ES2211884T3 - Anticuerpos contra el cd40. - Google Patents
Anticuerpos contra el cd40.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA ANTICUERPOS MONOCLONALES Y PROTEINAS DE UNION QUE SE UNEN ESPECIFICAMENTE A CD40 Y SON CAPACES DE BLOQUEAR LA UNION DE CD40 AL LIGANDO CD40.
Description
Anticuerpos contra el CD40.
La presente invención trata en general de
anticuerpos y, más específicamente, de anticuerpos
anti-CD40.
El CD40 es un antígeno de superficie que se
expresa en las células B, las células dendríticas, algunas líneas
celulares de carcinomas y en el epitelio tímico humano. Se sabe que
el CD40 juega un importante papel en la proliferación y la
diferenciación de los linfocitos B. Basándose en similitudes de la
secuencia de aminoácidos, se ha identificado el CD40 como miembro de
la familia de las proteínas receptoras del TNF, que incluye
moléculas como el receptor de baja afinidad para el factor de
crecimiento de los nervios, las dos formas de receptores del TNF:
CD27, OX40, y el marcador del linfoma de Hodgkin CD30. Las formas
humana y murina de un ligando para el CD40 (CD40L) se han clonado
recientemente y se ha demostrado que son proteínas de membrana
integral de tipo II que se expresan principalmente en células T
CD4+ activadas. El CD40L proporciona una fuerte señal estimulante a
las células B humanas y murinas; sin embargo, se sabe poco sobre
la regulación de la expresión del CD40L y de los efectos del CD40L
sobre otros tipos de células.
También se ha mostrado que los anticuerpos
monoclonales dirigidos contra el antígeno de superficie CD40 sirven
de intermedios en varias actividades biológicas en las células B
humanas. Por ejemplo, el Acm anti-CD40 induce
adhesiones homotípicas y heterotípicas (Barrett y col., J.
Immunol. 146:1722, 1991; Gordon y col., J. Immunol.
140:1425, 1988) e incrementa el tamaño celular (Gordon y col.,
J. Immunol. 140:1425, 1988; Valle y col., Eur. J.
Immunol. 19:1463, 1989). El CD40 induce la proliferación de las
células B activadas con anti-IgM, Acm
anti-CD20 o éster de forbol solo (Clark y
Ledbetter, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4494, 1986; Gordon y
col. LEUCOCYTE TYPING III. A. J. McMichael ed. Oxford University
Press. Oxford, p. 426; Pauline y col., J. Immunol. 142:590,
1989) o junto con IL4 (Valle y col., Eur. J. Immunol.
19:1463, 1989; Gordon y col. Eur. J. Immunol. 17:1535, 1987),
y produce IgE (Jabara y col., J. Exp. Med. 172:1861, 1990;
Gascan y col., J. Immunol. 147:8, 1991), IgG e IgM (Gascan y
col., J. Immunol. 147:8, 1991) a partir de cultivos
empobrecidos en células T estimuladas con IL-4.
Además, se ha informado de que los Acm anti-CD40
incrementan en las células B la liberación de
CD23/Fc\varepsilonRII soluble en la que el IL-4
sirve de intermedio (Gordon y Guy, Immunol. Today 8:339,
1987; Cairns y col., Eur. J. Immunol. 18:349, 1988) y
promueven la producción de IL-6 en las células B
(Clark y Shu, J. Immunol. 145:400, 1990). Recientemente, en
presencia de células adherentes CDw32+, se han generado líneas de
células B humanas a partir de poblaciones de células B primarias
con Acm anti-IL-4 y
anti-CD40. Además, es posible evitar que los
centrocitos de los centros germinales sufran apoptosis si se
activan mediante el CD40 y/o los receptores para el Ag (Liu y col.,
Nature 342:929, 1989). Cada una de las publicaciones
precedentes describe Acms anti-CD40 que estimulan la
actividad biológica de las células B.
Se han descrito anticuerpos monoclonales
anti-CD40 que no estimulan conjuntamente la
proliferación de las células B humanas e inhiben la proliferación
de células B humanas inducida por células EL4B5 (Kwekkeboom y col.
Immunology 79; 439 (1993)).
Sin embargo, todavía no se han descubierto
anticuerpos monoclonales que bloqueen la unión del CD40 con el
ligando CD40. Tales anticuerpos bloqueadores serían útiles, por
ejemplo, en aplicaciones de investigación para profundizar en la
aclaración de la función del CD40 y también en aplicaciones
terapéuticas que requieran inhibición de la actividad biológica
producida por medio del CD40. Los Acms bloqueadores del ligando CD40
también serían útiles en aplicaciones clínicas, por ejemplo, para
la diagnosis de enfermedades asociadas con el CD40. Además, los
anticuerpos se pueden usar en varias aplicaciones de investigación,
como la purificación del CD40 recombinante o en ensayos que detecten
la presencia del CD40.
La presente invención proporciona tales
anticuerpos, y además, proporciona otras ventajas relacionadas.
La presente invención proporciona anticuerpos
monoclonales que se unen específicamente a una molécula del CD40
humano y bloquean la unión de la molécula de CD40 a un ligando del
CD40. El anticuerpo monoclonal puede seleccionarse del grupo
compuesto por los anticuerpos monoclonales humanos y de ratón. De
igual modo, el CD40 puede seleccionarse del grupo compuesto por CD40
humano y murino. También se proporciona una composición terapéutica
que comprende un anticuerpo monoclonal para el CD40 según se
describe anteriormente y un vehículo o diluyente fisiológicamente
aceptable.
La invención también proporciona una proteína de
unión que se une específicamente a un CD40 de mamífero, que puede
ser, por ejemplo, un fragmento de un anticuerpo o una proteína de
fusión que comprenda al menos un dominio derivado de un anticuerpo.
También se proporciona una composición terapéutica que comprende
una proteína de unión que se une específicamente con el CD40 de
mamífero y un vehículo o diluyente fisiológicamente aceptable.
La presente invención también incluye un
procedimiento para detectar el CD40 en las células que comprende las
etapas: (a) incubación de las células con un anticuerpo monoclonal,
según se describe anteriormente, que está marcado, y (b) detección
de la presencia del anticuerpo unido. La invención también
proporciona un procedimiento para detectar el CD40 soluble en suero
que comprende las etapas: (a) incubación del suero que se sospecha
que contiene el CD40 soluble con un soporte sólido que contenga los
anticuerpos monoclonales según se describe anteriormente fijados a
él bajo las condiciones y durante el tiempo suficientes para que
tenga lugar la unión, (b) incubación del soporte sólido con un
segundo anticuerpo monoclonal marcado específico para el CD40 bajo
las condiciones y durante el tiempo suficientes para que tenga
lugar la unión y (c) detección de la presencia del anticuerpo
marcado unido.
