ES2228520T3 - Capatura rapida y eficaz de adn de una muestra sin usar reactivo de lisis celular. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para proporcionar un ácido nucleico a partir de una muestra sin el uso de un reactivo de lisis celular, que comprende las etapas de: A) a un pH de menos de 7, poner en contacto una muestra sospechosa de contener un ácido nucleico con un polímero soluble en agua, débilmente básico que comprende unidades recurrentes derivadas mediante polimerización por adición de: 1) entre aproximadamente 15 y 100% en peso de un monómero polimerizable débilmente básico etilénicamente insaturado que tiene al menos un grupo que se puede protonar a pH ácido y que se selecciona entre el grupo constituido por aminoalquilo, imidazolilo, isoxazolilo, piridilo, piperidilo, piperazinilo, pirazolilo, triazolilo, tetrazolilo, oxadiazolilo, piridazinilo, pirimidilo, pirazinilo, quinolinilo y quinazolinilo 2) entre 0 y aproximadamente 35% en peso de un monómero no iónico, hidrófilo etilénicamente insaturado, y 3) entre 0 y aproximadamente 85% en peso de un monómero polimerizable, no iónico, hidrófobo etilénicamente insaturado en una cantidad suficiente para formar un precipitado insoluble en agua de dicho polímero débilmente básico con todos los ácidos nucleicos presentes en dicho lisado, B) separar dicho precipitado insoluble en agua de dicha muestra, y C) poner en contacto dicho precipitado con una base para elevar el pH de la solución hasta uno mayor que 7, y por lo tanto liberar dichos ácidos nucleicos de dicho polímero débilmente básico, comprendiendo dicho polímero débilmente básico unidades recurrentes derivadas mediante polimerización por adición de uno o más monómeros polimerizables etilénicamente insaturados que tienen un grupo amino que se puede protonar a pH ácido.

Description

Captura rápida y eficaz de ADN de una muestra sin usar reactivo de lisis celular.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a un procedimiento para preparar una muestra mediante captura y liberación selectiva de ácidos nucleicos para detección. En particular, se refiere a un procedimiento para la captura y liberación de ácidos nucleicos para tratamiento posterior tal como amplificación. También se refiere a un kit se ensayo para uso en el procedimiento.

Antecedentes de la invención

La tecnología para detectar cantidades minúsculas de ácidos nucleicos ha avanzado rápidamente a lo largo de las dos últimas décadas incluyendo el desarrollo de técnicas de amplificación altamente sofisticadas tales como la reacción en cadena de la polimerasa (abreviadamente en inglés PCR). Los investigadores han reconocido fácilmente el valor de tal tecnología para detectar ácidos nucleicos que son indicadores de enfermedades y características genéticas en especímenes de ensayos de seres humanos y de animales. El uso de sondas y cebadores en tal tecnología se basa en el concepto de complementariedad, es decir, la unión de dos cadenas de un ácido nucleico mediante enlaces hidrógeno entre nucleótidos complementarios (también conocidos como pares de nucleótidos).

La PCR es un avance significativo en la técnica para permitir la detección de concentraciones muy pequeñas de un ácido nucleico diana. Los detalles de la PCR se describen en, por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº 4.683.195 (Mullis y col.,), la patente de Estados Unidos Nº 4.965.188 (Mullis y col.,), aunque existe un volumen rápidamente creciente de bibliografía en este campo.

Con el fin de ampliar y detectar eficazmente un ácido nucleico diana, por lo general es necesario aislar ese ácido nucleico de los desechos celulares y de otros especímenes. Se conocen diversos procedimientos de lisis, que incluyen congelación, tratamiento con enzimas digestivas tales como proteasas (por ejemplo, la proteinasa K), ebullición, y uso de diversos detergentes (véase, por ejemplo, El documento de Estados Unidos Nº de serie 178.202, presentado el 6 de abril de 1988 por Higucji, y el documento EP-A-0 428 197, publicado el 22 de mayo de 1991), precipitaciones con disolvente y protocolos de calentamiento.

El ADN circulante se ha detectado en plasma y suero sanguíneo. Cantidades en nanogramos se detectan en sujetos normales (Steinman, C. R., J Clin. Invest. 56: 512-515, 1975 y Raptis, L., y col., J Clin. Invest. 66: 1391-1399, 1980) y se detectan niveles aumentados en enfermedades autoinmunes crónicas (Leon, S. A., y col., Cancer Res., 37: 646-650, 1977) y en los pacientes con cáncer (Stroun, M., y col., Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 28: 707-712, 1987; Maebo., Jpn. J. Thorac. Dis. 28: 1085-1091, 1990; Fournie, G. J., y col., Cancer Lett., 91: 221-227, 1995; Lin, A., y col., BioTecniques 24: (6) 937-940, 1998; y Sorenson, G. D., y col., Cancer Epidemiology, Biomarkers and Prevention 3: 67-71., 1994). Recientemente, se ha hecho evidente que el ADN extracelular libre presente en el suero y plasma sanguíneo se puede usar para análisis de genotipo (Lin, A., y col., BioTecniques 24: (6) 937-940, 1998), para la detección de cáncer (Mulcahy, H. E., y col., Clin. Cancer Res. 4: 271-275, 1998), y ADN en suero materno se puede usar en diagnóstico prenatal (Lo Dennis, y col., Am. J. Human Genet. 62: 768-775, 1998). La mutaciones presentes en un tumor primario, a menudo se pueden detectar usando ADN de plasma sanguíneo o de suero (Sorenson, G. D., y col., Cancer Epidemiology, Biomarkers and Prevention 3: 67-71., 1994; Vasyukhin, V., y col., en Challenges of Modern Medicine, Vol. 5, Biotechnology Today, R. Verna, y A. Shamoo, eds, 141-150. Aera-Serono Simposia Publications, Rome; Mulcahy, H. E., y col., anteriormente; Kopreski, M. S., y col., Brit. J. Cancer 76: 1293-1299, 1997; Chen, X., y col., Nature Medicine 2: 1033-1035, 1996; Vasioukin, V., y col., Brit. J. Haematology 86: 774-779, 1994; y Tada, M., y col., Cancer Res. 53.: 2472-2474, 1993). Así pues, el ADN presente en suero y plasma representa una fuente invasiva en forma mínima para la información relacionada con diagnosis, prognosis, y terapia de cáncer.

Para ampliar y detectar eficazmente un ácido nucleico diana, usualmente es necesario separar el ácido nucleico de sustancias que interfieren presentes en un espécimen de interés. Se ha usado varios planteamientos diferentes para concentrar y purificar ADN de suero o plasma sanguíneo. Muchos de estos procedimientos implican múltiples etapas incluyendo tratamiento con fenol, éter, y cloroformo, diálisis, paso a través de Concanavalina Sefarosa A para eliminar los polisacáridos y después centrifugación en un gradiente de cloruro de cesio (Vasyukhin, V., y col., anteriormente). Más recientemente, Qiagen ha comercializado un sistema para la concentración y purificación basándose en un protocolo de columna de centrifugación de sílice. El protocolo de Qiagen es complejo, implicando un total de ocho etapas, tratamiento con una proteasa, incubaciones a 70ºC, y requiere el uso de al menos 3 tampones diferentes, además de una etapa de centrifugación en columna de centrifugación de sílice.

Recientemente, Goecke y col., (documento 97/34015) describieron la detección de ácido nucleico extracelular asociado a tumores en plasma y suero sanguíneo usando ensayos de amplificación de ácidos nucleicos. En su procedimiento preferido, el ADN se co-precipita a partir de plasma y suero usando un protocolo de múltiples etapas que implica una co-precipitación inicial por gelatina, seguida de tratamiento con disolvente y centrifugación. También se describen otros protocolos de larga duración y complejos que implican el uso de perlas de vidrio, partículas de sílice o tierra de diatomeas para la extracción de ADN de suero y plasma.

El uso de polímeros débilmente básicos para la captura y liberación selectiva de ácidos nucleicos se ha descrito en la patente de Estados Unidos Nº 5.622.822 (Ekeze y col.), la patente de Estados Unidos Nº. 5.582.988 (Backus y col.), y la patente de Estados Unidos Nº 5.434.270 (Ponticello, y col.). Los protocolos descritos en las patentes anteriormente mencionadas tras el uso de un agente de lisis de células o una etapa de lisis de células. Los tensioactivos se usan a menudo como agentes de lisis de células. El uso de tensioactivos y otros agentes de lisis dan como resultado la liberación de ácidos nucleicos de las células y componentes celulares en sangre; produciendo una gran concentración de ADN de fondo.

El documento WO 97/34015 describe un procedimiento para detectar y aislar ADN extracelular de plasma sanguíneo. La muestra de plasma que contiene el ADN extracelular se trata primero con una etapa de extracción con fenol; cloroformo: alcohol isoamílico seguida de una etapa de precipitación con gelatina del ADN en presencia de etanol. Después de la centrifugación el ADN se liofiliza y se vuelve a suspender en agua destilada dispuesta para una reacción de amplificación.

El documento WO 95/16792 describe el aislamiento de ADN circulante libre a partir del plasma. El ADN se aísla después de una etapa de extracción con fenol/cloroformo y se usa una columna de afinidad ConA-sefarosa.

El documento EP 707.077 describe el uso de un polímero débilmente básico que se usa para capturar ADN a pH ácido por consiguiente para proporcionar un procedimiento para aislar ácido nucleico para tratamiento posterior.

Anker P. y col., Gastroenterology, 1997, 112 (4), p. 1114-1120 describe un procedimiento de detección de las mutaciones K-ras en ADN circulante libre a partir del plasma de pacientes con cáncer.

Sumario de la invención

Los problemas asociados al uso de agentes de lisis o etapas de lisis en los procedimientos de la técnica anterior se han superado con el procedimiento de la presente invención.

El procedimiento de esta invención implica el uso de un polímero débilmente básico, como se describe en las patentes de Estados Unidos indicadas anteriormente, para la captura y liberación selectiva de los ácidos nucleicos capturados a partir del polímero, pero sin el uso de una etapa de lisis o agente de lisis, como se realiza usando los procedimientos de la técnicas anterior.

Según un aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento simplificado, fácil de usar para recuperar ADN a partir de suero y plasma sanguíneo. El procedimiento incluye el uso de un polímero débilmente básico para unirse al ADN de una muestra tal como suero o plasma sanguíneo. Tras la unión al ADN, el polímero se hace insoluble. Después el ADN unido al polímero se separa de la mezcla líquida que comprende sustancias solubles no deseables. Después el ADN se libera del polímero mediante la adición de álcali. Así pues, el procedimiento de la presente invención requiere solamente tres etapas: (a) contacto de la muestra con tampón, (b) contacto e incubación de la mezcla formada en la etapa (a) con un polímero débilmente básico, y (c) liberación del ADN unido al polímero en la etapa (b) mediante contacto con álcali. El procedimiento elimina la necesidad de extracción con alcohol u otro disolvente y materiales tóxicos tales como fenol o cloroformo, y no se usan agentes de lisis. El procedimiento no solamente simplifica la recuperación de ADN, sino también da como resultado una mejora en la producción de ADN diana amplificable. Aunque el procedimiento se usa preferiblemente con suero y sangre como muestra, es aplicable a otros fluidos corporales que incluyen, pero sin limitación, orina, bilis, fluido de la médula espinal, lavado bronquial (BAL), lavados de colon, y evacuación de vientre. Además, se pueden usar muestras de cualquier otro tipo, incluyendo las recogidas de animales, seres humanos, especímenes ambientales y microbianos.

En otro aspecto la presente invención se refiere a la amplificación y detección de ADN diana usando el procedimiento de recuperación de ADN descrito en esta memoria descriptiva anteriormente.

