CZ2004265A3 - Peptidové arginaly a způsoby léčby diseminované intravaskulární koagulace - Google Patents

Description

Oblast techniky

Předmětný vynález se týká diseminované intravaskulární koagulace. Konkrétně se předmětný vynález týká léčebného zásahu v případě výskytu diseminované intravaskulární koagulace.

Dosavadní stav techniky

Diseminovaná intravaskulární koagulace (DIC) je sekundárním onemocněním a může být důsledkem velkého počtu primárních onemocnění (viz. publikace Bick, Disseminated Intravascular Coagulation and Related Syndromes, CRC Press, Boča Raton, (1983)). Mezi charakteristické příznaky tohoto onemocnění patří systemická aktivace koagulace krve, která vede ke generování a ukládání fibrinu, což dále vede ke vzniku mikrovaskulárních trombů v různých orgánech a k podpoře k vyvinutí selhání více orgánů. V publikaci Bick a spolupracovníci, Clin. Appl. Thrombosis Hemostasis, 1: 3-23 (1995) je popsáno, že dalším charakteristickým znakem DIC je systemicky obíhající plasmin, což je komplexní proteolytický enzym, jenž je schopen biologicky odbourávat různé plazmové proteiny (faktory, hormony atd.) a který je schopen štěpit fibrinogen/fibrin za vzniku produktů degradace fibrinogenu/fibrinu. Tyto produkty negativně ovlivňují hemostázi a vedou ke krvácení.

Nejvážnější klinická forma DIC je charakteristická extenzivní spotřebou proteinů podílejících se na koagulaci, výrazným ukládáním fibrinu a krvácením.

Zranění pacienti jsou vystaveni zvýšenému riziku výskytu DIC, a to zejména pokud je toto zranění doprovázeno velkými plochami poraněné tkáně (zejména pak mozku), sepse a selhání více orgánů. Poranění hlavy je zvlášť, běžnou příčinou výskytu DIC u kojenců a dětí, protože mozek obsahuje vysoké množství tromboplastinu a díky proporcionálně zvýšenému poměru velikosti povrchu hlavy k celkovému povrchu těla.

Sepse se může vyskytnout u přibližně 40 procent všech zraněných pacientů a jedná se o významnou primární příčinu výskytu DIC u všech pacientů. Klinický stav pacienta zhoršuje sekundární fibrinolýza, která vede ke vzniku produktů degradace fibrinogenu/fibrinu (FDP z anglického spojení „fibrinogen/fibrin degradation product) neboli „D-dimerů, které interferují s normální tvorbou fibrinu a funkcí krevních destiček.

Ukládání fibrinu při onemocnění DIC může vést k další dysfunkci orgánu. DIC je hlavní příčinou akutního renálního selhání a může rovněž přispívat k několikanásobnému selhání tělesných orgánů. Popsaný efekt platí i opačně, tj. že poškozené orgány přispívají ke vzniku DIC.

V současné době je jediná přijatelná -léčba DIC omezená na pokusy zmírnění dané primární poruchy. Pokud není DIC léčena, probíhá dále i přes aplikaci terapie zaměřené na zmírnění krvácení nebo trombotického problému. V některých případech, ···· «· ···· · · · • · · · · · · • · ···· · · · · ve kterých dochází k výraznému krvácení, může být do získání kontroly nad primárním problémem vhodné aplikovat substituční terapii, při níž se používá čerstvá zmrazená plazma, kryoprecipitát složek plazmy (např. antitrombinu III) a/nebo koncentráty krevních destiček, avšak tyto terapie jsou nepřijatelně nákladné. Použití heparinu u pacientů postižených DIC je velmi kontroverzní a obecně se nepoužívá u pacientů, u nichž je uvedeným primárním problémem zranění.

Proto existuje poptávka po nových a lepších sloučeninách a způsobech pro léčení DIC. Viz. např. také publikace de Jonge a spolupracovníci, Drugs, 55: Ί6Ί-ΊΊΊ (1998) a Levi a spolupracovníci, Thrombosis and Haemostasis, 82: 695 (1999).

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu jsou nové a lepší sloučeniny a způsoby pro léčení DIC. Zcela neočekávatelně bylo zjištěno, že sloučeniny s antikoagulačními účinky, které vykazují účinek jak vůči volnému trombinu a trombinu vázanému k trombu, tak vůči faktoru Xa, a které rovněž inhibují aktivátory plasminu a plasminogenu, mohou být vhodné pro léčbu DIC.

Prvním aspektem předmětného vynálezu je kompozice zahrnující peptidylarginal obecného vzorce (I)

Xaa-Xbb-Arg-H (I) kde

Xaa představuje zbytek α-substituované karboxylové kyseliny obecného vzorce (II)

Q-CH(R)-CO (II) kde

Q představuje alkyloxykarbonylaminoskupinu obsahující v alkylové části od 1 do 3 atomů uhlíku, methylaminoskupinu nebo hydroxylovou skupinu, a

R představuje cykloalkylmethylovou skupinu obsahující v cykloalkylová části od 7 do 9 atomů uhlíku, nebo cykloalkylovou skupinu obsahující od 5 do 7 atomů uhlíku nebo 1-adamantylmethylovou skupinu; a

Xbb představuje zbytek L-prolinu nebo zbytek L-azetidin-2karboxylové kyseliny a kyselé adiční soli těchto sloučenin vytvořené s organickými nebo anorganickými kyselinami.

Ve zvlášť, výhodném provedení mohou být sloučeniny podle předmětného vynálezu vybrány ze skupiny zahrnující: strukturu vyjádřenou vzorcem (1) (tj. ethoxykarbonyl-D-cykloheptylalanyl-L-prolyl-L-argininaldehyd, neboli Eoc-D-cHpa-Pro-Arg-H), strukturu vyjádřenou vzorcem (2) (tj. N-methyl-D-cykloheptylalanyl-L-prolyl-L-argininaldehyd, neboli N-Me-D-cHpa-ProArg-H), strukturu vyjádřenou vzorcem (3) (tj. D-cykloheptyllaktyl-L-prolyl-L-argininaldehyd, neboli D-cHpl-Pro-Arg-H), strukturu vyjádřenou vzorcem (4) (tj . N-methyl-D-cyklohexylglycyl-L-azetidin-2-karbonyl-L-argininaldehyd, neboli N-Me-D-Chg-Aze-Arg-H), což jsou sloučeniny odpovídající obecnému vzorci (I), ve kterém skupina Xaa představuje zbytky

a-substituovaných alkylových karboxylových kyselin obecného vzorce (II), ve kterém skupina R představuje cykloheptylmethylovou skupinu, respektive cyklohexylovou skupinu, skupina Q představuje ethoxykarbonylaminoskupinu, methylaminoskupinu, respektive hydroxylovou skupinu a skupina Xbb představuje zbytek L-prolinu, respektive zbytek kyseliny L-azetidinyl-2karboxylové.

NH

Dalším aspektem předmětného vynálezu je farmaceutická kompozice zahrnující antikoagulační peptidylarginal nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl podle prvního aspektu tohoto vynálezu a farmaceuticky přijatelný nosič, excipient nebo ředidlo.

Dalším aspektem předmětného vynálezu je způsob léčení diseminované intravaskulární koagulace, který zahrnuje podávání peptidylarginalu obecného vzorce (I)

Xaa-Xbb-Arg-H „ (I.) kde

Xaa představuje zbytek a-substituované karboxylové kyseliny obecného vzorce (II)

Q-CH(R)-CO (II) kde

Q představuje alkyloxykarbonylaminoskupinu obsahující v alkylové části od 1 do 3 atomů uhlíku, methylaminoskupinu nebo hydroxylovou skupinu, a

R představuje cykloalkylmethýlovou skupinu obsahující v cykloalkylové části od 7 do 9 atomů uhlíku, nebo 1-adamantylmethylovou skupinu, nebo cykloalkylovou skupinu obsahující od 5 do 7 atomů uhlíku; a

Xbb představuje zbytek L-prolinu nebo zbytek L-azetidin-2karboxylové kyseliny nebo kyselých adičních solí těchto sloučenin, vytvořených s organickými nebo anorganickými kyselinami, pacientovi s diseminovanou intravaskulární koagulace.

Ve zvlášú výhodném provedení mohou být sloučeniny podle předmětného vynálezu vybrány ze skupiny zahrnující: strukturu vyjádřenou vzorcem (1) (tj. ethoxykarbonyl-D-cykloheptylalanyl-L-prolyl-L-argininaldehyd, neboli Eoc-D-cHpa-Pro-Arg-H), strukturu vyjádřenou vzorcem (2) (tj. N-methyl-D-cykloheptylalanyl-L-prolyl-L-argininaldehyd, neboli N-Me-D-cHpa-ProArg-H), strukturu vyjádřenou vzorcem (3) (tj. D-cykloheptyllaktyl-L-prolyl-L-argininaldehyd, neboli D-cHpl-Pro-Arg-H), strukturu vyjádřenou vzorcem (4) (tj. N-methyl-D-cyklohexylglycyl-L-azetidin-2-karbonyl-L-argininaldehyd, neboli N-Me-D-Chg-Aze-Arg-H), což jsou sloučeniny odpovídající obecnému vzorci (I), ve kterém skupina Xaa představuje zbytky a-substituovaných alkylových karboxylových kyselin obecného vzorce (II), ve kterém skupina R představuje cykloheptylmethýlovou skupinu, respektive cyklohexylovou skupinu, skupina Q představuje ethoxykarbonylaminoskupinu, methylaminoskupinu, respektive hydroxylovou skupinu a skupina Xbb představuje

zbytek L-prolinu, karboxylové.

respektive zbytek kyseliny L-azetidinyl-2 -

A Á .H

NH ···· ·· ··«· ·· · • · · · · · · • · ···· · ··· • · · · ··· ····

Předmětný vynález se týká diseminované intravaskulární koagulace. Konkrétně se předmětný vynález týká léčebného zásahu v případě výskytu diseminované intravaskulární koagulace. Předmětem tohoto vynálezu jsou nové a lepší sloučeniny a způsoby pro léčení DIC. Sloučeniny podle tohoto vynálezu vykazují inhibiční účinky jak vůči volnému trombinu a trombinu vázanému k trombu, tak vůči faktoru Xa a rovněž inhibují aktivátory plasminu a plasminogenu.

Patenty a publikace citované v tomto textu odrážejí současný stav techniky v daném oboru a jejich obsah je zahrnut v tomto textu jako odkazový materiál. Jakoukoli nekonzistenci mezi těmito patenty a publikacemi a tímto popisem je třeba vykládat ve prospěch předmětného popisu.

Prvním aspektem předmětného vynálezu je kompozice zahrnující peptidylarginal obecného vzorce (I)

Xaa-Xbb-Arg-H (I) kde

Xaa představuje zbytek a-substituované karboxylové kyseliny obecného vzorce (II) • · « «

Q-CH(R)-CO (II) kde

Q představuje alkyloxykarbonylaminoskupinu obsahující v alkylové části od 1 do 3 atomů uhlíku, methylaminoskupinu nebo hydroxylovou skupinu, a

R představuje cykloalkylmethylovou skupinu obsahující v cykloalkylová části od 7 do 9 atomů uhlíku, nebo 1-adamantylmethylovou skupinu, nebo cykloalkýlovou skupinu obsahující od 5 do 7 atomů uhlíku; a

Xbb představuje zbytek L-prolinu nebo zbytek L-azetidin-2karboxylové kyseliny a kyselé adiční soli těchto sloučenin vytvořené s organickými nebo anorganickými kyselinami.

Zvlášť výhodným provedením tohoto’aspektu předmětného vynálezu je sloučenina vzorce (1) (tj. ethoxykarbonyl-Dcykloheptylalanyl-L-prolyl-L-argininaldehyd, neboli Eoc-D-cHpa-Pro-Arg-H):

O • ···· · · · · · · ·· · ·· · r· · « · * * • · · «··« · » * ·

··· · ♦ · · · · * · · ·

Dalším zvlášť, výhodným provedením tohoto aspektu předmětného vynálezu je sloučenina vzorce (2) (tj. N-methyl-Dcykloheptylalanyl-L-prolyl-L-argininaldehyd, neboli

N-Me-D-cHpa-Pro-Arg-H):

Dalším zvlášť výhodným provedením tohoto aspektu předmětného vynálezu je sloučenina vzorce (3) (tj. D-cykloheptyllaktyl-L-prolyl-L-argininaldehyd, neboli D-cHpl-Pro-Arg-H):

Dalším zvlášť výhodným provedením tohoto aspektu předmětného vynálezu je sloučenina vzorce (4) (tj. N-methylD-cyklohexylglycyl-L-azetidin-2-karbonyl-L-argininaldehyd, neboli N-Me-D-Chg-Aze-Arg-H):

« · · «

NH

Η

O

Sloučeniny vzorce (1), (2), (3) a (4) se připravují například kondenzací N- nebo O-chráněného 2-zbytku kyseliny s L-argininlaktamem, který je chráněný na guanidinové skupině benzyloxykarbonylovou skupinou, a redukcí získaného tripeptidlaktamu na chráněný tripeptidaldehyd, odstraněním uvedené chránící skupiny z guanidinové skupiny argininu a, v případě, že skupina Q v obecném vzorci (II) představuje methylaminoskupinu nebo hydroxylovou skupinu, rovněž z terminální methylaminoskupiny nebo hydroxylové skupiny a izolací peptidového derivátu obecného vzorce (I) ve formě jeho adiční soli s organickou nebo anorganickou kyselinou.

Sloučeniny obecného vzorce (I) se připravují a používají ve formě kyselých adičních solí, a to kvůli větší stabilitě těchto solí. V případě kyselých adičních solí sloučenin obecného vzorce (I) je aktivita sloučenin dána odpovídající volnou bází a povaha dané kyseliny je méně důležitá, i když pro terapeutické účely je výhodné používat farmaceuticky přijatelné kyselé adiční soli. Jako příklad kyseliny vhodné pro vytvoření takovýchto kyselých adičních solí je možné uvést (a) minerální kyseliny, jako je kyselina chlorovodíková, kyselina bromovodíková, kyselina fosforečná, kyselina metafosforečná a kyselina sírová, (b) organické kyseliny, jako je kyselina vinná, • · · · ··· ·· ·« ··· · · kyselina octová, kyselina citrónová, kyselina jablečná, kyselina mléčná, kyselina fumarová, kyselina benzoová, kyselina glykolová, kyselina glukonová, kyselina jantarová, kyselina pamová a arylsulfonové kyseliny, jako je například kyselina p-toluensulfonová. Výhodnou kyselou adiční solí podle tohoto vynálezu je sulfát, zvláště pak hemisulfát.

Uvedené kyselé adiční se připravují běžným způsobem, jako je například neutralizace volné báze sloučeniny obecného vzorce (I) kyselinou.

Strukturu uvedené komponenty tvořené 2 zbytky kyselin je možné vystihnout obecným vzorcem D-Xaa-Xbb, ve kterém skupina Xaa představuje zbytek a-substituované karboxylové kyseliny obecného vzorce Q-CH(R)-CO, ve kterém skupina Q představuje alkoxykarbonylaminoskupinu obsahující v alkoxylové skupině od 1 do 3 atomů uhlíku, skupina R má výše definovaný význam a skupina Xbb představuje zbytek L-prolinu nebo kyseliny L-azetidin-2-karboxylové. Pokud skupinou Xaa, tj. a-substituovanou karboxylovou kyselinou, je a-methylaminokyselina nebo a-hydroxykyselina, tzn. že skupina Q představuje methylaminoskupinu nebo hydroxylovou skupinu, je možné strukturu uvedené komponenty tvořené 2 zbytky kyselin vystihnout obecným vzorcem P-D-Xaa-Xbb, ve kterém P představuje N-chránicí skupinu, jako je benzyloxykarbonylová skupina (Z) nebo terč. butoxykarbonylová skupina (Boc), nebo O-chránicí skupinu, kterou je výhodně tetrahydropyranylová skupina (THP).

Acylový dipeptid, který se používá jako výchozí sloučenina pro přípravu uvedených sloučenin obsahujících zbytek a-aminokyseliny nebo α-methylaminokyseliny, se připravuje acylací ···· ·· «··· ·· · • · · ·> · · · • · · · · · · ♦ · · ··· · · · · ····· ··· ····· · · · a-aminokyseliny odpovídajícím esterem kyseliny chlormravenčí za vzniku alkoxykarbonylaminokyseliny obsahující v alkoxylové části od 1 do 3 atomů uhlíku a benzyloxykarbonylaminokyseliny, která se následně aduje na L-prolin nebo kyselinu L-azetidin2-karboxylovou za vzniku sloučeniny obecného vzorce D-Xaa-Xbb a sloučeniny obecného vzorce Z-aminoacyl-Xbb, která se methyluje za vzniku požadované sloučeniny obecného vzorce

P-D-Xaa-Xbb.

