ES2219607T3

ES2219607T3 - Nuevo agente inhibidor de la urocinasa.

Info

Publication number: ES2219607T3
Application number: ES02016038T
Authority: ES
Inventors: Olaf Wilhelm; Viktor Magdolen; Jorg Sturzebecher; John Foekens; Verena Lutz
Original assignee: Wilex AG
Current assignee: Heidelberg Pharma AG
Priority date: 1998-07-20
Filing date: 1999-07-20
Publication date: 2004-12-01
Anticipated expiration: 2019-07-20
Also published as: CA2338073A1; AU5161599A; EP1098651A2; BR9912327B1; DE59903981D1; ATE230599T1; PT1264828E; AU754958B2; DE59909210D1; EP1098651B1; CA2338073C; EP1264828B1; JP4603162B2; ES2189455T3; WO2000004954A3; US20030013723A1; ATE264103T1; WO2000004954A2; BR9912327A; JP2002521348A

Abstract

Medicamento caracterizado porque como sustancia activa contiene 4-etoxicarbonil-piperazida de Ná-(2, 4, 6-triisopropil-fenilsulfonil)-3-amidino-(D, L)- fenilalanina, el enantiómero L de ésta o una sal farmacéuticamente compatible de uno de los compuestos.

Description

Nuevo agente inhibidor de la urocinasa.

El invento se refiere a la utilización del hidrocloruro de 4-etoxicarbonil-piperazida de N\alpha-(2,4,6-triisopropil-fenilsulfonil)-3-amidino-(D,L)-fenilalanina como agente inhibidor de la urocinasa, en particular para el tratamiento de tumores malignos y de la formación de metástasis, o como agentes para dirigir a las células linfáticas hacia dianas, y para el tratamiento de enfermedades del tejido linfático, en particular de linfomas.

La capacidad de los tumores sólidos para propagarse y formar metástasis en un tejido circundante se correlaciona con la descomposición o reestructuración de la matriz extracelular (estroma tumoral) en el entorno de la célula tumoral, o bien con su capacidad para atravesar la membrana basal. A pesar de que las relaciones (pato)bioquímicas no se han esclarecido todavía de manera definitiva, al activador de plasminógeno urocinasa (uPA) y al receptor de urocinasa (uPAR) les corresponde una importancia decisiva. La uPA media en la disociación proteolítica de plasminógeno para dar plasmina. La plasmina, por su parte, es una proteasa con un amplio espectro de efectos, que es capaz de descomponer directamente a componentes de la matriz extracelular tales como fibrina, fibronectina, laminina, y al entramado proteínico de los proteoglicanos. Además, la plasmina puede activar a metalo-proteasas "latentes" y a la proenzima inactiva de uPA, pro-uPA.

Las células tumorales y las células no malignas del estroma tumoral sintetizan y segregan la proenzima enzimáticamente inactiva pro-uPA. Ciertas proteasas, tales como p.ej. plasmina o las catepsinas B y L, disocian a la pro-uPA mediante una proteolisis limitada para formar la proteasa de serina activa HMW-uPA (HMW, de High Molecular Weight = de alto peso molecular). La pro-uPA y la proteasa activa HMW-uPA se fijan al receptor de superficie celular uPAR (CD87). La plasmina (o el plasminógeno) se fija asimismo a receptores específicos de la membrana plasmática de una célula tumoral, consiguiéndose un enfoque y una amplificación de la activación del plasminógeno en el entorno directo de la célula tumoral. A las células invasivas se les ofrece por consiguiente la posibilidad de descomponer a la matriz extracelular, sin substraerse por proteolisis de los substratos necesarios para un movimiento dirigido.

En diferentes estudios de biología celular se pudo poner de manifiesto que al sistema activador de plasminógeno, asociado a células, le corresponde un rango especial dentro de las rutas de reacción a modo de cascadas de sistemas proteolíticos asociados a tumores (Wilhelm y colaboradores (1994), The Urokinase/Urokinase receptor system: A new target for cancer therapy? [El sistema de la urocinasa y del receptor de urocinasa: ¿Una nueva diana para la terapia del cáncer?], En: Schmitt M., Graeff H., Kindermann G. (coordinadores de edición): Prospects in Diagnosis and Treatment of Cancer [Expectativas en el diagnóstico y el tratamiento del cáncer]. International Congress Series, Excerpta Medica 1050, Amsterdam, Elsevier 1994, páginas 145-156). En cultivos de células humanas de carcinoma de colon se observó que su capacidad para desplazarse a través de una matriz extracelular es dependiente del grado de saturación con uPA activa de los receptores de uPA (Hollas y colaboradores, Cancer Res. 51 (1991), 3.690-3.695). Asimismo, en el modelo de un cultivo celular se observó una reducción del potencial invasivo de células, cuando se inhibía la actividad proteolítica de uPA por PAI-1 (Cajot y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 6.939-6.943) o PAI-2 (Baker y colaboradores, Cancer Res. 50 (1990), 4.676-4.684). Un efecto comparable se consiguió en el caso de la inhibición de la fijación de uPA a la superficie celular por bloqueo del receptor mediante variantes de uPA proteolíticamente inactivas (Cohen y colaboradores, Blood 78 (1991), 479-487; Kobayashi y colaboradores, Br. J. Cancer 67 (1993), 537-544). También la transfección de células de carcinoma epidermoide con un plásmido, que expresa un transcrito antisentido contra una parte del uPAR, condujo mediante la represión de la síntesis de uPAR a la disminución de la invasividad de estas células (Kook, EMBO J. 13 (1994), 3.983-3.991). Anticuerpos dirigidos contra uPA y PAI-1 reducían el potencial invasivo de células de cáncer de pulmón in vitro (Liu y colaboradores, Int. J. Cancer 60 (1995), 501-506).

