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ES2665280T3 - Métodos para la extracción y purificación de componentes de muestras biológicas - Google Patents

Métodos para la extracción y purificación de componentes de muestras biológicas Download PDF

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ES2665280T3
ES2665280T3 ES08781182.4T ES08781182T ES2665280T3 ES 2665280 T3 ES2665280 T3 ES 2665280T3 ES 08781182 T ES08781182 T ES 08781182T ES 2665280 T3 ES2665280 T3 ES 2665280T3
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ES
Spain
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nucleic acid
neutralization
elution
buffer
sample
Prior art date
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Active
Application number
ES08781182.4T
Other languages
English (en)
Inventor
Matthew P. Collis
Michael Lizzi
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Becton Dickinson and Co
Original Assignee
Becton Dickinson and Co
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Publication date
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Abstract

Un método para extraer componentes de ácidos nucleicos de una muestra biológica, que comprende: (i) en un recipiente, unir de manera reversible al menos un componente de un ácido nucleico de la muestra biológica a al menos una partícula paramagnética, siendo dicha partícula paramagnética una partícula de óxido de hierro en un entorno ácido; (ii) separar al menos una partícula paramagnética unida al componente del ácido nucleico, de los componentes sin unir de las muestras biológicas; (iii) lavar al menos una partícula paramagnética unida al componente de ácido nucleico; (iv) separar al menos una partícula paramagnética unida al componente de ácido nucleico de lavado; (v) eliminar al menos un componente de ácido nucleico a partir de al menos una partícula paramagnética mediante elución en dos etapas y un proceso de neutralización que comprende - extraer al menos una partícula paramagnética unida al componente de ácido nucleico con una disolución tampón de elución de pH básico que consiste en hidróxido potásico o hidróxido sódico, produciendo así una muestra eluida; y - seguido de la neutralización de la muestra eluida mediante la adición posterior de un tampón de neutralización seleccionado de bicina, Tris, ácido 2-(ciclohexilamino)etanosulfónico (CHES), N,N-bis(2-hidroxietil)-2-aminoetano sulfónico (BES), ácido 4-morfolinopropanosulfónico (MOPS) o fosfato, produciendo así un tampón optimizado; (vi) seguido de la separación y eliminación de las partículas paramagnéticas tras la neutralización de la muestra mientras que la disolución de pH optimizado que contiene el ácido nucleico sin unir se transfiere para una manipulación adicional, en donde la etapa de eliminación se separa de la etapa de neutralización.

Description

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DESCRIPCION
Métodos para la extracción y purificación de componentes de muestras biológicas Campo de la invención
La presente invención se refiere generalmente a composiciones y métodos útiles para la extracción de materiales biológicos, en particular de ácidos nucleicos a partir de muestras biológicas. Más específicamente, la presente invención se refiere a la separación de ácidos nucleicos a partir de muestras biológicas.
Antecedentes de la invención
En la discusión siguiente se describirán determinados artículos y métodos con propósitos informativos e introductorios. Nada de lo que contiene la presente memoria se interpreta como una “admisión” de la técnica anterior. Los solicitantes se reservan expresamente el derecho de demostrar, cuando sea apropiado, que los artículos y métodos a los que se hace referencia en la presente memoria no constituyen la técnica anterior bajo las disposiciones legales aplicables.
En metodologías diagnósticas y bioquímicas, es imprescindible el acceso a la extracción o a la purificación de componentes celulares, tales como los ácidos nucleicos, y el acceso a la extracción o purificación de formas proteicas. El acceso a los ácidos nucleicos se requiere en metodologías tales como la secuenciación de ácidos nucleicos, la detección directa de secuencias de ácidos nucleicos particulares mediante la hibridación de ácidos nucleicos, y técnicas de amplificación de secuencias de ácidos nucleicos. Por lo tanto, un método para extraer y purificar ácidos nucleicos deberá ser simple, rápido y requerir, si la hubiera, una escasa manipulación adicional de la muestra para obtener el acceso al ácido nucleico deseado. Un método con todas estas características será extremadamente atractivo en la automatización de la preparación de muestras, un objetivo de los laboratorios de investigación y diagnóstico. El acceso a formas de proteínas purificadas se consigue a través de técnicas tales como la cromatografía de exclusión, cromatografía de intercambio iónico, precipitación diferencial, y similares. Estas metodologías, sin embargo, son problemáticas por varias razones. Por ejemplo, las técnicas de precipitación son aún rudimentarias y difíciles de automatizar, y a menudo dan como resultado una pérdida inaceptable de la muestra, mientras que la cromatografía es cara y requiere mucho tiempo.
Se describen métodos eficaces para la purificación y la manipulación de ácidos nucleicos empleando partículas paramagnéticas en las Patentes U.S. 5.973.138 (“138”) y 6.433.160 (“160”). Las partículas paramagnéticas empleadas en las mismas, se unen de manera reversible a los ácidos nucleicos en las muestras biológicas y permiten la separación de ácidos nucleicos a partir de algunos de los demás componentes en las muestras biológicas. Una vez extraídos, los ácidos nucleicos unidos se eliminan de las partículas paramagnéticas a través de un tampón de elución/neutralización. Las partículas paramagnéticas se eliminan a continuación del tampón de elución/neutralización que contiene los ácidos nucleicos. El tampón que contienen los ácidos nucleicos se puede emplear en una manipulación adicional de los ácidos nucleicos extraídos, tal como la hibridación, restricción, marcaje, transcripción inversa y amplificación.
La purificación proteica mediante fraccionamiento rápido a partir de muestras biológicas se divulga en la Publicación de la concesión anterior 2006-0030056 (“0056”). Las proteínas en las muestras biológicas se separan mediante la unión de manera reversible de una molécula proteica a una partícula paramagnética en una muestra biológica. La muestra se puede someter a un proceso adicional para obtener una muestra proteica en una forma más pura o una muestra más reducida de proteínas seleccionadas. Un método que incremente la separación y el aislamiento de los componentes o de las muestras biológicas, tal como ácidos nucleicos y proteínas a partir de una muestra, mejoraría el producto disponible para las metodologías diagnósticas y bioquímicas.
La Patente US 2007/031880 divulga un método para extraer componentes de una muestra biológica, que comprende una etapa de extraer el componente de la partícula paramagnética mediante la adición de un tampón de elución y un tampón de neutralización. Describe la adición de un tampón de elución y un tampón de neutralización en la misma etapa.
La Patente US 2007/092403 divulga métodos similares para aislar el ARN o ADN a partir de muestras biológicas. Compendio de la invención
La presente invención se dirige a un método de extracción de componentes de muestras biológicas.
En particular, la presente invención se refiere a un método para extraer componentes de ácidos nucleicos de una muestra biológica, que comprende:
(i) en un recipiente, unir de manera reversible al menos un componente de un ácido nucleico de la muestra biológica a al menos una partícula paramagnética, siendo dicha partícula paramagnética una partícula de óxido de hierro en un entorno ácido;
(ii) separar al menos una partícula paramagnética unida al componente del ácido nucleico de los componentes
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sin unir de la muestras biológica;
(iii) lavar al menos una partícula paramagnética unida al componente de ácido nucleico;
(iv) separar al menos una partícula paramagnética unida al componente de ácido nucleico de lavado;
(v) eliminar al menos un componente de ácido nucleico a partir de al menos una partícula paramagnética mediante elución en dos etapas y un proceso de neutralización que comprende
- extraer al menos una partícula paramagnética unida al componente de ácido nucleico con una disolución tampón de elución de pH básico que consiste en hidróxido potásico o hidróxido sódico, produciendo así una muestra eluida; y
- seguido de neutralización de la muestra eluida mediante la adición subsecuente de un tampón de neutralización seleccionado de bicina, Tris, ácido 2-(ciclohexilamino)etanosulfónico (CHES), N,N- bis(2-hidroxietil)-2-aminoetano sulfónico (BES), ácido 4-morfolinopropanosulfónico (MOPS) o fosfato, produciendo así un tampón optimizado;
(vi) seguido de la separación y eliminación de las partículas paramagnéticas tras la neutralización de la muestra mientras que la disolución de pH optimizado que contiene el ácido nucleico sin unir se transfiere para una manipulación adicional, en donde la etapa de eliminación se separa de la etapa de neutralización.
Las realizaciones preferidas de la presente invención son evidentes a partir de las reivindicaciones dependientes.
La presente invención proporciona un método para extraer componentes de ácidos nucleicos de muestras biológicas, que es simple, rápido y que requiere, si la hubiera, una escasa manipulación adicional de la muestra.
La presente invención proporciona un método que aumentaría la eficacia de la separación y del aislamiento de componentes de ácidos nucleicos de una muestra biológica.
La presente invención proporciona procesos mejorados para optimizar la extracción de componentes de ácidos nucleicos de muestras biológicas. Estos procesos de extracción optimizada aumentan significativamente la capacidad de separar y recuperar componentes de ácidos nucleicos, para metodologías diagnósticas y bioquímicas adicionales.
Las realizaciones de la presente invención proporcionan un método para extraer componentes de ácidos nucleicos a partir de muestras biológicas empleando el ajuste de pH de tampones para elución y neutralización de componentes biológicos diana.
Se dan también a conocer kits para llevar a cabo el método de extracción y purificación de componentes de una muestra biológica, tal como moléculas biológicas, orgánulos, y células a partir de las muestras biológicas.
Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una representación gráfica de los resultados del Ejemplo 7.