Estos y otros aspectos de la presente invención
se harán evidentes mediante la referencia a la descripción
detallada y las figuras adjuntas siguientes.
La Figura 1 muestra la inhibición de la unión
del CD40 humano soluble al CD40L humano mediante los Acms
anti-CD40 M2 y M3.
La Figura 2 muestra la inhibición de la unión
del CD40 humano soluble al CD40L murino mediante los Acms
anti-CD40 M2 y M3.
La Figura 3 es un gráfico que muestra una
relación dependiente de la dosis entre el CD40L (expresado en la
superficie de células CV-1/EBNA) y la producción de
TNF-\alpha en monocitos en presencia del
GM-CSF, el IL-3 o el
IFN-\gamma.
La Figura 4 es un gráfico que muestra que la
producción de TNF-\alpha en monocitos inducida
por el CD40L es inhibida por el CD40.Fc o el Acm
anti-CD40 M2.
La Figura 5 presenta los resultados de un ensayo
de proliferación usando células B de sangre periférica estimuladas
con el anti-IgM y el ligando CD40 trimérico.
La Figura 6 presenta los resultados de un ensayo
de proliferación usando células B de sangre periférica estimuladas
solo con el ligando CD40 trimérico.
La Figura 7 presenta los resultados de un ensayo
de proliferación usando células B de sangre periférica estimuladas
con IL-4 y el ligando CD40 trimérico.
El CD40 purificado se puede usar para preparar
anticuerpos monoclonales, así como otras proteínas de unión que
pueden ser construidas específicamente usando procedimientos de ADN
recombinante. Estas proteínas de unión incorporan las regiones
variables de un gen que codifica un anticuerpo monoclonal de enlace
específico. En el contexto de la presente invención, se define que
los anticuerpos monoclonales y las proteínas de unión presentan
especificidad de enlace si se unen con un K_{a} mayor o igual que
10^{7} M^{-1}. En los aspectos preferidos de la invención, los
anticuerpos monoclonales también bloquean la unión del CD40 al
ligando CD40 (CD40L). Un experto en la materia puede determinar
fácilmente la afinidad de un anticuerpo monoclonal o proteína de
unión (ver Dower y col., "The Interaction of Monoclonal Antibodies
with MHC Class I Antigens on Mouse Spleen Cells. I. Analysis of he
Mechanism of Binding" J. Immunol. 132:751, 1984). En pocas
palabras, se exponen cantidades crecientes de anticuerpo o proteína
de unión marcados radioactivamente a la acción del CD40. La afinidad
de un anticuerpo se puede determinar tomando el recíproco de la
concentración de anticuerpo a la cual un medio de los anticuerpos
muestra una unión máxima (ver Dower y col. citado anteriormente).
Como resultará evidente para un experto en la materia, se pueden
generar anticuerpos contra células que lleven el CD40, El CD40
completo o porciones del CD40. Se prefieren particularmente los
anticuerpos desarrollados contra el CD40 usando una molécula de
CD40.Fc soluble. Además, en el contexto de la presente invención,
los anticuerpos monoclonales incluyen fragmentos
F(ab')_{2} y Fab que pueden ser preparados fácilmente por
un experto en la materia.
Un experto en la materia puede generar fácilmente
anticuerpos policlonales a partir de diversos animales de sangre
caliente, como caballos, vacas, varias aves de corral, conejos,
ratones o ratas. En pocas palabras, el CD40 se usa para inmunizar
al animal mediante inyecciones intraperitoneales, intramusculares,
intraoculares o subcutáneas. La inmunogenicidad del CD40 se puede
incrementar mediante el uso de un adyuvante como el adyuvante
completo o incompleto de Freund. Después de varias inmunizaciones de
recuerdo ("booster"), se recogen pequeñas muestras de suero y
se prueba su reactividad frente al CD40 mediante uno cualquiera de
entre varios procedimientos, como un ensayo ELISA, los ensayos ABC o
ABC modificados, o mediante un ensayo "dot blot," entre otros.
Los antisueros policlonales que se prefieren particularmente darán
una señal en uno de estos ensayos al menos 3 veces mayor que la
señal de fondo. Una vez que la concentración en el suero del animal
ha alcanzado un máximo en términos de su reactividad frente al CD40,
se pueden conseguir fácilmente mayores cantidades de antisuero
policlonal tanto sangrando al animal semanalmente como desangrando
al animal.
También se pueden generar fácilmente anticuerpos
monoclonales usando técnicas convencionales (ver las patentes de
EE.UU. Nº RE 32.011, 4.902.614, 4.543.439 y 4.411.993; ver también
Monoclonal Antibodies Hybridomas: A New Dimension in Biological
Analyses, Plenum Press, Kenett), McKearn, y Bechtol (eds.),
1980, y Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Lane
(eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988.
En pocas palabras, en una realización, se inyecta
a un sujeto animal, como una rata o un ratón, una forma de CD40
adecuada para generar una respuesta inmune contra el CD40. Esto
puede lograrse mediante inmunización con varias formas de CD40,
incluyendo entre otras, células que expresen el CD40, virus como el
virus vaccinia que expresen el CD40, formas solubles del CD40, como
el CD40.Fc, o péptidos que estén basados en la secuencia del CD40.
Además, la técnica conoce muchas técnicas para incrementar la
respuesta inmune resultante, por ejemplo, mediante el acoplamiento
del receptor soluble o péptido a otra proteína como la ovalbúmina o
la hemocianina del molusco Megathura crenulata (KLH) o
mediante el uso de adyuvantes como el adyuvante completo o
incompleto de Freund. La inmunización inicial puede producirse
mediante las vías intraperitoneal, intramuscular, intraocular o
subcutánea.
Entre una y tres semanas después de la
inmunización inicial, el animal puede volver a inmunizarse con una
inmunización de recuerdo. Se puede sangrar al animal para una
prueba y probar la inmunoreactvidad del suero frente al CD40 usando
ensayos como el ELISA, el "dot blot", el ABC o el ensayo ABC
modificado. También se pueden realizar inmunizaciones adicionales
hasta que el animal alcance un máximo en su reactividad al CD40.
Entonces se puede volver a inmunizar al animal por última vez con
CD40 soluble y sacrificarle tres o cuatro días más tarde. En este
momento, se pueden recoger los órganos que contienen grandes
cantidades de células B, como el bazo y los nódulos linfáticos, y
romperse para dar una suspensión de células individuales pasando los
órganos por un tamiz o rompiendo las membranas del bazo y de los
nódulos linfáticos que encapsulan las células. En una realización,
posteriormente se lisan los glóbulos rojos mediante la adición de
una solución hipotónica seguida del retorno inmediato a la
isotonicidad.
