ES2181607T3

ES2181607T3 - Procedimiento para la reticulacion de acido hialuronico a polimeros.

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Publication number: ES2181607T3
Application number: ES00901772T
Authority: ES
Inventors: Xiaobin Fermentech Med. Ltd. Zhao; Catherine Fermentech Med. Ltd. ALEXANDER; Jane Elizabeth Fermentech Med. Ltd. FRASER
Original assignee: Mentor Biopolymers Ltd
Current assignee: Mentor Biopolymers Ltd
Priority date: 1999-02-05
Filing date: 2000-02-03
Publication date: 2007-05-01
Anticipated expiration: 2020-02-03
Also published as: CN1342170A; US6703444B2; WO2000046252A1; EP1163274B9; DE1163274T1; ATE335011T1; BR0007985A; AU773628B2; EP1163274B1; BR0007985B1; AU2307200A; MXPA01007877A; PT1163274E; DK1163274T3; GB9902652D0; US20040127699A1; JP2002536465A; CN1243773C; CA2362233A1; US7226972B2

Abstract

Procedimiento para la preparación de derivados de ácido hialurónico reticulados de forma múltiple, caracterizado porque comprende reticular HA a uno o más polímeros distintos de HA y opcionalmente a otra molécula de HA por vía de dos o más grupos funcionales diferentes.

Description

Procedimiento para la reticulación de ácido hialurónico a polímeros.

La presente invención se refiere a un procedimiento para la producción de derivados de ácido hialurónico (HA), en particular derivados de ácido hialurónico reticulados de forma múltiple, por ejemplo de forma doble, a los nuevos derivados reticulados así obtenidos, a productos que contienen tales derivados y a sus usos en aplicaciones cosméticas, médicas y farmacéuticas.

El HA es un miembro de una clase de polímeros conocidos como glicosaminoglicanos. El HA es un polisacárido lineal de cadena larga y normalmente está presente como la sal sódica que tiene la forma molecular (C_{14}H_{20}NNaO_{11})_{n}
en donde n puede variar de acuerdo con el origen, procedimiento de aislamiento y método de determinación. Sin embargo, se han indicado pesos moleculares de hasta 14 x 10^{6}.

El HA y sus sales se pueden aislar de muchas fuentes incluyendo cordón umbilical humano, crestas de gallos y casi todas las matrices conectivas de organismos vertebrados. El HA es también un componente capsular de bacterias tales como Streptococci como ha sido demostrado por Kendall et al, (1937), Biochem. Biophys. Acta, 279, 401-405; por tanto, también se puede obtener mediante métodos de fermentación. Por ejemplo, la Patente US No. 5.411.874 de la presente entidad solicitante describe un método para la producción de ácido hialurónico por fermentación continua de Streptococcus equi.

El HA es no inmunógeno y, por tanto, presenta un gran potencial en medicina. Debido a sus propiedades visco-elásticas, se ha comprobado que el HA que tiene un alto peso molecular (por encima de 1 millón) resulta particularmente útil en una variedad de campos clínicos, incluyendo tratamiento de heridas, cirugía oftálmica y cirugía ortopédica. El HA es también potencialmente útil en un variedad de campos no médicos, tales como aplicaciones cosméticas.

Sin embargo, el uso de HA en alguna de estas aplicaciones queda limitado por el hecho de que después de su administración a seres humanos, el HA es degradado fácilmente por enzimas tales como hialuronidasas y por radicales libres. Además, el HA es soluble en agua a temperatura ambiente, lo cual puede hacer que resulte menos adecuado para ciertas aplicaciones. Por tanto, se han realizado varios intentos para preparar formas más estables de HA, en particular por reticulación de las moléculas de HA.

Así, la USP 4.582.865 (Biomatrix Inc.) describe la preparación de geles reticulados de ácido hialurónico que se forman por reticulación de HA bien por sí mismo o mezclado con otros polímeros hidrófilos empleando divinilsulfona como agente reticulante. Parece ser que en este caso la reticulación surge por vía de los grupos hidroxilo del
HA.

La USP 5.550.187 (Collagen Corporation) describe un método para la preparación de composiciones de biomateriales reticulados que comprende mezclar un polímero biocompatible, que preferentemente es colágeno pero que puede ser seleccionado entre otros polímeros incluyendo ácido hialurónico, con un agente reticulante seco estéril, tal como un polímero hidrófilo sintético.

La USP 5.510.121 (Rhee et al.) describe conjugados formados enlazando covalentemente glicosaminoglicanos o sus derivados a polímeros sintéticos hidrófilos, en particular derivados activos de PEG. El procedimiento descrito implica al parecer solo una etapa de reticulación.

La USP 5.578. 661 (Nepara Inc.) describe un sistema formador de gel para utilizarse como un vendaje para heridas y que está formado a partir de tres componentes principales, siendo el primero un polímero soluble en agua, siendo el segundo un polímero que contiene ácido y siendo el tercero un polisacárido o polímero que contiene grupos amino, tal como ácido hialurónico. En este caso, la reticulación parece surgir por vía de enlace iónico.

La USP 5.644.049 (Italian Ministry for Universities and Scientific and Technology Research) describe un biomaterial que comprende una red polimérica inter-penetrante (IPN) en donde uno de los componentes poliméricos es un polisacárido ácido tal como ácido hialurónico y el segundo componente polimérico puede ser un polímero químico sintético. Los dos componentes pueden estar reticulados (pero no necesariamente).

Tomihata e Ikada han informado sobre la reticulación de HA empleando una carbodiimida soluble en agua como agente reticulante. Se postuló que la reticulación tenía lugar por vía de grupos éster. También se efectúo la reacción de reticulación en presencia de éster metílico de L-lisina, lo cual proporcionó al parecer una reticulación adicional por vía de enlaces amida al éster de lisina (J. Biomed. Mater. Res., 37, 243-251, 1997).

La Patente US No. 5.800.541 describe matrices de colágeno-polímero sintético preparadas empleando una reacción en múltiples etapas. La primera etapa comprende hacer reaccionar colágeno con un polímero hidrófilo sintético; la matriz resultante puede ser modificada entonces en una segunda etapa de reacción que puede implicar la reticulación o conjugación de la matriz con un polímero sintético, el acoplamiento en la matriz de moléculas biológicamente activas o glicosaminoglicanos, la reticulación de la matriz empleando agentes reticulantes químicos convencionales o la modificación del colágeno en la matriz por medio de reacción química. En este proceso, la matriz inicial de colágeno-polímero sintético parece ser reticulada sólo por vía de un tipo de enlace y las etapas adicionales del proceso sirven para introducir otras sustancias químicas que pueden formar diferentes tipos de enlaces. Sin embargo, no parece que cualquiera de las dos sustancias que forman el producto se enlacen entre sí por más de un tipo de enlace.

