ES2215797T3 - Metodo para la sintesis de isoguanosina y de sus derivados 2'. - Google Patents

Abstract

Un método para sintetizar un compuesto que tiene la fórmula estructural **FORMULA** donde R1 es seleccionado entre el grupo consistente en hidrógeno, hidroxilo, sulfhidrilo, halógeno, amino, alquilo, alilo y -OR2, donde R2 es alquilo, alilo, sililo o fosfato, consiste en: a) hacer reaccionar un compuesto que tiene la fórmula estructural **FORMULA** con un reactivo adecuado para proteger los grupos hidroxilo tanto 3¿ como 5¿; b) hacer reaccionar el producto de la etapa (a) con un reactivo adecuado para convertir el resto O6-oxi en un grupo funcional que sea susceptible de desplazamiento nucleofílico, produciendo así un resto O6 funcionalizado; c) oxidar el grupo 2-amino del producto de la etapa (b); d) hacer reaccionar el producto de la etapa (c) con un reactivo nucleofílico para desplazar el resto O6 funcionaliza y e) hacer reaccionar el producto de la etapa (d) con un reactivo adecuado para desproteger los grupos hidroxilo 3¿ y 5¿ protegidos.

Description

Método para la síntesis de isoguanosina y de sus derivados 2'.

Campo técnico

Esta invención se relaciona, en general, con la química de los ácidos nucleicos y los ensayos de hibridación. Más concretamente, la invención se relaciona con métodos para generar una señal más dependiente del blanco en los ensayos de hibridación de ácidos nucleicos minimizando el ruido de fondo que deriva primariamente de hibridación no específica. La invención tiene también aplicaciones en la terapéutica antisentido y de aptámeros y en el descubrimiento de fármacos.

Antecedentes

Los ensayos de hibridación de ácidos nucleicos son comúnmente usados en la investigación genética, la investigación biomédica y el diagnóstico clínico. En un ensayo básico de hibridación de ácidos nucleicos, se hibrida un ácido nucleico analito de hebra sencilla a una sonda de ácido nucleico de hebra sencilla marcada y se detectan los dúplex marcados resultantes. Se han desarrollado variaciones de este esquema básico para aumentar la exactitud, facilitar la separación de los dúplex que han de ser detectados de los materiales extraños y/o amplificar la señal que se detecta.

La presente invención se dirige a un método de reducción del ruido de fondo que aparece en cualquier ensayo de hibridación de ácidos nucleicos. En general, el ruido de fondo al que se aborda por medio de las técnicas aquí descritas es el resultado de la interacción no deseada de diversos componentes polinucleotídicos utilizados en un ensayo dado, es decir, de la interacción que da lugar a una señal que no corresponde a la presencia o cantidad de analito. La invención es útil junto con cualquier número de formatos de ensayo donde se llevan a cabo múltiples etapas de hibridación para producir una señal detectable que guarda correlación con la presencia o la cantidad de un analito polinucleotídico.

Uno de tales ensayos está descrito con detalle en la Patente EE.UU. de asignación común Nº 4.868.105, de Urdea y col. Ese ensayo implica el uso de unsistema de captura en dos partes diseñado para unir el analito polinucleotídico a un soporte sólido y de un sistema de marcaje en dos partes diseñado para unir un marcaje detectable al analito polinucleotídico que ha de ser detectado o cuantificado. El sistema de captura en dos partes implica el uso de sondas de captura unidas a un soporte sólido y de moléculas prolongadoras de captura que se hibridan tanto con un segmento de las sondas de captura como con un segmento del analito polinucleotídico. El sistema de marcaje en dos partes implica el uso de moléculas prolongadoras de marcaje que se hibridan con un segmento del analito polinucleotídico y de sondas marcadas que se hibridan con las moléculas prolongadoras de marcaje y contienen o se unen a un marcaje detectable. Una ventaja de dicho sistema es que deben producirse una pluralidad de etapas de hibridación para que el marcaje sea detectado de un modo tal que guarde correlación con la presencia del analito, en la medida en que se han de producir dos reacciones distintas de hibridación para la "captura" del analito y, de forma similar, se han de producir dos reacciones distintas de hibridación para el marcaje del analito. Sin embargo, sigue habiendo una serie de formas en las que se puede generar una señal detectable de un modo tal que no se corresponda a la presencia o cantidad de analito y éstas serán discutidas con detalle a continuación.

Otro ejemplo de un ensayo con el que es útil la presente invención es un método de amplificación de señal que se describe en la Patente EE.UU. comúnmente asignada Nº 5.124.246, de Urdea y col. En ese método, se amplifica la señal a través del uso de multímeros de amplificación, polinucleótidos que son construidos de manera que contengan un primer segmento que se hibride específicamente con los prolongadores de marcaje, y una multiplicidad de segundos segmentos idénticos que se hibridan de manera específica con una sonda marcada. El grado de amplificación es teóricamente proporcional al número de iteraciones del segundo segmento. Los multímeros pueden ser lineales o ramificados. Los multímeros ramificados pueden estar en forma de horquilla o de peine, siendo preferidos los multímeros de tipo peine.

Se presenta una aproximación para resolver el problema de la interferencia de las señales de fondo en los ensayos de hibridación de ácidos nucleicos en la Publicación PCT de asignación común Nº WO95/16055, en donde se deben unir al menos dos prolongadores de captura y/o dos o más prolongadores de marcaje al analito para disparar una señal detectable. Para reducir aún más el ruido de fondo, se lleva a cabo el ensayo en condiciones que favorezcan la formación de complejos de múltiples componentes.

Otra aproximación que ha sido propuesta para aumentar la dependencia con respecto al blanco de la señal en un ensayo de hibridación aparece descrita en la Publicación de Patente Europea Nº 70.685, de los inventores Heller y col. Esa referencia describe un ensayo de hibridación homogéneo en el que se produce una transferencia no radiactiva de energía entre sondas proximales; han de producirse dos sucesos distintos para que se produzca una señal generada por el blanco, aumentando la exactitud de la detección.

La presente invención está también diseñada para aumentar la exactitud de la detección y la cuantificación de analitos polinucleotídicos en ensayos de hibridación. La invención aumenta tanto la sensibilidad como la especificidad de dichos ensayos reduciendo la incidencia de generación de señal que se produce en ausencia de blanco y no implica un aumento ni en el tiempo ni en el coste en relación a las configuraciones de ensayo actualmente utilizadas.

Los objetivos de la presente invención, a saber, reducir el ruido de fondo y aumentar la exactitud de la detección y la cuantificación de analitos en ensayos de hibridación de ácidos nucleicos, han sido conseguidos, en parte, mediante el uso de variantes nucleosídicas que formen pares de bases en virtud de patrones de enlaces de hidrógeno "no naturales". Tal como se usa aquí, un par de bases "no natural" es uno formado entre unidades nucleotídicas distintas de la adenosina (A), la timidina (T), la citidina (C), la guanosina (G) o la uridina (U). Uno de tales pares de bases nucleosídicas no naturales se forma entre la isocitosina (isoC) y la isoguanina (isoG). La isoC y la isoG pueden formar un par de bases con una geometría estándar (es decir, un "par de bases de Watson-Crick"), pero que incluye uniones de hidrógeno distintas de la implicada en la unión de la citosina (C) a la guanina (G), tal como se muestra a continuación:

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Leach y col. (1992), J. Am. Chem. Soc., 114: 3675-3683, aplicaron cálculos de mecánica molecular, dinámica molecular y perturbación de energía libre para estudiar la estructura y la estabilidad del par de bases isoC*isoG. Tor y col. (1993), J. Am. Chem. Soc., 115: 4461-4467, describen un método mediante el cual una isoC modificada en una plantilla de ADN dirigirá la incorporación de un análogo isoG a un producto de ARN transcrito. Switzer y col. (1993), Biochemistry, 32: 10489-10496, estudiaron las condiciones en las cuales el par de bases formado entre isoC e isoG podría incorporarse a ADN y ARN por ADN y ARN polimerasas.

La introducción de un nuevo par de bases en oligómeros de ADN ofrece el potencial de permitir un control más preciso sobre la hibridación.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona métodos y kits para la detección de analitos de ácidos nucleicos en una muestra. En general, los métodos representan perfeccionamientos en los ensayos de hibridación de ácidos nucleicos, tales como los ensayos de hibridación in situ, los Southerns, los Northerns, las transferencias de manchas y los ensayos de reacción en cadena de polimerasa. En particular, los métodos representan perfeccionamientos sobre los ensayos de hibridación en emparedado en fase de solución que implican la unión del analito a un soporte sólido, el marcaje del analito y la detección de la presencia de marcaje sobre el soporte. Los métodos preferidos implican el uso de multímeros de amplificación que permiten la unión de significativamente más marcaje en el complejo analito-sonda, aumentando la sensibilidad y especificidad del ensayo.

En un primer aspecto de la invención, se facilita un ensayo en el que se incorporan una o más unidades nucleotídicas que son capaces de formar pares de bases y que son distintas de adenosina (A), timidina (T), citidina (C), guanosina (G) o uridina (U), a segmentos oligonucleotídicos hibridantes que no son blanco, es decir, segmentos "universales", de componentes de ensayos de hibridación de ácidos nucleicos. Este uso de tales unidades nucleotídicas da lugar a esquemas de emparejamiento de bases únicos que dan como resultado una mayor especificidad de unión entre segmentos universales.

En un aspecto relacionado de la invención, se facilita un ensayo en el que al menos una primera unidad nucleotídica distinta de A, T, C, G o U, capaz de formar un par de bases con una segunda unidad nucleotídica distinta de A, T, C, G o U. se incorpora a secuencias de ácidos nucleicos de componentes de ensayo que son complementarias de las secuencias de ácidos nucleicos presentes en componentes de ensayo distintos del analito blanco. En las siguientes estructuras (I) a (IV), se dan ejemplos de pares de bases formados entre dos de tales unidades nucleotídicas:

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y

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donde R representa un esqueleto que permitirá a las bases formar un par de bases con una unidad nucleotídica complementaria al incorporarse a un polinucleótido y R' es, por ejemplo, hidrógeno, metilo, \alpha- o \beta-propinilo, bromo, flúor, yodo o similar. Incorporando dichas unidades nucleotídicas a dichas así llamadas secuencias "universales", es decir, secuencias no implicadas en la hibridación al analito blanco, se reduce en gran medida el potencial de hibridación inespecífica. En una realización preferida, las primeras y segundas unidades nucleotídicas consisten de manera intercambiable en isocitidina e isoguanosina, tal como se muestra en la Fórmula (I).

En un aspecto relacionado de la invención, se facilita un ensayo en el que la temperatura de fusión T_{m1} del complejo formado entre el analito y las sondas de captura unidas al soporte, mediado por una o más moléculas prolongadoras de captura distintas, y/o el prolongador marcado y el amplificador o amplificadores es significativamente inferior a la temperatura de fusión T_{m2} del complejo formado entre las sondas marcadas y el amplificador. En este aspecto, el ensayo es llevado a cabo en condiciones que inicialmente favorecen la formación de todos los complejos híbridos. Las condiciones son entonces alteradas en el curso del ensayo para desestabilizar los complejos híbridos T_{m1}.

La invención contempla adicionalmente un método para llevar a cabo un ensayo de hibridación en el que se combinan cada una de las técnicas antes mencionadas, es decir, en el que se incorporan unidades nucleotídicas distintas de A, T, G, C o U a segmentos universales de componentes de ensayo y en el que la temperatura de fusión de los complejos híbridos T_{m1} es significativamente inferior a la temperatura de fusión de los complejos híbridos T_{m2}.

En otro aspecto, la invención contempla un nuevo método para sintetizar isoguanosina o 2'-desoxiiso-guanosina.

Finalmente, la invención contempla kits que contienen los reactivos necesarios para llevar a cabo los ensayos aquí descritos y reivindicados.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. La Figura 1 es un diagrama de un ensayo de hibridación en emparedado en fase de solución de la técnica anterior, donde las líneas gruesas indican las secuencias universales.

Figura 2. La Figura 2 representa un método para unir sondas a ADN de doble hélice, donde las líneas gruesas indican las secuencias universales.

Figura 3. La Figura 3 representa el uso de sondas que contienen nucleótidos no naturales y competímeros para bloquear la hibridación no específica.

Descripción detallada de la invención Definiciones y nomenclatura

Antes de exponer y describir con detalle la presente invención, hay que entender que esta invención no se limita a formatos de ensayo, materiales o reactivos específicos, ya que éstos podrían, por supuesto, variar. También es necesario entender que la terminología aquí empleada tiene el fin de describir sólo realizaciones particulares y que no se pretende que sea limitante.