Los procedimientos inventivos de la invención comprenden las etapas de:

A)

a un pH de menos de 7, poner en contacto una muestra sospechosa de contener un ácido nucleico con un polímero soluble en agua, débilmente básico en una cantidad suficiente para formar un precipitado insoluble en agua del polímero débilmente básico con todos los ácidos nucleicos presentes en la muestra,

B)

separar el precipitado insoluble en agua de la muestra, y

C)

poner en contacto el precipitado con una base para elevar el pH de la solución hasta uno mayor que 7, y por lo tanto liberar los ácidos nucleicos del polímero débilmente básico, comprendiendo el polímero débilmente básico unidades recurrentes derivadas mediante la polimerización por adición de uno o más monómeros polimerizables etilénicamente insaturados que tienen un grupo amino que se puede protonar a un pH ácido.

Esta invención también proporciona un procedimiento para la amplificación y detección de un ácido nucleico diana que comprende:

I)

proporcionar un ácido nucleico diana usando las etapas de:

A)

a un pH de menos de 7, poner en contacto una muestra sospechosa de contener un ácido nucleico diana con un polímero soluble en agua, débilmente básico en una cantidad suficiente para formar un precipitado insoluble en agua de un polímero débilmente básico con todos los ácidos nucleicos presentes en la muestra, incluyendo el ácido nucleico diana,

B)

separar el precipitado insoluble en agua de la muestra, y

C)

poner en contacto el precipitado con una base para elevar el pH de la solución hasta uno mayor que 7, y por lo tanto liberar los ácidos nucleicos, incluyendo el ácido nucleico diana, del polímero débilmente básico, comprendiendo el polímero débilmente básico unidades recurrentes derivadas mediante polimerización por adición de uno o más monómeros polimerizables etilénicamente insaturados que tienen un grupo amino que se puede protonar a pH ácido

II)

amplificar el ácido nucleico diana presente entre los ácidos liberados, y

III)

detectar el ácido nucleico diana amplificado.

Un kit de ensayo para la amplificación de un ácido nucleico comprende, empaquetado separadamente:

a)

una mezcla de reacciones de amplificación que comprende uno o más reactivos de amplificación, y

b)

un polímero débilmente básico que comprende unidades recurrentes derivadas mediante la reacción de polimerización por adición de uno o más monómeros polimerizables etilénicamente insaturados que tienen un grupo amino que se puede protonar a pH ácido.

La presente invención proporciona un procedimiento rápido, sencillo y eficaz para aislar y proporcionar selectivamente ácidos nucleicos para tratamiento adicional, tales como ensayos de hibridación o procedimientos de amplificación. Esta invención supera los problemas indicados anteriormente relativos a medios de aislamiento convencionales, incluyendo el uso de polietilenimina. Además, los problemas presentados por el uso de polietilenimina combinada con un tensioactivo de fosfato fluorado también se evitan porque el tensioactivo no se necesita. El procedimiento de preparación de muestras de esta invención no es tedioso y requiere un mínimo de etapas, por lo tanto lo hace más fácilmente automatizable. Usualmente se puede llevar a cabo en menos de 15 minutos (preferiblemente en menos de diez minutos).

Estas ventajas se proporcionan usando en lugar de la polietilenimina un polímero "débilmente básico" que es catiónico e insoluble en agua a pH ácido, pero se desprotona a un pH básico que es significativamente superior al pKa del polímero. "Débilmente básico" significa que el pKa del polímero es menor que 7, y más probablemente menor que 6,5. Por lo tanto, el polímero se puede usar a pH bajo para precipitar ácidos nucleicos debido a la interacción iónica del polímero catiónico y la estructura principal del fosfato aniónico de los ácidos nucleicos.

Después de eliminar los materiales no complejados, y tras el ajuste de pH hasta condiciones básicas, los ácidos nucleicos se liberan (o se descomplejan) del polímero débilmente básico del precipitado y están disponibles para tratamiento posterior, tal como amplificación. Los procedimientos de amplificación se pueden llevar a cabo en condiciones básicas.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 ilustra una curva patrón para el ADN evaluada mediante la amplificación de TaqMan con el gen actina \beta después de 40 ciclos de PCR.

La figura 2 ilustra los resultados del análisis para una mutación K-12 ras como se determina mediante electroforesis en gel después de REMS-PCR de acuerdo con el ejemplo 7.

Descripción detallada de la invención

La presente invención es especialmente adecuada para la extracción y detección de uno o más ácidos nucleicos diana presentes en una muestra de cualquier tipo recogida de especímenes animales, humanos, ambientales o microbianos. Los ácidos nucleicos así obtenidos se pueden tratar posteriormente sometiéndolos a ensayos de hibridación convencionales, los procedimientos de los cuales se conocen bien en la técnica (por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº 4.994.373).

Sin embargo, la descripción restante se dirigirá a realizaciones preferidas mediante las que los ácidos nucleicos se someten a procedimientos de amplificación, particularmente la PCR. Sin embargo, el alcance de esta invención no se intenta que se limite debido a que también se pueden usar otras técnicas de amplificación (tal como la LCR).

Los principios y condiciones generales para la amplificación y detección de ácidos nucleicos que usan la reacción en cadena de la polimerasa se conocen bastante bien, los detalles de los cuales se proporcionan en numerosas referencias incluyendo la patente de Estados Unidos Nº 4.683.195 (Mullis y col, la patente de Estados Unidos Nº 4.683.202 (Mullis), la patente de Estados Unidos Nº 4.965.188 (Mullis y col) y el documento WO-A-91/12342. En vista de la descripción proporcionada en esta memoria descriptiva, los expertos en la técnica no deben tener ninguna dificultad en poner en práctica la presente invención combinando el procedimiento preparatorio de esta invención con procedimientos de la reacción en cadena de la polimerasa, o con cualquier otro procedimiento de amplificación conocido en la técnica.

Otros procedimientos de amplificación que se pueden usar en la práctica de esta invención incluyen, pero sin limitación, la reacción en cadena de la ligasa como se describe, por ejemplo, en el documento EP-A-0 320 308 (publicado en diciembre de 1987) y el documento EP-A-0 439 182 (publicado en enero de 1990).

Los especímenes de ensayo ("muestras") pueden incluir fluidos corporales u otros materiales que contienen ADN o RNA genético. El ácido nucleico diana se puede extraer a partir de cualquier fuente humana, animal, microbiana, viral o vegetal.

El avance descrito en esta memoria descriptiva contempla que antes de poner en contacto con el polímero débilmente básico definido en esta memoria descriptiva, no se requiere extracción de ácidos nucleicos del espécimen. Aunque la técnica anterior describe diversos procedimientos de lisis conocidos en al técnica (incluyendo los descritos por Maure y col en The Lancet, pp. 538-540 (3 de septiembre de 1988), Maniatis y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, pp. 280-281 (1982), Gross-Belland y col., en Eur. J. Biochem., 36, 32 (1973) y la patente de Estados Unidos Nº 4.965.188 (indicada anteriormente)). La extracción de ADN a partir de sangre entera de componentes de la misma se describe, por ejemplo, en EP-A-0 393 744 (publicada el 24 de octubre de 1990), la patente de Estados Unidos Nº 5.231.015 (Cumins y col.) y la patente de Estados Unidos Nº 5.334.499 (Burdick y col); el procedimiento de lisis dependiendo del ciclo de espécimen que se usa como la fuente de ácidos nucleicos; un procedimiento de lisis preferidos incluye el calentamiento del espécimen en presencia de un tensioactivo no iónico adecuado, numerosos de los cuales se conocen en la técnica.

La muestra, primero diluida y mezclada con un tampón a pH por debajo de aproximadamente 7,0, se mezcla con un polímero débilmente básico (definido más adelante) en una cantidad suficiente para formar complejos con todos los ácidos nucleicos presentes en la muestra, formando un precipitado soluble en agua. Este polímero es soluble en agua a pH ácido. En general, la cantidad de polímero presente en al menos aproximadamente 0,01 por ciento en peso, siendo preferido entre aproximadamente 0,05 y aproximadamente 0,5 por ciento en peso. Por supuesto, los expertos en la técnica conocerían cómo ajustar la cantidad de polímero para acomodar cualquier cantidad de ácidos nucleicos. La mezcla se puede llevar a cabo de cualquier manera adecuada durante hasta 30 minutos (generalmente menos de cinco minutos) y a cualquier temperatura adecuada (generalmente entre 15º y 35ºC).

Los tampones adecuados para mezclarse con la muestra incluyen los tampones que tienen un pKa menor que 7, más preferiblemente menor que un pKa 6,5, incluyendo MES (ácido 2-[N-morfolino]etanosulfónico) a pKa 6,1, BIS-TRIS (bis [2-hidroxietil]iminotris[hidroximetil]metano; 2-bis[2-hidroxietil]amino-2-[hidroximetil]-1,3-propanodiol) a pK 6,5, ADA ácido (N-[2-acetamido]-2-iminodiacético; ácido N-[carbamoilmetil]iminodiacético) a pK 6,6, ACES (ácido N-[carbamoilmetil]-2-aminoetanosulfónico; ácido N-[2-acetamido]-2-aminoetanosulfónico) a pK 6,8, PIPES (ácido piperazina-N,n'-bis[2-etanosulfónico]; ácido 1,4-piperazinidadietanosulfónico) a pK 6,8, MOPSO (ácido 3-[N-morfolino]-2-hidroxipropanosulfónico) a pK 6,9, BIS-TRIS propano (1,3-bis[tris(hidroximetil)matilamino]propano a pK 6,8, PBS (solución salina tamponada con fosfato), y TRIS (tris(hidroximetil)aminometil)metano), el polímero débilmente básico se puede usar en su forma libre soluble en agua, o unido a un sustrato insoluble en agua, tal como en una columna de afinidad, o unido a partículas poliméricas, de vidrio u otras partículas inorgánicas. Así pues, los polímeros se pueden unir usando medios convencionales (por ejemplo, absorción, enlaces covalentes o reacciones de unión específicas) a un sustrato adecuado, incluyendo partículas de vidrio, poliméricas o magnéticas, filtros o películas. Donde el polímero débilmente básico es insoluble en agua incluso a pH básico, se puede retirar a través de filtración, centrifugación u otros medios convencionales después que se liberan los ácidos nucleicos.

Sin embargo, aunque unidos al polímero débilmente básico, los ácidos nucleicos no son útiles. Entonces es necesario separar el precipitado insoluble en agua del resto de la muestra que puede contener desechos celulares considerables y polímero en exceso. Esta separación se puede lograr usando cualquiera de los diversos procedimientos, incluyendo centrifugación o filtración después de los cual se desecha el líquido. Se prefiere la centrifugación en la práctica de esta invención y se puede llevar a cabo a más de 1000 x g, durante entre un minuto y cinco minutos.

Después de la etapa de separación, los ácidos nucleicos se pueden separar del complejo o liberar del polímero débilmente básico, poniendo en contacto el precipitado con una base, con o sin calentar. Las bases fuertes se pueden usar sin calentar, e incluyen, pero sin limitación, hidróxido sódico, hidróxido potásico, hidróxido amónico, hidróxido de litio, carbonato sódico, bicarbonato sódico, una amina terciaria (tal como trietilamina, diisopropiletilamina y lutidina), tricina, bicina o cualquier otra base orgánica e inorgánica que sería fácilmente evidente para los expertos en la técnica. Las bases más débiles útiles pueden incluir tampones básicos tales como tris(hidroximetil)aminometano (o las sales de adición de ácido del mismo), N,N-bis(2-hidroxietil)glicina, N-tris(hidroximetil)metilglicina, y otros bien conocidos en la técnica. Cuando se usan bases más débiles puede ser necesario calentamiento.