La solicitud de patente internacional WO 97/04012 (Agerup) describe composiciones en gel de polisacáridos (que pueden consistir, inter alia, en ácido hialurónico) que se preparan formando una solución acuosa del polisacárido, iniciando la reticulación en presencia de un agente reticulante polifuncional, impidiendo estéricamente que la reacción de reticulación se termine antes de que se presente la gelificación (por ejemplo por dilución de la solución) e introduciendo entonces de nuevo condiciones no estéricamente impedidas (por ejemplo por evaporación de la solución), con el fin de continuar la reticulación a un gel visco-elástico. En esta solicitud no se dice nada sobre la formación de diferentes tipos de enlaces en las dos etapas de reticulación.

La WO 98/02204 describe dispositivos médicos constituidos por hidrogeles conformados que comprenden polímeros, tal como HA, que están reticulados tanto iónicamente como no iónicamente. La US 5677276 describe conjugados de un polipéptido sintético y un polímero biodegradable, tal como hialuronato, que facilitan la curación de heridas y la regeneración de tejido. El HA y el polipéptido se reticulan por medio de un solo tipo de reticulación.

Ninguno de los documentos anteriormente mencionados describen productos en donde el HA está reticulado a una o más moléculas poliméricas (las cuales pueden ser iguales o diferentes) por medio de dos tipos diferentes de enlaces de reticulación.

Se ha comprobado ahora que el ácido hialurónico puede ser reticulado con otros polímeros por dos tipos diferentes de enlaces de reticulación, para efectuar una "reticulación doble". La formación de diferentes tipos de enlaces se consigue efectuando la reticulación por vía de diferentes grupos funcionales. Los enlaces así formados pueden ser descritos, por tanto, como enlaces funcionales. De este modo, por ejemplo, se puede formar un tipo de enlace por reticulación por vía de grupos hidroxilo y se puede formar un enlace funcional diferente por reticulación por vía, por ejemplo, de grupos carboxilo. Se ha comprobado que dicha reticulación múltiple se traduce en un alto grado de reticulación con una bioestabilidad mejorada del HA en base al grado se reticulación y a la selección del segundo polímero.

Por tanto, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para la preparación de derivados de ácido hialurónico reticulados de forma múltiple (por ejemplo, de forma doble), cuyo procedimiento comprende reticular el HA a uno o más polímeros distintos de HA y opcionalmente a otra molécula por vía de dos o más grupos funcionales diferentes, en donde dicha reticulación se efectúa poniendo en contacto el HA y un polímero distinto de HA con uno o más agentes reticulantes químicos con el fin de formar dos o más reticulaciones químicamente distintas entre el HA y dicho polímero. Esto se puede efectuar de manera simultánea o secuencial, como se describe a continuación con mayor detalle.

En esta descripción, el polímero al cual se puede reticular el HA puede ser referido en general como "polímero", "segundo polímero" o "posterior polímero". El "segundo polímero" o "posterior polímero" puede comprender una mezcla de polímeros.

En esta descripción, la expresión "HA reticulado de forma múltiple" se refiere a un derivado de ácido hialurónico en donde una molécula de HA está reticulada a un segundo polímero y opcionalmente a un posterior polímero y/u otra molécula de HA por medio de dos o más tipos diferentes de enlaces funcionales. Similarmente, la expresión "HA reticulado de forma doble" se refiere a un derivado de ácido hialurónico en donde una molécula de HA está reticulada a un segundo polímero y opcionalmente a un posterior polímero y/u otra molécula de HA por medio de dos o más tipos diferentes de enlaces funcionales y la expresión "HA reticulado de forma simple" se refiere a un derivado de ácido hialurónico en donde una molécula de HA está reticulada solo a un segundo polímero por medio de sólo un tipo de enlace funcional.

Los polímeros a los cuales se puede reticular el HA de acuerdo con la presente invención incluyen biopolímeros y polímeros sintéticos. Como es lógico, podrá apreciarse que dicho polímero deberá ser atóxico y biocompatible. Con preferencia, el segundo (o posterior) polímero es un polímero soluble en agua. También podrá apreciarse que las propiedades del segundo (o posterior) polímero influenciarán en cierto grado las propiedades del producto reticulado final. Por tanto, el segundo o posterior polímero deberá seleccionarse teniendo en cuenta las propiedades deseadas en el producto final y deberá ser compatible con, e incluso acentuar, estas propiedades. En particular, el segundo (o posterior) polímero tenderá preferentemente una buena bioestabilidad.

Polímeros sintéticos que pueden ser empleados incluyen alcohol polivinílico (PVA), óxido de polietileno (PEO) y óxido de polipropileno (PPO), así como copolímeros de cualquiera de los polímeros antes mencionados, ha sido poliacrílico, poliacrilamida y otros polímeros sintéticos hidroxílicos, carboxílicos e hidrófilos.

Los biopolímeros que pueden ser empleados de acuerdo con la presente invención incluyen polipéptidos, celulosa y sus derivados tales como hidroxietilcelulosa y carboximetilcelulosa, alginato, quitosano, lípido, dextrano, almidón, goma de gelano y otros polisacáridos.

Los polímeros antes mencionados pueden ser no iónicos, aniónicos o catiónicos. Los polímeros no iónicos incluyen PVA, PEO y copolímeros tal como PEO-PPO-PEO. Los polímeros catiónicos incluyen quitosano; polímeros que contienen grupos amino, colágeno y gelatina. Los polímeros aniónicos incluyen alginato, goma de gelano, carboximetilcelulosa (CMC), ácido poliacrílico y ácido poliaspártico.

Podrá apreciarse que ciertos polímeros, por ejemplo polipéptidos, pueden existir de forma aniónica o catiónica, dependiendo de varios factores, por ejemplo, del pH de la mezcla de reacción. En general, es preferible utilizar dichos polímeros bajo condiciones que hagan que los mismos sean aniónicos.

La reticulación de cada tipo de grupo funcional se puede efectuar de forma simultánea o secuencial, como se describe con mayor detalle a continuación.

Los grupos funcionales que fundamentalmente son responsables de la reticulación de las moléculas de HA al segundo polímero son los grupos hidroxilo y carboxilo. Los grupos hidroxilo pueden ser reticulados por vía de un enlace éter y los grupos carboxilo por vía de un enlace éster. Si se desea, el HA puede ser modificado químicamente antes de la reticulación para formar otros grupos químicamente reactivos. Así, por ejemplo, el HA puede ser tratado con ácido o base, de forma que experimentará una desacetilación al menos parcial, dando ello lugar a la presencia de grupos amino libre. Dichos grupos amino pueden ser reticulados por vía de un enlace amida (-C(O)-NH-); imino (-N=CH-) o amina secundaria (-NH-CH-). Un enlace imino es un precursor de un enlace amina y un enlace imino puede ser convertido a un enlace amina en presencia de un agente reductor.