La Figura 2 es una representación gráfica de los resultados del Ejemplo 7.

La Figura 3 es una representación gráfica de los resultados del Ejemplo 7.

La Figura 4 es una representación gráfica de los resultados del Ejemplo 7.

La Figura 5 es una representación gráfica de los resultados del Ejemplo 7.

La Figura 6 es una representación gráfica de los resultados del Ejemplo 7.

La Figura 7 es una representación gráfica de los resultados del Ejemplo 7.

La Figura 8 es una representación gráfica de los resultados del Ejemplo 7.

La Figura 9 es una representación gráfica de los resultados del Ejemplo 8.

La Figura 10 es una representación gráfica de los resultados del Ejemplo 8.

La Figura 11 es una representación gráfica de los resultados del Ejemplo 8.

La Figura 12 es una representación gráfica de los resultados del Ejemplo 8.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se dirige generalmente a métodos para la extracción de componentes de muestras biológicas.
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En particular, la presente invención describe un método de extracción de ácidos nucleicos a partir de una muestra biológica, en donde el ácido nucleico extraído se puede manipular adicionalmente mediante medios tales como metodologías de hibridación, restricción, marcaje, transcripción inversa y amplificación. Los métodos descritos en la presente memoria presentan procesos mejorados para optimizar la extracción de ácidos nucleicos a partir de muestras biológicas. Estos procesos de extracción optimizados incrementan significativamente la separación y recuperación de ácidos nucleicos para metodologías diagnósticas y bioquímicas adicionales.
Como se emplea en la presente memoria, los términos “purificar” y “purificación” incluyen también extraer/extracción, aislar/aislamiento y concentrar/concentración y no requiere pureza absoluta, sino que sólo requiere eliminar al menos alguno o todos los componentes de la muestra biológica. En la práctica se supone que los profesionales purificarán aproximadamente al 80% de pureza o más, preferiblemente 80%, 90%, 95% o más.
Las muestras biológicas empleadas según la presente invención, por ejemplo, muestras clínicas, forenses o medioambientales, pueden ser cualquier material biológico, preferiblemente que contiene ácido nucleico. Estas muestras pueden contener cualquier material viral o celular, incluyendo células procariotas o eucariotas, virus, bacteriófagos, micoplasmas, protoplastos y orgánulos, o cualquier parte de los mismos. Un componente de una muestra biológica como se emplea en la presente memoria puede ser cualquier parte de la muestra, que incluye material biológico y moléculas biológicas. Tales materiales biológicos pueden comprender todos los tipos de células de animales mamíferos o no mamíferos, células vegetales, algas (incluyendo las algas verde-azuladas), hongos, bacterias, levaduras, protozoos y virus. Las realizaciones de esta invención se emplean para extraer ácidos nucleicos de estas composiciones. Ejemplos representativos de materiales biológicos incluyen la sangre y productos derivados de la sangre, tales como sangre entera, plasma y suero; muestras clínicas, tales como semen, orina, heces, esputos, tejidos, cultivos celulares y suspensiones celulares, aspiraciones nasofaríngeas y frotis, incluyendo los frotis endocervical, vaginal, ocular, de garganta y bucal; y otros materiales biológicos, tales como uñas de las manos y los pies, piel, pelo, y fluido cerebroespinal u otro fluido corporal. Las muestras medioambientales incluyen tierra, agua, aire, efluentes en suspensión, polvos y otras fuentes de material que contienen ácido nucleico.
Las muestras biológicas de la presente invención se pueden pre-tratar para asegurar la liberación de los ácidos nucleicos en la muestra biológica de extracción. El pre-tratamiento de las muestras biológicas con este propósito se describe en la Publicación de la concesión anterior U.S. 2004-0157218 (“7218”). Como se divulga en la publicación 7218, se puede emplear preferiblemente una proteína desnaturalizada en el proceso de pre-tratamiento. Una proteína desnaturalizada que es útil en la presente invención incluye un agente o agentes que causan un incremento en el pH, tal como hidróxido potásico (KOH).
Los ácidos nucleicos de la presente invención se unen preferiblemente de forma reversible a las partículas paramagnéticas como se divulga mediante los métodos de las publicaciones 138 y 160. En las publicaciones 138 y 160, se encontró que cuando las partículas paramagnéticas de la invención estaban en un medio ácido, se unirían de manera reversible a las moléculas de ácido nucleico sin necesidad de un detergente aniónico, como se enseña en la Publicación Internacional N° WO 96/18731. Como se emplea en la presente memoria, el término de partícula o partículas paramagnéticas significa partícula o partículas como se describen en las publicaciones 138 y 160.
Dentro del significado de la presente invención, las etapas del método para la separación de la partícula paramagnética unida a los ácidos nucleicos de los demás componentes de la muestra biológica son preferiblemente las etapas del método descritas en las publicaciones 138 y 160.
En una realización preferida, la partícula paramagnética unida a las moléculas de ácido nucleico se pueden extraer con un tampón de elución adecuado obtenido aumentando el pH de tal medio. En métodos anteriores, la etapa de elución comprendía la adición de un tampón diseñado para eliminar los ácidos nucleicos en general de las partículas paramagnéticas y para neutralizar la disolución al mismo tiempo para la manipulación adicional, tal como hibridación, restricción, marcaje, transcripción inversa y amplificación. La extracción de los ácidos nucleicos de las partículas paramagnéticas en una etapa separada de la neutralización permite la optimización del pH del tampón de elución para extraer el ácido nucleico, logrando así de forma inesperada una mayor capacidad para separar y recuperar el ácido nucleico no unido en relación a la que se consigue con una sola etapa de elución/neutralización anterior con tampones modelo. Como se describe en la presente memoria, las partículas paramagnéticas, tales como óxido de hierro, se unen a ácidos nucleicos cargados negativamente en un pH ácido con una carga neta positiva. En un pH neutro a básico, las partículas paramagnéticas, tales como óxido de hierro, no están lo suficientemente cargadas positivamente y extraen los ácidos nucleicos. Agentes que emplean para ayudar en la elución del ácido nucleico de las partículas paramagnéticas, son disoluciones básicas que consisten en hidróxido potásico (KOH), o hidróxido sódico (NaOH) que incrementarán el pH del medio hasta un nivel suficiente como para que el ácido nucleico electronegativo se desplace de las partículas paramagnéticas.
