ES2230555T3 - Vacuna acelular. - Google Patents
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Abstract
SE DESCRIBE UNA VACUNA ACELULAR QUE PROPORCIONA PROTECCION CONTRA LAS INFECCIONES POR BORDETELLA PERTUSSIS. LA VACUNA SE BASA EN LA COMBINACION SINERGICA DE DOS ANTIGENOS DE B. PERTUSSIS, UN ANTIGENO DE 69 KDA Y UN ANTIGENO FILAMENTOSO DE HEMAGLUTININA.
Description
Vacuna acelular.
La presente invención se relaciona con
composiciones vacunales acelulares de Bordetella
pertussis.
Bordetella pertussis causa una grave y
debilitante enfermedad en humanos, siendo los niños particularmente
susceptibles, que se mantiene bajo control en los países
desarrollados mediante programas de inmunización a gran escala. Se
ha visto que la inmunización es un factor muy importante en la
reducción de la enfermedad y que el fallo en la vacunación puede dar
lugar a una mayor incidencia de la enfermedad. Prácticamente en
todas las áreas, la inmunización es efectuada usando una vacuna de
células enteras de B. pertussis que ha resultado ser
relativamente efectiva en la prevención de la enfermedad. Sin
embargo, recientemente, la preocupación sobre las reacciones
adversas a las vacunas ha llevado a una menor aceptación de las
vacunas y a un debate acerca de su uso continuado.
Algunas de las reacciones adversas observadas
incluyen fiebre, reacciones locales y chillidos persistentes. La
incidencia de fiebre y de chillidos persistentes ha sido estimada
en un 7% de los pacientes (Wardlaw y col., Medical Microbiology,
Vol. 2, Immunisation against Bacterial Disease, 1983).
Con la baja incidencia actual de la enfermedad en
los países desarrollados con los programas de inmunización, la razón
beneficio/riesgo está pobremente definida y muchos clínicos creen
que el riesgo de inoculación supera a los beneficios obtenidos
gracias a la inmunización. Como resultado de ello, muchos niños no
son inoculados y existe ahora, en consecuencia, un riesgo de
pandemia de tos ferina. Ciertamente, en los últimos años ha
aumentado la incidencia de la tos ferina y la morbilidad infantil
resultante, al haber disminuido el uso de la vacuna de células
enteras. Se ha dirigido, por lo tanto, un considerable esfuerzo de
investigación hacia el desarrollo de vacunas pertussis mejoradas y,
especialmente, de vacunas acelulares que carezcan de los
componentes asociados a los efectos tóxicos de las vacunas de
células enteras, que han causado estas preocupaciones, incorporando
al mismo tiempo los componentes necesarios para proteger frente a
la enfermedad.
La búsqueda de una vacuna de B. pertussis
acelular más segura y efectiva se ha visto obstaculizada, en parte,
por la escasez de información en cuanto a la identidad y a los
mecanismos de acción de los restos patógenos, tóxicos y protectores
de B. pertussis contenida en las vacunas de células enteras.
Se ha concentrado, por lo tanto, el trabajo en el aislamiento y la
purificación de 20 ó más antígenos de superficie del organismo B.
pertussis y en la caracterización de su capacidad para inducir
reacciones inmunes (véase, por ejemplo, J. Am. Med. Soc.,
248 (1), 22-23). Como ejemplos de antígenos
que se han sugerido para investigación, se incluyen el factor
promotor de la linfocitosis (toxina pertussis/LPF), la hemaglutinina
filamentosa (FHA), el lipopolisacárido (LPS), los aglutinógenos, la
toxina dermonecrótica (DNT), las toxinas termolábiles y
termoestables, el factor inhibidor de los leucocitos
polimorfonucleares, la adenilato ciclasa y otros componentes
superficiales. Otros antígenos candidatos propuestos para
investigación incluyen la citotoxina traqueal y diversas proteínas
de la membrana externa.
L. Pillemer (Proc. Soc. Exp. Biol. Med. (1950),
75, 704-705) desarrolló una vacuna de
extracto precoz que se basaba en células rotas de B.
pertussis y que resultó proporcionar protección, pero que no fue
adooptada comercialmente debido la toxicidad de la
preparación.
Como ejemplos de vacunas más recientes de
extractos de B. pertussis que han sido sugeridas, se incluyen
las descritas en la Descripción de la Patente UK 2.083.358A
(Takeda), que conllevan la eliminación de la endotoxina de los
sobrenadantes de cultivo; en la Descripción de la Patente Francesa
2.047.886 (Institut Mérieux), que conlleva la extracción de una
suspensión microbiana con un surfactante aniónico; y en la
Descripción de la Patente Japonesa 58-222032
(Teijin), que consiste en una vacuna de proteínas subunitarias
basada en la toxina pertussis
(LPF).