Tal calentamiento se puede llevar a cabo durante hasta 15 minutos (en general menos que 5 minutos) a una temperatura que es al menos aproximadamente 50ºC, y preferiblemente está entre aproximadamente 95ºC y aproximadamente 125ºC, a presión adecuada. Como se usa en este párrafo, "aproximadamente" se refiere a +/- 0,5ºC.

En las realizaciones preferidas, las bases más débiles se pueden usar con calentamiento, para liberar los ácidos nucleicos del precipitado. Esto proporciona una solución que contiene ácidos nucleicos que están dispuestos para amplificación sin tratamiento adicional. Tales bases más débiles pueden ser tampones, tales como clorhidrato de tris(hidroximetil)aminometano.

En algunas realizaciones, los polímeros usados en tales realizaciones son aquellos (definidos más adelante) que son insolubles en agua incluso a pH básico. Tales polímeros se pueden retirar del sistema después de la liberación de los ácidos nucleicos y antes de la amplificación si se desea.

La solución resultante que contiene ácidos nucleicos liberados tiene un pH básico. En algunos casos, los ácidos nucleicos se pueden además tratar sin ningún ajuste posterior de pH. En otras realizaciones en las que se usa una base fuerte, el pH de la solución se puede ajustar (generalmente hacia abajo) hasta entre aproximadamente 6 y aproximadamente 9 (preferiblemente entre aproximadamente 7,5 y aproximadamente 9), usando cualquier ácido o tampón adecuado, tales como clorhidrato de tris(hidroximetil)aminometano, N,N-bis(2-hidroxietil)glicina, N-tris(hidroximetil)metilglicina y otros que serían fácilmente evidentes para los expertos en la técnica. Las cantidades de tales materiales necesarios para lograr el pH deseado serían fácilmente evidentes para los expertos en la técnica.

A pH básico, el polímero usado para captura de ácidos nucleicos puede ser bien soluble en agua o insoluble en agua, y los monómeros necesarios para proporcionar tales propiedades se describen más adelante.

El procedimiento descrito de captura y liberación de ácidos nucleicos de esta invención típicamente se lleva a cabo dentro de aproximadamente 20 minutos, y preferiblemente dentro de aproximadamente 10 minutos.

Como se usa en esta memoria descriptiva, salvo que se indique otra cosa, el modificador "aproximadamente" se refiere a una variación de 110% de los valores indicados. Cuando se usa con valores de pH, "aproximadamente" se refiere a +/- 0,5 de unidad de pH.

En una realización preferida de esta invención, un procedimiento para la amplificación y detección de un ácido nucleico diana comprende:

I)

proporcionar una muestra sospechosa de contener un ácido nucleico diana,

II)

someter el ácido nucleico diana a las etapas de:

A)

a un pH de menos de 7, poner en contacto el ácido nucleico diana con un polímero soluble en agua, débilmente básico en una cantidad suficiente para formar un precipitado insoluble en agua de un polímero débilmente básico con todos los ácidos nucleicos presentes en la muestra, incluyendo el ácido nucleico diana,

B)

separar el precipitado insoluble en agua de la muestra, y

C)

poner en contacto el precipitado con una base para elevar el pH de la solución a uno mayor que 7, y por lo tanto liberar los ácidos nucleicos, incluyendo el ácido nucleico diana, del polímero débilmente básico, comprendiendo el polímero débilmente básico unidades recurrentes derivadas mediante polimerización por adición de uno o más monómeros polimerizables, etilénicamente insaturados que tienen un grupo amino que se puede protonar a pH ácido

III)

sin ajuste posterior de pH, amplificar el ácido nucleico diana liberado, y

IV)

detectar el ácido nucleico diana amplificado.

En el procedimiento anterior, se prefiere todavía más que el polímero débilmente básico sea insoluble en agua a pH básico, y el procedimiento además comprende la etapa de eliminar el polímero insoluble en agua después de la liberación del ácido nucleico diana pero antes de la amplificación del mismo.

El polímero débilmente básico usado en la práctica de esta invención se prepara a partir de uno o más monómeros polimerizables, etilénicamente insaturados, al menos uno de los cuales tiene un grupo amina que se puede protonar a pH ácido. Así pues, a pH ácido, el polímero se protona para formar la sal de adición de ácido de la amina.

A pH básico, el polímero existe en forma de la base libre.

Los "grupos débilmente básicos" particulares que pueden ser parte de los monómeros polimerizables útiles en esta invención incluyen, pero sin limitación, grupos aminas cíclicas, o grupos aminoalquilos primarios, secundarios o terciarios que se pueden protonar a pH ácido. Los grupos de aminas cíclicas útiles incluyen, pero sin limitación, grupos imidazolilo, isoxazolilo, piridilo, piperidilo, piperazinilo, pirazolilo, triazolilo, tetrazolilo, oxadiazolilo, piridazinilo, pirimidilo, pirazinilo, quinolinilo y quinazolinilo. Los grupos preferidos son grupos cíclicos que son aromáticos, y el grupo imidazolilo es el más preferido. Los grupos aminoalquilos o aminas cíclicas útiles se unen a grupos vinilo de los monómeros usando grupos de unión convenientes que incluyen grupos alquileno, amido o éster, y grupos alquileno múltiple se pueden unir junto con grupos imino, oxi, amida, carbonilo o éster.

En general los polímeros útiles para capturar ácidos nucleicos comprenden unidades recurrentes derivadas mediante la polimerización por adición de:

a) entre aproximadamente 15 y 100 por ciento en peso de un polímero soluble en agua, débilmente básico etilénicamente insaturado que tiene al menos un grupo que se puede protonar a pH ácido y que se selecciona entre el grupo constituido por aminoalquilo, imidazolilo, isoxazolilo, piridilo, piperidilo, piperazinilo, pirazolilo, triazolilo, tetrazolilo, oxadoazolilo, piridazinilo, pirimidilo, pirazinilo, quinolinilo y quinazolinilo,

b) entre 0 y aproximadamente 35 por ciento en peso de un monómero polimerizable no iónico, hidrófilo etilénicamente insaturado, y

c) entre 0 y aproximadamente 85 por ciento en peso de un monómero polimerizable no iónico, hidrófobo etilénicamente insaturado.

Preferiblemente, el polímero débilmente básico comprende unidades recurrentes de entre aproximadamente 20 y aproximadamente 100 por ciento en peso de a), entre 0 y aproximadamente 25 por ciento en peso de b), y entre aproximadamente 0 y aproximadamente 80 por ciento en peso de c).

Una clase más específica de monómeros útiles en a) anterior son los representados por la estructura (I):

1

en la que R^{3} es hidrógeno o metilo, y X es oxi o imino. Además, R^{4} es un grupo de unión hidrocarburo divalente que tiene entre 1 y 8 átomos de carbono y átomos hetero en la cadena y que comprende uno o más grupos alquileno (tales como metileno, etileno, n-propileno, isopropileno y n-pentileno), con tal que cuando existe más de un grupo alquileno, se unen juntos en R^{4} con uno o más grupos carbonilo, oxi, imino, éster o amido en una combinación operable. "Combinación operable" significa que los grupos se pueden combinar con los grupos alquileno en cualquier configuración químicamente posible, y se puede usar en combinación (conectado a cada uno) en las formas químicamente posibles (tales como oxicarbonilo, carbonamido y otras fácilmente evidentes para los expertos en la técnica). También se entiende que R^{4} puede terminar (o conectarse a R^{5}) con un grupo carbonilo, oxi, imino, éster o amido.

R^{5} es un grupo amina cíclica o aminoalquilo primario, secundario o terciario, como se ha definido anteriormente, que se puede protonar a pH ácido.

Los ejemplos de monómeros de tipo a) útiles incluyen, pero sin limitación, 1-vinilimidazol, 2-metil-1-vinilimidazol, 2-vinilpiridina, 1-hidroxi-6-vinil-1H-benzotriazol, clorhidrato de metacrilato de 2-aminoetilo, clorhidrato de acrilato de 2-aminoetilo, N-(3-aminopropil)metacrilamida, 2-vinilquinolina, N-(3-imidazililpropil)metacrilamida, N-(2-imidazoliletil)metacrilamida, N-(3-imidazolilpropil)acrilamida, N-(1,1-dimetil-3-N-imidazolilpropil)acrilamida, N-(imidazolilmetil)acrilamida, 1-vinilpirrolidinona, metacrilato de 3-(N,N-dimetilamino)propilo y las sales de adición de ácido de las bases libres indicadas.

Una clase de monómeros novedosos del tipo a) de esta invención se pueden usar para preparar bien homopolímeros o copolímeros. Estos monómeros se definen por la estructura (II):

2

en la que R es hidrógeno o metilo. Preferiblemente R es metilo. Además R^{1} es alquileno lineal o ramificado de 1 a 3 átomos de carbono (tales como metileno, etileno, trimetileno o propileno). Preferiblemente, R^{1} es alquileno de 2 ó 3 átomos de carbono. Más preferiblemente, R^{1} es trimetileno.

Los monómeros particularmente útiles que tienen la estructura (II) incluyen, pero sin limitación, N-(3-imidazililpropil)metacrilamida, N-(2-imidazoliletil)metacrilamida, N-(3-imidazolilpropil)acrilamida, N-(1,1-dimetil-3-N-imidazolilpropil)acrilamida, N-(imidazolilmetil)acrilamida, y sus sales de adición de ácido. De los monómeros novedosos descritos en esta memoria descriptiva, el primer compuesto es el más preferido.

Los monómeros de tipo a) preferidos incluyen 1-vinilimidazol y N-2-metil-1-vinilimidazol.

Si los monómeros de tipo a) tienen baja o ninguna solubilidad en agua, también se pueden polimerizar en forma de sus sales de adición de ácido (tales como el clorhidrato o bromhidrato).

Los monómeros identificados como monómeros como tipo b) son los que se definen en esta memoria descriptiva como "hidrófilos", significando aquellos que, cuando se homopolimerizan, proporcionan homopolímeros que son solubles en agua a pH 7 o superior. En general, tales monómeros tienen grupos hidrófilos tales como grupos hidroxi, amina (primaria, secundaria, terciaria o cíclica), amida, sulfonamida y poietilenoxi, pero no es necesario que comprendan tales grupos si el homopolímero indicado reúne el parámetro de solubilidad en agua.

Los monómeros representativos de tipo b) incluyen, pero sin limitación, acrilamida, acrilato de 2-hidroxietilo, acrilato de 2,3-dihidroxipropilo, metacrilato de 2,3-dihidroxipropilo, metacrilato de poli(etilenoxi)etilo (que tiene entre 2 y 10 grupos etilenoxi), y N,N-dimetilacrilamida. Un monómero preferido es acrilamida.

Los monómeros identificados como monómeros de tipo c) son los que se definen en esta memoria descriptiva como "hidrófobos", significando aquellos que, cuando se homopolimerizan, proporcionan homopolímeros que son insolubles en agua a pH 7 o superior, independientemente del tipo de grupos pendientes que puedan poseer.

Los monómeros representativos del tipo c) incluyen, pero sin limitación, metacrilamida, metacrilato de 2-hidroxietilo, N-t-butilmetacrilamida, acrilato de etilo, acrilato de butilo, metacrilato de metilo, estireno, viniltolueno y otros vinilos aromáticos y otros que serían fácilmente evidentes para los expertos en la técnica. Un monómero preferido es metacrilato de 2-hidroxietilo.

Los monómeros de tipo a), b) y c) que no son novedosos son generalmente y fácilmente disponibles de fuentes comerciales, o preparados usando procedimientos y materiales de partida convencionales.

