enzymu je štěpit nukleosidy guanosin nebo inosin na jejich příslušné molekuly báze a cukr-1 -fosfáty v přítomnosti ortofosfátu.

Příklad 5

Pátý plasmid byl označen pMS10. Fragment klonované DNA byl sekvencován a nukleotidová odvozená aminokyselinová sekvence (SEQ ID č. 11 a 12) byly použity pro prohledávání databází.

Homology GBS MS10 genového produktu mohou být identifikovány u Streptococcus mutans, Nicotiana plumb, Pisum sativum a Zea mays. Ve všech případech jsou homology geny pro protein nefosforylující, NADP-dependentní glyceraldehyd-3fosfát dehydrogenázy (NPGAP-3-DH). NPGAP-3-DH je považována za důležitý prostředek ke generování NADPH pro biosyntetické reakce u S. mutans (na rozdíl od NAD-specifické GAP-3-DH, která splňuje požadavky glykolytické cesty) (Boyd, D.A., Cvitkovitch, D.G. a Hamilton, I. R. 1995 J. Bacteriol. 177: 2622-2727).

Claims (12)

1. Peptid kódovaný operonem obsahujícím kterýkoli z genů zde identifikovaných jako MS4, MS10, MS11, MS14 a MS16, které je možno získat ze skupiny B rodu Streptococcus, nebo jeho homology nebo jeho funkční fragment.

2. Peptid podle nároku 1, zahrnující kteroukoli z aminokyselinových sekvencí identifikovaných jako SEQ ID NOS. 2, 4, 6, 8, 10 a 12.

3. Peptid podle nároků 1 nebo 2 pro terapeutické užití.

4. Polynukíeotid kódující peptid podle nároku 1 nebo 2 pro terapeutické užití.

5. Hostitel transformovaný tak, aby exprimoval peptid podle nároku 1 nebo 2.

6. Vakcína obsahující peptid podle nároku 1 nebo 2 nebo prostředky pro jeho expresi.

7. Použití produktu podle kteréhokoli z nároků 1 až 5 pro screening potenciálních léků nebo pro detekci virulence.

8. Použití produktu podle kteréhokoli z nároků 1 až 5 pro výrobu léčiva pro použití v léčbě nebo prevenci stavů spojených s bakteriální infekcí.

9. Použití podle nároku 8, kde tato infekce je infekce bakteriemi skupiny B rodu Streptococcus.

10. Použití podle nároku 8 nebo 9, kde tato infekce je infekce fokální.

11. Použití podle nároku 8 nebo 9, kde tato infekce je infekce močového traktu.

12. Protilátka vypěstovaná proti peptidu podle nároku 1 nebo 2.