En esta descripción y en las reivindicaciones que se darán a continuación, se hará referencia a una serie de términos que se definirán según los siguientes significados:

Tal como se utilizan aquí, los términos "polinucleótido" y "oligonucleótido" son genéricos para polidesoxirribonucleótidos (que contienen 2-desoxi-D-ribo-sa), para polirribonucleótidos (que contienen D-ribosa), para cualquier otro tipo de polinucleótido que sea un N- o C-glicósido de una base de purina o pirimidina y para otros polímeros que contengan esqueletos no nucleotídicos, por ejemplo poliamidas (por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos ("PNA") y polimorfolinos (comercializados por Anti-Virals, Inc., Corvallis, Oregón, como polímeros Neugene™) y otros polímeros de ácidos nucleicos específicos de secuencia sintéticos, siempre que los polímeros contengan nucleobases en una configuración que permita el emparejamiento de bases y el apilamiento de bases, tal como se encuentra en el ADN y el ARN. No hay una distinción intencionada en cuanto a la longitud entre el término "polinucleótido" y "oligonucleótido" y estos términos serán usados indistintamente. Estos términos se refieren sólo a la estructura primaria de la molécula. Así, estos términos incluyen ADN de hebra doble y sencilla, así como ARN de hebra doble y sencilla, híbridos ADN:ARN e híbridos entre PNA y ADN o ARN, y también incluyen tipos conocidos de modificaciones, por ejemplo marcajes conocidos en la técnica, metilación, "remates", substitución de uno o más de los nucleótidos naturales con un análogo, modificaciones internucleotídicas, tales como, por ejemplo, las que se producen con uniones no cargadas (por ejemplo, fosfonatos de metilo, fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos, etc.), con uniones cargadas negativamente (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.) y con uniones cargadas positivamente (por ejemplo, aminoalquilfosforoamidatos, aminoalquilfosfotriésteres), las que contienen restos pendientes, tales como, por ejemplo, proteínas (incluyendo nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, poli-L-lisina, etc.), las que tienen intercaladores (por ejemplo, acridina, psoralén, etc.), las que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radioactivos, boro, metales oxidativos, etc.), las que contienen alquilantes, las que tienen uniones modificadas (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa-anoméricos, etc.), así como formas no modificadas del polinucleótido u oligonucleótido.

Se apreciará que, tal como se utilizan aquí, los términos "nucleósido" y "nucleótido" incluirán aquellos restos que contienen no sólo las bases conocidas de purina y pirimidina, sino también otras bases heterocíclicas que han sido modificadas. Dichas modificaciones incluyen purinas o pirimidinas metiladas, purinas o pirimidinas aciladas u otros heterociclos. Los nucleósidos o nucleótidos modificados incluirán también modificaciones en el resto de azúcar, por ejemplo, donde uno o más de los grupos hidroxilo están substituidos con halógeno o grupos alifáticos o están funcionalizados como éteres, aminas o similares. El término "unidad nucleotídica" pretende abarcar nucleósidos y nucleótidos.

Más aún, las modificaciones en las unidades nucleotídicas incluyen la redistribución, aposición, substitución o algún otro modo de alteración de los grupos funcionales sobre la base de purina o de pirimidina que forman uniones de hidrógeno a una pirimidina o purina complementaria respectiva. La unidad nucleotídica modificada resultante puede formar un par de bases con otras unidades nucleotídicas modificadas de este tipo, pero no con A, T, C, G o U. Los pares de bases estándar A-T y G-C se forman en condiciones que permiten la formación de uniones de hidrógeno entre el N^{3}-H y el C^{4}-oxi de la timidina y el N^{1} y el C^{6}-NH_{2}, respectivamente, de la adenosina y entre el C^{2}-oxi, el N^{3} y el C^{4}-NH_{2} de la citidina y el C^{2}-NH_{2}, el N^{1}-H y el C^{6}-oxi, respectivamente, de la guanosina. Así, por ejemplo, se puede modificar la guanosina (2-amino-6-oxi-9-\beta-D-ribofuranosilpurina) para formar isoguanosina (2-oxi-6-amino-9-\beta-D-ribofuranosilpurina). Dicha modificación da lugar a una base nucleosídica que ya no formará de manera efectiva un par de bases estándar con la citosina. Sin embargo, la modificación de la citosina (1-\beta-D-ribofuranosil-2-oxi-4-aminopirimidina) para formar isocitosina (1-\beta-D-ribofuranosil-2-amino-4-oxipirimidina) da lugar a un nucleótido modificado que no formará con efectividad un par de bases con la guanosina, pero que formará un par de bases con la isoguanosina. La isocitosina puede ser adquirida de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO); la isocitidina puede ser preparada por el método descrito por Switzer y col. (1993), antes citado, y en las referencias allí citadas; la 2'-desoxi-5-metilisocitidina puede ser preparada por el método de Tor y col. (1993), antes citado, y en las referencias allí citadas, y los nucleótidos de isoguanosina pueden ser preparados usando el método descrito por Switzer y col., antes citado, y por Mantsch y col. (1993), Biochem., 14: 5593-5601, o por el método descrito con detalle a continuación. Los pares de bases no naturales representados en la estructura (II), a los que se hace referencia como \kappa y \pi, pueden ser sintetizados por el método descrito en Piccirilli y col. (1990), Nature, 343: 33-37, para la síntesis de 2,6-diaminopirimidina y su complementaria (1-metilpirazolo[4,3]pirimidina-5,7-(4H,6H)-diona). Otras de tales unidades nucleotídicas modificadas que forman pares de bases únicos han sido descritas en Leach y col. (1992), J. Am. Chem. Soc., 114: 3675-3683, y Switzer y col., antes citado, o serán evidentes para los que tienen conocimientos ordinarios en la técnica.

El término "analito polinucleotídico" se refiere a una molécula de ácido nucleico de hebra sencilla o doble que contiene una secuencia nucleotídica blanco. Los ácidos nucleicos analitos pueden proceder de una variedad de fuentes, por ejemplo de fluidos o sólidos biológicos, de substancias alimenticias, de materiales ambientales, etc., y pueden ser preparados para el análisis de hibridación por una variedad de medios, por ejemplo proteinasa K/SDS, sales caotrópicas o similares. El término "analito polinucleotídico" es usado aquí de manera indistinta con los términos "analito", "ácido nucleico analito" y "blanco".

Tal como se utiliza aquí, el término "región blanco" o "secuencia nucleotídica blanco" se refiere a una región de unión a sondas contenida dentro de la molécula blanco. El término "secuencia blanco" se refiere a una secuencia con la cual una sonda formará un híbrido estable en las condiciones deseadas.

Tal como se utiliza aquí, el término "sonda" se refiere a una estructura constituida por un polinucleótido, según se definió anteriormente, que contiene una secuencia de ácido nucleico complementaria a una secuencia de ácido nucleico presente en el analito blanco. Las regiones polinucleotídicas de las sondas pueden estar compuestas por ADN y/o ARN y/o análogos nucleotídicos sintéticos.

Se apreciará que las secuencias de unión no necesitan tener una perfecta complementariedad para dar híbridos estables. En muchas situaciones, se formarán híbridos estables cuando menos de aproximadamente un 10% de las bases son emparejamientos erróneos, ignorando los bucles de cuatro o más nucleótidos. En consecuencia, tal como se usa aquí, el término "complementariedad" se refiere a un oligonucleótido que forma un dúplex estable con su "complementario" en las condiciones de ensayo, generalmente cuando hay aproximadamente un 90% o más de homología.

Los términos "multímero de ácido nucleico" o "multímero de amplificación" son aquí usados para hacer referencia a un polímero lineal o ramificado del mismo segmento oligonucleotídico de hebra sencilla repetitivo o de diferentes segmentos polinucleotídicos de doble hebra, cada uno de los cuales contiene una región en la que se puede unir una sonda marcada, es decir, que contiene una secuencia de ácido nucleico complementaria a una secuencia de ácido nucleico contenida en una sonda marcada; los segmentos oligonucleotídicos pueden estar compuestos por ARN, ADN, nucleótidos modificados o combinaciones de éstos. Al menos uno de los segmentos tiene una secuencia, longitud y composición que le permiten unirse específicamente a una sonda marcada; adicionalmente, al menos uno de los segmentos tiene una secuencia, longitud y composición que le permite unirse específicamente a un prolongador de marcaje o preamplificador. Típicamente, dichos segmentos contendrán aproximadamente 15 a 50, preferiblemente 15 a 30, nucleótidos y tendrán un contenido en GC en el rango de aproximadamente un 20% a aproximadamente un 80%. El número total de segmentos oligonucleotídicos en el multímero estará normalmente en el rango de aproximadamente 3 a 1.000, más típicamente en el rango de aproximadamente 10 a 100 y, más típicamente, será de aproximadamente 50. Los segmentos oligonucleotídicos del multímero pueden unirse covalentemente entre sí a través de enlaces fosfodiéster o a través de agentes de unión interpuestos, tales como ácido nucleico, aminoácido, carbohidrato o puentes de poliol, o a través de otros agentes entrecruzantes capaces de entrecruzar hebras de ácido nucleico o de ácido nucleico modificado. Alternativamente, el multímero puede estar constituido por segmentos oligonucleotídicos que no se unen covalentemente, sino que se unen de algún otro modo, por ejemplo por hibridación. Dicho multímero está descrito, por ejemplo, en la Patente EE.UU. Nº 5.175.270 de Nilsen y col. El(los) sitio(s) de unión puede(n) estar en los extremos del segmento (en la orientación 3'-5' normal u orientado(s) aleatoriamente) y/o en uno o más nucleótidos internos de la hebra. En multímeros lineales, los segmentos individuales se unen de extremo a extremo para formar un polímero lineal. En un tipo de multímero ramificado, tres o más segmentos oligonucleotídicos emanan de un punto de origen para formar una estructura ramificada. El punto de origen puede ser otro segmento nucleotídico o una molécula multifuncional a la que se pueden unir covalentemente al menos tres segmentos. En otro tipo, existe un esqueleto de segmento oligonucleotídico con uno o más segmentos oligonucleotídicos pendientes. Los multímeros de este último tipo son de "de tipo horquilla", de "tipo peine" o una combinación de "tipo horquilla" y "tipo peine" en cuanto a su estructura, donde los multímeros de "tipo peine", que son los multímeros preferidos aquí, son polinucleótidos que tienen un esqueleto lineal con una multiplicidad de cadenas laterales que se extienden desde el esqueleto. Los segmentos pendientes dependerán normalmente de un nucleótido modificado o de otro resto orgánico que tenga grupos funcionales apropiados a los que se puedan conjugar o unir de algún otro modo oligonucleótidos. El multímero puede ser totalmente lineal, totalmente ramificado o ser una combinación de porciones lineales y ramificadas. Típicamente, habrá al menos dos puntos de ramificación en el multímero, más preferiblemente al menos tres, más preferiblemente en el rango de aproximadamente 5 a 30, aunque en algunas realizaciones puede haber más. El multímero puede incluir uno o más segmentos de secuencias de doble hélice. Se puede encontrar una mayor información concerniente a la síntesis de multímeros y a estructuras específicas de multímeros en la Patente EE.UU. de propiedad común Nº 5.124.246, de Urdea y col.

La Publicación PCT Nº WO92/02526 describe los multímeros ramificados de tipo peine que son particularmente preferidos junto con el presente método y que están compuestos por un esqueleto lineal y cadenas laterales pendientes; el esqueleto incluye un segmento que proporciona un sitio de hibridación específica para ácido nucleico analito o ácido nucleico unido al analito, mientras que las cadenas laterales pendientes incluyen iteraciones de un segmento que proporciona sitios de hibridación específicos para una sonda marcada.

Tal como se ha indicado antes, se puede usar también una molécula "preamplificadora", que sirve como resto puente entre las moléculas prolongadoras de marcaje y los multímeros de amplificación. De este modo, se une más amplificador y, por lo tanto, más marcaje en cualquier complejo dado de blanco-sonda. Las moléculas preamplificadoras pueden ser lineales o ramificadas y típicamente contienen en el rango de aproximadamente 30 a aproximadamente 3.000 nucleótidos. En la realización aquí preferida, la molécula preamplificadora se une a al menos dos moléculas prolongadoras de marcaje diferentes, de tal forma que aumenta la exactitud global del ensayo (es decir, porque, una vez más, se necesita una pluralidad de sucesos de hibridación para que se forme el complejo sonda-blanco).

Tal como se usa aquí, una "muestra biológica" se refiere a una muestra de tejido o fluido aislada de un individuo, incluyendo, aunque sin limitación, por ejemplo, plasma, suero, fluido espinal, semen, fluido linfático, las secciones externas de la piel, los tractos respiratorio, intestinal y genitourinario, las lágrimas, la saliva, la leche, las células sanguíneas, los órganos y también muestras de constituyentes de cultivos celulares in vitro (incluyendo, aunque sin limitación, el medio condicionado resultante del crecimiento de células en medio de cultivo celular, de células supuestamente infectadas con virus, de células recombinantes y de componentes celulares). Los usos preferidos del presente método son en la detección y/o cuantificación de ácidos nucleicos como sigue: (a) ácidos nucleicos víricos, tales como procedentes del virus de la hepatitis B ("HBV"), del virus de la hepatitis C ("HCV"), del virus de la hepatitis D ("HDV"), del virus de la inmunodeficiencia humana ("HIV") y de la familia de los virus herpes, incluidos el herpes zoster (virus de la varicela), los virus herpes simplex I y II, el citomegalovirus, el virus de Epstein-Barr y el recientemente aislado virus Herpes VI; (b) ácidos nucleicos bacterianos, tales como de Chlamydia, de Mycobacterium tuberculosis, etc., y (c) numerosas secuencias humanas de interés.