Los monómeros novedosos de estructura (II) se pueden preparar generalmente mediante condensación de un 1-(amidoalquil)imidazol con cloruro de (met)acriloílo usando condiciones apropiados que serían fácilmente aparentes para los expertos en la técnica. Una preparación representativa de un monómero preferido se proporciona más adelante precediendo los ejemplos. Más detalles sobre tales monómeros se pueden obtener a partir de la patente de Estados Unidos de cesión común Nº 5.434.270, Ponticello y col., titulada "Weakly Basic Polymerizable Monomers and Polymers Prepared Therefrom".

Los homopolímeros y copolímeros descritos en esta memoria descriptiva se pueden preparar usando técnicas de polimerización en solución convencionales que se conocen bien en la técnica, aunque existen algunas condiciones preferidas que se ilustran en los procedimientos preparatorios proporcionados más adelante precediendo a los ejemplos. La relación de diversos monómeros se pueden ajustar, como saben los expertos en la técnica, para proporcionar polímeros que son bien solubles en agua o insolubles en agua a pH básico, mientras tales polímeros permanezcan solubles en agua a pH ácido.

La polimerización en solución generalmente implica disolver los monómeros en un disolvente adecuado (incluyendo agua o diversos disolventes orgánicos miscibles en agua) y polimerizar en presencia de un iniciador adecuado de radical libre. El polímero resultante es soluble en agua a pH ácido, así precipita usando un disolvente tal como acetona, se purifica y se redisuelve en agua para uso futuro.

Los polímeros particularmente útiles descritos en esta memoria descriptiva, incluyen, pero sin limitación, poli[N-(3-imidazolilpropil)metacrilamida clorhidrato-co-acrilamida], poli[N-(3-imidazolilpropil)metacrilamida clorhidrato-co-2-hidroxietilmetacrilato], poli(1-vinilimidazol), metacrilato de poli(2-aminoetilo clorhidrato-co-2-hidroxietilmetacrilato), poli(1-vinilimidazol clorhidrato-co-2-hidroxiletilmetacrilato), poli[N-(1,1-dimetil-3-imidazolilpropil)acrilamida]poli(N-2-metil-1-vinilimidazol) y las sales de adición de ácido de los polímeros de base libre.

En las realizaciones preferidas, los polímeros usados son insolubles en agua a pH básico. Tales polímeros se preparan usando monómeros de tipo a) así como monómeros de tipo c) pero sin cantidades limitadas (menos del 15 por ciento de peso de los monómeros de tipo b) para evitar la solubilización del polímero a pH básico. Los polímeros representativos de este tipo incluyen, pero sin limitación, poli[N-(3-imidazolilpropil)metacrilamida clorhidrato-co-2-hidroxietilmetacrilato], poli(1-vinilimidazol), poli(2-aminoetilmetacrilato clorhidrato-co-2-hidroxietilmetacrilato) y poli(1-vinilimidazol clorhidrato-co-hidroxietilmetacrilato).

La presente invención también se refiere a la amplificación o detección de una o más secuencias de ácidos nucleicos específicos presentes en uno o más ácidos nucleicos liberados como se ha indicado anteriormente. Además, una pluralidad de ácidos nucleicos diana se pueden amplificar y detectar simultáneamente usando un conjunto de cebadores y medios de detección correspondientes para cada ácido nucleico específico. También se pueden amplificar y detectar múltiples secuencias en el mismo ácido nucleico.

Un "reactivo de la PCR" se refiere a cualquiera de los reactivos generalmente considerados útiles en la PCR, a saber un conjunto de cebadores para cada ácido nucleico diana, una ADN polimerasa, un cofactor de la ADN polimerasa y dos o más desoxirribonucleósido-5'-trifosfatos (abreviadamente en inglés dNTP).

Como se usa en esta memoria descriptiva con relación a los cebadores o sondas, el término "oligonucleótido" se refiere a una molécula que comprende cuatro o más desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, y preferiblemente más de diez. Su tamaño exacto no es crítico pero depende de muchos factores incluyendo el uso o función última del oligonucleótido. El oligonucleótido se puede derivar mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica.

El término "cebador" se refiere a un oligonucleótido, bien de origen natural o producido sintéticamente, que es capaz de actuar como punto de iniciación de la síntesis cuando se coloca en condiciones en las que se induce la síntesis de un producto de extensión del cebador complementario a una cadena de ácido nucleico (es decir, molde). Tales condiciones incluyen la presencia de nucleótidos (tales como los cuatro desoxirribonucleósido-5'-trifosfatos habituales), una ADN polimerasa y un cofactor de ADN polimerasa, y temperatura y pH adecuados. Normalmente, tales condiciones son las que se conocen en la técnica como condiciones "altamente rigurosas" de manera que se minimiza la amplificación no específica. El cebador debe ser bastante largo para iniciar la síntesis de los productos de extensión en presencia de la ADN polimerasa. El tamaño exacto de cada cebador variará dependiendo del uso contemplado, la complejidad de la secuencia diana, la temperatura de reacción y la fuente del cebador. En general, los cebadores usados en esta invención tendrán entre 10 y 60 nucleótidos.

Los cebadores útiles en esta invención se pueden obtener a partir de numerosas fuentes o prepararse usando técnicas y equipos conocidos, incluyendo por ejemplo, un sintetizador de ADN ABI (disponible de Applied Biosystems) o un sintetizador de Biosearch de serie 8600 o de serie 8800 (disponible de Milligen-Biosearch, Inc.) y procedimientos conocidos para sus uso (por ejemplo como se describe en la patente de Estados Unidos Nº 4.965.188). Son también útiles los cebadores de origen natural aislados a partir de fuentes naturales (tales como digestiones con endonucleasas de restricción). Como se usa en esta memoria descriptiva, el término "cebador" también se refiere a una mezcla de cebadores. Así pues, cada conjunto de cebadores para un ácido nucleico diana dado puede incluir dos o más cebadores para cada cadena diana opuesta.

Uno o ambos cebadores se pueden marcar con el mismo o diferente marcador para la detección o captura de producto amplificado. Los procedimientos para unir marcadores y preparar cebadores se conocen bien en la técnica, por ejemplo, como se describe en el documento de Agrawal y col., Nucleic Acid Res., 14, pp. 6227-45 (1986), la patente de Estados Unidos Nº 4.914.210 (Levenson y col) con relación a marcadores de biotina, la patente de Estados Unidos Nº 4.962.029 (Levenson y col.,) con relación a marcadores de enzimas, y las referencias indicadas en esos documentos. Los marcadores útiles también incluyen radioisótopos, reactivos con densidad electrónica, cromógenos, fluorógenos, restos fosforescentes, ferritina y otras partículas magnéticas (véase la patente de Estados Unidos Nº 4.795.698 de Owen y col., y la patente de Estados Unidos Nº 4.920.061 de Pontyon y col.,), restos quimioluminiscentes (tales como luminol), y otras especies de unión específica (avidina, estreptavidina, biotina, azúcares o lectinas). Los marcadores preferidos son enzimas, radioisótopos y especies de unión específica (tales como biotina). Las enzimas útiles incluyen, glucosaoxidasa, peroxidadasas, uricasa, fosfatasa alcalina y otras conocidas en la técnica y se pueden unir a oligonucleótidos usando procedimientos conocidos. Se conocen bien los reactivos que proporcionan una señal colorimétrica o quimioluminiscente con tales enzimas.

Cuando el marcador es una enzima tal como una peroxidasa, en algún punto del ensayo, peróxido de hidrógeno y composiciones formadoras de tintes adecuadas se añaden para proporcionar un tinte detectable. Por ejemplo, los reactivos útiles que proporcionan tintes incluyen tetrametilbenzidina y los derivados de los mismos, y tintes leuco, tales como tintes leuco de triarilimidazol insolubles en agua (como se describe en la patente de Estados Unidos Nº 4.089.747 de Bruschi), u otros compuestos que reaccionan para proporcionar un tinte en presencia de peroxidasa y peróxido de hidrógeno. Las composiciones particularmente útiles que proporcionan tintes se describen en el documento EP-A-0 308 236 (publicado el 22 de marzo de 1989). Las señales quimioluminiscentes en respuesta a un marcador de peroxidasa también se pueden generar usando los reactivos apropiados.

Si uno o ambos cebadores están biotinilados, el ácido nucleico amplificado se puede detectar usando avidina detectablemente marcada o un equivalente de la misma (tal como estreptavidina). Por ejemplo, la avidina se puede conjugar con una enzima, o tener un radioisótopo usando tecnología conocida. Se usan biotina sobre complejos de productos amplificados con la avidina, y detección apropiada para detectar una señal radiactiva, colorimétrica o quimioluminiscente.

Como se usa en esta memoria descriptiva, una "sonda" de captura es un oligonucleótido que es sustancialmente complementario a una secuencia de ácido nucleico de una o más cadenas del ácido nucleico diana, y que se usa para insolubilizar el ácido nucleico amplificado. El oligonucleótido de sonda generalmente se une a un sustrato adecuado insoluble en agua tal como perlas poliméricas o de vidrio, pocillo de placas de microtitulación, película polimérica o celulósica fina u otros materiales fácilmente evidentes para los expertos en la técnica. El oligonucleótido está generalmente entre aproximadamente 12 y aproximadamente 40 nucleótidos de longitud, aunque la longitud no es crítica.

Una ADN polimerasa es una enzima que añadirá moléculas de monofosfato de desoxinucleósido al extremo 3 + -hidroxi del cebador en un complejo de cebador y molde, pero esta adición es de una manera dependiente del molde (es decir, dependiente de los nucleótidos específicos en el molde). Se conocen en la técnica muchas ADN polimerasas útiles. Preferiblemente, la polimerasa es "termoestable", significando que es estable al calor, especialmente a las altas temperaturas usadas para la desnaturalización de las cadenas de ADN. Más particularmente, las ADN polimerasas termoestables no se inactivan sustancialmente por las altas temperaturas usadas en la PCR como se describe en esta memoria descriptiva.

Se han descrito numerosas ADN polimerasas en la técnica, incluyendo las mencionadas en detalle en la patente de Estados Unidos Nº 4.965.188 (indicada anteriormente) y la patente de Estados Unidos Nº 4.889.818 (Gelfand y col). Las polimerasas particularmente útiles son las obtenidas a partir de diversas especies de bacterias Thermus, tales como Thermus aquaticus, Thermus thermophilus, Thermus filiformis o Thermus flavus. Otras polimerasas termoestables se obtienen a partir de una diversidad de otras fuentes microbianas incluyendo Thermococcus literalis, Pyrococcus furiosus, Thermotoga sp. Y las descritas en el documento WO-A-89/06691 (publicada el 27 de julio de 1989). Algunas polimerasas útiles están comercialmente disponibles. Se conocen numerosas técnicas para aislar polimerasas de origen natural a partir de organismos, y para producir enzimas modificadas por ingeniería genética usando técnicas recombinantes, como las indicadas en la técnica citada en este párrafo.

Un cofactor de la ADN polimerasa se refiere a un compuesto no proteico de la que depende la enzima para actividad. Numerosos de tales cofactores son conocidos, incluidos las sales de magnesio y manganeso. Los cofactores útiles incluyen, pero sin limitación, cloruros, sulfatos acetatos y sales de ácidos grasos de magnesio y magnesio (por ejemplo, las sales de ácidos butírico, caproico, caprílico, capricho y laúrico). Se prefieren las sales más pequeñas, es decir cloruros, sulfatos y acetatos.

También son necesarios para la PCR dos o más desoxirribonucleótido-5'-trifosfatos, tales como dTA, dCTP, dGTP, dUTP o dTTP. Usualmente, dATP, dCTP, dGTP y dTTP se usan todos en la PCR. También son útiles los análogos tales como dITP y 7-deaza-dGTP.