Sloučeninu obecného vzorce D-Xaa, kterou je třeba adovat na skupinu Xbb, je možné výhodně připravit acetylací racemické sloučeniny obecného vzorce DL-Xaa, převedením vzniklé

DL-acetylaminokyseliny na odpovídající methylester a enzymatickou resolucí vzniklého racemického esteru obecného vzorce DL-Xaa-OMe. Takto získaný ester obecného vzorce D-Xaa-OMe se následně zmýdelňuje a deacetyluje a poté převádí na požadovanou N-chráněnou D-aminokyselinu.

Požadovanou D-a-hydroxykyselinu je možné výhodně získat z odpovídající D-α-aminokyseliny. Poté je tato kyselina převedena na odpovídající O-chráněnou formu a adována na skupinu Xbb za vzniku požadovaného produktu obecného vzorce P-D-Xaa-Xbb.

Dalším aspektem předmětného vynálezu je farmaceutická kompozice zahrnující peptidylarginal podle prvního aspektu tohoto vynálezu a farmaceuticky přijatelný nosič, excipient nebo ředidlo.

Farmaceutické prostředky podle tohoto vynálezu zahrnují účinné množství sloučeniny obecného vzorce (I) nebo její

farmaceuticky přijatelné soli a známé farmaceuticky přijatelné nosiče, plniva, ředidla a/nebo další farmaceutické excipienty.

Výše uvedenými nosiči, ředidly nebo plnivy mohou být materiály vybrané ze skupiny zahrnující vodu, alkoholy, želatinu, laktosu, sacharosu, škrob, pektin, stearát hořečnatý, kyselinu stearovou, mastek, různé živočišné nebo rostlinné oleje a glykoly, jako je např. propylenglykol nebo polyethylenglykol.

Výše uvedené farmaceutické excipienty mohou být vybrané ze skupiny zahrnující konzervační činidla, různé přírodní a syntetické emulgátory, disperzní nebo smáčecí činidla, barvivá, chuřová činidla, pufry, materiály podporující dezintegraci a další materiály zlepšující biologickou dostupnost dané aktivní složky.

Farmaceutické kompozice podle předmětného vynálezu mohou být připraveny v obvyklých formách, jako jsou orální farmaceutické kompozice (podávané ústy), jejichž příkladem jsou tablety, kapsle, prášky, pilulky, dražé nebo granule, a parenterální farmaceutické kompozice (podávané s vyloučením gastrointestinálního traktu), jejichž příkladem jsou injekce, infúze, čípky, náplasti nebo masti.

Dalším aspektem předmětného vynálezu je způsob léčby pacienta postiženého diseminovanou intravaskulární koagulací, který zahrnuje podávání pepdidylarginalu obecného vzorce Xaa-Xbb-Arg-H, tj. obecného vzorce (I), ve kterém mají skupiny Xaa a Xbb výše uvedený význam, nebo farmaceuticky přijatelné kyselé adiční soli této sloučeniny pacientovi postiženému diseminovanou intravaskulární koagulací. Peptidylarginaly se označují také jako deriváty peptidylargininaldehydu.

Podle tohoto aspektu předmětného vynálezu vynález poskytuje způsob léčby diseminované intravaskulární koagulace, přičemž tento způsob zahrnuje podávání peptidylarginalů podle tohoto vynálezu živočichovi, včetně člověka. Při způsobu podle tohoto aspektu předmětného vynálezu se terapeuticky účinné množství peptidylarginalu podle tohoto vynálezu podává po terapeuticky účinnou dobu živočichovi, včetně člověka, v jehož těle dochází k diseminované intravaskulární koagulaci. Ve výhodném provedení tohoto způsobu se uvedené podávání provádí intravenóznš nebo subkutánnš, výhodněji pak intravenózně. Podávání farmaceutických kompozic podle tohoto vynálezu je možné provádět známými postupy, a to v dávkách a po takovou dobu, které jsou účinné pro snížení symptomů nebo nahrazení markérů DIC. Při systemickém podávání se farmaceutická kompozice podle tohoto vynálezu podává výhodně v dávce, která je dostatečná pro dosažení hladiny peptidylarginalů v krvi v rozmezí od přibližně 6 μΜ do přibližně'100 μΜ. Ve výhodném provedení se celková dávka pohybuje v rozmezí od přibližně 0,1 miligramu do přibližně 50 miligramů peptidylarginalu na kilogram tělesné hmotnosti denně. V některých případech může být žádoucí danému jedinci podávat během jednoho léčebného cyklu simultánně nebo postupně terapeuticky účinné množství jedné nebo více farmaceutických kompozic podle tohoto vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Níže uvedené příklady jsou určeny pro další ilustraci některých zvlášť výhodných provedení tohoto vynálezu a nijak neomezují jeho rozsah. Pokud není uvedeno jinak, byly pro níže uvedené experimenty lidský trombin (3 000 NIH U/mg), lidský albumin a lidský fibrinogen získány od společnosti Sigma Aldrich Kft. (Budapešť, Maďarsko) a lidský faktor Xa (8 pg/U) byl získán od společnosti Enzyme Research Laboratories (Swansea, Velká Británie). Reakční činidlo pro test APTT bylo získáno od společnosti REANAL (Budapešť, Maďarsko) a činidlo pro test PT, kterým byl simplastin D, bylo získáno od společnosti ORGANON, TEKNIKA (Eppelheim, Německo).

Zkratky aminokyselin, peptidů, substituentů a reakčních činidel použité v tomto textu jsou v souladu s pravidly IUPAC-IUB. Konkrétně jsou v tomto textu použity následující zkratky: Arg = L-arginin, Boc = terč. butoxykarbonyl, Bzl = benzyl, Chg - L-cyklohexylglycin, DCHA = dicyklohexylamin,

DHP = dihydropyran, Eoc = ethoxykarbonýl, Gly = glycin,

Me = methyl, MePhe = N-methyl-L-fenylalanin, Moc = methoxykarbonyl, Pro = L-prolin, pNA = p-nitroanilino, TFA = kyselina trifluoroctové, THP = tetrahydropyranyl, Tos = p-toluensulfonyl, Z = benzyloxykarbonyl. Dále jsou v tomto textu použity následující zkratky méně obvyklých kyselin: Ada = adamantylL-alanin, Aze = kyselina L-azetidin-2-karboxylové, N-Me-D-cHpa = N-methyl-D-cykloheptylalanin, D-cHpa = D-cykloheptylalanin nebo kyselina (R)-2-amino-3-cykloheptylpropionová, D-Hpa = kyselina D-cykloheptylmléčná nebo kyselina (R)-2-hydroxy-3cykloheptylpropionová.

Hodnoty retenčních faktorů (R_f) v příkladech byly stanoveny chromatografií na tenké vrstvě, a to s použitím silikagelového adsorbentu (DC-Alufolien Kieselgel 60 F₂₅4 , Merck, Darmstadt, Německo), a to v níže uvedených vyvíjecích systémech. Čísla použitých systémů jsou vždy uvedeny v závorce za zkratkou R_f.

1	ethylacetát
2 3 4 5 6	ethylacetát - n-hexan (1:4) ethylacetát - n-hexan (1:1) ethylacetát - cyklohexan (15:85) chloroform - aceton (95:5) ethylacetát - pyridin - kyselina octová - voda
7	(960:20:6:11) ethylacetát - pyridin - kyselina octová - voda
8	(480:20:6:11) ethylacetát - pyridin - kyselina octová - voda
9	(240:20:6:11) ethylacetát - pyridin - kyselina octová - voda
10	(120:20:6:11) ethylacetát - pyridin - kyselina octová - voda
11	(90:20:6:11) ethylacetát - pyridin - kyselina octová - voda
12	(60:20:6:11) ethylacetát - pyridin - kyselina octová - voda
13	(45:20:6:11) ethylacetát - pyridin - kyselina octová - voda

(30:20:6:11) .

Kapacitní faktory (k') uvedené v příkladech byly stanoveny pomocí zařízení „Pharmacia LKB Analytical HPLC System Two, a to za těchto podmínek:

Kolona: LiChrospher RP-18: 12 μτη 240 x 4 mm;

Teplota kolony: stejná jako v místnosti;

Eluční činidla: rozpouštědlo A - 0,1% TFA/voda;

rozpouštědlo B - 0,1% TFA/acetonitril;

Gradientovy profil: 0 až 15 minut 30 až 60 % B, potom isokraticky 60 % B;

Průtok rozpouštědla: 1 mililitr/minutu;

Detektor: LKB 2141 UV Monitor; vlnová délka 214 nanometrů Nástřik: Rheodyne 7125. Objem nástřikové smyčky 100 mikrolitrů;

Čerpadla: 2 typu LKB 2148;

Řídicí systém: LKB HPLC Manager;

Koncentrace vzorku: 1 miligram/mililitr rozpouštědla A, nastřikovaný objem 25 mikrolitrů;

Doba trvání analýzy 40 minut.

Acylargininové aldehydy jsou přítomné v rovnovážných strukturách, tj. ve formě aldehydu, hydrátu aldehydu a dvou aminocyklolových formách. Během HPLC analýzy se uvedený hydrát aldehydu a jedna nebo obě aminocyklolové formy objevují jako dva nebo tři oddělené píky. Acylargininové aldehydy popsané v příkladech jsou popsány dvěma nebo třemi hodnotami k'.

Co se hmotnostní spektroskopie týče, byla měření FAB s pozitivní ionizací prováděna v zařízení Finnigan MAT 8430. Vzorky byly rozpuštěny v m-nitrobenzylalkoholové (NBA) matrici a přivedeny přímo do zdroje iontů. Ve spektru peptidylarginin aldehydů byl detekovatelný další molekulový ion, který odpovídal další sloučenině vytvořené reakcí s NBA: [M+H]⁺ a [M+H+NBA]⁺. Odpovídajícím způsobem jsou údaje týkající se FAB spekter uvedeny i v příkladech. Měření ESI s pozitivní ionizací byla provedena v zařízení VG Quattro (Fisions). Vzorky byly rozpuštěny ve směsi acetonitril - voda (1:1) obsahující 1 objemové procento kyseliny mravenčí a byly přivedeny pomocí nástřikové smyčky o objemu 10 mililitrů do zdroje iontů, a to rychlostí 15 až 25 mililitrů/minutu.

Příklad 1

Syntéza hemisulfátu ethoxykarbonyl-D-cykloheptylalanyl-Lprolyl-L-argininaldehydu

Stupeň 1: ethoxykarbonyl-D-cykloheptylalanyl-L-prolyl-N^Gbenzyloxykarbonyl-L-argininlaktam

7,80 gramu (20,1 milimolu) terč. butyloxykarbonyl-N^Gbenzyloxykarbonyl-L-argininlaktamu (viz. publikace Bajusz a spolupracovníci, J. Med. Chem., 33, 1729 (1990)) byl suspendován ve 20 mililitrech chloroformu a následně bylo k roztoku, který byl neustále míchán a chlazen v ledové lázni, přidáno 20 mililitrů ethylacetátu nasyceného chlorovodíkem (obsah chlorovodíku činil 0,11 až 0,15 gramu/mililitr). Odštěpování Boc skupiny bylo monitorováno chromatografií na tenké vrstvě [Rf (11) = 0,5 (volná sloučenina); 1,0 (Boc-sloučenina)]. Na konci reakce byla suspenze zředěna 40 mililitry diethyletheru, vyloučená krystalická látka byla odfiltrována, promyta 10 mililitry acetonu a 10 mililitry diethyletheru a vysušena při sníženém tlaku nad hydroxidem draselným. Vzniklý hydrochlorid ff-benzyloxykarbonyl-L-laktamu byl rozpuštěn ve 20 mililitrech

dimethylformamidu, roztok byl ochlazen na teplotu -20 °C a přidán k následujícímu směsnému anhydridu.

7,12 (20,1 milimolu) ethoxykarbonyl-D-cykloheptylalanyl-Lprolinu (ze stupně J příkladu 1) bylo rozpuštěno ve 20 mililitrech dimethylformamidu, roztok byl ochlazen na teplotu -15 °C a za neustálého míchání k němu bylo postupně přidáno 2,23 mililitru (20,1 milimolu) N-methylmorfolinu a 2,65 mililitru (20,1 milimolu) isobutylchlorformiátu. Po 10 minutách míchání byl k reakční směsi nejprve přidán shora uvedený dimethylformamidový roztok N^G-benzyloxykarbonyl-L-argininlaktamu a následně triethylamin, a to v množství, které postačovalo k úpravě pH reakční směsi na hodnotu 8 (bylo třeba použít přibližně 2,8 mililitru triethylaminu).· Reakční směs byla 30 minut míchána při teplotě -10 °C a další 1 hodinu při teplotě 0 °C. Poté byly odfiltrovány vyloučené soli a získaný filtrát byl zředěn 100 mililitry ethylacetátu. Vzniklý roztok byl promyt 3 x 25 mililitry vody, 10 mililitry lmolárního roztoku KHSO₄ a 3 x 10 mililitry vody, vysušen nad bezvodým síranem sodným a odpařen při tlaku v rozmezí od 2,0 do 2,5 kilopascalu. Získaný produkt byl nanesen na chromatografickou kolonu naplněnou 200 gramy silikagelu (Kieselgel 60; 0,040 až 0,063 milimetru), která byla vymývána ethylacetátem. Frakce obsahující pouze čistý produkt [R_f (1) = 0,60] byly spojeny a odpařeny při tlaku v rozmezí od 2,0 do 2,5 kilopascalu. Zbytek po odpařování byl krystalizován z diisopropyletheru.

Výtěžek 10,84 gramu (86,1 procenta), Rf (1) - 0,55 az

0,65.

FAB hmotnostní spektrum (627 [M+H]⁺) potvrdilo předpokládanou strukturu.

Stupeň 2: ethoxykarbonyl-D-cykloheptylalanyl-L-prolyl-N⁰benzyloxykarbonyl-L-argininaldehyd

8,02 gramu (12,8 milimolu) ethoxykarbonyl-D-cykloheptylalanyl-L-prolyl-l^-benzyloxykarbonyl-L-argininlaktamu (ze stupně 1 příkladu 1) bylo rozpuštěno v 15 mililitrech tetrahydrofuranu a k tomuto roztoku byl za neustálého míchání a při teplotě nepřesahující -50 °C přidán roztok 3,6 milimolu LiAlH₄ v tetrahydrofuranu. Postup redukce byl monitorován chromatografií na tenké vrstvě (s eluci rozpouštědlem 7) a v případě potřeby byl do reakční směsi přidán další podíl LiAlH₄. K reakční směsi byl za neustálého míchání a chlazení přikapáván 0,5molární roztok KHSO₄ až do dosažení pH 3 a následně byla směs zředěna 35 mililitry vody. Vzniklý roztok byl extrahován 2 x 15 mililitry hexanu a 3 x 20 mililitry dichlormethanu. Dichlormethanové extrakty byly spojeny, promyty 3 x 15 mililitry vody, 15 mililitry studeného 5procentního roztoku hydrogenuhličitanu sodného a znovu 15 mililitry vody, vysušeny nad bezvodým síranem sodným a zahuštěny při tlaku v rozmezí od 2,0 do 2,5 kilopascalu. Ke zbytku po odpařování byl přidán diisopropyletheru, směs byla přefiltrována a filtrační koláč byl vysušen při sníženém tlaku.

Výtěžek 7,08 gramu (88 procent), R_f (8) = 0,40 až 0,50.

FAB hmotnostní spektrum (629 [M+H]⁺, 782 [M+H+NBA]*) potvrdilo předpokládanou strukturu.