La condición para la elución de ácidos nucleicos aparece a valores de pH de 8 a 14. Se desea una elución a un pH lo más alto posible sin degradación para prevenir la auto re-asociación no específica de la hebra de ácido nucleico y para optimizar la liberación de los ácidos nucleicos de las partículas paramagnéticas. Una elución a pH alto y la desnaturalización de híbridos de ADN:ADN, ADN:ARN o ARN:ARN también es beneficioso para aplicaciones subsiguientes que requieren una diana monocatenaria, tal como la hibridación, en particular la hibridación de una sonda, o la amplificación, en particular la amplificación de ácido nucleico isotérmico. El mantenimiento del ácido
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nucleico diana en forma monocatenaria evita la necesidad de una desnaturalización con calor posterior antes de la hibridación de los cebadores o sondas complementarios. La auto re-asociación podría favorecer el enredo del ácido nucleico con la propia partícula paramagnética y evitar la separación del ácido nucleico de la partícula paramagnética en la etapa de elución. Otros tipos de partículas podrían emplear el concepto de elución seguido de neutralización.
Los ácidos nucleicos unidos a la partícula se eluyen con el tampón de elución hasta que se alcanza el resultado deseado. Por ejemplo, los ácidos nucleicos se pueden eluir de las partículas paramagnéticas con la adición de un tampón de elución de compuesto de KOH y mezclando, por ejemplo, por aspirado y dispensado de un volumen dado, hasta que se alcance el resultado deseado. Aunque este método es eficaz para la separación de ADN y ARN, se debe tener cuidado para evitar valores de pH y/o tiempos de exposición que puedan conducir a la degradación del ácido nucleico.
Eliminando de esta manera los ácidos nucleicos, el pH se optimiza para alcanzar la liberación máxima de los ácidos nucleicos unidos. De manera sorprendente, se encontró que realizando la etapa de elución de manera separada y permitiendo el uso de valores de pH altos, se daba como resultado un incremento de la reproducibilidad de la generación de la señal en ensayos de amplificación de ácido nucleico de las fases posteriores, en relación a la alcanzada usando un tampón de elución/neutralización combinado. La capacidad mejorada de recuperar y/o detectar los ácidos nucleicos fue inesperada. Por lo tanto, separando la etapa de elución de la etapa de neutralización se proporciona una ventaja significativa sobre los planteamientos anteriores.
Según la invención, se añade un tampón de neutralización después de la etapa de elución. El tampón de neutralización ajusta el valor del pH de la disolución de elución que contiene los ácidos nucleicos sin unir hasta un rango de pH preferido de 6 a 9, dependiendo de la aplicación posterior, más preferiblemente de 8 a 8,5, y lo más preferiblemente de 8,4. Neutralizando de esta manera la disolución que contiene los ácidos nucleicos sin unir, el pH del medio se optimiza para la manipulación adicional del ácido nucleico, tal como la hibridación, restricción, marcaje, transcripción inversa y amplificación. Esto se puede conseguir usando cualquier tampón de neutralización adecuado para alcanzar el valor de pH optimizado para la manipulación adicional. Un tampón de neutralización preferido es bicina, como se emplea en los ejemplos de a continuación. Tampones de neutralización alternativos incluyen, pero no se limitan a, Tris, CHES [ácido 2-(ciclohexilamino)etanosulfónico], BES (N,N-bis(2-hidroxietil)-2-aminoetano sulfónico), MOPS (ácido 4-morfolinopropanosulfónico) y fosfato. Otros tampones de neutralización útiles en el método de la presente invención se pueden determinar fácilmente por el experto en la técnica empleando métodos de cribado rutinarios que no requieren excesiva experimentación.
Después de la neutralización de la muestra, las partículas paramagnéticas se eliminan mientras la disolución de pH optimizado que contiene los ácidos nucleicos sin unir se transfieren para la manipulación adicional, tal como, por ejemplo, hibridación, restricción, marcaje, transcripción inversa y amplificación. Se emplea preferiblemente una fuerza magnética para separar las partículas paramagnéticas, como se describe en la presente memoria.
Otro aspecto de la presente divulgación proporciona kits para tratar una muestra biológica para la extracción de materiales biológicos de los mismos. Los kits pueden comprender al menos una proteína desnaturalizada como se describe en la presente memoria. Los kits pueden contener agua y disoluciones tampón como se describe en la presente memoria, así como partículas paramagnéticas u otros soportes sólidos para la extracción y/o purificación, que se describen en más detalle en otra parte. Los kits pueden contener también uno o más de los siguientes elementos para procesar y ensayar las muestras biológicas: dispositivos de recogida, tales como torundas, tubos y pipetas; controles; indicadores de pH; y termómetros. Los kits pueden incluir recipientes de reactivos mezclados juntos en las proporciones adecuadas para realizar el método de acuerdo con la presente invención. Los recipientes de reactivos contienen preferiblemente reactivos en cantidades unitarias que evitan etapas de medición cuando se realiza el método sujeto. Los kits de la presente divulgación pueden incluir tampones de elución optimizados para liberar los ácidos nucleicos de las partículas paramagnéticas, como se describe en la presente memoria. Los kits pueden incluir tampones de neutralización para aplicaciones de optimización posterior, tales como la hibridación, restricción, marcaje, transcripción inversa y amplificación de ácido nucleico, como se describe en la presente memoria.
Los kits de la presente divulgación pueden incluir también las mezclas de reacción, así como métodos para la extracción del ácido nucleico desde las mezclas de reacción. Las mezclas de reacción pueden comprender al menos una proteína desnaturalizada para realizaciones particulares cuando sea necesario. Las mezclas de reacción pueden incluir en algunas realizaciones varios reactivos empleados con las mezclas de reacción en cuestión, para purificar y detectar ácidos nucleicos, tal como tampones y óxido de hierro u otros soportes sólidos para la purificación de ácido nucleico.
Ejemplos
La invención se describirá a continuación con mayor detalle por medio de ejemplos específicos. Los siguientes ejemplos se presentan con propósitos ilustrativos. Los siguientes ejemplos ilustran la eficacia de las composiciones y métodos de la presente invención para pre-tratar muestras de sangre entera y plasma para la extracción optimizada de ácido nucleico y la manipulación optimizada. La sangre entera y el plasma están entre las muestras más