También es útil en la práctica de la invención un anticuerpo específico para la ADN polimerasa, dicho anticuerpo inhibe su actividad enzimática a temperaturas inferiores a aproximadamente 50ºC, pero dicho anticuerpo se desactiva a temperaturas superiores. Los anticuerpos monoclonales representativos que tienen estas propiedades se describen en la patente de Estados Unidos Nº 5.338.671 (Scalice y col.) Se pueden usar fragmentos de anticuerpos en lugar de la molécula entera si tienen propiedades equivalentes.

Los reactivos de la PCR descritos en esta memoria descriptiva se proporcionan y se usan en la PCR en concentraciones adecuadas para proporcionar la amplificación del ácido nucleico diana. La cantidad mínima de la ADN polimerasa es generalmente al menos aproximadamente 1 unidad/100 \mul de solución, siendo preferida entre aproximadamente 4 y aproximadamente 25 unidades/100 \mul. Una "unidad" se define en esta memoria descriptiva como la cantidad de actividad enzimática requerida para incorporar 10 nmoles nucleótidos totales (dNTP) en una cadena de ácido nucleico extensible en 30 minutos a 74ºC. La concentración de cada cebador es al menos aproximadamente 0,075 \mumolar prefiriéndose entre aproximadamente 0,2 y aproximadamente 1 \mumolar. Todos los cebadores están presentes en aproximadamente la misma cantidad (dentro de una variación de 10% de cada uno). El cofactor generalmente está presente en una cantidad entre aproximadamente 1 aproximadamente 15 mmolar, y cada dNTP está generalmente presente a entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 3,5 mmolar en la mezcla de reacción. Como se usa en este párrafo, el modificador "aproximadamente" se refiere a una variación de +/- 10% del valor indicado.

Los reactivos de PCR se pueden suministrar individualmente, o en una solución tamponada que tiene un pH en el intervalo de entre aproximadamente 7 y aproximadamente 9 usando cualquier tampón adecuado.

Ya que el ácido nucleico diana a amplificar y detectar está usualmente en forma de doble cadena, las dos cadenas se deben separar (es decir, desnaturalizar) antes de que tenga lugar el cebado. Esto se puede producir durante el procedimiento de extracción, pero preferiblemente, se produce en una etapa separada después. El calentamiento a una temperatura adecuada (identificada como "primera temperatura" o T_{1} en esta memoria descriptiva) es un medio preferido para la desnaturalización. En general, esta primera temperatura está en el intervalo entre aproximadamente 85º y aproximadamente 100ºC durante un tiempo adecuado, por ejemplo entre 1 y aproximadamente 240 segundos (preferiblemente entre 1 y aproximadamente 40 segundos). Esta etapa de desnaturalización inicial también puede estar incluida en el primer ciclo de amplificación. En tales casos, la desnaturalización puede ser más larga en el primer ciclo (por ejemplo, hasta 240 segundos) mientras que ciclos posteriores pueden tener muchas etapas de desnaturalización más cortas (por ejemplo, hasta 30 segundos).

Las cadenas desnaturalizadas se ceban después con los conjuntos de cebadores apropiados enfriando la mezcla de reacción hasta una segunda temperatura, T_{2}, que está generalmente dentro del intervalo de entre aproximadamente 55ºC y aproximadamente 70ºC. Se desea que el enfriamiento se hace tan rápidamente como sea posible, pero con el equipo actualmente conocido, generalmente tiene lugar durante un período de tiempo de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 40 segundos, y más preferiblemente durante entre aproximadamente 5 y aproximadamente 20 segundos.

Una vez que se enfrían las cadenas desnaturalizadas, la mezcla de reacción que contiene los reactivos de la PCR se incuba a una tercera temperatura, T_{3}, generalmente durante entre 1 y aproximadamente 120 segundos, y preferiblemente entre 1 y aproximadamente 80 segundos, para efectuar la formación de productos de extensión de cebadores. En general, la tercera temperatura está dentro del intervalo de entre aproximadamente 55º y aproximadamente 74ºC. Preferiblemente, está dentro del intervalo de entre aproximadamente 62º y aproximadamente 70ºC.

En una realización más preferida, la segunda y tercera temperaturas son las mismas y están dentro del intervalo de entre aproximadamente 62º y aproximadamente 70ºC. Así pues, el cebo y la extensión del cebador se llevan a cabo preferiblemente en la primera etapa.

Así pues, un ciclo de amplificación comprende las etapas de desnaturalización, cebo (o hibridación) y extensión del cebador descritas anteriormente. En general, al menos 15 de tales ciclos de amplificación se llevan a cabo en la práctica de esta invención estando el máximo número de ciclo a discreción del usuario particular. En la mayoría de los casos, se usan 15 a 50 ciclos de amplificación en el procedimiento prefiriéndose 15 a 40 ciclos. Cada ciclo de amplificación generalmente está entre 20 y aproximadamente 360 segundos, prefiriéndose un tiempo de ciclo de entre aproximadamente 30 y aproximadamente 120 segundos y prefiriéndose más entre aproximadamente 30 y aproximadamente 90 segundos. Sin embargo, tiempos de ciclo más cortos o más largos se pueden usar si se desea.

Cuando se usa con relación al tiempo para una etapa dada en el procedimiento de amplificación, el término "aproximadamente" se refiere a +/- 10% de ese tiempo límite. Además, cuando se usa en relación a temperaturas, el "aproximadamente" se refiere a +/- 0.5ºC.

La detección de productos amplificados se puede lograr usando cualquier procedimiento conocido, incluyendo técnicas de transferencia de Southern, como se describe en la patente de Estados Unidos Nº 4.965.188 (indicada anteriormente), o mediante el uso de sondas o cebadores marcados, como se conoce en la técnica.

Como alternativa a las realizaciones descritas anteriormente, los productos amplificados se pueden detectar usando un oligonucleótido marcado que es complementario a uno de los productos de extensión del cebador.

Todos los reactivos para realizar el ensayo de TapMan se compraron en Appied Biosystems, una división de Perkin-Elmer Co., Foster City, CA, incluyendo: reactivos de detección de Actina \beta (número de catálogo 401846), reactivos de moldes de ADN (número de catálogo 401970) y kit de los reactivos centrales de la PCR TaqMan (número de catálogo N808-0228). Los ensayos se realizaron usando la mezcla maestra de la PCR y perfiles de ciclación térmica para el ensayo de TaqMan de actina \beta proporcionados por el fabricante. Un microlitro de reactivo de molde de ADN se añadió a 49 \mul de la mezcla maestra de la actina \beta de la PCR en un sistemma de detección de secuencias ABI Prism 7700 (Applied Biosystems) y se midió la fluorescencia durante los 40 ciclos de la PCR.

La figura 1 muestra una curva de calibración para diferentes niveles de partida de ADN frente al recuento de ciclos umbrales, que es un valor determinado por el instrumento y representa el número estimado de ciclos de la PCR al que se obtendrá una señal fluorescente preseleccionada. Así pues, el ensayo TaqMan para un fragmento génico de la actina \beta proporciona una buena herramienta analítica para medir la concentración de ADN presente en una muestra.

En los ejemplos que siguen, se extrajo ADN del gen de la actina \beta de la copia individual (por célula) de las muestras indicadas según el procedimiento de la invención o usando el procedimiento de la técnica anterior indicada que utiliza un reactivo de lisis celular. Por lo tanto el ADN de la actina \beta extraído se amplificó usando la mezcla maestra de la PCR y perfiles de ciclación térmica y detección de TaqMan según los procedimientos recomendados por el fabricante.

En los sistemas de detección heterogéneos de esta invención, los productos amplificados se capturan sobre un sustrato insoluble en agua de alguna clase, y los otros materiales en la mezcla de reacción se retiran de una manera adecuada, tal como mediante filtración, centrifugación, lavado u otra técnica de separación.

Las sondas de captura se pueden unir a soportes insolubles en agua usando técnicas de unión conocidas (incluyendo absorción y reacciones covalentes). Una de dichas técnicas se describe en el documento EP-A-0 439 222 (publicado el 18 de septiembre de 1991). Se describen otras técnicas, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos Nº 4.713.326 (Dattagupta y col), la patente de Estados Unidos Nº 4.914.210 (Levenson y col.,) y el documento EP-B-0 070 687 (publicado el 26 de enero de 1983). Los medios de separación útiles incluyen filtración a través de membranas tales como membranas microporosas de poliamida comercialmente disponibles de Pall Corporation.

Sin embargo, cualquier soporte sólido se puede usar para anclar la sonda de captura y el producto de hibridación eventual, incluyendo placas de microtitulación, tubos de ensayo, vasos de precipitados partículas magnéticas o poliméricas, metales, productos cerámicos, y lana de vidrio por nombrar unos pocos. Los materiales particularmente útiles son partículas magnéticas o poliméricas que tiene grupos reactivos útiles para unirse covalentemente a la sonda de captura. Tales partículas están generalmente entre aproximadamente 0,001 y aproximadamente 10 \mumetros. Los detalles adicionales sobre los ejemplos de tales materiales se proporcionan en la patente de Estados Unidos Nº 4.997.772 (Sutton y col., la patente de Estados Unidos Nº 5.147.777 (Sutton y col), la patente de Estados Unidos Nº 5.155.166 (Danielosn y col) y la patente de Estados Unidos Nº 4.795.698 (Owen y col),

La sonda de captura se puede fijar a un soporte plano tal como una película polimérica, membranas, papeles de filtro, o papel revestido de resina o sin revestir. La sonda de captura fijada a partículas poliméricas también se pueden inmovilizar sobre tales soportes planos de una manera adecuada, por ejemplo, como depósitos secos, o adheridos mediante fusión por calor o con adhesivos. La sonda se captura se puede fijar, por ejemplo, a un soporte plano en el dispositivo de ensayo independiente de esta invención. Otros detalles de tales materiales se proporcionan en el documento EP-A-0 408 738 (publicado el 23 de enero de 1991), documento WO 92/16659 (publicado el 1 de octubre de 1992) y la patente de Estados Unidos 5.173.260 (Sutton y col.)

Las sondas de captura se pueden disponer en un soporte adecuado en cualquier configuración, por ejemplo filas de depósitos redondos o bandas.

La presente invención también se puede usar en los que se conocen como procedimientos de amplificación "homogénea" en los que los ácidos nucleicos se detectan sin la necesidad de reactivos de captura. Los detalles de tales ensayos se conocen en la técnica, tales como en el documento EP-A-0 487 218 (publicada en 27 de mayo de 1992) y el documento EP-A-0 512 334 (publicado el 11 de noviembre de 1992).

La composición de las reacciones de amplificación se puede incluir como un componente empaquetado individualmente de un kit de ensayo útil para diversos ensayos de amplificación. El kit puede incluir otros reactivos, soluciones, equipo e instrucciones útiles en el procedimiento de esta invención, incluyendo reactivos de captura inmovilizados sobre un sustrato insoluble en agua, soluciones de lavado, reactivos de detección y otros materiales fácilmente evidentes para los expertos en la técnica. Además, el kit de ensayo puede incluir un polímero débilmente básico empaquetados separadamente como se ha descrito anteriormente, tampones, bases débiles o fuertes y otros reactivos necesarios para cualquiera o tanto amplificación como preparación de la muestra de especímenes. El kit de ensayo también puede incluir un dispositivo de ensayo que contiene uno o más otros componentes del kit. Este dispositivo de ensayo es preferiblemente "independiente" como se entiende ese término en la técnica. Otros kits pueden incluir el polímero débilmente básico descrito en esta memoria descriptiva y uno o más reactivos (tales como sondas de detección o de captura) usados en ensayos de hibridación.