Stupeň 3: hemisulfát ethoxykarbonyl-D-cykloheptylalanyl-Lprolyl-L-argininaldehydu

6,91 gramu (11,0 milimolu) ethoxykarbonyl-D-cykloheptylalanyl-L-prolyl-N^G-benzyloxykarbonyl-L-argininaldehydu (ze stupně 2 příkladu 1) bylo rozpuštěno v 85 mililitrech ethanolu a k tomuto roztoku bylo postupně přidáno 11,25 mililitru 0,5molární kyseliny sírové a suspenze 0,7 gramu Pd-C katalyzátoru ve 14 mililitrech vody a tato směs byla hydrogenována při teplotě přibližně 10 °C. Průběh reakce byl monitorován chromatografii na tenké vrstvě. Po skončení reakce (po asi 15 minutách) byl z reakční směsi odfiltrován katalyzátor a filtrát byl zahuštěn při tlaku v rozmezí od 2,0 do 2,5 kilopascalu na objem přibližně 7 až 9 mililitrů. Tento zbytek byl zředěn 80 mililitry vody, extrahován 4 x 15 mililitry dichlormethanu a vodná vrstva byla ponechána 24 hodin stát při teplotě od 20 do 22 °C. Roztok byl znovu extrahován 3 x 15 mililitry dichlormethanu, pomocí iontoměničové pryskyřice Dowex AG 1-X8 (HO) bylo pH směsi upraveno na hodnotu 3,5 a následně byl tento roztok lyofilizován.

Výtěžek 4,90 gramu (82 procent), Rf (11) = 0,35 až 0,45, [a]_D ²⁰ = -77,6° (c = 1,018; voda).

HPLC: k' = 1,695 a 2,328.

FAB hmotnostní spektrum (495 [M+H]⁺, 648 [M+H+NBA]⁺) potvrdilo předpokládanou strukturu.

·«·· ·» r · ·· · · · · * · · • · « · · * · · «·* · · · · ·

Syntéza výchozích sloučenin

Ethoxykarbonyl-D-cykloheptylalanyl-L-prolin

Stupeň A: l-cykloheptylacetyl-2,5-dimethylpyrazol

58,6 gramu (375 milimolu) kyseliny cykloheptyloctové (viz.

publikace Protiva a spolupracovníci, Collect. Czech. Chem. Commun., 55, 1278-1289 (1990)) bylo rozpuštěno v 375 mililitrech tetrahydrofuranu, vzniklý roztok byl ochlazen na teplotu -15 °C a poté k němu bylo za neustálého míchání přidáno 41,3 mililitru (375 milimolu) N-methylmorfolinu, 49,50 mililitru (375 milimolu) isobutylchlorformiátu a po 10 minutách míchání při teplotě -10 °C byl k reakční směsi při teplotě -10 °C přidán roztok 3,5-dimethylpyrazolu ve 300 mililitrech tetrahydrofuranu. Míchání směsi pokračovalo při teplotě -10 °C dalších 30 minut, dále 1 hodinu při teplotě 0 °C a další 3 hodiny při teplotě místnosti. Poté byly ze směsi odfiltrovány vyloučené soli, filtrát byl zahuštěn při sníženém tlaku a získaný zbytek byl rozpuštěn v 900 mililitrech ethylacetátu. Vzniklý roztok byl postupně promyt 3 x 80 mililitry lmolárního hydroxidu sodného, 89 mililitry vody, 3 x 80 mililitry lmolární kyseliny chlorovodíkové a vodou do neutrální reakce extraktu. (Bazické extrakty byly spojeny a okyseleny, čímž bylo regenerováno přibližně 5,8 gramu (37,1 milimolu) kyseliny cykloheptyloctové). Ethylacetátový roztok byl vysušen nad bezvodým síranem sodným a poté odpařen při tlaku v rozmezí od 2,0 do 2,5 kilopascalu. K získanému olejnatému produktu bylo přidáno 340 milimolů l-cykloheptylacetyl-2,5-dimethylpyrazolu a tato směs byla bez dalšího přečištění použita v dalším reakčním stupni. Rf (2) = 0,8 až 0,9 (kyselina: 0,3 až 0,4).

> · • 9 · 9 9 * 9 9 99 9

9 9 * · · ’ • · 9 9 9 9 9 9 · * · • 9 9 9 · »·· »»,···

Stupeň B: 1-cykloheptylacetaldehyd

K 350 mililitrům tetrahydrofuranu ochlazenému na teplotu -30 °C bylo přidáno 12,83 gramu (338 milimolů) LiAlH₄. Poté byl k této směsi za neustálého míchání při teplotě -25 °C přikapán roztok uvedeného olejnatého produktu (ze stupně A příkladu 1) v 250 mililitrech studeného tetrahydrofuranu. Reakce byla monitorována TLC. V případě potřeby bylo do reakční směsi přidáno 30 až 40 mililitrů roztoku LiAlH₄ v tetrahydrofuranu (o koncentraci 3 gramy LiAlH₄/l00 mililitrů). Po skončení redukce byla studená směs okyselena 6molární kyselinou chlorovodíkovou a zředěna 500 mililitry ethylacetátu. Vodná fáze byla extrahována ethylacetátem, organické vrstvy byly spojeny, promyty vodou do neutrální reakce extraktu, vysušeny nad bezvodým síranem sodným a odpařeny při tlaku v rozmezí od 2,0 do 2,5 kilopascalu. Získaným olejnatým produktem byl surový 1-cykloheptylacetaldehyd kontaminovaný 2,5-dimethylpyrazolem (DMP). R_f (2) = 0,7 až 0,8 (DMP: 0,25 až 0,35).

K 62,6 gramu uvedeného olejnatého produktu rozpuštěných ve 350 mililitrech methanolu byl za neustálého míchání přidán roztok 35,6 gramu NaHSO₃ v 70 mililitrech vody. Reakční směs byla přes noc uložena v mrazáku. Vysrážená pevná látka byla odfiltrována, promyta studenou směsí 35 mililitrů methanolu a 7 mililitrů vody, diethyletherem a vysušena. Získanou pevnou látkou byl adukt hydrogensiřičitanu sodného (73,87 gramu,

302,38 milimolů, R_f (14) = 0,55 až 0,65), který byl přidán do směsi 450 mililitrů dichlormethanu a 450 mililitrů vody obsahující 47,7 gramu (450 milimolů) uhličitanu sodného. Reakční směs byla míchána přes noc. Obě fáze byly od sebe odděleny, organická fáze byla promyta 2 x 100 mililitry dichlormethanu. Spojené organické vrstvy byly promyty vodou, vysušeny nad

bezvodým síranem sodným a odpařeny při tlaku v rozmezí od 2,0 do 2,5 kilopascalu. Bylo získáno 36,97 gramu (263,64 milimolu) olejnatého produktu, kterým byl čistý 1-cykloheptylacetaldehyd, jenž byl přímo použit v dalším'reakčním stupni.

R_f (2) = 0,7 až 0,8.

Stupeň C: 5-cykloheptylmethylhydantoin

K roztoku aldehydu (ze stupně B příkladu 1) v 857 mililitrech 50procentního vodného ethanolu (3,25 mililitru roztoku obsahovalo 1 milimol aldehydu) bylo za neustálého míchání při teplotě v rozmezí od 50 do 55 °C postupně přidáno 15,5 gramu (290 milimolu, 1,1 ekvivalentu) chloridu amonného, 27,27 gramu (659 milimolu, 2,5 ekvivalentu) uhličitanu amonného a 18,9 gramu (290 milimolu, 1,1 milimolu) kyanidu draselného a míchání směsi pokračovalo při teplotě 50 °C dalších 48 hodin. Vysrážená látka byla odfiltrována, promyta 100 mililitry 50 procentního ethanolu a vysušena ve vakuovém exsikátoru.

Jako první podíl bylo takto získáno 42,26 gramu (206,97 milimolu) produktu. Z matečného louhu byl oddestilován ethanol a získaný zbytek byl extrahován 1 x 250 mililitry a 2 x 100 mililitry ethylacetátu, organické roztoky byly spojeny, promyty 3 x 50 mililitry vody, vysušeny nad bezvodým síranem sodným a odpařeny při tlaku v rozmezí od 2,0 do 2,5 kilopascalu. Získaný zbytek byl triturován diisopropyletherem, odfiltrován a usušen. V druhém podílu bylo takto získáno 3,6 gramu (17,12 milimolu) produktu, takže celkem bylo získáno

45,86 gramu (218 milimolu, 82,5 procenta) 5-cykloheptylmethylhydantoinu. Teplota tání: 240,9 °C. Rf (6) = 0,73 až 0,78.

Analýza pro CiiH₁₈N₂O₂ (210,28). Vypočteno C% = 62,83;

H% = 8,63; N% = 13,32. Nalezeno: C% = 63,09; H% = 8,67;

N% = 13,25.

Stupeň D: hydrochlorid DL-cykloheptylalaninu gramů (1,55 molu) hydroxidu draselného bylo za nestálého míchání a zahřívání rozpuštěno ve 435 mililitrech n-butanolu a ke vzniklému roztoku bylo přidáno 45,71 gramu (217,4 milimolu) 5-cykloheptylmethylhydantoinu (ze stupně C příkladu 1). Takto získaný roztok byl 72 hodin zahříván na teplotu varu, zředěn vodou a odpařen při sníženém tlaku. Získaný zbytek byl rozpuštěn v 220 mililitrech vody, vzniklý roztok byl pomocí přibližně 130 mililitrů kyseliny chlorovodíkové okyselen na pH 2 a uložen přes noc do mrazáku. Vysrážená látka byla odfiltrována, promyta 50 mililitry vody a usušena ve vakuovém exsikátoru. 106,5 gramu takto získaného produktu bylo považováno za 217 milimolu DL-cykloheptylalaninu a použito v dalších reakcích. R_f (11) = 0,2 až 0,3.

Stupeň E: hydrochlorid methylesteru DL-cykloheptylalaninu

23,65 mililitru (325,25 milimolu) SOC1₂ bylo přikapáno při teplotě v rozmezí od 0 °C do -5 °C a za neustálého míchání do 217 mililitrů methanolu. Poté bylo ke směsi přidáno 217 milimolu DL-cykloheptylalaninu (ze stupně D příkladu 1) a výsledná směs byla míchána 24 hodin. Reakce byla sledována chromatografií na tenké vrstvě (TLC) Rf (11) = 0,75 až 0,85 (ester),

0,3 až 0,4 (kyselina). Když nebylo možné v reakční směsi detekovat nezreagovanou kyselinu, byla tato ochlazena na teplotu -5 °C, ke směsi bylo přikapáno 11, 8 mililitru SOC1₂ a vzniklá směs byla míchána dalších 24 hodin. Poté byly odfiltrovány nerozpuštěné soli, které byly promyty 2 x 50 mililitry

methanolu a spojené methanolové roztoky byly odpařeny. Zbytek byl znovu rozpuštěn v methanolu a získaný roztok byl znovu odpařen. Nakonec byl získaný zbytek triturován diisopropyletherem, odfiltrován, promyt diisopropyletherem a usušen ve vakuovém exsikátoru nad KOH a P₂O₅. Bylo získáno 33,68 gramu (142,85 milimolu) hydrochloridu methylesteru DL-cykloheptylalaninu. R_f (11) = 0,5 až 0,6. Teplota tání: 95,4 až 96,5 °C.

Stupeň F: methylester acetyl-DL-cykloheptylalaninu

K roztoku 33,68 gramu (142,85 milimolu) hydrochloridu methylesteru DL-cykloheptylalaninu (ze stupně E příkladu 1) ve 140 mililitrech pyridinu bylo během jedné hodiny za neustálého míchání a chlazení reakční směsi v ledové lázni přikapáno 16,2 mililitru (171,43 milimolu) anhydridu kyseliny octové. Reakční směs byla 24 hodin míchána při teplotě místnosti a následně odpařena za sníženého tlaku. Zbytek byl rozpuštěn ve 300 mililitrech ethylacetátu, vzniklý roztok byl promyt 3 x 50 mililitry lmolárního roztoku KHSO₄ a 3 x 50 mililitry vody, vysušen nad bezvodým síranem sodným a zahuštěn při tlaku v rozmezí od 2,0 do 2,5 kilopascalu. Vzniklý olejnatý produkt byl triturován diisopropyletherem, čímž došlo k vyloučení pevné látky, jež byla odfiltrována, promyta postupně diisopropyletherem a vodou a vysušena v exsikátoru. Bylo získáno 24,36 gramu (100,94 milimolu, 70,4 procenta) methylesteru acetyl-DL-cykloheptylalaninu (označovaného také jako acetylDL-ester). R_f (1) = 0,55 až 0,65. Teplota tání 69 až 71 °C.

Analýza pro C₁₃H₂₃NO₃ (241,332). Vypočteno C% = 64,70;

H% = 9,61; N% = 5,80. Nalezeno: C% = 64,75; H% = 9,76;

N% = 5,85.

Stupeň G: methylester acetyl-D-cykloheptylalaninu (enzymatická resoluce methylesteru acetyl-DL-cykloheptylalaninu)

K roztoku 8,69 gramu (36 milimolů) methylesteru acetyl-DLcykloheptylalaninu (acetyl-DL-esteru^ (ze stupně F příkladu 1) ve 36 mililitrech toluenu bylo přidáno 72 mililitrů vody a 36 miligramů Subtilisin Carlsberg (Proteasa typu VIII, Sigma). Enzymatická hydrolýza L-enantiomeru (acetyl-L-esteru) probíhala při pH 7,0, které bylo udržováno autotitrátorem naplněným 3molárním roztokem hydroxidu sodného. Když skončilo spotřebovávání hydroxidu sodného (bylo spotřebováno 5,8 mililitru roztoku, 17,4 milimolů) byla reakční směs zředěna 36 mililitry toluenu a vzniklé dvě vrstvy byly od sebe odděleny. Vodná fáze byla promyta 2 x 30 mililitry toluenu. Spojené toluenové roztoky obsahovaly acetyl-D-ester a spojené vodné roztoky obsahovaly sodnou sůl acetyl-L-kyseliny.

Po vysušení nad bezvodým síranem sodným byly spojené toluenové roztoky odpařeny při sníženém tlaku, čímž bylo získáno 3,8 gramu (15,75 milimolů) acetyl-D-esteru, Rf (1) = 0,55 až 0,65, jenž byl přímo použit v dalším stupni.

Spojené vodné roztoky byly okyseleny a extrahovány 3 x 30 mililitry ethylacetátu. Spojené ethylacetátové extrakty byly promyty vodou, vysušeny nad bezvodým síranem sodným a odpařeny při sníženém tlaku, čímž byly získány 4,0 gramy (17,6 milimolů) acetyl-L-kyseliny. Rf (7) = 0,38 až 0,42.

Podobným postupem, při kterém se vycházelo z 9,65 gramu (40 milimolů) acetyl-DL-esteru (ze stupně F příkladu 1), bylo získáno 4,6 gramu (19,06 milimolů) acetyl-D-esteru a 4,44 gramu (19,55 milimolů) acetyl-L-kyseliny.

Stupeň H: hydrochlorid D-cykloheptylalaninu

7,24 gramu (30 milimolu) acetyl-D-esteru (ze stupně G příkladu 1) bylo suspendováno ve 120. mililitrech Smolární kyseliny chlorovodíkové a tato směs byla 3 hodiny zahřívána na teplotu varu. Volná aminokyselina byla izolována ve formě krystalů. Reakční směs byla ochlazena, uložena přes noc v mrazáku, přefiltrována a filtrační koláč byl promyt studenou vodou a etherem a následně usušen ve vakuovém exsikátoru. Bylo získáno 5,9 gramu (26,69 milimolu, 89 procent) hydrochloridu D-cykloheptylalaninu. R_f (12) = 0,10 až 0,15. [a]_D ²⁰ = -11° (c = 0,4; 1M HC1).

Analýza pro C10H19NO2. HCl (221,728). Vypočteno C% = 54,17; H% = 9,09; N% = 6,32; Cl% = 15,99. Nalezeno: C% = 9,27; H% = 9,27; N% = 6,30; Cl% = 16,2.

Stupeň I: ethoxykarbonyl-D-cykloheptylalanin

K roztoku 4,43 gramu (20 milimolu) hydrochloridu D-cykloheptylalaninu (ze stupně H příkladu 1) ve 20 mililitrech dimethylformamidu bylo přidáno 5,6 mililitru (40 milimolu) triethylaminu a 3,95 gramu (21 milimolu) (N-hydroxysukcinimidyl)ethylkarbonátu*. Po 3hodinovém míchání při teplotě místnosti byla reakční směs odpařena, získaný zbytek byl rozpuštěn ve 40 mililitrech ethylacetátu a tento roztok byl promyt 2 x 30 mililitry 1M KHSO₄ a vodou do neutrální reakce extraktu. Poté byla organická vrstva vysušena nad bezvodým síranem sodným a odpařena při tlaku v rozmezí od 2,0 do

2,5 kilopascalu. Bylo získáno 4,47 gramu (přibližně 17 milimolů) olejnatého produktu, kterým byl ethoxykarbonyl-D31 cykloheptylalanin [R_f (7) = 0,85 až 0,90] a tento produkt byl přímo použit v dalším stupni, [a]_D ²⁰ = +6,3° (c = 1, methanol).