Tal como se emplea aquí, el término "hibridación no específica" es usado para hacer referencia a aquellos casos en los que un segmento de un primer polinucleótido que se pretende hibridar con un segmento de un segundo polinucleótido seleccionado también se hibrida con un tercer polinucleótido, disparando un resultado erróneo, es decir, dando lugar a una situación en la que se puede detectar el marcaje en ausencia de analito blanco. El uso del término "se hibrida" no pretende excluir el emparejamiento de bases que no se corresponde al de Watson-Crick.

Tal como se usa aquí, el término "unión no específica" se usa para referirse a aquellos casos en los que un polinucleótido se une a un soporte sólido u otro componente del ensayo a través de una interacción -que puede ser directa o indirecta- que no implica uniones de hidrógeno con los polinucleótidos unidos al soporte.

Haciendo ahora referencia a la realización preferida representada en la Figura 1, los siguientes términos se aplican al ensayo de hibridación en ella descrito. Nótese que, en la Figura 1, las secuencias universales están indicadas por líneas gruesas por razones de claridad.

Las "moléculas prolongadoras de marcaje" ("LE"), a las que también se hace aquí referencia como "prolongadores de marcaje", contienen regiones de complementariedad frente al polinucleótido analito y para el multímero de amplificación ("AMP"). Si se usa un preamplificador (no mostrado en la figura), las moléculas prolongadoras de marcaje se unirán a esta especie intermedia más que directamente al multímero de amplificación. Si no se usa ni preamplificador ni amplificador, las moléculas prolongadoras de marcaje se unirán directamente a una secuencia en la sonda marcada ("LP"). Así, las moléculas prolongadoras de marcaje son cadenas polinucleotídicas de una sola hebra que tienen una primera secuencia de ácido nucleico L-1 complementaria a una secuencia del polinucleótido analito y una segunda región universal que tiene una secuencia de reconocimiento de multímeros L-2 complementaria a un segmento M-1 de la sonda de marcaje, del multímero de amplificación o del preamplificador.

Las "sondas marcadas (LP)" están diseñadas para unirse al prolongador de marcaje o, si se emplea un multímero de amplificación en el ensayo, a los segmentos oligonucleotídicos repetitivos del multímero. Las LP contienen un marcaje o bien están estructuradas para unirse a un marcaje. Así, las LP contienen una secuencia de ácido nucleico L-3 complementaria a una secuencia de ácido nucleico M-2 presente en las unidades oligonucleotídicas repetitivas del multímero y se unen a, o están estructuradas para unirse a, un marcaje que proporciona, directa o indirectamente, una señal detectable.

Las "moléculas prolongadoras de captura (``CE'')", a las que también se hace aquí referencia como "prolongadores de captura", se unen al polinucleótido analito y a las sondas de captura, que a su vez se unen a un soporte sólido. Así, las moléculas prolongadoras de captura son cadenas polinucleotídicas de una sola hebra que tienen una primera región de secuencia polinucleotídica que contiene una secuencia de ácido nucleico C-1 que es complementaria de una secuencia del analito y una segunda región no complementaria que tiene una secuencia de reconocimiento de sonda de captura C-2. Las secuencias C-1 y L-1 son secuencias no complementarias y no idénticas que son, cada una, complementaria de secuencias físicamente distintas del analito.

Las "sondas de captura (``CP'')" se unen a los prolongadores de captura y a un soporte sólido. Así, tal como se ilustra en la Figura 1, las sondas de captura tienen una secuencia de ácido nucleico C-3 complementaria a C-2 y se unen covalentemente (o son capaces de unirse covalentemente) a un soporte sólido.

En general, los ensayos de hibridación en fase de solución llevados a cabo usando el sistema ilustrado en la Figura 1 proceden como sigue. Se incuba un ácido nucleico analito de hélice sencilla en condiciones de hibridación con los prolongadores de captura y los prolongadores de marcaje. El producto resultante es un complejo de ácido nucleico del polinucleótido analito unido a los prolongadores de captura y a los prolongadores de marcaje. Este complejo puede ser posteriormente añadido en condiciones de hibridación a una fase sólida que tenga sondas de captura unidas a su superficie; sin embargo, en una realización preferida, la incubación inicial es llevada a cabo en presencia de las sondas de captura unidas al soporte. El producto resultante consiste en el complejo unido a la fase sólida a través de las moléculas prolongadoras de captura y de las sondas de captura. La fase sólida con el complejo unido se separa entonces de los materiales no unidos. Se añade luego eventualmente un multímero de amplificación, preferiblemente un multímero de tipo peine como se ha descrito antes, al complejo fase sólida-analito-sonda en condiciones de hibridación para permitir que el multímero se hibride a las LE; si se usan sondas preamplificadoras, se incuba el complejo fase sólida-analito-sonda con las sondas preamplificadoras junto con el multímero de amplificación o, preferiblemente, antes de la incubación con el multímero de amplificación. Se separa entonces el complejo de fase sólida resultante de cualquier preamplificador y/o multímero no unidos por lavado. Se añaden entonces las sondas marcadas en condiciones que permitan la hibridación con las LE o, si se usa un multímero de amplificación, a los segmentos oligonucleotídicos repetitivos del multímero. El complejo resultante de fase sólida y ácido nucleico marcado es luego lavado para eliminar el oligonucleótido marcado no unido y se hace la lectura. Habría que hacer notar que los componentes representados en la Figura 1 no están necesariamente dibujados a escala y que los multímeros de amplificación, si se usan, contienen un número mucho mayor de segmentos oligonucleotídicos repetitivos que lo mostrado (como se ha explicado antes), cada uno de los cuales está diseñado para unirse a una sonda marcada.

El foco primario del presente método es la eliminación de las fuentes del ruido de fondo minimizando la interacción de las sondas de captura y de las moléculas prolongadoras de captura con las sondas marcadas, las moléculas prolongadoras de marcaje y los amplificadores, reduciendo la probabilidad de que se unan restos incorrectos a las sondas de captura unidas al soporte.

La hibridación entre secuencias oligonucleotídicas complementarias está condicionada por la capacidad de los nucleótidos de purina y pirimidina contenidos en ellas para formar pares estables de bases. Los cinco nucleótidos naturales adenosina (A), guanosina (G), timidina (T), citidina (C) y uridina (U) forman los pares de bases purina-pirimidina G-C y A-T(U). La energía de unión del par de bases G-C es mayor que la del par de bases A-T debido a la presencia de tres restos de uniones de hidrógeno en el primero en comparación con los dos del segundo, tal como se muestra a continuación:

7

y

8

Así, en un ensayo en emparedado de ácidos nucleicos en fase de solución convencional, las moléculas oligonucleotídicas están diseñadas para contener secuencias de ácidos nucleicos que sean complementarias a, y por lo tanto se hibriden con, secuencias de ácidos nucleicos de otros componentes de ensayo o del analito blanco, tal como se explicó con detalle anteriormente. El método de la invención reduce la hibridación no específica incorporando unidades nucleotídicas no naturales a segmentos oligonucleotídicos universales de componentes de ensayo que son capaces de formar pares de bases únicos. Más aún, el método de la invención reduce la contribución de la unión no específica de los componentes de ensayo separando los componentes de ensayo marcados de manera detectable que se asocian a la presencia y/o cantidad de un analito blanco de los que se unen de un modo no específico y contribuyen al ruido de fondo del ensayo.

En una primera realización de la invención, se presenta un ensayo de hibridación en el que se incorporan unidades nucleotídicas distintas de A, T, C, G y U, que son capaces de formar pares de bases únicos, a segmentos oligonucleotídicos hibridantes de componentes de ensayo que no son específicos para el analito blanco y que, por lo tanto, tienen menos probabilidad de formar híbridos estables con secuencias de sondas específicas del blanco o con secuencias de ácidos nucleicos no blanco extrañas. Así, tal como se muestra en la Figura 1, por ejemplo, dichas unidades nucleotídicas pueden ser incorporadas a secuencias complementarias de ácidos nucleicos C-2/C-3, L-2/M-1 y L-3/M-2. Los segmentos oligonucleotídicos hibridantes de los componentes de ensayo que son complementarios a los segmentos de ácidos nucleicos del analito blanco son construidos a partir de nucleótidos naturales (es decir, A, T, C, G o U). Los segmentos oligonucleotídicos que contienen unidades nucleotídicas pueden ser construidos substituyendo de aproximadamente un 15% a aproximadamente un 100% de los nucleótidos naturales con la contrapartida de unidades nucleotídicas. Preferiblemente, se substituirá cada tercera o cuarta base de un oligonucleótido con una unidad nucleotídica capaz de formar un par de bases único. Será evidente para los expertos en la técnica que, al aumentar el porcentaje de unidades nucleotídicas de substitución, disminuye la hibridación no específica de forma concomitante. Sin embargo, la substitución completa requerirá al menos dos nuevos pares de bases para mantener suficiente diversidad de secuencia para impedir la hibridación inespecífica entre las secuencias universales.

En otra realización de la invención, se aborda el fenómeno de la generación de señales independiente del blanco disponiendo de un ensayo de hibridación que está configurado de tal forma que la temperatura de fusión T_{m1} del híbrido C-2/C-3 es significativamente inferior a la temperatura de fusión T_{m2} del híbrido L-3/M-2. Este método se basa en el diseño y la construcción de complejos híbridos de tal forma que la temperatura de fusión T_{m1} sea al menos aproximadamente 5ºC inferior, preferiblemente al menos aproximadamente 10ºC inferior, más preferiblemente al menos aproximadamente 20ºC inferior, a la temperatura de fusión T_{m2}.

Esta diferencia de estabilidad es explotada realizando el ensayo en condiciones estrictas que inicialmente favorecen la formación de complejos híbridos T_{m1} y T_{m2}. Esta severidad es alterada en una etapa posterior del ensayo, permitiendo así la separación física del analito de interés de las sondas de captura o la separación física de las sondas marcadas unidas al amplificador del blanco. Se puede controlar la severidad alterando un parámetro que sea una variable termodinámica. Dichas variables son bien conocidas en la técnica e incluyen la concentración de formamida, la concentración salina, la concentración de sales caotrópicas, el pH (concentración de iones hidrógeno), el contenido en solventes orgánicos y la temperatura. Son controles de severidad preferidos el pH y la concentración salina: se realiza una etapa del ensayo a un pH o una concentración salina que desestabiliza el complejo híbrido formado entre la sonda de captura/prolongador de captura o desestabiliza el híbrido formado entre el prolongador de marcaje/amplificador (o preamplificador). Una etapa preferida en la que se ejerce la severidad es la adición de substrato. Así, en una realización preferida, el ensayo de hibridación es conducido en condiciones que favorecen la estabilidad de los complejos híbridos formados entre todos los componentes del ensayo y, a continuación, con la adición de substrato de marcaje, se altera la severidad para desestabilizar complejos híbridos tales como la sonda de captura/prolongador de captura o el prolongador de captura/amplificador (preamplificador) y similares, con la condición de que la sonda marcada no se libre del prolongador de marcaje o del amplificador.

Otra realización de la invención representa un medio mediante el cual se puede llevar a efecto la anterior realización de la invención configurando el ensayo de hibridación de tal forma que las secuencias nucleotídicas complementarias que forman complejos híbridos T_{m1} sean más cortas que las que forman complejos híbridos T_{m2}. Los expertos en la técnica apreciarán que, con secuencias nucleotídicas complementarias más cortas, se reduce la oportunidad de diversidad de secuencia en ellas. Esta diversidad se puede mantener, sin embargo, incorporando en las secuencias complementarias un par de bases no natural, por ejemplo un par de bases isoC-isoG.

Será fácilmente evidente para un experto en la técnica que cuanto mayor sea la diferencia de temperatura entre T_{m1} y T_{m2}, mayor será la "eficiencia" de esta técnica en la eliminación del ruido de fondo. Por lo tanto, un experto en la técnica reconocerá que diferencias de temperatura de menos de 10ºC, incluso de menos de 5ºC, permitirían también la reducción del ruido de fondo, aunque en menor grado.

El método de la invención descrita, mediante el cual se incorporan unidades nucleotídicas no naturales a secuencias oligonucleotídicas hibridantes para aumentar la especificidad de la hibridación con un analito blanco, encuentra utilidad en una variedad de aplicaciones.

En el ensayo en emparedado de ácidos nucleicos en fase de solución básico o amplificado, se fija una pluralidad de sondas de captura a una superficie sólida. Más frecuentemente, el área superficial disponible para la unión no específica es controlada incubando la superficie con ADN de, por ejemplo, esperma de salmón o timo de ternera. Sin embargo, la presencia de este ADN aumenta el potencial de hibridación inespecífica de los componentes del ensayo al soporte sólido y, por lo tanto, de que haya un mayor ruido de fondo. La substitución de estos ADN naturales con ADN sintéticos que contienen bases no naturales minimizará la hibridación no específica y la unión no
específica.

Preferiblemente, se prepararán estos polinucleótidos formando colas 3' de oligonucleótidos cortos con mezclas de nucleótidos por métodos bien conocidos en la técnica. Alternativamente, se pueden unir entre sí oligonucleótidos cortos, de secuencia casi aleatoria, que contienen nucleótidos no naturales para formar polinucleótidos. Se pueden usar ADN ramificados convenientemente para este fin. Por ejemplo, se puede preparar la secuencia de bloques -TNVN-F-TNVN-J-TNVN-, donde F es isoC y J es isoG, y unirla químicamente para formar un polímero. La ventaja de usar esta aproximación con respecto a la utilización de la aproximación de la formación enzimática de colas 3' es la eliminación de las secuencias de homopolímeros/homooligómeros.