Agentes reticulantes que pueden ser empleados en el procedimiento de la presente invención incluyen aquellos que ya son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, formaldehído, glutaraldehído, divinilsulfona, un polianhídrido, un polialdehído, un alcohol polihídrico, carbodiimida, epiclorhidrina, diglicidiléter de etilenglicol, diglicidiléter de butanodiol, poliglicidiléter de poliglicerol, polietilenglicol, diglicidiléter de polipropilenglicol o un reticulante bis- o poli-epoxi tal como 1,2,3,4-diepoxibutano o 1,2,7,8-diepoxioctano.

Para formar un enlace éter, el agente reticulante se elige preferentemente entre formaldehído, glutaraldehído, divinilsulfona y, en condiciones alcalinas, bis- y poli-epóxidos. Con preferencia, el reticulante contiene un segmento hidrocarbonado hidrófobo, por ejemplo 1,2,3,4-diepoxibutano o con suma preferencia 1,2,7,8-diepoxioctano.

Para formar un enlace éster, el agente reticulante se elige preferentemente entre alcoholes polihídricos, carbodiimidas, polianhídridos, cloruros de ácido carboxílico y, en condiciones ácidas, bis- y poli-epóxidos. Con preferencia, el reticulante contiene un segmento hidrocarbonado hidrófobo, por ejemplo 1,2,3,4-diepoxibutano o con suma preferencia 1,2,7,8-diepoxioctano.

Un enlace amida se forma preferentemente empleando un agente reticulante elegido entre carbodiimidas en presencia de aminas, anhídridos y cloruros de ácido carboxílico (con HA desacetilado), y diisocianatos.

Un enlace amina se forma preferentemente empleando un agente reticulante elegido entre un epóxido o glutaraldehído con un agente reductor, en presencia de grupos amino en el HA desacilado.

Un enlace imino (enlace de base de Schiff) se puede formar empleando glutaraldehído en presencia de grupos amino en el HA desacilado.

Un enlace sulfona se forma preferentemente empleando un cloruro de sulfonilo.

En una modalidad de la presente invención, los diferentes enlaces funcionales se pueden formar de manera secuencial, en un proceso de múltiples etapas, lo cual se puede conseguir empleando un agente reticulante diferente en cada etapa o empleando el mismo agente reticulante en cada etapa y ajustando las condiciones de reacción para controlar la reacción de reticulación específica requerida.

Así, para conseguir una reticulación múltiple, por ejemplo doble, por etapas de acuerdo con la presente invención, se efectúa una primera reacción de reticulación, por ejemplo empleando uno de los métodos a continuación descritos. Finalizada esta etapa o una vez que ha progresado en el grado requerido, se añade otro agente reticulante a la mezcla de reacción para efectuar la segunda reticulación. El otro agente reticulante puede ser el mismo o distinto del primero. Cuando se emplea un agente reticulante diferente, el mismo se elegirá generalmente de manera que, sin cambiar las condiciones de reacción, se formará un tipo diferente de enlace funcional. Sin embargo, cuando se emplea el mismo agente reticulante para formar ambas reticulaciones, las condiciones de reacción deberán ajustarse consecuentemente con el fin de formar un tipo diferente de enlace. Los expertos en la materia podrán seleccionar fácilmente un agente reticulante adecuado y las condiciones de reacción apropiadas para formar el enlace deseado.

Para evitar dudas, ha de apreciarse que si se emplea el mismo agente reticulante bajo las mismas condiciones de reacción en cada etapa, esto dará lugar sólo a un tipo de enlace, es decir, se obtendrá un producto reticulado una sola vez, aunque producido en dos o más etapas.

Podrá apreciarse que cuando los dos o más enlaces funcionales de acuerdo con la invención se forman de manera secuencial, es decir, en una reacción en múltiples etapas, la reticulación formada en la primera etapa de la reacción deberá ser lo suficientemente fuerte para soportar las condiciones de reacción necesarias para formar la segunda o posteriores reticulaciones. De este modo, en primer lugar deberá formarse el más fuerte de los dos (o más) enlaces. Esto resultará fácilmente evidente para el experto en la materia y, si es necesario, se puede determinar por medio de experimentación rutinaria.

De este modo, cuando las reticulaciones han de formarse por vía de grupos hidroxilo y carboxilo, se reconocerá que la reticulación de la primera etapa deberá efectuarse por vía de los grupos hidroxilo para proporcionar un enlace éter y la reticulación de la segunda etapa se efectuará entonces por vía de los grupos carboxilo, para proporcionar un enlace éster.

Un enlace éter se puede formar empleando un epóxido reticulante bajo condiciones alcalinas, preferentemente a un pH de 10 o más o, siempre que el HA no contenga grupos amino libres, empleando glutaraldehído como el agente reticulante bajo condiciones ácidas, por ejemplo un pH de 4 o menos. Un enlace éster se puede formar con epóxido reticulante bajo condiciones ácidas, por ejemplo un pH de 4 o menos.

Así, por ejemplo, se puede efectuar una primera reacción de reticulación para formar un enlace éter empleando un epóxido tal como 1,2,7,8-diepoxioctano bajo condiciones alcalinas, preferentemente a un pH de 10 o más, por ejemplo a un pH de 10 a 12. A continuación se puede efectuar una segunda reacción de reticulación para formar un enlace éster empleando el mismo agente reticulante y ajustando el pH del medio de reacción a un pH de 4 o menos, por ejemplo a un pH de 4 a 2. Alternativamente, se pueden emplear en cada etapa distintos agentes reticulantes, en cuyo caso puede no ser necesario ajustar las condiciones de reacción. Así, por ejemplo, se puede efectuar una primera reacción de reticulación empleando glutaraldehído bajo condiciones ácidas para formar un enlace éter, seguido por reacción con un epóxido reticulante también bajo condiciones ácidas, para formar un enlace éster.

La concentración de HA con respecto al polímero total empleado (es decir, HA + segundo + posterior polímero, referido aquí como material compuesto de HA/polímero), será generalmente del orden de 1 a 99%, por ejemplo de 5 a 95%. Preferentemente, la concentración de HA en el material compuesto de HA/polímero es de al menos 50% y puede ser de hasta 99%, por ejemplo 90% de HA.

La relación de agente reticulante a polímero total (HA + segundo polímero) empleada en cada etapa de este procedimiento, será en general del orden de 1:10 a 10:1 en peso.

Las reacciones de reticulación individuales se pueden efectuar de acuerdo con métodos conocidos generalmente en la técnica.

Así, el HA y el segundo polímero empleados como materiales de partida pueden encontrarse en forma de una película o en solución. Se puede obtener una película de HA/segundo polímero mezclando HA y el segundo polímero requerido en solución acuosa y secando dicha solución para formar una película. Cuando se emplea dicha película, ésta se puede suspender en un disolvente adecuado junto con agente reticulante. El medio de reacción comprende preferentemente un disolvente orgánico tal como acetona, cloroformo o un alcohol, por ejemplo etanol o isopropanol, en mezcla con una solución acuosa ácida o alcalina. Una solución ácida tiene preferentemente un pH de 4 o menos y una solución alcalina tiene preferentemente un pH de 10 o mayor. La reacción de reticulación tiene lugar adecuadamente a una temperatura del orden de 15 a 30ºC, por ejemplo a temperatura ambiente.