*Příprava (N-hydroxysukcinimidyl)ethylkarbonátu

11,5 gramu (100 milimolú) N-hydroxysukcinimidu bylo rozpuštěno ve 100 mililitrech tetrahydrofuranu, roztok byl ochlazen na teplotu -10 °C a za neustálého míchání k němu bylo přidáno 15,4 mililitru (110 milimolú) triethylaminu a 10,45 mililitru (110 milimolú) ethylchlorkarbonátu. Po 2 hodinách míchání při teplotě místnosti byla reakční směs přefiltrována a získaný filtrát byl odpařen při sníženém tlaku. Získaný olejnatý zbytek po ochlazení zkrystalizoval. Tento krystalický materiál byl suspendován v petroletheru, odfiltrován a usušen ve vakuovém exsikátoru. Bylo získáno 12,78 gramu (68,3 procenta) produktu. Teplota tání: 39,4 až 39,7 °C.

Analýza pro C7H9NO5 (187,15). Vypočteno C% = 44,92;

H% = 4,85; N% = 7,48. Nalezeno: C% = 44,67; H% = 4,81;

N% = 7,27.

Stupeň J: ethoxykarbonyl-D-cykloheptylalanyl-L-prolin

K roztoku přibližně 17 milimolú ethoxykarbonyl-D-cykloheptylalaninu (ze stupně I příkladu 1) v 17 mililitrech tetrahydrofuranu (THF) bylo přidáno 3,74 gramu (20 milimolú) N-hydroxysukcinimidu, směs byla ochlazena na teplotu -10 °C a smíchána s roztokem 4,12 gramu (20 milimolú) 1,3-dicyklohexylkarbodiimidu v přibližně 20 mililitrech tetrahydrofuranu (THF). Reakční směs byla míchána přibližně 5 hodin při teplotě 22 °C a po uplynutí této doby bylo na základě chromatografie na tenké vrstvě (TLC) usouzeno, že tvorba aktivního esteru byla skončena.

K míchané reakční směsi bylo postupně přidáno 1,95 gramu (17 milimolů) L-prolinu a 2,3 mililitru (17 milimolů) triethylaminu. Reakční směs byla míchána přibližně 15 hodin při teplotě 22 °C a po uplynutí této doby bylo chromatografií na tenké vrstvě zjištěno, že byl spotřebován veškerý aktivní ester. Směs byla přefiltrována, filtrační koláč byl promyt 10 mililitry tetrahydrofuranu (THF) a filtrát byl odpařen. Získaný zbytek byl rozpuštěn ve 30 mililitrech ethylacetátu a 30 mililitrech vody. Vodná fáze byla promyta 2 x 20 mililitry ethylacetátu, okyselena 20 mililitry 1M KHSO₄ a extrahována 3 x 20 mililitry ethylacetátu. Spojené ethylacetátové roztoky byly promyty vodou do neutrální reakce extraktu, vysušeny nad bezvodým síranem sodným a odpařeny při tlaku v rozmezí od 2,0 do 2,5 kilopascalu. Získaný zbytek po trituraci diisopropyletherem zkrystalizoval. Získaná suspenze krystalů byla ochlazena v mrazáku, přefiltrována, krystaly byly promyty petroletherem a usušeny ve vakuovém exsikátoru. Bylo získáno 4,2 gramu (11,85 milimolú, 70 procent) ethoxykarbonyl-D-cykloheptanyl-L-prolinu. R_f (7) = 0,45 až 0,55.

Analýza pro C₁₈H₃oN20₄ (354,45). Vypočteno C% = 60,99;

H% = 8,53; N% = 7,90. Nalezeno: C% = 60,14; H% = 8,55;

N% = 7,38.

FAB hmotnostní spektrum (355 [M+H]⁺) potvrdilo předpokládanou strukturu.

Příklad 2

Syntéza sulfátu N-methyl-D-cykloheptylalanyl-L-prolyl-Largininaldehydu

Stupeň 1: benzyloxykarbonyl-N-methyl-D-cykloheptylalanyl-Lprolyl -N^G-benzyloxykarbonyl-L-argininlaktam

3,98 gramu (10 milimolů) terč. butyloxykarbonyl-N^Gbenzyloxykarbonyl-L-argininlaktamu (viz. publikace Bajusz a spolupracovníci, J. Med. Chem., 33, 1729 (1990)) bylo suspendováno v 10 mililitrech chloroformu a následně bylo k roztoku, který byl neustále míchán a chlazen v ledové lázni, přidáno 10 mililitrů ethylacetátu nasyceného chlorovodíkem (obsah chlorovodíku činil 0,11 až 0,15 gramu/mililitr). Odštěpování Boc skupiny bylo monitorováno chromatografií na tenké vrstvě [R_f (11) = 0,5 (volná sloučenina); 1,0 (Boc-sloučenina)]. Na konci reakce byla suspenze zředěna 20 mililitry diethyletheru, vyloučená krystalická látka byla odfiltrována, promyta 5 mililitry acetonu a 10 mililitry diethyletheru a vysušena při sníženém tlaku nad hydroxidem draselným. Vzniklý hydrochlorid N^G-benzyloxykarbonyl-L-laktamu byl rozpuštěn v 10 mililitrech dimethylformamidu, roztok byl ochlazen na teplotu -20 °C a přidán k následujícímu směsnému anhydridu.

4,32 (10 milimolů) benzyloxykarbonyl-N-methyl-D-cykloheptylalanyl-L-prolinu (ze stupně C příkladu 2) bylo rozpuštěno v 10 mililitrech dimethylformamidu, roztok byl ochlazen na teplotu -15 °C a za neustálého míchání k němu bylo postupně přidáno 1,12 mililitru (10,1 milimolů) N-methylmorfolinu a 1,33 mililitru (10,1 milimolů) isobutylchlorformiátu. Po 10 minutách míchání byl k reakční směsi nejprve přidán shora uvedený dimethylformamidový roztok N^G-benzyloxykarbonyl-Largininlaktamu a následně triethylamin, a to v množství, které postačovalo k úpravě pH reakční směsi na hodnotu 8 (bylo třeba použít přibližně 1,4 mililitru triethylaminu). Reakční směs byla 30 minut míchána při teplotě -10 °C a další 1 hodinu při teplotě 0 °C. Poté byly odfiltrovány vyloučené soli a získaný filtrát byl zředěn 100 mililitry ethylacetátu. Vzniklý roztok byl promyt 3 x 15 mililitry vody, 6 mililitry lmolárního roztoku KHSO₄ a 3 x 6 mililitry vody, vysušen nad bezvodým síranem sodným a odpařen při tlaku v rozmezí od 2,0 do 2,5 kilopascalu. Získaný produkt byl nanesen na chromatografickou kolonu naplněnou 100 gramy silikagelu (Kieselgel 60,- 0,040 až 0,063 milimetru), která byla vymývána ethylacetátem. Frakce obsahující pouze čistý produkt [Rf (1) = 0,70] byly spojeny a odpařeny při tlaku v rozmezí od 2,0 do 2,5 kilopascalu. Zbytek po odpařování byl krystalizován z diisopropyletheru.

Výtěžek 6,0 gramů (85 procent), Rf (1) = 0,65 až 0,75.

FAB hmotnostní spektrum (703 [M+H]⁺) potvrdilo předpokládanou strukturu.

Stupeň 2: benzyloxykarbonyl-N-methyl-D-cykloheptylalanyl-Lprolyl-N^G-benzyloxykarbonyl-L-argininaldehyd

5,62 gramu (8 milimolů) benzyloxykarbonyl-N-methyl-Dcykloheptylalanyl-L-prolyl-Išf-benzyloxykarbonyl-L-argininlaktamu (ze stupně 1 příkladu 2) bylo rozpuštěno v 10 mililitrech tetrahydrofuranu a k tomuto roztoku byl za neustálého míchání a při teplotě nepřesahující -50 °C přidán roztok 2,25 milimolů LiAlH₄ v tetrahydrofuranu. Postup redukce byl monitorován chromatografií na tenké vrstvě (s elucí roz35 pouštědlem 7) a v případě potřeby byl do reakční směsi přidán další podíl LiAlH₄. K reakční směsi byl za neustálého míchání a chlazení přikapáván 0,5molární roztok KHSO₄ až do dosažení pH 3 a následně byla směs zředěna 25 mililitry vody. Vzniklý roztok byl extrahován 2 x 10 mililitry hexanu a 3 x 15 mililitry dichlormethanu. Dichlormethanové extrakty byly spojeny, promyty 3 x 15 mililitry vody, 15 mililitry studeného 5procentního roztoku hydrogenuhličitanu sodného a znovu 15 mililitry vody, vysušeny nad bezvodým síranem sodným a zahuštěny při tlaku v rozmezí od 2,0 do 2,5 kilopascalu. Ke zbytku po odpařování byl přidán diisopropylether, směs byla přefiltrována a filtrační koláč byl vysušen při sníženém tlaku.

Výtěžek 4,95 gramu (88 procent), Rf (1) = 0,20 až 0,25.

FAB hmotnostní spektrum (705 [M+H]⁺, 858 [M+H+NBA]⁺) potvrdilo předpokládanou strukturu.

Stupeň 3: sulfát N-methyl-D-cykloheptylalanyl-L-prolyl-Largininaldehydu

4,6 gramu (6,5 milimolu) benzyloxykarbonyl-N-methyl-Dcykloheptylalanyl-L-prolyl-lS^-benzyloxykarbonyl-L-argínínaldehydu (ze stupně 2 příkladu 2) bylo rozpuštěno v 65 mililitrech ethanolu a k tomuto roztoku bylo postupně přidáno

13.5 mililitru 0,5molární kyseliny sírové a suspenze 0,4 gramu Pd-C katalyzátoru v 10 mililitrech vody a tato směs byla hydrogenována při teplotě přibližně 10 °C. Průběh reakce byl monitorován chromatografií na tenké vrstvě. Po skončení reakce (po asi 15 minutách) byl z reakční směsi odfiltrován katalyzátor a filtrát byl zahuštěn při tlaku v rozmezí od 2,0 do

2.5 kilopascalu na objem přibližně 5 až 7 mililitrů. Tento zbytek byl zředěn 50 mililitry vody, extrahován 4 x 10 mililitry dichlormethanu a vodná vrstva byla ponechána 24 hodin stát při teplotě od 20 do 22 °C. Roztok byl znovu extrahován 3 x 10 mililitry dichlormethanu, pomocí iontoměničové pryskyřice Dowex AG 1-X8 (HO) bylo pH směsi upraveno na hodnotu

3,5 a následně byl tento roztok lyofilizován.

Výtěžek 2,85 gramu (82 procent), Rf (9) = 0,35 až 0,45, [a]_D ²⁰ = -79,6° (c = 1; voda).

FAB hmotnostní spektrum (437 [M+H]⁺, 590 [M+H+NBA]⁺) potvrdilo předpokládanou strukturu.

Syntéza výchozích sloučenin

Benzyloxykarbonyl-N-methyl-D-cykloheptylalanyl-L-prolin

Stupeň A: syntéza N-benzyloxykarbonyl-D-cykloheptylalaninu

11,09 gramu (50 milimolu) hydrochloridu D-cykloheptylalaninu bylo smícháno při teplotě 0 °C se 40 mililitry tetrahydfrofuranu (THF) a 40 mililitry vody. Směs byla míchána a pomocí 5molárního hydroxidu sodného bylo její pH upraveno na hodnotu přibližně 10. K reakční směsi bylo přidáno 8,22 mililitru (55,4 milimolu) benzylchlorformiátu, přičemž teplota směsi byla udržována na přibližně 3 °C a zároveň bylo pomocí Smolárniho hydroxidu sodného pH směsi udržováno na hodnotě přibližně 10. Po skončení přidávání benzylchlorformiátu byla reakční směs 1 hodinu míchána při teplotě 0 °C a její pH bylo udržováno na hodnotě přibližně 10. Směs byla míchána přes noc při teplotě místnosti a byla monitorována TLC (7). V případě potřeby bylo do reakční směsi přidáno další množství (137 • ·

χ 0,75 mililitru, 5 milimolu) benzylchlorformiátu, přičemž stále byla teplota směsi byla udržována na přibližně 3 °C a zároveň bylo pomocí 5molarního hydroxidu sodného pH směsi udržováno na hodnotě přibližně 10. Následně bylo do reakční směsi přidáno 25 mililitrů terč. butylmethyletheru a tato byla za neustálého míchání ponechána ohřát na teplotu 22 °C. Vodná fáze byla oddělena a promyta druhým podílem 25 mililitrů terč. butylmethyletheru. Obsah organické fáze byl testován TLC a v případě potřeby byla organická fáze zpětně extrahována 25 mililitry vody. Vodné fáze byly smíchány s 25 mililitry ethylacetátu a pH této směsi bylo sníženo koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou na hodnotu 2. Jednotlivé fáze byly od sebe odděleny a vodná fáze byla extrahována druhým podílem 25 mililitrů ethylacetátu. Spojené organické fáze byly promyty 20 mililitry lmolárního KHSO₄ a 2 x 30 mililitry vody, vysušeny nad bezvodým síranem sodným a odpařeny při tlaku v rozmezí od 2,0 do 2,5 kilopascalu. Odparek byl rozpuštěn ve 45 mililitrech tetrahydrofuranu (THF) a tento roztok benzyloxykarbonylD-cykloheptylalaninu byl bez dalšího přečištění uchován pro použití v dalším stupni.

Stupeň B: benzyloxykarbonyl-D-cykloheptylalanyl-L-prolin

Roztok benzyloxykarbonyl-D-cykloheptylalaninu v kyselině trifluoroctové (TFA) (ze stupně A příkladu 2) byl smíchán s 5,9 gramu (51,24 milimolu) N-hydroxysukcinimidu, ochlazen na teplotu 10 °C a smíchán s roztokem 11 gramů (53,3 milimolu)

1,3-dicyklohexylkarbodiimidu v přibližně 25 mililitrech tetrahydrofuranu (THF). Směs byla míchána přibližně 4,5 hodiny při teplotě 22 °C a po uplynutí této doby byla podle chromatografie na tenké vrstvě (TLC) reakce na odpovídající aktivní ester skončena.

K míchané reakční směsi bylo postupně přidáno 5,9 gramu (51,24 milimolu) L-prolinu a 7,2 mililitru (51,24 milimolu) triethylaminu. Reakční směs byla míchána přibližně 15 hodin při teplotě 22 °C a po uplynutí této doby bylo chromatografií na tenké vrstvě (TLC) zjištěno, že byl spotřebován veškerý aktivní ester. Směs byla přefiltrována, filtrační koláč byl promyt 25 mililitry tetrahydrofuranu (THF) a filtrát byl odpařen. Získaný zbytek byl rozpuštěn v 50 mililitrech ethylacetátu a 50 mililitrech vody. Vodná fáze byla promyta 2 x 20 mililitry ethylacetátu, okyselena 20 mililitry lmolárního KHSO₄ a extrahována 3 x 40 mililitry ethylacetátu. Spojené ethylacetátové roztoky byly promyty vodou do neutrální reakce extraktu, vysušeny nad bezvodým síranem sodným a odpařeny při tlaku v rozmezí od 2,0 do 2,5 kilopascalu. Získaný zbytek, kterým byl benzyloxykarbonyl-D-cykloheptylalanyl-L-prolin, byl rozpuštěn v 60 mililitrech tetrahydrofuran (THF) a tento roztok byl bez dalšího přečištění použit v dalším stupni.