Otra aplicación en la que halla uso la construcción de oligonucleótidos hibridantes que contienen unidades nucleotídicas no naturales es en el diseño de compuestos antisentido. Los compuestos antisentido, según se explica, por ejemplo, en Ching y col. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86: 10006-10010; Broder y col. (1990), Ann. Int. Med., 113: 604-618; Loreau y col. (1990), FEBS Letters, 274: 53-56, y Publicaciones PCT Nº WO91/11535, WO91/09865, WO91/04753, WO90/13641, WO91/13080 y WO91/06629, son oligonucleótidos que se unen al, e incapacitan o previenen la producción del, ARNm responsable de la generación de una proteína particular. Las moléculas antisentido convencionales son generalmente capaces de reaccionar con una variedad de especies oligonucleotídicas. Sin embargo, debido a su longitud (generalmente, secuencias oligonucleotídicas de hasta 30 unidades nucleotídicas), dichas moléculas antisentido presentan problemas asociados a la hibridación inespecífica con especies que no son blanco. Una solución es utilizar regiones cortas de hibridación entre múltiples sondas y el blanco; para reforzar el complejo global, se usan cortos "dominios de dimerización" entre las sondas, según describen Distefano y col. (1992), J. Am. Chem. Soc., 114: 1006-1007. Los dominios de dimerización pueden ser diseñados para tener colas con secuencias complementarias que contengan unidades nucleotídicas no naturales y así obtener una unión altamente eficiente y específica al analito blanco sin aumentar la hibridación inespecífica a los analitos que no son blanco. La idea queda ilustrada en la Figura 2 con un blanco de ADN de doble hélice.

Tal como se ilustra en la Figura 2, se puede usar el desplazamiento de hebra para separar el ADN de doble hebra. Las secuencias promotoras ricas en AT bajo estrés superhelicoidal, que son sensibles a la nucleasa S1 y son, por lo tanto, ya parcialmente de hélice sencilla, son un sitio particularmente preferido para este tipo de aplicación de antígenos. Se utilizarían oligonucleótidos cortos para maximizar la especificidad y se aumentaría su energía de unión al blanco uniéndolos entre sí para formar una red de oligonucleótidos.

En este constructo, las secuencias universales cortas, que no formarán pares de bases estables en ausencia de blanco, contienen isoC e isoG para limitar la hibridación inespecífica de las sondas con las secuencias humanas. Al unirse las sondas 1, 2 y 3 al blanco, las secuencias universales estarán en una proximidad lo suficientemente estrecha como para que su concentración efectiva aumente de manera significativa. Las secuencias universales se emparejarán entonces, dando lugar a un mayor aumento en la fuerza de la unión. También se pueden usar blancos de ARN junto con esta aproximación.

Se puede emplear el procedimiento SELEX, descrito en la Patente EE.UU. Nº 5.270.163 de Gold y col., Tuerk y col. (1990), Science, 249: 505-510; Szostak y col. (1990), Nature, 346: 818-822, y Joyce (1989), Gene, 82: 83-87, para seleccionar secuencias de ARN o de ADN que reconocen y se unen a una molécula blanco deseada en virtud de su forma. El término "aptámero" (o anticuerpo de ácido nucleico) es empleado aquí para referirse a dicha molécula de ADN de hebra sencilla o doble o de ARN de hebra sencilla. Véanse, por ejemplo, las Publicaciones PCT Nº WO92/14843, WO91/19813 y WO92/05285. Las "moléculas blanco", a diferencia de los "analitos blanco", incluyen polímeros tales como proteínas, polisacáridos, oligonucleótidos u otras macromoléculas y pequeñas moléculas tales como fármacos, metabolitos, toxinas o similares, a las que un aptámero está diseñado para unirse.

En el procedimiento SELEX, se construye un oligonucleótido en el que un n-mero, preferiblemente una secuencia aleatorizada de nucleótidos que forman así una "reserva aleatoria" de oligonucleótidos, está flanqueado por dos cebadores de reacción en cadena de polimerasa ("PCR"). Se pone entonces en contacto el constructo con una molécula blanco en condiciones que favorezcan la unión de los oligonucleótidos a la molécula blanco. Aquellos oligonucleótidos que se unen a la molécula blanco son: (a) separados de los oligonucleótidos que no se unen a la molécula blanco usando métodos convencionales, tales como filtración, centrifugación, cromatografía o similares; (b) disociados de la molécula blanco, y (c) amplificados usando tecnología convencional de PCR para formar una reserva de oligonucleótidos enriquecida en ligando. Se realizan más tandas de unión, separación, disociación y amplificación hasta obtener un aptámero con la afinidad de unión o la especificidad deseadas o ambas. La secuencia de aptámeros final identificada puede ser entones preparada químicamente o por transcripción in vitro. Al preparar dichos aptámeros, se substituyen pares de bases seleccionados con pares de bases no naturales para reducir la probabilidad de que los aptámeros se hibriden con ácidos nucleicos humanos.

Se puede usar la presente invención en al menos dos formas generales en SELEX. Primeramente, se pueden incluir isodG e isodC entre las secuencias en la reserva aleatoria de secuencias de ADN. El número de estructuras aleatorias posibles que pueden reconocer proteínas u otras biomoléculas importantes aumenta sintetizando hebras de ADN a partir de seis o más nucleótidos, más que a partir de los cuatro nucleótidos convencionales A, T, G y C. Esto a su vez mejora las posibilidades de identificar una secuencia que se une con mayor afinidad y/o especificidad a la molécula blanco.

En SELEX, las secuencias oligonucleotídicas conservadas seleccionadas pueden tener una hibridación no deseada con secuencias celulares. Esta hibridación no específica puede ser reducida usando bases no naturales en el proceso de selección. Los nucleótidos que no son reconocidos por las ARN y ADN polimerasas humanas, pero que son reconocidos por ciertas polimerasas de fagos o de bacterias, son particularmente útiles en esta aplicación.

Un segundo uso para la presente invención en el procedimiento SELEX es en la preparación de un constructo aptamérico final con hibridación inespecífica minimizada. Por ejemplo, se seleccionan aptámeros que muestran una afinidad de unión, especificidad u otras características de reconocimiento de moléculas blanco predeterminadas entre una reserva de secuencias de ARN o de ADN usando el procedimiento SELEX. Estas características de reconocimiento de moléculas blanco son determinadas por la estructura secundaria del aptámero que se mantiene, en parte, por la formación de complejos híbridos de oligonucleótidos intramoleculares. Al elucidar la estructura secundaria del aptámero, será obvio para un experto en la técnica que la especificidad de los pares de bases en determinados complejos híbridos intramoleculares es altamente preferida para mantener la estructura secundaria y, por lo tanto, las características de reconocimiento y de unión a las moléculas blanco del aptámero, es decir, que habrá pares de bases que sean preferiblemente G-C o A-T. Habrá otros pares de bases en estos complejos híbridos intramoleculares, por ejemplo, en la porción de emparejamiento de bases del bucle truncal, que puedan estar substituidos por cualquier par de nucleótidos complementarios, a los que se hace aquí referencia como pares de bases N-N', sin alterar la estructura secundaria del aptámero.

Una substitución simple de pares de bases N-N' seleccionados y de pares de bases G-C y C-G en el constructo aptamérico final con isoG-isoC o isoC-isoG reducirá la hibridación no específica con secuencias oligonucleotídicas que no son blanco. Como el par de bases isoC-isoG es isoenergético con el par de bases C-G, la forma básica de la molécula y la fuerza de las horquillas será muy similar. Sería deseable un par de bases isoenergético con A-U para substituir pares de bases en donde las secuencias vencedoras muestran una fuerte preferencia por A-U o U-A en comparación con C-G. Estas substituciones tienen el efecto de hacer que los aptámeros sean más específicos para la molécula blanco limitando su potencial de hibridación no deseada a secuencias de ARN y ADN celulares.

En el proceso básico, se substituyen pares de bases seleccionados con pares de bases isoC-isoG o isoG-isoC. En el constructo final, los pares de bases isoC-isoG pueden consistir en ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos. Se puede producir una molécula aptamérica quimérica (compuesta tanto por ribonucleótidos como por desoxirribonucleótidos) químicamente. Alternativamente, se pueden usar el ribo-isoGTP y el ribo-isoCTP (con protección 2' adecuada) para preparar el aptámero por transcripción in vitro de plantillas de ADN que contienen isoC e isoG.

Otras aplicaciones en las que la presente invención puede hallar utilidad incluyen hibridaciones in situ, reducción de la unión no específica en ensayos de hibridación y ensayos de reacciones en cadena de polimerasa (PCR).

La hibridación in situ carece de suficiente sensibilidad para detectar una sola molécula de analito blanco. La PCR in situ (véase, por ejemplo, Bagasra y col. (1993), J. Immunological Methods, 158: 131-145) ha sido desarrollada para cumplir con esta necesidad de sensibilidad; sin embargo, la cuantificación no es tan precisa con el método de la PCR. Una alternativa utilizaría múltiples sondas prolongadoras de marcaje para unirse al analito blanco. Los prolongadores de marcaje se unirían a preamplificadores o a amplificadores. Si se usan, los preamplificadores harían un puente entre los prolongadores y los amplificadores. Los amplificadores se unirían a sondas marcadas, que serían preferiblemente detectadas por luminiscencia (fluorescencia si la sensibilidad es lo suficientemente alta). Como antes, las secuencias universales, L-2/M-1 y M-2/L-3, consistirían en oligonucleótidos cortos que contienen de manera óptima entre un 15 y un 30% de isoC e isoG para reducir la hibridación no deseada a secuencias humanas. Se podría utilizar un cuarto par de bases para reducir aún más la representación de las bases naturales en estas secuencias.

Como se ha indicado anteriormente, se puede reducir la unión inespecífica, así como la hibridación inespecífica, usando pares de bases no naturales. Se podrían usar polímeros aleatorios o copolímeros de bloques casi aleatorios consistentes en 6-8 diferentes nucleótidos para reducir la unión inespecífica del amplificador y de las sondas marcadas a los constituyentes celulares que tienen alta afinidad por los polinucleótidos. Por lo tanto, se reduciría la unión inespecífica sin riesgo de aumentar la hibridación inespecífica introduciendo secuencias naturales de ternera o de salmón, como comúnmente se hace.

Un experto en la técnica reconocerá que se podría aplicar la misma estrategia a los ensayos de manchas, tales como transferencias de manchas, Southerns y Northerns, para reducir la hibridación inespecífica y la unión inespecífica de las sondas a los soportes sólidos.

La presente invención también encuentra varios usos en PCR y otras tecnologías de amplificación exponencial. Por ejemplo, en la PCR anidada, después de amplificar inicialmente el analito blanco y de diluirlo luego varios miles de veces, es común utilizar una proyección 5' en un cebador para captura y una proyección 5' en el otro cebador para marcaje. Se inserta un espaciador que no puede ser leído por la polimerasa de tal forma que las proyecciones siguen siendo de hebra sencilla (véase, por ejemplo, Newton y col. (1993), Nucl. Acids Res., 21: 1155-1162). Estas secuencias genéricas en estas proyecciones 5' pueden ser preparadas para que contengan pares de bases modificados con objeto de reducir la frecuencia de cebado sobre no-blancos. Ciertamente, se puede usar la presencia de isodC o de isodG en la primera base de la proyección 5' en lugar de los espaciadores actualmente utilizados; la polimerasa no puede leer isodC o isodG, ya que no tendrá isodGTP o isodCTP que poner en su lugar. Dado que la polimerasa puede poner T en el polímero a una baja frecuencia cuando detecta isodG en lo que fue el cebador, es preferible usar isoC como primera base en la proyección 5'.

Experimental

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique otra cosa, técnicas convencionales de química orgánica sintética, bioquímica, biología molecular y similares, que están dentro de los conocimientos en este campo. Dichas técnicas están totalmente explicadas en la literatura. Véanse, por ejemplo, Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición (1989); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames y S.J. Higgins, eds., 1984), y la serie Methods in Enzymology (Academic Press,Inc.).

En los ejemplos siguientes, se han hecho esfuerzos por asegurar la exactitud con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.), pero habría que considerar algún error experimental y alguna desviación. Se da siempre la temperatura en grados C y, a menos que se indique algo diferente, la presión es la atmosférica o próxima a ella.

Síntesis de isoguanosina o de 2'-desoxiisoguanosina

Se han descrito pocos procedimientos para la síntesis de isoguanosina o de 2'-desoxiisoguanosina. Por ejemplo, se ha sintetizado 2'-desoxiisoguanosina: 1) a partir de 2'-desoxiadenosina a través de 2'-desoxiadenosina-(N^{1}-óxido) por fotolisis directa en condiciones básicas (Switzer y col. (1993), antes citado); 2) a partir de 2-cloro-2'-desoxiadenosina por fotolisis directa en condiciones básicas (Seela y col. (1992), Helv. Chim. Acta, 75: 2298-2306), y 3) por una ruta química a partir de 6-amino-1-(2'-desoxi-beta-D-eritropentofuranosil)-1H-imidazol-4-carbonitrilo [2'-desoxinucleósido AICA], al cual se hizo reaccionar con isocianato de benzoílo, seguido de tratamiento con amoníaco para efectuar la hibridación del anillo de pirimidina (Kazimierczuk y col. (1991), Helv. Chim. Acta, 74: 1742-1748).