complicadas para la extracción de ácido nucleico debido a su elevado contenido proteínico; por lo tanto, se espera que los métodos de la presente invención sean también eficaces para otras muestras biológicas. En estos ejemplos, la unión reversible de las moléculas de ácido nucleico a las partículas paramagnéticas en un medio ácido se emplea para el aislamiento del ácido nucleico a partir de la mezcla de reacción resultante de tratar las muestras para la 5 extracción de ácido nucleico intacto según la presente invención. El pH de unión es preferiblemente de 1 a 6,5, más preferiblemente de 1 a 4, y lo más preferiblemente de 2. El pH de elución es preferiblemente de 8 a 14. Un experto en la técnica apreciará que el pH de elución se optimiza preferiblemente mediante el empleo de un pH que sea lo más alto posible sin causar la degradación de los ácidos nucleicos de la muestra. La tecnología de la partícula paramagnética captura los ácidos nucleicos de manera no específica, o independiente de la secuencia. Después de 10 la neutralización, el pH es preferiblemente de 6,0-9,0 dependiendo de la aplicación posterior. Más preferiblemente el pH es de 8 a 8,5, y lo más preferiblemente de 8,4.
Ejemplo 1: El tratamiento alcalino extrae el ADN a partir del óxido de hierro mejor que sólo con calor
Este ejemplo se realizó para determinar si el tratamiento de las muestras con KOH 150 mM extrae el ADN a partir del óxido de hierro mejor que sólo con calor.
15 Los materiales que se emplearon fueron como sigue:
Tampón Bicina 2X 300 mM
Tampón de muestra
Pocillos de cebador Chlamydia
Pocillos de amplificación Chlamydia
20 Pocillos de cebador de la Amplificación Control (AC)
Pocillos de Amplificación AC
KOH 150 mM
Muestras de plasma
Óxido de hierro
25 Tubos de Pre-tratamiento de Plasma (PPT)
El plasma se preparó a partir de sangre entera mediante la centrifugación de la sangre entera en Tubos de Pretratamiento de Plasma (PPT) en 1.100 g durante 10 minutos. Se preparó un volumen de 6 ml de plasma. Se añadieron por mililitro diez mil estructuras elementales (EB) de Chlamydia trachomatis (CT) al plasma original, que se dispensó en volúmenes iguales en seis tubos de centrifugación de 2 ml. Se prepararon otros 10 ml de la 30 suspensión bacteriana en agua desionizada (H2ODi) con 10.000 CT EB/ml y se repartieron en volúmenes de 10 x 1 ml. Se preparó otra suspensión que contiene 10.000 CT EB/ml en tampón de muestra que contiene Bicina 2X 300 mM.
Se repartieron cuarenta miligramos de óxido de hierro en cuatro tubos de plasma; se repartieron 80 pl de ácido acético en dos de los tubos, y se añadieron 300 pl de ácido acético a dos tubos que contienen plasma pero no óxido 35 de hierro. Los seis tubos se colocaron en un aparato de lisis durante 30 minutos a 105°C. Se añadieron cuarenta miligramos de óxido de hierro a los dos tubos que no contienen óxido de hierro después de la lisis; se añadieron 80 pl de ácido acético a los dos tubos que no contienen ácido. Después del mezclado, de la recuperación del óxido de hierro y de la eliminación de la matriz de la muestra, las partículas se lavaron dos veces con 1 ml/tubo de agua desionizada. Se trató un tubo de cada condición con 500 pl de KOH 150 mM durante 15 minutos antes de la adición 40 de tampón de muestra de Bicina 2X 300 mM. Como controles, se añadió a un tubo de cada condición un tampón de muestra que contiene KOH 75 mM/Bicina 2X 150 mM.
Se añadieron cuarenta miligramos de óxido de hierro en dos de los 10 tubos con 10.000 CT EB/ml en agua desionizada. Se añadieron 80 pl de ácido acético a los dos tubos que no contienen óxido de hierro y 300 pl de ácido acético a los dos tubos que contienen óxido de hierro. Se lisaron estos tubos y cuatro tubos sin tratamiento ácido 45 previo a 105°C durante 30 minutos. Los tubos que contienen óxido de hierro antes de la lisis tenían 80 pl repartidos en cada uno. Al resto de tubos se añadieron 40 mg de óxido de hierro y todos los tubos se colocaron en un dispositivo rotatorio de extremo sobre extremo durante 30 minutos. Después de la recuperación del óxido de hierro, las partículas se lavaron dos veces con 1 ml/tubo de agua desionizada. Se trató un tubo de cada condición con 500 pl de KOH 150 mM durante 15 minutos antes de la adición del tampón de muestra de Bicina 2X 300 mM. Como 50 controles, se añadió a un tubo de cada tipo un tampón de muestra que contiene KOH 75 mM/Bicina 2X 150 mM.
Los eluidos de todos los tubos se hirvieron durante 5 minutos y los lisados se ensayaron empleando micropocillos para el Ensayo de ADN Amplificado de Chlamydia trachomatis BD ProbeTec™ (Little et al., Clin Chem 1999; 45:777-
784). Tabla 1
Muestra
Óxido de Hierro en el lisador Ácido Acético en el lisador Tratamiento Alcalino CT MOTA AC MOTA*
Plasma
Si NO 80|jl Si 12988 9978
Plasma
Si NO 80jl NO 3937 18449
Lavar
SÍ NO 80jl Si 13664 9869
Lavar
Sí NO 80jl NO 116 5129
Lavar
NO NO 80jl Si 11727 8207
Lavar
NO NO 80jl NO 234 10788
Plasma
Si Si 80jl Si 84 4014
Plasma
Si Si 80jl NO 158 10916
Lavar
NO Si 80jl Si 160 7765
Lavar
NO Si 80jl NO 194 8481
Plasma
NO Si 300jl Si 77 9817
Plasma
NO Si 300jl NO 244 3541
Lavar
NO Si 300jl Si 5 4670
Lavar
NO Si 300jl NO 97 1931
Lavar
NO NO 300jl Si 1360 42
Lavar
NO NO 300jl NO 176 610
Control SB
Tampón de muestra 33912 12048
Control SB
Tampón de muestra 23450 9601
* AC -Amplificación Control
5 El valor MOTA (suma de unidades individuales de medición a lo largo del tiempo) representa el área bajo la curva de la fluorescencia relativa a lo largo del tiempo. El punto de corte establecido para una reacción positiva con el ensayo CT es de 2.000 MOTA. Es evidente que, en la mayoría de los casos, se obtuvieron valores MOTA superiores a partir de los lisados expuestos al proceso de las dos etapas de elución (KOH seguido de neutralización con Bicina).
5
10
15
20
25
30
Ejemplo 2: Menor volumen de elución empleado en la elución en dos etapas
Este ejemplo demuestra la recuperación de ARN empleando un proceso de elución en dos etapas.
Los materiales que se emplearon fueron como sigue:
Óxido de hierro
Tubos de pre-tratamiento de Plasma (PPT)
KPO4 30 mM KPO4 500 mM
Transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis aviar (AMV-RT)
Enzima de restricción BsoBI Proteína GP32
Albúmina de Suero Bovino (BSA)
Polimerasa Bst Glicerol 55%
Magnesio 200 mM Dimetilsulfóxido (DMSO)
Sonda Detectora Fluorescente
Cebadores de la Amplificación por Desplazamiento de la Hebra (SDA)
Cebadores Bumper
Desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTPs)
Proteinasa K
Formamida
Ácido de fijación
KOH
Bicina
Transcritos del gen gag del VIH
El plasma se pre-trató con formamida 44% y 5U de Proteinasa K durante 20 minutos a 65°C y 10 minutos a 70°C. Se añadió al plasma óxido de hierro y 180 pl de ácido de fijación. A las mezclas se añadieron 10.000 copias/ml del transcrito del gen gag del VIH. Después de la unión al óxido de hierro y del lavado, el ARN se extrajo con 120 pl bien de un tampón de elución de KOH 80 mM o bien 100 mM durante 20 minutos a 65°C. El eluido restante se neutralizó con 60 pl de bicina bien de 192 mM o bien de 230 mM, y se mezcló durante 2 minutos. El ARN se transcribió de forma inversa con AMV-RT y se amplificó mediante SDA empleando cebadores específicos de gag. (Nycz et al., Anal Biochem, 1998; 259:226-234). La detección ocurrió a tiempo real empleando una sonda detectora fluorescente. (Nadeau et al., Anal Biochem, 1999; 276:177-187).