(LPF).
Gran parte del trabajo llevado a cabo sobre las
vacunas pertussis acelulares se concentra en la posibilidad de
basar dicha vacuna en LPF. Sin embargo, se cree que algunos de los
efectos adversos hasta la fecha observados como asociados a la
vacunación pertussis están relacionados con la toxina. En
combinación con el toxoide del tétanos o de la difteria y LPS, es
capaz de inducir encefalopatía experimental en ratones susceptibles
(L. Steinman y col., Nature (1982), 299,
738-740; Redhead y col., Workshop on B.
pertussis, Nat. Inst. of Biol. Standards & Controls, Holy
Hill, Hampstead, London, 1983). Así, algunos clínicos creen que el
LPF puede ser posiblemente responsable de lesiones cerebrales, en
caso de que dichas complicaciones aparezcan tras la vacunación.
No obstante, los estudios realizados hasta la
fecha han generado datos que han conducido a una creencia general de
que el LPF es una parte esencial de cualquier vacuna acelular
(Bacterial Vaccines, 1984, Capítulo 3, Manclark y col., Editor
Germanier).
Se ha estudiado una nueva vacuna acelular,
actualmente disponible en Japón, en pruebas clínicas controladas en
Suecia. Esta vacuna incluye la toxina pertussis (LPF) y FHA o LPF
solo (Lancet, 1. 995, 1988). Sin embargo, esta vacuna ha
demostrado no ser tan efectiva como una vacuna de células enteras,
dando sólo una protección de aproximadamente el 69%.
Aparte del pobre efecto protector, se produjeron
tres muertes en el grupo de la vacuna basada en toxina, que pueden
estar posiblemente asociadas a la vacuna. Considerando todos estos
datos, las Autoridades Sanitarias Suecas se negaron a autorizar
esta así llamada "Vacuna Japonesa" en Suecia.
Esta prueba clínica, sin embargo, es una
ilustración de la creencia de que el antígeno LPF es un componente
esencial de la vacuna, ya que se ha sugerido que la tos ferina es
una enfermedad mediada por toxina y que la protección de ratones en
la prueba de protección de ratones frente a pertussis sólo depende
de la presencia de un LPF activo en la preparación (Pittman, M.,
1984: The Concept of Pertussis as A Toxin-Mediated
Disease, Pediatric Infection Disease, 3,
467-486). Se cree que estas suposiciones son
incorrectas.
La hemaglutinina filamentosa (FHA) es una
proteína que tiene un peso molecular de entre 107 y 130 kDa y
aparece como filamentos al microscopio electrónico. Es una
hemaglutinina la que es inhibida por el colesterol.
Muchos grupos de investigación han sugerido que
la FHA puede ser un importante inmunógeno y candidato vacunal. (Para
una revisión, véase Bacterial Vaccines, 1984, Capítulo 3, Manclark
y col., Editor Germanier). Nuestros datos muestran, sin embargo,
que la FHA sola sólo proporciona una protección mínima.
El antígeno de 69 kDa de pertussis es una
proteína de la membrana externa que es termoestable y puede ser
preparada por métodos conocidos en la técnica (véase EP0162639). El
uso de 69 kDa por sí solo no es tan eficaz como la vacuna de
células enteras.
De Magistris y col. (J. Exp. Med.,
168, 1351-1362 (1998)) describe el resultado
de un estudio para investigar las respuestas humorales y celulares
en adultos que habían sufrido de pertussis en la niñez. Se
obtuvieron clones de células T.
El presente inventor ha visto que la vacuna 69
kDa/FHA es más potente que 69 kDa/LPF y al menos tan potente, si no
más, que la vacuna de células enteras. La combinación de 69 kDa y
FHA es ventajosa, ya que no se requiere el LPF y, en consecuencia,
se reducen las posibilidades de efectos adversos. Adicionalmente,
una vacuna bivalente que contenga sólo 69 kDa y FHA será claramente
más segura y barata de fabricar que una vacuna trivalente que
contenga también LPF.
Aparte de eso, mediante una combinación apropiada
de antígenos pertussis, la dosis efectiva igual de la combinación
sugerida es hasta 15 veces menor que, por ejemplo, la de una
combinación de la proteína 69 kDa y LPF.