La influencia del sistema de activador de plasminógeno sobre el proceso de formación de metástasis se pudo demostrar también en modelos de tumores en animales. Así, la formación de metástasis en pulmones, causada por células humanas de carcinoma en embriones de pollos, se impedía de manera casi total mediante la adición de anticuerpos dirigidos contra la uPA (Ossowski y Reich, Cell 35 (1983), 611-619). Células humanas de carcinoma, que formaban metástasis, se transfectaron con un plásmido de expresión, que codificaba una mutante de uPA proteolíticamente inactiva, pero que se fijaba al uPAR. En el modelo de un ratón se puso de manifiesto que las células de carcinoma, que sintetizaban una uPA inactiva, después de su inyección formaban un número significativamente menor de metástasis en comparación con las células no transfectadas (Crowley y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, (1993), 5.021-5.025). Después de la administración de oligonucleótidos antisentido para uPA se observó además de esto una inhibición de la propagación intraperitoneal de células humanas de carcinoma de ovario en ratones desprovistos de inmunidad (Wilhelm y colaboradores, Clin. Exp. Metast. 13 (1995), 296-302).

En los últimos años se investigó intensamente la relevancia clínica de factores del sistema del activador de plasminógeno (uPA, uPAR, PAI-1 y PAI-2) para el pronóstico de pacientes con tumores malignos sólidos. En tal caso, el contenido de antígenos para uPA en diferentes tumores (p.ej. de mama, ovario, estómago, pulmón, riñón, etc.) se manifestó, tanto para la supervivencia sin recidivas como también para la mortalidad, como un fuerte factor de pronóstico (véanse p.ej. las citas de Schmitt y colaboradores, J. Obstet. Gynaecol. 21 (1995), 151-165; Jaenicke y colaboradores, Breast Cancer Res. Treat. 24 (1993), 195-208; Kuhn y colaboradores, Gynecol. Oncol. 55 (1994), 401-409; Nekarda y colaboradores, Lancet 343 (1994), 117; Pedersen y colaboradores, Cancer Res. 54 (1994), 4.671-4.675). De igual manera, unas concentraciones aumentadas de uPAR en un tejido de cáncer de pulmón (Pedersen y colaboradores, véase más arriba) y en un tejido de cáncer de mama (Duggan y colaboradores, Int. J. Cancer 61 (1995), 597-600; Ronne et al, Breast Cancer Res. Treat. 33 (1995), 199-207), así como, en el caso de un cáncer de estómago, tanto en el propio tejido tumoral (Heiss y colaboradores, J. Clin. Oncol. 13 (1995), 2.084-2.093) como también en el caso de las células propagadas en la médula ósea (Heiss y colaboradores, Natural Medicine 1 (1995), 1.035-1.039), se correlacionan con un pronóstico pesimista.

El empleo de agentes sintéticos inhibidores de la uPA ofrece la posibilidad de reprimir la invasión y la propagación de células tumorales. No obstante, el desarrollo de agentes inhibidores específicos para la uPA conlleva dificultades, puesto que el activador de plasminógeno del tipo tisular (tPA) tiene una especificidad idéntica para el desdoblamiento del enlace peptídico Arg560/Val561 de plasminógeno. En la mayoría de los casos, por lo tanto, los agentes inhibidores de la uPA, de bajo peso molecular, inhiben también al tPA y, por consiguiente, asimismo a la fibrinolisis mediada por t-PA. Además, tiene que estar garantizado que los agentes sintéticos inhibidores de la uPA no muestren ninguna fuerte inhibición de la plasmina.

A pesar de estas limitaciones, se conocen algunas sustancias inhibidoras, que poseen una cierta especificidad frente a la uPA, pero que poseen una pequeña capacidad inhibidora, tales como por ejemplo derivados de benzamidina y de
\beta-naftamidina, realizándose que el compuesto más eficaz inhibe a la uPA con un valor de K_{i} = 2,2 \mumol/l (Stürzebecher y Markwardt, Pharmazie 33 (1978), 599), o a la amilorida con un valor de K_{i} = 7 \mumol/l (Vassalli y Belin, FEBS. Lett. 214 (1987), 187-191).

El documento de solicitud de patente alemana DE-A-30.35.086 divulga derivados de ácido ciclohexano-carboxílico, que tienen efectos inhibidores sobre proteasas tales como tripsina, quimiotripsina, trombina ó uPa. Los compuestos investigados muestran, sin embargo, solamente una inhibición bastante pequeña, y además de esto inespecífica, de la uPA. El documento de solicitud de patente europea EP-A-0.183.271 divulga derivados de lisina y su utilización como agentes inhibidores de proteasas. También se describe un derivado de benzamidino-lisina (compuesto 108), que muestra in vitro una inhibición de la uPA, pero también un efecto comparable sobre otras proteasas tales como tripsina o calicreína plasmática. El documento de solicitud de patente internacional WO 95/17885 divulga polipéptidos de bajo peso molecular como agentes inhibidores de la uPA.

Una clase adicional de conocidos agentes inhibidores de la uPA la constituyen benzotiofeno-2-carboxamidinas sustituidas en posición 4, que tienen un valor de K_{i} = 0,16 mmol/l en el caso del benzotiofeno-623 (Towle y colaboradores, Cancer Res. 53 (1993), 2.553-2.559). Estas sustancias inhibidoras tienen una afinidad significativamente más alta para la uPA, en comparación con tPA y con plasmina. También la uPA fijada al uPAR es inhibida con una alta eficiencia. Una desventaja de estas sustancias reside no obstante en el hecho de que su síntesis química es complicada y apenas se presentan, o hasta ahora no se pudieron mostrar, posibilidades para la modificación de la estructura.

El desarrollo de otras sustancias inhibidoras de la uPA es, por consiguiente, de gran utilidad para el esclarecimiento adicional del cometido de la uPA y del uPAR en el caso de diferentes enfermedades, en especial en el caso de la propagación de tumores y de la formación de metástasis.