Stupeň C: benzyloxykarbonyl-N-methyl-D-cykloheptylalanyl-Lprolin

17,95 mililitru (288 milimolu) jodmethanu bylo přidáno do tetrahydrofuranového (THF) roztoku benzyloxykarbonyl-D-cykloheptylalanyl-L-prolinu (ze stupně B příkladu 2). Získaný roztok byl ochlazen na teplotu 8 °C a přenesen spolu s 20 mililitry tetrahydrofuranu (THF), který sloužil pro vypláchnutí reakční nádoby, k míchané suspenzi 4,75 gramu (119 milimolů) 60procentního hydridu sodného v 35 mililitrech tetrahydrofuranu, přičemž při této operaci byla teplota reakční směsi udržována pod 13 °C. Směs byla 24 hodin míchána při teplotě 11 °C. Přebytek hydridu sodného byl rozložen opatrným přidáním

1,6 mililitru vody k reakční směsi, přičemž teplota směsi byla udržována pod 13 °C a bylo rovněž kontrolováno pěnění směsi. Rozložená reakční směs byla míchána přibližně 20 minut při teplotě 22 °C a zahuštěna při sníženém tlaku při teplotě pod 30 °C na objem přibližně 40 mililitrů. K tomuto zbytku bylo postupně přidáno 70 mililitrů vody a 30 mililitrů terč. butylmethyletheru. Jednotlivé fáze byly od sebe odděleny a vodná fáze byla znovu promyta 30 mililitry terč. butylmethyletheru. Vodná produktová fáze byla smíchána se 40 mililitry ethylacetátu a její pH bylo pomocí 3molární kyseliny sírové upraveno na hodnotu 2,2. jednotlivé fáze byly od sebe odděleny a vodná fáze byla zpětně extrahována 40 mililitry ethylacetátu. Spojené organické fáze byly promyty 70 mililitry 5procentního roztoku thiosíranu sodného. Po oddělení fází byla organická fáze zahuštěna při sníženém tlaku (v rozmezí od 33 do 45 kilopascalů) na malý objem, přičemž teplota směsi byla udržována pod 50 °C. Získaný zbytek byl smíchán s 18,6 mililitru tetrahydrofuranu (THF) a 100 mililitry vody a přidáním cykloxexylaminu bylo pH této směsi upraveno na hodnotu 8,5. Vzniklá suspenze byla při sníženém tlaku (v rozmezí od 33 do 45 kilopascalů) a teplotě v rozmezí od 25 do 55 °C zahuštěna na objem 100 mililitrů, vytemperována na teplotu 25 °C, zředěna 71,5 mililitru vody a míchána přibližně 10,5 hodiny. Suspenze byla přefiltrována, filtrační koláč byl promyt vodou a usušen na vzduchu při teplotě 45 °C, čímž bylo získáno 16,72 gramu (63 procent, počítáno na D-cykloheptylalanin) cyklohexylaminové soli benzyloxykarbonyl-N-methyl-D-cykloheptylalanylu. R_f (8) = 0,55 až 0,65.

Příklad 3

Syntéza hemisulfátu D-cykloheptyllaktyl-L-prolyl-L-argininaldehydu

Stupeň 1: tetrahydropyranyl-D-cykloheptyllaktyl-L-prolyl-N*³benzyloxykarbonyl-L-argininlaktam

5,88 gramu (13 milimolu) terč. butyloxykarbonyl-N^Gbenzyloxykarbonyl-L-argininlaktamu (viz. publikace Bajusz a spolupracovníci, J. Med. Chem., 33, 1729 (1990)) bylo suspendováno ve 13 mililitrech chloroformu a následně bylo k roztoku, který byl neustále míchán a chlazen v ledové lázni, přidáno 13 mililitrů ethylacetátu nasyceného chlorovodíkem (obsah chlorovodíku činil 0,11 až 0,15 gramu/mililitr). Odštěpování Boc skupiny bylo monitorováno chromatografií na tenké vrstvě [Rf (11) = 0,5 (volná sloučenina); 1,0 (Bocsloučenina)]. Na konci reakce byla suspenze zředěna 25 mililitry diethyletheru, vyloučená krystalická látka byla odfiltrována, promyta 7 mililitry acetonu a 7 mililitry diethyletheru a vysušena při sníženém tlaku nad hydroxidem draselným. Vzniklý hydrochlorid N^G-benzyloxykarbonyl-Largininlaktamu byl rozpuštěn ve 13 mililitrech dimethylformamidu, roztok byl ochlazen na teplotu -20 °C a přidán k následujícímu směsnému anhydridu.

Roztok 12 milimolů triethylamoniové soli tetrahydropyranyl-D-cykloheptyllaktyl-L-prolinu ze stupně I příkladu 3 byl ochlazen na teplotu -20 °C a poté k němu bylo za neustálého míchání přidáno 1,6 mililitru (12 milimolů) isobutylchlorformiátu. Po 10 minutách míchání byl k této směsi přidán výše popsaný dimethylformamidový roztok Is^-benzyloxykarbonyl-L41

argininlaktamu a triethylamin, který byl přidán v množství dostatečném pro úpravu pH reakční směsi na hodnotu 8 (bylo třeba použít přibližně 1,8 mililitru triethylaminu). Reakční směs byla 30 minut míchána při teplotě -10 °C a další 1 hodinu při teplotě 0 °C. Poté byly odfiltrovány vyloučené soli a získaný filtrát byl zředěn 65 mililitry ethylacetátu. Vzniklý roztok byl promyt 3 x 25 mililitry vody, 7 mililitry lmolárního roztoku KHSO₄ a 3 x 7 mililitry vody, vysušen nad bezvodým síranem sodným a odpařen pří tlaku v rozmezí od 2,0 do 2,5 kilopascalu. Získaný produkt byl nanesen na chromatografickou kolonu naplněnou 130 gramy silikagelu (Kieselgel 60; 0,040 až 0,063 milimetru), která byla vymývána ethylacetátem. Frakce obsahující pouze čistý produkt [Rf (1) = 0,60] byly spojeny a odpařeny při tlaku v rozmezí od 2,0.do 2,5 kilopascalu. Zbytek po odpařování byl krystalizován z diisopropyletheru.

Výtěžek 5,0 gramů (7,8 milimolu, 64 procent), R_f (1) =

0,6.

FAB hmotnostní spektrum (640 [M+H]⁺) potvrdilo předpokládanou strukturu.

Stupeň 2: tetrahydroopyranyl-D-cykloheptyllaktyl-L-prolyl-N°benzy1oxykarbony1-L-argininaldehyd

4,8 gramu (7,51 milimolu) tetrahydropyranyl-D-cykloheptyllaktyl-L-prolyl-N^G-benzyloxykarbonyl-L-argininlaktamu (ze stupně 1 příkladu 3) bylo rozpuštěno v 15 mililitrech tetrahydrofuranu a k tomuto roztoku byl za neustálého míchání a při teplotě nepřesahující -50 °C přidán roztok 3,6 milimolu LiAlH₄ v tetrahydrofuranu. Postup redukce byl monitorován chromatografií na tenké vrstvě (s elucí rozpouštědlem 8) a v případě

-»· ···· • ♦ *1 . 'i » Μ • · «> · · · · • · · t. ·>·· · « • * «* · · » ·· · · · · · · · potřeby byl do reakční směsi přidán další podíl LiAlH₄. K reakční směsi byl za neustálého míchání a chlazení přikapáván 0,5molární roztok kyseliny sírové až do dosažení pH 3 a následně byla směs zředěna 35 mililitry vody. Vzniklý roztok byl extrahován 2 x 15 mililitry hexanu a 3 x 20 mililitry dichlormethanu. Dichlormethanové extrakty byly spojeny, promyty 3 x 15 mililitry vody, 15 mililitry studeného 5procentního roztoku hydrogenuhličitanu sodného a znovu 15 mililitry vody, vysušeny nad bezvodým síranem sodným a zahuštěny při tlaku v rozmezí od 2,0 do 2,5 kilopascalu. Ke zbytku po odpařování byl přidán diisopropylether, směs byla přefiltrována a filtrační koláč byl vysušen při sníženém tlaku.

Výtěžek 3,9 gramu (6,07 milimolu, 81 procent), Rf (8) = 0,40. [a]_D ²⁰ = +16,2° (c = 1; tetrahydrofuran).

FAB hmotnostní spektrum (642 [M+H]⁺, 795 [M+H+NBA]⁺) potvrdilo předpokládanou strukturu.

Stupeň 3: hemisulfát D-cykloheptyllaktyl-L-prolyl-L-argininaldehydu

3,21 gramu (5,0 milimolů) tetrahydropyranyl-D-cykloheptyllaktyl-L-prolyl-N^G-benzyloxykarbonyl-L-argininaldehydu (ze stupně 2 příkladu 3) bylo rozpuštěno ve 40 mililitrech ethanolu a k tomuto roztoku bylo postupně přidáno 5 mililitrů 0,5molární kyseliny sírové a suspenze 0,3 gramu Pd-C katalyzátoru v 6 mililitrech vody a tato směs byla hydrogenována při teplotě přibližně 10 °C. Průběh reakce byl monitorován chromatografii na tenké vrstvě. Po skončení reakce (po asi 15 minutách) byl z reakční směsi odfiltrován katalyzátor a filtrát byl zahuštěn při tlaku v rozmezí od 2,0 do 2,5 kilopascalu na objem přibližně 4 až 6 mililitrů. Tento zbytek byl zředěn 40 mililitry vody, extrahován 4 x 7 mililitry dichlormethanu a vodná vrstva byla ponechána 24 hodin stát při teplotě od 20 do 22 °C.

Roztok byl znovu extrahován 3 x 15 mililitry dichlormethanu, pomocí iontoměničové pryskyřice Dowex AG 1-X8 (HO) bylo pH směsi upraveno na hodnotu 3,5 a následně byl tento roztok lyofilizován.

Výtěžek 1,65 gramu (3,5 milimolu, 70 procent), [a]_D ²⁰ = -94,7° (c = 1; voda).

HPLC: k' = 2,702 a 3,010.

FAB hmotnostní spektrum (424 [M+H]⁺, 577 [M+H+NBA]⁺) potvrdilo předpokládanou strukturu.

Syntéza výchozích sloučenin

Trietylamoniová sůl tetrahyropyranyl-L-cykloheptyllaktyl-Lprolinu

Stupeň A: methylster chloracetyl-DL-cykloheptylalaninu

K roztoku 15,2 gramu (65 milimolu) hydrochloridu methylesteru DL-cykloheptylalaninu (ze stupně E příkladu 1) v 65 mililitrech dichlormethanu bylo postupně přidáno 9,1 mililitru (65 milimolů) triethylaminu a 14,9 gramu (78 milimolů) (N-hydroxysukcinimidyl)chloracetátu*. Po 3 hodinách míchání při teplotě místnosti byla reakční směs zředěna 65 mililitry dichlormethanu a postupně promyta 3 x 30 mililitry vody, lmolárním KHSO₄, vodou, 5procentním NaHCO₃ a nakonec vodou do

neutrální reakce extraktu. Poté byla organická vrstva vysušena nad bezvodým síranem sodným a odpařena při tlaku v rozmezí od 2,0 do 2,5 kilopascalu. Získaný olejnatý produkt byl triturován petroletherem. Vyloučená pevná 'látka byla odfiltrována, promyta petroletherem a vysušena ve vakuovém exsikátoru. Bylo získáno 17,54 gramu (63,6 milimolů, přibližně 98 procent) methylesteru chloracetyl-DL-cykloheptylalaninu, který byl přímo použit v další reakci. Rf (7) = 0,73 až 0,83. teplota tání: 78 až 80 °C.

Analýza pro C13H22NO3CI (275,777). Vypočteno C% = 56,62;

H% = 8,04; N% = 5,08; Cl% = 12,86. Nalezeno: C% = 55,65; H% = 7,93; N% = 5,06; Cl% = 12,72.

*Příprava (N-hydroxysukcinimidyl)chloracetátu mililitrů (450 milimolů) chloracetylchloridu bylo přidáno k 23 gramům (200 milimolů) N-hydroxysukcinimidu a tato směs byla 10 minut zahřívána na teplotu varu a následně nalita na rozdrcený led, přefiltrována, filtrační koláč byl promyt studenou vodou a vysušen ve vakuovém exsikátoru.

Výtěžek 20,23 gramu (105,9 milimolů, 53 procent), teplota tání: 113,3 až 113,7 °C

Analýza pro C₆H₆NO₄C1 C₇H₉NO₅ (191,55). Vypočteno C% = 37,62; H% = 3,16; N% = 7,31; Cl% = 18,51. Nalezeno: C% =

37,37; H% = 3,16; N% = 7,23; Cl% = 18,35.

Stupeň B: methylester chloracetyl-D-cykloheptylalaninu (enzymatická resoluce methylesteru chloracetyl-DL-cykloheptylalaninu)

K roztoku 8,71 gramu (31,6 mil-imolu) methylesteru chloracetyl-DL-cykloheptylalaninu (DL-esteru) (ze stupně A příkladu 3) ve 30 mililitrech toluenu bylo přidáno 70 mililitrů vody a 50 miligramů Subtilisin Carlsberg (Proteasa typu VIII, Sigma). Enzymatická hydrolýza L-enantiomeru (L-esteru) probíhala při pH 7,0, které bylo udržováno autotitrátorem naplněným 3molárním roztokem hydroxidu sodného.

Když skončilo spotřebovávání hydroxidu sodného (bylo spotřebováno 5,522 mililitru roztoku, 16,57 milimolu) byla reakční směs zředěna 30 mililitry toluenu a vzniklé dvě vrstvy byly od sebe odděleny. Vodná fáze byla promyta 2 x 20 mililitry toluenu. Spojené toluenové roztoky obsahovaly D-ester a spojené vodné roztoky obsahovaly sodnou sůl L-kyseliny.

Po vysušení nad bezvodým síranem sodným byly spojené toluenové roztoky odpařeny při sníženém tlaku, čímž bylo získáno 4,18 gramu (15,16 milimolu) D-esteru, Rf (7) = 0,73 až 0,83, jenž byl přímo použit pro přípravu D-cykloheptylalaninu.

Spojené vodné roztoky byly okyseleny a extrahovány 3 x 30 mililitry ethylacetátu. Spojené ethylacetátové extrakty byly promyty vodou, vysušeny nad bezvodým síranem sodným a odpařeny při sníženém tlaku, čímž byly získány 3,46 gramu (13,22 milimolu) L-kyseliny. Rf (7) = 0,45 až 0,50, která byla přímo použita pro přípravu L-cykloheptylalaninu.

Podobným postupem, při kterém se vycházelo z 8,25 gramu (30 milimolu) DL-esteru (ze stupně A příkladu 2), bylo získáno ·«·« ·· · · · · ·· ·

·· ·· ·· ··· ··

4,08 gramu (14,79 milimolu) D-esteru a 3,23 gramu (12,34 milimolu) L-kyseliny.

Stupeň C: hydrochlorid D-cykloheptylalaninu

8,27 gramu (30 milimolů) D-esteru (ze stupně B příkladu 2) bylo suspendováno ve 120 mililitrech 6molární kyseliny chlorovodíkové a tato směs byla 3 hodiny zahřívána na teplotu varu. Volná aminokyselina byla izolována ve formě krystalů. Reakční směs byla ochlazena, uložena přes noc v mrazáku, přefiltrována a filtrační koláč byl promyt studenou vodou a etherem a následně usušen ve vakuovém exsikátoru. Bylo získáno 5,9 gramu (26,69 milimolu, 89 procent) hydrochloridu D-cykloheptylalaninu. R_f (12) = 0,10 až 0,15. [a]_D ²⁰ = -11° (c = 0,4;

1M HCI).

Analýza pro Ci₀Hi₉NO₂ .HCl (221,728). Vypočteno C% = 54,17; H% = 9,09; N% = 6,32; Cl% = 15,99. Nalezeno: C% = 9,27; H% = 9,27; N% = 6,30; Cl% = 16,2.

Stupeň D: dicyklohexylamoniová sůl kyseliny D-cykloheptylmléčné

5,78 gramu (26,15 milimolu) hydrochloridu D-cykloheptylalaninu (ze stupně C příkladu 3) bylo rozpuštěno ve 26 mililitrech vody, získaný roztok byl zředěn 105 mililitry a 52,5 mililitru ledové kyseliny octové a tato směs byla ochlazena na teplotu 5 °C. Ke směsi byl za neustálého míchání a chlazení přikapán roztok 18,0 gramů (261 milimolů) dusitanu sodného ve 30 mililitrech vody. Reakční směs byla hodinu míchána při teplotě 5 °C a dále přes noc při teplotě místnosti. Druhý den byla reakční směs za neustálého míchání okyselena 25 mililitry koncentrované kyseliny chlorovodíkové.