Sin embargo, como la conversión fotolítica del 2'-desoxiadenosina-(N^{1}-óxido) en 2'-desoxiisoguanosina no se presta con facilidad a ser llevada a escala, se desarrolló una ruta química conveniente a la 2'-desoxiisoguanosina a partir de materiales de partida de 2'-desoxirribonucleósidos de fácil disponibilidad.

Se han descrito varios procedimientos para la conversión de 2'-desoxiguanosina en nucleósido de 2,6-diaminopurina y nucleósido de N^{6}-alquil-2,6-diaminopurina a través de derivados de 2'-desoxiguanosina "convertibles", tales como O^{6}-fenil-2'-desoxiguanosina (MacMillan y col. (1991), Tetrahedron, 47: 2603-2616; Gao y col. (1992), J. Org. Chem., 57: 6954-6959, y Xu y col. (1992), Tetrahedron, 48: 1729-1740). Además, Fathi y col. (1990), Tetrahedron Letters, 31: 319-322, describieron una síntesis conveniente de O^{6}-fenil-2'-desoxiguanosina usando un procedimiento que implica el tratamiento de 2'-desoxiguanosina con anhídrido trifluoroacético/piridina, seguido de desplazamiento in situ con fenol. Alternativamente, la introducción de restos O^{6}-fenilo en la 2'-desoxiguanosina ha sido descrita por Reese y col. (1984), J. Chem. Soc., Perkin Trans., 1, 1263-1271, donde se trató el intermediario O^{6}-(4-toluensulfonil)-2'-desoxiguanosina con trimetilamina, seguido de fenol, para afectar al desplazamiento de O^{6}-(4-toluensulfonilo) para dar O^{6}-fenil-2'-desoxiguanosina. Se generó un compuesto de tipo isoguanosina a partir de ribonucleósido de 2-(metilmercapto)-6-aminopirazolopirimidina por S-oxidación, produciendo ribonucleósido de 2-(metilsulfonil)-6-aminopirazolopirimidina, seguido de desplazamiento con NaOH para obtener el análogo isoguanosina (Cottam y col. (1983), Nucleic Acids Research, 11: 871-882).

Se ha descrito la transformación del grupo 2-amino de la guanosina y de la 2'-desoxiguanosina utilizando nitritos de alquilo. Estos métodos incluyen la conversión a 2-halo (Nair y col. (1982), Synthesis, 670-672) y ribonucleósido de 2-(metilmercapto)-6-cloropurina (Trivedi (1991), en Nucleic Acid Chemistry, Townsend y col. (eds.), Wiley Inter-Science, Parte 4, 269-273) en reacciones de radicales. Se ha descrito la oxidación de la O^{6}-(p-nitrofeniletil)-3', 5'-O-di-t-butildimetilsilano-2'-desoxiguanosina con nitrito de pentilo neto para obtener O^{6}-(p-nitrofeniletil)-3',5'-O-di-TBDMS-2'-desoxixantosina (Steinbrecher y col. (1993), Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 32: 404-406).

Se ha descrito un procedimiento para la síntesis de 2'-desoxiisoguanosina en Seela y col. (1994), Helv. Chim. Acta, 77: 622-30. En una primera etapa, se convirtió 2'-desoxiguanosina en 2-amino-2'-desoxiadenosina. En una segunda etapa, se desaminó la 2-amino-2'-desoxiadenosina por diazotización del grupo 2-amino con nitrito de sodio para dar 2'-desoxiisoguanosina.

El método aquí descrito y reivindicado para sintetizar un compuesto que tiene la fórmula estructural:

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donde R^{1} es seleccionado entre el grupo consistente en hidrógeno, hidroxilo, sulfhidrilo, halógeno, amino, alquilo, alilo y -OR^{2}, donde R^{2} es alquilo, alilo, sililo o fosfato, consiste en:

a) hacer reaccionar un compuesto que tiene la fórmula estructural

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con un reactivo adecuado para proteger los grupos hidroxilo tanto 3' como 5';

b) hacer reaccionar el producto de la etapa (a) con un reactivo adecuado para convertir el resto O^{6}-oxi en un grupo funcional que sea susceptible de desplazamiento nucleofílico, produciendo así un resto O^{6} funcionalizado;

c) oxidar el grupo 2-amino del producto de la etapa (b);

d) hacer reaccionar el producto de la etapa (c) con un reactivo nucleofílico para desplazar el resto O^{6} funcionalizado, y

e) hacer reaccionar el producto de la etapa (d) con un reactivo adecuado para desproteger los grupos hidroxilo 3' y 5' protegidos.

Se puede efectuar la conversión de guanosina o de 2'-desoxiguanosina en isoguanosina o 2'-desoxiisoguanosina, respectivamente, protegiendo los grupos hidroxilo del resto de azúcar usando un reactivo adecuado, por ejemplo TBDMS, cloruro de benzoílo, anhídrido acético o similar. Como se ha indicado con anterioridad, se pueden substituir uno o más de los grupos hidroxilo del resto de azúcar por halógeno o grupos alifáticos, o se pueden funcionalizar como éteres, aminas o similares. Se aísla el producto y se modifica el O^{6} de tal forma que pueda ser desplazado por un nucleófilo adecuado. Como ejemplos de tales grupos desplazables se incluyen, por ejemplo, CH_{3}-S-C_{6}H_{4}-O^{6}-, C_{6}H_{5}-SO_{2}-O^{6}-, C_{6}H_{5}-O^{6}-, 4-nitro-C_{6}H_{4}-O^{6}-, 2,4,6-trinitro-C_{6}H_{2}-O^{6}- o similar. El grupo 2-amino es entonces transformado en la función oxi usando un nitrito de alquilo u otro agente adecuado, tal como se conoce en la técnica (véanse Nair y col. (1982), antes citado; Trevidi (1991), antes citado, o Steinbrecher y col. (1993), antes citado). El producto reacciona con un nucleófilo adecuado, por ejemplo NH_{4}OH, u otro aminoalquilo, aminoarilo, aminoheteroalquilo o aminoheteroarilo que contiene un terminal -NH_{2}, -SH, -COOH o similar, desplazando así el grupo saliente O^{6} modificado. La desprotección de los grupos hidroxilo protegidos puede ser efectuada por tratamiento con, por ejemplo, base o fluoruro.

En la siguiente discusión, el O^{6}-(4-metiltiofenilo) servirá como grupo desplazable ejemplar. Sin embargo, su uso tiene el fin de describir realizaciones particulares solamente y no pretende ser limitante.

Los derivados de isoguanosina N^{6}-alquilados pueden ser fácilmente sintetizados usando una alquilamina como nucleófilo. Por ejemplo, se puede usar hexanodiamina para desplazar el O^{6}-(4-metiltiofenilo) y formar N^{6}-(6-aminohexil)isoguanosina. La protección del grupo aminohexilo (por ejemplo, como derivado trifluoroacetamido) y la posterior conversión en un reactivo de fosforamidita proporciona un análogo de isoguanosina funcionalizable que puede ser incorporado en cualquier posición en un oligonucleótido para posterior derivatización post-síntesis. Así, sería posible marcar específicamente el resto isoguanosina de pares de bases isoguanosina/isocitidina seleccionados. También sería posible sintetizar una serie de derivados N^{6} de isoguanosina que lleven cualquier funcionalidad deseada simplemente desplazando el grupo O^{6}-(4-metiltiofenilo) con un nucleófilo adecuadamente terminado; por ejemplo, se pueden preparar fácilmente derivados -COOH, -SH, -NH_{2} o similares.

Más aún, la O^{2}-(4-metiltiofenil)-2'-desoxixantosina, en su forma de fosforamidita totalmente protegida (O^{2}-(4-metiltiofenil)-5'-O-DMT-3'O-(BCE-diisopropil-fosforamidita)-2'-desoxixantosina), puede ser usada como derivado convertible después de la incorporación a un oligonucleótido. El desplazamiento post-síntesis del O^{2}-(4-metiltiofenilo) de la O^{2}-(4-metiltiofenil)-2'-desoxixantosina con una alquildiamina u otra alquilamina funcionalizada, produce oligonucleótidos que contienen N^{6}-(aminoalquil)-2'-desoxiisoguanosina. La isoguanosina derivatizada puede servir como sitio para la introducción de un marcaje o de otra molécula informadora específicamente en el residuo de isoguanosina funcionalizado.

Esquema de aproximación sintética. Como se describe en el Esquema 1, se consiguió la síntesis de 2'-desoxiisoguanosina en cinco etapas partiendo de 2'-desoxiguanosina como sigue:

1) conversión de 2'-desoxiguanosina a 3',5'-O-(t-butildimetilsilil)_{2}-2'-desoxiguanosina (Ogilvie y col. (1973), Can. J. Chem., 51: 3799-3807), con purificación por recristalización;

2) conversión a O^{6}-(4-toluensulfonil)-3',5'-O-TBDMS_{2}-2'-desoxiguanosina;

3) desplazamiento del grupo 4-toluensulfonilo en O^{6} con un fenol adecuado, por ejemplo 4-(metiltio)-fenol o pentaclorofenilo, usando el procedimiento de Reese para obtener O^{6}-(4-(metiltio)fenil)-3',5'-O-TBDMS_{2}-2'-desoxiguanosina (Reese y col. (1984), antes citado);

4) oxidación del grupo 2-amino a la función oxi con nitrito de terc-butilo en condiciones neutras, para obtener O^{6}-(4-(metiltio)fenil)-3',5'-O-TBDMS_{2}-2'-desoxixantosina (Steinbrecher y col. (1993), antes citado), y

5) desplazamiento del grupo O^{2}-(4-metiltiofenilo) con hidróxido de amonio a temperatura elevada, para obtener 3',5'-O-TBDMS_{2}-2'-desoxiisoguanosina.

La síntesis de isoguanosina a partir de guanosina puede ser efectuada usando un esquema de reacción similar.

Esquema 1

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Esquema 1 (continuación)

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Esquema 1 (continuación)

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Esquema 1 (continuación)

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El material obtenido era idéntico en todos los sentidos (TLC, HPLC, UV y RMN) a una muestra auténtica preparada mediante una ruta fotolítica publicada (Switzer y col. (1993), antes citado).

Preparación de derivados de isocitidina o de 2'-desoxiisocitidina

Se pueden preparar derivados de isocitidina o de 2'-desoxiisocitidina en los que el enlace glicosídico está estabilizado frente a la exposición a ácido diluido durante la síntesis de oligonucleótidos. Se han descrito derivados N^{2}-amidina para la 2'-desoxiadenosina, por ejemplo, por parte de McBride y col. (1986), J. Am. Chem. Soc., 108: 2040-2048; Froehler y col. (1983), Nucleic Acids Res., 11: 8031-8036, y Pudlo y col. (1994), Biorg. Med. Chem. Lett., 4: 1025-1028. Se sintetizó N^{2}-(N,N-di(X)formamidino)-2'-desoxiisocitidina por el siguiente procedimiento. Tal y como se ejemplifica aquí, X es n-butilo. Sin embargo, X puede ser alquilo C_{2}-C_{10}, arilo, heteroalquilo, heteroalquilo o similar.

Se sintetizó N-di-n-butilformamida dimetilacetal por transaminación de N,N-metilformamida dimetilacetal con di-n-butilamina según describen McBride y col. (1986), antes citado; Froehler y col. (1983), antes citado, y Pudlo y col. (1994), antes citado. Se suspendieron 10 mmol de 2'-desoxi-5-metilisocitidina en 100 ml de metanol y se añadieron 10 mmol de N,N-di-n-butilformamida dimetilacetal. Después de 2 horas a temperatura ambiente con agitación, se produjo como resultado una solución transparente. El análisis de cromatografía en capa fina en sílice 60H revelada usando metanol al 10% en cloruro de metileno indicó que el material de partida se había consumido por completo. Se añadió agua (10 ml) para destruir el exceso de reactivo y se eliminaron los solventes a vacío, para obtener 3,8 gramos de N^{2}-(N,N-dibutilformamidino)-2'-desoxiisocitidina. Se puede convertir directamente este derivado en 5'-O-DMT-N^{2}-(N,N-dibutilformamidino)-2'-desoxiisocitidina para incorporación aoligonucleótidos.

Se pueden preparar otros derivados de isocitidina que proporcionan substituyentes funcionalizables mediante los cuales se pueden incorporar marcajes detectables en una posición específica de un oligonucleótido. Por ejemplo, han sido descritos derivados de 2'-desoxiuridina 5-alquilados, por ejemplo la 5-[N-(6-trifluoroacetilaminohexil)-3-(E)acrilamido]-2'-desoxiuridina, por Ruth (1991), Oligodeoxynucleotides with Reporter Groups Attached to The Base, en Eckstein (ed.), Oligonucleotides and Analogues, IRL Press, p. 255-282. Dichos derivados de posición 5 han resultado no obstruir los patrones de hibridación de pares de bases. La química descrita por Ruth puede ser usada para sintetizar 5-[N-(6-trifluoroacetil-aminohexil)-3-(E)acrilamido]-2'-desoxiisocitidina, obteniéndose así una isocitidina funcionalizada que puede ser marcada de un modo detectable en pares de bases isoguanosina*isocitidina seleccionados.