Ciertos derivados de N\alpha-arilsulfonilo y N\alpha-arilsulfonil-amino-acilo de la 3-amidino-fenilalanina son conocidos como sustancias inhibidoras selectivas de la trombina (Markwardt y colaboradores, Thromb. Res. 17 (1980), 425-431) o del factor de coagulación Xa (Stürzebecher y colaboradores, Thromb. Res. 54 (1989), 245-252). También en los documentos WO 92/08709, WO 94/18185 y WO 96/05189 se divulga la utilización de derivados de amidino-fenilalanina como sustancias inhibidoras de la coagulación de la sangre, en particular como sustancias inhibidoras de la trombina.

Se investigaron intensivamente piperididas y piperazidas de la 3-amidino-fenilalanina, entre las cuales se encontraron también estructuras conductoras directoras para la inhibición de enzimas fibrinolíticas (Stürzebecher y colaboradores, J. Enzyme Inhibition 9, 87-99, 1995; Stürzebecher y colaboradores, J. Med. Chem. 40, 3.091-3.099, 1997). Mientras que en el caso de Stürzebecher y colaboradores (1995) solamente se describe una inhibición de la trombina, del factor Xa, de la plasmina y de la tripsina, en la cita de Stürzebecher y colaboradores (1997) se encuentran también datos acerca de la inhibición de la uPA. En el caso de piperazidas de 3-amidino-fenilalanina sustituidas con
N\alpha-2-naftilsulfonilo, N\alpha-2-(2,2,5,7,8-pentametil-croman-6-il)sulfonilo y N\alpha-2-canfor-10-il-sulfonilo se encuentra para la uPA un valor de K_{i} de 28 a 140 \mumol/l, que es más alto en tres órdenes de magnitud que el de la constante de inhibición para la trombina. Por consiguiente, no se podía partir del hecho de que ciertos derivados de 3-amidino-fenilalanina sean apropiados como agentes inhibidores de la urocinasa.

Sorprendentemente, se encontró, sin embargo, que unos derivados de 3-amidino-fenilalanina sustituidos con un radical fenilo en la posición 2 constituyen unas sustancias inhibidoras selectivas y activas in vivo de la uPA. Además, se encontró que estas sustancias presentan una alta selectividad para el tejido linfático y, por lo tanto, son apropiadas como agentes para dirigir hacia una diana de células linfáticas, por ejemplo, para el tratamiento de enfermedades malignas del tejido linfático, tales como ilustrativamente linfomas.

El presente invento se refiere al nuevo agente inhibidor de la urocinasa, 4-etoxicarbonil-piperazida de N\alpha-(2,4,6-triisopropil-fenilsulfonil)-3-amidino-(D,L)-fenilalanina de la Fórmula general I,

1

que se presenta en forma del racemato así como de compuestos con la configuración L ó D y en el que

R^{1}

\hskip0.5cm

(a) representa un grupo de la fórmula

2

y

R^{2}

\hskip0.5cm

representa 2,4,6-triisopropil-fenilo

El compuesto puede presentarse también como una sal, preferiblemente como una sal de ácidos fisiológicamente compatibles, p.ej. como una sal de un ácido inorgánico, de manera especialmente preferida como hidrocloruro, o como una sal de ácidos orgánicos apropiados.

El compuesto de la Fórmula I se puede preparar de una manera conocida en principio, tal como se ha descrito p.ej. en los documentos WO 92/08709 y WO 94/18185, y se puede investigar en cuanto a su actividad biológica in vitro.

El hidrocloruro del éster metílico de (L)-, (D)- ó (D,L)-3-ciano -fenilalanina se hace reaccionar con un correspondiente sulfocloruro o con un aminoácido sulfonilado o bien con su halogenuro en presencia de una base para formar un compuesto de la Fórmula general I con una función ciano, en la que R^{1} es = OCH_{3} y R^{2} corresponde al significado definido en la memoria descriptiva. Mediante una hidrólisis ácida o alcalina moderada se pueden obtener a partir de ellos los compuestos de la Fórmula general I con una estructura de ácido carboxílico (R^{1} = -OH), cuya esterificación con un alcohol correspondiente en condiciones catalíticas ácidas conduce a compuestos de la Fórmula general I, realizándose que R^{1} significa = (a). Según un procedimiento usual en la química de los péptidos, p.ej. el procedimiento de DCC en presencia de HOBt, mediante reacción de los ácidos carboxílicos de la Fórmula general I (con R^{1} = -OH) con un compuesto nucleófilo de la estructuras (a) se pueden preparar los compuestos con un correspondiente R^{1} de la Fórmula general I.

El compuesto diana de la Fórmula I con una estructura de amidina se puede obtener de manera conocida a partir de los compuestos de ciano, obteniéndose por regla general, mediante reacción por adición de H_{2}S con el grupo ciano, primeramente las tio-amidas. que son transformadas seguidamente mediante metilación en S con yoduro de metilo en los tio-imido-ésteres y, a continuación, mediante tratamiento con acetato de amonio en solución alcohólica, en los compuestos de amidino. Además, eventualmente se pueden preparar, a partir de los compuestos de ciano con metanol o etanol, en presencia de HCl gaseoso y en determinados casos de un disolvente inerte, los correspondientes hidrocloruros de imido-ésteres, cuya reacción en una solución alcohólica de amoníaco conduce a los compuestos de amidino.

El agente inhibidor de la urocinasa, conforme al invento, se puede utilizar eventualmente junto con por lo menos una sustancia coadyuvante o de vehículo farmacéutica apropiada, para la preparación de medicamentos administrables por vía oral, subcutánea o intravenosa para la represión de tumores o en el diagnóstico. Asimismo es posible la administración en combinación con otras sustancias activas, p.ej. otros agentes inhibidores de la urocinasa, tales como por ejemplo anticuerpos o/y péptidos.