Con preferencia, cuando se emplea una película de HA/polímero como material de partida, se forma primero un enlace éter bien con un epóxido bajo condiciones alcalinas o bien, siempre que no estén presentes grupos amino libres, con glutaraldehído bajo condiciones ácidas, seguido por la formación de un enlace éster empleando epóxido bajo condiciones ácidas. Cuando una película de HA/polímero contiene grupos amino, se pude formar una base de Schiff con un enlace imino mediante reacción con glutaraldehído bajo condiciones ácidas. Este enlace imino se puede convertir a un enlace amina empleando un agente reductor.

Alternativamente, el reticulante se puede añadir a una solución acuosa ácida o alcalina HA y del segundo polímero. Bajo condiciones ácidas, el pH de la solución de partida es con preferencia de 4 o menos y, para una solución alcalina, el pH es con preferencia de 10 o más. La concentración de polímero total, es decir HA más otro polímero en la solución es convenientemente del orden de 1 a 10% p/p. La reacción se puede efectuar a una temperatura de 15 a 50ºC. El tiempo para completar la reacción de reticulación puede variar en general entre una hora y varios días aproximadamente. Con preferencia, cuando se emplea una solución de HA y segundo polímero se forma primero un enlace éter con un epóxido bajo condiciones alcalinas, seguido por la formación de una reticulación éster empleando un epóxido (preferentemente el mismo epóxido que en la primera etapa) bajo condiciones ácidas.

Según otro método, se puede someter una solución de HA y segundo polímero a una primera reacción de reticulación, tras lo cual el producto intermedio se seca para formar una película la cual se somete a otra reacción de reticulación como se ha descrito anteriormente, para proporcionar un producto doblemente reticulado en forma de una película. Con preferencia, para obtener un derivado de HA doblemente reticulado de acuerdo con este procedimiento, se forma primero una reticulación éter con un epóxido bajo condiciones alcalinas, seguido por la formación de una reticulación éster empleando un epóxido (preferentemente el mismo epóxido que en la primera etapa) bajo condiciones ácidas.

En otra modalidad de esta invención, se puede efectuar una reticulación múltiple del HA con un segundo polímero, en particular una reticulación doble, en una reacción de un sola etapa, poniendo en contacto el HA y el segundo polímero simultáneamente con dos agentes reticulantes diferentes, adecuados para reticular dos grupos funcionales diferentes bajo las mismas condiciones. Así, por ejemplo, para formar ambos grupos éter y éster en una sola etapa, el HA y el segundo polímero se pueden poner en contacto con una mezcla de glutaraldehído y 1,2,7,8-diepoxioctano.

La naturaleza precisa del producto se puede variar mediante la selección adecuada de las condiciones de reacción con el fin de controlar el grado de reticulación y por tanto las propiedades del producto. Los factores que influencian el grado de reticulación y por tanto la naturaleza del producto final incluyen la forma del HA empleado como material de partida, la naturaleza del segundo polímero, la relación de alimentación de agente reticulante a Ha y segundo polímero, el tiempo de reacción, la temperatura y el pH. El producto se puede obtener en forma de un gel o película y puede ser transparente u opaco. La capacidad de absorción de agua y la bioestabilidad variarán en función de la naturaleza precisa del producto.

Se puede obtener un producto de acuerdo con la invención en forma de película o lámina empleando los materiales de partida de HA y otro polímero en forma de una solución, película o lámina y efectuando el procedimiento sin agitación. Se puede obtener una película o lámina no reticulada que comprende HA y un segundo polímero mezclando HA y dicho segundo polímero en solución y secando para obtener una película o lámina. Podrá apreciarse que cuando se emplea el HA más polímero en forma de película o lámina, ésta absorberá agua cuando se ponga en solución acuosa, tal como tampón PBS, y se hinchará para formar un gel. Si se desea, se puede formar opcionalmente una película intermedia después de la primera etapa de reticulación, como se ha descrito anteriormente. El producto puede ser transparente u opaco, dependiendo del grado de reticulación y de la naturaleza del otro u otros polímeros a los cuales se reticula el HA. De este modo, por ejemplo, la reticulación de HA con un polímero tal como PVA puede dar lugar a un producto opaco en forma de película o lámina. Los productos de HA/polímero altamente reticulados son en general opacos y pueden incluso ser de color blanco.

Se puede obtener un producto de acuerdo con la invención en forma de un gel por hidratación de una película, la cual, por ejemplo, puede prepararse como anteriormente se ha descrito. Si es necesario, la película puede subdividirse en pequeñas piezas para facilitar la absorción de agua.

Para obtener un producto de acuerdo con la invención en forma de un gel opaco, los materiales de partida de HA y otro polímero se pueden emplear en forma de una solución, película o lámina y todo el procedimiento se efectúa con agitación y sin formación de una película en cualquier etapa.

Cualquiera que sea el método de reticulación que se utilice, el término de la reacción se puede controlar de forma usual por métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, la reacción se puede terminar por neutralización de la mezcla de reacción y precipitación en disolvente para obtener un producto con el grado deseado de reticulación.

El producto final puede ser aislado del medio de reacción por procedimientos convencionales.

Podrá entenderse que cuando se requiera un producto que contenga más de dos reticulaciones diferentes, éste se puede preparar mediante una combinación adecuada de reacciones de reticulación en secuencia o simultáneas, como anteriormente se ha descrito.

Se pueden reticular HA y alginato por vía de grupos tanto hidroxilo como carboxilo dando ello como resultado enlaces de reticulación éter y éster. Por tanto, podrá apreciarse que cuando la reticulación se efectúa por etapas, el enlace éter deberá formarse antes que el enlace éster. Preferentemente, se efectúa una primera reacción de reticulación empleando un epóxido como reticulante tal como 1,2,7,8-diepoxioctano, bajo condiciones alcalinas, seguido por una segunda reacción de reticulación con un epóxido tal como 1,2,7,8-diepoxioctano bajo condiciones ácidas.

En esta modalidad, la reticulación puede tener lugar por vía de grupos hidroxilo y carboxilo presentes en ambos polímeros y, de este modo, el HA forma dos enlaces funcionales diferentes (éter y éster) con el alginato. Otros polímeros aniónicos, tales como carboximetilcelulosa y goma de gelano, así como otros polímeros que poseen dos grupos funcionales diferentes, pueden ser doblemente reticulados con HA de manera similar.

En el caso de polímeros aniónicos que contienen solo grupos carboxilo, tal como ácido poliacrílico, podrá apreciarse que solo se formará una única reticulación con HA por vía de un enlace éster. Se puede formar una segunda reticulación, de acuerdo con la presente invención, entre dos moléculas de HA o entre el HA reticulado y un polímero diferente.