Poté byla reakční směs odpařena při teplotě 50 °C a sníženém tlaku do sucha. Získaný zbytek byl rozpuštěn ve 100 mililitrech vody a odpařen za podobných podmínek. Zbytek byl triturován toluenem a znovu odpařen. Konečný zbytek byl rozpuštěn v 50 mililitrech ethylacetátu a 50 mililitrech vody. Vodná fáze byla promyta ethylacetátem a spojené ethylacetátové roztoky byly promyty vodou do neutrální reakce extraktu, vysušeny nad bezvodým síranem sodným a odpařeny při sníženém tlaku. Takto získaná pevná látka byla rozpuštěna ve 20 mililitrech diisopropyletheru. Ke vzniklému roztoku bylo přidáno 5 mililitrů (25 milimolů) dicyklohexylaminu, přičemž došlo k vyloučení krystalické soli. Po ochlazení směsi byly krystaly odfiltrovány, promyty studeným etherem a usušeny ve vakuovém exsikátoru, čímž bylo získáno 5,5 gramu (14,96 milimolu, 57,2 procenta) dicyklohexylaminové soli kyseliny D-cykloheptylmléčné, neboli D-cHla.DCHA. R_f (7) = 0,53 až 0,60. [a] _D ²⁰ = +19,5° (c = 1; methanol). Teplota tání: 147 až 150 °C.

Analýza pro C₁₀H₁₈O₃ (C22H41NO3) . Vypočteno C% = 71,89;

H% = 11,24; N% = 3,81. Nalezeno: C% =71,57; H% = 11,34; N% = 3,83.

Konverzí 0,35 gramu (1 milimol) D-cHla.DCHA na volnou α-hydroxykyselinu bylo získáno 0,15 gramu (0,8 milimolu) D-cHla, [a]_D ²⁰ = +10,1° (c = 1; methanol); teplota tání 125 až 127 °C.

Analýza pro Ci₀Hi₈O₃ (186,252). Vypočteno C% = 64,48;

H% = 9,74. Nalezeno: C% = 64,54; H% = 9,86.

« · · · ·

Stupeň E: benzylester kyseliny D-cykloheptylmléčné

K roztoku 11,21 gramu (30,5 milimolů) dicyklohexylamoniové soli kyseliny D-cykloheptylmléčné (ze stupně D příkladu 3) ve 30 mililitrech dimethylformamidu bylo přidáno 3,57 mililitru (30 milimolů) benzylbromidu. Směs byla míchána 24 hodin při teplotě místnosti a následně přefiltrována a odpařena při tlaku v rozmezí od 2,0 do 2,5 kilopascalu. Získaný zbytek byl rozpuštěn ve 20 mililitrech 0,5molárního roztoku hydrogenuhličitanu draselného a 60 mililitrech etheru. Organická fáze byla postupně promyta 20 mililitry vody, 0,5molárním roztokem KHSO₄ a vodou, vysušena nad bezvodým síranem sodným a odpařena při sníženém tlaku. Bylo získáno 8,3 gramu (přibližně 30 milimolů) benzylesteru kyseliny D-cykloheptylmléčné ve formě olejnatého zbytku [Rf (3) = 0,2 až 0,3], který byl přímo použit ve stupni F.

Stupeň F: Benzylester kyseliny tetrahydropyranyl-D-cykloheptylmléčné

K roztoku 8,29 gramu (30 milimolů) benzylesteru kyseliny D-cykloheptylmléčné (ze stupně E příkladu.3) ve 30 mililitrech dichlormethanu bylo přidáno 3,01 mililitru (33 milimolů)

3,4-dihydro-2H-pyranu a 0,3 mililitru přibližně 3molárního roztoku chlorovodíku v ethylacetátu a vzniklá směs byla ponechána 16 hodin stát při teplotě místnosti. Poté byla reakční směs zředěna 40 mililitry dichlormethanu, promyta 3 x 20 mililitry vody, vysušena nad bezvodým síranem sodným a odpařena při tlaku v rozmezí od 2,0 do 2,5 kilopascalu. Získaný zbytek byl nanesen na chromatografickou kolonu naplněnou 200 gramy silikagelu (Kieselgel 60; 0,040 až 0,063 milimetru), která byla vymývána směsí cyklohexan/ethylacetát (85:15). Frakce obsahující pouze čistý produkt [R_f (4) = 0,60 až 0,70] byly ·· ·«·· ·· · • ··· ···· spojeny a odpařeny při tlaku v rozmezí od 2,0 do 2,5 kilopascalu. Bylo získáno 7,9 gramu (21,9 milimolú, 73 procent) benzylesteru kyseliny tetrahydropyranyl-D-cykloheptylmléčné ve formě olejnatého zbytku, který byl přímo použit v dalším stupni.

Stupeň G: triethylamoniová sůl kyseliny tetrahydropyranyl-Dcykloheptylmléčné

7,21 gramu (20 milimolů) benzylesteru kyseliny tetrahydropyranyl-D-cykloheptylmléčné (ze stupně F příkladu 3) bylo rozpuštěno ve 20 mililitrech dimethylformamidu, k tomuto roztoku bylo přidáno 2,8 mililitru (20 milimolů) triethylaminu a tato směs byla hydrogenována v přítomnosti 0,1 gramu Pd/C katalyzátoru. Průběh reakce byl monitorován chromatografií na tenké vrstvě [Rf (1) = 0,30 (ester), 0,00 (kyselina)]. Po skončení reakce byl ze směsi odfiltrován katalyzátor, který byl na filtru promyt 2x5 mililitry dimethylformamidu. Filtrát a promývací roztoky byly spojeny a výsledný roztok byl použit v dalším stupni, přičemž bylo předpokládáno, že tento roztok obsahuje 20 milimolů triethylamoniové soli kyseliny tetrahydropyranyl-D-cykloheptylmléčné.

Stupeň H: benzylester tetrahydropyranyl-D-cykloheptyllaktyl-Lprolinu

Roztok 20 milimolů triethylamoniové soli kyseliny tetrahydropyranyl-D-cykloheptylmléčné ze stupně G příkladu 3 byl ochlazen na teplotu +5 °C a za neustálého míchání k němu bylo postupně přidáno 2,7 gramu (20 milimolů) 1-hydroxybenzotriazolu, 4,83 gramu (20 milimolů) hydrochloridů benzylesteru L-prolinu a 4,12 gramu (20 milimolů) dicyklohexylkarbodiimidu. Reakční směs byla přes noc ponechána míchat při teplotě míst50 • · ···· · · · * ··· · ··« ···· nosti a následně přefiltrována a odpařena při tlaku v rozmezí od 2,0 do 2,5 kilopascalu. Získaný zbytek byl rozpuštěn v 50 mililitrech ethylacetátu a tento roztok byl promyt 20 mililitry vody a 5procentním roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vysušen nad bezvodým síranem sodným a odpařen při sníženém tlaku. Získaný zbytek byl nanesen na chromatografickou kolonu naplněnou 200 gramy silikagelu (Kieselgel 60; 0,040 až 0,063 milimetru), která byla vymývána směsí n-hexan/ethy1acetát (1:1). Frakce obsahující pouze čistý produkt [Rf (3) = 0,3 až 0,4] byly spojeny a odpařeny při tlaku v rozmezí od 2,0 do 2,5 kilopascalu. Bylo získáno 5,95 gramu (13 milimolú, procent) benzylesteru tetrahydropyranyl-D-cykloheptyllaktyl-L-prolinu ve formě olejnatého zbytku, který byl přímo použit v dalším stupni.

Stupeň I: triethylamoniová sůl tetrahydropyranyl-D-cykloheptyllaktyl-L-prolinu

5,5 gramu (12 milimolú) benzylesteru tetrahydropyranyl-Dcykloheptyllaktyl-L-prolinu (ze stupně H příkladu 3) bylo rozpuštěno ve 12 mililitrech dimethylformamidu, k tomuto roztoku bylo přidáno 1,68 mililitru (12 milimolú) triethylaminu a tato směs byla hydrogenována v přítomnosti 0,1 gramu Pd/C katalyzátoru. Průběh reakce byl monitorován chromatografií na tenké vrstvě [R_f (1) = 0,30 (ester), 0,00 (kyselina)] . Po skončení reakce byl ze směsi odfiltrován katalyzátor, který byl na filtru promyt 2x2 mililitry dimethylformamidu. Filtrát a promývací roztoky byly spojeny a výsledný roztok byl použit při reakci, přičemž bylo předpokládáno, že tento roztok obsahuje 12 milimolú triethylamoniové soli tetrahydropyranyl-D-cykloheptyllaktyl-L-prolinu.

Přiklad 4

Syntéza hemisulfátu N-methyl-D-cyklohexylglycyl-L-azetidin-2karbonyl-L-argininaldehydu

Stupeň 1: benzyloxykarbonyl-N-methyl-D-cyklohexylglycyl-Lazetidin-2-karbonyl-N^G-benzyloxykarbonyl-L-argininlaktam

1,97 gramu (5 milimolů) terč. butyloxykarbonyl-N⁰benzyloxykarbonyl-L-argininlaktamu (viz. publikace Bajusz a spolupracovníci, J. Med. Chem., 33, 1729 (1990)) bylo suspendováno v 5 mililitrech chloroformu a následně bylo k roztoku, který byl neustále míchán a chlazen v ledové lázni, přidáno 5 mililitrů ethylacetátu nasyceného chlorovodíkem (obsah chlorovodíku činil 0,11 až 0,15 gramu/mililitr). Odštěpování Boc skupiny bylo monitorováno chromatografií na tenké vrstvě [Rf (11) = 0,5 (volná sloučenina); 1,0 (Bocsloučenina)]. Na konci reakce byla suspenze zředěna 10 mililitry diethyletheru, vyloučená krystalická látka byla odfiltrována, promyta 3 mililitry acetonu a 3 mililitry diethyletheru a vysušena při sníženém -tlaku nad hydroxidem draselným. Vzniklý hydrochlorid is^-benzyloxykarbonyl-Largininlaktamu byl rozpuštěn v 5 mililitrech dimethylformamidu, roztok byl ochlazen na teplotu

-20 °C a přidán k následujícímu směsnému anhydridu.

1,95 gramu (5 milimolů) kyseliny benzyloxykarbonyl-Nmethyl-D-cyklohexylglycyl-L-azetidin-2-karboxylové (ze stupně B příkladu 4) bylo rozpuštěno v 5 mililitrech dimethylformamidu, roztok byl ochlazen na teplotu -15 °C a poté k němu bylo za neustálého míchání přidáno 0,56 mililitru (5,05 milimolů) N-methylmorfolinu a 0,665 mililitru (5,05 milimolů) isobutylchlorformiátu. Po 10 minutách míchání byl k této směsi přidán výše popsaný dimethyl formami dový roztok Is^-benzyloxykarbonyl-L-argininlaktamu a triethylamin, který byl přidán v množství dostatečném pro úpravu pH -reakční směsi na hodnotu 8 (bylo třeba použít přibližně 0,7 mililitru triethylaminu). Reakční směs byla 30 minut míchána při teplotě -10 °C a další 1 hodinu při teplotě 0 °C. Poté byly odfiltrovány vyloučené soli a získaný filtrát byl zředěn 50 mililitry ethylacetátu. Vzniklý roztok byl promyt 3x7 mililitry vody, 3 mililitry lmolárního roztoku KHSO₄ a 3 x 3 mililitry vody, vysušen nad bezvodým síranem sodným a odpařen při tlaku v rozmezí od 2,0 do 2,5 kilopascalu. Získaný produkt byl nanesen na chromatograf ickou kolonu naplněnou 50 gramy silikagelu (Kieselgel 60; 0,040 až 0,063 milimetru), která byla vymývána ethylacetátem. Frakce obsahující pouze čistý produkt [Rf (1) = 0,70] byly spojeny a odpařeny při tlaku v rozmezí od 2,0 do 2,5 kilopascalu. Zbytek po odpařování byl krystalizován z diisopropyletheru.

Výtěžek 2,35 gramů (71 procent), R_f (1) = 0,45 až 0,55.

FAB hmotnostní spektrum (661 [M+H]⁺) potvrdilo předpokládanou strukturu.

Stupeň 2: benzyloxykarbonyl-N-methyl-D-cyklohexylglycyl-Lazetidin-2 -karbonyl-lSÚ-benzyloxykarbonyl-L-argininaldehyd

2,15 gramu (3,25 milimolu) benzyloxykarbonyl-N-methyl-Dcyklohexylglycyl -L-azetidin-2-karbonyl-N^G-benzyloxykarbonyl-Largininlaktamu (ze stupně 1 příkladu 4) bylo rozpuštěno v 5 mililitrech tetrahydrofuranu a k tomuto roztoku byl za neustálého míchání a při teplotě nepřesahující -50 °C přidán • ♦ · · • · roztok 2,25 milimolu LiAlH₄ v tetrahydrofuranu. Postup redukce byl monitorován chromatografií na tenké vrstvě (s elucí rozpouštědlem 7) a v případě potřeby byl do reakční směsi přidán další podíl LiAlH₄. K reakční směsi byl za neustálého míchání a chlazení přikapáván 0,5molární roztok KHSO₄ až do dosažení pH 3 a následně byla směs zředěna 13 mililitry vody. Vzniklý roztok byl extrahován 2x5 mililitry hexanu a 3x7 mililitry dichlormethanu. Dichlormethanové extrakty byly spojeny, promyty 3x7 mililitry vody, 7 mililitry studeného 5procentního roztoku hydrogenuhličitanu sodného a znovu 7 mililitry vody, vysušeny nad bezvodým síranem sodným a zahuštěny při tlaku v rozmezí od 2,0 do 2,5 kilopascalu. Ke zbytku po odpařování byl přidán diisopropylether, směs byla přefiltrována a filtrační koláč byl vysušen při sníženém tlaku.

Výtěžek 1,6 gramu (74 procent), R_f (7) = 0,33 až 0,43.

FAB hmotnostní spektrum (663 [M+H]⁺) potvrdilo předpokládanou strukturu.

Stupeň 3: sulfát N-methyl-D-cyklohexylglycyl-L-azetidin-2karbonyl-L-argininaldehydu

1,53 gramu (2,3 milimolu) benzyloxykarbonyl-N-methyl-Dcyklohexylglycyl-L-azetidin-2 -karbonyl-N^G-benzyloxykarbonyl-Largininaldehydu (ze stupně 2 příkladu 4) bylo rozpuštěno ve 23 mililitrech ethanolu a k tomuto roztoku bylo postupně přidáno 4,8 mililitru 0,5molární kyseliny sírové a suspenze 0,15 gramu Pd-C katalyzátoru v 3,5 mililitru vody a tato směs byla hydrogenována při teplotě přibližně 10 °C. Průběh reakce byl monitorován chromatografií na tenké vrstvě. Po skončení reakce (po asi 15 minutách) byl z reakční směsi odfiltrován

A * A · AA A A A A AA A

A A A A AAA • A AAA· A ··· katalyzátor a filtrát byl zahuštěn při tlaku v rozmezí od 2,0 do 2,5 kilopascalu na objem přibližně 2 až 3 mililitry. Tento zbytek byl zředěn 20 mililitry vody, extrahován 4x7 mililitry dichlormethanu a vodná vrstva' byla ponechána 24 hodin stát při teplotě od 20 do 22 °C. Roztok byl znovu extrahován 3x4 mililitry dichlormethanu, pomocí iontoměničové pryskyřice Dowex AG 1-X8 (HO) bylo pH směsi upraveno na hodnotu 3,5 a následně byl tento roztok lyofilizován.

Výtěžek 1,02 gramu (90 procent), Rf (12) = 0,40.

FAB hmotnostní spektrum (395 [M+H]⁺, 548 [M+H+NBA]⁺) potvrdilo předpokládanou strukturu.

Syntéza výchozích sloučenin

Kyselina benzyloxykarbonyl-N-methyl-D-cyklohexylglycyl-Lazetidin-2-karboxylové

Stupeň A: syntéza 2,4,5-trichlorfenylesteru benzyloxykarbonylD-cyklohexylglycinu

K míchané suspenzi 5,42 gramu (20 milimolů) trifluoracetátové soli D-cyklohexylglycinu a 5,6 mililitru (40 milimolů) triethylaminu v 50 mililitrech dimethylformamidu bylo přidáno 8,8 gramu (22 milimolů) benzylpentachlorfenylkarbonátu (viz. publikace Anteunis a spolupracovníci, Bul. Soc. Chim. Belg.,

96, ΊΊ5 (1987)) a 6,16 mililitru (44 milimolů) triethylaminu.