Los medicamentos para la represión de tumores en seres humanos y animales se pueden administrar por vía tópica, oral, rectal o parenteral, p.ej. por vía subcutánea o intravenosa, en forma de tabletas, grageas, cápsulas, gránulos, supositorios, soluciones o sistemas transdérmicos, tales como emplastos.

El hidrocloruro de 4-etoxicarbonil-piperazida de N\alpha-(2,4,6 -triisopropil-fenilsulfonil)-3-amidino-(D,L)-fenilalanina o bien el enantiómero L de éste o una sal farmacéuticamente compatible de estos compuestos, tienen un buen comportamiento de solubilidad. En un tampón Tris (de pH 7,3) éstos son solubles hasta en una concentración de
5 x 10^{-5} mol/l. Mediante la adición de 5% de etanol, la solubilidad aumenta a 2x10^{-4} mol/l y al añadir 5% de DMSO ésta aumenta a 10^{-3} mol/l.

El compuesto conforme al invento está en situación de inhibir de una manera muy eficiente el crecimiento o/y la propagación de tumores malignos, p.ej. la propagación de un tumor en el caso de un carcinoma de páncreas, el crecimiento de un tumor de carcinoma de mama, así como la formación de metástasis de tumores. En este caso, los agentes inhibidores de la uPA se pueden emplear eventualmente en común con otros agentes antitumorales o con otros tipos de tratamientos, p.ej. de irradiación o intervenciones quirúrgicas. Además, los agentes inhibidores conformes al invento son eficaces también para otras enfermedades asociadas con la uPA (p.ej. en la evitación de la formación de ampollas en el caso de la enfermedad cutánea Pemphigus vulgaris = pénfigo vulgar).

Los agentes inhibidores de la uPA, conformes al invento, están caracterizados preferiblemente porque tienen un valor de K_{i} para uPA por lo menos dos veces, preferiblemente 5 veces y, de manera especialmente preferida, 10 veces menor en comparación con tPA. Además es digno de mención que los compuestos conformes al invento influyen sólo de manera escasa sobre la coagulación sanguínea, puesto que tienen unos valores de K_{i} demasiado altos para una inhibición efectiva de la trombina y del factor Xa.

La sustancia conforme al invento de la Fórmula I se puede emplear en forma de conjugados con sustancias fisiológicamente activas, p.ej. con marcaciones radiológicas o con agentes citotóxicos, p.ej. agentes quimioterapéuticos, tales como cis-platino o 5-fluoro-uracilo, o con péptidos. Además, la sustancia se puede incorporar también en la membrana de vesículas de soporte, p.ej. liposomas, y por consiguiente puede hacer posible una dirección hacia dianas de sustancias activas encerradas en las vesículas de soporte, p.ej. agentes citotóxicos tales como por ejemplo doxorrubicina.

Una indicación adicional para los compuestos conformes al invento es la dirección hacia una diana de células linfáticas, que se hace posible por causa de su afinidad para un tejido de nódulo linfático, más alta en un factor de 10 a 20 en comparación con otros tipos de tejidos. Por consiguiente, estas sustancias se adecuan sobresalientemente como agentes para el diagnóstico o el tratamiento de enfermedades del tejido linfático, en particular enfermedades malignas, tales como ilustrativamente metástasis de tumores y linfomas. La administración de las sustancias se puede efectuar tal como ya se ha descrito. Un tratamiento de enfermedades del tejido linfático se efectúa de modo preferido mediante una administración durante varios días del medicamento, p.ej. durante un período de tiempo de 5 a 20 días, con una subsiguiente pausa sin tratamiento y eventualmente mediante una repetición en una o múltiples veces de la aplicación.

El invento se debe explicar con mayor detalle con los Ejemplos y las Figuras siguientes. En éstas muestran:

la Figura 1 el resultado de una determinación de la citotoxicidad de una sustancia conforme al invento,

la Figura 2 el resultado de un experimento para la inhibición de la descomposición de una matriz de fibrina por células humanas de carcinoma de mama,

las Figuras 3 y 4 el efecto de una sustancia conforme al invento sobre la propagación, el crecimiento y la formación de metástasis de células de carcinoma de mama en una rata,

la Figura 5 el efecto de una sustancia conforme al invento sobre el crecimiento de un tumor de páncreas en una rata, y

la Figura 6 el efecto de una sustancia conforme al invento sobre el crecimiento de células humanas de carcinoma de mama en ratones.

Ejemplos 1. Hidrocloruro de 4-etoxicarbonil-piperazida de N\alpha-2,4,6 -triisopropil-fenilsulfonil-(L)-3-amidino-fenilalanina (compuesto conforme al invento) 1.1 Éster metílico de N\alpha-2,4,6-triisopropil-fenilsulfonil-(L)-3-ciano-fenilalanina

5 g del éster metílico de (L)-3-ciano-fenilalanina se suspendieron en 100 ml de dioxano, se añadieron 4,45 ml de N-metil-morfolina (NMM) y se agitó durante 30 min. Después de haber añadido 5,97 g de sulfocloruro de 2,4,6 -triisopropil-benceno en forma sólida, se agitó durante 3 días, después de ello se separó por filtración el NMM-HCl que había precipitado, se separó por destilación el disolvente, y el producto bruto obtenido se purificó a través de gel de sílice (KG, de KieselGel) 60 (con cloroformo). Rendimiento: 8,34 g de un jarabe (90%).

1.2 N\alpha-2,4,6-Triisopropil-fenilsulfonil-(L)-3-ciano-fenilalanina

8,34 g del compuesto 1.1 se calentaron a reflujo en una mezcla a base de cada vez 50 ml de ácido acético y de ácido clorhídrico 1 N durante 8 horas, después de haber enfriado se extrajo 2 veces con acetato de etilo, las soluciones en acetato de etilo reunidas se secaron sobre MgSO_{4} y el disolvente se separó por destilación. Después de haber purificado a través de KG 60 (con cloroformo) se obtuvieron 5,8 g (72%) de un producto sólido.