Éstos y otros derivados de posición 5 de la isocitidina y de la 2'-desoxiisocitidina proporcionan una estabilización adicional para la formación de pares de bases. Dichos derivados incluyen: 5-\beta-propinilo (véase Froehler y col. (1993), Tetrahedron Lett., 34: 1003-1006), 5-\beta-propenilo u otros derivados 5-alquil-isocitidina o 2'-desoxiisocitidina.

Los kits para llevar a cabo los ensayos de hibridación de ácidos nucleicos según la invención consistirán en una combinación empaquetada de al menos una sonda oligonucleotídica hibridante, un segmento de la cual es capaz de formar un complejo híbrido con el analito, y un medio para detectar el complejo híbrido, donde al menos una sonda oligonucleotídica hibridante contiene una primera unidad nucleotídica que, en condiciones en las cuales se forman pares de bases A-T y G-C, no formará con efectividad pares de bases con la adenosina (A), la timidina (T), la citidina (C), la guanosina (G) o la uridina (U). Los reactivos estarán típicamente en recipientes separados en el kit. El kit puede también incluir un reactivo desnaturalizante para desnaturalizar el analito, tampones de hibridación, soluciones de lavado, substratos enzimáticos, controles negativos y positivos e instrucciones escritas para llevar a cabo el
ensayo.

Los polinucleótidos de la invención pueden ser montados usando una combinación de síntesis de oligonucleótidos directa en fase sólida, métodos de ligadura enzimática y síntesis química en fase de solución, según se describe con detalle en la Patente EE.UU. de asignación común Nº 5.849.481.

Todas las síntesis químicas de oligonucleótidos pueden ser llevadas a cabo en un sintetizador de ADN automático (Perkin Elmer/Applied Biosystems Division, modelo 380 B). Se utilizó la química de la fosforamidita del tipo \beta-cianoetilo, incluyendo la fosforilación 5', que empleaba reactivo PHOSTEL™ (DMT-O-CH_{2}CH_{2}-(SO_{2})-CH_{2}CH_{2}-O-P(N(iPr)_{2})(-O-CH_{2}CH_{2}CN), donde DMT es dimetoxitritilo e iPr es isopropilo). Se emplearon los protocolos estándar del fabricante, a menos que se indique algo diferente.

Ejemplo 1 Ruido de fondo del ensayo provocado por la hibridación no específica de secuencias prolongadoras específicas del blanco con componentes genéricos del ensayo

Con objeto de determinar cómo el ruido de fondo del ensayo puede estar producido por la hibridación cruzada de secuencias prolongadoras específicas del blanco con componentes genéricos del ensayo, se realizó un ensayo de hibridación de ADN amplificado para cuantificar el fago M13 usando las reservas de prolongadores de captura y los prolongadores de marcaje, según se muestra en las Tablas 1, 2 y 3.

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Con fines ilustrativos, un espacio separa la región de que no se une al blanco 3' de la región de unión al blanco de cada sonda.

Se llevó a cabo el ensayo esencialmente como se describe en la Publicación PCT Nº WO95/16055. Resumiendo, después de hibridar durante la noche a 63ºC en pocillos de microtitulación que contenían sondas de captura complementarias a la región que no se une al blanco de los prolongadores de captura, se enfriaron las placas a temperatura ambiente durante 10 min., se lavaron dos veces con un tampón que contenía SSC 0,1x (NaCl 15 mM, citrato de sodio 1,5 mM, pH 7,0)y dodecilsulfato de sodio al 0,1%. Se añadió a los pocillos un amplificador de ADN ramificado 15 x 3 (15 "brazos" cada uno con 3 sitios de unión a sondas de fosfatas alcalina) (100 fm) complementario a la región que no se une al blanco 3' del prolongador de marcaje y se continuó con la incubación durante 30 min. a 53ºC, después de lo cual se enfriaron las placas y se lavaron como antes. Después de añadir una sonda de fosfatasa alcalina (200 fm) a los pocillos y de posterior incubación durante 15 min. a 53ºC, se enfriaron de nuevo las placas y se lavaron como antes. Se hicieron tres lavados adicionales con un tampón SSC 0,1x. Se detectaron las señales en un luminómetro Chiron después de 20 min. en la solución de substrato de fosfato de dioxetano Lumiphos 530 (Lumigen). En la Tabla 4 se muestran los resultados.

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La adición de los prolongadores de captura de la reserva B no aumenta la señal neta, pero sí aumenta el ruido aproximadamente cien veces. El análisis por ordenador de las secuencias implicadas mostró que el prolongador de captura #8 de la reserva B tiene una extensa homología con la secuencia T20-LLA2 del amplificador de ADN ramificado (incluyendo un oligo(dA)-oligo(dT) 9-mero), mientras que el prolongador de captura #9 de la reserva B tiene una extensa homología con la secuencia BLA3c del amplificador de ADN ramificado.

La presente invención aborda el problema del ruido de fondo de los ensayos dependientes de hibridación. Se construyen secuencias nucleotídicas que están interrumpidas por nucleótidos que no forman pares de bases estables con nucleobases "naturales", inhibiendo así la hibridación de dichas secuencias con las secuencias naturales. De forma ideal, cada tercera o cuarta base de la secuencia universal sería un nucleótido modificado que no se empareja con A, C, G o T(U). Utilizando pares de bases isoenergéticos con el par de bases C*G, se puede reducir también la longitud de las secuencias universales. Los argumentos estadísticos muestran que esto debería reducir también la frecuencia de hibridación cruzada no deseable entre secuencias universales y entre secuencias universales y secuencias no-blanco en la muestra y entre secuencias universales y las secuencias específicas de blanco de las sondas prolongadoras. Basándose en la unión multidentada para formar híbridos estables, se pueden reducir aún más las longitudes de las secuencias universales (véase WO95/16055). Todas las secuencias universales estarían diseñadas con al menos 6, y preferiblemente 8, nucleótidos: sonda de captura, colas prolongadoras de captura, colas prolongadoras de marcaje, amplificadores, sondas marcadas y preamplificadores (cuando sea aplicable).

Ejemplo 2 Especificidad y fuerza de los pares de bases isoC-isoG

Con objeto de determinar la especificidad y la fuerza del par de bases isoC-isoG, se hizo un análisis de fusión térmica sobre los siguientes oligonucleótidos:

1) 5'(L) CA CCA CTT TCT CC (T) 3' [SEC ID Nº: 25],

2) 5'(L) CA CFA CTT TCT CC (T) 3' [SEC ID Nº: 26],

3) 3'(T) GT GGT GAA AGA GG 5' [SEC ID Nº: 27],

4) 3'(T) GT GJT GAA AGA GG 5' [SEC ID Nº: 28] y

5) 5' CA CTA CTT TCT CC (T) 3' [SEC ID Nº: 29].

El núcleo híbrido de estos oligonucleótidos consiste en trece nucleótidos. Los nucleótidos no implicados en el emparejamiento de bases están indicados entre paréntesis. L = una amina primaria, F = isoC, J = isoG. Se hizo el análisis de fusión térmica en un Espectrofotómetro Cary 3E en SSC 3x (NaCl 0,45 M, citrato de sodio 0,045 M), pH 7,9. Cada uno de los dos oligonucleótidos incubados conjuntamente estaba presente a aproximadamente 1,5 \muM. Se calculó la T_{m} como el máximo en un gráfico de dA_{260}/dT frente a la temperatura. Los resultados mostrados en la Tabla 4 indican que el par de bases isoC*isoG es isoenergético con el par de bases natural C*G.

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En consecuencia, las secuencias universales que contienen C, G, isoC, isoG, A y T aproximadamente equimolares pueden ser más cortas que las secuencias que contienen sólo A, T, C y G en proporciones aproximadamente iguales. Esto limita el potencial de reactividad cruzada con secuencias no-blanco naturales en la muestra y con secuencias de unión a blanco LE y CE, que están más o menos restringidas a estar compuestas por A, T(U), C y G.

Los datos también muestran la especificidad del par de bases isoC*isoG. Los pares isoC*G e isoG*C se comportan como emparejamientos erróneos. Así, se predeciría que se produciría un cambio de aproximadamente 7,5ºC en T_{m} para 1 emparejamiento erróneo en 13 nucleótidos (7,5% de malemparejamiento). El cambio observado de 8ºC cuando se comparan los emparejamientos C*G o isoC*isoG con los malemparejamientos es similar al cambio que se produciría en un malemparejamiento medio con código de A, T, C y G.

IsoG existe en al menos dos formas tautoméricas, la ceto y la enol. La forma ceto está favorecida en solventes acuosos y la enol está favorecida en solventes orgánicos (Sepiol y col. (1976), Zeitschrift fuer Naturforschung, 31C: 361-370). El tautómero enol de isoG puede formar, en principio, dos enlaces de hidrógeno con dT, haciéndolo análogo al par de bases A*T. Si el tautómero enol estuviera presente a niveles significativos en el tampón de hibridación, la especificidad del par de bases isoC*isoG estaría limitada. Sin embargo, la T_{m} observada en el malemparejamiento isoG*T era de 53ºC, esencialmente la misma que en los otros malemparejamientos.

Estos datos apoyan la conclusión de que el tautómero enol está presente a una concentración muy baja en SSC 3x a pH 7,9, o, si está presente, aún forma un híbrido con una T_{m} 7-8ºC menor que el híbrido isoC-isoG. El control con un malemparejamiento G*T tenía una T_{m} de aproximadamente 49ºC. Ésta es algo inferior a lo esperado para el par erróneo medio G*T, pero está próxima a la del par erróneo isoG-T.

Un experto en la técnica apreciará que el tener aún otra combinación de emparejamiento de bases (es decir, 8 bases, 4 pares), ya sea isoenergética con C*G o no, mejoraría todavía más la especificidad del emparejamiento de bases entre secuencias universales. En este caso, se podría casi eliminar A, T, C y G de las secuencias universales. Sin embargo, el tener una pequeña representación de estas bases se suma a la diversidad de la librería de posibles secuencias universales, lo que permite diseñar secuencias universales que son todo lo no interaccionantes posible entre sí.

Por ejemplo, con un código de 4 bases, se pueden diseñar sólo dos pares de 15-meros universales que no tienen ni siquiera un solo híbrido cruzado 3-mero. Es decir, con la adición de un tercer par de secuencias 15-meras, ha de haber al menos algunos híbridos cruzados de 3 nucleótidos. Con un código de seis bases, se pueden diseñar 8 pares de secuencias 15-meras sin ni siquiera un tipo Watson-Crick 3-mero de híbrido cruzado. Con un código de ocho bases, se pueden diseñar 19 de tales pares de 15-meros.

Ejemplo 3 Efecto del pH sobre el emparejamiento de bases isoC*isoG

Con objeto de examinar el comportamiento del par de bases isoC*isoG en función del pH, se realizó el análisis de T_{m} de los oligonucleótidos que aparecen en el Ejemplo 2. Se determinó el efecto del pH sobre la T_{m} de los oligonucleótidos que contenían el par de bases complementarias isoC*isoG (secuencias 2 y 4, respectivamente) y el par de bases C*G (secuencias 1 y 3, respectivamente) (n = 2 ó 3) a 0,5 M de sal y aproximadamente 1,5 \muM de oligonucleótido y en la Tabla 5 se muestran los resultados.

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En general, los híbridos de oligonucleótidos son estables a pH 5 y a pH 10. Por debajo de pH 5, C y A se protonan, mientras que, por encima de pH 10, G y T comienzan a perder sus protones imino. Por lo tanto, por debajo de pH 5 y por encima de pH 10, los híbridos de ácidos nucleicos muestran una estabilidad reducida. Los datos de la Tabla 2 muestran que el par de bases isoC*isoG tiene una estabilidad normal en ácido. Sin embargo, tanto el híbrido isoC*isoG como el híbrido G*C muestran un cambio anormal de -9ºC en la T_{m} a lo largo de un aumento de pH de 1,6 unidades. Esto es probablemente debido a su muy corta longitud.

Teóricamente, se podrían seleccionar híbridos con aún mayor sensibilidad al pH usando el protocolo SELEX, descrito en la Patente EE.UU. Nº 5.270.163 de Gold y col.; en Tuerk y col. (1990), Science, 249: 505-510; en Szostak y col. (1990), Nature, 346: 818-822, y en Joyce (1989), Gene, 82: 83-87, en donde se seleccionaría una población de randómeros de ADN o de ARN en cuanto a la unión a pH neutro y en cuanto a la disociación de la secuencia blanco a pH débilmente alcalino o débilmente ácido. Después de la amplificación, se repetiría iterativamente el proceso de selección. Después de la iteración final, se clonarían y secuenciarían aquellos oligómeros que muestren la sensibilidad deseada al pH. Se sintetizarían esas secuencias y se seleccionarían las que funcionaran mejor en un ensayo competitivo directo.