En otra realización, se obtienen las células
adecuadas para preparar anticuerpos monoclonales mediante el uso de
técnicas de inmunización in vitro. En pocas palabras, se
sacrifica un animal y se retiran las células del bazo y de los
nódulos linfáticos según se describe anteriormente. Se prepara una
suspensión de células individuales y se colocan las células en un
cultivo que contenga una forma de CD40 que sea adecuada para
generar una respuesta inmune como se describe anteriormente.
Posteriormente, se recogen los linfocitos y se fusionan según se
describe más abajo.
Las células obtenidas mediante el uso de
inmunización in vitro o de un animal inmunizado según se
describe anteriormente, se pueden inmortalizar mediante transfección
con un virus como el virus Epstein Bar (EBV) (ver Glasky y Reading,
Hybridoma 8(4):377-389, 1989).
Alternativamente, en una realización preferida, se fusionan las
suspensiones de células del bazo y/o nódulos linfáticos recogidos
con una célula de mieloma adecuada para crear un "hibridoma"
que secrete anticuerpo monoclonal. Las líneas de mieloma adecuadas
presentan preferiblemente una construcción o expresión de
anticuerpos defectuosa y son además singeneicas con las células del
animal inmunizado. Muchas de estas líneas celulares de mieloma son
bien conocidas en la técnica y se pueden conseguir de fuentes como
la American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland (ver
Catalogue of Cell Lines & Hybridomas, 6th ed., ATCC,
1998). Las líneas de mieloma representativas incluyen para humanos:
UC 729-6 (ATCC Nº CRL 8061),
MC/CAR-Z2 (ATCC Nº CRL 8147) y
SKO-007 (ATCC Nº CRL 8033); para ratones:
SP2/0-AG14 (ATCC Nº CRL 1581) y P3X63Ag8 (ATCC Nº
TIB 9) y para ratas: Y3-Ag1.2.3 (ATCC Nº CRL 1631)
y YB2/0 (ATCC Nº CRL 1662). Las líneas de fusión particularmente
preferidas incluyen NS-1 (ATCC Nº TIB 18) y P3X63 -
Ag8.653 (ATCC Nº CRL 1580) que pueden usarse para fusiones con
líneas celulares de ratón, rata o humanas. Se puede conseguir la
fusión entre la línea celular de mieloma y las células del animal
inmunizado mediante varios procedimientos, incluyendo el uso de
polietilenglicol (PEG) (ver Antibodies: A Laboratory Manual,
Harlow y Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988) o
electrofusión (ver Zimmerman y Vienken, J. Membrane Biol.
67:165-182, 1982).
Después de la fusión, las células se pueden
colocar en placas de cultivo que contengan un medio adecuado, como
RPMI 1640 o DMEM ("Dulbecco's Modified Eagles Medium" o Medio
Eagle Modificado por Dubelcco) (JRH Biosciences, Lenexa, Kansas). El
medio también puede contener ingredientes adicionales, como Suero
Bovino Fetal (SBF, es decir, de Hyclone, Logan, Utah o JRH
Biosciences), timocitos obtenidos de una cría de la misma especie
usada para la inmunización o agar para solidificar el medio.
Además, el medio debería contener un reactivo que permita
selectivamente el crecimiento de las células fusionadas de bazo y
mieloma. Se prefiere particularmente el uso de HAT (hipoxantina,
aminopterina y timidina) (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri).
Después de unos 7 días, las células fusionadas o hibridomas
resultantes se pueden analizar para determinar la presencia de
anticuerpos que reconozcan al CD40. Después de varias diluciones
clonales y reensayos, se puede aislar un hibridoma que produzca
anticuerpos que se unan al CD40.
También se pueden usar otras técnicas para
construir anticuerpos monoclonales (ver William D. Huse y col.,
"Generation of a Large Combinational Library of the Immunoglobulin
Repertoire in Phage Lambda," Science
246:1275-1281, diciembre 1989; ver también L. Sastry
y col., "Cloning of the Immunological Repertoire in
Escherichia coli for Generation of Monoclonal Catalitic
Antibodies: Construction of a Heavy Chain Variable
Region-Specific ADNc Library," Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 86:5728-5732, agosto 1989; ver
también Michelle Alting-Mees y col., "Monoclonal
Antibody Expression Libraries: A Rapid Alternative to
Hybridomas," Strategies in Molecular Biology
3:1-9, enero 1990; estas referencias describen un
sistema comercial disponible en Stratacyte, La Jolla, California,
que permite la producción de anticuerpos mediante técnicas
recombinantes). En pocas palabras, se aísla mRNA a partir de una
población de células B y se usa para crear librerías de expresión de
ADNc de inmunoglobulinas de cadena pesada y ligera en los vectores
kImmunoZap(H) y kImmunoZap(L). Estos vectores se
pueden analizar individualmente o expresar conjuntamente para
formar fragmentos Fab o anticuerpos (ver Huse y col., citados
anteriormente; ver también Sastry y col., citados anteriormente).
Posteriormente, el ADN de las placas positivas se puede convertir en
un plásmido no lítico que permita un alto nivel de expresión de los
fragmentos de anticuerpo monoclonal de E. Coli.
De igual modo, también se pueden construir
proteínas de unión usando técnicas de ADN recombinante para
incorporar las regiones variables de un gen que codifique un
anticuerpo de unión específica que bloquee la unión del CD40 al
CD40L. Cualquier experto en la materia puede llevar a cabo
fácilmente la construcción de estas proteínas (ver James W. Larrick
y col., "Polymerase Chain Reaction Using Mixed Primers: Cloning of
Human Monoclonal Antibody Variable Region Genes From Single
Hybridoma Cells," Biotechnology 7:934-938,
septiembre 1989; Riechmann y col., "Reshaping Human Antibodies
for Therapy," Nature 332:323-327, 1988;
Verhoeyen y col., "Reshaping Human Antibodies: Grafting an
Antilysozyme Activity," Science
239:1534-1536, 1988; Roberts y otros "Generación
de un anticuerpo con afinidad potenciada y especificada para su
antígeno mediante ingeniería de proteínas" Nature
328:731-734, 1987; Chaudhary y col., "A
Recombinant Immunotoxin Consisting of Two Antibody Variable Domains
Fused to Pseudomonas Exotoxin," Nature
339:394-397, 1989), dado el descubrimiento
proporcionado en la presente invención. En pocas palabras, se
amplifican los sitios de unión del antígeno o el dominio de unión
del CD40 de una célula que produzca un anticuerpo monoclonal de
unión y bloqueo específicos y se inserta directamente en el genoma
de una célula que produzca anticuerpos humanos (ver Verhoeyen y
col., citado anteriormente; ver también Reichmann y col., citado
anteriormente). Esta técnica permite la transferencia a un
anticuerpo humano de un sitio de unión para un antígeno que se une
específicamente a un anticuerpo monoclonal murino o de rata. Estos
anticuerpos son preferibles para uso terapéutico en humanos porque
no son tan antigénicos como los anticuerpos de rata o ratón.