Los siguientes ejemplos se incluyen para ilustrar la práctica de esta invención, y no significa que la limiten de ninguna forma. Todos los porcentajes son en peso salvo que se indique otra cosa.

Materiales y procedimientos para los ejemplos Preparación de N-(3-imidazolilpropil)metacrilamida

Este procedimiento muestra la preparación de un monómero novedoso de estructura (I), identificado anteriormente, pero la preparación es representativa de cómo se pueden preparar fácilmente otros monómeros dentro del alcance de esta invención.

Se preparó una mezcla de disolventes mezclando agua (100 ml) que contiene hidróxido sódico (12,8 g, 0,32 moles) y diclorometano (200 ml) conteniendo 1-(3-aminopropil)imidazol (37,5 g, 0,3 moles), y se enfrió en un baño de hielo. A esta mezcla enfriada se le añadió todo de una vez, cloruro de metacriloílo (34,8 g, 0,3 moles) en diclorometano (100 ml) con agitación vigorosa en una atmósfera de nitrógeno. Se desprendió calor alcanzando la temperatura de la mezcla aproximadamente 60ºC, y la mezcla se agitó vigorosamente durante otros 10 minutos, y después se dejó que se separara la fase orgánica. La fase orgánica se extrajo dos veces con diclorometano (100 ml cada vez). La solución orgánica combinada (la fase de los disolventes orgánicos y los extractos) se lavó con cloruro sódico saturado (100 ml), se secó sobre sulfato sódico anhidro, se filtró, y se retiró el disolvente. El residuo se disolvió en cloroformo (50 ml), seguido de la adición de éter etílico (50 ml) hasta el punto de turbidez.

El producto de reacción resultante cristalizó a aproximadamente 0ºC, y se filtró proporcionando un sólido blanco que tenía un punto de fusión de 45º-46ºC. El rendimiento fue del 70%.

Los datos analíticos incluyeron: m/e (M-193),

^{1}H RMN (DMSO d6) 1,8 (m, 2H, C-CH_{2}-C, CH_{3}), 3,02 (m, 2H, N-CH_{2}), 3,95 (t, 2H, im-CH_{2}), 5,25 y 5,6 (AB, 2H, vinil-CH_{2}), 6,82 y 7,15 (AB, 2H, 5-H de im), 7,6 (s, 1H, 2-H de im), 7,95 (m, 1H, NH).

Preparación de homopolímero

Un homopolímero preferido preparado a partir de un monómero novedoso descrito en esta memoria descriptiva se preparó a añadiendo 2,2'-azobis(2-metilpropiontitrilo) (300 mg) a una solución de N-(3-imidazolilpropil)metacrilamida (12,5 g, 0,065 moles) en agua (90 ml) e isopropanol (10 ml), se mantuvo en una atmósfera de nitrógeno.

La solución resultante se calentó, mientras se agitaba, hasta 65-70ºC en un baño de agua durante 3 horas. Después de 1,5 horas de este tiempo, se añadió HCl concentrado (3 ml), y la agitación continuó en atmósfera de nitrógeno durante el tiempo restante. Después la solución se concentró en un evaporador rotatorio hasta aproximadamente 25 ml, y el producto polimérico resultante se precipitó en acetona (sobre 4 litros), se filtró y se disolvió en agua desionizada (80 ml). La solución contenía 12% de sólidos.

Preparación del primer copolímero

El poli[N-(3-imidazolilpropil)metacrilamida clorhidrato-co-acrilamida] (90:10 de relación de peso) se preparó añadiendo 2,2'-azobis(2-metilpropionitrilo) (400 mg) a una solución de N-(3-imidazolilpropil)metacrilamida (18 g, 0,09 moles) y acrilamida (2 g, 0,028 moles) en agua desionizada (120 ml) e isopropanol (15 ml), mantenida en una atmósfera de nitrógeno. La solución se calentó hasta 65-70ºC con agitación durante 4 horas, seguido de la adición de HCl diluido para reducir el pH hasta aproximadamente 2. La agitación y el calentamiento se continuaron durante otra hora, y después se dejó que la solución alcanzara la temperatura ambiente durante toda una noche.

La solución se concentró hasta aproximadamente 75 ml usando un evaporador rotatorio, y el polímero resultante se precipitó en acetona (aproximadamente 4 litros), se filtró y se disolvió en agua desionizada (150 ml). La concentración adicional hasta aproximadamente 125 ml se llevó a cabo para retirar la acetona residual. El polímero estaba presente con 15,5% de sólidos.

Preparación del segundo copolímero

Poli[metacrilato de 2-aminoetilo clorhidrato-co-2-hidroxietilmetacrilato] (20:80 de relación de peso) se preparó añadiendo 2,2'-azobis(2-metilpropionitrilo) (400 mg) a una solución de clorhidrato de metacrilato de 2-aminoetilo (4 g, 0,02 moles) y metacrilato de 2-hidroxietilo (16 g, 0,12 moles) en agua desionizada (180 ml) y etanol (20 ml), mantenidos en una atmósfera de nitrógeno. La solución se calentó hasta 65º-70ºC con agitación durante 4 horas. La agitación y calentamiento se continuaron durante otra hora, y después la solución se dejó que alcanzara la temperatura ambiente durante toda una noche.

El polímero resultante se precipitó en acetona (aproximadamente 4 litros), se filtró y se disolvió en agua desionizada (150 ml). Se llevó a cabo una concentración posterior hasta aproximadamente 125 ml para retirar la acetona residual. El polímero estaba presente con 5,6% de sólidos.

Preparación del tercer copolímero

El poli[1-vinilimidazol-co-2-hidroxietilmetacrilato] (50:50 de relación de peso) se preparó añadiendo 2,2'-azobis(2-propilmetionitrilo) (350 mg) a una solución de 1-vinilimidazol (10 g, 0,1 moles) y metacrilato de 2-hidroxietilo (10 g, 0,077 moles) en N,N-dimetilformamida (160 ml), mantenida en una atmósfera de nitrógeno. La solución se calentó hasta 65-70ºC con agitación durante 7 horas.

Después de agitar a temperatura ambiente durante toda una noche, el polímero se precipitó en acetona (aproximadamente 4 litros), se filtró y se disolvió en agua desionizada (200 ml) conteniendo HCl concentrado (8,5 ml). La concentración posterior se llevó a cabo para retirar la acetona residual. El polímero estaba presente con 12,4% de sólidos.

Preparación del cuarto copolímero

El poli(1-vinilimidazol-co-2-hidroxietilmetacrilato) (27:75 de relación de peso) se preparó de una manera similar al "tercer copolímero". La solución resultante contenía 13,7% de sólidos.

Los desoxirribonucleótidos (dNTP), tampón tris(hidroximetil)aminometano y ADN de timo de ternera liofilizado se obtuvo de Sigma Chemical Co.

La electroforesis en gel se llevó a cabo añadiendo la mezcla de los productos de amplificación (6,75 \mul) a geles de agarosa (2,5%) que se habían teñido previamente con bromuro de etidio (0,4 mg/ml de concentración final). Los geles se sometieron a electroforesis a aproximadamente 8 voltios/cm durante aproximadamente 1 hora usando un tampón de electroforesis (600 ml) conteniendo bromuro de etidio (0,4 mg/ml) de concentración final). El tampón era una mezcla de tris(hidroximetil)aminoetano, borato y ácido etilendiaminotetraacético. Las bandas resultantes se compararon con marcadores de pesos moleculares convencionales, y la intensidad de las bandas de los productos se puntuaron (115-meros para HIVI y 383-meros para M. tuberculosis) sobre una escala de 0 a 5, representando 0 señal no detectable y representando 5 la señal más alta.

Otros reactivos y materiales se obtuvieron bien a partir de fuentes comerciales o se prepararon usando materiales de partida fácilmente disponibles y procedimientos convencionales.

La invención se ha descrito en detalle con referencia particular a las realizaciones preferidas de la misma, pero se entenderá que se pueden efectuar variaciones y modificaciones dentro del espíritu y alcance de la invención.

Ejemplo 1 Captura y liberación de ADN usando un homopolímero débilmente básico

Este ejemplo ilustra la práctica de la presente invención para capturar y liberar un ácido nucleico usando poli(1-vinilimidazol).

Se mezclaron diversos volúmenes de poli(1-vinilimidazol) [de una dilución 1:10 de solución madre al 2,4% (pH 2,3)] con ADN de timo de ternera (100 \mul, 0,5 \mug/\mul) y se agitaron en un aparato vortex para formar un precipitado de ácido nucleico y polímero. Después se llevó a cabo la centrifugación durante 1 minuto. Se añadió una cantidad adicional de polímero (10 \mul de la solución madre al 2,4%) a cada sobrenadante y la mezcla resultante se agitó en un aparato vortex y se centrifugó para determinar si la primera precipitación era cuantitativa. La tabla I más adelante muestra la cantidad de polímero usada y el tipo de precipitación observada para cada muestra.

TABLA I

3

Se observó que la precipitación ocurrió en condiciones ácidas (pH 2,3), y que se podrían usar 50 \mul de la dilución 1:10 de la solución madre del polímero para precipitar 100 \mul de la solución de ADN de timo de ternera (0,5 \mug/\mul) Sigma Chemical Co., San Luis, MO, de una manera casi cuantitativa. Esta observación también se confirmó usando procedimientos convencionales electroforéticos sobre gel.

Se llevaron a cabo experimentos para determinar cómo solubilizar el precipitado, por lo tanto liberando el ácido nucleico para uso posterior. La tabla II más adelante muestra las diversas condiciones intentadas de solubilización del sedimento y el tamaño del sedimento resultante. La técnica más útil fue el uso de calor en combinación con pH básico (sin sedimento). La electroforesis sobre gel convencional indicó claramente que a pH básico, el polímero y los ácidos estaban presentes como materiales libres. Así pues, los ácidos nucleicos estaban disponibles para uso posterior, tal como en la PCR.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA II

4

*Tampón "TE" incluye ácido etilendiaminotetraacético (1 mmolar) en tampón clorhidrato de tris(hidroximetil)aminometano (10 mmolar, pH 8).

La tabla III más adelante muestra el efecto del pH sobre la formación de un precipitado entre el polímero (50 \mul de dilución 1:10 de la solución madre) y ADN de timo de ternera (100 \mul de solución de 0,5 \mug/\mul). Claramente se requería pH ácido para la captura eficaz del ácido nucleico mediante la formación de un precipitado (sedimento).

TABLA III

pH	Tamaño del sedimento
2,3	Grande
3	Grande
4	Grande
7	Transparente, masa espesa
12	Escasamente visible

Ejemplo 2 Comparación de la captura de polímero de ADN con y sin reactivo de lisis

La cantidad de ADN liberado de los glóbulos blancos puestos en contacto con un agente de lisis (control) se compara con la cantidad liberada de las células no puestas en contacto con un reactivo de lisis (procedimiento de invención) pero tratada por lo demás de manera idéntica.

En este ejemplo, se sacaron 10 ml de sangre en un tubo de preparación de células VACUTAINER CPT (Becton Dickinson Co., Franklin Lakes, NJ), y se separaron los glóbulos blancos (abreviadamente en inglés WBC) mediante centrifugación según el protocolo recomendado por el fabricante. La concentración final de WBC se determinó que era 3,5 x 10^{5}/ml, basándose en microscopía.

Se colocaron doscientos microlitros de la suspensión de WBC en cada uno de los ocho tubos de microcentrífuga de 1,5 ml (Eppendorf North America, Inc., Madison, WI). Se centrifugaron los glóbulos blancos, y se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato, (PBS NaCl 0,15 M, y tampón fosfato potásico 0,05 M, pH 7,5).