En otra modalidad específica, el HA puede ser reticulado con el polímero no iónico alcohol polivinílico (PVA). En este caso, el HA y el PVA se reticulan por vía de grupos hidroxilo, formando un enlace éster y el HA se reticula adicionalmente a otra molécula de HA por vía de grupos carboxilo, formando un enlace éster.

El HA y el PVA se pueden mezclar en primer lugar en solución, la cual se puede secar para proporcionar una película de HA/PVA que no está reticulada. La reticulación se puede efectuar por los métodos anteriormente descritos. Con preferencia, la reticulación se efectúa por etapas, con formación de una reticulación éter entre HA y PVA seguido por la formación de una reticulación éster entre dos moléculas de HA. Preferentemente, el enlace éter se forma empleando un epóxido bajo condiciones alcalinas y el enlace éster se forma empleando un epóxido bajo condiciones ácidas. Convenientemente, el epóxido es 1,2,7,8-diepoxioctano.

Según otra modalidad específica, el HA puede ser reticulado con el biopolímero quitosano (CS). El quitosano es un polímero lineal de anhidroglucosamina. El quitosano comercialmente disponible es de hecho una mezcla con quitina, siendo el primero un derivado desacetilado de la última. En esta descripción, el término "quitosano" se utilizará para representar quitosano puro así como mezclas del mismo con quitina. En esta modalidad, el quitosano forma una red de inter-penetración (IPN) con el HA. De este modo, el quitosano y el HA son reticulados por vía de sus grupos amino e hidroxilo respectivamente y el HA es reticulado a otra molécula de HA por vía de los grupos carboxilo, formando enlaces éster.

En esta modalidad, se puede preparar una película de HA no reticulado/quitosano antes de la primera reacción de reticulación. Si se desea, se puede incorporar en la película, como plastificante, glicerol o un polietilenglicol de bajo peso molecular. Se puede preparar una película de HA no reticulado/quitosano mezclando una solución de HA con una solución de quitosano y secando para obtener una película. Sin embargo, la simple mezcla de quitosano y HA formará un precipitado debido a la complejación iónica. La entidad solicitante ha comprobado que puede evitarse la precipitación a través de la adición de cloruro sódico o ácido clorhídrico a la mezcla. Preferentemente, el cloruro sódico se añade en una concentración de 1 M a 2 M y el ácido clorhídrico en una concentración de 0,1 M a 0,5 M. Este método se puede emplear también para mezclar HA con otros polímeros policatiónicos y polímeros sintéticos que contienen grupos amino.

La primera reacción de reticulación entre HA y quitosano se efectúa preferentemente sobre la película de HA no reticulado/quitosano empleando un epóxido bajo condiciones alcalinas y la segunda reacción de reticulación para formar una reticulación de HA-HA, se efectúa preferentemente empleando un epóxido bajo condiciones ácidas. El epóxido es con preferencia 1,2,7,8-diepoxioctano.

Otros polímeros que solo tienen un grupo funcional pueden ser reticulados con HA de manera similar a la descrita para PVA y quitosano. En este caso, se puede formar una segunda reticulación entre dos moléculas de HA o con otro polímero que tiene un grupo funcional adecuado.

En una modalidad preferida, la presente invención proporciona un procedimiento para preparar derivados de HA/polímero doblemente reticulados, comprendiendo dicho procedimiento poner en contacto el HA y un segundo polímero con uno o más agentes reticulantes en condiciones adecuadas para formar dos enlaces diferentes entre las moléculas de HA y dicho segundo polímero. Con preferencia, las reacciones de reticulación se efectúan en secuencia. De este modo, el procedimiento en dos etapas de acuerdo con la invención comprende:

(a) reticular HA con un segundo polímero por vía de un primer grupo funcional y a continuación

(b) reticular adicionalmente el producto de (a) por vía de un segundo grupo funcional,

en donde dichos primero y segundo grupos funcionales representan entidades químicas diferentes.

Los derivados de HA/polímero reticulados, preparados de acuerdo con la presente invención, contienen al menos dos tipos diferentes de enlaces de reticulación, por ejemplo ambos enlaces éter y éster.

Se cree que los derivados de HA/polímero reticulados de forma múltiple (por ejemplo, de forma doble) preparados de acuerdo con la invención son por sí mismos nuevos. De este modo, según otro aspecto, la presente invención proporciona derivados de HA/polímero reticulados de forma múltiple (es decir, HA reticulado a uno o más polímeros y opcionalmente a otras moléculas de HA, por vía de dos o más enlaces funcionales diferentes) obtenibles mediante el procedimiento descrito anteriormente.

Según otro aspecto, la presente invención proporciona HA reticulado a uno o más polímeros distintos de HA y dicho o dichos polímeros son reticulados por al menos dos tipos diferentes de enlace covalentediferentes. Preferentemente, el HA es HA doblemente reticulado. En particular, la presente invención proporciona HA reticulado a un segundo polímero en donde el HA y dicho segundo polímero son reticulados por dos tipos diferentes de enlace covalente.

La presente invención también proporciona HA reticulado a uno o más polímeros distintos del HA, en donde el HA es reticulado a dicho o dichos polímeros y a otras moléculas de HA mediante al menos dos tipos diferentes de enlace covalente.

Los derivados de HA/polímero doblemente reticulados de acuerdo con la presente invención pueden tener un grado de reticulación del orden de 10 a 50%, por ejemplo 15 a 30%, con preferencia 20 a 25% (en donde 100% está representado por la reticulación de todos los grupos OH en la posición C6 y de todos los grupos COOH en la posición C5). El grado de reticulación se puede medir por análisis elemental o análisis NMR en estado sólido. Las relaciones de los diferentes enlaces funcionales en el producto variarán en función de los tipos de enlaces funcionales presentes y de las condiciones de reacción empleadas para su formación. Para un producto reticulado de forma doble que contiene enlaces éter y éster, la relación de dichos enlaces puede variar de 50:50 a 95:5, por ejemplo de 60:40 a 80:20 de enlaces éter:éster.

En general, un producto según la presente invención tiene un mayor grado de reticulación, es decir, una red de reticulaciones más densas que un derivado de HA/polímero reticulado de forma simple. Se ha comprobado que un mayor grado de reticulación reduce la capacidad de absorción de agua del HA reticulado, traduciéndose ello en una mayor estabilidad en solución acuosa. Además, se ha comprobado que el HA doblemente reticulado exhibe una mayor estabilidad contra la degradación por hialuronidasa y contra la degradación debida a radicales libres, indicativo ello de una mayor bioestabilidad. Como se ha indicado anteriormente, la bioestabilidad del producto final dependerá, en parte, de la naturaleza del otro u otros polímeros a los cuales se reticula el HA. Por tanto, el segundo y cualquier posterior polímero deberán elegirse de acuerdo con las propiedades deseadas, entrando esto dentro de las posibilidades del experto en la materia.

Un producto opaco de acuerdo con la presente invención tiene en general un mayor grado de reticulación y, por tanto, una menor capacidad de absorción de agua y una mayor estabilidad, en comparación con un producto transparente. Dichos productos son adecuados para su implantación a largo plazo.