Alternativamente, los sitios de unión del antígeno (región
variable) pueden tanto unirse a otra proteína completamente
diferente como insertarse en ella (ver Chaudhary y col., citado
anteriormente), lo que resulta en una nueva proteína que posee tanto
los sitios de unión al antígeno del anticuerpo como la actividad
funcional de la proteína completamente diferente. Como un experto en
la materia reconocerá, los sitios de unión al antígeno o el dominio
de unión al CD40 del anticuerpo se pueden encontrar en la región
variable del anticuerpo. Además, en el contexto de la presente
invención, se pueden usar secuencias de ADN que codifiquen porciones
más pequeñas del anticuerpo o regiones variables que se unan
específicamente al CD40 de los mamíferos. Se puede probar fácilmente
la especifidad de unión de estas porciones al CD40 usando ensayos
conocidos por la técnica, incluyendo, por ejemplo, ensayos ELISA,
ABC o "dot blot".
En una realización preferida, se amplifican los
genes que codifican la región variable de un hibridoma que produzca
un anticuerpo monoclonal de interés usando nucleótidos cebadores
para la región variable. Estos cebadores pueden ser sintetizados por
un experto en la materia o bien pueden adquirirse de fuentes
comerciales disponibles. Stratacyte (La Jolla, Calif.) vende
cebadores para regiones variables de ratón y humanas incluyendo,
entre otros, los cebadores para las regiones V_{Ha}, V_{Hb},
V_{Hc}, V_{Hd}, C_{Hl}, V_{L} y C_{L}. Estos cebadores
pueden usarse para amplificar regiones variables de cadena pesada o
ligera, que pueden insertarse después en vectores como ImmunoZAP* H
o ImmunoZAP* L (Stratacyte), respectivamente. Después, estos
vectores pueden introducirse en E. coli para que se expresen.
Usando estas técnicas, se pueden producir grandes cantidades de
proteínas de cadena única que contengan una fusión de los dominios
V_{H} y V_{L} (ver Bird y col., Science
242:423-426, 1988).
En otra realización, la proteína de unión se
fusiona dentro del vector de expresión a otra proteína, como una
toxina. De este modo pueden matarse las células a las que se une la
proteína por incorporación de la toxina (ver Chaudhary y col.).
Alternativamente, la proteína de unión puede fusionarse con un
antagonista del CD40L (es decir, una proteína de unión al CD40 pero
que no genera actividad biológica), permitiendo desarrollar grandes
concentraciones del antagonista alrededor de las células que
expresan el CD40. Solo resultarían afectadas las células que
pudieran unirse con el antagonista, disminuyendo potencialmente la
dosis necesaria para propósitos terapéuticos.
Una vez que se han obtenido los anticuerpos o las
proteínas de unión adecuadas, se pueden aislar o purificar mediante
muchas técnicas bien conocidas por los expertos en la materia (ver
Antibodies: A Laboratory manual, Harlow ad Lane (eds.), Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 1988). Las técnicas adecuadas
incluyen las columnas de afinidad de péptidos o proteínas, la HPLC o
la RP-HPLC, la purificación en columnas de proteína
A o proteína G o cualquier combinación de estas técnicas.
Los anticuerpos y las proteínas de unión de la
presente invención tienen muchos usos. Por ejemplo, los anticuerpos
pueden usarse en la citometría de flujo para seleccionar células
que contengan el CD40 o para marcar histoquímicamente las células
que contengan el CD40. En pocas palabras, para detectar el CD40 en
las células, se incuban las células con un anticuerpo monoclonal
marcado que se una específicamente al CD40 de mamíferos, seguido de
la detección de la presencia del anticuerpo unido. Estas etapas se
pueden llevar a cabo también con etapas adicionales, como lavados
para eliminar el anticuerpo no unido. Los marcadores apropiados
para ser usados en la presente invención son bien conocidos por la
técnica e incluyen, entre otros, el isotiocinato de fluoresceína
(FITC), la ficoeritrina (PE), la peroxidasa de rábano picante
(Horse Radish Peroxidase, HRP) y el oro coloidal. Para uso en
citrometría de flujo, se prefiere particularmente el FITC, el cual
se puede conjugar con el anticuerpo purificado según el
procedimiento de Keltkamp en "Conjugation of Fluorescein
Isothiocyanate to Antibodies. I. Experiments on the Conditions of
Conjugation," Immunology 18:865-873, 1970.
(Ver también Keltkamp, "Conjugation of Fluorescein Isothiocyanate
to Antibodies. II. A Reproducible Method," Immunology
18:875-881, 1970; y Goding, "Conjugation of
antibodies with Fluorochromes: Modification to the Standard
Methods," J. Immunol. Methods 13:215-226,
1970). Para las marcaciones histoquímicas, se prefiere el HRP, que
puede conjugarse con el anticuerpo purificado según el procedimiento
de Nakane y Kawaoi en "Peroxidase-Labeled
Antibody: A New Method of Conjugation," J. Histochem.
Cytochem. 22:1084-1091, 1974. (Ver también
Tijssen y Kurstak, "Highly Efficient and Simple Methods for
Preparation of Peroxidase and Active Peroxidase Antibody Conjugates
for Enzyme Immunoassays," Anal. Biochem.
136:451-457, 1984).
Los anticuerpos o las proteínas de unión
purificados pueden también usarse terapéuticamente para bloquear la
unión del CD40L al CD40 en vivo o para la neutralización en vivo de
células portadoras del CD40. En las realizaciones preferidas, el
anticuerpo se modifica para escapar a la detección inmunológica,
por ejemplo, mediante la transferencia del sitio de unión para el
antígeno de un anticuerpo monoclonal murino específico a un
anticuerpo monoclonal humano, como se discute anteriormente. Se
prefiere particularmente el uso de composiciones terapéuticas que
comprendan un anticuerpo o una proteína de unión al CD40 y un
vehículo o diluyente aceptable fisiológicamente. Los vehículos o
diluyentes adecuados incluyen, entre otros, una solución tampón
neutra o una solución salina mezclada con una albúmina
inespecífica. Además, la composición terapéutica puede contener
excipientes o estabilizantes adicionales, como tampones,
carbohidratos que incluyen, por ejemplo, la glucosa, la sacarosa o
la dextrosa, agentes quelantes como el EDTA o varios conservantes.
Las dosificaciones adecuadas se pueden determinar en pruebas
clínicas, aunque la cantidad y la frecuencia de la administración
pueden depender de factores tales como la naturaleza y la severidad
de la indicación que se esté tratando, la respuesta deseada y el
estado del paciente.