Tabla 2
Elución con KOH
Neutralización con Bicina Concentración del transcrito de VIH/ml VIH/MOTA Media
80
230 4000 4108
80
230 4000 2098
80
230 4000 6550 4252
80
230 8000 37915
80
230 8000 1501
80
230 8000 9832 16416
80
192 4000 2
80
192 4000 13
80
192 4000 863 299
80
192 8000 24648
80
192 8000 24957
80
192 8000 41701 30435
100
230 4000 0
100
230 4000 0
100
230 4000 6 3
100
230 8000 0
100
230 8000 4
100
230 8000 1 2
100
192 4000 0
100
192 4000 0
100
192 4000 0 0
100
192 8000 0
100
192 8000 0
100
192 8000 3 1
Las muestras en las que se empleó para la elución una menor concentración de KOH 80 mM produjeron mayores valores MOTA, indicando una detección/amplificación más fuerte del ARN diana. Esto es probablemente porque la exposición a la mayor concentración de KOH (100 mM) causó la hidrólisis y degradación de los transcritos de ARN. 5 Este experimento demuestra, por lo tanto, la capacidad de extracción del óxido de hierro con el proceso de elución en dos etapas para recuperar el ARN a partir de una matriz biológica compleja. Sorprendentemente, la exposición del ARN a un mayor pH durante la etapa de elución no causó la degradación del ácido nucleico diana.
Ejemplo 3: Efecto del calor durante la elución en dos etapas
El ejemplo se realizó para determinar si el calor durante la elución a diferentes concentraciones de KOH afectaba a 10 la estabilidad y/o recuperación y/amplificación/detección del ARN.
5
10
15
20
25
30
Los materiales que se emplearon en este ejemplo fueron los siguientes:
Óxido de hierro
Tubos de Preparación de Plasma (PPT)
KPO4 30 mM KPO4 500 mM AMV RT
Enzima de restricción BsoBI Proteína GP32
Albúmina de Suero Bovino (BSA)
Polimerasa Bst Glicerol 55%
Magnesio 200 mM Dimetilsulfóxido (DMSO)
Sonda Detectora Fluorescente
Cebadores de la Amplificación por Desplazamiento de la Hebra (SDA)
Cebadores Bumper
Desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTPs)
Proteinasa K
Formamida
Ácido de fijación
KOH
Bicina
Transcritos del gen gag del VIH
El plasma se pre-trató con formamida 44% y 5U de Proteinasa K durante 20 minutos a 65°C y 10 minutos a 70°C. Se añadió al plasma óxido de hierro y 180 pl de ácido de fijación. A las mezclas se añadieron 5.000 copias/ml del transcrito del gen gag del VIH. Después de la unión al óxido de hierro y del lavado, el ARN se extrajo con 120 pl bien de un tampón de elución de KOH 60 mM, 70 mM, o bien 80 mM durante 2 minutos sin calor o bien durante 20 minutos a 65°C. Las muestras se neutralizaron inmediatamente mediante mezclado con 60 pl de bicina 230 mM durante 2 minutos. El ARN se transcribió de forma inversa con AMV-RT y se amplificó mediante SDA empleando cebadores específicos de gag. (Nycz et al., Anal Biochem, 1998; 259:226-234). La detección ocurrió a tiempo real empleando una sonda detectora fluorescente. (Nadeau et al., Anal Biochem, 1999; 276:177-187).
Tabla 3
Elución con KOH (mM)
MOTA Media
60
SIN CALOR 20256
60
SIN CALOR 14841
60
SIN CALOR 13690
60
SIN CALOR 3821 13152
70
SIN CALOR 23759
70
SIN CALOR 5870
70
SIN CALOR 1923
70
SIN CALOR 11908 10865
80
SIN CALOR 6006
80
SIN CALOR 21826
80
SIN CALOR 4887
80
SIN CALOR 17973 12623
60
CON CALOR 34805
60
CON CALOR 25907
60
CON CALOR 18274
60
CON CALOR 6884 21467
70
CON CALOR 14220
70
CON CALOR 18591
70
CON CALOR 3872
70
CON CALOR 2297 9745
80
CON CALOR 3220
80
CON CALOR 3930
80
CON CALOR 75
80
CON CALOR 0 1806
Se obtuvieron valores MOTA positivos (>2000) bajo todas las condiciones. Estos datos indican, por lo tanto, que es posible extraer ARN a partir del óxido de hierro sin emplear calor usando un método de elución en dos etapas que implica la exposición al KOH tras la neutralización con bicina. El procedimiento sin calor tiene la ventaja de requerir 5 una instrumentación menos sofisticada.
Ejemplo 4: Optimización de las condiciones de elución
Este experimento se realizó para optimizar las condiciones de elución.
Los materiales que se emplearon en este ejemplo fueron los siguientes:
Óxido de hierro
10 Tubos de Preparación de Plasma (PPT)
KPO4 30 mM KPO4 500 mM AMV RT
5
10
15
20
25
Enzima de restricción BsoBI Proteína GP32
Albúmina de Suero Bovino (BSA)
Polimerasa Bst Glicerol 55%
Magnesio 200 mM Dimetilsulfóxido (DMSO)
Sonda Detectora Fluorescente
Cebadores de la Amplificación por Desplazamiento de la Hebra (SDA)
Cebadores Bumper
Desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTPs)
Proteinasa K
Formamida
Ácido de fijación
KOH
Bicina
Transcritos del gen gag del VIH
El plasma se pre-trató con formamida 44% y 5U de Proteinasa K durante 20 minutos a 65°C y 10 minutos a 70°C. Se añadió al plasma óxido de hierro y 180 pl de ácido de fijación. A las mezclas se añadieron 10.000 copias/ml del transcrito del gen gag del VIH. Después de la unión al óxido de hierro y del lavado, el ARN se extrajo con 120 pl bien de un tampón de elución de KOH 46 mM, 55 mM, 63 mM o bien 80 mM durante 20 minutos a 65°C. Las muestras se neutralizaron entonces con 60 pl de bicina 109 mM y se mezclaron durante 2 minutos. El ARN se transcribió de forma inversa con AMV-RT y se amplificó mediante SDA empleando cebadores específicos de gag. (Nycz et al., Anal Biochem, 1998; 259:226-234). La detección ocurrió a tiempo real empleando una sonda detectora fluorescente. (Nadeau et al., Anal Biochem, 1999; 276:177-187).
Tabla 4
Condición
MOTA Media
KOH 80 mM, bicina 109 mM, KPO4 24 mM
CON CALOR 5887
KOH 80 mM, bicina 109 mM, KPO4 24 mM
CON CALOR 5648
KOH 80 mM, bicina 109 mM, KPO4 24 mM
CON CALOR 7377 6304
KOH 63 mM, bicina 109 mM, KPO4 50 mM
CON CALOR 5339
KOH 63 mM, bicina 109 mM, KPO4 50 mM
CON CALOR 4586
KOH 63 mM, bicina 109 mM, KPO4 50 mM
CON CALOR 1648 3857
KOH 46 mM, bicina 46 mM, KPO4 36 mM
CON CALOR 4731
KOH 46 mM, bicina 46 mM, KPO4 36 mM
CON CALOR 6466
KOH 46 mM, bicina 46 mM, KPO4 36 mM
CON CALOR 6147 5781
KOH 55 mM, bicina 56 mM, KPO4 43 mM
CON CALOR 5656
KOH 55 mM, bicina 56 mM, KPO4 43 mM
CON CALOR 10620
KOH 55 mM, bicina 56 mM, KPO4 43 mM
CON CALOR 9606 8627
KOH 80 mM, bicina 109 mM, KPO4 24 mM
SIN CALOR 5430
KOH 80 mM, bicina 109 mM, KPO4 24 mM
SIN CALOR 3559
KOH 80 mM, bicina 109 mM, KPO4 24 mM
SIN CALOR 1566 3518
KOH 63 mM, bicina 109 mM, KPO4 50 mM
SIN CALOR 72
KOH 63 mM, bicina 109 mM, KPO4 50 mM
SIN CALOR 91
KOH 63 mM, bicina 109 mM, KPO4 50 mM
SIN CALOR 107 90
KOH 46 mM, bicina 46 mM, KPO4 36 mM
SIN CALOR 2087
KOH 46 mM, bicina 46 mM, KPO4 36 mM
SIN CALOR 2581
KOH 46 mM, bicina 46 mM, KPO4 36 mM
SIN CALOR 2004 2224
5
10
15
20
25
30
KOH 55 mM, bicina 56 mM, KPO4 43 mM
SIN CALOR 1122
KOH 55 mM, bicina 56 mM, KPO4 43 mM
SIN CALOR 1608
KOH 55 mM, bicina 56 mM, KPO4 43 mM
SIN CALOR 2782 1838
El ARN se recuperó eficazmente a partir del plasma empleando el procedimiento de elución en dos etapas. Estos datos muestran, sin embargo, que se obtuvieron mayores valores MOTA cuando el ARN se extrajo en presencia de calor, independientemente de las condiciones del tampón empleado para la amplificación/detección.
Ejemplo 5: Volumen de elución menor con elución en dos etapas