Po 3 hodinách míchání byla reakční směs odpařena při sníženém tlaku a získaný zbytek byl rozpuštěn v 60 mililitrech diethyletheru a 60 mililitrech vody. Jednotlivé fáze byly od sebe odděleny, organická fáze byla promyta vodou a spojené vodné fáze byly promyty diethyletherem, okyseleny Imolárním roztokem KHSO₄ na pH 3 a extrahovány 3 x 30 mililitry ethylacetátu. Organická fáze byla promyta vodou do neutrální reakce extraktu, vysušena nad bezvodým síranem sodným a odpařena při tlaku v rozmezí od 2,0 do 2,5 kilopascalu.

Získaným odparkem byl benzyloxykarbonyl-D-cyklohexylglycin, který byl rozpuštěn ve 20 mililitrech tetrahydrofuranu a tento roztok byl smíchán s 4,54 gramu (22 milimolů) 2,4,5-trichlorfenolu a 4,54 gramu (22 milimolů) dicyklohexylkarbodiimidu. Po 3 hodinách byla reakční směs přefiltrována, získaný filtrát byl spojen s promývacími roztoky a odpařen při sníženém tlaku. Získaný pevný zbytek byl přečištěn chromatografií na sloupci 140 gramů Kieselgelu 60 (0,040 až 0,063 milimetru) s elucí směsí chloroform/aceton (95:5). Frakce obsahující pouze čistý produkt [Rf (5) = 0,7 až 0,8] byly spojeny a odpařeny při tlaku v rozmezí od 2,0 do 2,5 kilopascalu. Získaný olejnatý zbytek byl triturován diethyletherem, přefiltrován, filtrační koláč byl promyt diethyletherem a usušen. Bylo získáno 8,34 gramu (88,5 procenta) čistého 2,4,5-trichlorfenylesteru benzyloxykarbonyl-D-cyklohexylglycinu.

Stupeň B: syntéza kyseliny benzyloxykarbonyl-N-methyl-Dcyklohexylglycyl-L-azetidin-2-karboxylové

1,01 gramu (10 milimolů) kyseliny L-azetidin-2-karboxylové a 1,4 mililitru (10 milimolů) triethyláminu bylo přidáno k roztoku 5,18 gramu (11 milimolů) 2,4,5-trichlorfenylesteru benzyloxykarbonyl-D-cyklohexylglycinu (ze stupně A příkladu 4) v 10 mililitrech pyridinu. Směs byla míchána přes noc a následně odpařena při sníženém tlaku a získaný zbytek byl rozředěn v 50 mililitrech 5procentního roztoku • » · « · ·· ·*·· ·· ♦ ·· · · · β ··· • · · · · φ · · · » hydrogenuhličitanu sodného a 50 mililitrech diethyletheru. Organická fáze byla promyta vodou a spojené vodné fáze byly promyty diethyletherem, okyseleny lmolárním KHSO₄ na pH 3 a extrahovány 3 x 50 mililitry ethylacetátu. Ethylacetátové extrakty byly spojeny, promyty vodou do neutrální reakce extraktu, vysušeny nad bezvodým síranem sodným a odpařeny při tlaku v rozmezí od 2,0 do 2,5 kilopascalu.

Získaným odparkem byla kyselina benzyloxykarbonyl-Dcyklohexylglycyl-L-azetidin-2-karboxylová, která byla rozpuštěna v 10 mililitrech tetrahydrofuranu a tento roztok byl smíchán s 5,0 mililitry (80 milimolů) methyljodidu a ochlazen na teplotu 0 °C. K tomuto roztoku bylo přidáno 1,2 gramu (30 milimolů) 60procentního hydridu sodného a reakční směs byla míchána přes noc při teplotě místnosti. Přebytek hydridu sodného byl rozložen opatrným přidáním 0,4 mililitru vody k reakční směsi. Rozložená reakční směs byla zahuštěna při sníženém tlaku při teplotě pod 30 °C na objem přibližně 10 mililitrů. Uvedený zbytek byl zředěn 15 mililitry vody a 10 mililitry terč. butylmethyletheru. Jednotlivé.fáze byly od sebe odděleny a vodná fáze byla znovu promyta 10 mililitry terč. butylmethyletheru. Vodná produktová fáze byla smíchána se 15 mililitry ethylacetátu a její pH bylo pomocí 3molární kyseliny sírové upraveno na hodnotu 2,2. Jednotlivé fáze byly od sebe odděleny a vodná fáze byla zpětně extrahována 10 mililitry ethylacetátu. Spojené organické fáze byly promyty 15 mililitry 5procentního roztoku thiosíranu sodného. Po oddělení fází byla organická fáze odpařena při sníženém tlaku, přičemž teplota směsi byla udržována pod 40 °C. Bylo získáno 3,75 gramu (9,65 milimolů, R_f (7) = 0,85 až 0,95) kyseliny benzyloxykarbonyl -N-methyl -D-cyklohexylglycyl -L-azetidin-2 -karboxylové

ve formě olejnatého zbytku, který byl rozpuštěn v 9,65 mililitru tetrahydrofuranu a uchován pro použití ve stupni 1 příkladu 4.

Příklad 5

Inhibice sráženi krve peptidylarginaly

Inhibiční účinek sloučenin podle tohoto vynálezu na koagulaci plazmy byl hodnocen při testu měření trombinového času (TT), testu měření aktivovaného parciálního tromboplastinového času (APTT) a testu měření protrombínového času (PT), při kterých se jako substrát používala citrátovaná lidská plazma (viz. publikace Bagdy, D. a spolupracovníci, Thromb. Haemostas., 67, 325 (1992)). Při testu TT se měří inhibice jediného stupně, a to koagulace fibrinogenu při účinku exogenního trombinu (o konečné koncentraci 2,5 NIH U/ml). Srážení plazmy při testu APTT a při testu PT byla vyvolána rekalcifikaci. Vytvořený endogenní trombin může být teoreticky přítomen v konečné koncentraci až 50 NIH U/ml (APTT, PT). Tyto testy detekují celý souhrn inhibičních účinků na tvorbu fibrinu a vznik trombinu, přičemž tento proces zahrnuje několik proteolytických reakcí zprostředkovaných buď trombinem nebo jinými enzymy, jako je například faktor Xa (fXa). Protisrážecí účinek je vyjádřen hodnotou CT₂, což je koncentrace (v nanomolech) dané látky potřebná pro zdvojnásobení doby srážení .

Tabulka 1

Inhibiční účinky sloučenin obecného vzorce (I) podle tohoto vynálezu (1 až 4), základní sloučeniny, kterou byl efegatran (C), a dalších příbuzných peptidylarginalů (Cl, C2) na koagulaci plazmy (sloupec A), na trombin vázaný k trombu a faktor Xa (sloupec B) a fibrinolytické enzymy (sloupec C)

	Peptidyl- arginaly: Xaa-Xbb-Arg-Ha	A CT2 (nM)b	B	C LAS0, pMc
ic50	(nM)
Číslo	Xaa-Xbb	TT	APTT	PT	Trombin	Faktor Xa	PL	tPA	UK
1	Eoc-D-cHpa-Pro	147	331	1839	103	118	18	10	14
2	N-Me-D-cHpa-Pro	118	315	876	93	102	16	14	18
3	D-cHla-Pro	86	281	1082	95	117	21	10	85
4	N-Me-D-Chg-Aze	101	677	2921	245	457	32	12	16
C	D-MePhe-Pro	87	622	2915	375	1000	54	132	82
Cl	D-cHga-Pro	120	333	1254	524	200	83	74	120
C2	Eoc-D-Cba-Pro	114	349	1148	390	702	27	27	120

^a Zkratky: Eoc = ethoxykarbonyl; cHpa = cykloheptylalanyl; cHla = cykloheptyllaktyl; MePhe = N-methylfenylalanyl; cHga = cykloheptylglykolyl; Chg = cyklohexylglycyl.

^b CT2 = koncentrace potřebná pro zdvojnásobení doby srážení při testu měření TT (trombinového času), APTT (aktivovaného parciálního tromboplastinového času) a PT (protrombinového času). ^c LA50 = koncentrace potřebná pro zmenšení lyžované oblasti na 50 % srovnávací hodnoty při testu měření fibrinového plátu;

PL = plasmin, tPA = tkáňový aktivátor plasminogenu; UK = urokinasa.

Některé z uvedených sloučenin vykazovaly lepší schopnost prodloužit dobu srážení než efegatran (který byl označen jako sloučenina C, neboli základní peptidový arginal, jenž má následující strukturu: D-MePhe-Pro-Arg-H) (viz. údaje v tabulce 1). Ve sloupci A tabulky 1 jsou uvedeny údaje týkající se antikoagulačního účinku sloučenin obecného vzorce (I) podle tohoto vynálezu (1 až 4) ve srovnání s antikoagulačním účinkem efegatranu (C), což je známé antikoagulační činidlo (viz. publikace Bajusz, S. a spolupracovníci, J. Med. Chem., 33,

1729 (1990) ; patent Spojených států amerických číslo

US 4,703,036 (1982); publikace Bagdy, D. a spolupracovníci, Thromb. Haemostas., 67, 357 a 68, 125 (1992); Jackson, C. V. a spolupracovníci, Clin. Appl. Thrombosis/Hemostasis, 2, 258 (1996)), a v porovnání s dalšími příbuznými peptidylarginaly (např. Cl a C2) (viz. publikace Bajusz, S. a spolupracovníci, Bioorg. & Med. Chem., 3, 1079 (1995); patent Spojených států amerických číslo US 6,121,241 (2000); zveřejněná mezinárodní přihláška číslo WO 97/46576). Z výsledků testu měření TT je patrné, že nové analogy podle předmětného vynálezu jsou při inhibici reakce trombin-fibrinogen téměř stejně účinné jako efegatran. Na druhé straně je z testu měření APTT patrné, že nové peptidy podle tohoto vynálezu jsou účinnější než efegatran při inhibici předcházejících, trombin-uvolňujících stupních koagulace.

Příklad 6

Inhibice trombinu a faktoru Xa

Inhibice enzymu byla testována v plazmových trombech bohatých na krevní destičky, jak bylo niž dříve zveřejněno (viz. zveřejněná mezinárodní přihláška číslo WO 97/46576 (Bajusz, S. a spolupracovníci)), přičemž tento test lze ve stručnosti popsat tak, že se při něm používají chromogenní substráty, tj. Tos-Gly-Pro-Arg-pNA - (Sl) pro trombin, respektive Moc-D-Chg-Gly-Arg-pNA (S2) pro faktor Xa. Uvedené testy byly provedeny ve skleněných zkumavkách a 96jímkových mikrotitrových platech při teplotě místnosti.

(a) Roztoky, (i) Pufr (A): 0,1M fosforečnan sodný/0,05M NaCI (pH 8,5). (ii) Inhibitory: roztoky v pufru A obsahujícím 0,02 % lidského albuminu o koncentraci 0,1, 1,0 a 10 miligramů/mililitr. (iii) Substráty: lmilimolární roztok substrátu Sl a 2milimolární roztok substrátu S2 v destilované vodě.

(b) Příprava plazmových trombů. 200 mikrolitrů vzorků bohatých na krevní destičky umístěných ve skleněných zkumavkách bylo 60 minut inkubováno při teplotě místnosti spolu s 80 mikrolitry 40milimolárního roztoku CaCl₂. Tromby byly promyty alikvóty fyziologického roztoku (0,9% roztok NaCI) o objemu 2 mililitry, přičemž toto promývání bylo spojeno s jemným mícháním a sloužilo pro odstranění nevázaných enzymů. V případě úspěšného promývání odpovídala hodnota optické hustoty reakční směsi obsahující promývací roztok a substrát Sl méně než 5 procentům hodnoty optické hustoty srovnávacího vzorku. Takto získané plazmové tromby byly až do použití uchovány ve zkumavce pod fyziologickým roztokem.

(c) Stanovení inhibice enzymu ve sraženinách. Po odstranění fyziologického roztoku byl uvedený plasmový trombus 5 minut inkubován při teplotě 37 °C spolu s 400 mikrolitry inhibitoru (nebo pufru A, jenž sloužil jako negativní srovnávací · · · a « « ·· · » » <.

«···« · · · a · · * · vzorek) a 30 minut se 100 mikrolitry substrátu SI nebo S2 a poté byla reakce zastavena přidáním 100 mikrolitrů 50procentní kyseliny octové. Do každé jímky mikrotitrového plata bylo naplněno 150 mikrolitrů jednotlivých reakčních směsí a toto plato bylo snímáno čítačem plat při vlnové délce 405 nanometrů (byl použit čítač plat ELISA READER 800, Bio-Tek Instruments lne. Winooski, VT, USA). Hodnoty IC₅₀ byly získány z graficky vynesených zhášecích dat.

Výsledky testu jsou uvedeny ve sloupci B tabulky 1. Sloučeniny 1, 2, 3 a 4 jsou jedinými analogy, které předčily efegatran při inhibici trombinu vázaného k trombu, avšak v případě inhibice faktoru Xa vázaného k trombu byl každý z uvedených analogů lepší než efegatran. Sloučeniny 1, 2, 3 a 4 tak vykazovaly největší inhibiční účinky vůči oběma enzymům vázaným k trombu.

Příklad 7 ňntífibrinolytícký účinek - --Inhibiční účinky sloučenin podle předmětného vynálezu vůči plasminu (PL) a vytváření plasminu vlivem aktivátorů plasminogenu (plogen), jako je tkáňový aktivátor plasminogenu (tPA) a urokinasa (UK), byly zkoušeny při testu měření fibrinového plátu (viz. publikace Bagdy, D., Barabás, E., Bajusz, S. a Széll, E., Thromb. Haemostas., 67, 325-330 (1992); Barabás,

E., Szell, E. a Bajusz, S. Blood Coagulation and Fibrinolysis,

4, 243, (1993)) . Výsledky tohoto testu jsou uvedeny ve sloupci C tabulky 1. Až na některé výjimky byly uvedené analogy vůči uvedeným třem enzymům o něco účinnější než • ···· ·· ··*· ·· · · · ‘ • « · · · · · r · · · · · • · 9 · * · ··· ·· ·* ··· efegatran. Uvedenými výjimkami byly účinky sloučeniny Cl vůči PL a účinky sloučenin Cl a C2 vůči UK, zatímco účinky sloučeniny 3 vůči UK byly téměř stejné jako účinky efegatranu.

Příklad 8

Králičí model diseminované intravaskulární koagulace

Sloučeniny 1 a 3 podle předmětného vynálezu a další peptidylarginaly z tabulky 1 a dále sloučenina C3 byly testovány na účinky vůči diseminované intravaskulární koagulaci (DIC) u endotoxinem (kterým byl lipopolysacharid, označovaný zkratkou LPS) léčených králíků, jak bylo popsáno v publikaci Scherer,

M. U. a spolupracovníci, Lab. Anim. Sci., 45, 538 (1995). Test trval 4 hodiny. Endotoxin byl podáván v dávkách 80 a 40 mikrogramů/kilogram jednorázovou intravenózní (i.v.) injekcí, a to v čase 0, respektive 120 minut, zatímco peptidylarginaly 1, 3 a C až C3 byly podávány infúzně během celého experimentu (v dávce 0,25 a/nebo 0,5 miligramu/kilogram/hodinu) ., Srovnávací skupině zvířat byl podáván 0,9procentní fyziologický roztok. Hemostatické parametry byly stanoveny v čase 0, 120 a 240 minut trvání experimentu.

I přes pečlivou léčbu došlo v 31 procentech případů k úmrtní, která byla nejpravděpodobněji způsobena vysokou citlivostí králíků na endotoxin (viz. publikace Semerano, N. a spolupracovníci, Int. J. Clin. Lab. Res., 21, 214 (1992)).

Tabulka 2

Účinek sloučenin 1 a 3 podle předmětného vynálezu, základní sloučeniny, kterou byl efegatran (C), a dalších arginalů (Cl a C2) a heparinů (H) na úmrtnost endotoxinem léčených králíků

Činidla*	Úmrtnost počet uhynulých/počet léčených zvířat a %
2 hodiny	4 hodiny
Počet	%	Počet	%
Salsol (0,9% NaCl)	0/10	0	0/10	0
Endotoxin	0/13	0	4/13	31
+1, 0,5 mg/kg/hod	0/12	0	2/12	17
+1, 0,25 mg/kg/hod	0/19	0	3/19	16
+3, 0,25 mg/kg/hod	0/22	0	4/22	18
+C, 0,5 mg/kg/hod	1/15	7	6/15	40
+C, 0,25 mg/kg/hod	1/14	7	5/14	36
+C1, 0,5 mg/kg/hod	0/16	0	5/16	31
+C2, 0,5 mg/kg/hod	0/12	0	5/12	42
+C3, 0,5 mg/kg/hod	1/18	6	10/18	56
+H, 100 U/kg/hod	0/19	0	7/19	37
+H, 0,5 U/kg/hod	0/17	0	6/17	35

^a Struktury peptidylarginalů 1, 3, C, Cl a C3 jsou uvedeny v tabulce 1, C3 = hPla-Pro-Arg-H, kde hPla = kyselina 2-hydroxy4-fenylmáselná

Jak je patrné z údajů v tabulce 2, sloučeniny 1 a 3 výrazně snižovaly úmrtnost endotoxinem léčených králíků, zatímco ostatní antikoagulanty bud' neměly účinek na úmrtnost (Cl) nebo způsobovaly určitý vzrůst úmrtnosti, přičemž nejvyšší hodnota,

přibližně 1,8-násobek, byl pozorován v případě sloučeniny C3.