Un producto transparente, por ejemplo una película transparente, según la presente invención tiene una mayor capacidad de absorción de agua que un producto opaco y dichos productos resultan particularmente adecuados para implantes dérmicos, curación de heridas (absorción de exudado) e implantación resorbible a corto plazo.

El procedimiento en múltiples etapas descrito anteriormente se prefiere cuando se desea un producto altamente reticulado con una baja capacidad de absorción de agua. La reticulación simultánea se traduce generalmente en un producto insoluble en agua, pero con una mayor capacidad de absorción de agua que un producto preparado empleando un procedimiento en múltiples etapas (por ejemplo, dos etapas) bajo condiciones similares.

Por otro lado, se ha comprobado que empleando una película de HA/polímero reticulado una sola vez como material de partida para la segunda etapa de reticulación, se obtiene un producto (que puede estar en forma de película o que puede convertirse a un gel) con una capacidad de absorción de agua más baja que el producto de HA/polímero reticulado doblemente y preparado a partir de una solución de HA/polímero bajo condiciones de reticulación similares (es decir, sin formación intermedia de película). En realidad, se ha comprobado que la capacidad de absorción de agua de los productos resultantes puede variar desde 400% a 1000% para materiales de partida en forma de película y de gel, respectivamente.

Los derivados de HA reticulados de acuerdo con la presente invención se pueden emplear en una variedad de aplicaciones farmacéuticas, médicas (incluyendo quirúrgicas) y cosméticas.

Así, pueden ser útiles, por ejemplo, a la hora de promover la curación de heridas, por ejemplo como un vendaje para heridas dérmicas.

También pueden ser útiles a la hora de prevenir la adherencia, por ejemplo prevenir el crecimiento de tejido entre órganos después de la cirugía.

Los derivados de HA reticulados de acuerdo con la presente invención pueden encontrar también aplicación en el campo oftálmico, por ejemplo para sustituir el fluido vítreo, como pantallas corneales para el suministro de fármacos al ojo o como lentículas.

Los derivados de HA reticulados de acuerdo con la presente invención pueden ser también útiles en cirugía, por ejemplo como implantes sólidos para el aumento de tejido duro, por ejemplo preparación o sustitución de cartílago o hueso, o para el aumento de tejido blando, como implantes de mama, o bien como revestimiento para implantes destinados para su uso a largo plazo en el cuerpo, tales como implantes de mama, catéteres, cánulas, prótesis óseas, sustituciones de cartílagos, mini-bombas y otros dispositivos de administración de fármacos, órganos artificiales y vasos sanguíneos, mallas para el refuerzo de tejidos, etc. También se pueden emplear como lubricantes de articulaciones en el tratamiento de artritis.

Otro uso de los derivados de la presente invención reside en la administración de agentes terapéuticamente activos, incluyendo cualquiera de las aplicaciones antes mencionadas. Los agentes terapéuticamente activos pueden ser agentes quimioterapéuticos o factores biológicamente activos (por ejemplo, citoquinas) e incluyen agentes anti-inflamatorios, antibióticos, analgésicos, anestésicos, promotores de la curación de heridas, agentes citostáticos, inmunoestimulantes, inmunosupresores y antivíricos.

Los factores terapéuticamente activos se pueden unir al derivado de HA reticulado por métodos bien conocidos en la técnica.

Los derivados de HA reticulados se pueden emplear en diversas formas, incluyendo membranas, perlas, esponjas, tubos, láminas e implantes conformados.

La invención será ilustrada ahora adicionalmente por medio de los siguientes ejemplos no limitativos.

Se emplearon los siguientes procedimientos para medir la estabilidad de los productos.

Metodología Evaluación de la capacidad de absorción de agua

Se sumergieron 20 mg (Wd) de cada una de las muestras reticuladas secas en solución de tampón PBS para formulación durante 24 horas, para obtener un gel totalmente hinchado. El gel húmedo fue separado por filtración y el agua residual en la superficie se retiró empleando papel de seda. El gel húmedo se pesó para obtener Ws. De este modo, la capacidad de absorción de agua (WAC) (%) se puede calcular de acuerdo con la siguiente
fórmula:

WAC(%) = (Ws-Wd)/Wd\ x\ 100

Resistencia a la digestión por hialuronidasa

Se suspendieron 200 mg de HA reticulado en 6 ml de solución tampón de PBS (pH=7,2) conteniendo 1000 U de hialuronidasa y se incubó a 37ºC durante 24 horas. A continuación, la película se retiró y se enjuagó empleando tampón PBS y se recogió toda la solución de enjuagado para obtener un total de 10 ml de solución. Esta solución se hirvió durante 30 minutos para efectuar la precipitación de hialuronidasa. La solución se centrifugó entonces a 4000 rpm/10 minutos. La solución sobrenadante se completó a 25 ml empleando solución de PBS en un matraz volumétrico. La concentración de HA se midió empleado el ensayo de Carbazol.

La pérdida de peso de HA debido a la digestión con hialuronidasa se puede calcular empleando la siguiente fórmula:

Pérdida\ peso\ HA\ (%) = [HA]\ x\ 25/[HA]o\ x\ 100

en donde [HA] es la concentración de HA, [HA]o es el contenido original en HA (mg).

Resistencia a radicales libres

Se emplearon agentes Ferton para crear radicales libres, los cuales se forman mediante 25 microlitros de ácido ascórbico 0,1 y 0,25 microlitros de 0,1 M H_{2}O_{2} en 5 ml de solución de PBS. A esta solución se añadieron 20 mg de muestra seca para la digestión. El tiempo de digestión es de 24 horas a 37ºC. A continuación, la película se retiró y se enjuagó empleando tampón PBS y toda la solución de enjuagado se recogió y se completó a 25 ml empleando tampón PBS en un matraz volumétrico. La concentración de HA se medió empleando el ensayo de Carbazol. La pérdida de peso de HA se puede calcular empleando la misma fórmula que en la digestión con hialuroni-
dasa.

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Ejemplo 1

Preparación de HA/PVA reticulado

Se prepararon respectivamente una solución en agua de 1% de HA y 5% de PVA y se mezclaron entre sí para proporcionar una solución homogénea de HA/PVA con una composición variable de HA (véase la tabla 1). La solución se vertió en un plato petri y se secó durante 4 días para obtener una película.

La película resultante se suspendió en una mezcla de CHCl_{3} disolvente/solución ácida o alcalina/1,2,7,8-diepoxioctano o glutaraldehído como reticulante. La reacción de reticulación se efectuó a temperatura ambiente durante un tiempo fijo (24 horas).

Se añadió otra cantidad de agente reticulante y, si es necesario, se ajustó el pH, y la mezcla se dejó en reposo a temperatura ambiente durante 24 horas más, para efectuar la segunda reacción de reticulación. Las condiciones detalladas de la reticulación se muestran en la tabla 1. Después de la reticulación, las muestras se lavaron con IPA y acetona tres veces, se sumergieron en IPA/agua desionizada (60/40) durante la noche y luego se lavaron con acetona y se secaron en un horno a 37ºC hasta obtener un peso constante.