1.3 4-etoxicarbonil-piperazida de N\alpha-2,4,6-triisopropil -fenilsulfonil-(L)-3-ciano-fenilalanina

5,7 g del compuesto 1.2 se disolvieron en 100 ml de tetrahidrofurano (THF), se enfrió a 0ºC, se añadieron 2,22 g de \alpha-hidroxi-benzotriazol (HOBt), 2,82 g de diciclohexil-carbodiimida (DCC) y se agitó durante 30 min. Después de haber añadido 3,94 g de 1-etoxicarbonil-piperazina en 30 ml de THF, se agitó durante una noche, después de ello se separó por filtración la diciclohexil-urea (DCU) precipitada, el disolvente se separó por destilación y el producto bruto obtenido se purificó a través de KG 60 (con cloroformo). Rendimiento: 7,1 g de un polvo amorfo (96%).

1.4 Hidrocloruro de 4-etoxicarbonil-piperazida de N\alpha-2,4,6 -triisopropil-fenilsulfonil-(L)-3-amidino-fenilalanina

7,1 g del compuesto 1.3 se disolvieron en 30 ml de piridina, se añadieron 30 gotas de trietanol-amina (TEA), se introdujo durante 10 min una enérgica corriente de sulfuro de hidrógeno y se dejó reposar durante 2 días a la temperatura ambiente. A continuación, el disolvente se separó por destilación, el residuo se disolvió en acetato de etilo, la fase orgánica se lavó con ácido clorhídrico 1 N y con una solución saturada de cloruro de sodio, se secó sobre MgSO_{4} y el disolvente se separó por destilación. 7,2 g de la tio-amida obtenida de esta manera se disolvieron en 250 ml de acetona, la solución se mezcló con 17 g de yoduro de metilo y se dejó reposar durante 2 días a temperatura ambiente mediando protección con respecto de la luz. Después de esto, el disolvente se separó por destilación, el hidroyoduro del tio-imido -éster (8,5 g) se disolvió en 50 ml de metanol, se añadieron 1,9 g de acetato de amonio y la tanda se calentó a 60ºC durante 4 horas. El producto bruto obtenido después de haber separado por destilación el disolvente, se purificó a través de Sephadex LH20 (en metanol). El hidroyoduro de amidina, obtenido de esta manera, se transformó en el hidrocloruro a través de un intercambiador de iones (Amberlite IRA-420). Rendimiento: 5,3 g de un polvo amorfo (69%).

2. Hidrocloruro de bencil-amida de ácido N\alpha-2,4,6-triisopropil -fenilsulfonil-(D,L)-3-amidino-fenilalanil-nipecotínico (Ejemplo comparativo) 2.1 Éster etílico de ácido N\alpha-2,4,6-triisopropil-fenilsulfonil -(D,L)-3-ciano-fenilalanil-nipecotínico

4,56 g de N\alpha-2,4,6-triisopropil-fenilsulfonil-(D,L)-3-ciano -fenilalanina (obtenida a partir del hidrocloruro del éster metílico de (D,L)-3 -ciano-fenilalanina y del correspondiente sulfocloruro, de una manera análoga a como se ha expuesto en los párrafos 1.1 y 1.2), 1,5 g de HOBt y 2,42 g de DCC se disolvieron en 50 ml de DMF, se agitó durante 1 h y a continuación se añadieron 2,36 g del éster etílico de ácido nipecotínico. Después de haber agitado durante una noche, se separó por filtración la DCU precipitada, el disolvente se separó por destilación, el residuo se disolvió en un poco de metanol y se dejo reposar para la cristalización. El precipitado formado se filtró con succión, se lavó con metanol y se secó. Rendimiento: 4,46 g (75%).

2.2 Ácido N\alpha-2,4,6-triisopropil-fenilsulfonil-(D,L)-3-ciano -fenilalanil-nipecotínico

4,4 g del éster etílico anteriormente descrito se calentaron a reflujo en una mezcla de 35 ml de ácido acético y 25 ml de HCl 1 N durante 2 horas. Después de haber añadido 10 ml de agua, se dejó reposar para el enfriamiento, depositándose un producto ceroso. Después de haber decantado el disolvente, se añadieron 200 ml de agua, se agitó enérgicamente durante un prolongado periodo de tiempo y la sustancia sólida obtenida se filtró con succión, se lavó con agua y se secó. Rendimiento: 3,84 g (92%).

2.3 Bencil-amida de ácido N\alpha-2,4,6-triisopropil-fenilsulfonil -(D,L)-3-ciano-fenilalanil-nipecotínico

2,28 g del compuesto descrito anteriormente, 0,6 g de HOBt y 0,97 g de DCC se disolvieron en 20 ml de DMF, se agitó durante 1 hora, a continuación se añadieron 0,6 g de bencil-amina y se continuó agitando durante una noche. Después de haber separado por filtración la DCU precipitada, el disolvente se separó por destilación, el residuo se disolvió en metanol y la solución se vertió sobre una mezcla de una solución al 5 por ciento de hidrógeno-carbonato de sodio y hielo. Después de 1 hora, el precipitado formado se filtró con succión, se lavó con agua y se secó en vacío. Rendimiento: 2,48 g (94%).