Los anticuerpos también se pueden usar para
monitorizar la presencia de CD40 soluble circulante que haya sido
administrado a un paciente o para medir los niveles de CD40 en vivo
en pacientes. Dentro de una realización preferida, se usa un doble
determinante o ensayo tipo "sandwich" para detectar el CD40. En
pocas palabras, se incuba el suero sospechoso de contener CD40
soluble con un soporte sólido que contenga un anticuerpo monoclonal,
según se describe anteriormente, sujeto a él bajo las condiciones y
durante un tiempo suficientes para que ocurra la unión. La técnica
conoce muchos soportes sólidos, incluyendo, entre otros, las placas
ELISA (Linbro, McLean, Virginia), la nitrocelulosa (Millipore Corp.
Bedford, Massachusetts), las bolas (Polysciences, Varrington,
Pennsylvania) y las bolas magnéticas (Robbin Scientific, Mountain
View, California). Además, el anticuerpo monoclonal se puede fijar
fácilmente al soporte sólido usando técnicas bien conocidas por la
técnica (ver Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Lane
(eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988). El soporte
sólido se incuba entonces con un segundo anticuerpo monoclonal
marcado, específico para el CD40 de mamíferos, bajo las condiciones
y durante un tiempo suficiente para que ocurra la unión, después de
lo cual, se puede detectar la presencia del anticuerpo marcado
unido.
Dentro de una realización particularmente
preferida, se recubre un soporte sólido, como una placa de 96
pocillos, con un anticuerpo monoclonal. Posteriormente, se bloquea
la placa con una proteína como la albúmina del suero bovino o leche
en polvo no grasa durante aproximadamente 30 minutos. Se diluye el
suero de un paciente en tampón fosfato y se incuba en los pocillos
bajo las condiciones y durante un tiempo suficiente para que tenga
lugar la unión, generalmente 30 minutos aproximadamente.
Posteriormente, se lava la placa y se añade a los pocillos un
segundo anticuerpo monoclonal marcado, específico para un epitopo
del CD40 diferente, y se incuba según se describe anteriormente. Se
pueden determinar los anticuerpos para el CD40 diferentes mediante
el uso de ensayos de "bloqueo transversal." Entonces se examina
el pocillo para determinar la presencia del segundo anticuerpo
marcado. La presencia del segundo anticuerpo marcado indica la
presencia del CD40 en el suero del paciente. Como comprenderá
cualquier experto en la materia, los anticuerpos monoclonales usados
en el ensayo de arriba pueden sustituirse con anticuerpos
policlonales o proteínas de unión que sean específicas para el
CD40.
Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de
ilustración y no a modo de limitación.
Los anticuerpos monoclonales que se unen al CD40
humano y bloquean la unión del CD40 al ligando CD40 se generaron
como sigue. Se preparó un inmunógeno del CD40 humano, consistente en
el dominio extracelular del CD40 fusionado con una molécula de IgGl
Fc humana, sustancialmente según describen Fanslow y col., J.
Immunol. 149:655, 1992.
Se inyectaron a ratones BALB/c por las vías
intraperitoneal y subcutánea 10 \mug de huCD40.Fc emulsionados
con el adyuvante completo de Freund. Trece y diecinueve días
después, se inyectaron por vía subcutánea a los ratones 10 \mug
de huCD40.Fc (emulsionado con el adyuvante incompleto de Freund). Se
tomaron muestras de suero 6 días después mediante sangrado
retroorbital. A las muestras de suero se les realizó una prueba
"dot blot", un ensayo de captura de anticuerpos en placa y un
análisis FACS (usando tanto huCD40 unido a membrana como Flag HuCd40
soluble. El Flag HuCD40 tiene un péptido señal
N-terminal de secuencia:
Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys
(Hopp y col., Biol. Technology 6:1204, 1988) que es altamente
antigénico y proporciona un epitopo que se une reversiblemente a un
anticuerpo monoclonal específico, permitiendo un ensayo rápido y una
fácil purificación de la proteína recombinante expresada. La
enteroquinasa de la mucosa bovina rompe esta secuencia
específicamente en el residuo que sigue inmediatamente al par
Asp-Lys. Las muestras de suero tenían títulos de
>1:2.100 en un ensayo "dot blot" (usando 25 \mug de Flag
huCD40 por mancha) y aproximadamente 1:1.600 en un ensayo de
captura de anticuerpos con la técnica ELISA (usando Flag huCD40
marcado con biotina a una concentración de 150 ng/ml) y >1:1.600
en un ensayo de captura de anticuerpos en placa (usando Flag huCD40
marcado con I^{125} a una concentración de 3000 cpm/\mul).
También se sometió al suero a un ensayo FACS a una dilución de
1:400 usando células que expresaban huCD40 en su superficie celular,
y se encontró que mostraban un desplazamiento medio de la
fluorescencia 4 veces mayor que el suero de los ratones
normales.
Se dejó descansar a los ratones durante 8 semanas
aproximadamente y se inmunizaron con 7 \mug huCD40.Fc por vía
subcutánea (emulsionado con el adyuvante incompleto de Freund).
Cuatro semanas y media más tarde se suministraron 2 \mug de
huCd40.Fc por vía intravenosa sin adyuvante a un ratón. Este ratón
se sacrificó tres días después. Se recogieron las células del bazo
y se fusionaron con una línea celular de mieloma murino (Ag 8.653).
La fusión se pasó a placas de 96 pocillos en un medio selectivo HAT
(hipoxantina, aminopterina y timidina) para inhibir la proliferación
de células no fusionadas, híbridos de mieloma e híbridos de células
del bazo.
Se sometieron los sobrenadantes de células de
hibridoma a dos ensayos. Ambos se llevaron a cabo en placas de 96
pocillos recubiertas con 10 \mug/ml de anticuerpo
anti-ratón de cabra. En pocas palabras, el análisis
de la reactividad del huCD40.Fc que resultó positivo se llevó a
cabo como sigue. Las placas recubiertas y bloqueadas se lavaron y
se añadieron los anticuerpos primarios (sobrenadantes de células de
hibridoma). Se lavaron las placas de nuevo y se añadió y se incubó
huCD40.Fc marcado con biotina. Se lavaron las placas de nuevo y se
añadió y se incubó estreptavidina-HRP (conjugado de
peroxidasa de rábano picante). Como etapa final, se lavaron las
placas y se añadió un sustrato de peroxidasa TMB (3, 3', 5,
5'-tetrametilbenzidino). Se dejó que tomara color y
se leyó usando un lector de placa ELISA.
El análisis de reactividad del Fc que resultó
negativo se realizó como sigue. Se lavaron las placas recubiertas y
bloqueadas y se añadió y se incubó el anticuerpo primario
(sobrenadantes de células de hibridoma). Se volvieron a lavar las
placas y se añadió y se incubó huIgGl HRP (conjugado de peroxidasa
de rábano picante). Como etapa final, se lavaron las placas y se
añadió el sustrato de peroxidasa TMB. Se dejó que tomara color y se
leyó usando un lector de placa ELISA.