Por lo tanto, según la presente invención, se
presenta una vacuna acelular consistente en el antígeno 69 kDa de
Bordetella pertussis, el antígeno hemaglutinina filamentosa
de Bordetella pertussis, un adyuvante y una solución salina,
estando presentes el antígeno 69 kDa y el antígeno de la
hemaglutinina filamentosa en una proporción de pesos de entre 1:10 y
1:1 y siendo la vacuna al menos tan potente como la vacuna de
células enteras de referencia Británica 66/84 en la prueba de
Kendrick.
La proporción entre el antígeno 69 kDa y FHA es
preferiblemente de aproximadamente 1:1.
La formulación vacunal incluye un adyuvante para
estimular la respuesta inmune y así aumentar el efecto de la vacuna.
Como adyuvantes convenientes para uso en la presente invención, se
incluyen, por ejemplo, hidróxido de aluminio y fosfato de
aluminio.
Convenientemente, se presentan formulaciones
vacunales que contienen una concentración final de proteína
antigénica en el rango de 0,01 a 5 mg/ml, preferiblemente de 0,03 a
2 mg/ml, más preferiblemente de 0,3 mg/ml. Tras la formulación, la
vacuna puede ser incorporada a un recipiente estéril, el cual es
entonces sellado y guardado a una baja temperatura, por ejemplo 4ºC,
o puede ser liofilizado.
Con objeto de inducir inmunidad en el hombre
frente a la tos ferina, se pueden administrar una o más dosis de la
vacuna adecuadamente formulada. Se recomienda que cada dosis sea de
0,1 a 2 ml, preferiblemente de 0,2 a 1 ml, más preferiblemente de
0,5 ml de vacuna.
La vacuna puede ser usada en un método de
inducción de inmunidad frente a la tos ferina en el hombre. Las
vacunas según la presente invención pueden ser administradas por
cualquier método convencional para la administración de vacunas,
incluyendo la oral y la parenteral. El tratamiento puede consistir
en una sola dosis o en una pluralidad de dosis a lo largo de un
período de tiempo. La invención incluye el uso del antígeno 69 kDa
de Bordetella pertussis, del antígeno de la hemaglutinina
filamentosa de Bordetella pertussis, de un adyuvante y de
una solución salina para la fabricación de una vacuna acelular para
el tratamiento profiláctico de un mamífero susceptible a la
infección por B. pertussis, donde la vacuna contiene el
antígeno 69 kDa y el antígeno de la hemaglutinina filamentosa en
una razón de pesos de entre 1:10 y 1:1 y es al menos tan potente
como la vacuna de células enteras de referencia Británica 66/84 en
la prueba de Kendrick.
Se puede preparar la FHA por métodos bien
conocidos en la técnica (véase Araih y Munoz J.J. (1970), Infect.
Immunology, 25, 764-767; Ashworth y col.
(1982), Infect. Immun., 37, 1278-1281; Cowell
y col., Bacterial Vaccines, p. 371-379, Seminars in
Infectious Diseases, Vol. IV (1982); Sato y col. (1983), Infect.
Immun., 41. 313-320). Sin embargo, la FHA fue
preparada en el siguiente procedimiento según el siguiente
protocolo.
Purificación de la FHA: Se hicieron crecer
B. pertussis Tomaha o BP357 (mutante en el transposón Tn5 de
AA. Weiss y col. (1983) que no segrega el LPF) o W28\DeltaLPF
obtenido de R. Rappulbi en medio de Stainer y Scholte (0,05 Tris)
en matraces Costar de 650 ml (150 ml en cada uno) durante 5 días a
37ºC (Sato y col., 1983, antes citado). Antes de la centrifugación
(30 min. a 6.000 x g), se añadió 1,10-fenantrolina
50 \muM monohidrato como inhibidor de la proteolisis a los
cultivos. Se aplicó el sobrenadante libre de células, ajustado a pH
8,7 (usando NaOH 5N) a una columna de 30 x 350 mm de Hidroxiapatito
Esferoidal (BHD) a una velocidad de flujo de 500 ml/h. (Todas las
operaciones a temperatura ambiente). Se lavó entonces la columna en
la sal fría (+4ºC) hasta conseguir una línea basal estable a una
velocidad de flujo de 50 ml/h con (a) tampón fosfato 10 mM, pH 8,0,
(b) tampón fosfato 100 mM, pH 8,0, y finalmente (c), se eluyó el
material retenido con NaCl 0,5 N en tampón fosfato 100 mM, pH 7,0.