2.3 Hidrocloruro de bencil-amida de ácido N\alpha-2,4,6-triisopropil -fenilsulfonil-(D,L)-3-amidino-fenilalanil-nipecotínico

2,4 g del compuesto 2.3 se disolvieron en 30 ml de piridina, se añadieron 30 gotas de TEA, se introdujo sulfuro de hidrógeno en la solución durante 10 min y la tanda se dejó reposar durante 2 días a la temperatura ambiente. A continuación, el disolvente se separó por destilación, el residuo se recogió en acetato de etilo y se extrajo por agitación con HCl 1 N. Después de haber lavado la fase orgánica con una solución saturada de cloruro de sodio y de haber secado sobre sulfato de sodio, el disolvente se separó por destilación. 2,38 g de la tio-amida obtenida de esta manera se disolvieron en 100 ml de acetona, la solución se mezcló con 6,5 g de yoduro de metilo y se dejó reposar durante 20 horas a temperatura ambiente mediando protección con respecto de la luz. Después de esto el disolvente se separó por destilación, el hidroyoduro de tio-imido -éster se disolvió en 50 ml de metanol, se añadieron 0,5 g de acetato de amonio y la tanda se calentó a 60ºC durante 4 horas en un baño de agua. El producto bruto, obtenido después de haber separado por destilación el disolvente, se pudo purificar a través de KG 60. La elución se efectuó en primer lugar con cloroformo y a continuación con una mezcla de cloroformo y metanol 9:1. El hidroyoduro de amidina purificado de esta manera se transformó en el hidrocloruro a través de un intercambiador de iones (Amberlite IRA-420). Rendimiento: 1,45 g de un polvo amorfo (56%).

La caracterización de los compuestos se efectuó mediante espectrometría de masas, la comprobación de la pureza se efectuó mediante DC (cromatografía de capa fina) y HPLC (cromatografía en fase líquida a alta presión).

3. Inhibición in vitro de la urocinasa mediante compuestos seleccionados de la Fórmula I

3

: Abreviaturas: TIPP - 2,4,6-triisopropil-fenilo

Determinación del efecto inhibidor

Para la determinación de la actividad inhibidora se incubaron 200 \mul del tampón Tris (0,05 mol/l, que contiene el agente inhibidor, 0,154 mol/l de NaCl, 5% de etanol, de pH 8,0), 25 \mul de un substrato (Pefachrome UK o Bz-\betaAla-Gly-Arg-pNA en H_{2}O; Pentapharm Ltd., Basilea, Suiza) y 50 \mul de sc-urocinasa (Ribosepharm GmbH, Haan, Alemania) a 25ºC. Después de 3 min, se interrumpió la reacción mediante adición de 25 \mul de ácido acético (al 50%) y se determinó la absorción a 405 nm mediante un lector de microplacas Microplate Reader (MR 5000, Dynatech, Denkendorf, Alemania). Los valores de K_{i} se determinaron de acuerdo con Dixon por regresión lineal por medio de un programa de ordenador. Los valores de K_{i} son el promedio de por lo menos 3 determinaciones; la desviación típica estaba situada por debajo de 25%.

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(Tabla pasa a página siguiente)

4. Inhibición in vitro de diversas proteasas de serina del tipo de tripsina por la 4-etoxicarbonil-piperazida de N\alpha-(2,4,6-triisopropil -fenilsulfonil)-(L)-3-amidino-fenilalanina (agente inhibidor de la uPA) y la N'-metil-piperazida de N\alpha-2-naftilsulfonil-3-amidino-fenilalanina (derivado de naftilsulfonilo) como comparación

4

La determinación del efecto inhibidor para las enzimas utilizadas se efectuó según el principio descrito en el Ejemplo 3.

A partir de los valores indicados anteriormente se puede observar que la sustancia inhibidora de la urocinasa conforme al invento, es decir el agente inhibidor de la uPa, tiene sorprendentemente un valor de K_{i} para la urocinasa más pequeño en un factor de 10 que para cadenas individuales de tPa (Sc-tPA). Por consiguiente, las sustancias conformes al invento se adecuan como agentes inhibidores selectivos de la urocinasa. Como comparación se indica la actividad inhibidora del derivado de naftilsulfonilo, que tiene una actividad anti-uPA in vitro significativamente más pequeña.

5. Determinación de la citotoxicidad

Para la determinación de la proliferación celular y de la citotoxicidad se empleó un sistema de ensayo que se puede adquirir comercialmente (Promega), el cual está basado en la reacción celular de una sal de tetrazolio. El producto coloreado que resulta de esta reacción se puede cuantificar mediante un espectrómetro ELISA (ICN-Flow). El agente inhibidor sintético (círculos vacíos) no tenía por sí solo, al contrario que el disolvente (círculos rellenos), ninguna influencia sobre el crecimiento celular de células humanas de carcinoma de ovario OV-MZ-6 (Figura 1). Por consiguiente, el agente inhibidor de la uPA conforme al invento no es citotóxico en unas concentraciones farmacológicamente eficaces de hasta 40 \muM.

6. Inhibición de la descomposición de una matriz de fibrina por células humanas de carcinoma de mama

Para la investigación de la capacidad de células tumorales para descomponer a una matriz extracelular, se desarrolló y utilizó un sistema de ensayo de descomposición de la matriz de fibrina. Cuanto más grande sea la actividad proteolítica de las células tumorales, tanto más alta es la concentración de los productos de descomposición de fibrina en el material sobrenadante de la matriz. La capacidad para descomponer a la matriz corresponde a la concentración de los productos de descomposición de fibrina, que se determinan mediante un ELISA (dímero D).

Los geles de fibrina se formaron en placas de cultivo de 24 pocillos a partir de 200 ml de fibrinógeno (50 mg/ml) en PBS (solución salina tamponada con fosfato) (de pH 7,4) mediante 50 \mul de trombina (10 U/ml) y 50 \mul de CaCl_{2} (150 mM) por pocillo, después de haber incubado durante 30 min a 37ºC. 2 x 10^{5} células de carcinoma de mama se sembraron sobre esta matriz de fibrina en 1 ml de un medio de cultivo DMEM, más 10% de suero de ternero fetal y 2 \mug de Glu-plasminógeno, y se incubó durante 4 horas. Después de esto se centrifugó el material sobrenadante, a fin de eliminar las células, y los productos de descomposición de fibrina se cuantificaron mediante un ELISA. La adición del agente inhibidor (A) conforme al invento en diferentes concentraciones condujo a una inhibición significativa de la descomposición de la matriz por células de carcinoma de mama, en comparación con el derivado de naftilo (B), que no muestra ninguna inhibición de la descomposición de fibrina por células de carcinoma de mama (Figura 2).