A modo de análisis secundarios, se probó la
habilidad de los sobrenadantes de hibridoma para bloquear la unión
de huCd40.Fc marcado con biotina a células que expresaban el ligando
huCD40 sobre su superficie celular, usando un análisis FACS, y de
Flag huCD40 marcado con biotina, usando el mismo tipo de ensayo que
en el primer análisis (positivo).
Usando los procedimientos mencionados
anteriormente, se aislaron dos clones distintos de hibridoma que se
unen al CD40 y bloquean la unión del CD40 al CD40L. Nos referimos a
estos clones como huCD40m2 (M2) y huCD40m3 (M3). El clon de
hibridoma muCD40m2 generado según el procedimiento citado
anteriormente se ha depositado con la American Type Culture
Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, EE.UU.
(Acceso Nº HB1459) el día 6 de octubre de 1993, bajo las condiciones
del Tratado de Budapest.
Se ha analizado la reactividad de los clones de
hibridoma con el CD40 mediante el procedimiento ELISA, por ejemplo,
mediante adaptaciones de las técnicas descubiertas por Engvall y
col., Immunochemistry 8:871, 1971 y la patente de EE.UU. Nº
4.703.004. Los clones que dan positivo se inyectan en las cavidades
peritoneales de ratones singeneicos BALB/c para producir líquido
ascítico que contenga grandes concentraciones (>1 mg/ml) de
anticuerpo monoclonal anti-CD40. El anticuerpo
monoclonal resultante se puede purificar mediante precipitación con
sulfato de amonio seguida de cromatografía de exclusión en gel y/o
cromatografía de afinidad basada en la unión del anticuerpo a la
Proteína A de Staphylococcus aureus.
Se mostró que los Acm anti-CD40
M2 y M3 inhibían la unión del huCD40.Fc al huCD40L como sigue. Se
estimularon células T de sangre periférica humana purificadas
durante 18 horas con PMA (acetato mirístico de forbol) y ionomicina
para inducir la expresión del CD40L. Después, las células T se
unieron con IL-4R.Fc humano (5 \mug/ml) como
proteína de control negativo o con huCD40.Fc (5 \mug/ml) y se
llevó a cabo la inhibición de la unión con IgG de ratón irrelevantes
(20 \mug/ml), con el Acm anti-CD40 M2 (20
\mug/ml) o con el Acm anti-CD40 M3 (20 \mug/ml).
El CD40.Fc unido se detectó mediante un análisis de flujo
citométrico con un Ac anti-Fc humano marcado con
biotina y estreptavidina conjugada con ficoeritrina. Como se muestra
en la Figura 1, a estas concentraciones los M2 y los M3
anti-CD40 inhibían la unión del CD40.Fc por >90%
comparados con IgG de ratón irrelevante.
Se mostró que los Acms anti-CD40
M2 y M3 inhibían la unión del huCD40.Fc al muCD40 como sigue. Se
unieron células EL40.9 que expresaban constitutivamente el muCD40L
con la proteína control o con una concentración subóptima de huCD40
marcado con biotina (2,5 \mug/ml) y se llevó a cabo la inhibición
de la unión con IgG de ratón irrelevante (50 \mug/ml), un Acm
G28.5 de la IgGl de ratón (50 \mug/ml) (proporcionado por el Dr.
Edward A. Clark, Universidad de Washington), con el Acm
anti-CD40 M2 (12,5 \mug/ml) o con el Acm
anti-CD40 M3 (12,5 \mug/ml). El CD40.Fc marcado
con biotina unido se detectó mediante un análisis de flujo
citométrico usando estreptavidina conjugada con ficoeritrina. Como
se muestra en la Figura 2, a estas concentraciones los Acm
anti-CD40 M2 y M3 inhibían la unión del CD40.Fc por
>95% en comparación con la IgG de ratón o el Acm G28.5 de la IgGl
de ratón.
Este ejemplo muestra que el Acm
anti-CD40 bloquea la actividad biológica del CD40
mediante la inhibición de la producción por medio del CD40L de
TNF-\alpha. Se establecieron cultivos de monocitos
purificando, en primer lugar, monocitos de células mononucleares de
sangre periférica (PBMC) de un donante normal por elutriación en
contracorriente según describen Alderson y col., J. Exp. Med
173:923, 1991, y eran puros en al menos 95% al examinar al
microscopio preparaciones de citocentrífuga teñidas con Giemsa. Las
células se cultivaron en un medio RPMII640 que contenía 10% de
suero fetal bovino bajo en endotoxina, 50 U/ml de penicilina, 50
mg/\mul de estreptomicina y 5x10^{-5} M de
2-mercaptoetanol.
Se prepararon los siguientes reactivos. Se
fijaron células CV-1/EBNA que expresaban el CD40L
con paraformaldehído dos días después de la transfección, según
describen Armitage y col., Nature (Lond.) 357:80, 1992 y
Springgs y col., J. Exp. Med. 176:1543, 1992. Se purificaron
el IL-3, el IL-4 y el
GM-CSF recombinantes según describen Alderson y
col., J. Immunol. 149:1252, 1992, y tenían actividades
específicas de 9x10^{4}, 1x10^{4} y 5x10^{4} U/\mug.
La molécula de CD40 usada fue una proteína de
fusión del CD40 soluble consistente en el dominio extracelular del
CD40 acoplado a la región Fc de una IgGl humana, construida y
purificada según se describe anteriormente en el Ejemplo 1.
Se establecieron cultivos de monocitos en placas
de 24 pocillos (Costar, Cambridge, Massachusetts) junto con números
crecientes de células CV-1/EBNA que expresaban
transitoriamente el CD40L, bien solo o en presencia del
GM-CSF, el IL-3 o el
IFN-\gamma (10ng/ml). Se detectaron los niveles de
TNF-\alpha a las 24 horas mediante ELISA. La
Figura 3 muestra una relación dependiente de la dosis entre la
inducción del CD40L y la producción de TNF-\alpha.
Solamente se necesitaron 10^{3} células CV-1/EBNA
que expresaban el CD40L para inducir la producción de
TNF-\alpha en presencia del
GM-CSF, el IL-3 o el
IFN-\gamma, aunque grandes cantidades de estas
células solas fueron incapaces de inducir una producción de
TNF-\alpha significativa.