Se juntaron las fracciones pico que aglutinaban las células rojas
de la sangre de ganso (se añadieron volúmenes de 10 \mul de cada
fracción suspendidos en 50 \mul de PBS e igual cantidad de células
sanguíneas de ganso al 0,5% lavadas y se incubaron durante
1-2 horas a 37ºC). Se dializó el pool durante la
noche contra 20-30 volúmenes de tampón
Bis-Tris/HCl 0,025 M, pH 7,1, a 4ºC. Se recogió la
FHA precipitada en una centrífuga (20 min. a 8.000 x g). La
siguiente etapa se inspiró en Cowell y col. (1983), quienes vieron
que la FHA (así como el LPF) es soluble en tampón de
beta-alanina 40 mM, pH 3,5. Se solubilizó la FHA
precipitada en el menor volumen posible de tampón de
\beta-alanina (3,57 g de
\beta-alanina y 0,35 g de ácido fórmico por
litro), se eliminaron los insolubles por centrifugación y se aplicó
el sobrenadante transparente a una columna (25 x 80 mm) de Ultrogel
AcA 34 ó Aca 44 equilibrada y eluida con el mismo tampón para
eliminar impurezas. El material hemaglutinante retenido apareció en
un pico eluido por tampón Tris/HCl 0,05 M que contenía NaCl 0,5 M
(pH 7,2). Las fracciones del pico principal y que tenían propiedades
hemaglutinantes fueron reunidas y mantenidas congeladas o
reprecipitadas por diálisis contra tampón
Bis-Tris/HCl 0,025 M, pH 7,1, y disueltas en un
volumen menor de tampón de \beta-alanina. La
solubilidad es de aproximadamente 3,0 mg de FHA/ml. El producto
final así obtenido, ya fuera de la cepa Tomaha, BP357 o W28 LPF, no
contiene cantidad detectable de LPF, según se midió por ensayo en
células CHO (que era negativo a una concentración de
2-3 \mug de FHA por un solo pocillo que contenía
200 \mul de cultivo de tejidos; sensibilidad de la prueba:
1-2 pg de LPF por pocillo dan una aglutinación
positiva) o por sensibilización a la histamina. Se inyectaron
ratones N:NIH-S con dosis de 50 \mug de FHA
intraperitonealmente y se inocularon 4 días después mediante
inyección intraperitoneal de 4 mg de clorhidrato de histamina.
Ninguno de ellos murió. El material congelado (a -20 ó -40ºC) a pH
ácido parece estable, según se juzgó por su reactividad ELISA y su
aspecto en SDS-PAGE. Forma prevalentemente tres
fuertes bandas en la región de 150-100 kD.
Se preparó antígeno 69 kDa según los
procedimientos señalados en la solicitud de patente Europea
publicada Nº 0.162.639 usando la cepa BP357 ó W28\DeltaLPF de
B. pertussis y se inmunopurificó usando el anticuerpo
monoclonal BB05 - depositado en el Public Health Laboratory Service
Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down,
Salisbury Wiltshire SP4 0JG, Reino Unido, bajo el Nº 90020103 el 1
de Febrero de 1990.
Prueba de Kendrick. Se realizó ésta según
los Requerimientos de la O.M.S. para la Vacuna Pertussis utilizando
ratones NIH-S exogámicos (OLAC, categoría 3, libres
de la mayoría de los patógenos, incluyendo B. bronchiseptica)
de 14-16 g de peso. Se inocularon los antígenos, en
volúmenes de 0,5 ml, intraperitonealmente como mezcla y consistían
en una dilución superior y tres diluciones seriadas de razón 3. Al
cabo de dos semanas, se inoculó a los ratones intracerebralmente
usando la cepa de inoculación recomendada 18-323
(-400 DL_{50}). Se usó el número de supervivientes de cada grupo
para el cálculo de la potencia relativa con respecto a la Vacuna
Pertussis de Referencia Británica 66/84 usando un programa de
análisis de probits de líneas paralelas. Se realizó también una
prueba comparativa usando la vacuna 69 kDa/LPF. En la Tabla 1, se
muestran los resultados. En este experimento, la proteína 69 kDa y
la FHA se originaban de la cepa BP357.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos fueron computados según la metodología
del análisis de probits de líneas paralelas. En la Figura 1 se
muestran los resultados.
Los resultados muestran claramente que la vacuna
69 kDa/FHA es más potente que la 69 kDa/LPF y al menos tan potente,
si no más, como la vacuna de células enteras.