7. Sistema de ensayo in vivo del agente inhibidor de la uPA para determinar la propagación de tumores, el crecimiento de tumores y la formación de metástasis en ratas A) Modelo de cáncer de mama

Fragmentos de 10-25 mm^{2} de tumores de cáncer de mama de ratas BN-472 se trasplantaron ortotrópicamente por vía subcutánea (en el día 0) debajo del panículo adiposo de la glándula mamaria en ratas Brown Norwegian (Noruegas Pardas) hembras con una edad de 6 a 7 semanas. El tratamiento de los animales comenzó por vía intraperitoneal a las 24 horas después de la inoculación de tumores. Cada grupo constaba de 8 animales. El grupo testigo recibió solamente una solución inyectable (100 \mul de una solución de etanol al 10% en una solución salina (NaCl al 0,9%)). Al grupo comparativo tratado con el derivado de naftilo (B) y al grupo sometido a terapia con el agente inhibidor de la uPA (A) conforme al invento se les administró diariamente en la solución anteriormente citada i.p. (por vía intraperitoneal) una dosis de 1 mg/kg de peso corporal. El tratamiento se llevó a cabo a lo largo de un periodo de tiempo de 4
semanas.

Las dimensiones de los tumores subcutáneos y los pesos de los animales se determinaron semanalmente. Al final del tratamiento se sacrificaron los animales y se determinaron los pesos de los tumores, los pesos de los órganos y el número de metástasis en tejidos relevantes.

El tratamiento con el agente inhibidor de la uPA (A) condujo a una reducción significativa del peso de los tumores primarios así como de los nódulos linfáticos axilares (p = 0,003 y p = 0,005 respectivamente) en comparación con el derivado de naftilo (B) y con los grupos testigos sin agente inhibidor (Figuras 3 y 4). Los pesos de pulmones, hígados, riñones y bazos en los casos de los animales tratados con el agente inhibidor de la uPA permanecieron inalterados frente a los de los animales testigos.

B) Modelo de carcinoma de páncreas

Fragmentos del adenocarcinoma de páncreas trasplantable y que forma metástasis CA20948 de una rata se explantaron a partir de animales donantes. Después del aislamiento de las células, se implantaron por vía subcutánea las mismas cantidades de células tumorales suspendidas en común con 2 mg de Matrigel, a cada uno de los animales receptores, ratas Lewis machos con una edad de 10 semanas (n = 9). La realización del tratamiento así como la composición de los grupos sometidos a terapia eran idénticas a lo indicado en el párrafo A).

Como puede observarse en la Figura 5, en el caso del agente inhibidor de la uPA conforme al invento (círculos vacíos) en comparación con el derivado de naftilo (círculos rellenos) y el grupo testigo (triángulos) se encuentra una disminución significativa del peso de los tumores y una disminución del crecimiento en el caso de los carcinomas de páncreas de ratas.

C) Repetición de los experimentos con un modo de aplicación modificado

Los experimentos descritos en las secciones A y B se repitieron con un tipo de aplicación modificado del agente inhibidor. En estos casos, sin modificación de la dosis diaria, el agente inhibidor se aplicó por vía subcutánea en el modelo de carcinoma de mama (n = 9) y por vía intraperitoneal en el modelo de carcinoma de páncreas (n = 8). Los resultados de estos experimentos repetidos correspondieron en cuanto a la tendencia y a la extensión a los resultados ya representados.

D) Recopilación de los resultados

En todos los experimentos se consiguió mediante tratamiento con el agente inhibidor una reducción considerable del tamaño de los tumores o del peso de los tumores y del número y respectivamente de la masa de tumefacciones o tumores filiales en comparación con los grupos testigo. En el modelo de tumor de mama, en el grupo tratado con el agente inhibidor, los pesos medios de los tumores se habían reducido al final del tratamiento a 23% (i.p.) y respectivamente a 37% (por vía subcutánea = s.c.) en comparación con los testigos tratados con un vehículo. Los números de los focos pulmonares en los grupos tratados con el agente inhibidor se habían reducido a 9% (i.p.) y respectivamente a 32% (s.c.) y los pesos medios de los nódulos linfáticos axilares se habían reducido a 27% (i.p.) y respectivamente a 48% (s.c.).

En el modelo de tumor de páncreas, las masas de los páncreas que contenían tumores en los grupos tratados con el agente inhibidor se habían reducido en un 76% (i.p.) y respectivamente en un 34% (s.c.), las masas de los tumores subcutáneos se habían reducido en un 54% (i.p.) y respectivamente en un 60% (s.c.) en comparación con los respectivos grupos tratados con un vehículo. Los números de focos hepáticos detectados en los grupos tratados con el agente inhibidor eran de 29% (i.p.) y respectivamente 2% (s.c.) en comparación con los grupos testigos tratados con un vehículo.

El desarrollo del aumento de peso corporal y la comparación de los pesos de los órganos entre los grupos tratados con el agente inhibidor y los grupos tratados con un vehículo no proporcionó ninguna indicación acerca de una eventual toxicidad considerable del agente inhibidor bajo las condiciones descritas.