El CD40.Fc o el Acm anti-CD40 M2
mostraron ser capaces de inhibir la producción de
TNF-\alpha inducida por el CD40L. Se estimularon
monocitos con CD40L en presencia de GM-CSF. El
CD40.Fc y el Acm anti-CD40 M2 se usaron a una
concentración final de 10\mug/ml. El TNF-\alpha
fue indetectable (<5 pg/ml) en los cultivos control solo con el
medio, solo con el GM-CSF, solo con el CD40L, solo
con el CD40.Fc o solo con el anticuerpo CD40. La Figura 4 muestra
que tanto en ausencia del CD40.Fc como del Acm
anti-CD40 M2, se estimula la producción de
TNF-\alpha con el CD40L en presencia del
GM-CSF. Por el contrario, el CD40.Fc y el Acm M2
bloqueador del CD40 inhibían la producción de
TNF-\alpha inducida por el CD40L en presencia del
GM-CSF. Un Acm isotípico control y la IgG1 humana
fueron incapaces de bloquear la producción de TNF-a
en este ensayo (no se muestran los datos). Estos datos indican que
el mAc anti-CD40 M2 se une específicamente a la
molécula de CD40 humano y es capaz de bloquear la unión de la
molécula de CD40 a un ligando CD40. Estos datos sugieren además que
el mAc anti-CD40 M2 puede ser útil en el bloqueo de
la inflamación producida por medio de TNF-\alpha
cuando se use en conjunción con otras citoquinas.
Se cebaron ratones BALB/c por primera vez con 0,5
ml de pristano (2, 4, 6, 10 tetrametilpentadecano, Aldrich,
Milwaukee, Wisconsin). Dos semanas más tarde se inyectaron por vía
intraperitoneal a los ratones 1x10^{6} hibridomas de ratón en
tampón fosfato (PBS "phosphate buffer saline"). Aproximadamente
dos o cinco semanas más tardes se le quitó al ratón el líquido
ascítico y se centrifugó para eliminar las células y la materia
particulada.
Se aplicaron cinco mililitros de líquido ascítico
a una columna de proteína A-sefarosa de 3 ml
(Pharmacia, Piscataway, New Jersey) diluida a 1:4 con sulfato de
amonio 0,1M, pH 9. La columna se lavó con 10-20
volúmenes de columna de sulfato de amonio, pH 9. Después, el
anticuerpo purificado se obtuvo lavando la columna con citrato
0,05M, pH 3,0 y se neutralizó con NaOH 1M.
Se aislaron células mononucleares de sangre
periférica humana (PBMC) de la sangre periférica de voluntarios
normales mediante centrifugación por gradiente de densidad a través
de Histopaque® (Sigma, St. Louis, Missouri). Se obtuvieron
preparaciones de células empobrecidas en células T (E^{-})
eliminando las células T mediante "rosetting" con SRBC
(glóbulos rojos de oveja) tratado con bromuro de
2-aminoetilisotiouronio y centrifugación por
gradiente de densidad a través de Histopaque®. Los ensayos de
proliferación de células B se llevaron a cabo con preparaciones de
E^{-} en medios RPMI con 10% de suero bovino fetal (SBF)
inactivado por calor, a 37ºC y en una atmósfera con 10% de CO_{2}.
Se cultivaron 1x10^{5} células E^{-}por pocillo, por
triplicado, en placas de microtítulo (Corning) de 96 pocillos y
fondo plano, durante tres días, tanto en presencia del ligando
trimérico del CD40 solo (células del fluido sobrenadante, dilución
1:40, transfectadas con un vector de expresión que codifica el
CD40-L trimérico soluble sustancialmente como se
describe en PCT/EE.UU.92/08990), como del ligando del CD40 trimérico
soluble y anti-IgM inmovilizada (5\mug/ml; BioRad,
Richmond, Virginia) o del ligando del CD40 trimérico soluble y
interleucina-4 (5 ng/ml). Además, se titularon el
anticuerpo M2 (descrito en la presente invención), el
G28-5 (descrito en Ledbetter y col., patente de
EE.UU. 5.247.069), el EA5 y el BE1 (ambos descritos por Dörken y
col., Leukocyte Typing IV, 1989), otro anticuerpo
anti-CD40, el S2C6, o IgG murina control, para
observar el efecto de los diversos anticuerpos en la proliferación
de las células B. Las células se marcaron con 1 \muCi/pocillo de
timidina tritiada (25 Ci/nmol Amersham, Arlington Heights,
Illinois) durante las últimas ocho horas de cultivo. Las células se
recogieron en discos de fibra de vídrio con un colector de células
automático y las cpm incorporadas se midieron mediante
espectrometría de centelleo líquido. Los resultados se muestran de
la Figura 5 a la 7. El anticuerpo monoclonal M2 inhibía la
proliferación de células B inducida por el ligando del CD40,
mientras que el anticuerpo G28-5 y otro anticuerpo
monoclonal anti-CD40, el S2C6, no tenían ningún
efecto sobre la proliferación. Los anticuerpos EA5 y BE1 realmente
aumentaban la proliferacion. Experimentos similares han demostrado
que el anticuerpo monoclonal M3 actuaba del mismo modo que el
anticuerpo monoclonal M2.
Claims (5)
1. Anticuerpo monoclonal murino producido por el
hibridoma murino HuCD40-M2 (ATCC HB 11459).
2. Un anticuerpo monoclonal humanizado que
comprende el sitio de unión del antígeno de un anticuerpo monoclonal
murino producido por el hibridoma murino HuCD40-M2
(ATCC HB 11459).
3. Un fragmento Fv de cadena única o un fragmento
Fv bivalente de un anticuerpo monoclonal según se define en la
reivindicación 1.
4. Una composición terapéutica que comprende el
anticuerpo monoclonal según una cualquiera de las reivindicaciones 1
a 3 y un vehículo o diluyente aceptable fisiológicamente.
5. El uso de un anticuerpo monoclonal o un
fragmento de éste según las reivindicaciones 1 a 3 en la preparación
de un agente para la inhibición de la respuesta inmune o
inflamatoria producida por medio del ligando del CD40.