Se usaron combinaciones y/o antígenos
individuales originados de la cepa W28\DeltaLPF de Bordetella
pertussis en otra prueba de Kendrick. Como en esta cepa el gen
de la toxina completa ha sido bloqueado, la posibilidad de que
estas preparaciones estuviesen contaminadas por LPF es nula.
El(los) antígeno(s) fueron inoculados en volúmenes de
0,5 ml intraperitonealmente, individualmente o en mezclas, y
consistían en una dosis superior y tres diluciones seriadas de
razón cuatro. Después de dos semanas, se inoculó a los ratones
intracerebralmente usando una cepa de inoculación
18-323 (aproximadamente 400 DL_{50}). Se usó el
número de supervivientes de cada grupo para el cálculo de la
potencia relativa con respecto a la Vacuna Pertussis de Referencia
Británica 66/84 usando un programa de análisis de probits de líneas
paralelas. Se usó la Referencia británica 66/84 a la dilución
superior, que contenía 0,5 U.I., y tres diluciones seriadas de razón
cuatro. En la tabla 2 y en la figura 2, se muestran los
resultados.
Claims (14)
1. Un método para la preparación de una vacuna
acelular para el tratamiento profiláctico de un mamífero susceptible
a la infección por B. pertussis, cuyo método consiste en
mezclar el antígeno 69 kDa de Bordetella pertussis, el
antígeno de la hemaglutinina filamentosa de Bordetella
pertussis, un adyuvante y una solución salina en cantidades que
dan el antígeno 69 kDa y el antígeno de la hemaglutinina
filamentosa en una razón de pesos de entre 1:10 y 1:1, donde la
vacuna es al menos tan potente como la vacuna de células enteras de
referencia Británica 66/84 en la prueba de Kendrik.
2. Un método según la reivindicación 1, donde la
vacuna está desprovista de la toxina de B. pertussis.
3. Un método según la reivindicación 1 ó 2, donde
el antígeno 69 kDa y el antígeno de la hemaglutinina filamentosa
están en una razón de pesos de aproximadamente 1:1.
4. Un método según la reivindicación 1, 2 ó 3,
donde la proteína antigénica aparece en una concentración en el
rango de 0,01 a 5,0 mg/ml.
5. Utilización del antígeno 69 kDa de
Bordetella pertussis, del, antígeno de la hemaglutinina
filamentosa de Bordetella pertussis, de un adyuvante y de una
solución salina para la fabricación de una vacuna acelular para el
tratamiento profiláctico de un mamífero susceptible a la infección
por B. pertussis, donde la vacuna contiene el antígeno 69
kDa y el antígeno de la hemaglutinina filamentosa en una razón de
pesos de entre 1:10 y 1:1 y es al menos tan potente como la vacuna
de células enteras de referencia Británica 66/84 en la prueba de
Kendrick.
6. Una utilización según la reivindicación 5,
donde la vacuna está desprovista de la toxina de B.
pertussis.
7. Un uso según la reivindicación 5 ó 6, donde el
antígeno 69 kDa y el antígeno de la hemaglutinina filamentosa están
en una razón de pesos de aproximadamente 1:1.
8. Un método según la reivindicación 5, 6 ó 7,
donde la concentración de la proteína antigénica en la vacuna está
en el rango de 0,01 a 5,0 mg/ml.
9. Una vacuna acelular consistente en el antígeno
69 kDa de Bordetella pertussis, el antígeno de la
hemaglutinina filamentosa de Bordetella pertussis, un
adyuvante y una solución salina, estando presentes el antígeno 69
kDa y el antígeno de la hemaglutinina filamentosa en una razón de
pesos de entre 1:10 y 1:1 y siendo la vacuna al menos tan potente
como la vacuna de células enteras de referencia Británica 66/84 en
la prueba de Kendrik.
10. Una vacuna según se reivindica en la
reivindicación 9, que está desprovista de la toxina de B.
pertussis.
11. Una vacuna según se reivindica en la
reivindicación 9 ó 10, donde la razón es de aproximadamente 1:1.
12. Una vacuna según se reivindica en cualquiera
de las reivindicaciones 9 a 11, donde la concentración de proteína
antigénica está en el rango de 0,01 a 5,0 mg/ml.
13. Una vacuna según se reivindica en cualquiera
de las reivindicaciones 9 a 12 para uso en un método de tratamiento
del organismo humano o animal mediante terapia.
14. Una vacuna según se reivindica en cualquiera
de las reivindicaciones 9 a 12 para uso en un método de inducción de
inmunidad frente a la tos ferina en el hombre.
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