V této souvislosti je třeba poznamenat, že z údajů v tabulce 1 vyplývá, že sloučeniny 1 a 3 snižující úmrtnost králíků zároveň vykazují nejvyšší inhibiční účinky vůči trombinu vázanému k trombu, jakož i vůči faktoru Xa vázanému k trombu a rovněž účinně inhibují jak koagulaci plazmy, tak fibrinolytické enzymy, plasmin a aktivátory plasminogenu.

Příklad 9

Potkaní model diseminované intravaskulární koagulace

Mezi nejvážnější důsledky DIC patří ukládání fibrinu v různých orgánech, změny krevních buněk, jako je např. snížení počtu krevních destiček, a změny v produktech degradace fibrinu. Účinky sloučeniny 1 podle předmětného vynálezu a dvou srovnávacích antikoagulantů, kterými byly efegatran (C) a heparin (H), na uvedené jevy byly testovány na potkanech léčených endotoxinem (viz. publikace Ford, A. J.a Longridge, D. J., Br. J. Pharmacol, 110, Suppl. 131P (1993); Hasegawa, N. a spolupracovníci, Am. J. Resp. Crit. Care Med., 153, 1831 (1996); Dichneite, G. a spolupracovníci, Thromb. Res., 77, 357 (1995)).

Potkaním samcům byl jednorázově podán endotoxin ve formě intravaskulární injekce, a to v dávce 10 miligramů/kilogram.

Po této injekci byl potkanům 4 hodiny intravaskulární infúzí podáván fyziologický roztok nebo testované sloučenina. Sloučeniny 1 a 3 byly dávkovány tak, že na počátku léčby bylo danému jedinci jednorázově injekčně podáno 0,25 miligramu sloučeniny/ kilogram a po této injekci byla daná sloučenina podávána čtyři hodiny ve formě intravaskulární infúze, a to v dávce 0,25 miligramu/kilogram/hodinu. Podobně byl podáván heparin (H), kdy danému jedinci bylo na počátku léčby jednorázově injekčně podáno 50 IU heparinu/kilogram a následně byl uvedenému jedinci čtyři hodiny podáván heparin ve formě intravaskulární infúze, a to v dávce 50 IU/kilogram/hodinu. Srovnávací skupině zvířat byl podáván 0,9% fyziologický roztok.

Ve vybraných orgánech (v játrech a ledvinách) bylo sledováno ukládání fibrinu značeného ¹²⁵I (¹²⁵I-fibrin) . ¹²⁵I-fibrin byl zvířatům podán injekčně 30 minut před injekcí endotoxinu. Radioaktivita ve vzorcích tkáně byla měřena gama čítačem (Wallac Wizard 1470). Tvorba mikrotrombů v uvedených orgánech byla testována prostřednictvím poměru aktivity orgánu obsahujícího ¹²⁵I k celkové aktivitě ¹²⁵I injekčně dodaného do organismu, přičemž tento poměr se označuje jako mikrotrombový index. Změny tohoto parametru jsou vyjádřené v procentech v porovnání se skupinou, které byl podáván fyziologický roztok.

Počet krevních destiček byl stanoven v automatickém zařízení (Sysmex F-800) a byl vztažen ke srovnávacím hodnotám.

Stanovení produktů degradace fibrinu (FDP) bylo provedeno testem srážení aggristinu (ristocetinu). Zvířata byla usmrcena čtyři hodiny po podání endotoxinu.

Zjištěné výsledky jsou shrnuty v tabulce 3.

Tabulka 3

Účinky sloučeniny 1 podle tohoto vynálezu, základního peptidu, kterým byl efegatran (C) , a heparinu (H) na ukládání ¹²⁵I-fibrinu a na změny počtu krevních destiček a změny v produktech degradace fibrinu (FDP) u potkanů léčených endotoxinem

	Ukládání 125I-fibrinu	Změna
Činidla	Játra	Ledviny	v počtu krevních v FDP destiček
endotoxin, 10mg/kga	36 %	36 %	62 %	2,56
+ 1, 0,25 mg/kg/h b	13 %	26 %	48 %	1,66
+ C, 0,25 mg/kg/h β	30 %	33 %	52 %	1,94
+ H, 50 NIH U/kg/h ů	22 %	28 %	43 %	2,37

^a jednorázová i.v. injekce; ^b jednorázová i.v. injekce + i.v. infúze.

Z údajů v tabulce 3 vyplývá, že schopnost sloučeniny 1 inhibovat DIC bylo výraznější než v případě heparinu nebo efegatranu.

Příklad 10

Sledování mortality u potkaního modelu diseminované intravaskulární koagulace

Potkaním samcům byla jednorázově intravenózně podána dávka 30 miligramú/kilogram LPS (endotoxinu). Peptidy byly okamžitě po podání LPS podány v jednorázové počáteční injekční dávce 0,5 a/nebo 0,75, 1,0 a 1,5 miligramú/kilogram s následným osmihodinovým infúzním podáváním daného peptidu. Úmrtnost byla zaznamenávána 4, 5, 6, 7 a 8 hodin po podání LPS.

Z údajů v tabulce 4 je zřejmé,-že léčba LPS vedla ke snížení podílu přeživších potkanů na konci experimentu (po 8 hodinách) na 20 procent. Všechny testované nové peptidylarginaly prodloužily dobu přežití a snížily úmrtnost v porovnání se skupinou léčenou pouze LPS. Sloučeniny 1, 2,3 a 4 byly účinnější než srovnávací sloučenina C.

···· · ··· • ··· ····· podle tohoto vynálezu a základní sloučeniny C na úmrtnost

CN co

- Oj H J

β	34
	•Η	0
	β
	φ	β
	>ϋ	φ
	Ρ	>υ
	0	'φ
N1	1—I m	Γ—1
Φ		•Ρ
34	34	β
rd	Φ	Φ
Ρ	β	λ;
34	Ή	43
Φ	>0	0
Η	Ο	a

		0,75	100	100	ο ο 1—1	100	100	100
		0,75
	σι ε	100	100	100	100	CN σ	θ5
		ιη	ο	γω				Ο
		ο	1—I	σ	C0	00	00	C0
		LD	ο	ο	ο	ο	ο	92
			ο	Ο	ο	ο	ο
	σι χ	Τ—1	ι—1	I—1	rd	rd	rd
	σι ε	ιη	ο ο	ο ο	00	00	00	92
	ο	rd	rd	rd	Η	rd
	η	ιη	ο	ο	ο	ο	Ο
			ο	ο	ο	ο	ο	00
ο\°		ο	rd	Γ-|	rd	rd	rd
—
•Ρ		ιη	ο	ο	ο	ο	ο	ο
ϋ		«.	ο	ο	ο	ο	ο	ο
in	mg/kg	γΗ	rd	rd	rd	rd	rd	rd
j ed	ο I—1	100	100	100	100	06	06
34
ivšíc	CN	ιη	ο	ιο	00			ο
	ο	γ—1	00		ιη	ιη	ιη
>Ν
Φ		ιη	ο	ο	ο	ο	ο	ο
>Ρ			ο	ο	ο	ο	ο	ο
Λ	σι 34	rd	I—1	rd	rd	rd	rd	rd
Ρ
orně	σ ε	1,0	100	100	100	100	06	06
CU
	ι—Ι	ιη ο	100	100	100	100	06	70
		ιη	ο	ο	ο	ο	92	92
			ο	ο	ο	ο
	σι 34	rd	Γ-1	Γ_1	rd	Η
	ε	1,0	100	83	83	νο	58	50
	υ	ιη	Λ—·>
			Ζ~\	ΓΩ	ΓΩ		ΓΩ
		ο	τ—1	σι	r-	<0	η	CN
	νη.		ο (•—1	Ό	CN		V	Ο
	ro		rd		ο	ΓΩ	CN	CN
	ω
κι Ό
α	0		ο		ιη	ΙΟ	Γ'·	00
>υ	34

		ίΡ β
•Ρ		•Η
ε		β
(ϋ	Φ	φ
β	>	>ο
σι		Ρ
•rd	Φ	0
ι—1	>	ι—1
•rd	β	ra
ε	a
	•η	'φ
ο	Φ	β
η	β	Φ
φ	0	Ό
Ο	4-1	ε
>		Ή
'Φ	Φ	β
Ό		'Φ

>	ω	'Φ
ω	a 31	Ό 0
CU		a	ω
31	Ή		Λ
	β	ε	ι-4
Ή	'φ	Ή
0	Ό	β	Μ
34	0	Ν	β
Φ	a	'Ρ	'Φ
*ΓΩ		<+-ι	Ό
β	0	β	0
•Η	a	Ή	a
Ή	>φ	ρ	0
β	4-1	'r1	a
Ν '0	•rd >Ν	0	β
β	ε	β	•rd
φ	φ	•rd	m)
>	34		0
φ	0	0	34
ρ 4-1	>1	34 •rd	co
β	β	ε
•rd	'Φ	m	Φ
Ρ	Ό 0	0	r-
0 >	a
0		β	ΙΟ
Ν	r-d	Ό
'φ	ί>1	Φ
Ρ	34	ι—1	in
0 β	>1	ra 'Φ
Ό	β	β	Φ
(ϋ •ΓΩ	•rd β	ra	Φ
•rd	φ >ο	φ	β 'Φ
β	Ρ	ο	>
φ	0	34	'Φ
>ϋ	γΗ	Φ	β
'Φ	m	•ΓΩ	φ
rH		β	ε
	'Φ	-rd	φ
•rd	β		β
ι—1	Φ	'Φ	Ν
	>	>	Φ
34	0	0	Ν
-rd	43 ra	Ν 'Φ	Φ
o	φ	Ρ	ι—1
ε	Η	0	>1
φ		β	34
ra	•	Ό
	ε	Φ	43
Ή	φ	‘ΓΩ	ra
β	β		0
φ	σ	>φ	β
34	0	ε	43
4-1	ι—d	Ρ	Ρ
0	•rd	0	ε
Λ	34	Μ-Ι	'£>

JUDr. Miloš VŠETÉékA advokát

120 00 PRAHA 2, Hálkova 2

Claims (21)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Sloučenina obecného vzorce (I)

   Xaa-Xbb-Arg-H (I) kde

   Xaa představuje zbytek α-substituované karboxylové kyseliny obecného vzorce (II)

   Q-CH(R)-CO (II) kde

   Q představuje alkyloxykarbonylaminoskupinu obsahující v alkoxylové skupině od 1 do 3 atomů uhlíku, methylaminoskupinu nebo hydroxylovou skupinu; a

   R představuje cykloalkylmethylovou skupinu obsahující v cykloalkylmethylové části od 7 do 9 atomů uhlíku, 1-adamantylmethýlovou skupinu nebo cykloalkylovou skupinu obsahující od 5 do 7 atomů uhlíku; a

   Xbb představuje zbytek L-prolinu nebo kyseliny L-azetidin-2-karboxylové;

   a kyselé adiční soli této sloučeniny vytvořené s organickou nebo anorganickou kyselinou.

   Sloučenina vzorce (1)

   Z^o a její kyselé adiční soli.

   Sloučenina vzorce (2)

   4.

   a její kyselé adiční soli.

   Sloučenina vzorce (3) a její kyselé adiční soli.

   ·«·· · · ···· ·· · • · · · « · · ♦ · ··*· · ··
2. 5. Sloučenina vzorce (4) a její kyselé adiční soli.
3. 6. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že zahrnuje sloučeninu podle nároku 1.
4. 7. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že zahrnuje sloučeninu podle nároku 2.
5. 8. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že zahrnuje sloučeninu podle nároku 3.
6. 9. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že zahrnuje sloučeninu podle nároku 4.
7. 10. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že zahrnuje sloučeninu podle nároku 5.
8. 11. Sloučenina, kterou je ethoxykarbonyl-D-cykloheptylalanyl-L-prolyl-N^G-benzyloxykarbonyl -L-argininaldehyd.

   « ···· ·· ···· ·· · ·· ···* ··· • · ····· · · · • ··· « · · · ···
9. 12.
10. 13.
11. 14.
12. 15.
13. 16.
14. 17.

    Sloučenina, kterou je tetrahydropyranyl-D-cykloheptyllaktyl-L-prolyl -^-benzyloxykarbonyl -L-argininaldehyd.

    Sloučenina, kterou je benzyloxykarbonyl-N-methyl-Dcykloheptylalanyl-L-prolyl-N^G-benzyloxykarbonyl-Largininaldehyd.

    Sloučenina, kterou je N-methyl-D-cyklohexylglycyl-Lazetidin-2-karbonyl-L-argininaldehyd.

    Farmaceutický prostředek podle kteréhokoli z nároků 6 až 10, vyznačující se tím, že je tvořen tabletou, kapslí, práškem, pilulkou, dražé, granulátem, roztokem, infúzním roztokem, čípkem, náplastí nebo mastí.

    Způsob léčby pacienta s diseminovanou intravaskulární koagulací, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání peptidylarginalu, jenž má inhibiční účinek vůči trombinu vázanému k trombu, vůči faktoru Xa, vůči plasminu a vůči aktivátorům plasminogenu, uvedenému pacientovi.

    Způsob léčby pacienta s diseminovanou intravaskulární koagulací, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání peptidylarginalu obecného vzorce (I)

    Xaa-Xbb-Arg-H (I) kde

    Xaa představuje zbytek α-substituované karboxylové kyseliny obecného vzorce (II)

    Q-CH(R)-CO (II)
15. 18.

    kde

    Q představuje alkyloxykarbonylaminoskupinu obsahující v alkoxylové skupině od 1 do 3 atomů uhlíku, methylaminoskupinu nebo hydroxylovou skupinu; a

    R představuje cykloalkylmethylovou skupinu obsahující v cykloalkylmethylové části od 6 do 9 atomů uhlíku, 1-adamantylmethýlovou skupinu nebo cykloalkylovou skupinu obsahující od 5 do 7 atomů uhlíku; a

    Xbb představuje zbytek L-prolinu nebo kyseliny L-azetidin-2 -karboxylové;

    nebo farmaceuticky přijatelných kyselých adičních solí této sloučeniny uvedenému pacientovi.

    Způsob léčby pacienta s diseminovanou intravaskulární koagulací, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání peptidylarginalu vzorce (1) » · · · ·9 · · ·4 • · « * • · · · · · nebo farmaceuticky přijatelných kyselých adičních solí této sloučeniny uvedenému pacientovi.
16. 19.

    Způsob léčby pacienta s diseminovanou intravaskulární koagulací, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání peptidylarginalu vzorce (2) nebo farmaceuticky přijatelných kyselých adičních solí této sloučeniny uvedenému pacientovi.
17. 20.

    Způsob léčby pacienta s diseminovanou intravaskulární koagulací, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání peptidylarginalu vzorce (3)

    O

    H

    Ί5 nebo farmaceuticky přijatelných kyselých adičních solí této sloučeniny uvedenému pacientovi.
18. 21. Způsob léčby pacienta s diseminovanou intravaskulární koagulací, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání peptidylarginalu vzorce (4) nebo farmaceuticky přijatelných kyselých adičních solí této sloučeniny uvedenému pacientovi.
19. 22. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že pacientovi je podáván peptidylarginal v dávce od přibližně 0,1 miligramu/kilogram tělesné hmotnosti do přibližně 50 miligramu/kilogram tělesné hmotnosti.
20. 23. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že pacientovi je podáván peptidylarginal v dávce, jež je dostatečná pro dosažení hladiny peptidylarginalů v krvi v rozmezí od přibližně 6 μΜ do přibližně 100 μΜ.
21. 24. Způsob podle nároku 7 nebo 8, vyznačující se tím, že uvedené peptidylarginaly se podávají simultánně nebo postupně.