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Families Citing this family (50)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5874082A (en) * | 1992-07-09 | 1999-02-23 | Chiron Corporation | Humanized anti-CD40 monoclonal antibodies and fragments capable of blocking B cell proliferation |
| US5397703A (en) | 1992-07-09 | 1995-03-14 | Cetus Oncology Corporation | Method for generation of antibodies to cell surface molecules |
| AU699291B2 (en) * | 1995-03-01 | 1998-11-26 | Immunex Corporation | Method for stimulating an immune response |
| US6340459B1 (en) | 1995-12-01 | 2002-01-22 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Therapeutic applications for the anti-T-BAM (CD40-L) monoclonal antibody 5C8 in the treatment of reperfusion injury in non-transplant recipients |
| US20020102706A1 (en) * | 1997-06-18 | 2002-08-01 | Genentech, Inc. | Apo-2DcR |
| JP2002508663A (ja) * | 1997-06-18 | 2002-03-19 | ジェネンテク，インコーポレイテッド | Ａｐｏ−２ＤｃＲ |
| DK1616579T3 (da) * | 1998-05-23 | 2009-09-14 | Univ Leiden Medical Ct | CD40 bindende molekyler og CTL peptider til behandling af tumorer |
| EP2039368A3 (en) | 1999-04-30 | 2009-04-01 | La Jolla Institute For Allergy And Immunology | Methods for preventing reactivation of latent virus and controlling virus replication |
| US6946129B1 (en) | 1999-06-08 | 2005-09-20 | Seattle Genetics, Inc. | Recombinant anti-CD40 antibody and uses thereof |
| AU1072701A (en) * | 1999-10-04 | 2001-05-10 | Chiron Corporation | Cd40 antagonist for treating psoriasis |
| US20020028178A1 (en) * | 2000-07-12 | 2002-03-07 | Nabil Hanna | Treatment of B cell malignancies using combination of B cell depleting antibody and immune modulating antibody related applications |
| EP1975182A1 (en) | 2000-02-01 | 2008-10-01 | PanGenetics B.V. | CD40-binding APC-activating molecules |
| CN1437478A (zh) * | 2000-04-25 | 2003-08-20 | Idec药物公司 | 瑞图希单抗的鞘内施用,用于中枢神经系统淋巴瘤的治疗 |
| AU2001259215A1 (en) * | 2000-04-28 | 2001-11-12 | La Jolla Institute For Allergy And Immunology | Human anti-cd40 antibodies and methods of making and using same |
| US20030059427A1 (en) * | 2000-04-28 | 2003-03-27 | Force Walker R. | Isolation and characterization of highly active anti-CD40 antibody |
| US7063845B2 (en) | 2000-04-28 | 2006-06-20 | Gemini Science, Inc. | Human anti-CD40 antibodies |
| CA2424749A1 (en) | 2000-10-02 | 2002-04-11 | Chiron Corporation | Methods of therapy for b-cell malignancies using antagonist anti-cd40 antibodies |
| US20020159996A1 (en) * | 2001-01-31 | 2002-10-31 | Kandasamy Hariharan | Use of CD23 antagonists for the treatment of neoplastic disorders |
| US20030103971A1 (en) * | 2001-11-09 | 2003-06-05 | Kandasamy Hariharan | Immunoregulatory antibodies and uses thereof |
| US20070065436A1 (en) * | 2001-01-31 | 2007-03-22 | Biogen Idec Inc. | Anti-cd80 antibody having adcc activity for adcc mediated killing of b cell lymphoma cells alone or in combination with other therapies |
| US20030211107A1 (en) * | 2002-01-31 | 2003-11-13 | Kandasamy Hariharan | Use of CD23 antagonists for the treatment of neoplastic disorders |
| CA2436180C (en) | 2001-01-31 | 2011-11-08 | Idec Pharmaceutical Corporation | Immunoregulatory antibodies and uses thereof |
| CN101508734A (zh) * | 2001-04-27 | 2009-08-19 | 协和发酵麒麟株式会社 | 抗cd40单克隆抗体 |
| WO2003024480A2 (en) * | 2001-09-14 | 2003-03-27 | Cytos Biotechnology Ag | In vivo activation of antigen presenting cells for enhancement of immune responses induced by virus like particles |
| AR039067A1 (es) | 2001-11-09 | 2005-02-09 | Pfizer Prod Inc | Anticuerpos para cd40 |
| EP2075256A2 (en) | 2002-01-14 | 2009-07-01 | William Herman | Multispecific binding molecules |
| US20030180292A1 (en) * | 2002-03-14 | 2003-09-25 | Idec Pharmaceuticals | Treatment of B cell malignancies using anti-CD40L antibodies in combination with anti-CD20 antibodies and/or chemotherapeutics and radiotherapy |
| JP4765038B2 (ja) * | 2003-11-04 | 2011-09-07 | ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド | Ｃｄ４０細胞表面抗原を発現する固形腫瘍の治療方法 |
| US8277810B2 (en) | 2003-11-04 | 2012-10-02 | Novartis Vaccines & Diagnostics, Inc. | Antagonist anti-CD40 antibodies |
| US20050136055A1 (en) * | 2003-12-22 | 2005-06-23 | Pfizer Inc | CD40 antibody formulation and methods |
| CN1980957A (zh) | 2004-03-23 | 2007-06-13 | 比奥根艾迪克Ma公司 | 受体偶联剂及其治疗用途 |
| US20080057070A1 (en) * | 2004-11-04 | 2008-03-06 | Chiron Corporation | Antagonist Anti-Cd40 Monoclonal Antibodies and Methods for Their Use |
| KR101395005B1 (ko) * | 2005-11-01 | 2014-05-21 | 조마 테크놀로지 리미티드 | 항ｃｄ40 항체의 용도 |
| KR20080073725A (ko) * | 2005-11-01 | 2008-08-11 | 노파르티스 아게 | 항-ｃｄ40 항체의 용도 |
| MX2008013508A (es) | 2006-04-21 | 2008-10-31 | Novartis Ag | Composiciones farmaceuticas de anticuerpos antagonistas anti-cd40. |
| AU2007248628B2 (en) * | 2006-05-03 | 2013-02-07 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | CD40 agonist antibody/type1 interferon synergistic adjuvant combination, conjugates containing and use thereof as a therapeutic to enhance cellular immunity |
| US20090074711A1 (en) * | 2006-09-07 | 2009-03-19 | University Of Southhampton | Human therapies using chimeric agonistic anti-human cd40 antibody |
| AR083847A1 (es) | 2010-11-15 | 2013-03-27 | Novartis Ag | Variantes de fc (fragmento constante) silenciosas de los anticuerpos anti-cd40 |
| EP2683406B1 (en) | 2011-03-11 | 2019-05-08 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Anti-cd40 antibodies and uses thereof |
| RU2609647C2 (ru) | 2011-04-29 | 2017-02-02 | Апексиджен, Инк. | Анти-cd40-антитела и способы применения |
| CN109265552A (zh) | 2012-10-30 | 2019-01-25 | 埃派斯进有限公司 | 抗-cd40抗体及其使用方法 |
| HUE048284T2 (hu) | 2015-05-29 | 2020-07-28 | Abbvie Inc | Anti-CD40 antitestek és alkalmazásuk |
| SI3307322T1 (sl) | 2015-09-04 | 2021-08-31 | Primatope Therapeutics Inc. | Humanizirana protitelesa proti CD40 in njihove uporabe |
| EP3355921A4 (en) | 2015-09-30 | 2019-05-22 | Janssen Biotech, Inc. | ANTAGONIST ANTIBODIES SPECIFICALLY BINDING TO HUMAN CD40 AND METHODS OF USE |
| US11497781B2 (en) | 2016-03-10 | 2022-11-15 | Cg Oncology, Inc. | Methods of treating bladder cancer by combination therapy comprising the oncolytic adenovirus CG0070 and an immune checkpoint inhibitor |
| AU2017252527A1 (en) | 2016-04-18 | 2018-11-08 | Celldex Therapeutics, Inc. | Agonistic antibodies that bind human CD40 and uses thereof |
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