La labilidad en base débil puede ser explotada en el formato de ensayo de ADN amplificado actual para reducir el ruido de fondo del ensayo. En la etapa final, el tampón substrato usado tiene típicamente un pH de 9,5 a 10,5. Con una sonda de captura con la labilidad a base apropiada, el blanco se desprenderá de la superficie y podría ser detectado en otro pocillo. El fondo quedará atrás. La minimización de la unión de los prolongadores de captura al soporte por los métodos descritos en WO95/16055 reducirá el ruido de fondo causado por la liberación de moléculas unidas de forma no específica a las sondas de captura a través de los prolongadores de captura.

Dado que no se desearía liberar sondas de fosfatasa alcalina hibridadas con amplificadores unidos de manera no específica, preferiblemente se seleccionarían los híbridos sonda de captura-prolongador de captura para que tuvieran una labilidad a bases considerablemente mayor (es decir, mayor T_{m} a un pH dado) que los híbridos de amplificador y sonda marcada y de amplificador y prolongador marcado. Alternativamente, el híbrido L-2/M-2 de la Figura 1 podría ser el híbrido lábil a bases. En cualquier caso, el híbrido M-2/L-3 debe ser el más estable; de otro modo, se liberaría la sonda marcada hibridada con el amplificador unido de manera no específica.

Tal como se ha indicado con anterioridad, sería también posible transferir el blanco liberado a pocillos frescos para la lectura. Sin embargo, sería preferible leer la solución liberada en el pocillo en el que se generó. Esto evitaría etapas de pipeteo adicionales y eliminaría la imprecisión asociada a etapas de transferencia de líquidos adicionales. Existen varios métodos por los cuales se pueden evitar las transferencias de pocillo, según se describe a continuación.

Para aumentar aún más la especificidad del ensayo, se podría acoplar la liberación específica del blanco con el enmascaramiento del fondo sobre la superficie. En este caso, sería innecesaria la transferencia a otro soporte. Por ejemplo, se podría revestir la superficie del soporte sólido con inhibidores de la sonda marcada y/o varios inhibidores de la luminiscencia, absorbedores o apagadores. Un revestimiento de superficie actualmente en uso es la poli(phe-lys). La fenilalanina es un conocido inhibidor de la fosfatasa alcalina, un marcaje enzimático particularmente preferido. Se podrían incluir en el revestimiento peptídico polimérico otros inhibidores de la fosfatasa alcalina, tales como triptófano y cisteína. Como ejemplos de inhibidores luminiscentes se incluyen compuestos con bajos rendimientos cuánticos, es decir, cualquier compuesto que emita preferiblemente calor más que luz después de ser excitado por colisión con un dioxetano desfosforilado.

Existen al menos otras dos formas convenientes para hacer que la detección de la solución liberada sea más selectiva con objeto de evitar la transferencia del blanco liberado a otro pocillo. Las señales asociadas al blanco pueden ser leídas en solución haciendo que la fase sólida sea inaccesible a los reactivos de visualización o enmascarando las reacciones de generación de señales que se producen sobre el soporte sólido. Se podría hacer el aislamiento de la fase sólida de las posteriores etapas de visualización añadiendo un aceite inmiscible más pesado que el agua al recipiente de reacción. Este aceite cubriría el fondo del recipiente, permitiendo al mismo tiempo que la solución de interés flotara hacia la parte superior. Para la simple detección colorimétrica por medición visual o por reflectancia, se podría añadir una substancia opaca al aceite para servir como fondo neutro para la visualización.

Para la detección quimioluminiscente, se podría rellenar el aceite con una substancia ópticamente opaca. Si se usara un sólido blanco, tal como dióxido de titanio, la luz emitida por la capa acuosa flotante se reflejaría hacia arriba hacia fuera del recipiente para la detección. También se podría usar un sólido obscuro o una molécula de tinte disueltos en el aceite para enmascarar la fase estacionaria. Incluso si la solución de aceite no aísla por completo la fase sólida de los reactivos de visualización, los sólidos suspendidos o los tintes disueltos bloquearían la transmisión de esta luz desde la superficie.

Es también posible poder colorear una fase estacionaria con un tinte que bloqueara la emisión de la luz por las reacciones que se producen cerca de su superficie. Esto sería particularmente conveniente con una perla coloreada como fase sólida contenida en un pocillo opaco.

Ejemplo 4 Efecto de la sal sobre el par de bases isoC*isoG a pH neutro y alcalino

Con objeto de examinar el comportamiento del par de bases isoC*isoG en función de la concentración salina, se realizó un análisis de T_{m} de los oligonucleótidos del Ejemplo 2. Se determinó el efecto de la concentración salina sobre la T_{m} de los oligonucleótidos que contenían el par de bases complementarias isoC*isoG (secuencias 2 y 4, respectivamente) y el par de bases complementarias C*G (secuencias 1 y 3, respectivamente) (n = 3) a pH 7,9 ó 9,5 y a aproximadamente 1,5 \muM de oligonucleótido y en la Tabla 7 se muestran los resultados.

De manera clásica, los polinucleótidos muestran un cambio de aproximadamente 16-17ºC en la T_{m} para cada cambio log en la concentración salina. Los oligonucleótidos muestran con frecuencia una dependencia algo reducida de la sal. El cambio de 10-11ºC en la T_{m} por cambio log en la sal a pH 7,9 calculado para el híbrido isoC*isoG se aproxima a lo que se esperaría para un 13-mero. Sin embargo, el cambio a pH 9,5 de sólo 3ºC aproximadamente para el híbrido isoC*isoG y de 5 grados para el híbrido C*G por cambio log en la sal era sorprendentemente bajo.

Esto puede ser explotado en una liberación específica del blanco. En general, se usa poca sal para la liberación específica del blanco. Desafortunadamente, se libera también con frecuencia una significativa fracción del fondo.

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Debido a la independencia de la sal de la fusión del par de bases isoC*isoG a pH débilmente alcalino, no se obtiene ninguna ventaja adicional de la reducción de la sal, así del aumento del pH. Por lo tanto, se puede usar una alta concentración de sal (lo cual es también preferido para la fosfatasa alcalina) para la liberación y para minimizar la liberación del fondo.

Tal como se explicó en el Ejemplo 3, se podría usar el procedimiento SELEX para hallar secuencias de ADN o de ARN que muestren una mayor independencia de la sal en su fusión a cualquier pH seleccionado.

Ejemplo 5 Efecto del emparejamiento erróneo de los pares de bases sobre la hibridación

Los ejemplos anteriores mostraban que un oligómero con isoG forma pares de bases específicamente con su complementario que contiene isoC. El oligómero que contiene isoG se desestabiliza en aproximadamente 7-8ºC cuando se hibrida con otro oligómero que contiene un solo malemparejamiento isoG*T o isoG*C. Típicamente, hay una reducción de aproximadamente diez veces en la unión por cada 10ºC de cambio en la T_{m}.

Se valoró el efecto del emparejamiento erróneo de dos bases sobre la unión de un híbrido 13-mero usando las sondas mostradas en la Tabla 8.

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\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  \begin{minipage}[t]{145mm}  ^{1}  F  =   iso C,  J  =
 iso G, FOSF. ALC.  =  fosfatasa alcalina y X = una secuencia
espaciadora que contiene una amina para unión al soporte
sólido.\end{minipage} \cr}

La sonda marcada 32, el conjugado de oligonucleótido y fosfatasa alcalina, fue preparada como se ha descrito (Urdea y col. (1988), Nucl. Acids. Res., 16: 4937-4955). La sonda marcada 32 fue hibridada con la sonda control 30 para crear fosf. alc.-sonda 30*32. La sonda marcada 32 fue hibridada con la sonda modificada 31 para crear isoC,isoG-fosf. alc.-sonda 31*32.

Se unió la sonda 35, la sonda de captura, a pocillos de microtitulación según se ha descrito (Publicación PCT Nº WO93/13224, cuya descripción es aquí incorporada como referencia) para crear un soporte sólido para hibridación. Se hibridó la sonda 34, un prolongador de captura, con la sonda 35. Este prolongador de captura es complementario de fosf. alc.-sonda 30*32 y parcialmente complementario de fosf. alc.-sonda 31*32. La sonda 33 es un "competímero" que puede unirse al prolongador de captura y bloquear la unión de cualquiera de las sondas de fosfatasa alcalina.

Se realizaron las siguientes incubaciones durante 30 min. a 53ºC en NaCl aproximadamente 1,0 M:

(1) 250 fmoles de sonda 34 en pocillos que contenían 1 pmol de sonda 35 inmovilizada;

(2) 250 fmoles de sonda 34 + 5 pmoles de sonda 33 en pocillos que contenían 1 pmol de sonda 35 inmovilizada;

(3) 5 pmoles de sonda 33 en pocillos que contenían 1 pmol de sonda 35 inmovilizada, y

(4) sólo tampón.

Después de 2 lavados con SSC 0,1x, 0,1% de SDS, según se define en el Ejemplo 1, se expuso cada una de las primera incubaciones anteriores a una segunda incubación de 15 min. en las mismas condiciones con cada uno de los siguientes:

(1) 25 fmoles de sonda 30 + 500 attomoles de sonda 32;

(2) 25 fmoles de sonda 31 + 500 attomoles de sonda 32;

(3) 500 attomoles de sonda 32, y

(4) sólo tampón.

Se lavaron las placas como antes dos veces y tres veces con el mismo tampón suplementado con MgCl_{2} 10 mM, ZnCl_{2} 1 mM, 0,1% de Brij-35. Al cabo de 25 min. de incubación con Lumiphos Plus (Lumigen), se leyeron las placas en un luminómetro Chiron.

Los híbridos que pueden formarse están representados en la Figura 3, donde Z, aquí ejemplificado por isoC e isoG, representa un nucleótido no natural. La sonda 33, el competímero, puede formar 21 pares de bases con el prolongador de captura y, en teoría, puede bloquear la unión de ambas sondas de fosfatasa alcalina. La sonda modificada*sonda marcada (31*32) puede hibridarse con el prolongador de captura, formando 11 pares de bases y dos emparejamientos erróneos (por ejemplo, G*isoC,isoG*T). La sonda control*sonda marcada (30*32) puede formar 13 pares de bases con el prolongador de captura.

Tal como se muestra en la Tabla 8, el prolongador de captura (34) forma un fuerte híbrido con la sonda control*sonda marcada (30*32) (Muestra 1 = 399 unidades de luz relativas ("RLU")). La preincubación del prolongador de captura con 20 veces de exceso molar de competímero, muestra 2, redujo este ruido de fondo aproximadamente diez veces (30 RLU). La sonda modificada*sonda marcada (31*32) muestra 40 veces menos hibridación (muestra 3 = 9 RLU) con el prolongador de captura que la sonda control*sonda marcada (30*32). Los dos emparejamientos erróneos respondían de un cambio de 40 veces en la hibridación. Esto es lo esperado para 2 malemparejamientos, cada uno de los cuales desestabiliza la T_{m} en 7-8ºC (cf. 7x8 = 56 veces). El uso del competímero y de la sonda de fosf. alc. malemparejada (muestra 4 = 0,4 RLU) redujo el ruido de fondo aproximadamente 1.000 veces. La muestra 5 es un control y esencialmente no tiene ruido de fondo (0,1 RLU). Esto es lo esperado, ya que la sonda marcada 32 no tiene homología detectable con el prolongador de captura.

25

\hskip0.2cm

^{1}RLU = Unidades de luz relativas.

\hskip0.2cm

^{2}%CV = S.D./Media x 100.

En los ensayos de hibridación, el uso de competímeros para todos los prolongadores de captura es impráctico, ya que hay típicamente 5-10 prolongadores de captura por ensayo. Además, este ejemplo muestra que la preincubación con el competímero no era tan eficaz como la simple utilización de un 15% de substitución de bases (con isoC, isoG), por ejemplo 2 bases de 13, en las secuencias universales. Se esperaría que el uso de un 30% de substitución de bases (3 de 10) redujera la hibridación inespecífica de un complementario por lo demás de bases perfectamente emparejadas aproximadamente 1.000 veces (un 30% de malemparejamiento es igual a un cambio de aproximadamente 30ºC en la T_{m}; existe una reducción de aproximadamente diez veces en la unión por cada 10ºC de cambio en la T_{m}).

Ejemplo 6 Síntesis química de 2'-desoxiisoguanosina

Se realizó la síntesis de 2'-desoxiisoguanosina a partir de 2'-desoxiguanosina mediante el siguiente procedimiento.

Etapa 1

Se secaron 2'-desoxiguanosina monohidrato (50 mmoles) e imidazol (200 mmoles) por coevaporación con 500 ml de dimetilformamida (DMF) y se disolvió el residuo en 500 ml de DMF. Se añadió a esta solución cloruro de t-butildimetilsililo (150 mmoles) y se dejó la mezcla de reacción en agitación a temperatura ambiente durante 18 horas. Se añadió metanol (30 ml) y, a los 25 minutos, se eliminaron los solventes a vacío. Se eliminaron los solventes por evaporación, se disolvió el residuo en 1 L de CH_{2}Cl_{2}, se lavó con 1 L de NaHCO_{3} al 5% y 1L de NaCl saturada al 80%, se secó la fase orgánica sobre Na_{2}SO_{4}, se filtró y se evaporó a sequedad para obtener el producto bruto (30 gramos), que fue directamente disuelto en 2 L de etanol caliente. La lenta refrigeración hasta 20ºC, seguida de almacenamiento a 4ºC durante 20 horas, produjo 3',5'-TBDMS_{2}-2'-desoxiguanosina pura (65% de rendimiento).