Control Uso de reactivo de lisis

Para las muestras puestas en contacto con reactivo de lisis, el sedimento en cada uno de los cuatro tubos separados se trató como sigue: se añadieron ochenta microlitros de tampón de lisis (Tris HCl 10 mM, pH 8,0 y Tween 20 al 0,5%), seguido de 10 \mul de la proteasa termoestable Pre-Taq, (1 U/\mul, Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianápolis, IN), y los tubos se calentaron a 100ºC durante 5 minutos. Después del tratamiento por calor, se añadieron 10 \mul de NaOH 250 mM, y se calentaron los tubos otra vez a 105ºC durante 10 minutos, seguido de centrifugación a 14.000 rpm durante 2 minutos.

Procedimiento de invención Sin uso de reactivo de lisis

Las muestras no puestas en contacto con reactivo de lisis se trataron como sigue: el sedimento de cada uno de los cuatro tubos separados se volvió a suspender en 100 \mul de PBS.

Las muestras preparadas usando ambos procedimientos anteriores se trataron de manera idéntica: los tubos se centrifugaron a 14.000 rpm durante 2 minutos, el fluido sobrenadante de cada tubo se decantó cuidadosamente en nuevos tubos y se almacenaron a temperatura ambiente antes de análisis. El contenido de ADN de cada tubo se analizó usando el ensayo de TaqMan actina \beta y un detector de secuencias ABI Prism 7700 como se ha descrito anteriormente, basándose la calibración en los patrones de ADN comprados a Perkin Elmer. Los resultados se resumen en la tabla
IV.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA IV Comparación de ADN liberado de glóbulos blancos con y sin tratamiento con reactivo de lisis

5

Estos datos indican que en presencia de reactivo de lisis, hay aproximadamente una cantidad mayor que 300 veces de ADN liberado de los glóbulos blancos. Ya que el ADN liberado de los glóbulos blancos no se espera que albergue mutaciones, las supresiones u otros marcadores de cáncer específicos circulantes en la sangre de un tumor primario, tal como ADN relativo al no diana incrementa el fondo no específico, y por lo tanto, tiene un efecto perjudicial sobre un ensayo para cualquier ADN circulante libre en fluidos corporales basándose en la detección de alteraciones específicas en ADN asociado a cáncer.

Ejemplo 3 Comparación de la invención con el procedimiento del kit de Qiagen para extraer ADN de suero

El ejemplo siguiente muestra una comparación del kit de Qiagen comercial y el procedimiento de la presente invención para extraer ADN del mismo acúmulo de suero.

Para el aislamiento de ADN a partir de suero o plasma basándose en el procedimiento de la invención, todas las etapas iniciales se realizaron sobre hielo para minimizar la posible degradación de ADN mediante las nucleasas del suero. Se preparó tampón ACES ácido (N-(2-acetamido)-2-aminoetanosulfónico de Sigma Co., San Luis, Mo en forma de una solución madre 250 mM, pH 6,8. El polímero de captura de ADN, poli(1-vinilimidaziol clorhidrato-co-hidroxietilmetacrilato) a una relación en peso de 76:24 de monómero y a 2,4% de sólidos, se sintetizó mediante los protocolos descritos en la patente de Estados Unidos Nº 5.582.988. Es un copolímero de adición de vinilo lineal aleatorio preparado usando copolimerización en solución convencional en N,N-dimetilformamida con un iniciador azo. El copolímero (o simplemente polímero) se mezcló con un exceso de agua y se añadió HCl concentrado hasta que se obtuvo una solución transparente. Después la solución se diafiltró.

Doscientos microlitros de suero o plasma se añadieron a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml seguido de la adición de 100 \mul de la solución tampón ACES. Después de mezclar mediante un mezclador vortex, se añadieron 15 \mul de la solución acuosa de polímero de captura al tubo y la muestra se mezcló otra vez durante 5 segundos usando un mezclador vortex. El tubo se centrifugó mediante una microcentrífuga Eppendrf modelo 5415 (Brinkman Instruments, Westbury, N. Y.) a una velocidad máxima durante 2 minutos, y se decantó el fluido sobrenadante. Se añadieron cien microlitros de NaOH 20 mM al tubo que contenía el sedimento, y el tubo se mezcló mediante un mezclador vortex, seguido de calentamiento a 100ºC durante 5 minutos. Las muestras se mantuvieron bien a 4ºC y se ensayaron inmediatamente después de la extracción o se almacenaron congeladas antes de uso.

Para comparación, también se extrajo ADN a partir de suero o plasma usando un kit QIAmp Blood (nº de catálogo 29104) de Qiagen Corp., Chatsworth, CA. según el procedimiento recomendado por el fabricante. Los tampones AL, AW y AE se suministraron en el kit. Se combinaron doscientos microlitros de suero con 200 \mul de tampón fosfato potásico 0,05 M, pH 7,5, y 200 \mul de tampón AL y 25 \mul de la solución de la proteinasa K (reactivo de lisis) suministrado en el kit y los contenidos se mezclaron inmediatamente durante 15 segundos usando un mezclador vortex. Después de la incubación a 70ºC durante 10 minutos, se añadieron 210 \mul de etanol, y la muestra se mezcló otra vez usando el mezclador vortex. Se extrajo ADN mediante una columna de centrifugación QIAamp en un tubo de recogida de 2 ml. Después de aplicar la muestra, el tubo se centrifugó a 6000 x g durante 1 minuto. El tubo que contenía el filtrado se desechó. Se añadieron quinientos mililitros de tampón AW, y la columna se centrifugó de nuevo durante 1 minuto, y se desechó el tubo que contenía el filtrado. La columna se lavó un tiempo adicional con tampón AW y después de eluyó ADN de la columna con 200 \mul de tampón AE o agua destilada precalentada a 70ºC. Después de la adición del tampón o agua, el tubo se incubó a temperatura ambiente durante 1 minuto y después se centrifugó a 600 x g durante 1 minuto.

Una comparación de las etapas en el procedimiento del kit de Qiagen y el procedimiento de la presente invención se muestran en la tabla V. El kit de Qiagen requiere al menos 8 etapas comparado con el procedimiento de la invención, que requiere 3 etapas.

TABLA V Comparación de las etapas implicadas en la extracción de ADN usando el procedimiento de la invención y el procedimiento de Qiagen

Izan (76/24)
Captura del polímero	Kit de Qiagen
1 Adición de tampón ACES	1 adición de tampón PBS
2 adición de polímero	2 tratamiento con proteasa de Qiagen
3 liberación de ADN mediante NaOH	3 incubación a 70ºC durante 10 minutos.
	4 adición de etanol
	5 carga de la columna de centrifugación QIAamp y centrifugación.
	6 Lavar la columna con tampón,
	1 min centrifugación
	7 Lavar la columna con tampón,
	3 min centrifugación
	8 Eluir la columna con tampón

Una comparación del ADN de actina \beta amplificable medida mediante el protocolo de TaqMan actina \beta (8 réplicas) se muestra en la Tabla VI e indica un 58% de mejora en ADN amplificable recuperable usando el procedimiento de la invención (60,6 ng/ml en suero) comparado con el procedimiento Qiagen (25,3 ng/ml en suero).

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA VI Comparación de la extracción de ADN de actina \beta usando el procedimiento de la invención y el procedimiento Qiagen

6

Ejemplo 4 Recuperación de ADN de actina \beta a partir de suero de individuos diagnosticados con cáncer pancreático y controles usando el procedimiento de la invención

Este ejemplo proporciona los resultados de los experimentos que proporcionan una medición cuantitativa de la cantidad de ADN de actina \beta recuperado a partir del suero de pacientes normales y con cáncer pancreático usando el procedimiento de la invención de acuerdo con los materiales y procedimientos del ejemplo 8 en esta memoria descriptiva. El ADN de actina \beta así recuperado de cada muestra se cuantificó usando el protocolo de TaqMan actina \beta descrito anteriormente.

Como se muestra en la tabla VII, usando el procedimiento de la invención un total de 8 réplicas del mismo acúmulo de suero humano produjo una media de 12 ng de ADN de actina \beta/ml de suero, mientras que el ADN de actina \beta en el suero de 10 pacientes diferentes de cáncer pancreático recuperado usando el procedimiento de la invención se elevó en gran medida (media = 146 ng/ml). Estos hallazgos de ADN de actina \beta elevado en el suero de los individuos que tienen cáncer pancreático comparado con el de los normales se soportan mediante varias reseñas en la bibliografía (4,9).

TABLA VII Extracción de ADN de actina \beta a partir del acúmulo de suero normal y suero de individuos aquejados de cáncer pancreático usando el procedimiento de la invención

7

Ejemplo 5 Comparación del procedimiento de la invención y procedimiento de Qiagen para la recuperación de ADN de actina \beta a partir de suero de individuos diagnosticados con cáncer pancreático

En este ejemplo, la recuperación de ADN de actina \beta a partir de 6 pacientes con cáncer pancreático confirmado se comparó usando el procedimiento de la invención y el procedimiento de Qiagen de acuerdo con los materiales y los procedimientos del ejemplo 3 en esta memoria descriptiva. En general, como se muestra en la tabla VIII, el procedimiento de la invención produjo niveles más altos o comparables de ADN de actina \beta según se ensayó mediante en ensayo de TaqMan actina \beta. Dependiendo de la muestra, las concentraciones de ADN medible variaba entre 31 y 310 ng/ml.

TABLA VIII Comparación de extracción de ADN de actina \beta a partir de suero de individuos aquejados de cáncer pancreático usando el procedimiento de la invención y procedimiento de Qiagen

9

Los resultados son la media de 4 réplicas por muestra, excepto para la muestra 1 y 2 que son la media de 6 réplicas. La muestra 2 evaluada con el protocolo de Qiagen es la media de 2 réplicas.

Ejemplo 6 Aislamiento de ADN circulante a partir de suero de pacientes normales y con cáncer usando el procedimiento de la invención

Este ejemplo ilustra la utilidad del procedimiento de la invención para aislar el ADN circulante a partir de suero de 20 individuos normales y 30 individuos que tienen una diagnosis de cáncer confirmado. El suero de pacientes con cáncer incluyó 10 pacientes con cáncer pancreático confirmado, y 20 muestras de cáncer de colon (8 Dukes B, 5 Dukes C, y 7 Dukes D). El ADN se aisló según el procedimiento de la invención como en el procedimiento descrito en el ejemplo 3 en esta memoria descriptiva. El ADN se cuantificó usando el ensayo TaqMan de actina \beta. La captura de polímero sin el uso de un reactivo de lisis permitió que el ADN circulante se concentrara con una contaminación mínima o sin contaminación con ADN a partir de lisis de células indeseables y eliminación de las interferencias de la PCR que pueden estar presentes en suero. El ADN en cada suero se cuantificó mediante el ensayo de TaqMan para el gen de actina \beta usando la curva patrón en esta memoria descriptiva en la figura 1.

Los resultados se los análisis para el ADN circulante libre en cada muestra se muestran en las tablas IX y IX B e indican que los niveles de ADN son elevados en suero de pacientes con cáncer comparados con el suero de los individuos normales.

TABLA IX A Contenido de ADN en el suero de pacientes de cáncer

10

TABLA IX B Contenido de ADN en el suero de pacientes normales

12

Ejemplo 7 Detección de las mutaciones K-ras en el suero de pacientes de cáncer pancreático

En este ejemplo, se empleó una realización de la invención que implica la captura con polímero de ADN a partir del suero de pacientes con cáncer pancreático. Se realizó la PCR selectiva mediada por la endonucleasa de restricción (abreviadamente en inglés REMS-PCR) (Roberts, N. J. y col., 1999, Biotechniques 27: (3) 418-422, Ward, R. y col., 1998, Am. J. Pathol. 153 (2): 373-379, y el documento WO 96/32500) seguido de análisis sobre gel que se usó para detectar la presencia de una mutación K-ras en el codón 12 (K12-ras).