El ejemplo evaluó un volumen de elución menor con el proceso de elución en dos etapas.
Los materiales que se emplearon en este ejemplo fueron los siguientes:
Óxido de hierro
Tubos de Preparación de Plasma (PPT)
KPO4 30 mM KPO4 500 mM AMV RT
Enzima de restricción BsoBI Proteína GP32
Albúmina de Suero Bovino (BSA)
Polimerasa Bst Glicerol 55%
Magnesio 200 mM Dimetilsulfóxido (DMSO)
Sonda Detectora Fluorescente
Cebadores de la Amplificación por Desplazamiento de la Hebra (SDA)
Cebadores Bumper
Desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTPs)
Proteinasa K
Formamida
Ácido de fijación
KOH
Bicina
Transcritos del gen gag del VIH
El plasma se pre-trató con formamida 44% y 5U de Proteinasa K durante 20 minutos a 65°C y 10 minutos a 70°C. Se añadió al plasma óxido de hierro y 180 pl de ácido de fijación. A las mezclas se añadieron 10.000 copias/ml del transcrito del gen gag del VIH. Después de la unión al óxido de hierro y del lavado, el ARN se extrajo con 120 pl bien de un tampón de elución de KOH 50 mM, 65 mM, o bien 80 mM durante 20 minutos a 65°C. Las muestras se
neutralizaron entonces con 60 |jl de bicina bien 154 mM, 192 mM, o bien 230 mM, y se mezclaron durante 2 minutos. El ARN se transcribió de forma inversa con AMV-RT y se amplificó mediante SDA empleando cebadores específicos de gag. (Nycz et al., Anal Biochem, 1998; 259:226-234). La detección ocurrió a tiempo real empleando una sonda detectora fluorescente. (Nadeau et al., Anal Biochem, 1999; 276:177-187).
5 Tabla 5
Elución con KOH (mM)
Neutralización con Bicina (mM) KOH Final Bicina Final MOTA Media
80
230 42 86 74494
80
230 42 86 73007
80
230 42 86 59702 69068
80
192 42 76 59816
80
192 42 76 67597
80
192 42 76 70179 65864
80
154 42 66 64613
80
154 42 66 62096
80
154 42 66 64866 53858
65
192 34 76 72410
65
192 34 76 87738 70074
65
154 34 86 57300
65
154 34 86 37732 47516
50
230 26 86 65206
50
230 26 86 30787 47997
50
192 26 76 68328
50
192 26 76 54644 81486
50
154 26 66 60811
50
154 26 66 57274 59043
50
control 50 90 58761
50
control 50 90 65975 62358
5
10
15
20
25
30
35
40
Se consiguió una fuerte amplificación del ARN diana bajo cada una de las condiciones ensayadas, como se determina por los altos valores MOTA. Estos datos demuestran la utilidad de extracción del óxido de hierro tras el proceso de elución en dos etapas para la recuperación del ARN amplificable a partir de la matriz biológica compleja. No había evidencia de hidrólisis de ARN por la exposición a diferentes concentraciones de KOH durante 20 minutos a 65°C.
Ejemplo 6: Elución en dos etapas y Neutralización
Este ejemplo detalla la separación de las etapas de elución y neutralización en comparación al método de una sola etapa y el efecto sobre los valores MOTA.
Los materiales que se emplearon en este ejemplo fueron los siguientes:
Óxido de hierro
Tubos de Preparación de Plasma (PPT)
KPO4 30 mM KPO4 500 mM AMV RT
Enzima de restricción BsoBI Proteína GP32
Albúmina de Suero Bovino (BSA)
Polimerasa Bst Glicerol 55%
Magnesio 200 mM Dimetilsulfóxido (DMSO)
Sonda Detectora Fluorescente
Cebadores de la Amplificación por Desplazamiento de la Hebra (SDA)
Cebadores Bumper
Desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTPs)
Proteinasa K
Formamida
Ácido de fijación
KOH
Bicina
Transcritos del gen gag del VIH
El plasma se pre-trató con formamida 44% y 5U de Proteinasa K durante 20 minutos a 65°C y 10 minutos a 70°C. Se añadió al plasma óxido de hierro y 180 pl de ácido de fijación. A las mezclas se añadieron 10.000 copias/ml del transcrito del gen gag del VIH. Después de la unión al óxido de hierro y del lavado, el ARN se extrajo con 400 pl bien de un tampón de elución de KOH 50 mM, 65 mM, o bien 80 mM durante 20 minutos a 65°C. Los eluidos se dividieron en volúmenes de 100 pl y 300 pl, cada uno de los cuales se neutralizó con un tampón de neutralización diferente que contiene bicina (Tabla 6). El ARN se transcribió de forma inversa con AMV-RT y se amplificó mediante SDA empleando cebadores específicos de gag. (Nycz et al., Anal Biochem, 1998; 259:226-234). La detección ocurrió a tiempo real empleando una sonda detectora fluorescente. (Nadeau et al., Anal Biochem, 1999; 276:177- 187).
Tabla 6
Elución con KOH (mM)
Neutralización con Bicina (mM) MOTA MOTA Media KOH Final (mM) Bicina Final (mM)
80
0/160 49050 40 110
80
0/160 45345 40 110
80
0/160 34158 42851 40 110
80
0/130 36091 40 90
80
0/130 39036 40 90
80
0/130 46476 40534 40 90
80
0/100 64709 40 75
80
0/100 65277 40 75
80
0/100 40217 50058 40 75
65
0/160 54037 32,5 110
65
0/160 60464 32,5 110
65
0/160 56883 57061 32,5 110
65
0/130 56187 32,5 90
65
0/130 55621 65904 32,5 90
65
0/100 52745 32,5 75
65
0/100 54458 53602 32,5 75
50
0/160 70757 25 110
50
0/160 60795 65776 25 110
50
0/130 72728 25 90
50
0/130 67532 70130 25 90
50
0/100 69772 25 75
50
0/100 66012 67892 25 75
UNA ETAPA
CONTROL 84066 50 90
UNA ETAPA
CONTROL 69863 71965 50 90
80
20/160 34865 50 110
80
20/160 6098 50 110
80
20/160 2670 14544 50 110
80
20/130 34874 AMPLIFICACIÓN CONTROL 50 90
80
20/130 8710 50 90
80
20/130 29190 24258 50 90
80
20/100 47498 50 75
80
20/100 20794 50 75
80
20/100 44890 37727 50 75
65
35/160 45072 50 110
65
35/160 50814 50 110
65
35/160 41113 45686 50 110
65
35/130 33511 AMPLIFICACIÓN CONTROL 50 90
65
35/130 22663 28087 50 90
65
35/100 64496 50 75
65
35/100 68245 61370 50 75
50
50/160 6536 50 110
50
50/160 14936 10736 50 110
50
50/130 55468 AMPLIFICACIÓN CONTROL 50 90
50
50/130 15955 35711 50 90
50
50/100 44669 50 75
50
50/100 56643 55656 50 75
UNA ETAPA
CONTROL 70602 CONTROL CONTROL
UNA ETAPA
CONTROL 76028 73315 CONTROL CONTROL
Los valores MOTA mejoraron con el descenso de la concentración de KOH durante la elución, sugiriendo que el ARN diana se podría degradar parcialmente mediante la exposición prolongada a un álcali fuerte. La elución con menores concentraciones de KOH mejoraron los valores MOTA indicando una amplificación/detección más sólida.
Ejemplo 7: Eficacia de extracción del ADN diana
El propósito de este experimento era determinar la eficacia de extracción del ADN a partir de óxido de hierro empleando el Sistema BD ViperTM en el modo de extracción. Este estudio se diseñó para evaluar si aún había ADN diana amplificable unido al óxido de hierro después de la etapa de elución final en el proceso de extracción de óxido 5 de hierro realizado empleando un tampón compatible con SDA (pH de aproximadamente 8,4). En un experimento previo se determinó que si el óxido de hierro se volvía a exponer al tampón de elución de este pH, el segundo eluido ensayado daría como resultado señales fluorescentes positivas en la reacción SDA. Una de las posibles razones para esto era la presencia de cantidades traza del tampón de elución después de la extracción original. Para mitigar esta posibilidad, a todos los tubos de extracción de este experimento se les eliminó la forma del tampón de elución 10 remanente de la extracción inicial antes de volver a extraer con un tampón adicional compatible con SDA. Esto se completó con el lavado del óxido de hierro con agua desionizada (pH 4-5) para prevenir otra elución de cualquier ADN unido. En este experimento no se empleó la matriz clínica.