TABLA 1 Formación de PVA-HA reticulado (CPH)

1

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TABLA 2 Bioestabilidad de HA/PVA reticulado contra la digestión con hialuronidasa

3

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Ejemplo comparativo 2

Película de HA-alginato doblemente reticulado

Se preparó una película de HA/alginato doblemente reticulado con diferente composición de HA de acuerdo con el método descrito a continuación. Como reticulante extra-iónico se utilizó solución de ión calcio de diferente concentración.

Método

Se preparó una solución de alginato sódico al 2% en agua desionizada y se combinó con 1% de hialuronato sódico en salina tamponada con fosfato (HA) para proporcionar una solución homogénea de HA/alginato sódico. Las proporciones y concentraciones del HA y del alginato sódico en la solución se pueden variar en función de las características requeridas en la película final. La solución homogénea, aproximadamente 10 ml, se vertió en un plato petri y se añadió solución de cloruro cálcico. Esto se dejó aproximadamente durante 1 hora en cuyo tiempo se produjo la complejación iónica. La placa resultante de HA/alginato se lavó tres veces con agua desionizada para separar el calcio sin unir. El HA/alginato polimerizado se dejó secar en la campana de humos durante 72 horas. La película resultante se suspendió en una solución disolvente/alcalina. Se añadió un volumen de reticulante, 1,2,7,8-diepoxioctano, y se dejó proceder la reacción a temperatura ambiente. El tiempo para la reacción de reticulación se puede variar entre 1 hora y 48 horas. La película se suspendió en una solución disolvente ácida y se añadió otro volumen de reticulante, 1,2,7,8-diepoxioctano. La reacción se dejó proceder a temperatura ambiente durante un tiempo comprendido entre 1 hora y 48 horas. La película reticulada resultante se lavó con solución de acetona/agua desionizada (3/2) tres veces seguido por tres lavados con IPA/agua desionizada (3/1). La película se sumergió en IPA/agua desionizada durante la noche. La película se dejó secar en la campana de humos.

TABLA 3 Formación de Alginato (Alg)/HA doblemente reticulado (CAH)

4

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TABLA 4 Bioestabilidad de alginato/HA doblemente reticulado

5

Ejemplo 3

Preparación de derivados de HA/quitosano reticulados (CS)

Se preparó una película de HA/CS/glicerol con diferente porcentaje de HA. El reticulante podía añadirse bien antes o bien después de la colada. En este ejemplo, para la reticulación se utilizó la película seca de HA/CS/glicerol. Normalmente, y como un ejemplo, se suspendió una lámina entera de HA/CS (20% HA) (200 mg) en un recipiente con 40 ml de acetona/NaOH (pH = 12) para la impregnación durante 1 hora, tras lo cual se añadieron 0,4 ml de 1,2,7,8-diepoxioctano durante 24 horas de reacción a temperatura ambiente. Después de esta reacción, el pH se ajustó a pH = 4~5 y se añadieron otros 0,4 ml (dependiendo de la concentración de HA) de 1,2,7,8-diepoxioctano, para proceder a una segunda esterificación durante otras 24 horas. Después de la purificación, pudo observarse que la película formada de HA/CS es más tenaz y más flexible en estado seco que la muestra sin glicerol. Es transparente/incolora (en algunos casos presenta un color amarillo claro dependiendo de la condición de reticulación) y tiene una alta absorción de agua.

Como alternativa al glicerol podría utilizarse PEG de bajo peso molecular.

Ejemplo 4

Preparación de HA/CS reticulado con 20% en peso de HA (película)

Se prepararon 2,0 ml de HA (1% en solución tampón de formulación de PBS) y 8,0 ml de CS (1% en solución de HCl 0,1 M) respectivamente y se mezclaron entre sí para proporcionar una solución homogénea de HA/CS. La solución se vertió en un plato petri y se secó a temperatura ambiente durante 1 semana para obtener una película seca. La película seca se colocó en un recipiente con 10 ml de solución acuosa de 1 N NaOH/acetona (30/70). Se añadieron 0,2 ml de 1,2,7,8-diepoxioctano para reaccionar durante 24 horas a temperatura ambiente. Después de la primera reticulación, se añadieron otros 0,5 ml de 1 N HCl para mantener el pH por debajo de 4. Se añadieron 0,2 ml más de 1,2,7,8-diepoxioctano para reaccionar durante otras 24 horas a temperatura ambiente. Se retiró la película y se lavó tres veces empleando acetona/agua destilada 3/1 y otras tres veces empleando isopropanol (IPA)/agua destilada 3/1 y se guardó en solución de formulación de PBS.

Ejemplo 5 Preparación de HA/CS reticulado con 30% en peso de HA (en forma de gel)

Se disolvió una muestra seca de HA en solución de NaCl 1,25 M para obtener una solución al 1% de HA/NaCl. Se mezclaron 5 ml de solución de HA con 5 ml de solución de CS (1% en HCl 0,1 M) para obtener una mezcla homogénea. Se añadieron de manera simultánea 0,2 ml de glutaraldehído y 0,2 ml de 1,2,7,8-diepoxioctano para reaccionar durante 2,5 horas a 40ºC. El gel formado se lavó tres veces empleando acetona/agua destilada 3/1 y otras tres veces empleando IPA/agua destilada (3/1) y se guardó en solución de formulación de PBS.

Ejemplo 6

Preparación de HA/CS reticulado con 50% en peso de HA (película)

Se disolvió una muestra sólida seca de HA en solución de HCl 0,1 M para obtener una solución al 1% de HA/HCl. Se mezclaron 5 ml de esta solución de HA con 5 ml de CS (1% en HCl 0,1 M) para obtener una mezcla homogénea. La solución se coló y se secó a temperatura ambiente durante 1 semana para obtener una película seca. La película se reticuló de acuerdo con el mismo procedimiento descrito en el ejemplo 4. De este modo, se obtuvo una película de biomatriz de HA/CS conteniendo 50% de HA (basado en la relación de alimentación).

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Ejemplo 7

Preparación de HA/CS reticulado con 60% en peso de HA (película)

Se mezclaron 6 ml de solución al 1% de HA/1,25 M NaCl con 4 ml de 1% de CS (en solución de HCl 0,1 M) para obtener una solución homogénea. La solución fue colada y secada durante 1 semana a temperatura ambiente para obtener una película seca en donde el NaCl sirve como inductor de microporos. La película se colocó en un recipiente y se añadió 10 ml de NaOH 1 N/acetona (30/70) para suspender la película. El proceso de reticulación se realizó de acuerdo con el mismo procedimiento descrito en el ejemplo 4. Por último, se obtuvo una película con una superficie estructurada porosa.