Suero o plasma (300 \mul) de cada uno de los pacientes de cáncer pancreático se añadió a tubos separados de microcentrífuga, seguido de la adición de 100 \mul de tampón ACES 250 mM (ácido N-(2-acetamido)-2-aminoetanosulfónico) (pH 6,8 a 23ºC). Se añadieron quince microlitros (15 \mul) de polímero poli(1-vinilimidazol-co-2-hidroxietilmetacrilato (relación en peso 77/23) (véanse las patentes de Estados Unidos números 5.434.270; 5.523.368 y 5.582.988) y los tubos se mezclaron mediante un mezclador minivortex (VWR Scientific, Rochester, N. Y.) durante 10 segundos. Después los tubos se centrifugaron en una microcentrífuga Eppendorf, modelo 5415, a la velocidad máxima durante 2 minutos. El fluido sobrenadante se decantó y se añadieron a cada tubo 100 \mul de hidróxido sódico 20 mM, y el sedimento se volvió a suspender mezclando y se calentó hasta 100ºC durante 10 minutos.

Cada mezcla de PCR contenía tres conjuntos de cebadores. Los cebadores de diagnóstico inducen un sitio de restricción Bstn1 en ras de tipo salvaje, pero no en una mutación en el codón 12 de ras. Así pues, el ADN de tipo salvaje de ras se escinde selectivamente durante termociclación con la PCR, y se enriquecen las secuencias mutantes de ras en el codón 12. El par de cebadores de control de la PCR se usa para confirmar que se ha extraído el ADN amplificable de la PCR, y el par de cebadores de control de enzimas confirma que la enzima de restricción funcionó durante la termociclación. Las mezclas de reacción contenían 12 unidades/100 \mul de la Taq polimerasa recombinante, y un exceso 5 veces en peso (0,842 \mul) de anticuerpos inhibidores de Taq TPA-9,2 (véanse las patentes de Estados Unidos números 5.338.671 y 5.587.287) sobre la polimerasa, tampón HT50 1 mM (cloruro sódico 100 mM, y Tris (tris(hidroximetil)aminometano) 50 mM, pH 8,3, 0,3 \muM de cebadores de diagnóstico (véase más adelante), 5K15S (SEC ID Nº 1) y 5K37 (SEC ID Nº 2), 0,05 \muM de pares de cebadores de control de la PCR), 3K42 (SEC ID Nº 3) y 5BK5 (SEC ID Nº 4), 0,1 \muM de pares de cebadores control, 5N12A (SEC ID Nº 5) y 3N13A (SEC ID Nº 6), 0,2 mM de trifosfatos de disnucleósidos (dNTP) totales, 0,3 unidades/\mul de Bsl1 (New England BioLabs, Beverly MA), ditiotreitol 1 mM (DTT), cloruro de magnesio 5 mM, muestra (típicamente 3 \mul) y agua desionizada hasta un volumen final de 100 \mul. La polimerasa Taq y anticuerpos anti-Taq se combinaron y se incubaron durante 10-15 minutos antes de la adición de los otros componentes de la PCR. Los parámetros de termociclación eran como sigue: 1 ciclo a 94ºC durante 100 segundos, y 36 ciclos a 92ºC durante 15 segundos, y 60ºC durante 60 segundos. Las secuencias de cebadores eran como sigue:

13

Las muestras se analizaron mediante electroforesis sobre gel de agarosa NUSieve (FMC Bioproducts, Rockaland, ME) al 4% p/v y se representó mediante un sistema de video Stratagene Eagle Eye II (La Jolla, CA).

La figura 2 muestra los resultados de análisis para una mutación ras K-12 como se determina mediante electroforesis sobre gel después de REMS-PCR. La banda 1 muestra los resultados para K-562, que es de tipo salvaje para ras. La banda 2 muestra los resultados para un ADN Calul, heterocigoto para una mutación K-ras en el codón 12 (Capon, D. J. y col., 1983, Nature 403: 507-513) y un exceso de 10 veces de ADN de tipo salvaje K-562. Esta muestra presenta una banda control de PCR fuerte en 167 pares de bases y una banda de diagnosis fuerte en 68 pares de bases. Tanto el suero como el plasma del paciente 1 perdieron una banda de diagnosis en 68 pares de bases y son negativas para una K-ras. La presencia del ADN amplificable de la PCR se indica mediante la banda de control de la PCR en 167 pares de bases. Las muestras de plasma y suero del paciente 2 perdieron una banda de control de la PCR en 167 pares de bases indicando que no existe ADN amplificable circulante detectable en esta muestra. Tanto el suero como el plasma del paciente 3 con cáncer pancreático eran positivos para una mutación K-12 ras indicada mediante la banda en 68 pares de bases así como una banda de control de la PCR fuerte en 167 pares de bases. Una banda de control de enzimas en 126 pares de bases está ausente en todas las muestras en la figura 2, indicando que la enzima de restricción era activa durante la ciclación por la PCR.

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<110> Belly, Robert T

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Sun, Jianbo

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<120> CAPTURA RÁPIDA Y EFICAZ DE ADN A PARTIR DE UNA MUESTRA SIN USAR REACTIVO DE LISIS CELULAR

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<130> CDS219CKG_PCT-SECUENCIAS

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<140>

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<141>

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<150> 60/132.443

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<151> 1999-05-04

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<160> 6

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 28

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<212> ADN

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<213> HUMANO

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<400> 1

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tgaatataaa cttgtggtac ctggagct

\hfill

28

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<210> 2

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<211> 28

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<212> ADN

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<213> HUMANO

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<400> 2

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atataaactt gtggtagttc cagctggt

\hfill

28

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<210> 3

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<211> 26

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<212> ADN

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<213> HUMANO

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<400> 3

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gaattagctg tatcgtcaag gcactc

\hfill

26

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<210> 4

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<211> 21

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<212> ADN

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<213> HUMANO

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<400> 4

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tcagcaaaga caagacaggt a

\hfill

21

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<210> 5

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<211> 26

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<212> ADN

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<213> HUMANO

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<400> 5

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tatagatggt gaaacctgtt tgttgg

\hfill

26

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<210> 6

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<211> 29

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<212> ADN

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<213> HUMANO

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<400> 6

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\hskip-.1em\dddseqskip

cttgctatta ttgatggcaa ccacacaga

\hfill

29

Claims (9)

1. Un procedimiento para proporcionar un ácido nucleico a partir de una muestra sin el uso de un reactivo de lisis celular, que comprende las etapas de:

A)

a un pH de menos de 7, poner en contacto una muestra sospechosa de contener un ácido nucleico con un polímero soluble en agua, débilmente básico que comprende unidades recurrentes derivadas mediante polimerización por adición de:

1)

entre aproximadamente 15 y 100 por ciento en peso de un monómero polimerizable débilmente básico etilénicamente insaturado que tiene al menos un grupo que se puede protonar a pH ácido y que se selecciona entre el grupo constituido por aminoalquilo, imidazolilo, isoxazolilo, piridilo, piperidilo, piperazinilo, pirazolilo, triazolilo, tetrazolilo, oxadiazolilo, piridazinilo, pirimidilo, pirazinilo, quinolinilo y quinazolinilo

2)

entre 0 y aproximadamente 35 por ciento en peso de un monómero no iónico, hidrófilo etilénicamente insaturado, y

3)

entre 0 y aproximadamente 85 por ciento en peso de un monómero polimerizable, no iónico, hidrófobo etilénicamente insaturado en una cantidad suficiente para formar un precipitado insoluble en agua de dicho polímero débilmente básico con todos los ácidos nucleicos presentes en dicho lisado,

B)

separar dicho precipitado insoluble en agua de dicha muestra, y

C)

poner en contacto dicho precipitado con una base para elevar el pH de la solución hasta uno mayor que 7, y por lo tanto liberar dichos ácidos nucleicos de dicho polímero débilmente básico, comprendiendo dicho polímero débilmente básico unidades recurrentes derivadas mediante polimerización por adición de uno o más monómeros polimerizables etilénicamente insaturados que tienen un grupo amino que se puede protonar a pH ácido.

2. El procedimiento de la reivindicación 1 que además comprende la etapa:

D)

ajustar el pH de dicha solución que contiene dichos ácidos nucleicos liberados a entre aproximadamente 6 y aproximadamente 9.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que dicha base es hidróxido sódico, hidróxido potásico, hidróxido amónico, hidróxido de litio, carbonato sódico, bicarbonato sódico, una amina terciaria o tris(hidroximetil)aminometano.

4. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que dicho polímero débilmente básico se usa en la etapa A) en una cantidad de entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 0,5% en peso.

5. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que en la etapa C) se usa una base débil, acompañado de calentamiento de dicho precipitado insoluble en agua a entre aproximadamente 50º y aproximadamente 125ºC.

6. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que en la etapa C) se usa una base fuerte sin calentar dicho precipitado insoluble en agua.

7. Un procedimiento para la amplificación y detección de un ácido nucleico diana sin el uso de un reactivo de lisis celular, que comprende:

I)

proporcionar una muestra sospechosa de contener un ácido nucleico diana,

II)

someter dicha muestra que contiene el ácido nucleico diana a las etapas de:

A)

a un pH menor de 7, poner en contacto dicho ácido nucleico diana con un polímero soluble en agua, débilmente básico que comprende unidades recurrentes derivadas mediante polimerización por adición de:

1)

entre aproximadamente 15 y aproximadamente 100 por ciento en peso de un monómero polimerizable débilmente básico etilénicamente insaturado que tiene al menos un grupo que se puede protonar a pH ácido y que se selecciona entre el grupo constituido por aminoalquilo, imidazolilo, isoxazolilo, piridilo, piperidilo, piperazinilo, pirazolilo, triazolilo, tetrazolilo, oxadiazolilo, piridazinilo, pirimidilo, pirazinilo, quinolinilo y quinazolinilo

2)

entre 0 y aproximadamente 35 por ciento en peso de un monómero polimerizable no iónico, hidrófilo etilénicamente insaturado, y

3)

entre 0 y aproximadamente 85 por ciento en peso de un monómero polimerizable no iónico, hidrófobo etilénicamente insaturado en una cantidad suficiente para formar un precipitado insoluble en agua de dicho polímero débilmente básico con todos los ácido nucleicos presentes en dicha muestra, incluyendo dicho ácido nucleico diana,

B)

separar dicho precipitado insoluble en agua de dicha muestra, y

C)

poner en contacto dicho precipitado con una base para elevar el pH de la solución hasta uno mayor que 7, y por lo tanto liberar dichos ácidos nucleicos, incluyendo dicho ácido nucleico diana, de dicho polímero débilmente básico, comprendiendo dicho polímero débilmente básico unidades recurrentes derivadas mediante polimerización por adición de uno o más monómeros polimerizables etilénicamente insaturados que tienen un grupo amino que se puede protonar a pH ácido.

III)

sin ajuste adicional de pH, amplificar dicho ácido nucleico diana liberado, y

IV)

detectar dicho ácido nucleico diana amplificado.

8. El procedimiento de la reivindicación 7 en el que dicho polímero débilmente básico es insoluble en agua a pH básico, y comprendiendo dicho procedimiento además la etapa de retirar dicho polímero insoluble en agua después de la liberación de dicho ácido nucleico diana de él y antes de la amplificación del mismo.

9. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que el ácido nucleico diana es una secuencia K-ras.