Los materiales que se emplearon en este ejemplo fueron los siguientes:
Fosfato potásico-DMSO-glicerol (KPDG) Diluyente muestra (tampón compatible con SDA)
15 Tubos de extracción
Tampón de lisis
Tampón de unión
Tampón de lavado
Tampón de elución
20 Micropocillos de cebado y amplificación para Ensayos de ADN Amplificado BD ProbeTec™ CT/GC Qx para organismos de Chlamydia trachomatis (CT)/Neisseria gonnorhea (GC) (1x105/ml de evaluación).
El procedimiento fue como sigue:
1
Se utilizaron para el ensayo instrumentos Viper SP (PP001 - V3.00H+).
2
Mover el botón NUM_WASH_MIXES= 2, y ELUT_VOL_400, NO_LIQUID=1
3
Se reinicia cada instrumento con el disco de diagnóstico adecuado.
4
Preparar 70 mL de cada organismo/mL (CT y GC) mediante la adición de 35 pL de 105/mL CT/GC de evaluación en 70 mL del diluyente de muestra CT/GC.
5
Tomar una alícuota de 1 mL del diluyente positivo en 48 tubos de diluyente de muestra.
6
Establecer el instrumento Viper para una ejecución de extracción media con placas CTQX/GCQX.
7
PP01, Rejilla #14 - ejecución de extracción de control primaria
8
Después de la primera ejecución, eliminar los tubos de extracción del bloque de extracción del Viper.
9
Insertar todos los tubos en el bloque de extracción manual del Viper.
10
Encajar los imanes para bloquear el óxido de hierro.
11
Con un pipeteador Matrix, eliminar todo el fluido de tampón de elución de fosfato potásico DMSO- glicerol (KPDG) de los tubos de extracción adecuados.
12
Desencajar los imanes.
13
Añadir 1 mL de DiH2O a los 24 tubos de extracción empleados. Mezclar.
14
Encajar los imanes para bloquear el óxido de hierro.
15
Eliminar los eluidos de lavado y distribuirlo en nuevos tubos de diluyente de muestra.
16
Repetir el proceso para 12 de los 24 tubos de extracción empleados.
17
Añadir las muestras de eluido de lavado de la muestra a la rejilla de muestra del Viper.
18
Añadir el tampón de elución KPDG 2X a cada uno de los eluidos de lavado.
19
Añadir de nuevo todos los tubos de extracción empleados en la rejilla de extracción del Viper.
Los resultados, mostrados en las Figuras 1 - 8, indican que aún había ADN diana CT/GC amplificable unido al óxido de hierro después de la etapa de elución inicial con tampón KPDG a un pH de aproximadamente 8,4. El lavado del óxido de hierro con agua desionizada eliminó las trazas del primer eluido sin extraer el resto del ADN diana a partir del óxido de hierro. Otro tratamiento del óxido de hierro con un tampón de elución de KPDG adicional permitió la 5 recuperación de más ADN diana que era detectable por SDA. Para hacer un seguimiento este experimento se ensayó con un tampón de elución a un pH mayor para recuperar el ADN diana restante a partir del óxido de hierro. Un experto en la técnica tendrá la capacidad de evaluar varias condiciones de tales tampones sin demasiada experimentación.
Ejemplo 8: MSA de la elución en 2 etapas
10 El propósito de este experimento es completar el Análisis del Sistema de Medición (MSA, de sus siglas en inglés) para el proceso de elución en dos etapas empleando el Sistema BD ViperTM en el modo de extracción para determinar la reproducibilidad de los resultados entre las ejecuciones y los instrumentos Viper.
La segunda etapa de elución significa la adición de la disolución KOH 2X (142 mM) a los tubos de extracción seguido de la disolución de neutralización 2X para formar el tampón de ensayo SDA (disolución de neutralización 2X 15 es Bicina 251 mM, DMSO 21,8%, Glicerol 19%, con Tween 20 0,1% y Proclin 300 0,03%).
Los materiales que se emplearon en este experimento fueron como sigue:
5,9 L de Diluyente de muestra CT/GC
15 cubetas para tubos de extracción
250 ml de tampón de neutralización 2X
20 250 ml de KOH 2X (tampón de elución de pH alto)
Tampón de lavado (agua y Tween)
Ácido de fijación
Tampón de lisis KOH
Micropocillos de cebado y amplificación para Ensayos de ADN Amplificado BD ProbeTec™ CT/GC Qx 25 2 alícuotas de Chlamydia trachomatis (CT) 105.
4 alícuotas de Neisseria gonnorhea (GC) 105.
Las muestras CT/GC positiva y negativa se prepararon en diluyente de muestra. El conjunto diana mínimo era óptimo con CT a 15 EB (estructuras elementales)/ml y GC a 50 células/ml. El conjunto diana máximo era óptimo con CT a 30 EB/ml y GC a 100 células/ml. Los cálculos de los picos fueron como sigue:
30 Mínimo: CT 15 EB/ml: 105/ml (xmls) = 15 EB/ml (2450 ml) * pico CT 367,5 pl;
GC 50 células/ml: 105/ml (xmls) = 50 células/ml (2450 ml) * pico GC 1225 pl;
Máximo: CT 30 EB/ml: 105/ml (xmls) = 30 EB/ml (2450 ml) * pico CT 735 pl;
GC 100 células/ml: 105/ml (xmls) = 100 células/ml (2450 ml) * pico GC 2450 pl;
Las muestras de CT/GC negativas tienen menores picos. Las muestran se repartieron en alícuotas de 3,5 ml/tubo en 35 5 rejillas Viper separadas para 3 extracciones para cada tubo. Se emplearon las mismas muestras para las tres
ejecuciones en cada instrumento. Las muestras se extrajeron empleando bien el protocolo de elución en una etapa o bien el de dos etapas. En resumen, se añadió KOH a las muestras para lisar las células y liberar su ácido nucleico en la disolución. A continuación se añadió el ácido de fijación para disminuir el pH y producir una carga positiva en la superficie del óxido de hierro, que se une al ADN cargado negativamente. El óxido de hierro y el aDn unidos se 40 lavaron, y el ADN se extrajo bien mediante un proceso de dos etapas que implica la exposición a KOH seguido de la neutralización con tampón bicina, o bien mediante un proceso de una etapa que implica la exposición a una disolución de bicina y KOH a un pH de aproximadamente 8,4. Después el ADN extraído se detectó empleando Ensayos de ADN Amplificado BD ProbeTec™ CT/GC Qx.
Estos resultados se muestran en las Figuras 9-12, que representan las Unidades de Fluorescencia Relativa Máxima 45 (MaxRFU) obtenidas con cada muestra extraída. Una MaxRFU elevada es indicativa de una amplificación/detección más eficaz. La concentración más estricta de las puntuaciones MaxRFU, es el sistema más sólido. En las Figuras 9 y 11, el tipo de muestra CT inferior en dos etapas (15 EB/ml) proporcionó un CpK que era 1,46 veces más alto que el del método de elución en un sola etapa. En las Figuras 10 y 12, el tipo de muestra GC inferior en dos etapas (50 células/ml) proporcionó un CpK que era 0,94 veces más alto que el del método de elución en un sola etapa. El CpK
es el índice de capacidad del proceso, una medida de la variación de datos a largo plazo o en grandes muestras, que incluyen no sólo la variación sobre la media sino también del desplazamiento de la misma media. El CpK es una métrica común que se emplea durante el estado estable de producción para medir la reproducibilidad del resultado.
El proceso de elución en dos etapas se realizó mejor y proporcionó valores CpK más altos que el programa de 5 elución en una sola etapa tanto para CT como para GC.