8. Tratamiento de células humanas de cáncer de mama en ratones desprovistos de inmunidad

Para ensayar la eficiencia in vivo del agente inhibidor para la inhibición del crecimiento tumoral de células humanas de carcinoma de mama (MDA-BA-231), se inyectaron 6 x 10^{6} células por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones Balb/c desprovistos de inmunidad (con una edad de 4-6 semanas). Las células tumorales se incubaron previamente antes de la inoculación con el agente inhibidor sintético de la uPA. Después de 24 h los ratones se trataron dos veces por semana por vía intraperitoneal con una dosis de 1,2 mg/kg de peso corporal tal como se ha descrito en el párrafo A). El tamaño de los tumores se determinó semanalmente mediante medición de los dos diámetros mayores.

Como se desprende de la Figura 6, el volumen de los tumores, en el caso de la administración del agente inhibidor de la uPA (círculos vacíos) aumenta de manera significativamente más lenta que en el grupo testigo (círculos rellenos) en donde se administró etanol en una solución salina.

9. La biodistribución del agente inhibidor en ratas

La biodistribución del agente inhibidor se determinó en dos experimentos independientes en materiales disgregados de tejidos de ratas, que habían sido tratadas diariamente i.p. una vez con 1 mg/kg de agente inhibidor durante 5 y 10 días respectivamente. Para efectuar la disgregación se desmenuzaron mecánicamente en cada caso 100 mg de un tejido y se mezclaron con 200 \mul de Triton X-100 al 1% en una solución fisiológica de cloruro de sodio. Después de haber añadido 400 \mul de etanol, el material disgregado se trató con ultrasonidos durante 1 min. El extracto de tejido se centrifugó durante 15 min a 12.000 x g. Para la purificación previa, el material sobrenadante se aplicó sobre una columna preliminar con C18 silice de fase inversa (cartucho Sep-Pak® cartridge C18, 1 ml de Waters, Eschborn, Alemania), equilibrada con 1 ml de metanol y 1 ml de agua, se lavó consecutivamente con 2 x 1 ml de H_{2}O, 1 ml de metanol al 10%, 1 ml de H_{2}O, 1 ml de acetonitrilo al 5%, 0,04% de ácido perclórico y 1 ml de H_{2}O, y se eluyó con 500 \mul de acetonitrilo al 75% y con 0,04% de ácido perclórico. La analítica por HPLC se llevó a cabo en una columna con C18 sílice de fase inversa con un gradiente de 5-55% de acetonitrilo y con 0,04% de ácido perclórico.

Las concentraciones del agente inhibidor en los tipos de tejidos respectivamente investigados (en \mug/g), así como en plasma sanguíneo y en bilis (en \mug/ml) y, como comparación, las de un correspondiente derivado de naftilsulfonilo, se recopilan en la siguiente Tabla.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA Perfil de distribución de una sustancia conforme al invento en diferentes tejidos o en plasma sanguíneo y en bilis, en comparación con un derivado de naftilsulfonilo (4-etoxicarbonil-piperazida de N\alpha-2-naftilsulfonil-3 -amidino-fenilalanina)

5

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En la mayoría de los tipos de tejidos investigados, después de 5 a 10 días, el agente inhibidor estaba presente en un orden de magnitud de 1 a 3 \mug/g. Las concentraciones en plasma del agente inhibidor estaban situadas, a las 24 h después de la respectivamente última aplicación i.p., en cada caso en uno o dos ordenes de magnitud por debajo de las concentraciones medias en el tejido. De esto se puede sacar la conclusión de una alta afinidad para el tejido y una baja fijación a proteínas en plasma. Las concentraciones del derivado de naftilsulfonilo aplicado como comparación durante 5 días, fueron de 20-30 veces más pequeñas en los diferentes tejidos.

El agente inhibidor muestra un llamativo enriquecimiento en los nódulos linfáticos. En los experimentos independientes se midieron en nódulos linfáticos traqueales, después de una aplicación durante 5 días, unas concentraciones de 5,3 y 7,5 \mug/kg respectivamente, y después de una aplicación durante 10 días unas concentraciones de 21,6 y 16,4 \mug/g respectivamente. Puesto que las células tumorales se diseminan regularmente a través de las vías linfáticas, el enriquecimiento específico del agente inhibidor en los vasos linfáticos presenta importancia y ventaja para su empleo como agente terapéutico anti-metástasis.

Claims

1. Medicamento

caracterizado porque

como sustancia activa contiene 4-etoxicarbonil-piperazida de N\alpha-(2,4,6 -triisopropil-fenilsulfonil)-3-amidino-(D,L)-fenilalanina, el enantiómero L de ésta o una sal farmacéuticamente compatible de uno de los compuestos.

2. Medicamento de acuerdo con la reivindicación 1 para la administración en combinación con otras sustancias activas.

3. Medicamento de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 para la administración en combinación con otros agentes antitumorales.

4. Medicamento de acuerdo con la reivindicación 2 ó 3 para la administración en combinación con otros agentes inhibidores de la urocinasa.

5. Medicamento de acuerdo con la reivindicación 4,

caracterizado porque

los agentes inhibidores de la urocinasa están seleccionados entre el conjunto que consta de anticuerpos o/y péptidos.

6. Medicamento de acuerdo con la reivindicación 1 para el empleo con otros tipos de tratamiento, p.ej. irradiación o intervenciones quirúrgicas,

7. Medicamento de acuerdo con la reivindicación 1,

caracterizado porque

contiene la sustancia activa en forma de un conjugado con una sustancia fisiológicamente activa.

8. Medicamento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7,

caracterizado porque

contiene además por lo menos una sustancia coadyuvante o/y de vehículo farmacéuticamente apropiada.

9. Medicamento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 8 para la administración por vía tópica, oral, rectal o parenteral, p.ej. subcutánea o intravenosa.

10. Medicamento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 9 en forma de tabletas, grageas, cápsulas, gránulos, supositorios, soluciones o sistemas transdérmicos, tales como p.ej. emplastos.

11. Medicamento de acuerdo con la reivindicación 1,

caracterizado porque

la sustancia activa está incorporada en la membrana de vesículas de soporte, p.ej. liposomas.