Etapa 2

Se suspendió 3',5'-TBDMS_{2}-2'-desoxiguanosina (12 mmoles) en 125 ml de CH_{2}Cl_{2} que contenía trietilamina (150 mmoles) y N,N-dimetilaminopiridina (100 mg). Se añadió cloruro de 4-toluensulfonilo (40 mmoles) a 0ºC y se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 20 horas. En ese momento, todo el material sólido se había disuelto, dando lugar a una solución ligeramente amarilla. Se detuvo la reacción con 50 ml de NaHCO_{3} al 5% con agitación durante 1 hora. Se diluyó la mezcla de reacción con 300 ml de CH_{2}Cl_{2}, se lavó con 300 ml de NaHCO_{3} al 5% y 300 ml de NaCl saturado al 80%, se secó la fase orgánica sobre Na_{2}SO_{4}, se filtró y se evaporó a sequedad, para obtener el producto bruto (8,9 gramos). La cromatografía instantánea en gel de sílice usando un gradiente del 1% al 4% de metanol/CH_{2}Cl_{2} dio 7,95 gramos de O^{6}-(4-toluensulfonil)-3',5'-O-TBDMS_{2}-2'-desoxiguanosina (11 mmoles).

Etapa 3

Se suspendieron 12 g de O^{6}-(4-toluensulfonil)-3',5'-O-TBDMS_{2}-2'-desoxiguanosina (17 mmoles) en 300 ml de CH_{3}CN. Se añadió luego metilpirrolidina (17 ml) y se agitó la suspensión durante una hora para producir una solución transparente. El análisis de TLC mostró que todo el material de partida se había convertido en material de la línea basal. Se añadieron 11 g de 4-(metiltio)fenol (85 mmoles) y se agitó la solución durante 60 horas. Después de evaporar hasta obtener un pequeño volumen, se añadieron 600 ml de acetato de etilo. Se extrajo esta solución con 3x400 ml de NaOH 0,3 M y 400 ml de NaCl saturado al 80%, se secó la fase orgánica sobre Na_{2}SO_{4}, se filtró y se evaporó a sequedad para obtener 11,55 gramos de producto bruto. La cromatografía instantánea en gel de sílice usando un gradiente del 4% al 5% de metanol/CH_{2}Cl_{2} dio 8,16 gramos de O^{6}-(4-(metiltio)fenil)-3',5'-O-TBDMS_{2}-2'-desoxiguanosina (11 mmoles).

Etapa 4

Se disolvieron 4 g de O^{6}-(4-(metiltio)fenil)-3',5'-O-TBDMS_{2}-2'-desoxiguanosina (6,5 mmoles) en 65 ml de CH_{2}Cl_{2} a 0ºC y se añadieron por goteo 6,5 ml de nitrito de terc-butilo. Se dejó que la solución se calentara a temperatura ambiente y se desprendió gas de la mezcla (N_{2}). Después de 40 minutos, cuando el análisis de TLC mostró que se había consumido por completo el material de partida y que había surgido una nueva mancha de migración más lenta, se eliminó el exceso de nitrito de t-butilo por coevaporación con 2x100 ml de tolueno a vacío. Se purificó el residuo de producto bruto por cromatografía instantánea en gel de sílice usando un gradiente del 4% al 5% de metanol/CH_{2}Cl_{2}, para obtener 2,75 gramos de O^{6}-(4-(metiltio)fenil)-3',5'-O-TBDMS_{2}-2'-desoxixantosina (4,45 mmoles).

Etapa 5

Se disolvió la totalidad de los 2,75 gramos purificados de O^{6}-(4-(metiltio)fenil)-3',5'-O-TBDMS_{2}-2'-desoxixantosina (4,45 mmoles) en 50 ml de metanol. Se añadió hidróxido de amonio acuoso concentrado (50 ml) y se calentó la mezcla en una bomba herméticamente sellada a 100ºC durante 4 horas. Después de enfriar, se eliminaron los solventes por coevaporación con etanol a vacío, para obtener 1,8 gramos de producto bruto (3,6 mmoles). La purificación por recristalización con etanol caliente dio una muestra de 3',5'-O-TBDMS_{2}-2'-desoxiisoguanosina pura. Este material era en todos los sentidos (UV, TLC, RMN y MS) idéntico a una muestra preparada por la ruta fotolítica publicada (Switzer y col. (1993), antes citado).

Ejemplo 7 Control de la hibridación no específica del amplificador y de la sonda de fosfatasa alcalina a los prolongadores de captura A. Construcción de una sonda isoC,isoG bDNA amp e isoC,isoG ap

Se construyó un multímero de amplificación de 15 sitios de tipo peine (amp) como se ha descrito previamente en la Publicación PCT Nº WO92/02526. Se ligaron los brazos sobre el peine usando un ligante de 12 nucleótidos y ADN ligasa T4 como se ha descrito. Se construyó la sonda de fosfatasa alcalina (ap) a partir de un oligonucleótido que contenía una funcionalidad amino como se ha descrito en la Patente EE.UU. Nº 5.124.246. Las secuencias utilizadas fueron:

26

\hskip0.3cm

F = isoC, J = isoG, L = amina de cadena larga.

\newpage

B. Preparación de las secuencias de los prolongadores de captura (CE)

Se prepararon prolongadores de captura para el TNF-alfa, la interleukina-2 (IL-2), la IL-4, la IL-6 y el gamma-interferon (IFN\gamma) por métodos de fosforamidita estándar. Las secuencias de prolongadores de captura estudiadas fueron:

Reserva de CE para el TNF-alfa

27

Reserva de CE para la IL-6

28

Reserva de CE para el IFN\gamma

29

Reserva de CE para la IL-2

30

\newpage

Reserva de CE para al IL-4

31

Nota: Z = espaciador de trietilenglicol.

C. Procedimiento para medir la hibridación no específica ("NSH") entre CE y amp y CE y ap

Se incubaron un total de 100 femtomoles de las sondas prolongadoras de captura individuales o una reserva consistente en un total de 100 femtomoles de cada prolongador de captura en los micropocillos durante una hora a 53 grados. Después de lavar dos veces con un lavado A (SSC 0,1x, SDS al 0,1%), se incubaron los pocillos durante 30 min. en diluyente de amplificador +/- el isoC,isoG amp descrito en WO95/16055 o el isoC,isoG amp descrito en el Ejemplo 7A anterior. Después de dos lavados adicionales con lavado A, se incubaron los pocillos durante 15 min. en diluyente de amp (SSC 5x, suero de caballo digerido con proteinasa K al 50%) que contenía la sonda no-isoC,isoG ap descrito en WO95/16055 o la sonda isoC,isoG ap descrita en el Ejemplo 7A anterior.

Se usaron las siguientes definiciones: AP NSB = fondo de las sondas ap cuando no hay presencia de CE. Amp NSB = fondo del amp y la sonda ap cuando no hay presencia de CE, menos el ap NSB. AP NSH = RLU de la muestra de CE sin amp, menos el ap NSB. AMP NSH = RLU de la muestra de CE - AP NSH - AMP NSB - AP NSB.

D. Resultados

Se estudiaron cinco sondas CE individuales en cuanto a la hibridación no específica de fondo usando 100 fm por pocillo. Los resultados son mostrados en la Tabla siguiente.

32

Los valores entre paréntesis son menores de cero RLU. AMP = no-isoC,isoG amp, iC AMP = isoC,isoG amp, AP = no isoC,isoG ap, iC AP = isoC,isoG ap.

El fondo de unión no específica en ausencia de sondas CE (AP-NSB y AMP-NSB) es insignificante (<=1 RLU) para todas las sondas amp y ap. Tres de los prolongadores muestran una fuerte reactividad cruzada (>10 RLU) con la sonda amp actual, que no se observa con isoC,isoG amp. Una sonda muestra una reactividad cruzada de 6 RLU con la sonda AP actual, que no se observa con la sonda isoC,isoG AP. En todos los casos, la NSH con la sonda isoC,isoG es insignificante. Los valores RLU menores de 1,0 son considerados insignificantes en relación a NSB.

Se estudiaron cinco reservas de sondas CE en cuanto al fondo de hibridación no específica con las mismas moléculas. A continuación, se muestran los resultados.

33

Véase la leyenda de la tabla anterior para las abreviaturas.

Una vez más, la NSB de todas las sondas amp y ap es insignificante comparada con la NSH. Cuatro de los cinco reservas muestran una amp NSH significativa, que va de 2,3 a 34,9 RLU, mientras que ninguna de las reservas CE tiene una NSH significativa (<1) con isoC,isoG amp. Dos de las reservas tienen una NSH significativa con la sonda ap, mientras que ninguna de las reservas tiene una interacción significativa con la sonda isoC,isoG ap. En este experimento, se estudió un total de 30 secuencias CE en cuanto a la reactividad cruzada.

Un experto en la técnica, armado de la capacidad de incorporar nuevos pares de bases a formatos de ensayos de hibridación, se dará cuenta de que se esperaría que la substitución de la secuencia líder amp con una secuencia líder isoC,isoG diera lugar a valores inferiores de NSH para el isoC,isoG amp aquí utilizado.

E. Curvas completas de dosis-respuesta para IL-2 e IL-6 con isoC,isoG amp y ap

Se generaron curvas completas de dosis-res-puesta estudiando diluciones seriadas de células humanas para el ARNm de IL-2 e IL-6. Se calculó el límite de detección como el número de células al que delta = cero. Delta se define como: RLU pos. - 2 desv. estándar - (RLU neg. + 2 desv. estándar).

En la siguiente Tabla, se muestran los resultados.

34

La sensibilidad mejoró 12,6 veces con el ensayo de IL-2 y 3 veces con el ensayo de IL-6 utilizando el isoC/G amp y ap en lugar de las moléculas actuales, que tienen secuencias naturales. Cuando mayor es el ruido con las secuencias naturales, mayor es el perfeccionamiento del ensayo.

Por lo tanto, se han descrito nuevos métodos para generar una señal más dependiente de blanco en ensayos de hibridación en emparedado en fase de solución. Además, se ha descrito un nuevo método para sintetizar 2'-desoxiisoguanosina.

Claims (2)

1. Un método para sintetizar un compuesto que tiene la fórmula estructural

35

donde R^{1} es seleccionado entre el grupo consistente en hidrógeno, hidroxilo, sulfhidrilo, halógeno, amino, alquilo, alilo y -OR^{2}, donde R^{2} es alquilo, alilo, sililo o fosfato, consiste en:

a) hacer reaccionar un compuesto que tiene la fórmula estructural

36

con un reactivo adecuado para proteger los grupos hidroxilo tanto 3' como 5';

b) hacer reaccionar el producto de la etapa (a) con un reactivo adecuado para convertir el resto O^{6}-oxi en un grupo funcional que sea susceptible de desplazamiento nucleofílico, produciendo así un resto O^{6} funcionalizado;

c) oxidar el grupo 2-amino del producto de la etapa (b);

d) hacer reaccionar el producto de la etapa (c) con un reactivo nucleofílico para desplazar el resto O^{6} funcionalizado, y

e) hacer reaccionar el producto de la etapa (d) con un reactivo adecuado para desproteger los grupos hidroxilo 3' y 5' protegidos.

2. Un método para sintetizar 2'-desoxiisoguanosina consistente en:

a) 2'-desoxiguanosina en 3',5'-O-(t-butildimetilsilil)_{2}-2'-desoxiguanosina por reacción de 2'-desoxiguanosina con cloruro de t-butildimetilsililo (TBDMS);

b) convertir la 3',5'-O-TBDMS_{2}-2'-desoxiguanosina en O^{6}-(4-toluensulfonil)-3',5'-O-TBDMS_{2}-2'-desoxiguanosina por reacción de 3',5'-O-TBDMS_{2}-2'-desoxiguanosina con cloruro de 4-toluensulfonilo;

c) desplazar el grupo O^{6}-(4-toluensulfonilo) por tratamiento de la O^{6}-(4-toluensulfonil)-3',5'-O-TBDMS_{2}-2'-desoxiguanosina con un fenol para obtener O^{6}-(4-(metiltio)fenil)-3',5'-O-TBDMS_{2}-2'-desoxiguanosina;

d) oxidar el grupo 2-amino de la O^{6}-(4-(metiltio)fenil)-3',5'-O-TBDMS_{2}-2'-desoxiguanosina a la función oxi tratando la O^{6}-(4-(metiltio)fenil)-3',5'-O-TBDMS_{2}-2'-desoxiguanosina con nitrito de t-butilo en condiciones neutras para obtener O^{6}-(4-(metiltio)fenil)-3',5'-O-TBDMS_{2}-2'-desoxixantosina, y

e) desplazar el grupo O^{2}-(4-(metiltio)fenilo) de la O^{6}-(4-(metiltio)fenil)-3',5'-O-TBDMS_{2}-2'-desoxixantosina con hidróxido de amonio a elevada temperatura para obtener 3',5'-O-TBDMS_{2}-2'-desoxiisoguanosina.