Claims (8)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    REIVINDICACIONES
    1. Un método para extraer componentes de ácidos nucleicos de una muestra biológica, que comprende:
    (i) en un recipiente, unir de manera reversible al menos un componente de un ácido nucleico de la muestra biológica a al menos una partícula paramagnética, siendo dicha partícula paramagnética una partícula de óxido de hierro en un entorno ácido;
    (ii) separar al menos una partícula paramagnética unida al componente del ácido nucleico, de los componentes sin unir de las muestras biológicas;
    (iii) lavar al menos una partícula paramagnética unida al componente de ácido nucleico;
    (iv) separar al menos una partícula paramagnética unida al componente de ácido nucleico de lavado;
    (v) eliminar al menos un componente de ácido nucleico a partir de al menos una partícula paramagnética mediante elución en dos etapas y un proceso de neutralización que comprende
    - extraer al menos una partícula paramagnética unida al componente de ácido nucleico con una disolución tampón de elución de pH básico que consiste en hidróxido potásico o hidróxido sódico, produciendo así una muestra eluida; y
    - seguido de la neutralización de la muestra eluida mediante la adición posterior de un tampón de neutralización seleccionado de bicina, Tris, ácido 2-(ciclohexilamino)etanosulfónico (CHES), N,N-bis(2-hidroxietil)-2-aminoetano sulfónico (BES), ácido 4-morfolinopropanosulfónico (MOPS) o fosfato, produciendo así un tampón optimizado;
    (vi) seguido de la separación y eliminación de las partículas paramagnéticas tras la neutralización de la muestra mientras que la disolución de pH optimizado que contiene el ácido nucleico sin unir se transfiere para una manipulación adicional, en donde la etapa de eliminación se separa de la etapa de neutralización.
  2. 2. El método de la reivindicación 1, en donde la muestra biológica es clínica, forense o medioambiental.
  3. 3. El método de la reivindicación 2, en donde la muestra biológica medioambiental comprende tierra, agua,
    aire, efluentes en suspensión o polvo.
  4. 4. El método de la reivindicación 1, en donde la muestra biológica se pre-trata para lisar las células.
  5. 5. El método de la reivindicación 1, en donde dicha elución comprende elevar el pH con el tampón de elución
    de pH.
  6. 6. El método de la reivindicación 1, en donde el tampón de elución tiene un pH de 8 a 14.
  7. 7. El método de la reivindicación 1, en donde dicho tapón de neutralización desciende el pH.
  8. 8. El método de la reivindicación 7, en donde el pH es de 6 a 9, preferiblemente en donde el pH es de 8 a 8,5,
    más preferiblemente en donde el pH es 8,4, después de la adición del tampón de neutralización.
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