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Ejemplo 8

Preparación de HA/CS reticulado con 80% en peso de HA (película)

Se disolvió una muestra sólida seca de HA en solución de HCl 2,0 M para obtener una solución al 1% de HA/HCl. Se mezclaron 8 ml de esta solución de HA con 2 ml de CS (1% en HCl 0,1 M) para obtener una mezcla homogénea. La solución fue colada y secada a temperatura ambiente durante 1 semana para obtener una película seca. La película se colocó en un matraz provisto de tapón y se añadieron 10 ml de HCl 0,1 M/acetona (3/7 en volumen) para suspender la película. Se añadió entonces una mezcla de 0,2 ml de glutaraldehído y 0,2 ml de 1,2,7,8-diepoxioctano para reaccionar durante 6 horas a temperatura ambiente. La película se purificó de acuerdo con el mismo procedimiento descrito en el ejemplo 4.

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Ejemplo 9

Ensayo de estabilidad de HA/CS reticulado con diferente proporción en peso de HA

De acuerdo con la metodología descrita en el ejemplo 6 se preparó una serie de películas de HA/CS reticulado con relaciones de alimentación de HA que variaban desde 20%, 30%, 40%, 50% a 60%, para obtener las muestras CCH-5, 6, 7, 8 y 9. Las muestras se impregnaron en solución de formulación de PBS durante la noche y las películas húmedas se pesaron como un peso original (Wo). Después de guardarlas en solución de PBS durante 2 semanas, las películas se retiraron y el exceso de agua de la superficie se separó cuidadosamente empleando papel de seda y se pesaron de nuevo para obtener un peso restante (Wr). De este modo, el porcentaje en peso restante se puede derivar a partir de la siguiente fórmula: peso restante (%) = Wr/Wo x 100%. Los resultados se muestran en la tabla 6.

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TABLA 5 Comparación de quitosano (CS)/HA (CCH) reticulado de forma simple y reticulado de forma doble

6

TABLA 6 Estabilidad de HA/CS (CCH) doblemente reticulado

7

Claims

1. Procedimiento para la preparación de derivados de ácido hialurónico reticulados de forma múltiple, cuyo procedimiento comprende reticular HA a uno o más polímeros distintos de HA y opcionalmente a otra molécula de HA por vía de dos o más grupos funcionales diferentes, en donde dicha reticulación se efectúa poniendo en contacto el HA y un polímero distinto de HA con uno o más agentes reticulantes químicos con el fin de formar dos o más reticulaciones químicamente distintas entre el HA y dicho polímero, y siendo seleccionadas dichas reticulaciones entre enlaces éter, éster, amida, amina, imino o sulfona.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en donde dicho polímero se elige entre un biopolímero y un polímero sintético.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en donde dicho polímero sintético se elige entre alcohol polivinílico (PVA), óxido de polietileno (PEO) y óxido de polipropileno (PPO), así como copolímeros de cualquiera de los referidos polímeros, ácido poliacrílico, poliacrilamida y otros polímeros hidroxílicos, carboxílicos e hidrófilos sintéticos.

4. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en donde dicho biopolímero se elige entre polipéptidos, celulosa y sus derivados tales como hidroxietilcelulosa y carboximetilcelulosa, alginato, quitosano, lípido, dextrano, almidón, goma de gelano y otros polisacáridos.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde los grupos funcionales se eligen entre hidroxilo, carboxilo y amino.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la reticulación se efectúa por medio de dos o más enlaces diferentes seleccionados entre enlaces éter, éster, sulfona, amina, imino y amida.

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el agente reticulante se elige entre formaldehído, glutaraldehído, divinilsulfona, un polianhídrido, un polialdehído, un alcohol polihídrico, carbodiimida, epiclorhidrina, etilenglicol, diglicidiléter de butanodiol, diglicidiléter, poliglicidiléter de poliglicerol, diglicidiléter de polietilenglicol, diglicidiléter de polipropilenglicol o un agente reticulante de bis- o poli-epoxi.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde se forma un enlace éter empleando un agente reticulante seleccionado entre bis- y poli-epóxidos bajo condiciones alcalinas.

9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde se forma un enlace éster usando un agente reticulante seleccionado entre bis- y poli-epóxidos bajo condiciones ácidas.

10. Procedimiento según la reivindicación 8 ó 9, en donde el reticulante se elige entre 1,2,3,4,-diepoxibutano y 1,2,7,8-diepoxioctano.

11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde se forma un enlace éter empleando glutaraldehído como agente reticulante bajo condiciones ácidas.

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde la reticulación de cada tipo de grupo funcional se efectúa de manera secuencial.

13. Procedimiento según la reivindicación 12, que comprende reticular HA a un polímero distinto de HA por vía de un primer grupo funcional y a continuación reticular adicionalmente el producto por vía de un segundo grupo funcional, en donde dichos primero y segundo grupos funcionales representan entidades químicas diferentes.

14. Procedimiento según la reivindicación 13, en donde el HA se reticula primeramente a un polímero distinto de HA por vía de grupos hidroxilo mediante formación de enlaces éter y a continuación se retícula bien a dicho polímero o bien a otra molécula de HA por vía de grupos carboxilo mediante la formación de enlaces éster.

15. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y 9 a 11, en donde la reticulación de cada tipo de grupo funcional se efectúa de manera secuencial.

16. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 para la preparación de HA doblemente reticulado.

17. Procedimiento según la reivindicación 16, que comprende:

18. HA reticulado de forma múltiple y obtenible mediante un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17.

19. HA reticulado a uno o más polímeros distintos de HA, en donde el HA y dicho o dichos polímeros están reticulados por al menos dos tipos diferentes de enlaces funcionales.

20. HA reticulado a un segundo polímero, en donde el HA y dicho segundo polímero están reticulados por dos tipos diferentes de enlaces funcionales.

21. HA reticulado a un polímero distinto de HA, en donde el HA está reticulado a dicho polímero y a otra molécula de HA por al menos dos tipos diferentes de enlaces funcionales.

22. HA reticulado según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, en donde los enlaces de reticulación se eligen entre dos o más enlaces éter, éster, sulfona, amina, imino y amida.

23. HA reticulado de forma múltiple según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22 en forma de una película.

24. HA reticulado de forma múltiple según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22 en forma de un gel.

25. Un producto que comprende HA reticulado de forma múltiple según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 24.

26. Uso de un derivado de HA reticulado de forma múltiple según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 24 en la preparación de un producto para uso farmacéutico, médico o cosmético.

27. Uso según la reivindicación 26, en donde el producto está destinado a la administración de agentes anti-inflamatorios, antibióticos, analgésicos, anestésicos, promotores de la curación de heridas, agentes citostáticos, inmunoestimulantes, inmunosupresores y antivíricos.

28. Uso según la reivindicación 27, en donde el producto está destinado a la administración de anestésicos

29. Uso de un derivado de HA reticulado de forma múltiple según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 24 o de un producto según la reivindicación 25 en medicina o cirugía.